JP2001500477A - インドリシジンのアナログを用いて感染を処置するための組成物および方法 - Google Patents

インドリシジンのアナログを用いて感染を処置するための組成物および方法

Info

Publication number
JP2001500477A
JP2001500477A JP10510994A JP51099498A JP2001500477A JP 2001500477 A JP2001500477 A JP 2001500477A JP 10510994 A JP10510994 A JP 10510994A JP 51099498 A JP51099498 A JP 51099498A JP 2001500477 A JP2001500477 A JP 2001500477A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
analog
peptide
spp
indolicidin
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP10510994A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2001500477A5 (ja
Inventor
アール． フレイサー，ジャネット
エイチ．ピー． ウエスト，マイケル
ジェイ． クリーガー，ティモシー
テイラー，ロバート
アーフル，ダグラス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of JP2001500477A publication Critical patent/JP2001500477A/ja
Publication of JP2001500477A5 publication Critical patent/JP2001500477A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0028—Disruption, e.g. by heat or ultrasounds, sonophysical or sonochemical activation, e.g. thermosensitive or heat-sensitive liposomes, disruption of calculi with a medicinal preparation and ultrasounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 感染、特に細菌性感染を処置するための組成物および方法が提供される。少なくとも２つの塩基性アミノ酸を含むインドリシジンペプチドアナログが調製される。アナログは、好ましくは光酸化可溶化剤を含む、修飾されたペプチドとして投与される。

