CA2139345A1

CA2139345A1 - Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, preparation et utilisation

Info

Publication number: CA2139345A1
Application number: CA002139345A
Authority: CA
Inventors: Gerard Helynck
Original assignee: Individual
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1992-07-02
Filing date: 1993-06-30
Publication date: 1994-01-20
Also published as: FR2693199B1; WO1994001462A1; FR2693199A1; JPH07508746A; EP0651767A1

Abstract

2139345 9401462 PCTABS00165 La présente invention concerne un nouveau polypeptide de la formule (1) ayant une activité anti-virale, ses dérivés, leur préparation et leur utilisation. Le polypeptide a été isolé a partir du milieu de culture d'un actinomycète.

Description

-~ 94/01462 2 1 3 9 3 ~ ~ PCT/FR93/00659 POLYPEPTIDES BIOLOGIQUEMENT ACTIFS DERIVES D'UN ACTINOMYCETE.
.
La présente invention concerne un nouveau polypeptide et ses dé~ivés, leur préparation et leur utilisation, notamment comme agents pharmaceutiquement actifs.

Plus précisément, l'invention a pour objet un nouveau polypeptide poss~dant la s~ucture préæntée sur h figure 1 (polypeptide I), et tout fragment ou dérivé de celui-ci.
Par dérivé, on entend au sens de la présente invention les molécules comportant par exemple des modifications au niveau de la structure primaire, telles lo que des délétions d'un ou plusieurs résidus, des substitutions d'un ou plusieurs résidus, et/ou des modifications au niveau d'un ou plusieurs résidus. A titre d'exemple, les résidus modifiés peuvent être des résidus susceptibles de former des ponts disulfure, ou des résidus sites de glycosylation. Le terme dérivé comprendégalement les molécules comportant des parties supplémentaires internes ou - 15 terrninales, de nature peptidique ou non. Il peut s'agir notamment de parties actives, de marqueurs, de stabilisants, etc. n peut s'agir également d'acides aminés, tels qu'une mé~ionine en position -1. Le terme dérivé comprend également les molécules comportant des modifications au niveau de la structure tertiaire (ponts disulfure, extremité N-terminale, etc).
; 20 Ces dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui d'augmenter l'affinité du peptide pour son ou ses sites d'interaction, :1 celui d'améliorer ses niveaux de production, celui d'augmenter sa résistance à des p:rotéases, celui d'augmenter son efficacité thérapeutique ou de réduire ses effets secondaires, ou celui de lui conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiqueset/ou biologiques.
Préférentiellement, les dérivés conseIvent au moins une propriété du , polypeptide (I), qu'il s'agisse d'une propriété physique (homologie structurale), pharmacologique (immunogénicité) ou biologique. L,es dérivés peuvent également apporter de nouvelles propriétés au polypeptide de séquence (I) (marquage, ..), ou 30 améliorer ses propriétés (stabilité, activité biologique etc). Ils peuvent aussi posséder des propriétés équivalentes, compte tenu du caractère conservatoire de certainesmodifications, ou être dépourvus de pro;priétés biologiques. Ce dernier type de dérivé
peut en effet permettre l'identification de régions actives ou d'épitopes impor~nts dans la structure. Il peut également comprendre des antagonistes du polypeptide (I).

