HU201119B

HU201119B - Antitumor antibiotic kedarcidin.

Info

Publication number: HU201119B
Application number: HU891756A
Authority: HU
Inventors: Sandra June Hofstead; James Andrew Matson; Kin Sing Lam; Salvatore Forenza; James Allen Bush; Koji Tomita
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1988-04-12
Filing date: 1989-04-12
Publication date: 1990-09-28
Also published as: DK173589D0; DK174751B1; PT90252A; NO174474B; EP0337430A2; EP0337430A3; KR970010137B1; SG30654G; NO174474C; DE68913063D1; IE62912B1; CN1034589C; CY1849A; FI93969B; PL161004B1; MY105842A; CN1037735A; DE68913063T2; AU623641B2; FI93969C

Description

A találmány tárgya eljárás a kedarcidin tumorellenes antibiotikum mikrobiológiai előállítására a Streptoalloteichus sp. nov. L-585-6 törzzsel. A találmány foglalkozik továbbá a kedarcidin antibiotikumot tartalmazó gyógy- 5 szerkészitmények előállításával. Foglalkozik továbbá a leírás a kedarcidint termelő Streptoalloteichus sp. L-585-6 jelű, ATCC 53650 deponálási számú törzzsel.

A találmány szerinti tumorellenes kedar- 10 cidin jellemzői:

(a) megjelenés: barnássárga színű szilárd anyag;

(b) molekulatömeg: 12400 Dalton, SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel meghatároz- 15 va; 17000 gélszüréses/HPLC módszerrel meghatározva;

(c) UV spektrum: 2. ábra;

(d) izoelektromos pont: 3,65;

(e) a polipeptidrészének aminosavsorrendje: 20 X-ala-ala- val- se r- val- s e r- p r o-ala-1 h r-gly-leuala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-glyphe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu- 25

-gln-cys-alaile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-gluphe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr- 30 ser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-gly-tyr-val-metpro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thrala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly- 35

-gly-asn-thrgly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH; ahol X jelentése H-ala-ser, H-ser vagy H.

A találmány szerinti antibiotikumot a 40 fenti fizikai-kémiai tulajdonságai megkülönböztetik más, eddig ismert tumorellenes, peptidjellegü antibiotikumoktól, mint amilyen a neokazinosztatin, makromomicin, largomicin, aktinoxantin és az AN-7D. 45

A találmány tárgyául szolgáló mikrobiológiai kedarcidinelőállitás abból áll, hogy a fenti kedarcidin-termelő Streptoalloteichus törzset asszimilálható szénforróst és nitrogénforrást tartalmazó táptalajon tenyésztjük 50 süllyesztett, aerob körülmények között és az antibiotikumot a fermentléből kinyerjük.

A találmány további tárgya a kedarcidin antibiotikum tumorgátló mennyiségét és gyógyászati szempontból alkalmazható vivóanya- 55 got tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása.

A találmány szerint előállított antibiotikum alkalmas a tumornövekedés gátlására emlősöknél, oly módon, hogy a tumoros szer- 60 vezetbe a kedarcidin antibiotikum tumorgótló mennyiségét juttatjuk be.

Az aminosavak jelölésére az alábbi rövidítéseket használjuk:

thr: treonin 65

ser:	szerin
asp:	aszparaginsav
asn:	aszparagin
glu:	glutaminsav
gin:	glutamin
pro:	prolin
gly:	glicin
ala:	alanin
val:	valin
met:	metionin
ile:	izoleucin
leu:	leucin
tyr:	tirozin
phe:	fenilalanin
his:	hisztidin
ly:	lizin
arg:	arginin
cys:	cisztein
trp:	triptofán

Az L-586-6 törzset Indiában, a Maharasta államban gyűjtött talajmintából izoláltuk.

Az L-586-6 törzs leírása:

Alaktani sajátosságok:

Az L-586-6 Gram-pozitiv, szálas mikroorganizmus, mely szubsztrát- és légmicéliumokat fejleszt. A szubsztrátmicélium átszövi az agart és nem fragmentálödik. 5-25 pm átmérőjű gömb alakú hifaagregátumok figyelhetők meg az összeolvadt vegetatív hifák mentén.

A légmicéliumok jól elágazók, egy irányba meghajtó vagy spirálisan csavarodó hoszszú hifákat fejlesztenek, melyeken a spórák folyamatos vagy megtisztított láncokban fejlődnek. Főként az ISP5 táptalajon alakulnak ki az elágazó rövid spórafüzérekből tömött bojtok. Mindkét típusú spóra alakja az oválistól rövid hengeresig változik (0,4-0,6 x x 1,0-2,0 pm), mozgásra képtelen és a felszíne sima.

5-10 napos inkubáció után a légmicéliumon egyedül álló vagy tömegesen megjelenő színtelen gömb alakú testek jelennek meg (5-20 pm átmérőjű). További három hetes vagy hosszabb inkubáció után ezek a gömb alakú testek sárgásbarna szklerótikus granulátumokká (40-100 pm átmérőjű, fejlődnek, melyeket megnyúlt léghifák borítanak.

Tenyészet:

A növekedés általában közepes, de a Czapek-féle szacharóz/nitrátos agaron, zablisztes agaron és keményítő/ásványi sós agaron nagyon gyenge. Tirozinoe agaron és glicin/aszparaginos agaron légmicéliumokat fejleszt, viszont ISP 2, 3, 4, és 6 jelű agaron, valamint Bennett-féle agaron a légmicélium nem alakul ki. A légmicélium sárgás fehér színű. ISP6 és 7 jelű agaron feketés melanoid festék keletkezik. Más eltérő pigment nem keletkezik. Az L-586-6 törzs tenyészetének jellemzőit az I. táblázatban foglaljuk össze.