Description

【発明の詳細な説明】 インドリシジンのアナログを用いて感染を処置するための組成物および方法 技術分野 本発明は、一般に、微生物に起因する感染の処置、ならびにより詳細には、イ ンドリシジンアナログを含む組成物、ポリマー修飾アナログ、および感染を処置 する際のそれらの使用に関する 発明の背景 ほとんどの健常個体に対して、感染は刺激性であるが、一般に生命を脅かすこ とはない。多くの感染は、個体の免疫系により首尾良く撃退される。処置は、補 助的であり、そして一般に先進国においては容易に利用可能である。しかし、感 染性疾患は、発展途上国および免疫寛容化された個体においては深刻な問題であ る。 発展途上国において、適切な衛生設備の欠如およびそれに伴う貧弱な衛生状態 は、細菌性、寄生生物性、真菌性、およびウイルス性の感染を助長する環境を提 供する。貧弱な衛生状態および栄養欠乏は、感染因子による侵入に対する天然の 障壁（例えば、皮膚および粘膜）の有効性、または感染因子を除去する免疫系の 能力を低減させ得る。同様に、病原体の恒常的な攻撃は、抗体産生および食細胞 （例えば、多型好中球）の免疫系防御に対して亜正常レベルへとストレスを与え 得る。宿主防御の破壊もまた、循環系の障害、機構的障壁、疲労、喫煙、過度の 飲酒、遺伝的欠損、AIDS、骨髄移植、ガン、および糖尿病のような状態に起因し て起こりうる。世界で漸増的に拡がる問題は、HIV陽性である個人における日和 見感染である。 ワクチンは、これらの機構のいくつかに対して防御するのに利用可能であり得 るが、ワクチン接種は、不適切な送達機構および経済的な貧困のような因子に起 因して、常に可能でもなく、かつ感染の際の遅すぎる送達、患者がワクチンに対 する免疫応答を惹起することができないこと、または病原体の進化などに起因し て効果的でもないこともあり得る。他の病原因子については、ワクチンは利用可 能ではない。感染に対する防御が可能でない場合、感染の処置が、一般に探求さ れる。処置の兵器において主要な武器は抗生物質である。抗生物質は、多くの細 菌に対して効果的であり、そして数え切れない生命を救ってきたが、それらは万 能ではない。特定の状況での抗生物質の過度の使用により、耐性細菌株の拡散が 促進されてきている。そして非常に重要なことに、抗細菌剤はウイルス感染には 有用ではない。 種々の生物は、微生物に対する非特異的な防御機構の一部として使用されるカ チオン性（正に荷電した）ペプチド、分子を産生する。単離される場合、これら のペプチドは、広範な種々の微生物（細菌、真菌、および特定のエンベロープウ イルス）に毒性である。好中球において見い出される一つのカチオン性ペプチド はインドリシジンである。インドリシジンは、多くの病原体に対して作用するが 、顕著な例外および種々の程度の毒性が存在する。 カチオン性ペプチドは、種々の病原性細胞（グラム陽性細菌、グラム陰性細菌 、および真菌）に対してインビトロにおいて効力を示すが、これらのペプチドは 、一般に、注入される場合、哺乳動物に対して毒性であり、そして治療指標は通 常非常に小さい。毒性を低減させるアプローチには、毒性応答に関与する構造要 素を遮蔽するかまたは低用量での効力を改善する誘導体または送達系の開発が挙 げられる。評価中の他のアプローチには、ペプチド、タンパク質、および疎水性 薬物の臨床影響を改善するリポソーム系およびミセル系、ならびに水性培地中の 投与の間の疎水性表面を隔絶するためのシクロデキストリンが挙げられる。例え ば、ポリエチレングリコール（PEG）ポリマーの結合（最も頻繁にはアミノ基の 修飾による）は、アスパラギナーゼおよびアデノシンデアミナーゼのようないく つかのタンパク質の医学的価値を改善し、そしてインターロイキンのようなペプ チドの循環器半減期を増大させる。 これらのアプローチでカチオン性の投与を改善するものは示されていない。例 えば、アシル化反応によりペプチドを修飾し得るポリソルベート誘導体の段階的 な合成のための方法が開発されてきているが、アシル化は、修飾カチオン性ペプ チドの電荷を変化させ、そしてしばしば、化合物の抗微生物活性を低減または消 長させる。従って、カチオンペプチドならびに他のペプチドおよびタンパク質の 送達について、増大された循環系半減期の特性とミセル構造を形成する能力の特 性とを組み合わせた系への需要が存在する。 本発明は、範囲および効果を拡張しそして、さらに、他の関連する利点を提供 するように設計されたインドリシジンのアナログを開示する。本発明はまた、毒 性を低減させるためにペプチド、タンパク質、抗生物質などを修飾し、かつ他の 利点を提供するための方法および組成物を提供する。 発明の要旨 本発明は、一般に、インドリシジンアナログを提供する。関連する局面におい て、25アミノ酸までを含み、そして以下の式を含むインドリシジンアナログが提 供される：RXZXXZXB；BXZXXZXB（ここで、すくなくとも１個のＺはバリン）；BB BXZXXZXB；BXZXXZXBBBn(AA)nMILBBAGS；BXZXXZXBB(AA)nM；LBBnXZnXXZnXRK；LKn XZXXZXRRK；BBXZXXZXBBB、（ここで、少なくとも２個のＸ残基がフェニルアラニ ンである）；BBXZXXZXBBB（ここで、少なくとも２個のＸ残基がチロシンであり ；そしてここでＺがプロリンまたはバリンであり；Ｘが疎水性残基であり；Ｂが 塩基性アミノ酸であり、AAは任意のアミノ酸であり、そしてｎは０または１であ る）。好ましい実施態様において、Ｚはプロリンであり、Ｘはトリプトファンで あり、そしてＢはアルギニンまたはリジンである。他の局面において、特定の配 列を有するインドリシジンアナログが提供される。特定の実施態様において、イ ンドリシジンアナログは、カップリングされて分枝ペプチドを形成する。他の実 施態様において、アナログは、対応するD-アミノ酸に変換された１つ以上のアミ ノ酸を有し、そして特定の好ましい実施態様において、Ｎ末端および／またはＣ 末端アミノ酸は、D-アミノ酸である。他の好ましい修飾は、Ｎ末端アミノ酸がア セチル化されているアナログ、Ｃ末端アミノ酸がアミド化されているアナログ、 Ｃ末端アミノ酸がエステル化されているアナログ、ホモセリン／ホモセリンラク トンのＣ末端アミノ酸における組込みより修飾されているアナログ、およびポリ エチレングリコールまたはその誘導体と結合されているアナログを含む。 他の局面において、本発明は、単離された核酸分子（その配列は、１つ以上の インドリシジンアナログのコード配列を含む）、発現ベクター、および発現ベク ターでトランスフェクトされているかまたは形質転換された宿主細胞を提供する 。 他の局面は、少なくとも１つのインドリシジンアナログおよび生理学的に受容 可能な緩衝液、必要に応じて抗生物質を含む薬学滴組成物を提供する。好ましい 組合せは、ILKKFPFFPFRRKおよびシプロフロキサシン；ILKKFPFFPFRRKおよびムプ ロシン；ILKKYPYYPYRRKおよびムピロシン；ILKKWPWWPWRKおよびムピロシン；ILR RWPWWPWRRRおよびピペラシリン；WRIWKPKWRLPKWおよびシプロフロキサシン；WRI WKPKWRLPKWおよびムピロシン；WRIWKPKWRLPKWおよびピペラシリン；ILRWVWWVWRR Kおよびピペラシリン；ならびにILKKWPWWPWKおよびムピロシン。他の実施態様に おいて、薬学的組成物は、さらに、抗ウイルス剤（例えば、アシクロビル；塩酸 アマンタジン；ジダノシン；エドクスジン；ファムシクロビル；ホスカルネット ；ガンシクロビル；イドクスウリジン；インターフェロン；ラミブジン；ネビラ ピン；ペンシクロビル；ポドフィロトキシン；リバビリン；リマンタジン；ソリ ブジン；スタブジン；トリフルリジン；ビダラビン；ザルシタビン、およびジド ブジン）；駆虫剤（例えば、8-ヒドロキシキノリン誘導体；キナ皮アルカロイド ；ニトロイミダゾール誘導体；ピペラジン誘導体；ピリミジン誘導体；およびキ ノリン誘導体。アルベンダゾール；アトパクオン；リン酸クロロキン；クエン酸 ジエチルカルバマジン；エフロルニチン；ハロファントリン；ヨードキノール； イベルメクチン；メベンダゾール；塩酸メフロキン；メラルソプロールＢ；メト ロニダゾール；ニクロサミド；ニフルチモックス；パロモマイシン；ペンタミジ ンイセチオネート；ピペラジン；プラジカンテル；リン酸プリマキン；プログア ニル；パモ酸ピランテル；ピリメタシン；パモ酸ピルビニウム；グルコン酸キニ ジン；硫酸キニン；スチボグルコン酸ナトリウム；スラミン；およびチアベンダ ゾール）；抗真菌剤（例えば、アリルアミン；イミダゾール；ピリミジン；およ びトリアゾール、5-フルオロシトシン；アムホテリシンＢ；ブトコナゾール；ク ロルフェネシン；シクロピロックス；クリオキノール；クロトリマゾール；エコ ナゾール；フルコナゾール；フルシトシン；グリセオフルビン；イトラコナゾー ル；ケトコナゾール；ミコナゾール；塩酸ナフチフィン；ナイスタチン；硫化セ レン；スルコナゾール；塩酸テルビナフィン；テルコナゾール；チオ コナゾール；トルナフテート；およびウンデシレン酸）を含む。さらに他の実施 態様において、組成物は、リポソームまたは徐放ビヒクルに取り込まれる。 さらに別の局面において、本発明は、感染を処置する方法を提供し、この方法 は、治療的有効量の薬学的組成物を患者に投与する工程を含む。感染は、例えば 、微生物（例えば、細菌（例えば、グラム陰性細菌もしくはグラム陽性細菌また は嫌気性菌；例としては、Actinetobacter spp.、Enterobacter spp.,E.coli、H .ｉnfluenzae、K.pneumoniae、P.aeruginosa,.S,marcescensおよびS.maltophili a)Bordetella pertussis；Bricella spp.；Campylobacterspp.；Haemophlius du creyi；Helicobacter pylori；Legionella spp.；Moraxella catarrhalis；Neis seria spp.；Salmonella spp.；Shigella spp.およびYersinia spp.；E．faecal is、S.aureus、E.faecium、S.pyrogenes、S.pneumoniaeおよび凝固酵素陰性stap hylococcus；Bacillus spp.；Corynebacterium spp.；Diphtheroids；Listeria spp.およびViridans Streptococcus；Closteridium spp.;Bacteroides spp.およ びPeptostreptococcus spp.；Borrelia spp.；Chlamydia spp.；Mycobacterium spp.；Mycoplasma spp.；Propionibacterium acne；Rickettsia spp.；Treponem aspp.およびUreaplasma spp.）、真菌（例えば、酵母および／またはカビ）、寄 生生物（例えば、原生動物、線形動物、条虫類、および吸虫類（例えば、Babesi a spp.；Balantidium coli；Blastocystis hominis；Cryptosporidium parvum； Encephalitozoon spp.；Entamoeba spp.；Giardia lamblia；Leishmania spp.； Plasmodium spp.；Toxoplasma gondii；Trichomonas spp.；Trypanosoma spp、A scaris lumbrlcoides；Clonorchis Sinensis；Echincoccus spp.；Faschiola he patica；Fasciolopsis buski；Heterophyes heterophyes；Hymenolepis spp.；S chistosoma spp.；Taenia spp.；およびTrichinella spiralis））あるいはウイ ルス（例えば、αウイルス；アレナウイルス；ブンヤウイルス；コロナウイルス ；エンテロウイルス；フィロウイルス；フラビウイルス；ハンタウイルス；HTLV -BLV;インフルエンザウイルス；レンチウイルス；リッサウイルス；パラミクソ ウイルス；レオウイルス；ライノウイルス；およびロタウイルス、アデノウイル ス；サイトメガロウイルス；ヘパドナウイルス；モラシポックスウイルス（Moll uscipoxvirus）：オルトポックスウイルス：パピローマウイルス；パルボウイ ルス；ポリオーマウイルス；単純ヘルペスおよびバリセロウイルス（Varicellov irus））により発症し得る。 他の局面において、組成物が提供され、この組成物はインドリシジンアナログ および抗生物質を含む。さらに、デバイス（医療用デバイスであり得る）が提供 され、このデバイスはインドリシジンでコーティングされそしてさらに抗生物質 を含み得る。 他の局面において、本明細書中に記載されるいずれか一つと特異的に反応する 抗体が提供される。抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体または単鎖抗体で ある。 好ましい局面において、本発明は、活性化ポリオキシアルキレングリコールお よび脂肪酸を含む結合体でのアミノ基の誘導体化により修飾された化合物を含む 組成物を提供する。好ましい実施態様において、この結合体は、さらに、ポリオ キシアルキレングリコールおよび脂肪酸を連結するソルビタンを含み、より好ま しくは、ポリソルベートである。好ましい実施態様において、脂肪酸は、12〜18 炭素であり、そしてポリオキシアルキレングリコールは、ポリオキシエチレン（ 例えば、鎖長が２〜100）である。特定の実施態様において、化合物は、ペプチ ドまたはタンパク質（例えば、カチオン性ペプチド（例えば、インドリシジンま たはインドリシジンアナログ））である。好ましい実施態様において、ポリオキ シアルキレングリコールは、紫外光での照射により活性化される。 本発明はまた、活性化ポリオキシアルキレンおよび脂肪酸の結合体で修飾され た化合物を作製する方法を提供する。この方法は以下：（a）活性化ポリオキシ アルキレングリコールおよび脂肪酸の結合体とこの化合物との混合物を凍結させ る工程；および（b）凍結混合物を凍結乾燥する工程を包含し；ここでその化合 物は、遊離のアミノ酸を有する。好ましい実施態様において、化合物は、ペプチ ドまたは抗生物質である。他の好ましい実施態様において、工程（a）における 混合物は、酢酸緩衝液中である。関連する局面において、この方法は、活性化ポ リオキシアルキレングリコールおよび脂肪酸の結合体とこの化合物とを、修飾化 合物を形成するのに充分な時間混合する工程（ここでこの混合物は8.5より大き いpHを有する炭酸緩衝液に存在し、そしてこの化合物は遊離アミノ基を有する） を含む。修飾化合物は、逆相HPLCおよび／または有機溶媒からの沈降により単離 され得る。 本発明はまた、少なくとも１つの修飾化合物および生理学的に受容可能な緩衝 液を含む薬学的組成物を提供し、そして特定の実施態様において、本発明は、さ らに、抗生物質、抗ウイルス剤、駆虫剤、および／または抗真菌剤を含む。この 組成物は、感染（例えば、微生物（例えば、細菌、真菌、寄生生物、およびウイ ルス）により発症する）を処置するために使用され得る。 本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参 照することにより明らかになる。さらに、種々の参考文献が以下に示されており 、これらは、特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）をより詳述し 、それゆえそれらの全体が参考として援用される。 図面の簡単な説明 図１は、MBI-11融合タンパク質を含む全細胞由来の封入体（ib）の抽出プロフ ィールを示すSDS-PAGEである。融合タンパク質バンドは、矢印の先端により示さ れる。レーン１、タンパク質標準；レーン２、プラスミドを含まないXL-1 Blue の総溶解物；レーン３、30℃で培養された、XLl Blue（pR2h-11,pGP1-2）の総溶 解物；レーン４、42℃で培養された、XLl Blue（pR2h-11,pGP1-2）の総溶解物； レーン５、Triton X100洗浄後の封入体の不溶性画分；レーン６、MBI-11融合タ ンパク質の有機抽出物；レーン７、有機抽出溶媒に不溶性の濃縮物質。 図２は、プラスミドpPDR2h-11を使用するMBI-11融合タンパク質の発現プロフ ィールを示すSDS-PAGEである。レーン１、タンパク質標準；レーン２、有機溶媒 抽出MBI-11；レーン３、30℃で培養された、XLl Blue（pPDR2h-11,pGP1-2）の総 溶解物；レーン４、42℃で培養された、XLl Blue（pPDR2h-11,pGP1-2）の総溶解 物。 図３は、MBI 11CN、MBI 11F4CNおよびMBI 11B7CNについての時間殺傷（time k ill）アッセイの結果を示す。コロニー形成単位数（×10-4）を時間に対してプ ロットする。 図４は、種々の緩衝液におけるMBI 11CNペプチドの可溶性の程度を示すグラフ である。 図５は、処方物C1（左のグラフパネル）および処方物Ｄ（右のグラフパネル） MBI 11CNの逆相HPLCプロフィールである。 図６は、MBI 11CNおよびMBI 11B7CNのCDスペクトルを表す。 図７は、タンパク質に対して種々の脂質の比率の卵PCリポソームのANTS/DPX染 料放出の結果を表す。 図８は、テリフィック（terrific）ブロス（TB）またはLuria-Bretaniブロス （LB）中で増殖させた対数中期細胞に対するMBI 11B7CNの活性を示すグラフを表 す。 図９は、細菌をMBI 10CN、MBI 11CN、またはコントロールペプチド単独あるい はバリノマイシンと組み合わせての処置の結果を示す。 図10は、NaClまたはMg2+の存在下のMBI 11B7CNでの細菌の処置を示すグラフで ある。 図11は、経時的な血漿中の遊離MBI 11CNのインビトロ量を表すグラフである。 データは、処方物C1および処方物Ｄにおけるペプチドについて示される。 図12は、静脈内注射後の種々の時間における血液中のインビボMBI 11CNレベル における変化を表すグラフである。 図13は、静脈内注射後の種々の時間における血漿中のインビボMBI 11CNレベル における変化を表すグラフである。 図14は、MBI 10CN、アンピシリン、およびビヒクルの腹腔内注射後のMSSA感染 を生存動物の数を示すグラフである。 図15は、MBI 11CN、アンピシリン、およびビヒクルの腹腔内注射後のMSSA感染 を生存動物の数を示すグラフである。 図16は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11AlCNインビボ試験の結果を示すグラ フである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith) での感染後１時間でのip注射により投与される。 図17は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11E3CNインビボ試験の結果を示すグラ フである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith) での感染後１時間でのip注射により投与される。 図18は、S.aureus(Smih)に対するMBI 11F3CNインビボ試験の結果を示すグラフ である。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith)で の感染後１時間でのip注射により投与される。 図19は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11G2CNインビボ試験の結果を示すグラ フである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith) での感染後１時間でのip注射により投与される。 図20は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11CNインビボ試験の結果を示すグラフ である。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith)で の感染後１時間でのip注射により投与される。 図21は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11BlCNインビボ試験の結果を示すグラ フである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith) での感染後１時間でのip注射により投与される。 図22は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11B7CNインビボ試験の結果を示すグラ フである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith) での感染後１時間でのip注射により投与される。 図23は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11B8CNインビボ試験の結果を示すグラ フである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith) での感染後１時間でのip注射により投与される。 図24は、S.aureus(Smith)に対するMBI 11G4CNインビボ試験の結果を示すグラ フである。種々の濃度で処方されたペプチドは、ip注射によるS.aureus(Smith) での感染後１時間でのip注射により投与される。 図25AおよびBは、MBI 10CN、ゲンタマイシン、またはビヒクルの静脈内注射後 にS.epidermidis感染を生存動物の数を示すグラフを表示する。パネルA、i.v.注 射、注射後15分；パネルＢ、i.v.注射、注射後60分。 図26は、MBI 11CN、ゲンタマイシン、またはビヒクルの静脈内注射後のMRSA感 染マウスの生存動物の数を示すグラフである。 図27は、還元剤での活性化ポリソルベート処置後、APS-ペプチド処方物につい てのサンプルを分析するRP-HPLCの軌跡を示す。APS-MBI-11CNペプチドは、200mM 酢酸−NaOH、pH4.6、1mg/ml IMBI 11CN、および0.5％活性化ポリソルベート80中 における凍結乾燥を介して形成される。活性化2.0％ポリソルベートのストック 溶液は、（a）還元剤なし、（b）150mM 2-メルカプトエタノール、または(c)150 mM水素化ホウ素ナトリウムで、使用の直前１時間処置される。 図２８は、水性溶液中で経時的にAPS-MBI 11CNの形成のモニタリングをトレー スするRP-HPLCを示す。この反応は、200mMの炭酸ナトリウム緩衝液pH10.0、1mg/ ml MBI 11CN、0.5％活性化ポリソルベート80中で起こる。アリコートを、反応容 器から示された時点で取り出し、そして直ちにRP-HPLCにより分析した。 発明の詳細な説明 本発明を呈示する前に、その理解のために、本明細書で用いられる特定の用語 の定義を呈示することが有用であり得る。 本明細書中のアミノ酸の名称は、標準の１つまたは３文宇コードのいずれかと して呈示される。大文字はＬ型アミノ酸を示し；小文字は型アミノ酸を示す。 本明細書で用いられる「インドリシジン」は、抗微生物性のカチオン性ペプチ ドをいう。インドリシジン類は種々の生物から単離され得る。１つのインドリシ ジンは、ウシ好中球から単離され、そしてその天然形態中のカルボキシ末端でア ミデート化された13アミノ酸のペプチドである(Selstedら、J．Biol．Chem．267 :4292，1992)。インドリシジンのアミノ酸配列は、配列番号１に示される。 本明細書で用いられる、インドリシジンの「ペプチドアナログ」、「アナログ 」、または「改変体」は、長さが少なくとも５アミノ酸であり、少なくとも１つ の塩基性アミノ酸(例えばアルギニンおよびリジン)を有し、そして抗微生物活性 を有する。特に指示がなければ、命名されたアミノ酸はＬ型を意味する。塩基性 アミノ酸は、アルギニン、リジン、および誘導体を含む。疎水性残基は、トリプ トファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、および誘導体 を含む。 本発明の範囲内にはまた、メチル化(例えばαメチルバリン)、(特にアルキル アミンによるＣ末端アミノ酸の)アミデート化(例えばエチルアミン、エタノール アミン、およびエチレンジアミン)およびアミノ酸側鎖の修飾(リジンのεアミノ 基アシル化など)のような化学的手段により修飾されたアミノ酸誘導体が含まれ る。アナログに取り込まれ得る他のアミノ酸には、タンパク質中に一般に見出さ れる20のＬアミノ酸、イミノアミノ酸、ヒドロキシリジンのような稀少アミノ酸 、またはホモセリンおよびオルニチンのような非タンパク質アミノ酸に相当する 任意のＤアミノ酸が含まれる。ペプチドアナログは、これら誘導体、およびＤア ミノ酸を有さずまたは１つ以上を有し得る。さらに、ペプチドはまた、レトロ、 インベルトまたはレトロ-インベルトペプチドとして合成され得る。 Ａ．インドリシジンアナログ類 上記のように、本発明はインドリシジンアナログを提供する。これらのアナロ グは、化学的方法、特に自動化ペプチド合成器を用いる方法により合成され、ま たは組換え法により産生され得る。アミノ酸配列の選択は、本明細書に呈示され る一般式により案内される。 １．ペプチドの特性 本発明はインドリシジンアナログを提供する。このアナログは、長さが少なく とも５または７アミノ酸であり、そして好ましくは15、20、25、27、30、または 35アミノ酸を超えない。９〜14残基のアナログが好ましい。 本発明の範囲にあるペプチドアナログの一般式は以下のように呈示され得る： ＲＸＺＸＸＺＸＢ (1) ＢＸＺＸＸＺＸＢ (2) ＢＢＢＸＺＸＸＺＸＢ (3) ＢＸＺＸＸＺＸＢＢＢn(ＡＡ)nＭＩＬＢＢＡＧＳ (4) ＢＸＺＸＸＺＸＢＢ(ＡＡ)nＭ (5) ＬＢＢnＸＺnＸＸＺnＸＲＫ (6) ＬＫnＸＺＸＸＺＸＲＲＫ (7) ＢＢＸＺＸＸＺＸＢＢＢ (8) ＢＢＸＺＸＸＺＸＢＢＢ (9) ここで、標準の１文字アミノ酸略語が用いられ、そして；Ｚはプロリン、グリ シンまたは疎水性残基であり、そして好ましくはＺはプロリンまたはバリンであ り；Ｘはトリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンおよびバ リンのような、そして好ましくはトリプトファンである疎水性残基であり；Ｂは 塩基性アミノ酸、好ましくはアルギニンまたはリジンであり；ＡＡは任意のアミ ノ酸、そしてｎは０または１である。式(2)において、少なくとも１つのＺはバ リンであり；式(8)において、少なくとも２つのＸはフェニルアラニンであり； そして式(9)において、少なくとも２つのＸはチロシンである。さらなる残基が 、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその両方に存在し得る。 上記のように、ＮまたはＣ末端を含む任意の残基の修飾は本発明の範囲内にあ る。Ｃ末端の好ましい修飾はアミデート化である。Ｃ末端のその他の修飾は、エ ステル化およびラクトン形成を含む。Ｎ末端修飾は、アセチル化、アシル化、ア ルキル化、ＰＥＧ化、ミリスチル化などを含む。さらに、ペプチドは、以下に記 載されるように、修飾されてAPSペプチドを形成し得る。ペプチドはまた、放射 活性標識、蛍光標識、マススペクトルタグ、ビオチンなどによるように標識され 得る。 ２．ペプチド合成 ペプチドアナログは、自動化手順による合成を含む標準的な化学的方法により 合成され得る。一般に、ペプチドアナログは、カップリング試薬としてのHATUを 用いる標準の固相Fmoc保護戦略を基に合成される。ペプチドは、これもまた側鎖 官能基を脱保護する適切なスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸を用いて固相 樹脂から切断される。粗製ペプチドは、調製用逆相クロマトグラフィーを用いて さらに精製される。分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動、または イオン交換クロマトグラフィーのようなその他の精製方法が使用され得る。 tBoc保護戦略のような当該分野で公知のその他の合成手順、または異なるカッ プリング試薬などの使用が、等価なペプチドを産生するために採用され得る。 ペプチドは線状分子として、または分枝分子として合成され得る。代表的には 、分枝ペプチドは、さらなるペプチドに対して多くの付着点を提供するコアペプ チドを含む。リジンは、コアペプチド用に最も普通に用いられる。なぜなら、そ れは１つのカルボキシル官能基と２つ(αおよびε)のアミン官能基を有するから である。その他のジアミノ酸もまた用いられ得る。好ましくは、２または３レベ ルのいずれかで幾何学的に分枝したリジンが用いられる；これらのコアは、それ ぞれ、テトラマーおよびオクタマーのコア構造を形成する(Tam，Proc．Natl．Ac ad. Sci．USA 85:5409，1988)。図示すれば、これらのコアの例は以下のように表さ れる： 代表的には、ペプチドに対する付着点は、それらのカルボキシル官能基からリ ジンのαまたはεアミン基のいずれかまでにある。