WO 94/0~462 2 1 3 9 3 ~ ~ PCr/FX93/006S9 Plus préférentiellement, l'invention concerne un polypeptide ayant la structure donnée sur la figure 1.
Le polypeptide (I) a été isolé à partir du milieu de culhlre d'un actinomvcète.
- selon le protocole décrit dans les exemples. Schématiquement, ce procédé cc)mprend 5 une première phase de centrifugation, élimination du surnageant, traitement du culot à l'acétone, nouvelle centrifugation, et concentration sous pression réduite du surnageant avant plusieurs étapes de chromatographie de partage et de perméation. Il est entendu d'une part que ce procédé n'est pas limitatif, et d'autre part, que le polypeptide ~I) peut être isolé à partir du milieu de culture d'aulres microorganismes lo producteurs, identifiés par exemple par test biologique ou immunologique. Parailleurs, ce polypeptide et ses dérivés selon l'invention peuvent être synthétisés chimiquement en utilisant les technique connues de l'homme du métier. De plus, ce pol~peptide et ses dérivés selon l'invention peuvent également être synthétisés par voie génétique, par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique 15 codant pour le polypeptide (I) ou pour un dérivé de celui-ci tel que défini ci-avant.
_ Pour cette dernière voie de synthèse, la séquence nucleotidique peut être préparée chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique. Des exemples de telles séquences sont donnés dans les exemples. La sequence 20 nucléotidique peut également être préparée par criblage d'une banque d'ADNc au moyen d'une sonde nucléique dérivée de la séquence du polypeptide (I). Par ailleurs, - dans le cæ d'une synthèse par voie génétique, certaines modifications s~ucturales peuvent intervenir, telles que notamment l'ajout en position N-terminale d'une mé~ionine. Il est bien entendu que de tels polypeptides sont couverts par la presente 2s demande.

Iln autre objet de la présente demande concerne une sequence nucléotidique codant pour le polypeptide (I) ou pour un dérivé de celui-ci tel que défini précédernment. De telles séquences peuvent être utilisées pour la production despolypeptides de l'invention ou, par des expériences d'hybridation, pour la mise en 30 évidence et l'isolement d'autres microorganismes producteurs ou encore pour la mise en évidence et l'isolement de polypeptides homologues au polypeptide (I). Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides, etc. Ces séquences peuvent être obtenues selon les indications données ci-dessus.
Un autre objet de l'invention conceme une cellule capable de produire un 3i polypeptide de l'invention. Il peut s'agir d'une cellule produisant de manière naturelle ` i 94/01462 213 g 3 ~ 3 P
. , ce polypeptide (polypeptide (I), polypeptide homologue ou dérivé tels que définici-avant), ou d'une cellule obtenue par recombinaison génetique. Une telle cellule peut être eucaryote ou procatyote. Parmi les hôtes eucaryotes utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les cellules animales, végétales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les le rures du genre Saccha~omyces, Kluyver~myces, Pichia, ~chwarniorQvces, ou ~nula-S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules COS, CHO, C127, etc ou les cellules d'insectes. Parmi les champignons susceptibles d'être utilisés dans la présente invention, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp.
Io Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes: Actinomvcètes, ~oli, ;~acillus, ou Streptomvces.
A cet égard, l'invention a aussi pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini ci-avant caractérisé en ce que l'on cultive une cellule décrite ci-dessus et on iso!e le polypeptide produit.
- 15 Un autre objet de l'invention concerne une composition pharrnaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides selon l'invention. Les polypeptides de - l'invention possèdent en effet des propriétés pharmacologiques interessantes, en particulier des propriétés antivirales. Les polypeptides selon la présente invention - sont particu ièrement utiles pour la prophylaxie et le traitement du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise? et de syndromes associés [ARC (AIDS related complex)]. Ainsi qu'illustré dans les exemples, les polypeptides de l'invention et en particulier le polypeptide ~I) sont inhibiteurs de l'effet cytopathogène du HIV et inhibiteurs de la production de transcriptase inverse en culture cellulaire à des concentrations dépourvues d'effet cytotoxique ou cytostatique.
2s Plus particulièrement, les compositions pharmaceutiques de l'invention sont destinées aux traitements d'infections virales. Encore plus particulièrement, les compositions pharmaceutiques de l'invention sont destinées aux traitements des affections liées aux virus HIV.
Par ailleurs, les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent comprendre un ou plusieurs polypeptides tels que défini ci-avant en association avec d'autres agents actifs.
D'autres avantages des polypeptides de la présente invention sont donnés dans les exemples qui suivent, qui doivent etre considérés comme illustratifs et non limitatifs.

. , . ,, .. ..... ~ ~ .. . ... . . . . . .. . . .

