FR2693199A1 - Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, préparation et utilisation. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un nouveau polypeptide ayant une activité anti-virale, ses dérivés, leur préparation et leur utilisation.
Description
NOUVEAUX POLYPEPTIDES BIOLOGIOUEMENT ACTIFS.
PREPARATION ET UTILISATION
La présente invention concerne un nouveau polypeptide et ses dérivés, leur préparation et leur utilisation, notamment comme agents pharmaceutiquement actifs.
La présente invention concerne un nouveau polypeptide et ses dérivés, leur préparation et leur utilisation, notamment comme agents pharmaceutiquement actifs.
Plus précisément, l'invention a pour objet un nouveau polypeptide possédant la structure présentée sur la figure 1 (polypeptide I), et tout fragment ou dérivé de celui-ci.
Par dérivé, on entend au sens de la présente invention les molécules comportant par exemple des modifications au niveau de la structure primaire, telles que des délétions d'un ou plusieurs résidus, des substitutions d'un ou plusieurs résidus, et/ou des modifications au niveau d'un ou plusieurs résidus. A titre d'exemple, les résidus modifiés peuvent être des résidus susceptibles de former des ponts disulfure, ou des résidus sites de glycosylation. Le terme dérivé comprend également les molécules comportant des parties supplémentaires internes ou terminales, de nature peptidique ou non. I1 peut s'agir notamment de parties actives, de marqueurs, de stabilisants, etc. I1 peut s'agir également d'acides aminés, tels qu'une méthionine en position -1.Le terme dérivé comprend également les molécules comportant des modifications au niveau de la structure tertiaire (ponts disulfure, extrémité N-terminale, etc).
Ces dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son ou ses sites d'interaction, celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des protéases, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinetiques et/ou biologiques.
Préférentiellement, les dérivés conservent au moins une propriété du polypeptide (I), qu'il s'agisse d'une propriété physique (homologie structurale), pharmacologique (immunogénicité) ou biologique. Les dérivés peuvent également apporter de nouvelles propriétés au polypeptide de séquence (I) (marquage, ..), ou améliorer ses propriétés (stabiIité, activité biologique etc). Ils peuvent aussi posséder des propriétés équivalentes, compte tenu du caractère conservatoire de certaines modifications, ou être dépourvus de propriétés biologiques. Ce dernier type de dérivé peut en effet permettre l'identification de régions actives ou d'épitopes importants dans la structure. n peut également comprendre des antagonistes du polypeptide d).
Plus préférentiellement, l'invention concerne un polypeptide ayant la structure donnée sur la figure 1.
Le polypeptide (I) a été isolé à partir du milieu de culture d'un actinomvcete, selon le protocole décrit dans les exemples. Schématiquement, ce procédé comprend une première phase de centrifugation, élimination du surnageant, traitement du culot à l'acétone, nouvelle centrifugation, et concentration sous pression réduite du surnageant avant plusieurs étapes de chromatographie de partage et de perméation. I1 est entendu d'une part que ce procédé n'est pas limitatif, et d'autre part, que le polypeptide (I) peut être isolé à partir du milieu de culture d'autres microorganismes producteurs, identifiés par exemple par test biologique ou immunologique. Par ailleurs, ce polypeptide et ses dérivés selon l'invention peuvent être synthétisés chimiquement en utilisant les technique connues de l'homme du métier.De plus, ce polypeptide et ses dérivés selon l'invention peuvent également être synthétisés par voie génétique, par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le polypeptide (I) ou pour un dérivé de celui-ci tel que défini ci-avant.
Pour cette dernière voie de synthèse, la séquence nucléotidique peut être préparée chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique. Des exemples de telles séquences sont donnés dans les exemples. La séquence nucléotidique peut également être préparée par criblage d'une banque d'ADNc au moyen d'une sonde nucléique dérivée de la séquence du polypeptide (I). Par ailleurs, dans le cas d'une synthèse par voie génétique, certaines modifications structurales peuvent intervenir, telles que notamment l'ajout en position N-terminale d'une méthionine. I1 est bien entendu que de tels polypeptides sont couverts par la présente demande.
Un autre objet de la présente demande concerne une séquence nucléotidique codant pour le polypeptide (I) ou pour un dérivé de celui-ci tel que défini précédemment. De telles séquences peuvent être utilisées pour la production des polypeptides de l'invention ou, par des expériences d'hybridation, pour la mise en évidence et l'isolement d'autres microorganismes producteurs ou encore pour la mise en évidence et l'isolement de polypeptides homologues au polypeptide (I). Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides, etc. Ces séquences peuvent être obtenues selon les indications données ci-dessus.