HU 201119 Β táptalaj

I. Táblázat

Az L-586-6 törzs tenyészetének jellemző tulajdonságai leírás'¹¹ szacharóz/nitrátos agar (Czapek-Dox) tripton/élesztőkivonatos agar (ISP1) élesztőkivonat/maláta kivonatos agar (ISP2) zablisztes agar (ISP3) szervetlen só/keményítös agar (ISP4) glicin/aszparaginos agar (ISP5) pepton/élesztőkivonat/vasas agar (ISP6) tirozinos agar glükóz/aszparaginos

Bennett agar

N: nincs vagy gyenge

L: nincs

Sz: színtelen

Dp: nincs

N: mérsékelt, nem zavaros, pelyhes

L: nincs

Sz: színtelen

Dp: sötét sárgásbarna (75,'³¹N: mérsékelt L: nincs

Sz: sötét sárgásbarna (78)

Dp: sötét sárgásbarna (75)

N: gyenge

L: nincs vagy gyenge; fehér Sz: színtelen Dp: nincs N: gyenge

L: nincs vagy gyenge; fehér Sz: színtelen Dp: nincs N: mérsékelt

L: mérsékelt, sárgásfehér (92)

Sz: színtelen Dp: nincs N: mérsékelt L: nincs

Sz: halvány szürkés-sárgásbarna (79) Dp: barnásfekete (65)

N: mérsékelt

L: erőteljes, sárgásfehér (92,

Sz: fekete Dp: fekete N: gyenge L: nincs

Sz: sötét narancssárga (72)

Dp: nincs N: mérsékelt

L: nincs vagy gyenge; fehér Sz: sötét szürkés-sárgásbarna (81) Dp: közepes, sárgásbarna (77,

(1)	3 hetes, 28 °C hőmérsékleten történő 50 a D-ribózt és a D-glükózt hasznosítja a nö-
növekedés után	vekedéshez. A fiziológiai sajátosságait és a
(2)	N = növekedés; L = légmicélium, Sz = = szubsztrátmicélium; Dp = diffundáló festékanyag	szénhidráthasznosítást a II. és III. táblázatban foglaltuk össze.
(3)	a zárójelben lévő számok a ISCC-NBS szerinti színjelölések.	55

Fiziológiai sajátosságok:

A növekedés szempontjából optimális hőmérséklet: 30-35 °C, A növekedés 18-39 °C közötti hőmérséklettartományban megfigyel- 60 hető. Nincs növekedés 15 °C és 41 °C körül. Nincs növekedés olyan táptalajon, mely 5%-nál több nátrium-kloridot tartalmaz. A zselatint elfolyósítja, de a keményítőt nem hidrolizálja. A megvizsgált 25 cukor közül csak 65

-3HU 201119 B

II. Táblázat

III. Táblázat

Az L-585-6 törzs fiziológiai tulajdonságai

Hidrolízis zselatin keményitő-oldható burgonyakeményítö

Tej koaguláció peptonizáció

Nitrátreduktáz termelés Tirozináz termelés Tűrőképesség lizozim, 0,01% (tömeg/ /térf.) nátrium-klorid 1-4%

5% pH 5,0-11,0 4,5 és 12

Hasznosítás <^{* 2}>

L-ramnóz

D-glükóz

D-galaktóz

D-fruktóz

D-mannóz

L-szorbóz szacharóz laktóz cellobióz melibióz trehalóz raffinóz

D-melecitóz oldható keményítő cellulóz dulcit inozit

D-mannit

D-szorbit szalicin glicerin

D-arabinóz

L-arabinóz

D-xilóz

D-ribóz

Növekedési hőmérséklet növekedési tartomány nincs növekedés optimális növekedés +

+

- vagy + + +

+ +

+

18-39 °C 15 és 41 °C 30-35 °C

Czapek-féle szacharóz/nitrátos táptalajon negatív, pepton/nitrátos táptalajon pozitív.

⁽²⁾ Alaptáptalaj: a Pridham-Gottlieb-féle táptalaj (ISP9 jelű táptalaj).

Az 1-585-6 törzs további fiziológiai t ulajdonságai*

Hidrolízis:

adenin kazein eszkulin hippurinsav hipoxantin tirozin karbamid xantin

Túlélés 50 °C-on, 8 óra Felhasználás benzoát citrát mukát szukcinát tartarát

Savképzés glicerinből

D-arabinózból

L-arabinózból D-xilózból L-ramnózból D-glükózból

D-mannózból laktózból cellobiózból melibiózból trehalózból raffinózból

D-melecitózból inozitból

D-mannitból

D-szorbitból eritritböl adonitból metil-oC-glükozidból * A vizsgálati eljárások Gordon és munka45 társai szerint történtek [J. Gén. Microb.,

109: 69-78 (1978)].

Sejtfalanalizis: az L-855-6 törzs sejtfalanalizisét Becker és munkatársai [Appl. Microbiol.

13: 236-243 (1965)], Yamaguchi [J. Bacteriol., 89: 444-453 (1965)] és Lechavalier és Lechavalier [Biology of the Actimaycetes and rela55

HU 201119 Β ted organismus, 11: 78-92 (1976)1 módszereivel végezzük. A sejtfal peptidoglikámja mezo-diaminopimelinsavat tartalmaz. A teljes sejt cukrai: galaktóz, glükóz és ribóz. Ezek szerint a sejtfal a lile típusba tartozik. A foszfolipidek P-II típusúak: foszfatidil-etanol-amin, foszfatidil-glicerin és foszfatidil-inozitol. A menakinon föalkotó részek az MK-9(H4) és az MK9(He). A glikolát-teszt negatív.