これらのマルチマーペプチド を合成するために、固相樹脂はコアマトリックスで誘導体化され、そして次の合 成および樹脂からの切断は標準的な手順に従う。代表的には、次いで、マルチマ ーペプチドは、マルチマーのみを保持するポアサイズの膜を用いる、４Ｍグアニ ジン塩酸、次いで水に対する透析により精製される。マチルマーペプチドは、本 発明の文脈内では、任意の線状ペプチドに関して使用され得、そしてこのペプチ ドに対する抗体を生成する使用に好適である。 ３．ペプチド類の組換え産生 あるいは、ペプチドアナログは組換え産生により合成され得る(例えば米国特 許第5,593,866号を参照のこと)。ペプチドアナログの産生には種々の宿主系が好 適であり、細菌(例えばE.coli)、酵母(例えばSaccharomyces cerevisiae)、昆虫 （例えばSf9)、および哺乳動物細胞(例えばCHO、COS-7)を含む。多くの発現ベク ターが開発され、そしてこれらの宿主の各々について利用可能である。一般に、 細菌細胞および細菌で機能的であるベクターが本発明で用いられる。しかし、し ばしば他の宿主で機能的であるベクターを有することが好ましい。E.coli中のク ロ−ニングおよび発現のためのベクターおよび手順は、本明細書中、そして、例 えば、Sambrookら(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harb or Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1987)およびAusubelら(Curren t Protocols in Molecular Biology，Greene Puslishing Co.，1995)で論議され る。 １つ以上のインドリシジンアナログをコードするDNA配列は、宿主に適切な発 現ベクター中に導入される。好適な実施態様では、アナログ遺伝子は、ベクター 中にクローン化され融合タンパク質を作成する。融合パートナーは、細菌宿主が ペプチドの毒性効果から保護されるようなアニオン性領域を含むために選択され る。この保護領域は、ペプチドの抗微生物効果を効果的に中和し、そしてまた宿 主プロテアーゼによるペプチド分解を防ぎ得る。本発明の融合パートナー(キャ リアタンパク質)は、融合タンパク質を、封入体、ペリプラズム、外膜、または 細胞外環境に輸送するためにさらに機能し得る。本発明の分脈において適切なキ ャリアタンパク質は、制限されないが、特に、グルタチオン-S-トランスフェラ ーゼ(GST)、Staphylococcus aureus由来のプロテインＡ、プロテインＡの２つの 合成IgG結合性ドメイン（ZZ）、外膜プロテインＦ、βガラクトシダーゼ(lacZ) 、およびバクテリオファージλおよびバクテリオファージT7の種々の産物を含む 。本明細書中で提供される教示から、キャリアとして他のタンパク質が用いられ 得ることは明らかである。さらに、保護的アニオン性領域が存在する限り、完全 なキャリアタンパク質を用いる必要はない。ペプチド配列の単離を容易にするた めに、化学的切断(例えばCNBr)または酵素的切断(例えばV8プロテアーゼ、トリ プシン)を受けるアミノ酸を用いてペプチドおよび融合パートナーを架橋する。E .ｃoli中の発現には、好ましくは、融合パートナーは、封入体形成に向けた発現 を行う通常の細胞内タンパク質である。このような場合、最終産物を放出するた めの切断の後は、ペプチドの再生の必要はない。本発明では、融合パートナーお よびペプチド遺伝子を含むDNAカセットが、プラスミド、ウイルスまたは当該分 野で公知の他のビヒクルであり得る発現ベクター中に挿入され得る。好ましくは 、発現ベクターは、誘導的または構成的プロモーターを含むプラスミドであり、 宿主中で挿入されたDNA配列の効果的な転写を容易にする。組換えDNAを用いた宿 主細胞の形質転換は、Ca++介在技法により、エレクトロポーレーション、または 当業者に周知のその他の方法により実行され得る。 簡単に述べれば、ペプチドアナログをコードするDNAフラグメントは、存在す るcDNAまたはゲノムクローンまたは合成に由来する。便利な方法は、一本鎖テン プレートからの遺伝子の増幅である。一般に、テンプレートは、自動化オリゴヌ クレオチド合成の産物である。増幅プライマーは、テンプレートの５'および３' 末端に由来し、そして代表的には、ベクターのクローニング部位に関して選択さ れた制限部位を取り込んでいる。必要であれば、翻訳開始および停止コドンをプ ライマー配列中に加工し得る。タンパク質をコードする配列は、特定宿主におけ る発現にコドンが最適化され得る。従って、例えば、アナログ融合タンパク質が 細菌中で発現される場合、コドンは細菌の使用に最適化される。コドン最適化は 、全長遺伝子または遺伝子領域の自動化合成、複数オリゴヌクレオチドの連結、 天然配列の変異誘発、または当業者に公知のその他の技術により成し遂げられる 。 最小限、発現ベクターはプロモーター配列を含むべきである。しかし、その他 の調節配列もまた含まれ得る。このような配列は、エンハンサー、リボソーム結 合部位、転写終結シグナル配列、分泌シグナル配列、複製起点、選択マーカーな どを含む。調節配列は、互いに作動可能に連結され転写および次の翻訳を可能に する。好適な局面では、本明細書で発現に用いられるプラスミドは、細菌におけ るタンパク質の発現のために設計されたプロモーターを含む。適切なプロモータ ーは、構成的および誘導性プロモーターの両方を含み、広く入手可能でありそし て当該分野で周知である。細菌における発現に一般に用いられるプロモーターは 、T7、T3、T5、およびSP6ファージ、およびtrp，lpp、およびlacオペロンからの プロモーターを含む。tacおよびtrcのようなハイブリッドブロモーター(米国特 許第4,551,433号を参照のこと)もまた用いられ得る。 好適な実施態様では、ベクターは転写ターミネーター配列を含む。「転写ター ミネーター領域」は、選択されたプロモーターを認識するポリメラーゼによる転 写を終結するシグナルを提供する配列である。転写ターミネーターは、それが宿 主中で機能的である限り、融合パートナー遺伝子または別の遺伝子から得られ得 る。 好適な実施態様では、ベクターは細菌細胞中で複製し得る。従って、ベクター は、細菌複製起点を含み得る。好適な細菌複製起点は、fl-oriおよびcol E1 ori 、特にpUCプラスミド由来のoriを含む。低コピー数ベクター(例えばpPD100)もま た、特に産物が宿主に対して有害であるとき用いられ得る。 好ましくは、プラスミドはまた、宿主中で機能的である少なくとも１つの選択 マーカーを含み得る。選択マーカー遺伝子は、宿主に対して、形質転換された細 胞が同定および/または選択的に増殖し得る表現型を与える。細菌宿主に対する 適切な選択マーカー遺伝子は、クロラムフェニコール耐性遺伝子(Cmr)、アンピ シリン耐性遺伝子(Ampr)、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tcr)、カナマイシン耐 性遺伝子(Kanr)、および当該分野で公知のその他を含む。選択において機能する ために、いくつかのマーカーは、宿主に相補的な欠陥を必要とし得る。 いくつかの局面では、ペプチドアナログをコードするヌクレオチドの配列はま た、得られるペプチドが前駆体タンパク質として合成され、次いでプロセッシン グされそして分泌されるように、分泌シグナルをコードし得る。得られる分泌タ ンパク質はまた、ペリプラズム空間または発酵培地から回収され得る。使用に適 切な分泌シグナルの配列は、広く入手可能であり、そして周知である(von Heijn e，J．Mol．Biol．184:99-105，1985)。 ベクターはまた、リプレッサー結合部位を含むプロモーターの転写を抑制し得 るリプレッサータンパク質をコードする遺伝子を含み得る。細胞の生理学的条件 を変えることにより、プロモーターを脱抑制し得る。例えば、リプレッサーに競 合的に結合する分子が添加され得、または増殖培地の温度が改変され得る。リプ レッサータンパク質は、制限されないが、E.coli lacIリプレッサー(IPTGによる 誘導に反応性)、温度感受性λcI857リプレッサーなどを含む。 細菌における発現のためのプラスミドの例は、pET発現ベクターpET3a、pET11a 、pET12a-c、およびpET15bを含む(米国特許第4,952,496号；Novagen，Madison， WIから入手可能、参照のこと)。低コピー数ベクター(例えばpPD100)もまた、E.c oli宿主に有害なペプチドの効果的な過剰生産に用いられ得る(Derschら、FEMS M icrobiol．Lett．123:19，1994)。 T7発現ベクター用の細菌宿主は、E.coli株HMS174(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysS ,HMS174(DE3)およびBL21(DE3)中に見出されるような、誘導性プロモーター（例 えばlacUVプロモーター；米国特許第4,952,496号を参照のこと)に作動可能に連 結されたT7 RNAポリメラーゼをコードするDNAの染色体コピーを含み得る。T7 RN Aポリメラーゼはまた、T7発現ベクターと適合するプラスミド上に存在し得る。 このポリメラーゼは、λプロモーターおよびリプレッサーの制御下に存在し得る (例えばpGP1-2;TaborおよびRichardson，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82:1074 ，1985)。 ペプチドアナログタンパク質は、アフィニティー、サイズ排除、またはイオン 交換クロマトグラフィー、HPLCなどのような標準的な技法により単離される。好 ましくは、単離されたペプチドは、SDS-PAGEのクマシーブルー染色により、少な くととも物質の90％である主要バンドを示すべきである。 ４．増幅を基礎にする半ランダム変異誘発によるアナログの生成 インドリシジンアナログは、プライマーが、コードされた親ペプチド、例えば インドリシジンの５'および３'末端の標的配列に設計される増幅(例えばPCR)を 基礎にする手順を用いて生成され得る。増幅条件は、合成の間に熱安定性ポリメ ラーゼによるヌクレオチドの誤取り込みを促進するよう選択される。従って、ラ ンダム変異が元の配列中に導入され、そのいくつかはアミノ酸改変を生じる。増 幅産物は、受容可能な宿主中でパッケージ化されかつ増幅され提示ライブラリー を生成する、ファージミドベクターのようなファージベクターのコートタンパク 質中にクローン化され得る。 次いで、これらのライブラリーは、ペプチドの抗生物活性についてアッセイさ れ得る。簡単に述べれば、ライブラリーで感染された細菌が、プレートに播かれ 、増殖させ、そしてファージが感染し得ない細菌株を含むアガロースで重層され る。アガロース重層中の増殖阻害のゾーンが、抗細菌活性を有するアナログを発 現するファージの領域中で観察される。これら阻害性ファージが単離され、そし てクローン化されたペプチド配列がDNA配列分析により決定される。次いで、ペ プチドは独立に合成され得、そしてその抗生物活性がさらに調査される。 ５．インドリシジンアナログに対する抗体 代表的には、小さな非免疫原性ペプチジルコアに連結されたペプチドの約８コ ピーを含み、免疫原を形成する多重抗原性ペプチド(MAP)を用いて、特定のペプ チドアナログに対する抗体が生成される。（一般に、HarlowおよびLane、前述、 を参照のこと）MAPは、ウサギまたはマウスまたはその他の齧歯類中に皮下注射 され、そこで、それらは、抗体産生を容易にするに十分長い半減期を有し得る。 12週間後、血液サンプルを採取し、血清を分離し、そして元のペプチドに対して ELISAアッセイ中で試験され、陽性の結果は、標的ペプチドに対して特異的な抗 体の存在を示す。次いで、この血清を貯蔵し、そしてELISAアッセイ中で使用し 得、特定のアナログの量を特異的に測定する。あるいは、抗体産生の他の標準的 方法、例えばモノクローナル抗体の生成を使用し得る。 本発明の分脈において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、 抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント(例えばFab、およびF(ab')2、Fv可変 領域、または相補性決定領域）を含むことが理解される。一般に、抗体は、それ らが、10-7Ｍより大きいか等しい、好ましくは10-8Ｍより大きいか等しいKdで結 合する場合、インドリシジンアナログに対して特異的として受容される。モノク ローナル抗体または結合パートナーの親和性は、当業者により容易に決定され得 る(Scatchard，Ann．N.Y．Acad．Sci．51:660-672，1949を参照のこと)。一旦適 切な抗体が得られたなら、それらは、当業者に周知の多くの技法により単離また は精製され得る。 モノクローナル抗体はまた、従来技法(米国特許第RE32,011号，第4,902,614号 ，第4,543,439号，および第4,411,993号を参照のこと；Antibodies:A Laborator y Manual，HarlowおよびLane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press，198 8もまた参照のこと)。簡単に述べれば、１つの実施態様では、一般に、ラットま たはマウスのような被験体動物に、ペプチドを、免疫応答を増大するために、フ ロイントの完全または不完全アジュバントのようなアジュバント中のエマルジョ ンとして注射する。一般に、動物は、脾臓および/またはリンパ節の回収ならび にこれら細胞の不死化の前に、少なくとも１回追加免疫される。エプスタインバ ールウイルスまたは融合により介在されるようなハイブリドーマを生成するため の種々の不死化技法が用いられ得る。好適な実施態様では、不死化は、適切なミ エローマ細胞株との融合により生じ、モノクローナル抗体を分泌するハイブリド ーマを生成する。適切なミエローマ株は、例えば、NS-1(ATCC No．TIB 18)、お よびP3X63‐Ag8.653(ATCC No．CRL 1580)を含む。好適な融合パートナーは、内 因性の抗体遺伝子を発現しない。約７日後、ハイブリドーマを、テロメラーゼタ ンパク質に反応性の抗体の存在についてスクリーニングし得る。広範な種類のア ツセイが利用され得る(Antibodies:A Laboratory Manual，HarlowおよびLane (編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988を参照のこと)。 モノクローナル抗体を構築するためにその他の技法もまた利用され得る(組換 え技法を記載する、Huseら、Science 246:1275-1281，1989;Sastryら、Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 86:5728-5732，1989;Alting-Meesら、Strategies in Molec ular Biology 3:1-9，1990;を参照のこと)。これらの技法は、λImmunoZap(H)お よびλImmunoZap(L)のような適切なベクター中の重鎖および軽鎖免疫グロブリン cDNAのクローニングを含む。これらの組換え体は、個々にスクリーニングされる か、または同時発現されてFabフラグメントまたは抗体を形成し得る(Huseら、前 述；Sastryら、前述、を参照のこと)。次いで、陽性プラークを、E.coliからモ ノクローナル抗体フラグメントの高レベル発現を可能にする非溶菌性のプラスミ ドに転換し得る。 同様に、抗体のFabおよびFvフラグメントのような部分またはフラグメントが また、従来の酵素的消化または組換えDNA技法を利用して構築され、単離された 抗体の可変領域を生じ得る。１つの実施態様では、目的のモノクローナル抗体を 産生するハイブリドーマからの可変領域をコードする遺伝子が、可変領域に対す るヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。さらに、抗体の結合特異性を 改変することなく、「マウス」抗体を「ヒト」抗体に変化するための技法を利用 し得る。 Ｂ．試験 本発明のインドリシジンアナログは、単独または抗生物質もしくは別のアナロ グとの組合せで、抗生物質治療薬剤としての可能性について、一連のアッセイを 使用して評価される。好ましくは、すべてのペプチドは、最初に、インビトロで 評価され、最も見込みのある候補がインビボでのさらなる評価のために選択され 、そしてこれらアッセイの結果を使用して、前臨床試験のための候補が選択され る。インビトロアッセイには、抗生物質活性、毒性、溶解性、薬理学、二次構造 、リポソーム透過などの測定が含まれる。インビボアッセイには、動物モデルに おける効力、抗原性、毒性などの評価が含まれる。一般に、インビトロアッセイ がまず実施され、続いてインビボアッセイが実施される。 １．インビトロアッセイ インドリシジンアナログは、抗生物質活性について、アガロース希釈MICアッ セイまたはブロス希釈もしくはタイムキル(time-kill)アッセイのようなアッセ イによって評価される。抗生物質活性は、微生物(例えば、細菌、真菌)の増殖の 阻害または死滅として測定される。簡単に述べると、カルシウムおよびマグネシ ウムを補充したMueller Hintonブロス中の候補アナログを、溶融アガロースと混 合する。ブロスと寒天との他の処方物は、ペプチドアナログが培地全体を自由に 拡散し得る限り、使用され得る。アガロースをペトリ皿またはウェルに注ぎ、凝 固させ、そして試験株をアガロースプレートに塗布する。試験株は、アナログの 意図される適用に一部基づいて選択される。したがって、例として、S.aureusに 対する活性を有するアナログが所望される場合、S.aureus株が使用される。試験 種のいくつかの株および/または臨床単離株について、アナログをアッセイする ことが所望され得る。プレートを一晩インキュベートし、そして翌日、細菌増殖 について視覚的に検査する。アナログの最小阻害濃度(MIC)は、生物の増殖を完 全に阻害する、アナログの最低濃度である。試験株または株の群に対して良好な 活性を示す(代表的には、16μｇ/ml以下のMICを有する)アナログを、さらなる試 験のために選択する。 選択されたアナログは、正常哺乳動物に対する毒性についてさらに試験され得 る。例示的なアッセイは、赤血球(RBC)溶血アッセイである。簡潔には、赤血球 を、代表的には遠心分離によって全血から単離し、そして血漿成分を含まないよ うに洗浄する。等張生理食塩水中の赤血球の１％(v/v)懸濁物を、異なる濃度の ペプチドアナログとともにインキュベートする。一般に、アナログは適切な処方 緩衝液に存在する。約１時間で37℃にてのインキュベーション後、細胞を遠心分 離し、そして上清の540nmの吸光度を測定する。溶解の相対的測定値は、NH4Clま たは等価物(100％値を確立する)を使用する赤血球の完全な溶解後の吸光度との 比較によって決定される。実施例８に例示するような、細胞溶解性でないかまた は僅かに中程度に細胞溶解性であるアナログが所望され、そしてさらなるスクリ ーニングに適切である。他のインビトロ毒性アッセイ(例えば、培養哺乳動物細 胞に対する毒性の測定)が、インビトロ毒性を評価するために使用され得る。 処方緩衝液中ペプチドアナログの溶解性は、検査され得るさらなるパラメータ である。いくつかの異なるアッセイ(例えば、緩衝液中での出現)が使用され得る 。簡潔には、ペプチドアナログを、溶液(例えば、ブロスまたは処方緩衝液)中に 懸濁する。出現を、(ａ)透明(沈澱物なし)から、(ｂ)軽微(拡散した沈澱物)、( ｃ)白濁(激しい沈澱物)までに及ぶスケールに従って評価する。より細かい格付 けを使用し得る。一般に、沈澱物が少ないほどより望ましい。しかし、いくらか の沈澱物は許容され得る。 アナログの治療薬としての可能性を評価するために、さらなるインビトロアッ セイが実行され得る。このようなアッセイには、処方物中のペプチドの溶解性、 血中もしくは血漿中の薬理学、血清タンパク質結合、(例えば、円偏光二色性に よる)二次構造の分析、リポソーム透過、および細菌内膜透過が含まれる。一般 に、アナログは溶解性であり、そしてインドリシジンより良好に実施することが 望ましい。 ２．インビボアッセイ インビトロアッセイの結果に基づいて選択されたアナログは、効力、毒性など についてインビボで試験され得る。 選択されたアナログの抗生物質活性は、動物モデルを使用して、微生物の感染 を改善する能力についてインビボで評価され得る。これらのアッセイにおいて、 ビヒクル単独での阻害に比べて微生物増殖の阻害が統計学的に有意であれば、ア ナログは治療薬として有用である。これらの測定は、体液または身体部位から単 離した培養物から直接的に、または感染した動物の生存率を評価することによっ て間接的になされ得る。抗菌活性の評価のためには、いくつかの動物モデル、例 えば、(ａ)正常マウスに致死用量の微生物を投与するか、(ｂ)好中球減少性マウ スに致死用量の微生物を投与するか、または(ｃ)ウサギの心臓に接種物を投与す るモデルを含む急性感染モデル、および慢性感染モデルが利用可能である。選択 されるモデルは、アナログの意図される臨床適応症に一部依存する。 例として、１つのこのような正常マウスモデルにおいて、マウスは、致死用量 の細菌をipまたはiv接種される。代表的には、用量は、90〜100％の動物が２日 以内に死亡する用量である。このアッセイのための微生物株の選択は、アナログ の意図される適用に一部依存し、そして記載した実施例においては、３つの異な るStaphylococcus株を用いるアッセイが実行される。簡潔には、接種の直前もし くは直後(一般には、60分以内)に、適切な処方緩衝液中のアナログを注射する。 アナログの複数注射を行い得る。感染後８日間まで動物を観察し、そして動物の 生存を記録する。首尾よい処置は、動物を死亡から救済するか、または無処置コ ントロール動物と比較して統計学的に有意なレベルまで、死亡を遅延させるかい ずれかする。インドリシジン自体より良好な効力を示すアナログが好ましい。 意図される臨床的使用によって一部分規定される経路により、動物(代表的に は、マウス)に所定の範囲の用量を投与することによって、アナログのインビボ 毒性が測定される。動物の生存が記録され、そしてアナログ間の比較を可能にす るために、LD50、LD90-100および最大寛容用量(MTD)が計算され得る。インドリ シジンより毒性の少ないアナログが好ましい。 臨床的開発についてのアナログの選択を補助するために、さらなるインビボア ッセイが実行され得る。例えば、代表的には、処方緩衝液中のアナログを正常動 物(一般的には、マウス、ラット、またはウサギ)に注射することによって、アナ ログの免疫原性が評価され得る。注射後種々の時間で、血清が得られ、そしてア ナログと結台する抗体の存在について試験される。複数注射後の試験、処置プロ トコルの模擬もまた実施され得る。アナログに対する抗体は、ELISA、免疫沈降 アッセイ、ウェスタンブロット、および他の方法により同定され得る。(Harlow およびLane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laborator y Press、Cold Spring Harbor、NY、1988を参照)。抗体産生を惹起しないかまた は最小限の抗体産生を惹起するアナログが好ましい。さらに、動物におけるアナ ログの薬物動態およびアナログで処置した動物の組織病理学が測定され得る。 潜在的治療薬としてのインドリシジンアナログの選択は、インビトロおよびイ ンビボアッセイの結果に基づく。一般に、高用量レベルで低い毒性を示しそして 低用量レベルで高い効力を示すペプチドアナログが好ましい候補である。 ３．相乗作用アッセイ 抗生物質または別のアナログとの組合せでアナログを評価するために、組合せ が上記の一連のアッセイにかけられ得る。抗生物質には、生命を妨げるか、阻害 するか、または破壊する傾向があるいずれの化学物質などが含まれ、抗生物質に は、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、および駆虫剤が含まれる。単に例として 、抗菌性抗生物質が議論される。成分を混合および投与する方法は、組合せの意 図される臨床的使用に依存して変化する。 簡潔には、インビトロ抗菌活性についての１つのアッセイ(アガロース希釈ア ッセイ)を、それぞれが種々の濃度のペプチドアナログと抗生物質との組合せを 含む一連のプレートを使用してセットする。プレートに細菌単離物を接種し、プ レートをインキュベートし、そしてその成分のMICを記録する。次いで、これら の結果を使用して、FICを計算する。試験に使用する抗生物質には、ペニシリン 、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、カルバペネム、モノバ クタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、キノロン、テトラサイクリン、マ クロライド、およびフルオロキノロンが含まれるが、これらに限定されない(下 記の表１を参照)。 抗生物質の例には、ペニシリンＧ(CAS登録番号61-33-6)；メチシリン(CAS登録 番号61-32-5)；ナフシリン(CAS登録番号147-52-4)；オキサシリン(CAS登録番号6 6-79-5)；クロキサシリン(CAS登録番号61-72-3)；ジクロキサシリン(CAS登録番 号3116-76-5)；アンピシリン(CAS登録番号69-53-4)；アモキシシリン(CAS登録番 号26787-78-0)；チカルシン(CAS登録番号34787-01-4)；カルベニシリン(CAS登録 番号4697-36-3)；メズロシリン(CAS登録番号51481-65-3)；アズロシリン(CAS登 録番号37091-66-0)；ピペラシリン(CAS登録番号61477-96-1)；イミペネム(CAS登 録番号74431-23-5)；アズトレオナム(CAS登録番号78110-38-0)；セファロチン(C AS登録番号153-61-7)；セファゾリン(CAS登録番号25953-19-9)；セファクロール (CAS登録番号70356-03-5)；セファマンドールフォルメートナトリウム(CAS登録 番号42540-40-9)；セフォキシチン(CAS登録番号35607-66-0)；セフロキシム(CAS 登録番号55268-75-2)；セフォニシド(CAS登録番号61270-58-4)；セフメタゾール (CAS登録番号56796-20-4)；セフォテタン(CAS登録番号69712-56-7)；セフプロジ ル(CAS登録番号92665-29-7)；ロルカルベフ(CAS登録番号121961-22-6)；セフェ タメト(CAS登録番号65052-63-3)；セフォペラゾン(CAS登録番号62893-19-0)；セ フォタキシム(CAS登録番号63527-52-6)；セフチゾキシム(CAS登録番号68401-81- 0)；セフトリアキソン(CAS登録番号73384-59-5)；セフタジジム(CAS登録番号725 58-82-8)；セフェピム(CAS登録番号88040-23-7)；セフィキシム(CAS登録番号793 50-37-1)；セフポドキシム(CAS登録番号80210-62-4)；セフスロジン(CAS登録番 号62587-73-9)；フレオキサシン(CAS登録番号79660-72-3)；ナリジクス酸(CAS登 録番号389-08-2)；ノルフロキサシン(CAS登録番号70458-96-7)；シプロフロキサ シン(CAS登録番号85721-33-1)；オフロキサシン(CAS登録番号82419-36-1)；エノ キサシン(CAS登録番号74011-58-8)；ロメフロキサシン(CAS登録番号98079-51-7) ；シノキサシン(CAS登録番号28657-80-9)；ドキシサイクリン(CAS登録番号564-2 5-0)；ミノサイクリン(CAS登録番号10118-90-8)；テトラサイクリン(CAS登録番 号60-54-8)；アミカシン(CAS登録番号37517-28-5)；ゲンタマイシン(CAS登録番 号1403-66-3)；カナマイシン(CAS登録番号8063-07-8)；ネチルマイシン(CAS登録 番号56391-56-1)；トブラマイシン(CAS登録番号32986-56-4)；ストレプトマイシ ン(CAS登録番号57-92-1)；アジスロマイシン(CAS登録番号83905-01-5)；クラリ スロマイシン(CAS登録番号81103-11-9)；エリスロマイシン(CAS登録番号114-07- 8)；エストル酸エリスロマイシン(CAS登録番号3521-62-8)；エチルコハク酸エリ スロマイシン(CAS登録番号41342-53-4)；グルコヘプトン酸エリスロマイシン(CA S登録番号23067-13-2)；ラクトビオン酸エリスロマイシン(CAS登録番号3847-29- 8)；ステアリン酸エリスロマイシン(CAS登録番号643-22-1)；バンコマイシン(CA S登録番号1404-90-6)；テイコプラニン(CAS登録番号61036-64-4)；クロラムフェ ニコール(CAS登録番号56-75-7)；クリンダマイシン(CAS登録番号18323-44-9)； トリメトプリム(CAS登録番号738-70-5)；スルファメトキサゾール(CAS登録番号7 23-46-6)；ニトロフラントイン(CAS登録番号67-20-9)；リファンピン(CAS登録番 号13292-46-1)；ムピロシン(CAS登録番号12650-69-0)；メトロニダゾール(CAS登 録番号443-48-1)；セファレキシン(CAS登録番号15686-71-2)；ロキシスロマイシ ン(CAS登録番号80214-83-1)；コーアモキシクラブラネート；ピペラシリンとタ ゾバクタムの組合せ；ならびにそれらの種々の塩、酸、塩基、および他の誘導体 が含まれるが、これらに限定されない。 