FR2665363A1

FR2665363A1 - Composition pharmaceutique comprenant une ou des bleomycines, et une ou des proteines inactivant les bleomycines.

Info

Publication number: FR2665363A1
Application number: FR9009753A
Authority: FR
Inventors: Durand Henri Paul
Original assignee: Cayla
Current assignee: Cayla
Priority date: 1990-07-31
Filing date: 1990-07-31
Publication date: 1992-02-07
Anticipated expiration: 2010-07-31
Also published as: FR2665363B1; WO1992002230A1

Abstract

La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins un antibiotique de la famille des bléomycines et au moins une protéine inactivant la dite ou lesdites bléomycines administrable avant, pendant et/ou après l'administration des bléomycines. Elle a pour objet de réduire les effets secondaires induits par les bléomycines au niveau de certains organes. Les protéines inactivant les bléomycines peuvent être produites par une souche de Tolypocladium geodes transformée.

Description

La présente invention concerne une composition pharmaceutique à base d'antibiotiques de la famille des bléomycines d'une part, et de protéines inactivant les bléomycines d'autre part, dans laquelle les effets secondaires induits par les bléomycines au niveau de certains organes seront considérablement réduits.

Les bléomycines sont des antibiotiques antitumoraux découverts en 1966 (Umezawa et coll., 1966) qui sont très largement utilisés, seuls ou en association avec d'autres molécules pour le traitement des cancers. L'intérêt des bléomycines réside dans leur activité élevée contre des tumeurs variées (lymphomes, carcinomes testiculaires, carcinomes des cellules squameuses ...) et leur faible toxicité hépatique, rénale et vis à vis de la moëlle osseuse qui les distinguent de la plupart des autres antitumoraux. Cependant une limitation importante à l'utilisation des bléomycines est leur toxicité pulmonaire, caractérisée par l'apparition fréquence de fibroses interstitielles irréversibles et souvent létales chez les patients traités à haute dose (J.M. Bennett et S.D. Reich, 1979).Cet effet est dose-dépendant et cumulatif ; il a pu être reproduit sur différents modèles animaux (pour revue. J.H. Harrison Jr et J.S. Lazo, 1987) les bléomycines constituent même un outil pour l'étude expérimentale des fibroses pulmonaires (I.H. Raisfeld, 1978).

Des gènes bactériens de résistance aux antibiotiques de la famille des bléomycines ont été décrits. Sous la dénomination générique phléor, ils ont été clonés et incorporés dans des cellules procaryotes et eucaryotes. Cela permet d'utiliser les antibiotiques de la famille des phléomycines à titre de marqueur de sélection dans le domaine du génie génétique (brevet FR 84 13502) (brevet EP 85 904261-6). Le gène phléor peut être porté par un vecteur de clonage ou d'expression, ou bien intégré dans un chromosome de la cellule qui exprimera ce caractère de résistance aux phléomycines. Les gènes peuvent s'exprimer chez des procaryotes ou des eucaryotes supérieures ou inférieures, c'est-à-dire notamment chez les bactéries, les levures, les champignons, les cellules animales ou végétales.

On a ainsi pu obtenir une souche recombinante de champignon filamenteux Tolyplocladium geodes, exprimant un gène de résistance aux phléomycines. L'adjonction en amont dudit gène d'une séquence signal fongique a permis l'excrétion de la protéine de résistance dans le milieu de culture (demande de brevet francais n" 89 08838).

La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique comprenant au moins un antibiotique de la famille des bléomycines et au moins une protéine inactivant ladite ou lesdites bléomycines administrables avant, pendant et/ou après l'administration des blé omycin es.

La terminologie bléomycine désignera ci-après aussi bien les bléomycines elles-mêmes que les glycopeptides antibiotiques de la même famille.