2 PCr/FR93/00659 -` 2i3934$

Lé~ende des fi~ures Figure 1: Structure proposée du polypeptide (I).
Figure 2: Spectre RMN du polypeptide (I). Spectre lH 600 MHz dans 50% CD30H /
50% H20 à 313 deg. K.
~ ~ .

Ll~ d~ pQlype~ide (~
1.1. Ferrnentation Un erlen de 250 ml rempli avec 50 ml de milieu (corn steep 10 g/l, saccharose 30 g/l, CaC03 7,5 g/l, ~NH4)2 SO4 2 g/l) est ensemencé par une culture d'~jDgm~ç SP9440 sous forme de culture liquide congelée Il est agité à 250 t/mn dans un agitateur thermostaté à 28C.
Après 72 heures, 2 à 5 % de cette culture sont transférés dans un erlen de - ~ 2 li~es rempli avec 250 ml du même milieu. n est agité pendant 72 heures à 150 t/mn dans un agitateur thermostaté à 28C.
1~ La totalité de cette culture est alors transférée stérilement dans un fermenteur rempli avec 45 litres du même milieu. Le fermenteur est agité à 400 t/mn, aéré à4 m3fh et thermostaté à 28C pendant 48 heures.
40 litres de cette culture sont slors transférés dans un fermenteur de ~ production avec 400 litres dè milieu stérilisé 40 minutes à 122C (extrait de levure -~ 20 10g/I, glucose 30g/1, CaC03 5 g/l, NaCl 20 g/l, KH2P04 1 g/l, MgSO4 1 gll).
Pendant 192 heures il est maintenu à une température constante de 28C, agité à
150 t/mn et aéré à raison de 15 m3/h.

L2. Extraction et purification - Le moût entier (4~0 litres) est centrifugé à l'aide d'une centrifugeuse à
autodébourdage Westphalia. Le surnageant est écarté. Le culot est repris par 300 litres d'acétone pour délitage pendant 2 heures, les débris cellulaires sont écartés par centrifugation. Le surnageant est eoncentré sous vide pour éliminer l'acétone jusqu'à un volume de 60 litres; les 60 litres de phase aqueuse sont percolés sur une colonne en acier inoxydable 20 x 60 cm contenant 30 litres de résine DUOLr S861.
La colonne est rincée par 60 litres d'eau. La chromatographie est effectuée par un gradient par paliers MeOH/H20 avec un débit de 30 litres/heure.

-- .~ 94/01462 2 I 3 9 3 ~ ~ PCI/FR~3/00659 .: ; .
. ~;

La première fraction (60 litres) correspond à l`éluant MeOH/H20 20/80 v/v.
La deuxième fraction (30 litres) à MeOH/H20 50l50 v/v.
La troisième fraction (60 litres) à 100 Yo MeOH.
Le polypeptide (I), détecté par chromatographie sur couche n~ince, est S présent dans la troisième fraction. Le mé~anol de cette fraction est chassé sous vide pour obtenir 10 litres de phase aqueuse. Cette solution aqueuse est ensuite percolée sur une coloMe en verre de 10 cm de diamètre contenant 1,2 litre de support chromato~aphique DIAION HP20 Mitsubishi afin d'adsorber le polypeptide (I).
Après rinçage par 11 litres d'eau, on élue avec 8 litres de méthanol. Cette phase 10 mé~anolique contenant le polypeptide tI) renferme 64 g de solide.
La prochaine étape de purification est une chromatographie liquide haute pression avec une précolonne en acier inoxydable 2" x 5 cm et une colonne en acier inoxydable HP Chemicals 3" x 50 cm garnie de silice greffée C18 Amicon (20 ~
100A). Le débit de 200 mVminute est obtenu à l'aide d'une pompe à piston Lewa (Sar~ouville, France) type EK16, les fractions de 800 ml sont collectées avec uncollecteur de fractions Pharmacia (Uppsala, Suède) type PF30. Les 8 litres de phase méthanolique sont étendus à 16 litres avec de l'eau et sont percolés sur la colonne qui est rincée avec 2 litres de MeO~VH20 50/50 v/v.
L'élution s'effectue par paliers successifs de MeOH/H2O:
- 60t40 v/v pour les fractions 1 à 6, - 70/30 v/v pour les fractions 7 à 13, - 80i20 v/v pour les fractions 14 à 3Q.
Les différentes fractions sont analysées par chromatographie sur couche mince (CCM) sur plaque de silice Merck 60F254 avec l'éluant EtOAc/AcOH/H2O
2s 60/12/10 v~v/v. Dans ce système le polypeptide (I) recherché migre à un rapport frontal (RF) égal à 0,25, est visible sous W à 254 nm et se revèle au réactif de Greig et Laeback. Les fractions 10 à 18 contenant le polypeptide (I) sont collectées, les autres fractions sont écartées. Le poids sec de ces fractions 10 à 18, estimé sur une partie aliquote, est de 9,6 g. Leur volume est étendu avec de l'eau pour être amené à
une composition MeOH/H2O 50/50 v/v, avant d'être percolées sur une colonne cylindrique en verre de 13 cm de diamètre interne contenant 450 ml de silice greffée C18 BONDESIL 40~L L'effluent est écarté, le polypeptide (I) est élué par 4,5 litres de méthanol. Cette phase méthanolique est concentrée sous vide pour donner 9,2 g d'extrait sec.