表１ 相乗作用は下記の式に従って計算される。0.5以下のFICは相乗作用の証拠であ るが、より高い値を有する組合せも治療上有用であり得る。 例えば、ペニシリン群、セファロスポリン群、カルバセフェム群、セファマイ シン群、カルバペネム群、モノバクタム群、アミノグリコシド群、グリコペプチ ド群、キノロン群、テトラサイクリン群、マクロライド群、フルオロキノロン群 、および他の雑多な抗生物質群からの抗生物質が、本明細書に開示した任意のペ プチドとの組合せで使用され得る。例えば、MBI 11A1CNまたはMBI 11D18CNとシ プロフロキサシン、MBI 11A1CN、MBI 11A3CN、MBI 11B4CN、MBI 11D18CNまたはM BI11G13CNとムピロシン、MBI 11B9CN、MBI 11D18CNまたはMBI 11F4CNとピペラシ リンが好ましい組合せである。 Ｃ．ペプチドおよびタンパク質のポリマー修飾 本明細書中に明記したように、本発明は、遊離アミン基を有する化合物(例え ば、ペプチド、タンパク質、特定の抗生物質など)を、活性化されたポリソルベ ートエステルおよび誘導体で修飾するための方法および組成物を提供する。化合 物がペプチドまたはタンパク質である場合、修飾されたかまたは誘導体化された 形態は、本明細書中で「APS修飾ペプチド」または「APS修飾タンパク質」と呼ばれる 。同様に、修飾された形態の抗生物質は、「APS修飾抗生物質」と呼ばれる。APS修 飾化合物(例えば、APSカチオン性ペプチド)は、改善された薬理学的特性を有す る。 ペプチドおよびタンパク質に加えて、抗生物質、抗菌剤、抗不整脈薬(anti-ry thmic)、および遊離の一級もしくは他のアミンを有する他の任意の化合物が、修 飾に適切である。例えば、セファロスポリン、アミノペニシリン、エタンブトー ル、ピラジンアミド、スルホンアミン、キノロン(例えば、シプロフロキサシン 、クリナフロキサシン(clinafloxacin))、アミノグリコシドおよびスペクチノマ イシン(ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシンを 含 むがこれらに限定されない)は、修飾のための遊離アミンを有する。抗真菌剤(例 えば、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、5-フルオロサイトシンなど)は、誘導 体化に利用可能なアミンを有する。抗ウイルス剤(例えば、三環系アミン(例えば 、アマンタジン))；および駆虫剤(例えば、ダプソン)はすべて誘導体化され得る 。単に例示のために、本明細書での議論は、修飾されたペプチドおよびタンパク 質に関する。 １．試薬の特徴付け 本明細書に記載のように、APS修飾化合物(例えば、ペプチドおよびタンパク質 )の生成に適切な試薬は、疎水性領域および親水性領域、ならびに随意にリンカ ーを含む。疎水性領域は、親水性領域またはリンカーとの結合に適切な官能基を 有する脂肪親和性化合物である。親水性領域はポリアルキレングリコールである 。本明細書で使用する場合、「ポリアルキレングリコール」とは、２炭素ポリマー または３炭素ポリマーのグリコールをいう。２炭素ポリアルキレンには、種々の 分子量のポリエチレングリコール(PEG)およびその誘導体(例えば、ポリソルベー ト)が含まれる。３炭素ポリアルキレンには、ポリプロピレングリコールおよび その誘導体が含まれる。 疎水性領域は一般には脂肪酸であるが、脂肪アルコール、脂肪チオールなど( これらは脂肪親和性化合物でもある)であり得る。脂肪酸は飽和または不飽和で あり得る。鎖長は重要ではないようであるが、代表的には、市販の脂肪酸が使用 され、そしてこれらはＣ12-18の鎖長を有する。しかし、鎖長は、化合物の溶解 性または固体性(solidity)によって制限され得る。すなわち、より鎖長の長い脂 肪酸は室温で固体である。12個の炭素の脂肪酸(ラウリル)、14個の炭素の脂肪酸 、16個の炭素の脂肪酸(パルミテート)、および18個の炭素の脂肪酸(モノステア レートまたはオレエート)が好ましい鎖長である。 親水性領域は、ポリアルキレングリコール(ポリエチレンまたはポリプロピレ ンのいずれかのグリコールモノエーテル)である。エーテル官能基は、ポリオキ シエチレン鎖(好ましくは、２〜100モノマー単位の鎖長を有する)とソルビタン 基との間の結合によって形成される。ポリメチレングリコールは、ホルムアルデ ヒドを形成するため、動物への投与には適切でない。そして、４以上の鎖長を有 するグリコールは不溶性であり得る。混合されたポリオキシエチレン−ポリオキ シプロピレン鎖もまた適切であり得る。 親水性領域および疎水性領域を架橋するためのリンカーは必要ではないが、使 用する場合には、ポリアルキレングリコールおよび疎水性領域の両方と反応し得 る二官能性求核試薬であるべきである。リンカーは、ポリアルキレングリコール (代表的には、エチレンオキシドまたはプロピレンオキシドとの反応によって生 成される)に求核反応のための電子を提供する。適切なリンカーには、ソルビタ ン、糖アルコール、エタノールアミン、エタノールチオール、2-メルカプトエタ ノール、1,6ジアミノヘキサン、アミノ酸(例えば、グルタミン、リジン)、他の 還元糖などが含まれる。例えば、ソルビタンは、ポリソルベートにおいて脂肪酸 とエステル結合を形成する。 適切な化合物には、ポリオキシエチレンソルビタン(例えば、モノラウレート 、モノオレエート、モノパルミテート、モノステアレート、トリオレエート、お よびトリステアレートエステル)が含まれる。これらおよび他の適切な化合物は 、標準的な化学的方法によって合成され得るか、または市販のもの(例えば、Sig ma Chemical Co.，MO；Aldrich Chemical Co.，WI；J.B.Baker，NJ)を入手し得 る。 ２．試薬の活性化 試薬(一般には、ポリソルベート)は、空気を自由に交換しながらUV光に曝露す ることによって活性化される。254nmまたは302mnで照射するランプを使用して活 性化が達成される。好ましくは、出力は254nmが中心である。より長い波長は、 より長い活性化時間を必要とし得る。蛍光室内灯がポリソルベートを活性化し得 るという、いくつかの証拠が存在するが、実験は、室内灯が検出可能なレベルの 活性化を生じる前に、254nmのUV光の使用は最大の活性化を生じることを示して いる。 空気は、ポリソルベートの活性化において重要な役割を演じる。空気へのアク セスは、密封容器中で実施される活性化に比して、活性化の速度を二倍にする。 どの気体が原因であるのかはなお未知である。酸素誘導体である可能性が高いが 、過酸化物は関与していない。エーテル結合を有する化合物のUV曝露は、過酸化 物を生じることが知られている。過酸化物は、過酸化物試験片を使用して検出お よ び定量され得る。反応において、UV活性化した物質中に見出されるレベルより１ 〜10倍高いレベルの過酸化水素を、遮光下でポリソルベート溶液に添加した。活 性化は得られなかった。 試薬は照射に適切な容器中に置かれる。容器について考慮すべきことは、均一 な照射を達成可能であることである。したがって、経路長が長い場合、試薬は混 合され得るか、または攪拌され得る。活性化には空気が必要である。過酸化物は 活性化に関与しない。試薬は任意の水溶液中で活性化され得、そして緩衝化は必 要ではない。 例示的な活性化は、１cmの液厚のキュベット中で起こる。試薬は、９cm未満の 距離で1500μｗ/cm2(光源の最初の出力)にて、約24時間照射される。これらの条 件下で、活性化された試薬は、ペプチドの最低85％をAPSペプチドに変換する。 ３．活性化試薬でのペプチドまたはタンパク質の修飾 ペプチドまたはタンパク質は、液相または固相のいずれかでAPS試薬とともに 反応され、そしてAPS誘導体の結合によって修飾される。結合のための本明細書 中に記載される方法は、ペプチドまたはタンパク質上の電荷を維持する利点を提 供する。ペプチドの電荷がその機能（例えば、本明細書中に記載されるカチオン 性ペプチドの抗生物質活性）にとって重要である場合、これらの結合方法は、更 なる利点を提供する。基をアシル化を介して結合する方法は、アミノからアミド 基への変換を介して正電荷の損失を生じる。さらに、いかなるかさばったリンカ ーまたは潜在的に抗原性のリンカー（例えば、トリアジン基）も、本明細書中に 記載される方法によって導入されることは知られていない。 上記のように、APSペプチド形成は、固相または水溶液中で起こる。簡単には 、固相方法において、ペプチドは、適切な緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）中に懸 濁される。APSペプチド形成を支持する他の適切な緩衝液もまた使用され得る。 酢酸緩衝液は、ナトリウム、ルビジウム、リチウムなどであり得る。他のアセテ ート溶液（例えば、HAcまたはHAc-NaOH）もまた適切である。緩衝液についての 好ましいpH範囲は、２〜8.3であるが、広範な範囲が使用され得る。酢酸-NaOH緩 衝液の開始pHが変化する場合、200mM酢酸緩衝液からの引き続く凍結乾燥は、Ｉ 型修飾ペプチドのみを生じる（実施例14を参照のこと）。アルカリ緩衝液成分の 存 在は、II型修飾ペプチドの形成を生じる。代表的なペプチド濃度は、１mg/mlで あり、これは、85〜95％の修飾ペプチドを生じるが、他の濃度が適切である。濃 度を決定するために主に考慮するのは、経済面であるように見える。活性化ポリ マー（APS）は、APS修飾ペプチドの１：１のモル比が生成されるように、ペプチ ドに対してモル過剰で添加される。一般に、約2.5:1（APS:ペプチド）〜5:1（AP S:ペプチド）の開始比は、1:1 APS修飾ペプチドを生じる。 次いで、反応混合物は、凍結され（例えば、-80℃）そして凍結乾燥される。 酢酸ナトリウムは、凍結乾燥の間に酢酸とNaOHとに不均一にされる；減圧による 揮発性の酢酸の除去により、NaOHは、生じる固体マトリックス全体に分散される 。この酢酸の損失は、凍結乾燥物の溶解に際して検出されるpHの増加によって確 認される。APS修飾ペプチドは、サンプルが凍結され次いで解凍されるだけの場 合には、酢酸緩衝液中で形成されない。 修飾反応はまた、水溶液中で起こり得る。しかし、APS修飾は、pHに関わらず 試験される任意の酢酸緩衝系において、周囲温度では起こらない。APS修飾はま た、pH11.5程度のリン酸緩衝液において形成されない。APS修飾は、約8.5より高 いpHでは、炭酸ナトリウム緩衝液中で起こらない。他の緩衝液はまた、それらが 誘導体化を支持する場合には、使用され得る。９〜11のpH範囲はまた、適切であ り、そしてpH10が最も一般的に使用される。反応は、２相で起こる：Ｉ型ペプチ ドがまず形成され、続いてII型ペプチドが形成される。 本発明において、アミノ基で連結が起こる。ペプチドについて、連結は、Ｎ末 端アミノ酸のα-NH2で、またはリジンのε-NH2基で生じ得る。他の１級および２ 級アミンもまた、修飾され得る。アシル化による全てのアミノ基の完全なブロッ キング（MBI 11CN-Y1）は、APSペプチドの形成を阻害する。従って、アルギニン またはトリプトファン残基の修飾は起こらない。利用可能な唯一のアミノ基が、 αアミノ基（例えば、MBI 11B9CNおよびMBI 11G14CN）である場合、I型形態が観 察される。単一のリジンの包含（例えば、MBI 11B1CN、MBI 11B7CN、MBI 11B8CN ）によって、εアミノ基が提供され、II型形態もまた生じる。形成されるII型の 量は、より多くのリジン残基を有するペプチドについて増加する。 ４．APS 修飾ペプチドの精製および物理特性 APS修飾ペプチドが精製され得る。遊離のペプチドが毒性である状況では、未 修飾ペプチドおよび/または未反応ポリソルベートを除去するための精製が必要 であり得る。任意の種々の精製法が使用され得る。このような方法には、逆相HP LC、ポリソルベートを除去するための有機溶媒による沈澱、サイズ排除クロマト グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過などが含まれる。RP-HPLCが 好ましい。これらの分離方法についての手順は、周知である。 APSペプチド（または、タンパク質）形成により、親ペプチドよりも疎水性で あるペプチド含有生成物が生成される。この特性は、RP-HPLCによって遊離のペ プチドから結合体を分離させるために利用され得る。結合体は、RP-HPLCによっ て決定されるその疎水性に基づいて、２つの集団に分離される；Ｉ型集団は、II 型集団よりもわずかに早く溶出する。 ペプチドのMBI 11シリーズは、1600と2500との間の分子量を有する。サイズ排 除カラムであるSuperose 12カラム上で溶出した場合、これらのペプチドは、ベ ッド容量よりも早くは溶出せず、これは分子量が20kDa未満であることを示す。 対照的に、APS修飾ペプチドは50kDaで溶出し、したがって見かけの分子量の大き な増加を示す。 見かけの分子量の増加は、カチオン性ペプチドの薬物動力学を増強し得る。な ぜなら、分子量の増大は、ペプチドおよびタンパク質が血液から除去される速度 を減少させるからである。ミセル形成は、単一のペプチド分子の複数の結合に依 存するのではなくむしろ、ペプチド分子の「束(packet)」を微生物に送達するこ とによってさらなる利点を提供し得る。さらに、APS修飾ペプチドは、塩化メチ レンまたはクロロホルムに可溶性である。一方、親ペプチドは、本質的に不溶性 である。この増加した有機可溶性は、組織の壁を貫通する能力を有意に増強し得 る。 さらに、円偏光二色性（CD）研究により、APS修飾ペプチドは、変化した３次 元コンホメーションを有することが観察される。実施例において示されるように 、MBI 11CNおよ快4BI 11B7CNは、リン酸緩衝液、または40％水性トリフルオロエ タノール（TFE）中で無秩序の構造を有し、そしてリポソーム中への挿入の際に のみβターンコンホメーションを形成する。対照的に、APS修飾MBI 11CNおよびA PS 修飾MBI 11B7CNのCDスペクトルは、リン酸緩衝液中においてβターン構造を示す 。 Ｄ．処方および投与 上記のように、本発明は、本明細書中に記載されるインドリシジンのペプチド アナログの治療有効量を患者に投与することによって、感染を処置および防止す るための方法を提供する。このような処置のために適切な患者は、十分に確立さ れた感染の特徴（例えば、発熱、膿、生物の培養物など）によって同定され得る 。ペプチドアナログで処置され得る感染には、微生物によって引き起こされるも のが含まれる。微生物の例には、細菌（例えば、グラム陽性、グラム陰性）、真 菌（例えば、酵母およびカビ）、寄生虫（例えば、原生動物、線虫、条虫、およ び吸虫）、ウイルス、ならびにプリオンが挙げられる。これらのクラスの特定の 生物は、周知である（例えば、Davisら、Microbiology、第３版、HarperおよびR ow、1980を参照のこと）。感染には、毒素ショック症候群、ジフテリア、コレラ 、チフス、髄膜炎、百日咳、ボツリヌス中毒症、破傷風、化膿性感染、赤痢、胃 腸炎、炭痘、ライム病、梅毒、風疹、敗血症、および伝染病が含まれるが、これ らに限定されない。 感染の有効な処置は、いくつかの異なる様式で試験され得る。患者は、熱の低 下、生物の数の減少、炎症性分子のより低いレベル（例えば、IFN-γ、IL-12、I L-1、TNF）などを示し得る。 本発明のペプチドアナログは、好ましくは薬学的組成物として投与される。簡 単には、本発明の薬学的組成物は、本明細書中に記載される１つ以上のペプチド アナログを、１つ以上の生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤 と組み合わせて含み得る。本明細書中に記載されるように、処方物緩衝液は、ペ プチドアナログの効力または活性に影響し得る。適切な処方物緩衝液は、緩衝液 および可溶化剤を含有する。処方物緩衝液は、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリ ウム、中性緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水などの緩衝液、または塩 化ナトリウムのような塩を含み得る。酢酸ナトリウムが好ましい。一般に、５〜 500mMの酢酸緩衝液が使用され、そして好ましくは100〜200mMである。最終処方 物のpHは、３〜10の範囲であり得、そして好ましくはほぼ中性（約pH７〜８）で あり得る。ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Tween 80、Tween 20）およ びポリオキシエチレンエーテル（例えば、Brij 56）のような可溶化剤もまた、 化合物がまだAPS修飾されていない場合には、添加され得る。 処方物緩衝液は、本発明のペプチドアナログとともに本明細書中に例示される が、この緩衝液は、他のペプチドの送達のために一般に有用であり、そして望ま しい。この処方物緩衝液中で送達され得るペプチドには、インドリシジン、他の インドリシジンアナログ（PCT WO 95/22338を参照のこと）、バクテリオシン、 グラミシジン、バクテネシン（bactenecin）、ドロソシン（drosocin）、ポリフ ェムシン(polyphemusin)、デフェシン（defesin）、セクロピン(cecropin)、メ リチン(melittin)、セクロピン/メリチン(cecropin/melittin)ハイブリッド、マ ガイニン（magainin）、sapecin（サペシン）、アピダエシン（apidaecin）、プ ロテグリン（protegrin）、タキプレシン(tachyplesin)、チオニン（thionin） ；IL-1〜15：コルチコトロピン放出ホルモン；ヒト成長ホルモン；インスリン； エリスロポエチン；トロンボポエチン；ミエリン塩基性タンパク質ペプチド;M-C SF、GM-CSFのような種々のコロニー刺激因子、kitリガンド；ならびにこれらお よび類似のタンパク質のペプチドおよびアナログが含まれる。 さらなる化合物が、組成物中に含まれ得る。これらには、例えば、炭水化物（ 例えば、グルコース、マンノース、スクロース、もしくはデキストロース）、マ ンニトール、他のタンパク質、ポリペプチドもしくはアミノ酸、EDTAもしくはグ ルタチオンのようなキレート剤、アジュバント、および保存剤が含まれる。本明 細書中に記載されるように、本発明の薬学的組成物はまた、１つ以上のさらなる 有効成分（例えば、抗生物質（相乗効果に関する本明細書中の議論を参照のこと ）またはサイトカイン）を含み得る。 組成物は、送達ビヒクル中にて投与され得る。例えば、組成物は、リポソーム 中にカプセル化（例えば、WO 96/10585;WO 95/35094）、脂質と複合体化、徐放 または持続放出ビヒクル（例えば、ポリガラクシドなど）中にカプセル化され得 る。他の実施態様内で、組成物は、安定性を与えるための適切な賦形剤を利用し て凍結乾燥物として調製され得る 本発明の薬学的組成物は、種々の様式で投与され得る。例えば、ペプチドアナ ログは、静脈内注射、腹腔内注射もしくは、皮下注射もしくは移植、皮内注射、 洗浄液（lavage）、吸入、移植、筋肉内注射もしくは移植、くも膜下腔内注射、 膀胱洗浄、坐薬、膣坐剤、局所（例えば、クリーム、軟膏、皮膚パッチ、点眼剤 、点耳薬（ear drops）、シャンプー）適用、腸内、経口、もしくは経鼻経路に よって投与され得る。アナログは、注射、点滴剤、スプレー、錠剤、クリーム、 軟膏、ゲルなどとして局所的に適用され得る。アナログは、ボーラスとして、ま たは一定期間にわたる複数回用量として投与され得る。 投与後の血清および他の組織中のペプチドのレベルは、細菌ベース、クロマト グラフィーベース、または抗体ベース（例えば、ELISAアッセイ）のような種々 の十分に確立された技術によってモニターされ得る。 本発明の薬学的組成物は、処置される感染または疾患に対して適切な様式で投 与される。投与の量および頻度は、患者の状態、感染の原因、および感染の重篤 度のような因子によって決定される。適切な投薬量は、臨床試験によって決定さ れ得るが、一般に約0.1〜50mg/kgの範囲にある。 さらに、本発明のアナログは、一般的な殺菌剤の様式で、または微生物が望ま しくない任意の状況で使用され得る。例えば、これらのペプチドは、表面殺菌剤 、医療用デバイスのためのコーティング（共有結合を含む）として、衣服のため のコーティング（例えば、細菌の増殖を阻害するため、または蚊よけのため）と して、空気清浄のためのフィルターにおいて（例えば、飛行機上で）、浄水にお いて、シャンプーおよび石鹸の構成要素、食物保存剤、化粧品保存剤、培地保存 剤、除草剤または殺虫剤、建築材料の構成成分（例えば、シリコン、封止剤）と して、ならびに動物製品プロセシングにおいて（例えば、動物の皮の治療）使用 され得る。本明細書中で使用される「医療用デバイス」は、患者における使用（ 例えば、移植または人工補綴）のための任意のデバイスをいう。このようなデバ イスには、ステント、チュービング、プローブ、カニューレ、カテーテル、合成 脈管移植片、血液モニタリングデバイス、人工心臓バルブ、針などが含まれる。 これらの目的のため、代表的にはペプチドを単独で、または抗生物質と組み合 わせて、一般的に利用される組成物中または適切な塗布具（例えば、衣類に適用 するためのようなもの）中に含める。それらは、製造中に材料に（例えば、エア フィルターに）組み込むかまたは染み込ませ得るか、そうでなければデバイスに 適用され得る。ペプチドおよび抗生物質は、デバイスまたは物品に適切な溶液中 に懸濁される必要があるのみである。ポリマーは、使用され得るキャリアの１つ の型である。 アナログ、特に標識されたアナログは、画像分析および診断アッセイにおいて 、または真核生物多細胞および単細胞生物ならびに原核生物における部位を標的 化するために使用され得る。標的化系として、アナログは、他のペプチド、タン パク質、核酸、抗生物質などと結合され得る。 以下の実施例は、限定のためではなく例示のために提供される。 実施例 実施例１ ペプチドアナログの合成精製および特徴付け ペプチド合成は、標準的な固相Fmoc保護ストラテジーに基づいている。使用さ れた装置は、9050 Plus PepSythesiser(PerSeptive BioSystems Inc.)である。 ポリエチレングリコールポリスチレン（PEG-PS）移植片樹脂を、固相として使用 し、Ｃ末端アミド合成のためにFmoc保護アミノ酸リンカーで誘導体化した。HATU （0-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキ サフルオロホスフェート)をカップリング試薬として使用する。合成の間、カッ プリング工程を連続的にモニターし、各アミノ酸が高収量で組み込まれることを 確実にする。ペプチドを、トリフルオロ酢酸および適切なスカベンジャーを用い て固相樹脂から切断し、そして粗ペプチドを調製用逆相クロマトグラフィーを用 いて精製する。 全てのペプチドを質量分析機で分析し、生成物が予想された分子量を有するこ とを確実にする。生成物は、分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC ）に供した場合に、総ピーク面積の＞95％に相当する単一のピークを有するべき である。さらに、ペプチドは、酸尿素ゲル電気泳動に供した場合に、総バンド強 度の＞90％に相当する単一のバンドを示すべきである。 ペプチド含有量（保持された水、塩、または溶媒ではなく、ペプチドである生 成物の量）を、定量的アミノ酸分析、遊離アミン誘導体化、または分光光度計に よる定量によって測定する。アミノ酸分析はまた、ペプチド中に存在するアミノ 酸の比についての情報（これは、そのペプチドの真正性を確認するのに役立つ） を提供する。 ペプチドアナログおよびそれらの名称を、表２に列挙する。この表およびその 他の箇所において、アミノ酸は、１文字アミノ酸コードによって表され、そして 小文字は、アミノ酸のＤ形態を表す。 表２ CN接尾辞＝アミド化されたＣ末端 Ｈ接尾辞＝Ｃ末端のホモセリン Ｒ接尾辞＝レトロ-合成されたペプチド 実施例２ 修飾されたペプチドの合成 インドリジンアナログを、元のペプチドの物理特性を変更するために修飾する 。このような修飾には：Ｎ末端でのアセチル化、Fmoc誘導体化Ｎ末端、ポリメチ ル化、ペルアセチル化(peracetylation)、および分枝誘導体が含まれる。 α-N-末端アセチル化。ペプチドを樹脂から切断し、そしてそれを脱保護する 前に、完全に保護されたペプチドを、DMF中のＮアセチルイミダゾールで１時間 室温で処理することにより、α-N-末端で選択的反応を生じる。次いで、ペプチ ドを脱保護/切断し、そして未修飾ペプチドに関して精製する。 Fmoc-誘導体化α-N-末端。最終Fmoc脱保護工程を行わない場合、α-N末端Fmoc 基は、ペプチド上に残存する。次いで、ペプチドを、側鎖脱保護/切断し、そし て未修飾ペプチドに関して精製する。 ポリメチル化。メタノール溶液中の精製されたペプチドを、過剰の炭酸ナトリ ウムで、その後過剰のヨウ化メチルで処理する。反応混合物を一晩室温で撹拌し 、有機溶媒中で抽出し、中和し、そして未修飾ペプチドに関して精製する。この 手順を用いて、ペプチドは完全にメチル化されない;MBI 11CNのメチル化は、 平均６メチル基を生じた。従って、修飾ペプチドは、メチル化生成物の混合物で ある。 ペルアセチル化。DMF溶液中の精製されたペプチドをＮアセチルイミダゾール で１時間室温で処理する。粗生成物を濃縮し、水に溶解し、凍結乾燥し、水に再 溶解し、そして未修飾ペプチドに関して精製する。一級アミン基の完全なアセチ ル化が観察される。 ４/８分枝誘導体。分枝ペプチドを、樹脂に結合した４または８分枝コア上で 合成する。合成および脱保護/切断を未修飾ペプチドに関して進行する。これら のペプチドを、４Ｍ塩酸グアニジン、次いで水に対して透析することによって精 製し、そして質量分析によって分析する。 上記の手順を用いて修飾したペプチドを表３に列挙する。 表３ 実施例３ ペプチドアナログの組換え生成 あるいは、ペプチドアナログを細菌性宿主細胞において組換えDNA技術によっ て生成する。このペプチドを融合タンパク質として生成し、封入体、周辺質、外 膜、または細胞外環境への融合タンパク質の移行に役立つように選択する。 MBI-11融合ペプチドタンパク質をコードするプラスミドの構築 ポリメラーゼ連鎖反応による増幅を使用して、一本鎖鋳型からMBIペプチド遺 伝子をコードする二本鎖DNAを合成する。MBI-11については、供給者の緩衝液中 に50〜100ngの鋳型、25ピコモルの各プライマー、1.5mM MgCl2、200μＭの各dNT P、２ＵのTaqポリメラーゼを含む100μｌの反応混合物を調製する。反応を、30 秒間94℃、30秒間55℃、30秒間74℃の25サイクル、続いて１分間74℃を用いて行 った。増幅生成物を、BamHIおよびHindIIIで消化し、そして融合パートナーおよ び適切な選択マーカーをコードするプラスミド発現ベクター中にクローン化した 。 E．coli中でのMBI-11ペプチド融合物の生成 T7プロモーター、高コピー複製起点、Aprマーカーを用い、そして融合タンパ ク質の遺伝子を含む、プラスミドpR2h-11を、E．coli株XL1-BlueにpGP1-2と共に 同時エレクトロポレーションする。プラスミドpGP1-2は、λプロモーターおよび cI857リプレッサー遺伝子の制御下のT7ポリメラーゼ遺伝子を含む。融合タンパ ク質発現を30℃から42℃への温度移行によって誘導する。封入体を可溶化剤含有 溶液で洗浄し、そして有機抽出溶媒で抽出する。サンプルのプロフィールをSDS- PAGEによって分析する。図１は、SDS-PAGE分析および全細胞由来の封入体の抽出 プロフィールを示す。有機溶媒抽出物質中の主な夾雑物は、β-ラクタマーゼで ある（図１）。これらの細胞における発現レベルを表４に示す。 表４ さらに、アンピシリンを使用する必要性を除き、それによって抽出物質中のβ -ラクタマーゼの出現を減少させるために低コピー数のベクターpPD100（これは クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む）を使用して、MBI-11を発現させる。こ のプラスミドは、バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ/T7プロモーター系を 使用して、E．coli中で選択的な遺伝子発現および高レベルタンパク質過剰生成 を可能にする（Derschら、FEMS Microbiol．Lett．123:19-26，1994）。pPD100 は選択マーカーとしてのクロラムフェニコール耐性遺伝子（CAT）、複数のクロ ーニング部位、および低コピー数ベクタ−pSC101由来のori配列を含む。これら のプラスミドは、１宿主細胞当たり約４〜６コピーしか存在しない。