Il s'agit notamment des mélanges de bléomycines qui diffèrent essentiellement par la fonction amine terminale ou des produits isolés, bléomycine A ou bléomycine B et notamment bléomycine A2, mais également des produits tels que les phléomycines, tallysomycines, platomycines, victomycines et qui sont préparés notamment à partir des microorganismes suivants - Streptomyces verticillus ATCC 15003 (bléomycines) - Streptomyces verticillus ATCC 21678 (bléomycines) - Streptomyces verticillus ATCC 21890 (phléomycines) - Streptomyces flavoridis ATCC 21892 (phléomycines) - Streptoalloteichus hindustanus ATCC 31158 (tallysomycines) - Streptosporangium
violaceochromogenes sub. sp. ATCC 21893 (platomycines)
globophilum - Streptosporangium
violaceochromogenes ATCC 21807 (victomycines) - Streptomyces toyocaensis ATCC 31248 (S.F. 1771)
Les antibiotiques de la famille des bléomycines, après administration par voie générale, présentent une activité élevée contre des tumeurs variées. Mais si leur toxicité hépatique, rénale, et vis à vis de la moëlle osseuse est faible, les bléomycines présentent une toxicité pulmonaire élevée chez l'homme et chez certaines espèces animales.

L'utilisation de protéines inactivant les bléomycines en cause permet de réduire les effets secondaires desdites bléomycines.

Il peut s'agir notamment - d'enzymes qui scindent les bléomycines en produits pas ou peu toxiques
tels que les hydrolases, - d'enzymes qui modifient les bléomycines en produits pas ou peu toxiques
tels que les transférases, - les protéines qui complexent les bléomycines, notamment les protéines de
fixation aux bléomycines.

Dans ce qui suit, on se réfère aux figures ci-anexées sur lesquelles
La FIGURE 1 représente le gène Ble du plasmide PUBîlO
La FIGURE 2 représente le gène Ble Tn5 du transposon Tn5
La FIGURE 3 représente le gène Ble Sh de Streptoalloteichus hindustanus
La FIGURE 4 représente le gène Ble 990 de Streptomyces sp CL990
La FIGURE 5 représente la comparaison des séquences protéiques de 4 protéines codées par les gènes Ble de Streptoalloteichus hindustanus (Sh), de Streptomyces sp CL990 (S990), du plasmide pUB110 (PUBîlO) et du transposon TN5 (TN5).

La FIGURE 6 représente le gène de la bléomycine acétyl tranférase de streptomyces sp CL990
La FIGURE 7 représente le plasmide PUT751
On a pu identifier des protéines inactivant les bléomycines de différents types, certaines étant isolées à partir de tissus animaux, d'autres étant codées par des gènes bactériens de résistance aux antibiotiques.

- La bléomycine hydrolase a été purifiée à partir de poumons de lapin (Sebti et al. 1987). Sa présence a pu être correlée à la plus ou moins grande sensibilité de certains tissus à la toxicité des bléomycines.

Son activité est élevée dans les tissus sains et dans les tumeurs résistantes aux bléomycines, dans les poumons de lapin et d'espèces résistant à la toxicité des bléomycines. Cette activité est pratiquement nulle dans les poumons et dans les tumeurs sensibles. A l'intérieur d'une même espèce, la souris, des différences de sensibilité constatées entre différentes lignées pourraient être correlées à l'activité bléomycine hydrolase pulmonaire. Son mode d'action est connu : elle agit en hydrolysant la liaison carboxamide de la partie aminoamilamide de la molécule, qui est ainsi transformée en déaminogléomycine, pratiquement inactive.

- La bléomycine acétyltransférase est une enzyme de résistance bactérienne, mise en évidence récemment. Cette enzyme est capable de transférer le groupement acétyl de l'AcétylCoA sur les bléomycines, produisant une molécule acétylée, inactive. La séquence nucléotidique du gène de la bléomycine acétyltransférase a été déterminée chez Streptomyces Sp. CL990 et la séquence de la protéine en a été déduite. La séquence de ce gène est représentée sur la figure 6.