_ " ~. " ;., .~ ... 7.. .. .. ......... . . . . .

Wo 94/01462 pcr/FR93/oo6s9 213934~

L'étape suivante de purification consiste en une chromatographie de perméation sur support LH20 ~Pharmacia, Uppsala, Suède) effectuée sur des pa¢ties aliquotes de cet extrait sec. 586 mg sont dissous dans 11 ml d'un mélange MeOH/DMSO 10/l v/v qui est dépose w sommet d'une colonne cylindrique en verre de 30 mm de diamètre interne et de 150 cm~de hauteur. L'élution s'effectue dans le me~ianol à 1 mUminute. Les fractions de 15 ml sont collectées avec un collecteurLKB 7000 Ul~c. Le poiypq~tide ~I) est localiæ dw les fractions 19 à 26 qui sont r~unies, évaporé~ sous vide pour donner 445 mg d'une poudre beîge clair.
C~tte poudre peut etre décolorée par chromatographîe liquide sur colonne de ~silice ~fée Cl8. On utilise un réærvoir Analytichem International de 75 ml 2,5 cm - de diamètre i~ne con= 30 ml de silice greffée C18 ~Matrex silica C18 Amicon 20 11, 60A). 223 mg de cette poudre beige sont solubilisés par 60 ml d'un mélange MeO~JHCl 0,1N 50/50 v/v. Cette solution est percolée sur la colonne qui est ensuite ~in:cée par 60 ml d'un~mélange MeO~VH20 55/45 v/v, avec un débit de 10 mVminute.: ~
l5 ~ L'élr~ s'eff~uo w même~débit par p~iers successifs de MeOH/H2O:
;~5~ es fractions~ 1 à 15, -~ 70/~0~vfvpQu~les~frac~ons16~à30, ~ 80/20 vlv p~ f~ons 31 à 52, - ~ 85/15~ pour~ fractions53à62, ~- ~ ~ 20 ~ - 90/10 v/v pour les~fracMons 63 à 88.
- ~ ~ ~ To:utes les fractions æont de 5 ml.
Apds é~porntion sous p~ession réduite des fractions 42 à 65, on obt;ent 143 mg du ~ a) sous forme d'un~ p~udre blanche.
~ Un éohn~llon de la sou:che ~ins~de SP9440 a été déposé le 18 Mai - - ~ 25 1992~ au au voor Schimmelcultures à Baarn (Pays-Bas) selon le régime ~ ~ du Traité de Budapest sous le numéro d'enregistrement CBS 257.92.
,. i , 2. Caractérisation phvsico-chimique ~ , :
2.1. Masse moléculaire - ~ ~a masse chimique du polypeptide (I) déterminée par spectrométrie de 30 masse à l'aide d'un Autospec (VG) est de 2163,4 Da.