Un autre objet de l'invention concerne une cellule capable de produire un polypeptide de l'invention. I1 peut s'agir d'une cellule produisant de manière naturelle ce polypeptide (polypeptide (I), polypeptide homologue ou dérivé tels que défini ci-avant), ou d'une cellule obtenue par recombinaison génétique. Une telle cellule peut être eucaryote ou procaryote. Parmi les hôtes eucaryotes utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les cellules animales, végétales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomvces, Kluvveromvces, Pichia, Schwanniomvces, ou Hansenula.
S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, etc ou les cellules d'insectes. Parmi les champignons susceptibles d'être utilisés dans la présente invention, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp.
Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes
Actinomycètes, E.coli, Bacillus, ou Streptomyces.
Actinomycètes, E.coli, Bacillus, ou Streptomyces.
A cet égard, l'invention a aussi pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini ci-avant caractérisé en ce que l'on cultive une cellule décrite ci-dessus et on isole le polypeptide produit.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides selon l'invention. Les polypeptides de l'invention possèdent en effet des propriétés pharmacologiques interessantes, en particulier des propriétés antivirales. Les polypeptides selon la présente invention sont particulièrement utiles pour la prophylaxie et le traitement du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise) et de syndromes associés [ARC (AIDS related complex)]. Ainsi qu'illustré dans les exemples, les polypeptides de l'invention et en particulier le polypeptide (I) sont inhibiteurs de l'effet cytopathogène du HIV et inhibiteurs de la production de transcriptase inverse en culture cellulaire à des concentrations dépourvues d'effet cytotoxique ou cytostatique.
Plus particulièrement, les compositions pharmaceutiques de l'invention sont destinées aux traitements d'infections virales. Encore plus particulièrement, les compositions pharmaceutiques de l'invention sont destinées aux traitements des affections liées aux virus HIV.
Par ailleurs, les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs polypeptides tels que défini ci-avant en association avec d'autres agents actifs.
D'autres avantages des polypeptides de la présente invention sont donnés dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures
Figure 1: Structure proposée du polypeptide (I).
Figure 1: Structure proposée du polypeptide (I).
Figure 2: Spectre RMN du polypeptide (I). Spectre 1H 600 MHz dans 50% CD30H / 50% H20 à 313 deg. K.
Exemples 1. Isolement du polypeptide (I)
1.1. Fermentation
Un erlen de 250 mi rempli avec 50 ml de milieu (corn steep 10 g/l, saccharose 30 girl, CaC03 7,5 g/l, (NH4)2 SO4 2 g/l) est ensemencé par une culture d'actinomvcete SP9440 sous forme de culture liquide congelée. Il est agité à 250 t/mn dans un agitateur thermostaté à 28 C.
1.1. Fermentation
Un erlen de 250 mi rempli avec 50 ml de milieu (corn steep 10 g/l, saccharose 30 girl, CaC03 7,5 g/l, (NH4)2 SO4 2 g/l) est ensemencé par une culture d'actinomvcete SP9440 sous forme de culture liquide congelée. Il est agité à 250 t/mn dans un agitateur thermostaté à 28 C.
Après 72 heures, 2 à 5 to de cette culture sont transférés dans un erlen de 2 litres rempli avec 250 ml du même milieu. Il est agité pendant 72 heures à 150 t/mn dans un agitateur thermostaté à 280C.
La totalité de cette culture est alors transférée stérilement dans un fermenteur rempli avec 45 litres du même milieu. Le fermenteur est agité à 400 t/mn, aéré à 4 m3/h et thermostaté à 280C pendant 48 heures.
40 litres de cette culture sont alors transférés dans un fermenteur de production avec 400 litres de milieu stérilisé 40 minutes à 1220C (extrait de levure 10 g/l, glucose 30 g/l, CaC03 5 g/l, NaCI 20 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4 1 g/l).
Pendant 192 heures il est maintenu à une température constante de 280C, agité à 150 t/mn et aéré à raison de 15 m3/t.
1.2. Extraction et purification
Le moût entier (440 litres) est centrifugé à l'aide d'une centrifugeuse à autodébourdage Westphalia. Le surnageant est écarté. Le culot est repris par 300 litres d'acétone pour délitage pendant 2 heures, les débris cellulaires sont écartés par centrifugation. Le surnageant est concentré sous vide pour éliminer l'acétone jusqu'à un volume de 60 litres ; les 60 litres de phase aqueuse sont percolés sur une colonne en acier inoxydable 20 x 60 cm contenant 30 litres de résine DUOLITE
S861.
Le moût entier (440 litres) est centrifugé à l'aide d'une centrifugeuse à autodébourdage Westphalia. Le surnageant est écarté. Le culot est repris par 300 litres d'acétone pour délitage pendant 2 heures, les débris cellulaires sont écartés par centrifugation. Le surnageant est concentré sous vide pour éliminer l'acétone jusqu'à un volume de 60 litres ; les 60 litres de phase aqueuse sont percolés sur une colonne en acier inoxydable 20 x 60 cm contenant 30 litres de résine DUOLITE
S861.