- Les protéines bactériennes de résistance aux antibiotiques de la famille des bléomycines, agissent en complexant l'antibiotique. Les gènes correspondant aux protéines de ce groupe ont été isolés et clones chez différentes espèces bactériennes.

Parmi les protéines de fixation aux bléomycines, il faut citer en particulier les protéines correspondant aux protéines de la figure 5 - Protéine Sh, - protéine S 990, - Protéine pUB 110, - Protéine Tn 5, ainsi que leurs dérivés actifs.

Les dérivés actifs peuvent être déduits de l'analyse des homologies . Parmi ces dérivés, il faut citer les dérivés glycosylés ou non, les dérivés de type Met-protéine lorsque le produit est d'origine bactérienne ou bien des dérives comportant une extension N-terminale notamment un radical glutaminyl qui améliore la stabilité de la protéine par cyclisation en pyroglutamyl.

Un des gènes codant pour ce type d'enzymes est porté par le plasmide naturel pUB110 de Staphylococcus aureus (Armau et coll., 1984, Mac Kenzie et coll., 1986), un autre par le transposon Tn5 d'Escherichia coli (Armau et coll., 1984, Genilloud et coll., 1984, Mazodier et coll., 1985).

D'autres gènes ont été clonés à partir du génome d'organismes producteurs d'antibiotiques de la famille des bléomycines, comme Streptoalloteichus hindustanus (Armau et coll., 1984) ou Streptomyces sp. CL990. Les figures 1 à 4 représentent les séquences nucléotidiques des 4 gènes de résistance mentionnés ci-dessus. Ces séquences nucléotidiques, provenant d'organismes très différents, présentent très peu d'homologie. En revanche, les protéines codées par ces gènes sont assez fortement homologues sur le plan de leur structure primaire (figure 5) et sur celui de leurs propriétés physicochimiques, poids moléculaires, point isoélectrique, profil d'hydropathie.

Le mode d'action de la protéine codée par le gène de S.

hindustanus dénommée protéine Sh a été élucidé (Gatignol et coll., 1988).

L'inactivation de l'antibiotique a lieu par formation d'un complexe équimoléculaire réversible mais très fort avec la protéine. I1 est probable que le mécanisme d'action des autres protéines mentionnées sur la figure 5 est identique. L'antibiotique ainsi complexé ne possède plus d'activité antimicrobienne et son action in vitro de cassure de 1'ADN catalysée par l'oxygène et le fer est inhibée.

La présente invention propose donc d'associer l'administration de bléomycines par voie générale, en particulier parentérale, et l'administration de protéines inactivant les bléomycines par un mécanisme quelconque, notamment l'un de ceux décris ci-dessous.

L'administration des protéines inactivant les bléomycines se fera de façon à se concentrer sur ou dans certains organes, notamment par une voie évitant le passage systémique, de façon à localiser cette activité à un organe déterminé sur lequel se concentre la toxicité. L'activité antitumorale des bléomycines sur les tissus cibles ne sera ainsi pas entravee. Par contre, les effets toxiques indésirables pourront être contre-carrés. La protection d'un organe déterminé contre la toxicité des bléomycines pourra donc être réalisée, dès l'instant qu'une voie est disponible pour l'administration des protéines inactivant les bléomycines.

L'administration de ces protéines inactivant les bléomycines devra être réalisée de telle sorte que leur action soit simultanée à celle des bléomycines. Les protéines inactivatrices pourront donc être administrées préalablement aux bléomycines, de façon à ce que la concentration en protéines inactivatrices s'équilibre et à réaliser une imprégnation de l'organe à protéger.

L'administration des protéines inactivatrices pourra être réalisée en même temps que celle des bléomycines.

Selon la biodisponibilité des bléomycines dans l'organe considéré, l'administration des protéines inactivatrices pourra se faire après celle des bléomycines. On pourra bien entendu combiner ces différentes cinétiques d'administration.

L'une des applications de cette invention est la protection contre les fibroses pulmonaires induites par les bléomycines. L'administration des protéines inactivant les bléomycines sera avantageusement réalisée par voie d'aérosol, qui assure une bonne diffusion pulmonaire du produit.