': ~

.

213 9 3 4 ~
~ 94/0~462 PCT/FX93/00659 ., 2.2. Stn chlre La stmcture du polypeptide (I) a été déterminée en plusieurs étapes et en - combinant les résultats de plusieurs ~pes d'analyses (séquençage, RMN, analyse élémentaire, Masse, Infrarouge et Raman).
L'analyse par RMN et l'analyse élémentaire ont perrnis de déte~niner la présence dans le polypeptide (I) de 4 résidus cystéines et d'un résidu tryptophane.
Les premiers e~is de sequençage en utilisant la dégradation d'Edman se sont révélés infructueux. Des quantités très importantes de matériel déposees sur le séquenceur n'ont donné que des signaux très faibles, indiquant qu'il n'existe pas dans la molécule d'extrémité NH2-terminale. Différents essais de fragmentation ont donc été réalisés. Le polypeptide (I) n'est pas dégradé par la trypsine, la protéase V8, ou la chymotrypsine.
La composition en acides aminés a donc été déterminée après hydrolyse totale du polypeptide (I) par traitement avec une solution d'HCl 6N à 156C pendant 75 minutes. Cette analyse a donné les résultats suivants:
. . .. . _ Acide Aniine ~o Mol S.C. 1 s.p.2 .. _ ..
Asx 12,28 1,998 2 _ ~
_Ser 6,09 __ 0,991 1 Gly 24,33 3,959_ ~ 4 Ala 12,91 2,101 2 . _ l`vr 6,77 1,101 1 ...._ Val 12,48 2,03 2 . . _ Ile 6,~1 1,01 . . .. __ 1 Leu 6,08 0,989 1 ~ . .... __ Phe 12,73 2,071 _ 2 1 Stoechiométrie calculée 2 Stoechiométrie proposée Cette analyse ne permet pas d'identifier les cystéines et les tryptophanes.
20 Combinés avec les résidus identifiés par RMN et analyse élémentaire, ces resultats donnent la composition du polypeptide (I) et une masse chimique calculée de 2168,5 daltons. La différence avec la masse déterminée en spectrométrie de masse indique (i) WO 94~01462 2 I 3 9 3 4 ~) PCr/FR93/0065~ ?

que les cystéines sont oxydées en cystines, (ii) que le polypeptide (I) est cyclique et (iii) qu'il entre une asparagine dans sa composition.
La structure a finalement pu être élucidée par séquençage de fragments résultant d'une hydrolyse acide ménagée et recoupement avec la structure pr~posée S par l'étude RMN.
- La structure proposée résultant de cette étude est présentée sur la figure 1.
- Le spec~e RMN (lH 600 MHz dans ~0 ~o MeOH deutérié / 50 ~o H20 à
313 degres Kelvin) est présenté sur la figure 2.
- Spectre de masse: VG Autospec, ionisation LSIMS ("Liquid Secondary lo Ion Mass Spectromet~" ion césium Cs+ à 3~ KeV, matrice NBA: lM+H]+ M/Z
2164,4; [M~Na]+ M/Z 2186,4; [2M+H]+ M/Z 4326,1.

3. Synthèse de séquences nucléotidiques - Les sequences d'ADNc suivantes peuvent être synthétisées en utilisant les techniques classiques de synthèse d'ADN connues de l'homrne du métier:
~:~
15 TGTITAGGTATTGGTAGlTGTAATGAmTGCCGGl'rGTGGTTATGCCGTT
C~TlTGml~GG (SEQ ID n2) , TGC~GGGGATAGGGAGCTGTAACGAC rrTGCGGGATGCGGATACGCGGT
GGTGTG~lTlGG (SEQ ID n3) Ces séquences codent pour le polypeptide (I). D'autres séquences peuvent être 20 synthétisées codant pour des fragments ou dérivés du polypeptide (I).