Rendszertan: Az Actimiycetales nemzetségbe tartozó hosszú spóraláncú Pseudonocardia-tól, Saccharopolyspora-tól, Actinopolyspora-tól, Streptmyces-től, Actinomadura-tól, Glycomyces-tól, Nocardiopsis-től és Amycolata-tól az L-585-6 törzs világosan elkülönül, tekintettel a sejtfal-tipusra, a sejt cukorösszetételére, a foszfolipid és a menakinon alkotórészekre. A Kibdelosporangium [Shearer és munkatársai, Int. J. Syst. Bacteriol., 36: 47-54 (1986)], a Kitasatosporia [Takahashi és munkatársai J. Gén. Appl. Microbiol., 30: 377-387 (1984)] és az Amycolatopsis [Lechevalier és munkatársai, Int. J. System. Bacteriol., 36: 29-37 (1986)] a foszfolipidet és a menakinont tekintve rokonságban vannak az L-585-6 törzzsel, de különbőznek attól abban, hogy arabinóz van a sejtfalakban, továbbá a Kitasatosporia sejtfalában LL- és raeso-diaminopimelinsav is van. Ezen túlmenően a Kidbelosporangium hifával borított sporangiumszerű testeket fejleszt igazi membránnal, a Kitasatosporia süllyesztett spórákat képez. Ezek a sajátságos képződmények nem figyelhetők meg az L-585-6 törzsnél. Kemotaxonomiai szempontból a Streptoalloteichus [Tonita és munkatársai, Int. J. Syst. Bacteriol., 37: 211-213 (1987)], az Actinosynnema [Hasegawa és munkatársai, Int. J. Syst. Bacteriol., 28: 304-310 (1978)] és a Saccharothrix [Labeda és munkatársai, Int. J. Syst. Bacteriol., 34: 426-431 (1984)] állnak a legközelebb az L-585-6 törzshöz. Az Actinosynnema aerospórák láncát fejleszti a synnema csúcsából. A Saccharothrix fragmentált kokkoid elemeket fejleszt úgy a vegetatív, mint a légmicéliumban és nem képez elágazó, rövid spórafüzérekből nyalábokat vagy szklerotikus granulátumokat. A Saccharothrix australiensis és a S. aerocolonigenes [Labeda, Int. J. Syst. Bacteriol., 36: 109-110 (1986)] kokkoid elemeinek füzére morfológiailag rokon a Nocardiopsis hasonló képződményeivel, de nem rokon egyik Streptomyces fajjal sem. Ezek szerint az L-586-6 törzs nem tehető sem Actinosynnema sem a Saccharothrix nemzetségbe.

A Streptoalloteichus hindustanusnak hosszú spirális artrospóra láncai, elágazó, rövid spórafüzérei, a légniicéliumban szklerotikus granulumai, sürüs gömbőlyded hifatestjei vannak, valamint a vegetatív micéliumban olyan kis, sporangiumszerű testjei, melyek 1-4, flagellummal rendelkező spórát fejlesztenek. Az L-585-6 törzs valamennyi kis sporangiumszerű vezikulumot létrehozza. Hason6 lóan a Streptoalloteichus-hoz, az L-585-6 törzs is gömb alakú testeket képez, melyek belenőnek a szklerotikus granulumokba. Ez a struktúra több Streptomyces-nél megfigyelhető, például a S. kanamyceticus-nál [Shirling és munkatársai, Int. J. Syst. Bacteriol., 22: 265-394 (1972)] és a S. roseiscleroticus-nál (Chainia rubra) [Shirling és munkatársai, Int. J. Syst. Bacteriol., 22: 265-394 (1972)].

A fenti összehasonlító vizsgálatok alapján az L-585-6 törzset a Streptoalloteichus nemzetségbe soroljuk. Az L-585-6 törzs a következőkben különbözik a Streptoalloteichus hindustanus-tól: IPP 2,3 és 4 jelű táptalajon, illetve Bennett agaron nem képez légmicéliumot, melanint termel, a keményítőt nem hidrolizál ja, 41 °C hőmérsékleten nem nő, a 25 megvizsgált cukor közül csak a D-ribózt és a D-glükózt hasznosítja. Ezek szerint az L-585-6 törzset a Streptoalloteichus nemzetség egy új fajának tekintjük.

A Streptoalloteichus nemzetség új fajának tekintett L-585-6 törzs biológiailag tiszta tenyészetét ATCC 53650 számon letétbe helyeztük az amerikai törzsgyűjteményben (American Type Culture Collection; Rockville, MD, USA).

Antibiotikumtermelés: A találmány szerinti tumorellenes antibiotikumot az L-585-6 törzzsel állítjuk elő a mikroorganizmust süllyesztett tenyészetben vizes táptalajon növesztve. A termelő mikroorganizmus asszimilálható szénforrást - például szénhidrátot tartalmazó tápközegben nő. Alkalmas szénforrás lehet például a cerelóz és a glicerin. A táptalajnak asszimilálható nitrogénforrást is kell tartalmaznia, például hallisztet, élesztőkivonatot vagy ammóniumsót. Ha szükséges szervetlen sókat - például nátrium-klorid, kálium-klorid, magnézium-szulfát, kalcium-karbonát, foszfát, stb. - is adunk a táptalajhoz. Úgyszintén adunk nyomelemeket is - réz, mangán, vas, cink, stb. - ha szükséges, de ezek az elemek szennyezésként jelen lehetnek más táptalajkomponensekben. Bármilyen inkubációs hőmérsékletet használhatunk, amelynél a termelő törzs növekszik, tehát 18-39 °C hőmérséklettartományban fermentálhatunk, de előnyös 25-35 °C, a legelőnyösebb 27-32 °C hőmérsékletet alkalmazni. Előnyös, ha a táptalaj kémhatása semleges. Az antibiotikumtermelés általában 4-8 nap alatt történik. Az optimális termelés rendszerint az 5-6. napon érhető el. Viszonylag kis mennyiségű antibiotikum előállításához rázott lombikos vagy felületi tenyészetet is használhatunk, de nagyobb mennyiség előállítása előnyösen steril tankokban lévő süllyesztett, aerob tenyészettel történik. Ha tankfermentálást végzünk, ajánlatos vegetatív oltóanyagot készíteni, a táptalajt spórás tenyészettel beoltva, és az így kapott fiatal aktív vegetatív tenyészettel oltjuk be steril körülmények között a fermentorban lévő táptalajt. Keverte-59

HU 201119 Β téshez mechanikus keverölapátokat használhatunk. Ha szükséges alkalmazhatunk habzésgátlókat is, például disznózsír-olajat vagy szilikonolajat.