MBI-11を含 む得られた構築物をpPDR2h-11と呼ぶ。図２は、このベクターにおいて発現したM BI-11融合タンパク質のゲル電気泳動分析を示す。MBI-11融合タンパク質の発現 レベルは、プラスミドpR2h-11から得られた発現レベルに匹敵する。CAT遺伝子生 成物は、恐らくこのプラスミドの低コピー数の性質に起因して明らかではなく、 CATタンパク質は、pPDR2h-11において高レベルで発現しない。 実施例４ ペプチドアナログ活性を測定するためのインビトロアッセイ アガロース希釈アッセイ アガロース希釈アッセイは、ペプチドおよびペプチドアナログの抗菌活性を測 定する。これはペプチドの最少阻害濃度（MIC）として表される。 インビボ条件を模倣するために、カルシウムおよびマグネシウムを補充したMu eller Hintonブロスを、低EEOアガロースと組み合わせて細菌増殖培地として使 用する。寒天中の荷電した基が培地を介してペプチド拡散を妨げるので、より通 常に使用される寒天をアガロースと置換する。培地をオートクレーブし、次いで 抗菌溶液の無菌的な付加の前に水浴中で50〜55℃まで冷却する。異なる濃度のペ プチド溶液の同一容量を、冷却した溶融アガロースに添加する。次いで、これを 深さ３〜４mmまで注ぐ。 細菌接種物を、0.5McFarland濁度標準（PML Microbiological）に調整し、次 いでアガロースプレート上への適用前に1:10に希釈する。アガロースに適用する 最終接種物は、５〜８mm直径スポットで約104CFUである。アガロースプレートを 、35〜37℃で16〜20時間インキュベートする。 MICを、目視検査によって決定した、生物の増殖を完全に阻害するペプチドの 最少濃度として記録する。種々のインドリシジンアナログについての代表的なMI Cを以下の表５に示す。 表５ 1.MBI 10 2．MBI 10A 3．MBI 10CN 4．MBI 11 5.MBI 11A 6.MBI 11ACN 7.MBI 11CN 8.MBI 11CNR 9.MBI 11CNW1 10.MBI 11CNX111.MBI 11CNY1 12.MBI 11M4 13.MBI 11M8 14.MBI 11A1CN15.MBI 11A2CN 16.MBI 11A3CN 17.MBI 11A4CN 18.MBI 11A5CN 19.MBI 11A6CN 20.MBI 11A7CN 21.MBI 11A8CN 22.MBI 11B1CN 23.MBI 11B1CNW1 24.MBI 11B2CN25.MBI 11B3CN 26.MBI 11B4CN 27.MBI 11B4ACN28.MBI 11B5CN 29.MBI 11B7 30.MBI 11B7CN31.MBI 11B7CNR 32.MBI 11B8CN 33.MBI 11B9CN34.MBI 11B9ACN 35.MBI 11B10CN 36.MBI 11B16CN 37.MBI 11B17CN 38.MBI 11B18CN 39.MBI 11C3CN40.MBI 11C4CN 41.MBI 11C5CN 42.MBI 11D1CN43.MBI 11D3CN 44.MBI 11D4CN 45.MBI 11D5CN46.MBI 11D6CN 47.MBI 11D9M8 48.MBI 11D10M8 49.MBI 11D11H50.MBI 11D12H 51.MBI 11D13H 52.MBI 11D14CN 53.MBI 11D15CN54.MBI 11D18CN 55.MBI 11E1CN 56.MBI 11E2CN57.MBI 11E3CN 58.MBI 11F1CN 59.MBI 11F2CN60.MBI 11F3CN 61.MBI 11F4CN 62.MBI 11F4CNR63.MBI 11G2CN 64.MBI 11G3CN 65.MBI 11G4CN 66.MBI 11G5CN 67.MBI 11G6CN 68.MBI 11G6ACN 69.MBI 11G7CN 70.MBI 11G7ACN 71.MBI 11G13CN 72.MBI 11G14CN 73.MBI 11G16CN ブロス希釈アッセイ このアッセイはまた、カルシウムおよびマグネシウムを補充したMueller Hint onブロスを増殖培地として使用する。代表的には、100μｌのブロスを96ウェル マイクロタイタープレートの各ウエルに分配し、そしてペプチドアナログの100 μｌ容量の２倍連続希釈物を、プレート上に作製する。ウエルの１つの列にはペ プチドを与えず、そして増殖コントロールとして使用する。各ウェルを約５×105 CFUの細菌で接種し、そしてプレートを35〜37℃で16〜20時間インキュベートす る。MICを、再び、目視検査によって決定した生物の増殖を完全に阻害するペプ チドの最少濃度として記録する。 例えば、MIC値をS．aureus株に対する一連のペプチドアナログについて確立し た。結果を以下の表６に示す。 表６時間殺傷アッセイ 時間殺傷曲線を使用して、ある時間間隔に渡るカチオン性ペプチドの抗菌活性 を決定する。簡略には、このアッセイにおいて、0.5McFarland Standardに等し い微生物の懸濁液を、0.9％生理食塩水中で調製する。次いで、この懸濁物を、 カチオン調整Mueller Hintonブロスの9mlの総容量まで添加する場合、接種物サ イズが１×106CFU/mlであるように希釈する。0.1mlのアリコートを、24時間まで 予め決定した間隔で各チューブから取り出し、0.9％生理食塩水中に希釈し、そ して３連でプレートし、生存コロニー数を決定する。各サンプル中に残っている 細菌の数を経時的にプロットし、カチオン性ペプチド殺傷の割合を決定する。概 して、増殖コントロールと比較して抗菌懸濁物中の細菌数における３以上のlog1 0 減少は、適切な殺菌性応答を示す。 図３に示すように、全てのペプチドが増殖コントロールと比較して抗菌懸濁物 中の細菌数における３以上のlog10減少を示した。これは、これらのペプチドが 殺菌応答についての基準を満たすことを示す。 相乗効果アッセイ ペプチドアナログと従来の抗生物質の組み合わせでの処置は、相乗効果を有し 得る。相乗効果を、アガロース希釈技術を使用してアッセイする。ここで配列し たプレート（各々は特有の濃度混合物中にペプチドと抗生物質の組み合わせを含 む）を、細菌の単離物で接種する。相乗効果を多くの従来の抗生物質と組み合わ せたペプチドアナログについて調べる。これにはペニシリン、セファロスポリン 、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、マクロライド、フルオロキ ノロンが挙げられるが、これらに限定されない。 相乗効果をFractlonal Inhibitory Concentration（FIC）として表す。これは 、以下の式に従って計算する。0.5以下のFICは、相乗効果の証拠であるが、より 高い価を有する組み合わせが治療的に有用であり得る。 表７は、インドリシジンアナログとムピロシン（MUPirocin）の組み合わせに ついての例示的な相乗効果のデータを示す。 表７ E．coliの株、S．aureusの株、P．aeruginosaの株に対するムピロシンのMIC値 わせで少なくとも３倍まで減少する。 表９はインドリシジンアナログとシプロフロキサシンの組み合わせについての 例示的な相乗効果データを示す。 表９ で少なくとも２倍まで減少する。 実施例５ ペプチドアナログの生化学的特徴 処方物緩衝液中における可溶性 ペプチドの可溶性に影響を与える主な因子は、そのアミノ酸配列である。ポリ カチオン性ペプチドは、好ましくは、水性溶液に、特に低pH条件下で自由に可溶 性である。しかし、特定の処方物においてポリカチオン性ペプチドは濾過工程に よって除去される凝集を形成し得る。インビボアッセイのためのペプチド溶液は 、投与される前に濾過されるので、濾過後の用量レベルの正確性および再現性を 試験する。 処方物に溶解させたペプチドを、親水性0.2μｍフィルターメンブレンを通し て濾過し、次いで逆相HPLCを使用して総ペプチド含有量について分析する。各濃 度について、100％可溶標準を、ペプチドをMilliQ水に溶解させることによって 調製する。各濃度／処方物組み合わせについての相対的回収値を提供するために 、各条件についての総ピーク面積を測定し、そして標準のピーク面積と比較する 。 MBI 11CNを４つの異なる緩衝液系（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびC1）（以下の表10）中 において50、100、200、および400μｇ/mlペプチド濃度で調製した。処方物Ａま たはＢ（両方ともペプチドおよびタンパク質の溶媒和のために通常に使用される ）を用いると、ペプチドは、濃度依存性様式で濾過によって失われる（図４）。 回収率は、400μｇ/mlの濃度で最大70％に達したのみであった。対照的に、処方 物ＣおよびClに溶解させたペプチドは完全に回収された。ポリアニオン性イオン を含む緩衝液は凝集を強めるようであり、そして凝集物は、フィルターによって 補足されるマトリックスの形態をとるようである。モノアニオン性対イオンは、 非凝集可溶性形態のペプチドの維持により適切であるが、他の可溶化剤の添加は 処方物をさらに改善し得る。 表１０ ブロスにおける可溶性 ペプチドアナログの可溶性を、カルシウムおよびマグネシウムを補充したMuel ler Hintonブロス中で目視検査によって評価する。用いた手順は、細菌をウェル に添加しないことを除いてブロス希釈アッセイについて使用した手順である。各 ウェル中の溶液の外観を以下の尺度によって評価する：（ａ）清澄、沈澱なし、 （ｂ）軽い拡散性の沈澱、および（ｃ）濁り、重い沈澱。結果は、例えば、MBI- 10CNが、これらの条件下でMBI 11CNより可溶性ではないこと、およびMBI 11BCN アナログカ糧BI 11ACNアナログより可溶性ではないことを示す。 ペプチドアナログ処方物の逆相HPLC分析 逆相HPLC（これは、ペプチド定量化のための分析的方法を提供する）を使用し て、２つの異なる処方物中のペプチドを調べる。処方物C1およびＤにおいて調製 したMBI 11CNの400μｇ/ml溶液を、他の種からの遊離ペプチドを分離させる段階 的勾配を使用して分析する。以下のような標準的クロマトグラフィー条件を使用 する： ・溶媒Ａ：水中の0.1％トリフルオロ酢酸（TFA） ・溶媒Ｂ：水中の0.1％ TFA/95％アセトニトリル 図５に示すように、MBI 11CNを、処方物C1中の遊離ペプチド、および処方物Ｄ 中の主な処方物−複合体ペプチドとして２つの形態で分離し得る。この複合体は 、アセトニトリル（これは、複合体の安定性を破壊すると予想される）を含む勾 配中の分離プロトコールを耐える。少量（＜10％）の遊離ペプチドに対応するピ ークがまた、処方物Ｄにおいて観察される。溶出勾配の形態が変化される場合、 結合ペプチドは広く低いピークとして溶出する。これは処方物中のペプチドの複 合体が不均一であることを示す。 実施例６ 円二色性分光法を使用する、インドリシジン修飾体の構造分析 円二色性（CD）は、溶液中のペプチドおよびタンパク質の二次構造を調べる分 光学的技術である。例えば、R．W．Woody，（Methods in Enzymology，246:34， 1995）を参照のこと。α-ヘリックスペプチドのCDスペクトルは、208nmおよび22 2nmでの特徴的な二重の最小値に起因して最も容易に解釈可能である。しかし、 他の二次構造を有するペプチドについては、CDスペクトルの解釈は、より複雑で あり、そしてより信頼性がない。ペプチドについてのCDデータを使用して、溶液 構造をインビトロ活性に関連づける。 インドリシジンアナログのCD測定を、３つの異なる水性環境（（１）10mMリン 酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）（２）リン酸緩衝液および40％（v/v）トリフルオ ロエタノール（TFE）ならびに（３）リン酸緩衝液および大きな（100nm直径）単 層リン脂質ベシクル（リポソーム））中で行う（表11）。有機溶媒TFEおよびリ ポソームは、ペプチドが活性な構造をとっていると推定される細菌性膜を模倣す ることを意図する疎水的環境を提供する。 結果は、ペプチドがMBI 11F4CNを除いてリン酸緩衝液中で主に無秩序（200nm 付近でマイナスの最少値）であることを示す。MBI 11F4CNは、220nmにさらなる 最少値を示す（以下を参照のこと）。TFEの存在は、MBI 11および、BI 11G4CNに おいてβ-ターンを誘導し、そしてMBI 11F4CNにおいてα-ヘリックス性を増大さ せるが、ペプチドのほとんどは、無秩序のままである。リポソームの存在下で、 ペプチドMBI 11CNおよびBI 11B7CN（これらは、TFEにおいて無秩序である）は、 β-ターン構造を示す（230nm付近でのマイナスの最少値）（図６）。従って、リ ポソームは、TFEよりも秩序づけられた二次構造を誘導するようである。 β-ターン構造は、疎水性環境で表れる優勢な二次構造である。これは、β-タ ーン構造が活性な膜結合形態での主な構造であることを示唆する。対照的に、MB I 11F4CNは、TFEの存在下で増大したα-ヘリックス構造を示す。ペプチドMBI 11 4FCNはまた、試験したペプチドの中で最も不溶性かつ溶血性である。これは、α -ヘリックス二次構造はこれらのアナログにおいて望ましくない特性を導入し得 ることを示唆する。 さらに、CDスペクトルを、APS修飾ペプチドについて記録する（表11）。結果 は、これらの化合物がリン酸緩衝液中で有意なβ-ターン二次構造を有すること を示す。これはTFE中でほんのわずか変化される。 さらに、CDの結果は、β-ターン構造（すなわち、膜結合）は試験したインド リシジンアナログの中で好ましい活性構造であることを示唆する。 表11 表12 実施例７ 膜透過性アッセイ リポソーム色素放出 リン脂質二重層を透過するペプチドの能力を調べるための方法は記載されてい る（Parenteら、Biochemistry，29，8720，1990）。簡略には、規定されたリン 脂質組成のリポソームを蛍光色素分子の存在下で調製する。本実施例において、 蛍光性分子8-アミノナフタレン-1,3,6-トリスルホン酸（ANTS）およびその消光 剤分子p-キシレン-ビス-ピリジニウムブロミド（DPX）からなる色素対を使用す る。遊離色素分子、無色素リポソーム、およびカプセル化されたANTS-DPXを含む リポソームの混合物をサイズ排除クロマトグラフィーによって分離する。アッセ イにおいて、試験ペプチドをANTS-DPX含有リポソームとインキュベートし、そし てリポソームの外側へのANTS放出に起因する蛍光を経時的に測定する。 このアッセイを使用して、色素放出によって測定される、ペプチド活性は、多 くのリポソーム対ペプチド比（L/P）でリポソームの組成に対して非常に感受性 であることが示される（図７）。詳細には、エッグホスフォチジルコリン（PC） から構成されるリポソームへのコレステロールの付加は、MBI 11CNの膜透過性活 性を、極めて高い脂質対ペプチドモル比でさえ（コレステロールを含まないエッ グPCリポソームと比較する）実質的に消滅させる。このインビトロ選択性は、哺 乳動物細胞の存在下の細菌細胞についてインビトロで観察された選択性を模倣し 得る。 さらに、MBI 11CNによって誘導される膜破壊にサイズ限界が存在する。ANTS/D PXを、エッグPCリポソーム中でフルオレセインイソチオシアネート標識デキスト ラン（FD-4）(分子量4,400)と置換し得る。FD-4蛍光における増大は、MBI 11CN とのインキュベーションに際して検出されない。これらの結果は、MBI 11CN媒介 膜破壊は、相対的に小さなANTS/DPX分子（約400Da）の放出を可能にするが、よ りかさ高いFD-4分子の放出を可能にしないことを示す。 E．coli ML-35内膜アッセイ ペプチド−膜相互作用を測定するための別の方法は、E．coli ML-35株を使用 する（Lehrerら、J．Clin．Invest.，84:553，1989）。この株は、β-ガラクト シダーゼをコードするlacZ遺伝子の染色体性コピーを含み、そしてパーミアーゼ を欠失している。この株を、周辺質へのβ-ガラクトシダーゼの放出を通じて、 内膜上でのペプチドの効果を測定するために使用する。β-ガラクトシダーゼの 放出を、その基質0-ニトロフェノールβ-D-ガラクトピラノシド（ONPG）の加水 分解を分光光度的にモニターすることによって測定する。加水分解の最大速度（ Ｖmax）を、種々の増殖時点で採取した細胞のアリコートについて決定する。 中期対数期細胞（4×1077FU/mlに希釈した）に対する最大の活性に必要とさ れるペプチドの濃度を決定するための予備実験によって、50μｇ/mlの値が得ら れ、これを、全ての後の実験に使用する。細胞を、２つの異なる増殖培地（Terr ific培地（TB）およびLuria培地（LB））で増殖させ、そして等量の細胞をそれ らの増殖サイクルの間にアッセイする。得られるMBI 11B7CNの活性プロフィール を、図８に示す。富化したTB培地中での細胞増殖について、最大活性は、初期の 中期対数期（140分）で生じるが、一方、LB培地中での細胞増殖については、中 期対数期の後期（230分）で最大活性が生じる。さらに、LB中のみで140分で活性 の一時的な低下が観察される。この活性の低下は、本来の供給源の枯渇に起因す る新たなエネルギー源の利用の必要性のような、代謝の移行に関連し得る。これ は、さらに富化したTB培地では生じない。代謝の切り替えの結果として、膜電位 が変化する。 膜電位がペプチド活性に対して効果を有するかどうかを試験するために、カリ ウムイオン透過孔バリノマイシンを使用する電気化学的勾配の破壊効果を試験す る。バリノマイシンと共に予めインキュベートした細胞をペプチドで処理する。 そしてMBI 10CNおよびMBI 11CNについて、バリドマイシンと共に予めインキュベ ートしていないものと比較して、ONPGの加水分解は約50％まで減少した（図９） 。バリドマイシンに感受性ではない別のカチオン性ペプチドを、ポジティブコン トロールとして使用する。 膜透過活性に影響を与える因子のさらなる記載を試験する。例示的な試験にお いて、MBI 11B7CNを、150mMの塩化ナトリウム（NaCl）または５mMのマグネシウ ムイオン（Mg2+）のいずれかを含有する等張性のHEPES/スクロース緩衝液と共に 予めインキュベートし、そして上記のようにアッセイする。図10において、いず れの溶液でも有意な阻害が観察され、このことは、ペプチドの透過作用における 静電気的な相互作用の関与を示唆する。 実施例８ インドリシジンアナログによる赤血球溶解 赤血球（RBC）溶解アッセイを、MBI 11CNおよびグラミシジン-Sと比較して、 標準的な条件下でRBCを溶解するペプチドの能力にしたがってペプチドを分類す るために使用する。ペプチドサンプルおよび洗浄したヒツジRBCを、６と７の間 に調整した最終pHを有する等張性の生理食塩水中で調製する。ペプチドサンプル とRBC懸濁物とを共に混合して、１％（v/v）RBCおよび５、50、または500μｇ/m lペプチドの溶液を得る。アッセイ混合物を、絶えず振盪しながら37℃にて１時 間インキュベートし、遠心分離し、そして上清を540nmの吸光度について測定す る。これによって放出されたヘモグロビンを検出する。放出されたヘモグロビン の割合を、水中に溶解した一連の既知の標準物との比較によって決定する。アッ セイの各セットはまた、それぞれ「低溶解」コントロールおよび「高溶解」コン トロールとしてMBI 11CN（500μｇ/ml）およびグラミシジン-S（５μｇ/ml）を 含む。 MBI-11B7CN-HCl、MBI-11F3CN-HClおよびMBI-11F4CN-HClをこの手順を使用して 試験し、そして結果を以下の表13に示す。 表13Ｎ／Ｄ＝実施せず ５μｇ/mlで、「高溶解」コントロールであるグラミシジン-Sと同等またはそ れより多い程度にRBCを溶解するペプチドを、高溶解性と見なす。500μｇ/mlで 「低溶解」コントロールであるMBI 11CNと同等またはそれより少ない程度にRBC を溶解するペプチドを、非溶解性と見なす。試験した３つのアナログは全て、そ れらがMBI 11CNより多くそしてグラミシジン-Sより少ない溶解を生じるので、「 中程度に溶解性」である。さらに、アナログの１つである、MBI-11F3CN-HClは、 試験 した３つの濃度で他の２つの変異体よりも有意に溶解性が低い。 実施例９ ペプチドアナログに対する抗体の産生 小さい非免疫原性ペプチジルコアに連結した標的ペプチドの４または８つのコ ピーを含む多抗原性ペプチド（MAP）を、免疫原として調製する。あるいは、標 的ペプチドを、ウシ血清アルブミン（BSA）またはオボアルブミンに結合する。 例えば、MBI 11CN、ならびにその７アミノ酸のＮ末端フラグメントおよびＣ末端 フラグメントを、標的ペプチド配列として使用する。免疫原を、標準的なプロト コールを使用してウサギに皮下注射する（HarlowおよびLane，Antibodies：A La boratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor ，NY，1988を参照のこと）。追加免疫を繰り返した（通常は１ケ月ごと）後、血 液サンプルに由来する血清を、標的ペプチドに対するELISAで試験する。陽性の 結果は抗体の存在を示し、そしてさらなる試験によって標的ペプチドに結合する 抗体の特異性を決定する。次いで、精製した抗体をこの血清から単離し、そして 研究および臨床サンプル中の標的ペプチドを選択的に同定し、そしてその量を測 定するために、ELISAで使用する。 実施例10 血漿および血液中のペプチドアナログの薬理学 血漿および血液中の遊離のペプチドアナログのインビトロの寿命を、一連のイ ンキュベーション時間後に存在するペプチドの量を測定することによって決定す る。血液を、抗凝固剤（ヘパリン以外）で処置したヒツジから回収し、そして血 漿の調製のために、遠心分離して細胞を除去する。調剤したペプチドを、血漿画 分または全血のいずれかに添加し、そしてインキュベートする。インキュベーシ ョン後、ペプチドを同定し、そして逆11PLCによって直接定量する。遊離のペプ チドのピークが血液または血漿由来のいずれのピークよりも上にない場合は、抽 出は必要ではない。 処方物自およびＤ中の１mg/mLのMBI 11CNの溶液を、新たに調製したヒツジの 血漿に100μｇ/mLの最終ペプチド濃度で添加し、そして37℃でインキュベートす る。種々の時間で、血漿のアリコートを除去し、そして逆相HPLCによって遊離の ペプチドについて分析する。各クロマトグラムから、遊離のペプチドに対応する ピークの面積を積分し、そしてインキュベーション時間に対してプロットする。 図11に示すように、ペプチドレベルは経時的に減少する。さらに、処方物Ｄ中に 投与した場合、50％までのペプチドが、血液への添加の際に処方物−ペプチド複 合体から即座に放出される。遊離のペプチドについての減衰曲線によって、処方 物C1およびＤの両方について90分の血液中での見かけの半減期が得られる。これ らの結果は、ヒツジの血液中では、MBI 11CNは、血漿ぺプチダーゼおよびプロテ アーゼに対して比較的耐性であることを示す。インキュベーションの間に出現し た新たなピークは、ペプチドの崩壊産物であり得る。 インビボでの血漿中のぺプチドレベルを、処方物C1またはＤのいずれか中での ペプチドアナログの最大寛容用量の80〜100％のivまたはip投与後に測定する。 処方物C1中のMBI 11CNを、マウスCD1 ICRBR株の尾静脈に静脈内注射する。注射 後の種々の時点でマウスを麻酔し、そして血液を心臓の穿刺によって採取する。 個々のマウス由来の血液を遠心分離して、細胞から血漿を分離する。次いで、血 漿を、逆相HPLCカラムによって分析する。得られる溶出プロフィールを、280nm でのUV吸収によって遊離のペプチド含量について分析し、そしてこれらのデータ を、較正した標準物に基づいて血液中の濃度に変換する。各データ点は、２匹の マウスによる平均血液レベルを示す。このアッセイにおいて、検出限界は約１μ ｇ/mlであり、投与された用量の３％未満である。 ペプチドが測定され得る最も最初の時点は、注射後３分であり、従って、最大 の観察される濃度（μｇ/mlで）はゼロ時点まで戻ると推定される（図12）。概 算される開始濃度は、35〜45μｇ/mlの間の予想される濃度に充分に対応する。 減衰は迅速であるが、曲線が指数的な減衰方程式に一致する場合、遊離の環状ペ プチドは、2.1分の半減期を有すると計算される。遊離の環状ペプチドは、処方 物Ｄ中のMBI 11CNを注射したマウスの血液中で検出不可能であり、このことは、 インビトロでは、ペプチドが複合体から迅速には放出されないことを示唆する。 さらに、MBI 11CNをまた、40mg/kgの有効用量レベルで単回のip注射によって マウスCD1 ICRBR株に投与する。ペプチドを、ペプチド複合体が血液レベルに対 して任意の効果を有するかどうかを決定するために、処方物C1およびＤの両方中 で投与する。注射後の種々の時間にマウスを麻酔し、そして血液を心臓の穿刺に よって採取する。血液を回収し、そしてiv注射について分析する。 この経路によって投与したMBI 11CNは、極めて異なる薬理学的プロフィールを 示した（図13）。処方物C1において、ペプチドは、迅速に血流中に入り、15分後 にほぼ５μｇ/mlのピーク濃度を有し、これは60分後に検出不可能なレベルまで 低下する。対照的に、処方物Ｄ中のペプチドは、およそ２時間の間、２μｇ/ml を超えるレベルで存在する。従って、処方物は、血液への進入、および血液中の ペプチドレベルの維持に影響を与える。 実施例11 インビボでのペプチドアナログの毒性 種々のインドリシジンアナログの激しい単回用量の毒性を、種々の投与経路を 使用してSwiss CD1マウスで試験する。任意の処方物／送達ビヒクルの効果の非 存在下でのペプチドアナログの固有の毒性を決定するために、ペプチドを、６〜 ７の間の最終pHを有する等張性の生理食塩水中で全て投与する。 腹腔内経路。６匹のマウスの群に、500μｌの投与容量中で80〜５mg/kgの間の ペプチド用量を注射する。ペプチドの投与後、マウスを５日間観察する。この時 点で、50％の死亡率を生じる用量（LD50）、90〜100％の死亡率を生じる用量（L D90-100）、および最大寛容用量（MTD）レベルを決定する。LD50値を、Reedおよ びMuench（J．of Amer．Hyg．27:493-497，1938）の方法を使用して計算する。 表14に示す結果は、MBI 11CNおよびアナログについてのLD50値は21〜52mg/kgの 範囲にあることを示す。 表14 静脈内経路。６匹のマウスの群に、100μｌの容量中で20、16、12、８、４、 および０mg/kgのペプチド用量を注射する（4ml/kg）。投与後、マウスを５日間 観察する。この時点で、LD50、LD90-100、およびMTDレベルを決定する。MBI 11C Nおよび３つのアナログのIV毒性試験による結果を、表15に示す。LD50、LD90-10 0 、およびMTD値は、それぞれ、5.8〜15mg/kg、８〜20mg/kg、および＜４〜12mg/ kgの範囲にある。 表15 皮下経路。MBI 11CNの毒性をまた、皮下（SC）投与後に決定する。SC毒性試験 のために、６匹のマウスの群に、300μＬの投与容量中で128、96、64、32、およ び０mg/kgの間のペプチド用量を注射する（12mL/kg）。投与後、マウスを５日間 観察する。５日間の観察期間中には、いずれの用量でもマウスは死亡しなかった 。従って、LD50、LD90-100、およびMTDは全て128mg/kgよりも大きいと考えられ る。より高い用量レベルを受容しているマウスは、IV注射後に見られる症状に類 似の症状を示し、このことは、ペプチドが全身性の循環に入ったことを示唆する 。これ らの症状は可逆的であり、観察の２日目までに全てのマウスで消滅する。 別の処方物中でのMBI 10CNおよびMBI 11CNの単回用量の毒性をまた、非近交系 ICRマウスで試験する（表16）。処方物Ｄ中でのMBI 10CNの腹腔内注射（２匹の マウスの群）は、29mg/kgまでは毒性を示さず、そして同じ条件下でMBI 11CNは4 0mg/kgまで毒性を示さない。 処方物Ｄ中でのMBI 10CNの静脈内注射（10匹のマウスの群）は、5.6mg/kgの最 大寛容用量（MTD）を示す（表16）。11mg/kgの注射は40％の毒性を生じ、そして 22mg/kgの注射は100％の毒性を生じる。処方物Ｃ（凍結乾燥した）中でのMBI 11 CNの静脈内注射は、3.0mg/kgのMTDを示す。6.1mg/kgでの注射は10％の毒性を生 じ、そして12mg/kgでは100％の毒性を生じる。 表16 これらの結果を、調製後に凍結乾燥し、そして水中で再構成したペプチド／緩 衝液溶液を用いて得る。ペプチド溶液を注射前に凍結乾燥せずに、調製後すぐに 使用する場合、毒性の増大が見られ、そして最大寛容用量は４倍まで減少し得る 。例えば、非凍結緩衝溶液である処方物C1としてのMBI 11CNの静脈内注射は、1. 5mg/kgで20％の毒性を生じ、そして3.0mg/kgで100％の毒性を生じる。非凍結乾 燥処方物および凍結乾燥処方物のHPLC分析は、MBI 11CNがポリソルベートと複合 体を形成し、そしてこのペプチドの複合体がマウス中でのその毒性を低下するこ とを示す。 