4. Caracténsation biologique 4.1. Spectre d'activité antibiotique ~, A partir d'une solution mère de polypeptide (I) à 2,56 g/l de substance active, une gamme de dilution de raison 2 est réalisée en eau distillée stérile (de 2560 2s à 0,3 mg/l). 1 ml de chaque dilution est incorporé dans un tube contenant 19 ml de gélose Mueller Hinton maintenue en surfusion (dilution 1/20). L'ensemble est coulé
immédiatement en boites de Pétri. Après refroidissement et séchage, l'ensemensement des souches bactériennes est réalisé avec un inoculateur multipoint qui dépose 104 colonies formant unité (cfu) de chaque souche bactérienne étudiée à la surface de la 30 gélose. Après incubation des boites 18 heures à 37C, la concentration minimale 21393~S
~ 94/01462 pcr/Fl~93/oo659 . ,.
g inhibitrice (CMI en mg/l) du polypeptide (I), soit la plus petite concentration qui inhibe totalement la croissance bactérienne des souches testées est déterminée. Les - résultats sont présentés dans le tableau 1. }ls montrent que le polypeptide (I) ne possède pas d'activité antibactérienne notable, et en particulier qu'il a une faible

5 activité sur les cocci à Gram positif.
:
4.~vité antivi~ç
L'activité antivirale a été mise en évidence dans les tests suivants:
~ vis-à-vis de l'effet cytop~h~ne du virus HIV.
:~
Les produits en poudre ont été mis en solution à raison de 2 mg de produit lo par 2 ml (environ 4 x 10-3 M) dans une solution de diméthylformamide DMF/H2O
(10 %190 %: v/v). Le test est réalisé sur la lignée Iymphoblastoide CEM clone 13.
Dans une microplaque de 96 puits on dépose 25 ~Upuits d'une solution de produit à
tester dans du t~on phosphate isotonique (I~I) ou de TPI seul dans le cas des -~ `~ contr~les. Les pro~tuits sont étudiés à dff~rentes concentrations (souvent 8), à raison 15 de~6~puits par . On ajoute alors 125 ~1 d'une suspension de cellules CEM
(8~x 104 cellules par ml) dans le milieu RPMI contenant 10 % de sé~m de veau foetal, 100 UVml de pénicilline, 100 ~g/ml de streptomycine et 211moles/ml de glutamine et les microplaques sont incubées une heure à 37C, sous une atmosphère contenant 5 % de gaz carbonique. Pour chaque concentration, I'essai est partagé en 20 deux ~p~rdes: une ~ie (3 puits) sur cellules infectées, pour la détermination de , ~ I'a~livite andvirale et l'autre partie (3 puits) sur cellules non infectées, pour détenni--~ ~ ner~la cytotoxicité des produits. On infecte alors la première série avec HIV-1 (100 ~1 ; ~ par puits d'une suspension de virus LAV-1-BRU contenant 200-300 TCID50) tandis que l'autre série reçoit 100 ~1 de milieu RPMI tel que défini précédemment. Au bout 2s de 7 jours d'incubation, 100 ~1 de cellules sont prélevés pour mesurer la viabilité