La colonne est rincée par 60 litres d'eau. La chromatographie est effectuée par un gradient par paliers MeOH/H20 avec un débit de 30 litres/heure.
La première fraction (60 litres) correspond à l'éluant MeOH/H2O 20/80 v/v.
La deuxième fraction (30 litres) à MeOH/H2O 50/50 v/v.
La troisième fraction (60 litres) à 100 % MeOH.
Le polypeptide (I), détecté par chromatographie sur couche mince, est présent dans la troisième fraction. Le méthanol de cette fraction est chassé sous vide pour obtenir 10 litres de phase aqueuse. Cette solution aqueuse est ensuite percolée sur une colonne en verre de 10 cm de diamètre contenant 1,2 litre de support chromatographique DIAION HP20 Mitsubishi afin d'adsorber le polypeptide (I).
Après rinçage par 11 litres d'eau, on élue avec 8 litres de méthanol. Cette phase méthanolique contenant le polypeptide (I) renferme 64 g de solide.
La prochaine étape de purification est une chromatographie liquide haute pression avec une précolonne en acier inoxydable 2" x 5 cm et une colonne en acier inoxydable HP Chemicals 3" x 50 cm garnie de silice greffée C18 Amicon (20 , 100A). Le débit de 200 ml/minute est obtenu à l'aide d'une pompe à piston Lewa (Sartrouville, France) type EK16, les fractions de 800 ml sont collectées avec un collecteur de fractions Pharmacia (Uppsala, Suède) type PF30. Les 8 litres de phase méthanolique sont étendus à 16 litres avec de l'eau et sont percolés sur la colonne qui est rincée avec 2 litres de MeO1/H2O 50/50 v/v.
L'élution s'effectue par paliers successifs de MeOH/H2O: - 60/40 v/v pour les fractions 1 à 6, - 70/30 v/v pour les fractions 7 à 13, - 80/20 v/v pour les fractions 14 à 30.
Les différentes fractions sont analysées par chromatographie sur couche mince (CCM) sur plaque de silice Merck 60F254 avec l'éluant EtOAc/AcOH/H2O 60/12/10 v/v/v. Dans ce système le polypeptide (I) recherché migre à un rapport frontal (RF) égal à 0,25, est visible sous UV à 254 nm et se révèle au réactif de Greig et Laeback. Les fractions 10 à 18 contenant le polypeptide (I) sont collectées, les autres fractions sont écartées. Le poids sec de ces fractions 10 à 18, estimé sur une partie aliquote, est de 9,6 g.Leur volume est étendu avec de l'eau pour être amené à une composition MeOH/H20 50/50 v/v, avant d'être percolées sur une colonne cylindrique en verre de 13 cm de diamètre interne contenant 450 ml de silice greffée
C18 BONDESIL 40pL L'effluent est écarté, le polypeptide (I) est élué par 4,5 litres de méthanol. Cette phase méthanolique est concentrée sous vide pour donner 9,2 g d'extrait sec.
C18 BONDESIL 40pL L'effluent est écarté, le polypeptide (I) est élué par 4,5 litres de méthanol. Cette phase méthanolique est concentrée sous vide pour donner 9,2 g d'extrait sec.
L'étape suivante de purification consiste en une chromatographie de perméation sur support LH20 (Pharmacia, Uppsala, Suède) effectuée sur des parties aliquotes de cet extrait sec. 586 mg sont dissous dans 11 ml d'un mélange MeOlVDMSO 10/1 v/v qui est déposé au sommet d'une colonne cylindrique en verre de 30 mm de diamètre interne et de 150 cm de hauteur. L'élution s'effectue dans le méthanol à 1 ml/minute. Les fractions de 15 ml sont collectées avec un collecteur
LKB 7000 Ultrorack. Le polypeptide (I) est localisé dans les fractions 19 à 26 qui sont réunies, évaporées sous vide pour donner 445 mg d'une poudre beige clair.
LKB 7000 Ultrorack. Le polypeptide (I) est localisé dans les fractions 19 à 26 qui sont réunies, évaporées sous vide pour donner 445 mg d'une poudre beige clair.
Cette poudre peut être décolorée par chromatographie liquide sur colonne de silice greffée C18. On utilise un réservoir Analytichem International de 75 ml 2,5 cm de diamètre interne contenant 30 ml de silice greffée C18 (Matrex silica C18 Amicon 20 , 60A). 223 mg de cette poudre beige sont solubilisés par 60 ml d'un mélange MeOH/HCl 0,1N 50/50 v/v. Cette solution est percolée sur la colonne qui est ensuite rincée par 60 ml d'un mélange MeOH/H2O 55/45 v/v, avec un débit de 10 ml/minute.