さらにマウスを、MBI 11CNを静脈内経路によって複数回注射する（表17）。１ つの代表的な実験では、５分の間隔で0.84mg/kgの10回の注射で投与したペプチ ドは、致死的ではない。しかし、10分の間隔で投与される4.1mg/kgでのペプチド の２回の注射は、60％の死亡率を生じる。 表17 *（mg/kg） ペプチドアナログのマウスへの投与の効果を評価するために、一連の組織病理 学的研究を実施し得る。マウスの群に、MTD、またはMTD以下、またはMTD以上、 致死用量のいずれかの用量レベルでアナログを投与する。複数回の注射を、可能 性のある処置レジメを模倣するために使用し得る。コントロールマウスの群は、 注射しないかまたは緩衝液のみで注射する。 注射後、所定の時間にマウスを屠殺し、そしてそれらの個体を10％の平衡化ホ ルマリン溶液中に迅速に置く。アナログの毒性効果の結果死亡したマウスもまた 、それらの個体をすぐに保存する。組織サンプルを採取し、そしてスライド上に 染色した微小な切片として調製し、次いでこれを顕微鏡によって試験する。組織 の損傷を評価し、そしてこの情報を使用して、改善したアナログ、改善した投与 方法、または改善した投与レジメを開発し得る。 実施例12 ペプチドアナログのインビボでの効果 アナログを、致死的な細菌感染からマウスを救出（rescue）するそれらの能力 について試験する。使用する動物モデルは、106〜108のグラム陽性細菌でのマウ スの腹腔内（ip）接種、続くペプチドの投与である。試験する３つの病原体（メ チシリン感受性S．aureus（MSSA）、メチシリン耐性S．aureus（MRSA）、または S．ePidermidis）をマウスにip注射する。未処置のマウスについては、MSSAおよ びS．epidermisでは12〜18時間以内に死亡し、そしてMRSAでは６〜10時間以内に 死亡する。 ペプチドを、２つの経路（感染の１時間後に腹腔内で、または感染前もしくは 感染後の種々に時点で与えられる単回もしくは複数回の用量での静脈内で）投与 する。 MSSA感染。代表的なプロトコールでは、10匹のマウスの群を、５％のムチンを 含有する脳−心臓注入液中で注射したLD90-100用量（5.2×106CFU/マウス）のMS SA（Smith，ATCC ♯19640）を腹腔内感染させる。S．aureusのこの株は、全ての 一般的な抗生物質に対して耐性ではない。感染の60分後、処方物D中でMBI 10CN またはMBI 11CNを一定の用量レベルで腹腔内注射する。処方物のみの注射をネガ ティブコントロールとして取り扱い、そしてアンピシリンの投与をポジティブコ ントロールとして取り扱う。マウスの生存性を、感染後１，２，３，および４時 間、およびその後は１日に２回、全部で８日間モニターする。 図14に示すように、MBI 10CNは、14.5〜38.0mg/kgの用量でMSSAに対して最大 に活性（70〜80％の生存性）であるが、100％の生存性は達成されない。14.5mg/ kg未満では、明らかな用量依存性生存が存在する。これらの低い用量レベルでは 、動物−依存性閾値であるようである。なぜなら、マウスは、２日までに死亡す るかまたは全８日間にわたって生存するかのいずれかであるからである。一方、 図15に見られるように、MBI 11CNは、35.7mg/kgの用量レベルでMSSA感染から100 ％のマウスを救出した。従って、アンピシリンと同様に有効であった。全てのよ り低用量レベルでは、僅かに活性が存在したか、または全く活性はなかった。こ のことは、最低の血流ペプチドレベルが、細菌が宿主に対して危険である時間の 間に達成されなければならないことを示す。 上記に示すように、MBI 11CNの血液レベルは、２時間の間２μｇ/mlより大き いレベルで維持され得、これによってこれが最低レベルよりも高いことが推測さ れる。 さらに、MBI 11CNの配列に基づく８つの変異体を、上記の実験系を使用してMS SAに対して試験する。処方物Ｄ中で調製したペプチドを、12〜24mg/kgの範囲の 用量レベルで投与し、そして感染させたマウスの生存性を８日間モニターする（ 図16〜24）。各変異体について、観察期間の終わりでの生存の割合を表18にまと める。表に見られるように、いくつかの変異体はこれらの条件下でMBI 11CNより 大きいか、または同等の効率を示した。 表18 S．epidermidis感染。ペプチドアナログは一般に、S．epiidermidisに対して インビトロでより低いMIC値を有し、従ってより低い血液ペプチドレベルが感染 に対してより有効であり得る。 代表的なプロトコールでは、10匹のマウスの群を、５％のムチンを含有する脳 −心臓注入溶液（broth）中でS．epidermidis（ATCC♯12228）のLD90-100用量（ 2.0×108CFU/マウス）で腹腔内注射する。このS．epidermidis株は５日後に90％ が 死亡する。感染の15分および60分後、処方物Ｄ中の種々の用量のMBI 11CNを尾静 脈を通じて静脈内注射する。処方物のみの注射をネガティブコントロールとして 取り扱い、そしてゲンタマイシンの注射をポジティブコントロールとして取り扱 う。両方を感染後60分で注射する。マウスの生存率を、感染の１，２，３，４， ６，および８時間後、ならびにその後は１日に２回、全部で８日間モニターする 。 図２５Ａおよび２５Ｂに示すように、MBI 11CNは、マウスの生存を延長する。 効力は、注射15分後処理した３つの用量レベル全てにおいて観察されるが、注射 30分後では活性がより低く、そして注射60分後では、有意な影響はみられない。 投与時間は、このモデル系において重要であるようである。注射15分後の6.1mg/ kgの単回注射が最良の生存率を与える。 MRSA感染。MRSA感染は、短期間で致死であるが、MSSAよりも高い細菌充填量（ load）を必要とする。代表的なプロトコルにおいては、10匹マウス群を、５％ム チンを含有する脳心臓浸出物中のLD90-100用量（4.2×107CFU/マウス）のMRSA（ ATCC第33591号）で腹腔内注射する。処理プロトコルは以下の通りであり、処理 時間は、感染時間に対する： ・０mg/kg 処方Ｄのみ（ネガティブコントロール）、０分で注射 ・５mg/kg ３回5.5mg/kg注射（−５分、＋55分、および＋115分） ・１mg/kg（２時間） ５回1.1mg/kg注射 （−５分、＋55分、＋115分、＋175分、および＋235分） ・１mg/kg（20分） ５回1.1mg/kg注射 （−10分、−５分、０分、＋５分、および＋10分） ・バンコマイシン （ポジティブコントロール）、０分で注射 MBI 11CNを、処方Ｄ中で、尾静脈に静脈注射する。マウスの生存を注射１、２ 、３、４、６、８、10、12、24および30時間後に、その後総計８日間毎日２回記 録する。24時間後では、マウス生存数に何の変化もなかった（図２６）。 １mg/kg（20分）処理プロトコル（感染時間を中心に５分間隔で注射した）は 、マウスの死亡を有意な程度で遅延させ、研究の終わりには１匹生存していた。 表１９に示した結果は、より長い期間にわたって維持された充分に高いレベルの MB I 11CNは、マウス生存数を増大させることを示唆する。５mg/kgおよび１mg/kg（ ２時間）結果（ここでは、ネガティブコントロールを超える生存度の改善はない ）は、最も高いレベルでさえ、１時間毎の注射は、MRSAに対して有効でないこと を示す。 表19 実施例１３ 紫外光によるポリソルベート80の活性化 ２％（w/w）ポリソルベート80の溶液を水中で調製し、そして適切な反応容器 （例えば、水晶セル）中に入れる。準備が透明光路または長期の反応時間につい てなされれば、UV半透過性であるかまたは褐色でさえある他のコンテナが用いら れ得る。さらに、容器は、空気の交換を可能にするが、蒸発を最小に抑えなけれ ばならない。 この溶液を、254nmで放射するランプを用いて、紫外光で照射する。照射はま た、302nmで放射するランプを用いて実施され得る。活性化は、コンテナ、溶液 の深さ、および空気交換率に依存して１〜14日で完了する。反応を逆相HPLCアッ セイによりモニターする。これは、光活性化ポリソルベートをMBI 11CNと反応さ せたときのAPS修飾MBI 11CNの形成を測定する。 活性化ポリソルベートのいくつかの特性を決定する。過酸化物は、UV光にエー テルを曝露する既知の副産物であるので、過酸化物形成は、活性化ポリソルベー トに対する還元剤の影響を介して試験される。図２７Ａに見られるように、活性 化ポリソルベートは、MBI 11CNと容易に反応する。2-メルカプトエタノール（穏 和な還元剤）での前処理（図２７Ｂ）は、検出可能な過酸化物を除去するが、結 合体形成能の喪失を生じさせない。水素化ホウ素ナトリウムでの処理（図２７Ｃ ）は過酸化物を除去し、最終的には、活性化ポリソルベートがペプチドを修飾す る能力を除去する。水中でのホウ化水素の加水分解は、pHを上昇させ、そして加 水分解産物としてホウ酸塩を生成する。しかし、pH変化もホウ酸塩も確実ではな い。 これらのデータは、過酸化物は、活性化ポリソルベートによるペプチドの修飾 に関与しないことを示している。水素化ホウ素ナトリウムは、水性媒体中でエポ キドにもエステルにも影響を与えず、このことから、反応基はアルデヒドまたは ケトンであることが示唆される。活性化ポリソルベートにおけるアルデヒドの存 在は、ホルムアルデヒド試験を用いることにより確認し、これは、ホルムアルデ ヒド以外のアルデヒドを含むアルデヒドに特異的である。 さらに、反応基を捕獲する試みにおいて、活性化ポリソルベートを2,4-ジニト ロフェニルヒドラジン（DNPH）で処理する。３つのDNPH-タグ化成分を精製し、 質量分析により分析する。これらの成分はポリソルベート誘導され、1000〜1400 の間の分子量を有する。これは、低分子量アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒ ドまたはアセトアルデヒド）が関与することを示している。 実施例１４ APS修飾ペプチドの形成 APS修飾ペプチドを固相または液相のいずれかで調製する。固相調製について 、0.25mlの４mg/mlのMBI 11CNを0.5mlの0.4M酢酸NaOH（pH4.6）に添加し、その 後0.25mlのUV光UV活性化を添加する。反応混合物を−80℃冷凍庫中に置くことに より凍結する。凍結後、反応混合物を一晩凍結乾燥する。 結合体を水相中で調製するために、UV活性化ポリソルベートのサンプルをまず 0.1M NaOHの添加により7.5のpHに調整する。このpH調整溶液（0.5ml）を1.0mlの 100mMカルボン酸ナトリウムに添加する。このpH調整溶液（0.5ml）を1.0mlの100 mMカルボン酸ナトリウム（pH10.0）に添加し、その直後に0.5mlの4mg/nlのMBI 1 1CNを添加する。反応混合物を室温で22時間インキュベートする。反応の進行をR P-HPLCを用いる種々の時点での分析によりモニターする（図２８）。図２８では 、ピーク２は未反応ペプチドであり、ピーク３はAPS修飾ペプチドである。タイ プＩはピーク３の左側の大半部であり、そしてタイプ２は、ピーク３の右側の大 半部である。 表２０は、いくつかの実験からのデータを要約する。表２０において他にシル されなければ、APS修飾ペプチドは、200mM酢酸-NaOH緩衝液（pH4.6）中で凍結乾 燥法により調製する。 表20 アミノ基の修飾を、付着の間に喪失した第一級アミノ基の数を決定することに よりさらに分析する。未修飾および修飾ペプチドを、2,4,6-トリニトロベンゼン スルホン酸（TNBS）で処理する（R.L．Lundblad、Techniques in Protein Modif ication and Analysis,151〜154頁、1995）（表２１）。 簡単には、MBI 11CNのストック溶液（４mg/ml）およびAPS修飾MBI 11CNの等モ ル溶液を調製する。MBI 11CNまたはAPS修飾MBI 11CNの0.225mlアリコートを0.22 5mlの200mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8.8）と混合する。１％TNBSの0.450mlア リコートを各サンプルに添加し、そして反応を37℃で30分間インキュベートする 。367nmでの吸光度を測定し、そして１分子当たりの修飾された第一級アミノ基 の数をトリニトロフェニル（TNP）誘導体について10,500Ｍ-1cm-1の吸光係数を 用いて計算する。 次いで、親ペプチドの第一級アミノ基含量を、対応するAPS修飾ペプチドと比 較する。以下に示すように、単一の第一級アミノ基の喪失は、修飾ペプチドの形 成の間に生じる。3,4リジン対を有するペプチドは、一貫して、予期されるより １残基低い結果を与え、これは、ダブレットの１つのメンバーのタイトレーショ ン後の立体妨害を反映し得る。 表21 APS修飾ペプチドアナログの安定性 APS修飾ペプチドは、イオン性または疎水性の複合体の解離を促進する条件下 で高度の安定性を示す。処方Ｄ中のAPS修飾ペプチドを、水、0.9％生理食塩水、 ８Ｍ尿素、８Ｍグアニジン-HCl、67％1-プロパノール、１Ｍ HClおよび１Ｍ NaO H中の800μｇ/ml溶液として調製し、室温で１時間インキュベートする。サンプ ルを逆相HPLCおよび以下のクロマトグラフィー条件を用いて遊離ペプチドの存在 について分析する： 溶媒Ａ：0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）（水中） 溶媒Ｂ：0.1％TFA／95％アセトニトリル（水中） 媒体:POROSR2-20（ポリスチレンジビニルベンゼン） 溶出：０％Ｂ（５カラム容量） ０−25％Ｂ（３カラム容量） 25％Ｂ（10カラム容量） 25−95％Ｂ（３カラム容量） 95％Ｂ（10カラム容量） これらの条件下、遊離ペプチドは25％Ｂ段階でもっぱら溶出し、処方−ペプチ ド複合体は95％Ｂ段階でもっぱら溶出する。上記の解離条件はいずれも、APS修 飾ペプチドから遊離ペプチドを遊離することに成功しない（但し、１Ｍ NaOHを 除く（ここでは幾分かの分解が見られる））。追加研究を、55℃または85℃で１ 時間インキュベーションして実施する。APS修飾ペプチドは、55℃では同等に安 定であり、そして85℃ではややわずかにより安定でない。いくらかの酸加水分解 （HPLCクロマトグラムにおける新規ピークの存在により示される）は、85℃で１ 時間インキュベートした１Ｍ HClにおいて観察される。 実施例１５ APS修飾MBI 11CNの精製 APS修飾MBI 11CNの大規模調製物を精製する。約400mgのMBI 11CNをAPS修飾し 、そして20ml水中に溶解する。未反応MBI 11CNをRP-HPLCにより除去する。次い で、溶媒をAPS修飾MBI 11CNプールからエバポレートし、そして残渣をl0ml塩化 メチレンに溶解する。次いで、修飾ペプチドを10mlジエチルエーテルで沈澱させ る。室温で５分後、沈殿物を5000×gで10分間遠心分離することにより収集する 。ペレットを、5mlのジエチルエーテルで洗浄し、そして再度、5000×ｇで10分 間遠心分離することにより収集する。上清を、未反応ポリソルベート副産物の分 析のためにプールする。沈殿物を6mlの水中に溶解し、次いで30分間バブリング することにより窒素でフラッシュし、残余エーテルを除去する。出発MBI 11CNか らの総収量は43％であった。 実施例１６ APS修飾ペプチドを用いる生物学的アッセイ APS修飾ペプチドと未修飾ペプチドとを比較する全ての生物学的アッセイを、 等モル比で実施する。APS修飾ペプチドの濃度は、分光光度測定（これは、生物 学的アッセイのために濃度を標準化するために用いる）により決定され得る。例 えば、１mg/ml APS修飾MBI 11CN溶液は、１mg/ml MBI 11CN溶液と同じ量のペプ チドを含有し、従って毒性および効力データの直接比較を可能にする。 APS修飾ペプチドは、本明細書中に記載のように実施されるインビトロアッセ イにおいて親ペプチドと少なくとも同等に強力である。グラム陽性細菌に対する MIC値は、いくつかのAPS修飾ペプチドについて示され、そして親ペプチドを用い て得られた値と比較する（表２２）。結果は、修飾ペプチドが、インビトロで親 ペプチドと少なくとも同等に強力であり、そしてE．faecakis株に対して親ペプ チドより強力であり得ることを示す。 表22 APS修飾MBI 11CNおよび未反応MBI 11CNの毒性をSwiss CD-1マウスにおいて試 験する。６匹マウス群を、0.9％生理食塩水中0.1mlペプチドの単回用量で静脈注 射する。用いた用量レベルは、０、３、５、８、10、および13mg/kgである。マ ウスは、第１日目には注射１、３、および６時間後にモニターし、次いで４日間 毎日２回モニターする。MBI 11CNマウスについての生存データを表２３に示す。 APS修飾MBI 11CNについては、マウスの100％が全ての用量（13mg/kgの最大用量 を含む）で生存した。 表23 以下に要約するように、MBI 11CNについてのLD50は7mg/kgである（表２４）。 全ての被験体は８mg/mlの用量で死亡する。100％生存を与えるMBI 11CNの最も高 い用量は、５mg/kgであった。データは、APS修飾ペプチドが親ペプチドより有意 に毒性が低いことを示す。 表24 *入手可能なデータを用いては計算され得なかった。 例示の目的のために、本発明の特定の実施態様についてのみ本明細書中で説明 したが、種々の改変が本発明の意図および範囲から逸脱することなくなされ得る ことが理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲によるようなことを除 いては限定されない。
【手続補正書】 【提出日】平成１１年２月２６日（１９９９．２．２６） 【補正内容】 請求の範囲 １．インドリシジンアナログであって、８〜25アミノ酸を含み、そして以下の式 を含み： XZXXZXB ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘはトリプトファン、フェニルア ラニン、イソロイシン、ロイシン、およびバリンからなる群より選択される疎水 性残基であり；そしてＢはアルギニンおよびリジンからなる群より選択される塩 基性アミノ酸である、アナログ。 ２．以下の式を含み： RWZWWZWB ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｂはアルギニンまたはリジンであ る、請求項１に記載のインドリシジンアナログ。 ３．以下の式を含む、請求項２に記載のインドリシジンアナログ： ILRWPWWPWRRK。 ４．以下の式を含む、請求項２に記載のインドリシジンアナログ： ５．２つ以上のアナログが結合されて分岐ペプチドを形成する、請求項１〜４の いずれかに記載のインドリシジンアナログ。 ６．前記アナログが、対応するD-アミノ酸に変化された１つ以上のアミノ酸を有 する、請求項１〜５のいずれかに記載のインドリシジンアナログ。 ７．Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸がD-アミノ酸である、請求項６に記載 のインドリシジンアナログ。 ８．前記アナログがＮ末端アミノ酸においてアセチル化されている、請求項１〜 ７のいずれかに記載のインドリシジンアナログ。 ９．前記アナログがＣ末端アミノ酸においてアミド化されている、請求項１〜８ のいずれかに記載のインドリシジンアナログ。 １０．前記アナログがＣ末端アミノ酸においてエステル化されている、請求項１ 〜８のいずれかに記載のインドリシジンアナログ。 １１．前記アナログがＣ末端アミノ酸においてホモセリン／ホモセリンラクトン の組み込みによって修飾されている、請求項１〜８のいずれかに記載のインドリ シジンアナログ。 １２．前記アナログがポリアルキレングリコールまたはその誘導体と結合されて いる、請求項１〜１１のいずれかに記載のインドリシジンアナログ。 １３．その配列が、１つ以上の、請求項１〜４のいずれかに記載のインドリシジ ンアナログのコード配列を含む、単離された核酸分子。 １４．請求項１３に記載の核酸分子と作動可能に連結されたプロモーターを含む 発現ベクター。 １５．請求項１４に記載の発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換され た宿主細胞。 １６．少なくとも１つの、請求項１〜１２のいずれかに記載のインドリシジンア ナログ、および生理学的に受容可能な緩衝液を含む、薬学的組成物。 １７．抗生物質をさらに含む、請求項１６に記載の薬学的組成物。 １８．前記抗生物質が、ペニシリン、セファロスボリン、カルバセフェム、セフ ァマイシン、カルバペネム、モノバクタム、キノロン、テトラサイクリン、アミ ノグリコシド、マクロライド、グリコペプチド、クロラムフェニコール、グリシ ルサイクリン、リコサミド、およびフルオロキノロンからなる群より選択される 、請求項１７に記載の薬学的組成物。 １９．前記抗生物質が、アミカシン；アモキシシリン；アンピシリン；アジスロ マイシン；アズロシリン；アズトレオナム；カルベニシリン；セファクロール； セファマンドールフォルメートナトリウム；セファゾリン；セフェピム；セフェ タメト；セフィキシム；セフメタゾール；セフォニシド；セフォペラゾン；セフ ォタキシム；セフォテタン；セフォキシチン；セフポドキシム；セフプロジル； セフスロジン；セフタジジム；セフチゾキシム；セフトリアキソン；セフロキシ ム；セファレキシン；セファロチン；クロラムフェニコール；シノキサシン；シ プロフロキサシン；クラリスロマイシン；クリンダマイシン；クロキサシリン； コ-アモキシクラブラネート；ジクロキサシリン；ドキシサイクリン；エノキサ シン；エリスロマイシン；エストル酸エリスロマイシン；エチルコハク酸エリス ロマイシン；グルコヘプトン酸エリスロマイシン；ラクトビオン酸エリスロマイ シン；ステアリン酸エリスロマイシン；エタンブトール；フレロキサシン；ゲン タマイシン；イミペネム；イソニアジド；カナマイシン；ロメフロキサシン；ロ ルカルベフ；メロペネム；メチシリン；メトロニダゾール；メズロシリン；塩酸 ミノサイクリン；ムピロシン；ナフシリン；ナリジクス酸；ネチルマイシン；ニ トロフラントイン；ノルフロキサシン；オフロキサシン；オキサシリン；ペニシ リンＧ；ピペラシリン；ピラジナミド；リファブチン；リファンピシン；ロキシ スロマイシン；ストレプトマイシン；スルファメトキサゾール；シネルシド；テ イコプラニン；テトラサイクリン；チカルシリン；トブラマイシン；トリメトプ リム；バンコマイシン；ピペラシリンとタゾバクタムの組み合わせ；およびそれ らの誘導体からなる群より選択される、請求項１７に記載の薬学的組成物。 ２０．前記抗生物質が、アミカシン；アジスロマイシン；セフォキシチン；セフ トリアキソン；シプロフロキサシン；コ-アモキシクラブラネート；ドキシサイ クリン；ゲンタマイシン；ムピロシン；バンコマイシン；およびピペラシリンと タゾバクタムの組み合わせからなる群より選択される、請求項１７に記載の薬学 的組成物。 ２１．前記組成物がリポソーム中に組み込まれている、請求項１６〜２０のいず れかに記載の薬学的組成物。 ２２．前記組成物が徐放ビヒクル中に組み込まれている、請求項１６〜２０のい ずれかに記載の薬学的組成物。 ２３．治療的使用のための、請求項１〜１２のいずれかに記載のインドリシジン アナログ、または請求項１６〜２０のいずれかに記載の薬学的組成物。 ２４．感染を処置するための医薬品の製造のための、請求項１〜１２のいずれか に記載のインドリシジンアナログ、または請求項１６〜２０のいずれかに記載の 薬学的組成物の使用。 ２５．前記感染が微生物に起因する、請求項２４に記載の使用。 ２６．前記微生物が、細菌、真菌、寄生虫、およびウイルスからなる群より選択 される、請求項２５に記載の使用。 ２７．前記真菌が酵母および／またはカビである、請求項２６に記載の使用。 ２８．前記細菌がグラム陰性細菌である、請求項２６に記載の使用。 ２９．前記グラム陰性細菌が、Acinetobacter spp.；Enterobacter spp.；E．co li；H．influenzae；K．pneumoniae；P．aeruginosa；S．marcescens、およびS. maltophiliaからなる群より選択される、請求項２８に記載の使用。 ３０．前記グラム陰性細菌が、Bordetella pertussis；Brucella spp.；Campylo bacter spp.；Haemophilus ducreyi；Helicobacter pylori；Legionellaspp.；M oraxella catarrhalis；Neisseria spp．；Salmonella spp.；Shigella spp.、 およびYersinia spp.からなる群より選択される、請求項２８に記載の使用。 ３１．前記細菌がグラム陽性細菌である、請求項２６に記載の使用。 ３２．前記グラム陽性細菌が、E．faecalis；S.aureus；E．faecium；S．pyogen es；S．pneumoniae、およびコアグラーゼ陰性staphylococcusからなる群より選 択される、請求項３１に記載の使用。 ３３．前記グラム陽性細菌が、Bacillus spp.；Corynebacterium spp.；Diphthe roid；Listeriaspp.、およびViridans Streptococcusからなる群より選択される 、請求項３１に記載の使用。 ３４．前記細菌が嫌気性菌である、請求項２６に記載の使用。 ３５．前記嫌気性菌が、Clostridium spp.；Bacteroides spp.、およびPeptostr eptococcus spp.からなる群より選択される、請求項３４に記載の使用。 ３６．前記細菌がBorrelia spp.；Chlamydiaspp.；Mycobacteriumspp.；Mycopla smaspp.；Propionibacterium acne；Rickettsiaspp.；Treponemaspp.、およびUr eaplasma spp.からなる群より選択される、請求項３４に記載の使用。 ３７．前記インドリシジンアナログが、静脈内注射、腹腔内注射もしくは移植、 筋肉内注射もしくは移植、鞘内注射、皮下注射もしくは移植、皮内注射、洗浄、 膀胱洗浄、坐剤、ペッサリー、経口摂取、局所適用、腸適用、吸入、エーロゾル 適用、または鼻スプレー、または点滴剤によって投与される、請求項２５に記載 の使用。 ３８．請求項１〜２２のいずれかに記載のインドリシジンアナログを含む組成物 でコートされた、デバイス。 ３９．前記組成物が抗生物質をさらに含む、請求項３８に記載のデバイス。 ４０．前記デバイスが医療用デバイスである、請求項３８または３９のいずれか に記載のデバイス。 ４１．前記デバイスが、カテーテル、人工心臓弁、カニューレ、およびステント からなる群より選択される、請求項４０に記載の医療用デバイス。 ４２．請求項１〜１２のいずれかに記載のインドリシジンアナログと特異的に反 応する、抗体。 ４３．前記抗体がモノクローナル抗体または単鎖抗体である、請求項４２に記載 の抗体。 【図１】【図２】【図３】【図４】【図５】 【図６】【図７】【図８】【図９】【図１０】【図１１】 【図１２】【図１３】 【図１４】【図１５】 【図１６】【図１７】 【図１８】 【図１９】【図２０】 【図２１】 【図２２】【図２３】 【図２４】 【図２６】 【図２５】【図２７】【図２８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 33/00 33/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (71)出願人 ウエスト，マイケル エイチ．ピー. カナダ国 ブリティッシュ コロンビア, バンクーバー，イースト 19ティーエイチ ストリート 2554 (71)出願人 クリーガー，ティモシー ジェイ. カナダ国 ブイ５ゼット ２ゼット９ ブ リティッシュ コロンビア，バンクーバ ー，キャンビー ストリート 5471 (71)出願人 テイラー，ロバート カナダ国 ブイ４ビー １エックス３ ブ リティッシュ コロンビア，ホワイト ロ ック，ブエナ ビスタ アベニュー 14587 (71)出願人 アーフル，ダグラス カナダ国 ブイ６エイチ ３ダブリュー５ ブリティッシュ コロンビア，バンクー バー，ウエスト ７ティーエイチ アベニ ュー 1308 (72)発明者 フレイサー，ジャネット アール. カナダ国 ブイ６エイチ １ビー３ ブリ ティッシュ コロンビア，バンクーバー, ウエスト ７ティーエイチ アベニュー ナンバー12 1038 (72)発明者 ウエスト，マイケル エイチ．ピー. カナダ国 ブリティッシュ コロンビア, バンクーバー，イースト 19ティーエイチ ストリート 2554 (72)発明者 クリーガー，ティモシー ジェイ. カナダ国 ブイ５ゼット ２ゼット９ ブ リティッシュ コロンビア，バンクーバ ー，キャンビー ストリート 5471 (72)発明者 テイラー，ロバート カナダ国 ブイ４ビー １エックス３ ブ リティッシュ コロンビア，ホワイト ロ ック，ブエナ ビスタ アベニュー 14587 (72)発明者 アーフル，ダグラス カナダ国 ブイ６エイチ ３ダブリュー５ ブリティッシュ コロンビア，バンクー バー，ウエスト ７ティーエイチ アベニ ュー 1308