cellulaire [déterminée selon une modification de la technique décrite par R. Pauwels et coll., J. Virol. Meth., 20, 309-321 (1988)]. On ajoute à ce prélèvement 10 ~ul d'une ;~ solution contenant 7 mg de MTT [bromure de 3-(4,5-diméthyl 2-thiazolyl)-2,5-diphényltétrazolium] par ml de tampon phosphate isotonique. Après 3 heures 30 d'incubation à 37C le surnageant est enlevé. Le MIT est converti en un sel de - fonnazan (bleu) uniquement à l'intérieur des cellules vivantes. On ajoute alors 100 ~1 d'isopropanol (contenant 0,04 mole/l d'acide chlorhydrique) et les microplaques sont :
, 21393~5 WO 94/01462 ` PCI/FR93/0065 agitées jusqu'à la solubilisation du bleu de formazan. L'absorbance à ~40 nm est lue avec un lecteur automatique de réactions ELISA en microplaques; Cette absorbanceest proportionnelle à la quantité de cellules vivantes.
Le taux de protection (en %) d'un produit donné est déterminé à partir des 5 densités optiques (DO) par la formule:
Dol..a ~,_ et inf.)-DO(cell. non traitées et inf.) DO(cell. traitées et non inf.)-DO(cell. non ~aitées et inf.) Le cas échéant la concentration inhibitrice 50 % est déterminée. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Ils montrent que la CI50 du polypeptide (I) sur l'effet 10 cytopathogène du virus HIV est comprise entre 1 et 3 ~g/ml.
Détermi~on de la multiplication virale ~ar dosa~e de la transcri~tase inverse duvin~S ~V.
L'activité de la transcriptase inverse est mesurée dire^tement sur 50 ~1 de t, surnageant de culture. Selon la méthode décrite par O. Schwartz et coll., AIDS
Research and Human Retmtvirus 4(6). 441 448 (1988). 10 ~1 de tampon contenant 0,5 M de KCl, 5 mM de dithiothreitol (DTT) et 0,5 % de triton X-100 sont ajoutés à tous les micropuits contenant les 50 ~1 de surnageant à tester. 40 ~1 de tampon contenant les 1,25 mM d'éthylène glycol-bis (2-aminoéthyl éther) (EGTA), 0,125 mM de Tris.HCI pH 7,8, 12,5 mM de MgCl2, 3 ~Ci de (3H) thymidine triphosphate (TTP), 0,05 20 DO260 d'acide polyadénylique - scide thymidylique (poly rA-oligo dT) sont ajoutés ensuite. La microplaque est couverte au moyen d'un film plastique et incubée 60 minutes à 37C.
- On arrête la réaction en ajoutant 20,ul d'une solution glacée de 120 mM de Na4P2O7 dans 60 ~o d'acide trichloracétique et les échantillons sont placés 15 25 minutes sur le lit de glace.
Les précipités sont filtrés sur fibres de verre en utilisant un laveur de cellules (Skatron) et les filtres sont lavés avec une solution de 12 mM de Na4P207 dans 5 'Yo d'acide trichloracétique.
Les filtres sont séchés et la radioactivité est comptée après ajout d'un liquide30 scintillant. Les résultats sont présentés ;dans le tableau 2. Ils montrent que la CI50 du polypeptide (I) sur l'activité de la transcriptase inverse du virus HIV est de 4 ~g/ml environ.