L'élution s'effectue au même débit par paliers successifs de MeOHIH2O: - 65/35 v/v pour les fractions 1 à 15, - 70/30 v/v pour les fractions 16 à 30, - 80/20 v/v pour les fractions 31 à 52, - 85/15 v/v pour les fractions 53 à 62, - 90/10 v/v pour les fractions 63 à 88.
Toutes les fractions sont de 5 ml.
Après évaporation sous pression réduite des fractions 42 à 65, on obtient 143 mg du polypeptide (I) sous forme d'une poudre blanche.
Un échantillon de la souche actinomvcete SP9440 a été déposé le 18 Mai 1992 au Centraalbureau voor Schimmelcultures à Baarn (Pays-Bas) selon le régime du Traité de Budapest sous le numéro d'enregistrement CBS 257.92.
2. Caracterisation physico-chimique
2.1. Masse moleculaire
La masse chimique du polypeptide (I) déterminée par spectrométrie de masse à l'aide d'un Autospec (VG) est de 2163,4 Da.
2.1. Masse moleculaire
La masse chimique du polypeptide (I) déterminée par spectrométrie de masse à l'aide d'un Autospec (VG) est de 2163,4 Da.
2.2. Structure
La structure du polypeptide (I) a été déterminée en plusieurs étapes et en combinant les résultats de plusieurs types d'analyses (séquençage, RMN, analyse élémentaire, Masse, Infrarouge et Raman).
La structure du polypeptide (I) a été déterminée en plusieurs étapes et en combinant les résultats de plusieurs types d'analyses (séquençage, RMN, analyse élémentaire, Masse, Infrarouge et Raman).
L'analyse par RMN et l'analyse élémentaire ont permis de déterminer la présence dans le polypeptide (I) de 4 résidus cystéines et d'un résidu tryptophane.
Les premiers essais de séquençage en utilisant la dégradation d'Edman se sont révélés infructueux. Des quantités très importantes de matériel déposées sur le séquenceur n'ont donné que des signaux très faibles, indiquant qu'il n'existe pas dans la molécule d'extrémité NH2-terminale. Différents essais de fragmentation ont donc été réalisés. Le polypeptide (I) n'est pas dégradé par la trypsine, la protéase V8, ou la chymotrypsme.
La composition en acides aminés a donc été déterminée après hydrolyse totale du polypeptide (I) par traitement avec une solution d'HCl 6N à 1560C pendant 75 minutes. Cette analyse a donné les résultats suivants:
<tb> Acide <SEP> Aminé <SEP> % <SEP> Mol <SEP> S.C.1 <SEP> S.P.2
<tb> <SEP> Asx <SEP> 12,28 <SEP> 1,998 <SEP> 2
<tb> <SEP> Ser <SEP> 6,09 <SEP> 0,991 <SEP> 1
<tb> <SEP> Gly <SEP> 24,33 <SEP> 3,959 <SEP> 4
<tb> <SEP> Ala <SEP> 12,91 <SEP> 2,101 <SEP> i <SEP> 2
<tb> <SEP> Tyr <SEP> 6,77 <SEP> 1,101 <SEP> 1
<tb> <SEP> Val <SEP> 12,48 <SEP> 2,03 <SEP> 2
<tb> <SEP> Ile <SEP> 6,21 <SEP> 1,01 <SEP> 1
<tb> <SEP> Leu <SEP> 6,08 <SEP> 0,989 <SEP> 1
<tb> <SEP> Phe <SEP> 12,73 <SEP> 2,071 <SEP> 2
<tb> 1 Stoechiométrie calculée 2 Stoechiométrie proposée
Cette analyse ne permet pas d'identifier les cystéines et les tryptophanes.
<tb> <SEP> Asx <SEP> 12,28 <SEP> 1,998 <SEP> 2
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<tb> <SEP> Gly <SEP> 24,33 <SEP> 3,959 <SEP> 4
<tb> <SEP> Ala <SEP> 12,91 <SEP> 2,101 <SEP> i <SEP> 2
<tb> <SEP> Tyr <SEP> 6,77 <SEP> 1,101 <SEP> 1
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<tb> <SEP> Ile <SEP> 6,21 <SEP> 1,01 <SEP> 1
<tb> <SEP> Leu <SEP> 6,08 <SEP> 0,989 <SEP> 1
<tb> <SEP> Phe <SEP> 12,73 <SEP> 2,071 <SEP> 2
<tb> 1 Stoechiométrie calculée 2 Stoechiométrie proposée
Cette analyse ne permet pas d'identifier les cystéines et les tryptophanes.