Une autre voie d'abord envisageable est l'injection intrapleurale, qui permet en outre d'atteindre les ganglions pulmonaires, inaccessibles par les autres voies.

L'un des aspects de cette invention concerne l'obtention des protéines inactivant les bléomycines en grande quantité, purifiées. Nous avons considéré plus particulièrement la composition pharmaceutique incluant des protéines complexant les bléomycines comme protéines inactivatrices.

Les gènes de résistance aux bléomycines, et particulièrement les gènes ble Sh et ble Tn5 ont été clonés et exprimés chez différents organismes : bactéries, levures (Gatignol et coll., 1989, Gaillardin et Ribet, 1988), champignons (Durand et coli., 1987, Kolar et colle., 1988, van
Engelenburg et coll., 1989), cellules animales (Mulsant et coll., 1988), cellules végétales (Hille et coll., 1986, Perez et coll., 1989) conférant aux clones ainsi obtenus une résistance élevée aux antibiotiques de la famille des bléomycines. La protéine de résistance est normalement intracellulaire mais après fusion avec un peptide signal approprié, on a pu obtenir l'excrétion de la protéine dans l'espace périplasmique d'E. coli (Gatignol et coll. 1988) et dans le milieu de culture par le champignon Tolypocladium geodes (H. Durand et T.Calmels, demande de brevet français n 89 08838) déficient en protéases et poussant dans un milieu relativement simple. Dans ce dernier cas, la sélection de clones fortement résistants a conduit à des productions de protéine Sh extracellulaire de l'ordre de 2 g/l en 6 jours de fermentation. Une telle productivité, alliée à la facilité de purification de la protéine Sh a permis d'envisager sa production à grande échelle à des fins thérapeutiques.

I1 convient d'ajouter que la construction utilisée a conduit à l'excrétion d'une protéine comportant 2 acides aminés supplémentaires : une glutamine et une alanine en N-terminal par rapport à la protéine d'origine. La présence d'un résidu glutamine en N-terminal rend, après cyclisation spontanée en pyroglutamyl, la protéine insensible à la réaction d'Edman (ce qui a été vérifié expérimentalement) ainsi qu'à l'attaque par les aminopeptidases, enzymes largement répandues dans les tissus animaux et particulièrement dans les tissus pulmonaires.

La protéine Sh peut être préparée à partir d'un surnageant de culture de Tolypocladium geodes transformé par le plasmide pUT720. On le purifie par chromatographie sur colonne échangeuse d'ions et sur phénylsepharose en présence de sulfate d'ammonium 1M. Après dessalage par passage sur une colonne de gel Sephadex G25 médium (Pharmacia) d'aliquots successifs, on obtient une solution titrant environ 2 g/l de protéine Sh. C'est cette solution qui sera utilisée pour l'expérimentation, après filtration sur une membrane de porosité 0,2 p.

Son efficacité à titre de traitement préventif des fibroses pulmonaires induits par les bléomycines a été vérifiée sur un lot de souris.

Ont été étudiés simultanément un lot de souris témoins ne recevant aucun traitement, un lot de souris recevant la bléomycine seule, un lot de souris recevant la protéine Sh seule, et un lot de souris traitées à la fois par la bléomycine et la solution de protéine Sh. La bléomycine était administrée par injections IV, la solution de protéine Sh par aérosol ; on a utilisé un dispositif de pulvérisation destiné à produire des aérosols pour le traitement de certaines affections ORL, la solution de protéine Sh étant administrée immédiatement après l'injection de bléomycine, pendant 4 heures. Les animaux sont exposés au traitement par cycles répétés, et sont placés dans une atmosphère normale entre chaque cycle. Six semaines après l'arrêt du traitement, les animaux sons sacrifiés et une étude histologique de leurs poumons est réalisée.

On constate une diminution significative de l'incidence des fibroses pulmonaires chez les animaux traités par la bléomycine et recevant la protéine Sh, par rapport aux animaux traités par la bléomycine seule.