A kedarcidin antibiotikum termelődése a fermentáció alatt könnyen nyomonkövethetó az antibiotikus hatás felhasználásával - vizsgálati mikroorganizmusként Bacillus subtilist használva - vagy a hatóanyag citotoxicitásét kihasználva, a vizsgálatokhoz egér vagy patkány (B16-F10) vagy humán (például HCT-116, KB, tumorsejteket alkalmazva.

Nyilvánvaló, hogy a találmány oltalmi köre nem korlátozódik a fent leírt és különösen előnyös L-585-6 törzs alkalmazására. Az oltalmi kör felöleli a nevezett mikroorganizmus más, kedarcidint termelő variánsainak és mutánsainak alkalmazását is, mely mutánsok és variánsok a szokásos módon - Röntgen besugárzással, ultraibolyafény besugárzással, nitrogén-mustárokkal, fágfertőzéssel, stb. előállíthatók.

Az antibiotikum kinyerése és tisztítása: A találmány szerinti tumorellenes protein a fehérjekinyerésnél általánosan alkalmazható eljárásokkal nyerhető ki a fermentléböl, nevezetesen dialízissel, ultraszűréssel, gélszűréssel, izoelektromos lecsapással, kisózással, elektroforézissel, ioncserés kromatográfiával és affinitás kromatográfiával. Az említett módszerek kombinálva is alkalmazhatók a fehérjék tisztításánál. A kinyerés és a tisztítás az egyes lépéseknél nyomonkövethető, például mikrobiológiai úton B. subtilis vizsgálati mikroorganizmussal, in vitro az egér, patkány vagy humán ráksejtekkel szembeni citotoxikus hatás alapján, tumorellenes hatáson alapuló in vivő vizsgálatokkal vagy fizikai módszerekkel, mint amilyenek az UV és HPLC vizsgálatok. Az 1. ábrán egy tipikus elválasztási és tisztítási eljárás lépéseit mutatjuk be. A bemutatott folyamat természetesen csak szemléltető célzatú, a szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy más módszerek alkalmazásával is eljuthatunk nagytisztaságú, biológiailag aktiv proteinhez.

A fermentléböl először például centrifugálással vagy szűréssel eltávolítjuk a szilárd anyagot. Amennyiben szűrést alkalmazunk, előnyös szűrési segédanyagot, például Dicalite-ot használni. A szűrletet ezután anioncserélő kromatográfiának vetjük aló, eluensként először pH = 7-8 kémhatású kationpuffert használva, amit ugyanebben a pufferben készített nátrium-klorid oldat követ. Az említett pH tartományban használható kationpuffer lehet például a trisz-HCl. A nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel kapott frakciókat összegyűjtjük, betöményítjük és tovább tisztítjuk gélszűréses kromatográfiával ugyanazt a kationpuffert használva. A frakciókat összegyűjtjük és megvizsgáljuk bennük az aktív anyag jelenlétét. Az eluátum kezdeti kiértékelésére alkalmas a Bacillus subtilis-szel szembeni aktivitáson alapuló vizsgálati módszer. A gátlási zónát adó frakciókat egyesítjük, betöményítjük és anioncserélő kromatográfiával tisztítjuk tovább, melyhez kiindulási eluensként pH = 7-8 kémhatású kationpuffert használunk, melynek lineárisan növeljük az ionerősségét. Az aktiv frakciókat nátrium-dodecil-szulfótos poliakrilamid gélen (SDS-PAGE) végzett elektroforézissel, izoelektromos fókuszálással és HPLC módszerrel vizsgáljuk. Az egységesnek bizonyuló frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítva aktív fehérjepreparátumhoz jutunk.

Az antibiotikum jellemzése: A kedarcidin aktiv, tumorellenes, proteintipusú antibiotikum, mely egyetlen polipeptidláncból és egy nem-protein kromofor alkotórészből áll. Noha az SDS-PAGE, izoelektromos fókuszálás és HPLC vizsgálatok szerint az antibiotikum minta homogénnek bizonyult, a szekvencia vizsgálatok alatt kiderült, hogy az antibiotikum egy főkomponensból és egy vagy két mellékkomponensból áll. Az eltérés az egyes variánsok között a kezdeti, N-terminélis aminosavban van, amint azt az alábbiakban ismertetjük. A tumorellenes aktivitás szempontjából nem szükséges, hogy az egyes komponenseket elválasszuk egymástól.

Az antibiotikum aminosav-összetételét az ismert módszerek valamelyikével állapítjuk meg. A tisztított protein aminosav-összetételét a IV. táblázatban foglaltuk össze.

-611 HU 201119 Β 12

IV. Táblázat

A kedarcidin aminosavősszetétele aminosav

	mmól	mól*	(a)	(b)
asp	2,765	8,1	10,1	9,3	(6)
asn					(3)
thr	3,18	9,3	11,6	10,6	(11)
ser	3,163	9,3	11,5	10,6	(12)
glu	1,982	5,7	7,0	6,5	(4)
gin					(2)
pro	1,615	4,7	5,9	5,4	(4)
gly	5,529	16,2	20,1	18,5	(18)
ala	5,566	16,3	20,3	18,6	(18)
val	3,731	11	13,6	12,5	(13)
met	0,2873	0,8	1,1	1,0	(1)
ile	0,8531	2,5	3,1	2,9	(3)
leu	1,298	3,8	4,7	4,3	(4)
tyr	0,6274	1,8	2,3	2,1	(2)
phe	1,565	4,6	5,7	5,2	(5)
his	0,6235	1,8	2,3	2,1	(1)
lys	0,3196	0,9	1,2	1,1	(0)
arg	1,001	2,9	3,7	3,3	(3)
cys	0	0	0	0	(4)
trp	0	0	0	0	(0)
(a)	Aminosav száma	peptidmolekulánként,	proteáz esetében
	feltéve, hogy a	peptid	molekulatömege	40 μΐ 0,1	M tris

12.000.

(b) Az aminosavak száma, feltéve, hogy a teljes peptid 114 aminosavból áll. A zá- 35 rójelben lévő értéket az aminosav-sorrend analízise során nyertük.