;~ 21393~5 ~,~ 94/01462 P~/F~3/006~9 LISTE DE SEOUENCES

(1) ~NFORMATION GENERALE:

. (i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (ii) I'ITRE DE L'INvENTlON: Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, prepara~on et utilisation (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3 iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) T~PE DE SUPPORT: Tape lB~ ORDINATEUR: IBM PC compatible _ (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
lA) LONGUEUR: 21 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(D) CONFIGURATION: linéaire ~, (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine ~xi) DESCRlPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1 Cys Leu Gly Ile Gly Ser Cys Asn Asp PhP Ala Gly Cys Gly Tyr Ala Val Val Cys Phe Trp (2) ~NFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 63 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire 4~
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) ANTI-SENS: NON

WO94/01462 2i39345 PCI~/FR93/00659 ~

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

s (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARAC-I kRISIlQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: fi3 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

21393~
`~ 94/01462 ~ PCI/FR93/00659 ~bl~a~ 1 - ___ __ . Ampicilline I Polypeptide SOUCHES BAcrERIENNEs férence . CMI en mg~
.
Staphy. aure~s 209 P 0.06 32 . _ ;.
Staphy. aureus lP 8203 û.06 64 . .
Staphy. aure~s Deal 32 32 , _ _ ..
Staphy. aureus Duc 32 32 . , .... ~. _ ~taphy. aureus Lefevre 32 32 Staph~J. aureus Amiot >128 Strepto. pneumoniae 4255 0.03 2 .
Strepto. pneumoniae 4316 0.015 . ...
Strepto. Groupe A Bacha 0.015 8 _ -- r . _ .
S~repto. G~oupe B B96y 0.06 8 . . .
Strepto. Groupe G G 143 0.03 16 . .
Strep~o. faecal~ CR 2 16 .
Strepto. faecium ATCC 9790 2 16 Escherichia coli NIHJ-JC2 i >128 Escherichia coli V 2019 4 ~128 . _ ~CIebsiella pneumoniae StA P2 >128 >128 . .
Enerobacter cloacae 476 >128 ~128 .. .,.. ,., Enterobacter cloacae HM 12 64 >128 . . _ _ Serratia marcescens G ~lp~ 32 >128 , ........... ..... _ __ Pseudomonas aerugi. ~ A 237 64 ~128 Pseudomonas aerugi. Dalgleish >128 >128 WO 94/01462 213 9 3 4 a PC~r/F1R93/00655 ~' Tableau 2 . . . . , Cell~ Celln-~f %de %de %de CPM13H] % ~nhib Concen~a~ons DO 540 nrn DO 540 nn~ cell. Iyse prote ~co~x~ par 50 ~
. - ., .
ler Es~
O 548 906 100% 40% ~% 102973 0 .. . . .. _,_ 1,17 684 979 108 % 30 % 32 % 127791 -24 ~O
_ . . . .
2,34 816 1052 116% 22~ 53% 55562 46%
. . ._ _ 4,69 868 1078119 % 19 % 60 % 41890 ~9 %
. .. _ _ .. .___ 9,38 970 106~ 118 % 9 ~o 82 % 959 99 %
. . . _ . .
~8,75 874 888 98% ~% 96% 822 99%
. _ .
37,50 802 784 87 % -2 % 108 % 561 99 %
_, .
753 692 76% -~% 142% 691 99%
.... . .
. A~ZT 1~M 927 998110 % 7 % 84 % 1515 99 %
._ ,, 2e E~
.
0 702 . 1119100 % 37 % 0 % 39931 0 %
~ _ . .. _ _ 1,170 838 1292115 % 35 % 23 % 42849 -7 %
_ .. _.
2,340 853 1250112 % 32 % 28 % 33797 15 %
._ .
4,68 1150 1251112 % 8 % 82 % 18340 54 %
. _ 9,37 1180 1205108 % 2 % 9S % 4635 88 %
18,75 1127 992 89 % -14 ~O 147 % 1059 97 %
37,50 1006 818 73 % -23 % 262 % 759 98 %
_ 75 613 656 S9 % 7 ~o ~93 ~ 499 99 %

Claims

REVENDICATIONS

1. Polypeptide possédant la structure donnée sur la figure 1 (polypeptide I), ou tout fragment ou dérive de celui-ci et conservant au moins une propriété dudit polypeptide (I).

2. Fragment ou dérivé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une délation d'un ou plusieurs résidus, et/ou une substitution d'un ou plusieurs résidus, et/ou une modification au niveau d'un ou plusieurs résidus par rapport au polypeptide (I).

3. Dérivé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce qu'il comprend, par rapport au polypeptide (I) ou au fragment ou dérivé selon la revendication 2 une partie supplémentaire, peptidique ou non, terminale ou interne.

4. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 3.

5. Composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs polypeptides selon les revendications 1 à 3.

6. Composition pharmaceutique selon la revendication 5 destinée au traitement des infections virales.

7. Composition pharmaceutique selon la revendication 6 destinée au traitement des affections liées aux virus HIV.

8. Cellule produisant un polypeptide selon la revendication 1.

9. Cellule selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'il s'agit de la soucheSP9440 référence CBS 257.92.

10. Cellule selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule recombinante contenant une séquence nucléotidique selon la revendication 5.

11. Procédé de préparation d'un polypeptide selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule selon l'une des revendications 8 à 10 et on isole le polypeptide produit.