L'activité protectrice de la protéine Sh a donc été démontrée.

I1 est logique de penser que des résultats similaires seront obtenus avec les protéines complexant les bléomycines telles que celles déjà identifiées, et plus généralement avec toute protéine capable d'inactiver les bléomycines, par voie enzymatique ou en les complexant.

Les exemples qui suivent concernent un mode de réalisation
Intéressant mais il est clair au vu de ce qui précéde que les protéines en cause peuvent être obtenues par des technologies qui sont connues notamment voir WO 86 01537.

Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer de façon non limitative cette invention.

EXEMPLE I : Préparation de protéine Sh purifiée
La souche de Tolypocladium geodes a été déposée à la Collection
Nationale des Cultures de microorganismes, 28 rue du Docteur Roux 75015 PARIS, sous le n" I 880.

L'obtention de clones transformants résistants à la phléomycine Indique que le gène codant pour la protéine Sh s'exprime dans la souche NC50 de Tolypocladium geodes. Cependant, la protéine n'a pas pu être mise en évidence dans les surnageants de culture des souches transformées et n'est donc vraisemblablement pas excrétée en quantité dé tectab le.

Dans l'exemple suivant, la souche NC50 a été transformée en utilisant le plasmide pUT751. Ce plasmide se caractérise par la présence, sous la dépendance du promoteur TR1 (T.Calmels, soumis à publication) du gène de la protéine Sh en amont duquel a été ajoutée une séquence signal synthétique d'excrétion (Fig.7).

Parmi les colonies résistantes, obtenues avec une fréquence de 3000 transformants par micro gramme d'ADN, une centaine ont été repiquées sur des boîtes de PDA contenant des concentrations croissantes de phléomycine, de 25 à 1000 ug/ml. 3 souches résistantes à plus de 1000 ug/ml de phléomycine ont ainsi été sélectionnées ; l'une d'elles a été cultivée en fermenteur de laboratoire dans les conditions suivantes : les spores provenant d'une boîte de PDA incubée 7 jours à 27"C ont servi à inoculer 500 ml de milieu selon Mandels contenant 20 g/l de glucose et
I g/l d'extrait de levure, réparti dans deux erlenmeyers de 1 1. Après incubation 48 h sur table agitée à 27"C, 200 rpm, cette culture a permis d'inoculer un fermenteur de 14 litres de volume total (Chemap) contenant 8 litres du même milieu. La fermentation a duré 6 jours à 27"C avec une agitation de 500 rpm et une aération de 0,5 v.v.m, le pH étant régulé supérieur à 5.0 avec de l'ammoniaque. A partir du 2ème jour, une solution stérile de glucose à 200 g/l a été introduite en continu à raison de 0,8 litres par 24 h, soit environ 20 grammes de glucose par litre et par jour.

Après 6 jours, la culture a été récoltée et centrifugée. 7 litres d'un surnageant contenant 8,3 g/l de protéines totales, dont environ 20 '?G de protéine Sh ont ainsi été obtenues. Le surnageant a été appliqué sur une colonne de chromatographie de 2 1 de volume remplie avec un gel échangeur d'anions "Q Sepharose Fast Flow" (Pharmacia) équilibrée par un tampon acétate 50 mM pH 4,5. Après lavage par 4 1 de tampon, puis par 4 1 du même tampon contenant du chlorure de sodium à 0,2 M, la protéine Sh a été éluée par le même tampon contenant du chlorure de sodium à la concentration de 0,4 M. A cette fraction, du sulfate d'ammonium cristallisé a été ajouté jusqu'à obtenir une concentration de 1 M.La solution obtenue a été appliquée sur une colonne de 1 1 de Phenyl Sepharose Fast Flow (Pharmacia) équilibrée par du tampon acétate 50 m M pH 4,5 contenant du sulfate d'ammonium à la concentration 1 M. Après lavage par le même tampon, la protéine Sh a été éluée par 2,5 1 de tampon contenant du sulfate d'ammonium à 0,6 M. Cette fraction, contenant 7,2 g de protéine dosée par la méthode de Bradford, dont plus de 95 Ó de protéine Sh (estimée par électrophorèse en gel de polyacrylamide) a été dessalée par passage successif d'aliquots de 300 ml sur une colonne de 2 1 de gel
Sephadex G25 medium (Pharmacia) équilibrée avec une solution aqueuse de chlorure de sodium à 9 g/l. La préparation ainsi obtenue contenait 6,9 g de protéine pour un volume total de 3,55 1, soit environ 2 g/l.Cette solution a été utilisée telle quelle, après filtration sur membrane de O,2 um de porosité, pour l'expérimentation sur souris décrite dans l'exemple 2 ci -après.