A kedarcidin terminális aminosavsorrendjének megállapításához az antibiotikumot 40 2-merkapto-etanollal redukáljuk, 15% akrilamidot alkalmazó SDS-PAGE módszerre] tovább tisztítjuk és a gélről elektroelúcióval vagy más elektrokémiai módszerrel nyerjük ki a proteint. 45

A legtöbb enzimatikus hasításhoz további tisztítás nélkül használjuk a kedarcidint.

A kedarcidint 100 ul 0,4 M trisz-HCl pufferben, pH = 8,5 redukáljuk 20 mM ditiotreitollal 2 órán át 50 °C hőmérsékleten. A puffer 6M ,50 guanidin.HCl-ot és 0,1% Na2EDTA-t tartalmaz.

Ezt követően 100 mmól 4-vinil-piridinnel S-piridil-etilálunk szobahőmérsékleten, egy éjszakán át. 5%-os (térf.) ecetsavban végzett 24 órás dialízissel eltávolítjuk a reagenseket, 55 és a módosított kedarcidint egy Speedvac centrifuga-koncentrátorban (Savat Instruments) szárítjuk.

Az S-piridil-etilált kedarcidint ASP-N enzimmel vagy a S. aureus V8 proteázzal en- go zimatikusan hasítjuk. Az enzimatikus reakciót 40 μΐ 0,7 M karbamidot tartalmazó 0,1 M trisz ecetsav pufferben, pH = 8,0 végezzük 37 °C hőmérsékleten, egy éjszakán át. Az enzim/szubsztrát arány ASP-N esetében 1:100, V8 65 = 8,0 végezzük 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán ét. Az enzim/szubsztrát arány 1:20. Az enzimes emésztményt trifluor-ecetsawal pH = 2,0 kémhatásra savanyítjuk és fordított fázisú HPLC-vel szétválasztjuk.

A fordított fázisú HPLC tisztítást egy Model 130A készülékrendszeren végezzük (Applied Biosystems, Inc.) 40 °C hőmérsékleten RP-300 oszlopot (2,1 x 100 mm, Applied Biosystem, Inc.) használva. Eluáláshoz acetonitril gradienst használunk, a kezdő puffer 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav oldat, a befejeződő 60% acetonitrilt tartalmazó 0,085%-os trifluor-ecetsavas puffer. A peptidet tartalmazó frakciókat összegyűjtjük. Az aminosav sorrendet automata aminosavsorrend-analizátorral határozzuk meg (Model 475A, Applied Biosystems, Inc.) a szokásos eljárással.

A fökomponens polipeptid 114 aminosavból áll. Az aminosavak meghatározott sorrendje a következő:

N-terminális

H-ala-ser-ala-ala-val-ser-val-ser-pro-ala-thr-gly-leuala-asp-gly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-glyphe-ala-thr-ser-thr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-alaile-leu-ala-asp-gly-arg-gly-ala-cys-asnval-ala-gluphe-his-asp-phe-ser-leu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thrser-val-val-val-arg-arg-ser-phe-thr-713

HU 201119 Β

-gly-tyr-val-metpro-asp-gly-pro-glu-val-gly-ala-val-asp-cys-asp-thrala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-val-val-gly-gly-asn-thrgly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH. C-terminális

Két minor komponenst azonosítottunk még; az egyiknél hiányzik a főkomponens első alaninja, a másiknál a főkomponens első két aminosavja, azaz alanin és szerin.

A molekulatömeg meghatározás történhet gélszűréses/HPLC módszerrel és nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamid géles elektroforézissel (SD-PAGE).

a) Gélszűrés/HPLC módszer: TSK-G 200C SW (7,5 x 300 mm) oszlopot (LKB Producter AB, Svédország) használunk a gélszüréshez; az eluens 0,5 M nátrium-kloridot tartalmazó 50 mM trisz-HCl puffer (pH = 7,4); átfolyási sebesség 0,5 ml/perc. Ugyancsak használhatunk Waters oszlopot (Waters Associates Protein Analysis Column 1-125); az eluens ez esetben 0,2 M trisz-acetát és az átfolyási sebesség 1 ml/perc. Az összehasonlítási görbe alapján meghatározott molekulasúly: 17000 Dalton. Az összehasonlítási görbét standard molekulasúlyú markerekkel (Bio Rád Laboratories) készítjük el.

b) SDS-PAGE módszer: a proteinmintát és az ismert molekulasúlyú referens anyagokat (Diversified Biotech, Maine) azonos térfogatú Seprasolal (használatra kész proteinoldó közeg, mely szacharózt és nyomjelző festéket tartalmaz) keverjük össze és közvetlenül az elektroforézis előtt 3 percen át melegítjük 90 °C hőmérsékleten. Az elektroforézist 300 V feszültségnél végezzük Seprabuffban (trisz-glicin-SDS, pH = 8,3), amíg a festék el nem éri a gél alját. Ezután a gélt festóoldatba (1,25 g Comassie BB R-250, 92 ml jégecet 908 ml vizes metanolban) merítjük legalább 10 órán át, majd mosó oldatban (75 ml jégecet és 50 ml metanol 875 ml vízben) áztatjuk, amíg a gél háttere áttetszővé nem válik. A Seprasol és a Seprabuff az Integrated Separation System-től származik (Massachusett). Az így meghatározott molekulatömeg 12400 Daltonnak adódott.

Izoelektromos fókuszálás:

A fókuszáláshoz használt gélt az alábbi összetételű keverékből készítjük el:

29,1% akrilamid vizes oldat 10 ml

0,9% N,N-metilén-bisz-akrilamid vizes oldat 10 ml glicerin 7 ml

1802 Ampholine, pH = 2,5-4 3 ml vízzel feltöltve 60 ml-re.

Az oldatot 10 percen át gáztalanitjuk, majd hozzáadunk 1,5 ml 1%-os ammónium-perszulfát vizes oldatot és 10 μΐ Ν,Ν,Ν',Ν’-tetraraetil-etilén-diamint. A keveréket kiöntjük az öntőformába és hagyjuk polimerizólódni. Az elektródoldat az anódnál 1 M foszforsav, a katódnál 2%-os 1809 Ampholine, pH = 6,8. A fókuszálást 25 W állandó teljesítményű elektromos árammal végezzük 2 órán át. A megadott százalékok vegyesszázalékot jelentenek. A megállapított izoelektromos pont: 3,65 és a katódtól mért megtett út 6,25 cm.