Combinés avec les résidus identifiés par RMN et analyse élémentaire, ces résultats donnent la composition du polypeptide (I) et une masse chimique calculée de 2168,5 daltons. La différence avec la masse déterminée en spectrométrie de masse indique (i) que les cystéines sont oxydées en cystines, (ii) que le polypeptide (I) est cyclique et
(iii) qu'il entre une asparagine dans sa composition.
(iii) qu'il entre une asparagine dans sa composition.
La structure a finalement pu être élucidée par séquençage de fragments résultant d'une hydrolyse acide ménagée et recoupement avec la structure proposée par l'étude RMN.
- La structure proposée résultant de cette étude est présentée sur la figure 1.
- Le spectre RMN (1H 600 MHz dans 50 to MeOH deutérié / 50 to H20 à 313 degrés Kelvin) est présenté sur la figure 2.
. Spectre de masse: VG Autospec, ionisation LSIMS ("Liquid Secondary
Ion Mass Spectrometry" ion césium Cs+ à 35 KeV, matrice NBA: [M+H]+ M/Z 2164,4; [M+Na]+ M/Z 2186,4; [2M+H]+ M/Z 4326,1.
Ion Mass Spectrometry" ion césium Cs+ à 35 KeV, matrice NBA: [M+H]+ M/Z 2164,4; [M+Na]+ M/Z 2186,4; [2M+H]+ M/Z 4326,1.
3. Svnthèse de séquences nucléotidiques
Les séquences d'ADNc suivantes peuvent être synthétisées en utilisant les techniques classiques de synthèse d'ADN connues de l'homme du métier:
TGTTTAGGTATTGGTAGTTGTAGTGATTTTGCCGGTTGTGTTATGCCGTT
GTTTGTTTTTGG
TGCCTGGGGATAGGGAGCTGTAACTGTAACGACTTTGTGGGGATGCGGATACGCGGT GGTGTGrIT'TGG
Ces séquences codent pour le polypeptide (I). D'autres séquences peuvent être synthétisées codant pour des fragments ou dérivés du polypeptide (I).
Les séquences d'ADNc suivantes peuvent être synthétisées en utilisant les techniques classiques de synthèse d'ADN connues de l'homme du métier:
TGTTTAGGTATTGGTAGTTGTAGTGATTTTGCCGGTTGTGTTATGCCGTT
GTTTGTTTTTGG
TGCCTGGGGATAGGGAGCTGTAACTGTAACGACTTTGTGGGGATGCGGATACGCGGT GGTGTGrIT'TGG
Ces séquences codent pour le polypeptide (I). D'autres séquences peuvent être synthétisées codant pour des fragments ou dérivés du polypeptide (I).
4. Caractérisation biologique
4.1. Spectre d'activité antibiotique
A partir d'une solution mère de polypeptide (I) à 2,56 g/l de substance active, une gamme de dilution de raison 2 est réalisée en eau distillée stérile (de 2560 à 0,3 mg/l). 1 ral de chaque dilution est incorporé dans un tube contenant 19 ml de gélose Mueller Hinton maintenue en surfusion (dilution 1/20). L'ensemble est coulé immédiatement en boites de Pétri. Après refroidissement et séchage, l'ensemensement des souches bactériennes est réalisé avec un inoculateur multipoint qui dépose 104 colonies formant unité (cfu) de chaque souche bactérienne étudiée à la surface de la gélose.Après incubation des boites 18 heures à 37 C, la concentration minimale inhibitrice (CMI en mg/l) du polypeptide (I), soit la plus petite concentration qui inhibe totalement la croissance bactérienne des souches testées est déterminée. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. Ils montrent que le polypeptide (I) ne possède pas d'activité antibactérienne notable, et en particulier qu'il a une faible activité sur les cocci à Gram positif.
4.1. Spectre d'activité antibiotique
A partir d'une solution mère de polypeptide (I) à 2,56 g/l de substance active, une gamme de dilution de raison 2 est réalisée en eau distillée stérile (de 2560 à 0,3 mg/l). 1 ral de chaque dilution est incorporé dans un tube contenant 19 ml de gélose Mueller Hinton maintenue en surfusion (dilution 1/20). L'ensemble est coulé immédiatement en boites de Pétri. Après refroidissement et séchage, l'ensemensement des souches bactériennes est réalisé avec un inoculateur multipoint qui dépose 104 colonies formant unité (cfu) de chaque souche bactérienne étudiée à la surface de la gélose.Après incubation des boites 18 heures à 37 C, la concentration minimale inhibitrice (CMI en mg/l) du polypeptide (I), soit la plus petite concentration qui inhibe totalement la croissance bactérienne des souches testées est déterminée. Les résultats sont présentés dans le tableau 1. Ils montrent que le polypeptide (I) ne possède pas d'activité antibactérienne notable, et en particulier qu'il a une faible activité sur les cocci à Gram positif.