EXEMPLE 2 : Expérimentation sur souris
20 souris femelles C57B46 (Charles River, France) agées de 6 à 8 semaines et pesant de 17 à 20 g ont été réparties en 4 lots de 5 animaux, notés A, B, C et D. Chaque lot a été placé dans une enceinte en matière plastique et a été nourri et abreuvé ad libitum pendant toute la durée de l'expérimentation.

Le lot A n'a reçu aucun traitement et servait de témoin.

Le lot B a reçu un traitement consistant en 5 injections intraveineuses au niveau de la veine de la queue d'une solution de phléomycine D1 complexe cuivrique (Cayla). Chaque injection contenait 0,4 mg de phléomycine dissous dans 100 sul de soluté isotonique (chlorure de sodium à 9 g/l apyrogène). L'intervalle entre 2 injections était de 3 jours.

Le lot C a reçu le même traitement par la phléomycine que le lot B. De plus, immédiatement après chaque injection, les animaux étaient placés pendant 4 heures dans une enceinte en plastique de 25 x 25 x 15 cm dans laquelle était pulvérisé par un trou aménagé à cet effet, la solution de protéine Sh décrite dans l'exemple 1 ci-dessus. Le dispositif utilisé pour la pulvérisation était un appareil destiné à produire des aérosols pour le traitement de certaines affections ORL humaines (Atomizor, Saint Etienne,
France). Le réservoir de l'appareil était rempli par 50 ml de solution de protéine Sh au début du traitement et à nouveau rempli après 2 heures. La consommation totale de solution après un cycle de 4 heures de traitement était comprise entre 65 et 90 ml. A la fin de chaque cycle de traitement, les souris étaient replacées en atmosphère normale.

Le lot D a reçu 5 injections de 100 ml de soluté isotonique seul, suivies d'un traitement par aérosol de protéine Sh identique à celui appliqué au lot C.

6 semaines après l'arrêt du traitement, soit 8 semaines après le début de l'expérimentation, les animaux ont été sacrifiés et une étude histologique de leurs poumons a été pratiquée selon le protocole décrit ci-après. L'un des animaux du lot B est décèdé 24 jours après 1' arrêt du traitement. L'un des animaux du lot D présentait des symptômes d'hyperthermie et d'anorexie et a dû être sacrifié 4 jours après la fin du traitement. L'étude histologique a également été pratiquée sur ces deux individus.

Etude histologique
Après sacrifice de l'animal par injection d'une solution de pentobarbital de sodium (2 mg), 1 ml d'une solution de formaline à 10 % dans un tampon phosphate 0,1 M pH 7,1 a été injecté dans la trachée. Puis les poumons ont été prélevés et immergés dans la même solution fixatrice pendant 24 heures ou plus. Après inclusion des organes ainsi fixés dans la parafine, des coupes de 5 pm d'épaisseur ont été pratiquées au microtome les sections ont été placées sur des lames pour observation microscopique et colorées par le réactif au trichome selon Mallory.L'observation de ces coupes au microscope optique (grossissement 10X et 50X) a permis, par comparaison avec des organes d'animaux sains d'attribuer une "note" correspondant à la gravité des lésions (les tissus atteints de fibrose étant plus fortement colorés et présentant des hétérogénéités de coloration).