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．インドリシジンアナログであって、８〜25アミノ酸を含み、そして以下の式 を含み： RXZXXZXB ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；そしてＢ は塩基性アミノ酸である、アナログ。 ２．インドリシジンアナログであって、８〜25アミノ酸を含み、そして以下の式 を含み： BXZXXZXB ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基 性アミノ酸であり；そして少なくとも１つのＺがバリンである、アナログ。 ３．インドリシジンアナログであって、10〜25アミノ酸を含み、そして以下の式 を含み： BBBXZXXZXB ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；そしてＢ は塩基性アミノ酸である、アナログ。 ４．インドリシジンアナログであって、17〜25アミノ酸を含み、そして以下の式 を含み： BXZXXZXBBBn(AA)nMILBBAGS ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基 性アミノ酸であり；ＡＡは任意のアミノ酸であり；そしてｎは０または１である 、アナログ。 ５．インドリシジンアナログであって、10〜25アミノ酸を含み、そして以下の式 を含み： BXZXXZXBB(AA)nM ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基 性アミノ酸であり；ＡＡは任意のアミノ酸であり；そしてｎは０または１である 、アナログ。 ６．インドリシジンアナログであって、８〜25アミノ酸を含み、そして以下の式 を含み： LBBnXZnXXZnXRK ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基 性アミノ酸であり；そしてｎは０または１である、アナログ。 ７．インドリシジンアナログであって、10〜25アミノ酸を含み、そして以下の式 を含み： LKnXZXXZXRRK ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；そしてｎ は０または１である、アナログ。 ８．インドリシジンアナログであって、11〜25アミノ酸を含み、そして以下の式 を含み： BBXZXXZXBBB ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基 性アミノ酸であり；そして少なくとも２つのＸ残基はフェニルアラニンである、 アナログ。 ９．インドリシジンアナログであって、11〜25アミノ酸を含み、そして以下の式 を含み： BBXZXXZXBBB ここで、Ｚはプロリンまたはバリンであり；Ｘは疎水性残基であり；Ｂは塩基 性アミノ酸であり；そして少なくとも２つのＸ残基はチロシンである、アナログ 。 １０．Ｚがプロリンであり、Ｘがトリプトファンであり、そしてＢがアルギニン またはリジンである、請求項１、および３〜７のいずれかに記載のアナログ。 １１．以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ：１２．以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ： １３．以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ：１４．以下からなる群より選択される、インドリシジンアナログ： １５．２つ以上のアナログが結合されて分岐ペプチドを形成する、請求項１〜14 のいずれかに記載のインドリシジンアナログ。 １６．４つのアナログが以下の式を有するペプチドコアに結合される、請求項１ ５に記載のインドリシジンアナログ： １７．８つのアナログが以下の式を有するペプチドコアに結合される、請求項１ ５に記載のインドリシジンアナログ： １８．前記アナログが、対応するD-アミノ酸に変化された１つ以上のアミノ酸を 有する、請求項１〜１５のいずれかに記載のインドリシジンアナログ。 １９．Ｎ末端アミノ酸がD-アミノ酸である、請求項１８に記載のインドリシジン アナログ。 ２０．Ｃ末端アミノ酸がD-アミノ酸である、請求項１８に記載のインドリシジン アナログ。 ２１．Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸がD-アミノ酸である、請求項１８に 記載のインドリシジンアナログ。 ２２．前記アナログがＮ末端アミノ酸においてアセチル化されている、請求項１ 〜１５のいずれかに記載のインドリシジンアナログ。 ２３．前記アナログがＣ末端アミノ酸においてアミド化されている、請求項１〜 １５のいずれかに記載のインドリシジンアナログ。 ２４．前記アナログがＣ末端アミノ酸においてエステル化されている、請求項１ 〜１５のいずれかに記載のインドリシジンアナログ。 ２５．前記アナログがＣ末端アミノ酸においてホモセリン／ホモセリンラクトン の組み込みによって修飾されている、請求項１〜１５のいずれかに記載のインド リシジンアナログ。 ２６．前記アナログがポリエチレングリコールまたはその誘導体と結合されてい る、請求項１〜１５のいずれかに記載のインドリシジンアナログ。 ２７．その配列が、１つ以上の、請求項１１〜１４のいずれかに記載のインドリ シジンアナログのコード配列を含む、単離された核酸分子。 ２８．請求項２７に記載の核酸分子と作動可能に連結されたプロモーターを含む 発現ベクター。 ２９．請求項２８に記載の発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換され た宿主細胞。 ３０．少なくとも１つの、請求項１〜２６のいずれかに記載のインドリシジンア ナログ、および生理学的に受容可能な緩衝液を含む、薬学的組成物。 ３１．抗生物質をさらに含む、請求項３０に記載の薬学的組成物。 ３２．前記抗生物質が、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セフ ァマイシン、カルバペネム、モノバクタム、キノロン、テトラサイクリン、アミ ノグリコシド、マクロライド、グリコペプチド、クロラムフェニコール、グリシ ルサイクリン、リコサミド、およびフルオロキノロンからなる群より選択される 、請求項３１に記載の薬学的組成物。 ３３．前記抗生物質が、アミカシン；アモキシシリン；アンピシリン；アジスロ マイシン；アズロシリン；アズトレオナム；カルベニシリン；セファクロール； セファマンドールフォルメートナトリウム；セファゾリン；セフェピム；セフェ タメト；セフィキシム；セフメタゾール；セフォニシド；セフォペラゾン；セフ ォタキシム；セフォテタン：セフォキシチン；セフポドキシム：セフプロジル； セフスロジン；セフタジジム；セフチゾキシム；セフトリアキソン；セフロキシ ム；セファレキシン；セファロチン：クロラムフェニコール；シノキサシン；シ プロフロキサシン；クラリスロマイシン；クリンダマイシン；クロキサシリン； コーアモキシクラブラネート；ジクロキサシリン；ドキシサイクリン；エノキサ シン；エリスロマイシン；エストル酸エリスロマイシン：エチルコハク酸エリス ロマイシン；グルコヘプトン酸エリスロマイシン；ラクトビオン酸エリスロマイ シン；ステアリン酸エリスロマイシン；エタンブトール；フレロキサシン；ゲン タマイシン；イミペネム；イソニアジド；カナマイシン；ロメフロキサシン；ロ ルカルベフ；メロペネム；メチシリン；メトロニダゾール；メズロシリン；塩酸 ミノサイクリン；ムピロシン；ナフシリン；ナリジクス酸；ネチルマイシン；ニ トロフラントイン：ノルフロキサシン；オフロキサシン：オキサシリン：ペニシ リンＧ；ピペラシリン；ピラジナミド；リファブチン；リファンピシン；ロキシ スロマイシン；ストレプトマイシン；スルファメトキサゾール；シネルシド；テ イコプラニン；テトラサイクリン；チカルシリン；トブラマイシン；トリメトプ リム；バンコマイシン；ピペラシリンとタゾバクタムの組み合わせ；およびそれ らの誘導体からなる群より選択される、請求項３１に記載の薬学的組成物。 ３４．前記抗生物質が、アミカシン；アジスロマイシン；セフォキシチン；セフ トリアキソン；シプロフロキサシン；コ-アモキシクラブラネート；ドキシサイ クリン；ゲンタマイシン；ムピロシン；バンコマイシン；およびピペラシリンと タゾバクタムの組み合わせからなる群より選択される、請求項３１に記載の薬学 的組成物。 ３５．生理学的に受容可能な緩衝液ならびにアナログおよび抗生物質の組み合わ せを含む薬学的組成物であって、該組み台わせが以下からなる群より選択される 、組成物： ILKKFPFFPFRRKおよびシプロフロキサシン； ILKKFPFFPFRRKおよびムピロシン； ILKKYPYYPYRRKおよびムピロシン； ILKKWPWWPWRKおよびムピロシン； ILRRWPWWPWRRRおよびピペラシリン； WRIWKPKWRLPKWおよびシプロフロキサシン； WRIWKPKWRLPKWおよびムピロシン； WRIWKPKWRLPKWおよびピペラシリン； ILRWVWWVWRRKおよびピペラシリン；ならびに ILKKWPWWPWKおよびムピロシン。 ３６．抗ウイルス剤をさらに含む、請求項３０に記載の薬学的組成物。 ３７．前記抗ウイルス剤が、アシクロビル；塩酸アマンタジン；ジダノシン；エ ドクスジン；ファムシクロビル；ホスカルネット；ガンシクロビル；イドクスウ リジン；インターフェロン；ラミブジン；ネビラピン；ペンシクロビル；ポドフ ィロトキシン；リバビリン；リマンタジン；ソリブジン；スタブジン；トリフル リジン；ビダラビン；ザルシタビン、およびジドブジンからなる群より選択され る、請求項３６に記載の薬学的組成物。 ３８．駆虫剤をさらに含む、請求項３０に記載の薬学的組成物。 ３９．前記駆虫剤が、8-ヒドロキシキノリン誘導体；キナ皮アルカロイド；ニト ロイミダゾール誘導体；ピペラジン誘導体；ピリミジン誘導体、およびキノリン 誘導体からなる群より選択される、請求項３８に記載の薬学的組成物。 ４０．前記駆虫剤が、アルベンダゾール；アトバクオン；リン酸クロロキン；ク エン酸ジエチルカルバマジン；エフロルニチン；ハロファントリン；ヨードキノ ール；イベルメクチン；メベンダゾール；塩酸メフロキン；メラルソプロールＢ ；メトロニダゾール；ニクロサミド；ニフルチモックス；パロモマイシン；ペン タミジンイセチオネート；ピペラジン；プラジカンテル；リン酸プリマキン；プ ログアニル；パモ酸ピランテル；ピリメタミン；パモ酸ピルビニウム；グルコン 酸キニジン：硫酸キニン；スチボグルコン酸ナトリウム；スラミン、およびチア ベンダゾールからなる群より選択される、請求項３８に記載の薬学的組成物。 ４１．抗真菌剤をさらに含む、請求項３０に記載の薬学的組成物。 ４２．前記抗真菌剤が、アリルアミン；イミダゾール；ピリミジン、およびトリ アゾールからなる群より選択される、請求項４１に記載の薬学的組成物。 ４３．前記抗真菌剤が、5-フルオロシトシン；アムホテリシンＢ；ブトコナゾー ル；クロルフェネシン；シクロピロックス；クリオキノール；クロトリマゾール ；エコナゾール；フルコナゾール；フルシトシン；グリセオフルビン；イトラコ ナゾール；ケトコナゾール；ミコナゾール；塩酸ナフチフィン；ナイスタチン； 硫化セレン；スルコナゾール；塩酸テルビナフィン；テルコナゾール；チオコナ ゾール；トルナフテート、およびウンデシレン酸からなる群より選択される、請 求項４１に記載の薬学的組成物。 ４４．前記組成物がリポソーム中に組み込まれている、請求項３０に記載の薬学 的組成物。 ４５．前記組成物が徐放ビヒクル中に組み込まれている、請求項３０に記載の薬 学的組成物。 ４６．感染を標的化する方法であって、患者に、治療有効量の、請求項３０〜４ ５のいずれかに記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。 ４７．前記感染が微生物に起因する、請求項４６に記載の方法。 ４８．前記微生物が、細菌、真菌、寄生虫、およびウイルスからなる群より選択 される、請求項４７に記載の方法。 ４９．前記真菌が酵母および／またはカビである、請求項４８に記載の方法。 ５０．前記寄生虫が、原生動物、線虫、条虫、および吸虫からなる群より選択さ れる、請求項４８に記載の方法。 ５１．前記寄生虫が原生動物であり、そしてBabesia spp.；Balantidium coli； Blastocystis hominis：Cryptosporidium parvum；Encephalitozoon spp.；Enta moeba spp.；Giardia lamblia；Leishmania spp.；Plasmodium spp.；Toxoplasm a gondil；Trichomonas spp.、およびTrypanosoma spp.からなる群より選択され る、請求項５０に記載の方法。 ５２．前記寄生虫が、Ascaris lumbricoides；Clonorchis sinensis；Echinococ cus spp.；Fasciola hepatica；Fasciolopsis buskl；Heterophyes heterophyes ；Hymenolepis spp.；Schistosoma spp.；Taeniaspp.、およびTrichinella spir alisからなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。 ５３．前記細菌がグラム陰性細菌である、請求項４８に記載の方法。 ５４．前記グラム陰性細菌が、Acinetobacter spp.；Enterobacter spp.；E．co li；H．influenzae；K．pneumoniae；P．aeruginosa；S．marcescens、およびS ．maltophiliaからなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。 ５６．前記グラム陰性細菌が、Bordetella pertussis；Brucella spp.；Campylo bacter spp.；Haemophilus ducreyi；Hellcobacter pylori；Legionella spp.； Moraxella catarrhalis；Neisseria spp.；Salmonella spp.；Shigella spp.、 およびYersinia spp.からなる群より選択される、請求項５３に記載の方法。 ５７．前記細菌がグラム陽性細菌である、請求項４８に記載の方法。 ５８．前記グラム陽性細菌が、E．faecalis；S．aureus；E．faecium；S．pyoge nes；S．pneumoniae、およびコアグラーゼ陰性staphylococcusからなる群より選 択される、請求項５７に記載の方法。 ５９．前記グラム陽性細菌が、Bacillus spp.；Corynebacterium spp.；Diphthe roid；Listeria spp.、およびViridans Streptococcusからなる群より選択され る、請求項５７に記載の方法。 ６０．前記細菌が嫌気性菌である、請求項４８に記載の方法。 ６１．前記嫌気性菌が、Clostridium spp.；Bacteroides spp.、およびPeptostr eptococcus spp.からなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。 ６２．前記細菌がBorrelia spp.；Chlamydia spp.；Mycobacterium spp.；Mycop lasma spp.；Propionibacterium acne；Rickettsia spp.；Treponema spp.、お よびUreaplasma spp.からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。 ６３．前記ウイルスが、アルファウイルス；アレナウイルス；ブンヤウイルス； コロナウイルス；エンテロウイルス；フィロウイルス；フラビウイルス；ハンタ ウイルス；HTLV-BLV；インフルエンザウイルス；レンチウイルス；リッサウイル ス；パラミクソウイルス；レオウイルス；ライノウイルス、およびロタウイルス からなる群より選択されるRNAウイルスである、請求項４８に記載の方法。 ６４．前記ウイルスが、アデノウイルス；サイトメガロウイルス；ヘパドナウイ ルス；モルシポックスウイルス；オルソポックスウイルス；乳頭肺ウイルス；パ ルボウイルス；ポリオーマウイルス；シンプレックスウイルス、およびバリセロ ウイルスからなる群より選択されるDNAウイルスである、請求項４８に記載の方 法。 ６５．前記薬学的組成物が、静脈内注射、腹腔内注射もしくは移植、筋肉内注射 もしくは移植、鞘内注射、皮下注射もしくは移植、皮内注射、洗浄、膀胱洗浄、 坐剤、ペッサリー、経口摂取、局所適用、腸適用、吸入、エーロゾル適用、また は鼻スプレー、または点滴剤によって投与される、請求項４６に記載の方法。 ６６．請求項１〜２６のいずれかに記載のインドリシジンアナログおよび抗生物 質を含む、組成物。 ６７．請求項１〜２６のいずれかに記載のインドリシジンアナログを含む組成物 でコートされたデバイス。 ６８．前記組成物が抗生物質をさらに含む、請求項６７に記載のデバイス。 ６９．前記デバイスが医療用デバイスである、請求項６７または６８のいずれか に記載のデバイス。 ７０．請求項１１〜１４のいずれかに記載のアナログと特異的に反応する、抗体 。 ７１．前記抗体がモノクローナル抗体または単鎖抗体である、請求項７０に記載 の抗体。 ７２．活性化ポリオキシアルキレングリコールおよび脂肪酸を含む結合体でのア ミノ基の誘導体化によって修飾された化合物を含む、組成物。 ７３．前記結合体が、前記ポリオキシアルキレングリコールおよび脂肪酸を結合 するソルビタンをさらに含む、請求項７２に記載の組成物。 ７４．前記結合体がポリソルベートである、請求項７２に記載の組成物。 ７５．前記脂肪酸が12〜18の炭素を有する、請求項７２に記載の組成物。 ７６．前記ポリオキシアルキレングリコールがポリオキシエチレンである、請求 項７２に記載の組成物。 ７７．前記ポリオキシエチレンが２〜100モノマー単位の鎖長を有する、請求項 ７６に記載の組成物。 ７８．前記化合物がペプチドまたはタンパク質である、請求項７２に記載の組成 物。 ７９．前記化合物がカチオン性ペプチドである、請求項７２に記載の組成物。 ８０．前記カチオン性ペプチドがインドリシジン、インドリシジンアナログ、ま たはセクロピン／メリチン融合ペプチドである、請求項７９に記載の組成物。 ８１．前記ポリオキシアルキレングリコールが紫外光の照射によって活性化され る、請求項７２に記載の組成物。 ８２．活性化ポリオキシアルキレングリコールおよび脂肪酸の結合体で修飾され た化合物の作製方法であって： （ａ）活性化ポリオキシアルキレングリコールおよび脂肪酸の結合体の、化合 物との混合物を凍結する工程；および （ｂ）該凍結された混合物を凍結乾燥する工程、を包含し； ここで、該化合物が遊離アミノ基を有する、方法。 ８３．前記化合物がペプチドである、請求項８２に記載の方法。 ８４．前記化合物が抗生物質である、請求項８２に記載の方法。 ８５．工程（ａ）における前記混合物が酢酸緩衝液中に存在する、請求項８２に 記載の方法。 ８６．活性化ポリオキシアルキレングリコールおよび脂肪酸の結合体で修飾され た化合物の作製方法であって、修飾された化合物を形成するために十分な時間、 活性化ポリオキシアルキレングリコールおよび脂肪酸の結合体を、化合物と混合 する工程を包含し、ここで該混合物が8.5より高いpHを有する炭酸緩衝液中に存 在し、そして該化合物が遊離アミノ基を有する、方法。 ８７．前記化合物がペプチドである、請求項８６に記載の方法。 ８８．前記化合物が抗生物質である、請求項８６に記載の方法。 ８９．逆相HPLCによって前記修飾された化合物を単離する工程をさらに包含する 、請求項８２または８６のいずれかに記載の方法。 ９０．有機溶媒からの前記修飾された化合物の沈澱をさらに包含する、請求項８ ９に記載の方法。 ９１．少なくとも１つの、請求項７２〜８１のいずれかに記載の組成物、および 生理学的に受容可能な緩衝液を含む、薬学的組成物。 ９２．抗生物質をさらに含む、請求項９１に記載の薬学的組成物。 ９３．前記アナログおよび抗生物質が以下からなる群より選択される、請求項９ ２に記載の薬学的組成物： ILKKFPFFPFRRKおよびシプロフロキサシン； ILKKFPFFPFRRKおよびムピロシン； ILKKYPYYPYRRKおよびムピロシン； ILKKWPWWPWRKおよびムピロシン； ILRRWPWWPWRRRおよびピペラシリン； WRIWKPKWRLPKWおよびシプロフロキサシン； WRIWKPKWRLPKWおよびムピロシン； WRIWKPKWRLPKWおよびピペラシリン； ILRWVWWVWRRKおよびピペラシリン；ならびに ILKKWPWWPWKおよびムピロシン。 ９４．抗ウイルス剤をさらに含む、請求項９１に記載の薬学的組成物。 ９５．駆虫剤をさらに含む、請求項９１に記載の薬学的組成物。 ９６．抗真菌剤をさらに含む、請求項９１に記載の薬学的組成物。 ９７．感染を処置する方法であって、患者に、治療有効量の、請求項９１〜９６ のいずれかに記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。 ９８．前記感染が微生物に起因する、請求項９７に記載の方法。 ９９．前記微生物が細菌、真菌、寄生虫、およびウイルスからなる群より選択さ れる、請求項９８に記載の方法。 １００．前記薬学的組成物が、静脈内注射、腹腔内注射もしくは移植、筋肉内注 射もしくは移植、鞘内注射、皮下注射もしくは移植、皮内注射、洗浄、膀胱洗浄 、坐剤、ペッサリー、経口摂取、局所適用、腸適用、吸入、エーロゾル適用、ま たは鼻スプレー、または点滴剤によって投与される、請求項９７に記載の方法。
JP10510994A 1996-08-21 1997-08-21 インドリシジンのアナログを用いて感染を処置するための組成物および方法 Pending JP2001500477A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2475496P 1996-08-21 1996-08-21
US60/024,754 1996-08-21
US3494997P 1997-01-13 1997-01-13
US60/034,949 1997-01-13
PCT/US1997/014779 WO1998007745A2 (en) 1996-08-21 1997-08-21 Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004242925A Division JP4073900B2 (ja) 1996-08-21 2004-08-23 インドリシジンのアナログを用いて感染を処置するための組成物および方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2001500477A true JP2001500477A (ja) 2001-01-16
JP2001500477A5 JP2001500477A5 (ja) 2005-04-07