4.2. Activité antivirale
L'activité antivirale a été mise en évidence dans les tests suivants:
Activité vis-à-vis de l'effet cytopathogène du virus HIV.
L'activité antivirale a été mise en évidence dans les tests suivants:
Activité vis-à-vis de l'effet cytopathogène du virus HIV.
Les produits en poudre ont été mis en solution à raison de 2 mg de produit par 2 ml (environ 4 x 10-3 M) dans une solution de diméthylformamide DMF/H20 (10 to / 90 to: v/v). Le test est réalisé sur la lignée lymphoblastoide CEM clone 13.
Dans une microplaque de 96 puits on dépose 25 puits d'une solution de produit à tester dans du tampon phosphate isotonique (TPI) ou de TPI seul dans le cas des contrôles. Les produits sont étudiés à différentes concentrations (souvent 8), à raison de 6 puits par concentration. On ajoute alors 125 Cll d'une suspension de cellules
CEM (8 x 104 cellules par ml) dans le milieu RPMI contenant 10 to de sérum de veau foetal, 100 Ul/ml de pénicilline, 100 pg/ml de streptomycine et 2 prnoleslml de glutamine et les microplaques sont incubées une heure à 370C, sous une atmosphère contenant 5 % de gaz carbonique.Pour chaque concentration, l'essai est partagé en deux parties : une partie (3 puits) sur cellules infectées, pour la détermination de l'activité antivirale et l'autre partie (3 puits) sur cellules non infectées, pour déterminer la cytotoxicité des produits. On infecte alors la première série avec HIV-1 (100 tl par puits d'une suspension de virus LAV-1-BRU contenant 200-300 TCID50) tandis que l'autre série reçoit 100 p1 de milieu RPMI tel que défini précédemment. Au bout de 7 jours d'incubation, 100 l de cellules sont prélevés pour mesurer la viabilité cellulaire [déterminée selon une modification de la technique décrite par R. Pauwels et coll., J. Virol. Meth., AQ, 309-321 (1988)]. On ajoute à ce prélèvement 10 Cll d'une solution contenant 7 mg de MIT [bromure de 3-(4,5-diméthyl 2-thiazolyl)-2,5- diphényltétrazolium] par ml de tampon phosphate isotonique. Après 3 heures d'incubation à 37 C le surnageant est enlevé. Le MIT est converti en un sel de formazan (bleu) uniquement à l'intérieur des cellules vivantes. On ajoute alors 100 l d'isopropanol (contenant 0,04 mole/l d'acide chlorhydrique) et les microplaques sont agitées jusqu'à la solubilisation du bleu de formazan. L'absorbance à 540 nm est lue avec un lecteur automatique de réactions ELISA en microplaques. Cette absorbance est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes.
CEM (8 x 104 cellules par ml) dans le milieu RPMI contenant 10 to de sérum de veau foetal, 100 Ul/ml de pénicilline, 100 pg/ml de streptomycine et 2 prnoleslml de glutamine et les microplaques sont incubées une heure à 370C, sous une atmosphère contenant 5 % de gaz carbonique.Pour chaque concentration, l'essai est partagé en deux parties : une partie (3 puits) sur cellules infectées, pour la détermination de l'activité antivirale et l'autre partie (3 puits) sur cellules non infectées, pour déterminer la cytotoxicité des produits. On infecte alors la première série avec HIV-1 (100 tl par puits d'une suspension de virus LAV-1-BRU contenant 200-300 TCID50) tandis que l'autre série reçoit 100 p1 de milieu RPMI tel que défini précédemment. Au bout de 7 jours d'incubation, 100 l de cellules sont prélevés pour mesurer la viabilité cellulaire [déterminée selon une modification de la technique décrite par R. Pauwels et coll., J. Virol. Meth., AQ, 309-321 (1988)]. On ajoute à ce prélèvement 10 Cll d'une solution contenant 7 mg de MIT [bromure de 3-(4,5-diméthyl 2-thiazolyl)-2,5- diphényltétrazolium] par ml de tampon phosphate isotonique. Après 3 heures d'incubation à 37 C le surnageant est enlevé. Le MIT est converti en un sel de formazan (bleu) uniquement à l'intérieur des cellules vivantes. On ajoute alors 100 l d'isopropanol (contenant 0,04 mole/l d'acide chlorhydrique) et les microplaques sont agitées jusqu'à la solubilisation du bleu de formazan. L'absorbance à 540 nm est lue avec un lecteur automatique de réactions ELISA en microplaques. Cette absorbance est proportionnelle à la quantité de cellules vivantes.
Le taux de protection (en %) d'un produit donné est déterminé à partir des densités optiques (DO) par la formule:
DO(cell. traitées et inf.)-DO(cell. non traitées et inf.)