Biológiai aktivitás: a protein tumorellenes hatását transzplantálható egér vagy patkány P388 leukémiával szemben vizsgáljuk. DBA/2 donor egérből intraperitoneálisan (ip) vagy intravénásán (iv) ΙΟ⁶ P388 leukémia sejtet juttatunk be CDFi egérbe.

Az intraperitoneálisan bevitt P388 leukémia sejtekkel kezelt állatok a bevitelt követő naptól számított 5 napon ét naponta egyszer intraperitoneálisan fiziológiás sóoldatot (kontroll állatok) vagy kedarcidin dózist kapnak. Az intravénásán bevitt P388 leukémia sejtekkel kezelt állatok a kedarcidint ugyancsak intravénásán a beviteltől számított első (azaz Következő), harmadik és ötödik napon kapják. Az állatokat naponta megvizsgáljuk és elpusztulásuk idejét feljegyezzük. Mindegyik csoportnál meghatározzuk az átlagos testtömeg-változást (a leukémia sejtek bevitelének napjától az utolsó kezelés napjáig), ezzel jellemezve a hatóanyag toxicitását. Ennek további jellemzésére megadjuk az 5. napon életben lévő állatok számát is. Értelemszerűen nem tekintjük terápiás eredménynek, ha a kezelt csoportok állatai közül az 5. napig egynél több állat pusztul el. A kezelt csoportok 4 vagy 6, a kontrollcsoportok 10 darab egérből állnak. Ugyancsak feljegyeztük, hogy hány állat éli túl a 30. napot, a kísérlet utolsó napját. A vizsgálat végén minden csoportnál meghatározzuk a túlélési idő középértékét és meghatározzuk a T/C%-ot, amit úgy számolunk ki, hogy a kezelt csoport túlélési idejének középértékét elosztjuk a kontrollcsoport túlélési idejének középértékével, és a kapott értéket megszorozzuk százzal. Akkor beszélünk szignifikáns tumorellenes hatásról, ha a T/C% értéke 125 vagy ennél nagyobb. Az in vivő adatokat az V. és VI. táblázatban foglaltuk össze.

-815

HU 201119 Β

V. Táblázat

Tumorellenes aktivitás ip beültetett P388 leukémiával szemben

minta	dózis⁸’ hig. vagy mg/kg/inj	túlélési középérték (nap)	T/C%	átlagos tömeg változás (g)	Az 5. napon éló egerek száma
D16F411^C’	híg. 1-40	7,0	74	-1,9	4/4
	hig. 1-80	10,0	105	-1,2	4/4
	hig. 1-160	12,5	132	-1,0	4/4
	hig. 1-320	18,5	195	-1,9	4/4
	kontroll	9,5	-	0,2	10/10
D18F413	0,27	7,0	70	-1,9	4/6
	0,09	15,0	150	-0,8	6/6
	0,03	17,0	170	-1,7	6/6
	0,01	15,0	150	-0,3	6/6
D18G414^b>	0,09	9,5	95	-1,3	6/6
	0,03	15,5	155	-1,2	6/6
	0,01	14,5	145	-0,5	6/6
	0,0033	14,0	140	-0,2	6/6
kontroll		10,0	-	0	10/10

a)	a hatóanyag ip bejuttatva egyszer napjában a tumor beültetését követő naptól számítva 5 napon át	c)	a 4. példa szerinti eluátumot fiziológiás konyhasóoldattal hígítjuk, és 0,5 ml-es adagokat alkalmazunk.
b)	fagyasztva szárított és újra elkészített D18F413 minta	30
	VI.	Táblázat

Tumorellenes aktivitás iv beültetett P388 leukémiával szemben

minta	dózis⁸’ hig, vagy mg/kg/inj	túlélési idő középértéke (nap)	T/C%	átlagos tömegváltozás (g)	Az 5. napon élő egerek száma
D18F413	0,32	6,0	75	-3,1	6/6
	0,16	7,5	94	-3,2	6/6
	0,08	11,0	138	-1,4	6/6
	0,04	12,5	156	-0,6	6/6
	0,02	10,0	125	0,1	6/6
	0,01	8,0	100	1,2	6/6
D16F411»’	hig. 1-25	7,0	88	-2,9	6/6
	hig. 1-50	10,5	131	-1,6	6/6
	hig. 1-100	13,0	163	-1,2	6/6
	hig. 1-200	9,5	119	-0,2	6/6
	hig. 1-400	9,0	113	0,5	6/6
	hig. 1-800	8,0	100	0,8	6/6
	kontroll	8,0	-	-	10/10

a) a hatóanyag iv beadva a tumor beültetése utáni 1., 3. és 5. napon

b) a 4. példa szerinti eluátumot vízzel hígítjuk és 0,2 ml-es adagokat alkalmazunk. 60

A kedarcidint megvizsgáltuk egér/patkény B16 metánoméval szemben is. Ehhez a vizsgálatokhoz az állatokba 0,5 ml 10%-os tumorsejt szuszpenziót viszünk be intraperi- g5 toneálisan. 10-10 egeret használunk az egyes dózisokhoz. A tumor bevitele után számitott első naptól kezdve 9 napon át kapnak az állatok hatóanyagot naponta egyszer intraperitoneális úton. Feljegyezzük az élő egerek számát a 10. napon és a vizsgálat végén, azaz a 60. napon. A kapott eredményeket a VII. táblázatban foglaltuk össze. Szignifikáns tumorellenes hatásról beszélünk abban· az esetben, ha a T/C % értéke 123 vagy ennél magasabb.