Family

ID=26698836

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP10510994A Pending JP2001500477A (ja) 1996-08-21 1997-08-21 インドリシジンのアナログを用いて感染を処置するための組成物および方法
JP2004242925A Expired - Fee Related JP4073900B2 (ja) 1996-08-21 2004-08-23 インドリシジンのアナログを用いて感染を処置するための組成物および方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2004242925A Expired - Fee Related JP4073900B2 (ja) 1996-08-21 2004-08-23 インドリシジンのアナログを用いて感染を処置するための組成物および方法

Country Status (9)

Country Link
US (4) US6180604B1 (ja)
EP (1) EP0925308B1 (ja)
JP (2) JP2001500477A (ja)
AT (2) ATE218579T1 (ja)
CA (1) CA2263799A1 (ja)
DE (2) DE69713112T2 (ja)
ES (2) ES2315252T3 (ja)
HK (1) HK1043475B (ja)
WO (1) WO1998007745A2 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005504769A (ja) * 2001-08-21 2005-02-17 マイクロロジックス　バイオテック，インコーポレイテッド 抗菌性カチオン性ペプチドおよびそれらの処方物
JP2005516889A (ja) * 2001-08-24 2005-06-09 マイクロロジックス バイオテック， インコーポレイテッド 抗菌性および抗炎症性ペプチド
WO2009154264A1 (ja) * 2008-06-20 2009-12-23 学校法人福岡大学 ペプチド
US8697639B2 (en) 2005-07-28 2014-04-15 Biosynexus Incorporated Compositions and methods for treating bacteria
JP2016530315A (ja) * 2013-09-12 2016-09-29 アリオス バイオファーマ インク． ピリダジノン化合物およびその用途

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE910820A1 (en) * 1990-03-22 1991-09-25 Sloan Kettering Inst Cancer Gp75 as a tumor vaccine for melanoma
US6503881B2 (en) 1996-08-21 2003-01-07 Micrologix Biotech Inc. Compositions and methods for treating infections using cationic peptides alone or in combination with antibiotics
US6180604B1 (en) * 1996-08-21 2001-01-30 Micrologix Biotech Inc. Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin
WO1999043357A1 (en) * 1998-02-25 1999-09-02 Micrologix Biotech Inc. Indolicidin and cationic peptides conjugated with polymers
US6303575B1 (en) 1998-05-12 2001-10-16 The Regents Of The University Of California Indolicidin analogs and methods of using same
WO1999065506A2 (en) * 1998-06-12 1999-12-23 Micrologix Biotech Inc. Cancer therapy with indolicidin or cationic peptides and their polymer conjugates
US6444645B1 (en) * 1998-06-18 2002-09-03 The Regents Of The University Of California Crosslink-stabilized indolicidin analogs
US6288212B1 (en) * 1998-08-28 2001-09-11 The University Of British Columbia Anti-endotoxic, antimicrobial cationic peptides and methods of use therefor
JP2002530274A (ja) * 1998-10-30 2002-09-17 インターリンク・バイオテクノロジーズ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー プロテアーゼ分解に対する安定性の高いペプチド
US6946261B1 (en) 1998-11-20 2005-09-20 Migenix Inc. Efficient methods for producing anti-microbial cationic peptides in host cells
WO2000052144A1 (en) * 1999-03-03 2000-09-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Genetic and epigenetic manipulation of abc transporters and ecto-phosphatases for the conference of drug resistance and for the loss of drug resistance in biological systems and methods for the detection of ecto-phosphatase inhibitors
US7169889B1 (en) 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
US6309633B1 (en) * 1999-06-19 2001-10-30 Nobex Corporation Amphiphilic drug-oligomer conjugates with hydroyzable lipophile components and methods for making and using the same
US6576224B1 (en) 1999-07-06 2003-06-10 Sinuspharma, Inc. Aerosolized anti-infectives, anti-inflammatories, and decongestants for the treatment of sinusitis
US6429211B1 (en) * 2000-05-23 2002-08-06 Bayer Corporation Praziquantel compounds for treating diseases due to Sarcocystis Neospora Toxoplasma and Isospora
AU2001268512A1 (en) * 2000-06-16 2002-01-02 Hercules Incorporated Chemically-modified peptides, compositions, and methods of production and use
KR20090089922A (ko) 2000-10-18 2009-08-24 파마셋 인코포레이티드 바이러스 감염 및 비정상적인 세포 증식의 치료를 위한 변형된 뉴클레오시드
PT1353647E (pt) 2000-12-27 2011-05-24 Gilead Sciences Inc Aztreonam inal?vel para tratamento e preven??o de infec??es bacterianas pulmonares
US7214364B2 (en) 2000-12-27 2007-05-08 Corus Pharma, Inc. Inhalable aztreonam lysinate formulation for treatment and prevention of pulmonary bacterial infections
US6867183B2 (en) 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7060675B2 (en) 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US7115572B2 (en) * 2001-03-29 2006-10-03 Council Of Scientific And Industrial Research Indolicidin analogs with anti-microbial activity
US8658202B2 (en) 2001-04-25 2014-02-25 Western University Of Health Sciences Coated drug delivery formulations
US6759058B1 (en) * 2001-04-25 2004-07-06 Western Center For Drug Development College Of Pharmacy Western University Of Health Sciences Enteric-coated proliposomal formulations for poorly water soluble drugs
US6858580B2 (en) 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US20040235745A1 (en) * 2001-06-22 2004-11-25 Deber Charles M Antimicrobial Peptides
US6734165B2 (en) * 2001-08-23 2004-05-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for re-sensitizing vancomycin resistant bacteria which selectively cleave a cell wall depsipeptide
US7312192B2 (en) 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US6913903B2 (en) 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7196059B2 (en) 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7166571B2 (en) 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US20030219854A1 (en) * 2002-03-21 2003-11-27 Micrologix Biotech Inc. Methods for producing modified anti-infective peptides
WO2003087815A2 (en) * 2002-04-17 2003-10-23 Novartis Ag Method for the identification of inhibitors of the binding of are-containing mrn a and an hur protein
US7345018B2 (en) 2002-04-25 2008-03-18 Reception Aps Method of treating side effects induced by therapeutic agents
US7482328B2 (en) * 2002-04-25 2009-01-27 Toagosei Co., Ltd. Antimicrobial polypeptide and utilization thereof
US7601688B2 (en) 2002-06-13 2009-10-13 Biocon Limited Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus
IL150907A (en) * 2002-07-25 2007-07-04 Stephan Cherkez Process for the preparation of stable amorphous calcium pseudomonate
SE0202613D0 (sv) 2002-09-04 2002-09-04 Innate Pharmaceuticals Ab Förfarande och prob för identifiering av ämnen som modifierar bakteriers virulens, som sådana identifierade ämnen samt deras användning
US7238669B2 (en) * 2002-09-11 2007-07-03 The Curators Of The University Of Missouri Phage-display peptides as novel antimicrobial agents against Haemophilus influenzae
US20050245582A1 (en) * 2002-09-12 2005-11-03 The Hartz Mountain Corporation High concentration topical insecticides containing pyrethroids
US20060276339A1 (en) * 2002-10-16 2006-12-07 Windsor J B Methods and compositions for increasing the efficacy of biologically-active ingredients
PL219609B1 (pl) 2003-02-19 2015-06-30 Masanori Baba Analogi nukleozydów przeciwwirusowych, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna i ich zastosowania
US20040260454A1 (en) * 2003-06-11 2004-12-23 Basir Otman A. Vibro-acoustic engine diagnostic system
US7189403B2 (en) * 2003-06-30 2007-03-13 Institut Pasteur Attenuated flavivirus strains containing a mutated M-ectodomain and their applications
US20050171063A1 (en) * 2003-10-20 2005-08-04 Pawan Malhotra Use of phosphono derivatives as anti-malarials
TR200603675T2 (tr) * 2003-10-22 2007-01-22 Council Of Scientific And Industrial Research Seçilmiş amino asit-çinko komplekslerin anti-malaryal olarak kullanımı
US7674771B2 (en) * 2003-10-29 2010-03-09 Toagosei Co., Ltd Antimicrobial peptides and utilization of the same
US7994225B2 (en) * 2004-03-17 2011-08-09 Rempex Pharmaceuticals, Inc. Bacterial efflux pump inhibitors for the treatment of ophthalmic and otic infections
CA2559208A1 (en) * 2004-03-17 2005-09-29 Mpex Pharmaceuticals, Inc. Use and administration of bacterial efflux pump inhibitors
WO2005090385A2 (en) * 2004-03-18 2005-09-29 Ansata Therapeutics, Inc. Compositions having antimicrobial activity and uses thereof
PL2626368T3 (pl) 2004-07-19 2017-06-30 Biocon Limited Koniugaty insulina-oligomer, ich formulacje i zastosowania
JP4507080B2 (ja) * 2004-07-30 2010-07-21 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
US7588885B2 (en) * 2004-08-06 2009-09-15 Chung Yuan Christian University Use of biocistronic DNA constructs for identifying compounds that inhibit IRES-dependent translation
US20060068020A1 (en) * 2004-09-24 2006-03-30 Cottrell Ian W Encapsulated pharmaceutical agents
JP4730584B2 (ja) * 2004-12-06 2011-07-20 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
EP1849474B1 (en) * 2005-02-15 2016-09-07 Toagosei Co., Ltd. Antimicrobial peptide and use thereof
US20090099062A1 (en) * 2007-05-31 2009-04-16 Ethan Lee Pyrvinium For The Treatment of Cancer
PT2203181T (pt) 2007-10-16 2018-05-10 Biocon Ltd Uma composição farmacêutica sólida para administração por via oral e o seu processo de fabrico
WO2009149278A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Synergy Pharmaceuticals Inc. Agonists of guanylate cyclase useful for the treatment of gastrointestinal disorders, inflammation, cancer and other disorders
US8773662B2 (en) * 2010-07-22 2014-07-08 Vuv Analytics, Inc. Methods and apparatus for vacuum ultraviolet (VUV) or shorter wavelength circular dichroism spectroscopy
EP2600869B1 (en) * 2010-08-05 2020-09-23 Helperby Therapeutics Limited Combination of a pyrroloquinoline compound and a beta-lactam antimicrobial agent, mupirocin or chlorhexidine
CN102167731B (zh) * 2011-02-10 2013-01-23 周逸明 一种固相多肽合成奥米加南的制备方法
WO2013056003A2 (en) 2011-10-12 2013-04-18 Yale University Catechol diethers as potent anti-hiv agents
WO2015077057A1 (en) * 2013-11-20 2015-05-28 Texas Southern University Methionine aminopeptidase inhibitors for treating infectious diseases
RU2678985C2 (ru) * 2017-02-06 2019-02-05 Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА" Биоцидный пептид и препарат на его основе
CN108721292B (zh) * 2018-05-04 2022-04-01 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 扑蛲灵在制备广谱抗冠状病毒药物中的应用
KR102433665B1 (ko) * 2021-11-17 2022-08-19 주식회사 씨위드 인돌리시딘 유래 항균 펩타이드 및 이의 용도

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2128617A (en) 1982-10-06 1984-05-02 Martti Vaara Polypeptides for use in antibacterial therapy
NZ237202A (en) 1990-02-23 1994-01-26 Bristol Myers Squibb Co Composition containing beta-lactam antibiotic and cationic oligopeptide
US5547939A (en) 1991-06-14 1996-08-20 The Regents Of The University Of California Broad spectrum antimicrobial compounds and methods of use
US5324716A (en) 1991-06-14 1994-06-28 Regents Of The University Of California Broad spectrum antimicrobial compounds and methods of use
US5593866A (en) 1992-08-21 1997-01-14 The University Of British Columbia Cationic peptides and method for production
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
EP0759774B1 (en) 1993-09-22 2002-06-12 XOMA Technology Ltd. Method of treating gram-negative bacterial infection by administration of bactericidal/permeability-increasing (bpi) protein product and antibiotic
JP4076026B2 (ja) * 1993-10-25 2008-04-16 トランセイヴ，インコーポレイテッド リポソームディフェンシン
DE69527195T2 (de) 1994-01-14 2003-03-06 Xoma Technology Ltd., Berkeley Anti gram positive bakterielle verfahren und mittel
US5574017A (en) * 1994-07-05 1996-11-12 Gutheil; William G. Antibacterial agents
US5877274A (en) 1995-06-02 1999-03-02 University Of British Columbia Antimicrobial cationic peptides
ES2316154T3 (es) 1995-08-23 2009-04-01 University Of British Columbia Peptidos cationicos antimicrobianos y procedimientos de seleccion de los mismos.
US5994308A (en) 1996-02-28 1999-11-30 Board Of Trustees Of Southern Illinois University Broad spectrum antimicrobial peptides containing a tryptophan triplet and methods of use
US6503881B2 (en) * 1996-08-21 2003-01-07 Micrologix Biotech Inc. Compositions and methods for treating infections using cationic peptides alone or in combination with antibiotics
US6180604B1 (en) * 1996-08-21 2001-01-30 Micrologix Biotech Inc. Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin
US6551994B1 (en) 1997-04-10 2003-04-22 Mcgill University Compounds and methods for inhibiting the interaction between α-catenin and β-catenin
WO1999043357A1 (en) 1998-02-25 1999-09-02 Micrologix Biotech Inc. Indolicidin and cationic peptides conjugated with polymers

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005504769A (ja) * 2001-08-21 2005-02-17 マイクロロジックス　バイオテック，インコーポレイテッド 抗菌性カチオン性ペプチドおよびそれらの処方物
JP2012041367A (ja) * 2001-08-21 2012-03-01 Carrus Capital Corp 抗菌性カチオン性ペプチドおよびそれらの処方物
JP4932136B2 (ja) * 2001-08-21 2012-05-16 カーラス キャピタル コーポレイション 抗菌性カチオン性ペプチドおよびそれらの処方物
JP2005516889A (ja) * 2001-08-24 2005-06-09 マイクロロジックス バイオテック， インコーポレイテッド 抗菌性および抗炎症性ペプチド
US8697639B2 (en) 2005-07-28 2014-04-15 Biosynexus Incorporated Compositions and methods for treating bacteria
WO2009154264A1 (ja) * 2008-06-20 2009-12-23 学校法人福岡大学 ペプチド
JP2016530315A (ja) * 2013-09-12 2016-09-29 アリオス バイオファーマ インク． ピリダジノン化合物およびその用途
US10364226B2 (en) 2013-09-12 2019-07-30 Alios Biopharma, Inc. Pyridazinone compounds and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
DE69739035D1 (de) 2008-11-20
HK1021824A1 (en) 2000-07-07
US6180604B1 (en) 2001-01-30
US6538106B1 (en) 2003-03-25
DE69713112D1 (de) 2002-07-11
HK1043475A1 (en) 2002-09-13
JP2005225857A (ja) 2005-08-25
WO1998007745A2 (en) 1998-02-26
US20080242614A1 (en) 2008-10-02
ATE410441T1 (de) 2008-10-15
JP4073900B2 (ja) 2008-04-09
ES2315252T3 (es) 2009-04-01
DE69713112T2 (de) 2003-01-30
US20040009910A1 (en) 2004-01-15
HK1043475B (en) 2009-07-03
ATE218579T1 (de) 2002-06-15
US7390787B2 (en) 2008-06-24
EP0925308A2 (en) 1999-06-30
WO1998007745A3 (en) 1998-07-09
CA2263799A1 (en) 1998-02-26
EP0925308B1 (en) 2002-06-05
ES2178000T3 (es) 2002-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4073900B2 (ja) インドリシジンのアナログを用いて感染を処置するための組成物および方法
US6503881B2 (en) Compositions and methods for treating infections using cationic peptides alone or in combination with antibiotics
WO1998007745A9 (en) Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin
US9872885B2 (en) Antimicrobial and anti-inflammatory peptides
US8466102B2 (en) Antimicrobial cationic peptides and formulations thereof
WO1999065506A2 (en) Cancer therapy with indolicidin or cationic peptides and their polymer conjugates
EP1174439B1 (en) Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin
WO1999043357A1 (en) Indolicidin and cationic peptides conjugated with polymers
HK1021824B (en) Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin
HK1025103B (en) Compositions and methods for treating infections using cationic peptides alone or in combination with antibiotics

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040823

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20040823

A72 Notification of change in name of applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A721

Effective date: 20050908

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070515

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20070808

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20070914

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20071115

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20080108