DO(cell. traitées et non inf.)-DO(cell. non traitées et inf.)
Le cas échéant la concentration inhibitrice 50 % est déterminée. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Ils montrent que la CI50 du polypeptide (I) sur l'effet cytopathogène du virus HIV est comprise entre 1 et 3 pg/ml.
DO(cell. traitées et inf.)-DO(cell. non traitées et inf.)
DO(cell. traitées et non inf.)-DO(cell. non traitées et inf.)
Le cas échéant la concentration inhibitrice 50 % est déterminée. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Ils montrent que la CI50 du polypeptide (I) sur l'effet cytopathogène du virus HIV est comprise entre 1 et 3 pg/ml.
Détermination de la multiplication virale par dosage de la transcriptase mverse du virus HIV
L'activité de la transcriptase inverse est mesurée directement sur 50 lji de surnageant de culture. Selon la méthode décrite par O. Schwartz et coll., AIDS
Research and Human Retrovirus 4(6), 441-448 (1988). 10 lji de tampon contenant 0,5 M de KCl, 5 mM de dithiothreitol (DTT) et 0,5 to de triton X-100 sont ajoutés à tous les micropuits contenant les 50 lji de surnageant à tester. 40 lji de tampon contenant les 1,25 mM d'éthylène glycol-bis (2-aminoéthyl éther) (EGTA), 0,125 mM de Tris.HCl pH 7,8, 12,5 mM de MgC12, 3 Ci de (3H) thymidine triphosphate (TTP), 0,05 DO260 d'acide polyadénylique - acide thymidylique (poly rA-oligo dT) sont ajoutés ensuite. La microplaque est couverte au moyen d'un film plastique et incubée 60 minutes à 370C.
L'activité de la transcriptase inverse est mesurée directement sur 50 lji de surnageant de culture. Selon la méthode décrite par O. Schwartz et coll., AIDS
Research and Human Retrovirus 4(6), 441-448 (1988). 10 lji de tampon contenant 0,5 M de KCl, 5 mM de dithiothreitol (DTT) et 0,5 to de triton X-100 sont ajoutés à tous les micropuits contenant les 50 lji de surnageant à tester. 40 lji de tampon contenant les 1,25 mM d'éthylène glycol-bis (2-aminoéthyl éther) (EGTA), 0,125 mM de Tris.HCl pH 7,8, 12,5 mM de MgC12, 3 Ci de (3H) thymidine triphosphate (TTP), 0,05 DO260 d'acide polyadénylique - acide thymidylique (poly rA-oligo dT) sont ajoutés ensuite. La microplaque est couverte au moyen d'un film plastique et incubée 60 minutes à 370C.
On arrête la réaction en ajoutant 20Cl1 d'une solution glacée de 120 mM de Na4P2O7 dans 60 % d'acide trichloracétique et les échantillons sont placés 15 minutes sur le lit de glace.
Les précipités sont filtrés sur fibres de verre en utilisant un laveur de cellules (Skatron) et les filtres sont lavés avec une solution de 12 mM de Na4P207 dans 5 % d'acide trichloracétique.
Les filtres sont séchés et la radioactivité est comptée après ajout d'un liquide scintillant. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Ils montrent que la CI50 du polypeptide (I) sur l'activité de la transcriptase inverse du virus HIV est de 4 Eg/ml environ.
Tableau 1
<tb> <SEP> Ampicilline <SEP> Polypaptide
<tb> <SEP> SOUCHES <SEP> BACTERIENNES <SEP> (référence) <SEP> (I)
<tb> <SEP> CMI <SEP> en <SEP> mg/l
<tb> <SEP> Staphy. <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> P <SEP> 0.06 <SEP> 32
<tb> <SEP> Staphy. <SEP> wurcas <SEP> IP <SEP> 8203 <SEP> 0.06 <SEP> 64
<tb> <SEP> Staphy. <SEP> aureus <SEP> Deal <SEP> 32 <SEP> 32
<tb> <SEP> Staphy. <SEP> aureus <SEP> Duc <SEP> 32 <SEP> 32
<tb> <SEP> Staphy. <SEP> aureus <SEP> Lefevre <SEP> 32 <SEP> 32
<tb> <SEP> Staphy. <SEP> a,reis <SEP> Amiot <SEP> 4 <SEP> > 128
<tb> <SEP> Strepto. <SEP> pnenmonise <SEP> 4255 <SEP> 0.03 <SEP> 2
<tb> <SEP> Streto <SEP> pnenmonise <SEP> 4316 <SEP> 0.015 <SEP> 1
<tb> <SEP> Sirepto. <SEP> Groupe <SEP> A <SEP> Bacha <SEP> 0.015 <SEP> 8
<tb> <SEP> Strepto.<SEP> Groupe <SEP> B <SEP> B96 <SEP> # <SEP> <SEP> 0.06 <SEP> 8
<tb> Strepto. <SEP> Groupe <SEP> G <SEP> G <SEP> 143 <SEP> 0.03 <SEP> 16