-917

HU 201119 Β

VII. Táblázat

Kedarcidin tumorellenes hatása ip beültetett B16 melanomával szemben

dózis (mg/kg/dózis)	túlélési idő középértéke (nap) (d)	T/C%	átlagos tömegválto- zás (g)	Az 5. napon élő egerek száma*
0,256	16,0	97	-2,7	9/10
0,128	24,5	148	-1,3	10/10
0,064	26,5	161	0,3	10/10
0,032	31,5	191	1,0	10/10
0,016	32,5	197	0,6	10/10
0,008	34,0	206	0,6	9/10
0,004	27,0	164	0,3	10/10(1)
0,002	21,5	130	0	10/10
kontroll	16,5	-	1,3

* a zárójelben lévő szám a tumor beültetését követő 60. napon élő egerek száma.

Az V., VI. és VII. táblázat adatai mutatják, hogy a kedarcidin antibiotikum az egér/patkány P388 leukémiával és a B16 melanomóval szemben a reprodukálható in vivő vizsgálatok szerint hatásos. A megfigyelt ha- 30 tás megnyilvánul abban, hogy az ip. bevitt B16 melanomával és az ip. és iv. bevitt P388 sejtekkel implantált állatoknál a kedarcidin meghosszabbítja az élettartamot. A P388 esetében a kedarcidintermelés hatásossága a be- 35 tegségnek egy még súlyosabb formájával szemben nyilvánul meg, tekintettel annak diffúz jellegére.

Megvizsgáltuk a kedarcidin hatását szubkután beültetett B16 melanoma, M5076 40 egér és patkány tüdőtumor és intrakraniálisan beültetett P388 leukémiával szemben is, de ezeknél a kísérleteknél nem találtunk szignifikáns aktivitást.

A találmány további tárgya gyógyszer- 45 készítmény előállítása, mely hatóanyagként a találmány szerinti antibiotikum tumorgátló hatású mennyiségét tartalmazza gyógyászati szempontból alkalmazható vivő- vagy hígítóanyag kíséretében. A készítmény más tumor- 50 ellenes hatóanyagokat is tartalmazhat, és a kívánt beviteli módnak megfelelő formában készítjük el. A készítmény lehet orális adagolásra alkalmas szilárd - tabletta, kapszula, pirula, por és granulátum - vagy fo- 55 lyékony - oldat, szuszpenzió, szirup, elixir alakban és parenterális bevitelre alkalmas formában, például steril oldatként, szuszpenzióként vagy emulzióként. Elkészíthető steril szilárd készítményként is, melyet közvetlenül 60 a felhasználás előtt feloldunk steril vízben, fiziológiás sóoldatban vagy más steril injektálható közegben.

Tumorellenes szerként alkalmazva a szakemberek könnyen megállapíthatják azt az 65 optimális dózist és kezelési sorozatot, mellyel egy adott emlőst kezelhetünk. Természetesen figyelembe kell venni, hogy a tényleges dózis változik, a készítmény összetételétől, a bevitel módjától és a betegség helyétől, a kezelendő betegtől és betegségtől. Sok tényező módosíthatja a hatóanyag aktivitását, nevezetesen a beteg kora, súlya, neme, étrendje, a bevitel ideje, módja, a kiválasztás sebessége, a beteg állapota, más gyógyszerekkel való kombinálódás, a reagálás érzékenysége és a betegség súlyossága.

Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak, a találmány oltalmi körét nem korlátozzuk a példákra.

1. példa

A Streptoalloteichus L-585-6 törzs vegetatív tenyészetének előállítása

A Streptoalloteichus sp. L-585-6 törzset (deponálási szám: ATCC 53650) az alábbi öszszetételü ferdeagaron tartjuk fent:

dextróz	4,0 g
élesztőkivonat	4,0 g
malátakivonat	10,0 g
kalcium-karbonát	1,5 g
agar	15 g
deszt. vízzel
feltöltve	1 literre
Az egyes átoltásoknál	a ferdeagaros

tényszeretet 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk két héten át. A vegetatív tenyészet elkészítéséhez a ferdeagar felületéről a tenyészetet egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikban

-1019

HU 201119 Β

lévő 100 ml steril táptalajra	visszük át,
melynek összetétele:
cerelóz (Corn Products)	30 g
Pharmamedia (Traders Oil
Mill Co.)	10 g
Nutrisoy (Arches Daniels
Midland Co.)	10 g
kalcium-karbonát	3 g
deszt. vízzel
feltöltve	1 literre
A vegetatív tenyészetet 28	°C hőmér-
sékleten inkubáljuk 72 órán át	percenként

250 fordulatszámú körkörös rázógépen.

2. példa

Fermentálás rázott lombikban

Az 1. példában leírtak szerint előállított vegetatív tenyészet 5 milliliterével beoltunk egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 100 ml táptalajt, melynek összetétele a kővetkező:

glicerin 30 g

Pharmamedia 10 g

Distiller’s solubles (Nutrition Product Co. 1 15 g halliszt (Menhaden) 10 g kalcium-karbonát 6 g deszt. vízzel feltöltve 1 literre.

A tenyészetet 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk percenként 250 fordulatszámú körkörös rázógépen. Az antibiotikum fehérje termelődését mikrobiális úton követjük nyomon B. subtilis tesztorganizmust használva és in vitro citotoxikus vizsgálatokkal egér és patkány melanóma B16-F10 sejteket és humán tumorsejteket alkalmazva. A termelés optimuma általában a 144-168. órában érhető el.

3. példa

Tank fermentáció

Az 1. példában leírtak szerint előállított vegetatív tenyészet 25 milliliterével beoltunk egy 2 literes Vitro edényben lévő 500 ml táptalajt, melynek összetétele azonos a vegetatív tenyészet közegével. Ezt a tenyészetet 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk 72 órán át körkörös zárógépen, melynek percenkénti fordulatszároa: 250. A második lépéses oldótenyészettel (500 ml) beoltunk egy 16 liter névleges térfogatú New Brunswick Microgen fermentorban lévő 10 liter termelő táptalajt, melynek összetétele azonos a 2. példában megadott táptalajéval. A fermentálás 28 °C hőmérsékleten történik, percenként egy térfogatnyi levegővel levegőztetünk (fermentortérfogatra számitva), a kevertetés percenkénti fordulatszáma 250. A kedarcidin antibiotikum termelődését ín vitro biológiai értékméréssel követjük nyomon.