Ces notes sont les suivantes
0 : pas de fibrose
1: légère atteinte fibrotique
2 : atteinte modérée
3 : forte atteinte
4 : très forte atteinte
Les résultats obtenus sur les 20 animaux observés sont résumés dans le tableau ci-après.

Il a donc été constaté une diminution significative de l'incidence des fibroses pulmonaires chez les animaux traités par la phléomycine et recevant la protéine Sh par voie aérosol, par rapport aux animaux traités par la phléomycine seule. Parmi ces derniers, l'un des individus (B3) est décédé 24 jours après l'arrêt du traitement, très probablement des suite d'une très forte atteinte fibrotique. La cause de la maladie ayant nécessité le sacrifice de l'individu 4 du lot D n'a pas pu être déterminée, mais l'examen histologique pulmonaire était normal.

<tb>

Lot <SEP> Individu <SEP> n <SEP> Atteinte <SEP> fibrotique
<tb> <SEP> 1
<tb> <SEP> 2
<tb> A <SEP> 3
<tb> <SEP> 4
<tb> <SEP> 5 <SEP> 0
<tb> <SEP> 1
<tb> <SEP> 2 <SEP> 3
<tb> B <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> <SEP> 4 <SEP> 1
<tb> <SEP> 5 <SEP> 3
<tb> <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> <SEP> 2 <SEP> 0
<tb> C <SEP> 3
<tb> <SEP> 4 <SEP> 2
<tb> <SEP> 5
<tb> <SEP> 1
<tb> <SEP> 2
<tb> D <SEP> 3
<tb> <SEP> 4
<tb> <SEP> 5
<tb> : : Individu décédé 24 jours après l'arrêt du traitement ** : Individu sacrifié 4 jours après l'arrêt du traitement
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Claims

REVENDICATIONS

I) Composition pharmaceutique comprenant au moins un antibiotique de la famille des bléomycines et au moins une protéine inactivant la dite ou lesdites bléomycines administrable avant, pendant et/ou après l'administration des bléomycines.
2) Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est choisie parmi - les enzymes qui scindent les bléomycines en produits pas ou peu toxiques.

toxiques.

- les enzymes qui modifient les bléomycines en produits pas ou peu

- les protéines qui complexent les bléomycines.
3) Composition pharmaceutique selon la revendication 2, caractérisée en ce que les protéines inactivant les bléomycines sont choisies parmi - les bléomycines hydrolases - les bléomycines transférases - les protéines de fixation aux bléomycines.
4) Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est une protéine de résistance aux bléomycines, d'origine bactérienne.
5) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est une bléomycine acétyl transférase.
6) Composition pharmaceutique selon la revendication 3, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est une bléomycine hydrolase.
7) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est une protéine recombinante.
8) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 4 et 7, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est choisie parmi les protéines suivantes décrites à la figure 5.

- Protéine Sh - Protéine S 990 - Protéine PUB 110 - Protéine TN5 et leurs dérivés inactivant les bléomycines.
9) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est produite par une souche de Tolypocladium geodes transformée.
10) Composition pharmaceutique caractérisée selon la revendication 9, caractérisée en ce que la souche de Tolypocladium geodes est transformée par le plasmide pUT751 et produit la protéine Sh.
11) Composition pharmaceutique selon l'une des revendica tions 9 et 10, caractérisée en ce que la protéine Sh est purifiée à partir du milieu de culture de T. geodes.
12) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications I à Il, caractérisée en ce que la protéine inactivant les bléomycines est administrée de façon à se concentrer sur ou dans certains organes.
13) Composition pharmaceutique selon la revendication 12, caractérisée en ce que les protéines inactivant les bléomycines sont administrées par voie aérosol.
14) Composition pharmaceutique selon la revendication 12, caractérisée en ce que les protéines inactivant les bléomycines sont administrées par voie intrapleurale.
15) Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que la bléomycine est administrée par voie systém ique.