<tb> <SEP> Strepte. <SEP> faecallis <SEP> CR <SEP> 2 <SEP> 16
<tb> <SEP> Strepto. <SEP> faecius <SEP> ATCC <SEP> 9790 <SEP> 2 <SEP> 16
<tb> <SEP> Escherichis <SEP> coli <SEP> NIHJ-JC2 <SEP> 4 <SEP> > 128
<tb> <SEP> Escherichis <SEP> coli <SEP> V <SEP> 2019 <SEP> 4 <SEP> > 128
<tb> <SEP> klebslella <SEP> pneumonise <SEP> StA <SEP> P2 <SEP> > 128 <SEP> > 128
<tb> <SEP> Enterobacter <SEP> cloacae <SEP> 476 <SEP> > 128 <SEP> > 128
<tb> <SEP> Enterobacter <SEP> HM <SEP> 12 <SEP> 64 <SEP> > 128
<tb> <SEP> Serralla <SEP> marcescens <SEP> Guilpin <SEP> 82 <SEP> > 128
<tb> <SEP> Pseudomonas <SEP> serugl.<SEP> IP <SEP> A <SEP> 237 <SEP> 64 <SEP> > 128
<tb> <SEP> Pseudomonas <SEP> serugi. <SEP> Dalgleish <SEP> > 128 <SEP> > 128
<tb>
Tableau 2
<tb> <SEP> SOUCHES <SEP> BACTERIENNES <SEP> (référence) <SEP> (I)
<tb> <SEP> CMI <SEP> en <SEP> mg/l
<tb> <SEP> Staphy. <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> P <SEP> 0.06 <SEP> 32
<tb> <SEP> Staphy. <SEP> wurcas <SEP> IP <SEP> 8203 <SEP> 0.06 <SEP> 64
<tb> <SEP> Staphy. <SEP> aureus <SEP> Deal <SEP> 32 <SEP> 32
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<tb> <SEP> Streto <SEP> pnenmonise <SEP> 4316 <SEP> 0.015 <SEP> 1
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<tb> <SEP> Escherichis <SEP> coli <SEP> NIHJ-JC2 <SEP> 4 <SEP> > 128
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Tableau 2
<tb> <SEP> Call <SEP> Inf <SEP> Call <SEP> n-inf <SEP> % <SEP> de <SEP> %de <SEP> %de <SEP> CPM[ H] <SEP> % <SEP> inhib
<tb> Concentrations <SEP> DO <SEP> 540 <SEP> nm <SEP> DO <SEP> 540 <SEP> nm <SEP> call <SEP> lyse <SEP> prote <SEP> incorporé
<tb> <SEP> vivantes <SEP> par <SEP> 50 <SEP> l <SEP>
<tb> <SEP> 1er <SEP> Essai <SEP>
<tb> <SEP> O <SEP> 548 <SEP> 906 <SEP> 100 <SEP> % <SEP> 40 <SEP> % <SEP> 0% <SEP> 102973 <SEP> 0% <SEP>
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<tb> <SEP> 2e <SEP> Essai
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Claims (11)
1. Polypeptide possédant la structure donnée sur la figure 1 (polypeptide 1), ou tout fragment ou dérivé de celui-ci.
2. Fragment ou dérivé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une délétion d'un ou plusieurs résidus, et/ou une substitution d'un ou plusieurs résidus, et/ou une modification au niveau d'un ou plusieurs résidus par rapport au polypeptide (I).
3. Dérivé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il comprend, par rapport au polypeptide (I) ou au fragment ou dérivé selon la revendication 2 une partie supplémentaire, peptidique ou non, terminale ou interne.
4. Fragment ou dérivé selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il conserve au moins une propriété du polypeptide (I).
5. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4.
6. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides selon les revendications 1 à 4.
7. Composition pharmaceutique selon la revendication 6 destinée au traitement des infections virales.
8. Composition pharmaceutique selon la revendication 7 destinée au traitement des affections liées aux virus HIV.
9. Cellule produisant un polypeptide selon la revendication 1.
10. Cellule selon la revendication 9 caractérisée en ce qu'iI s'agit d'une cellule recombinante contenant une séquence nucléotidique selon la revendication 5.
11. Procédé de préparation d'un polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule selon l'une des revendications 9 ou 10 et on isole le polypeptide produit.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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- 1992-07-02 FR FR929208145A patent/FR2693199B1/fr not_active Expired - Fee Related
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1993
- 1993-06-30 JP JP6503008A patent/JPH07508746A/ja active Pending
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