4. példa

A kedarcidin kinyerése és tisztítása liter fermentlevet összekeverünk 6 liter Dicalite-val és a hig szuszpenziót Dicalite szűrőrétegen átszűrjük. A kiszűrt anyagot eldobjuk, a szűrletet Zeta Prep 250 QAE ioncserélő kész oszlopra (LKB-Produkter AB, Svédország) visszük 30 ml/perc átfolyási sebességgel. Az oszlopot előzőleg 2 liter 50 mM trisz-HCl pufferral, pH = 7,4, telítettük. Az eluátumot összegyűjtjük. Az oszlopot 1 liter 50 mM trisz-HCl pufferrel pH =7,4 mossuk, majd 0,5 mól nátrium-kloridot tartalmazó 500 ml 50 mM trisz-HCl pufferrel, pH = = 7,4, eluálunk. Az eluátumot összegyűjtjük 500 ml-ről 100 ml-re töményítjük Amicon ultraszüró cellában Amicon YM5 membránt használva. A betöményitett oldatot gélszűrésnek vetjük alá. 5 x 100 cm méretű oszlopot 1400 ml 50 mM trisz-HCl pufferben lévő azonos térfogatú Ultrogel AcA54 (LKB-Produkter AB, Sweden) gyantával töltünk meg. Az ultragel ágyat 5 liter 50 mM trisz-HCl pufferrel, pH = 7,4, hozzuk egyensúlyba. Az anyag rávitele után az oszlopot 2 liter 50 mM trisz-HC1 pufferrel, pH = 7,4, eluáljuk 60 ml/perc átfolyási sebesség mellett.

450 ml kezdeti frakció utón 10 milliliteres frakciókat gyűjtünk és valamennyit megvizsgáljuk a B. subtilis tesztorganizmussal szemben. A gátlás zónákat adó frakciókat (83-133 frakció) egyesítjük és ultraszűréssel 100 ml-re betöményitjük. A betöményitett oldatot ioncserélő oszlopra visszük, melyet előzőleg úgy készítünk el, hogy a 2,5 x 15 cm méretű oszlopba 70 ml 50 mM trisz-HCl pufferben 70 DEAE Trisacryl gyantát (LKB-Produkter AB, Svédország) töltünk. A Trisacryl ágyat tízszeres oszloptérfogatú 50 mM trisz-HC1 pufferrel kiegyenlítjük. A tisztítandó anyag felvitele után az elúciót tízszeres oszloptérfogatnyi 50 mM trisz-HCl pufferrel kezdjük, majd grádienselúcióval folytatjuk. Ehhez 300 ml össztérfogat eluenst használunk. A lineáris grádienselúció kezdeti oldata; 50 mM trisz-HCl puffer; a befejező eluens: 50 mM trisz-HCl puffer, mely 0,5 M nótrium-jdoridot tartalmaz. A sókoncentráció változásának sebessége: 0,1 M/óra; az áramlási sebesség: 60 ml/óra. Összesen 47 db 5 ml-es frakciót gyűjtünk, a frakciókat B. subtilis-szel vizsgáljuk. Az aktív 25-37. frakciókat egyesítjük és analitikai gélszűréses HPLC-nek vetjük alá. Waters Protein Analysis 1-125 oszlopot használva; az eluens 0,2 M trisz-acetát, pH = 7,0; átfolyási sebesség 1 ml/perc; detektálás 260 nm UV fényen. Az adott körülmények között egyetlen csúcs jelenik meg a kromatogramon 8,3 perces retenciós idővel. Az összegyűjtött frakciók egyneműségét izoelektromos fókuszálás! módszerrel és SDS-PAGE módszerrel is. igazoljuk az előzőekben már ismertetett eljárások szerint. Fagyasztva szárítással - a puffer töme-1121

HU 201119 Β gének figyelembevételével - megállapított hatóanyagkoncentráció: 4,25 mg/ml. A termék fizikai állandóit a leírás bevezető részében adtuk meg.

Claims

1. Eljárás kedarcidin antibiotikum előállítására, melynek jellemzői: 10

a) megjelenése: barnássárga, szilárd anyag;

b) molekulatömeg: 12400 Dalton nátrium-dodecil-szulfátos poliakril-amid gél elektroforézissel meghatározva és 17 000 Dalton gélszüréses/HPLC módszerrel 15 meghatározva;

c) UV-spektrum: 2. ábra;

dl izoelektromos pont: 3,65; és el a polipeptidrész aminosav-sorrcndje:

X-ala-ala-val-ser-val-ser- pro-ala-thr- 20

-gly-leu-ala-aspgly-ala-thr-val-thr-val-ser-ala-ser-gly- p he-ala- thr- serthr-ser-ala-thr-ala-leu-gln-cys-ala-ile-leu-ala-asp-gly- 25 arg-gly-ala-cys-asn-val-ala-glu-phe-his-asp-phe-serleu-ser-gly-gly-glu-gly-thr-thr-sei—val-val-val-arg-argser-phe-thr-gly-t.v r-val-met-pro-asp- 30 -gly-pro-glu-val-glyala-val-asp-cys-asp-thr-ala-pro-gly-gly-cys-gln-ile-valval-gly-gly-asn-thr- gly-glu-tyr-gly-asn-ala-ala-ile-ser-phe-gly-OH, ahol 35

X jelentése H-ala-ser, H-ser vagy hidrogénatom, azzal jellemezve, hogy a kedarcidint termelő Streptoalloteichus sp. L-585-6 jelű ATCC 53650 deponálási számú törzset vagy annak 40 kedarcidint termelő mutánsát vagy variánsát asszimilálható szénforrást és nitrogénforrást tartalmazó táptalajban süllyesztett tenyészetként aerob körülmények között tenyésztjük, és az antibiotikumot a fermentléből kinyer- 45 jük.

2. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított kedarcidint gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyagok- 50 kai és egyéb segédanyagokkal szokásos dózisformává alakítunk.