ES2315252T3 - Composiciones y metodos para tratar infecciones usando analogos de indolicidina. - Google Patents
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Abstract
Un análogo de indolicidina, que consiste en una de las siguientes secuencias: (Ver secuencias)
Description
Composiciones y métodos para tratar infecciones
usando análogos de indolicidina.
La presente invención se refiere en general a
composiciones para tratar infecciones causadas por microorganismos,
y más específicamente, a composiciones que comprenden análogos de
indolicidina, análogos modificados con polímeros, y a sus usos para
tratar infecciones.
Para la mayoría de los individuos sanos las
infecciones son molestas, pero generalmente no son amenazadoras
para la vida. Muchas infecciones son combatidas satisfactoriamente
por el sistema inmunitario del individuo. El tratamiento es un
complemento y generalmente está fácilmente disponible en países
desarrollados. Sin embargo, las enfermedades infecciosas son un
grave problema en países en desarrollo y en individuos
inmunocomprometidos.
En los países en desarrollo, la falta de
condiciones de salubridad adecuadas y la consiguiente poca higiene
proporcionan un entorno que promueve las infecciones bacterianas, de
parásitos, fúngicas y víricas. La poca higiene y las deficiencias
nutricionales pueden disminuir la eficacia de las barreras
naturales, tales como la piel y membranas mucosas, para la invasión
de agentes infecciosos o la capacidad del sistema inmunitario de
eliminar los agentes. También, un ataque constante de patógenos
puede estresar las defensas del sistema inmunitario de la
producción de anticuerpos y células fagocíticas (por ejemplo,
neutrófilos polimorfos) a niveles anormales. También se puede
producir una pérdida de las defensas del hospedante debido a
condiciones tales como trastornos circulatorios, obstrucción
mecánica, fatiga, fumar, bebida excesiva, defectos genéticos, SIDA,
trasplante de médula ósea, cáncer y diabetes. Un problema corriente
creciente en el mundo son las infecciones oportunistas en individuos
que son VIH positivos.
Aunque puede haber vacunas disponibles para
proteger frente a algunos de estos organismos, las vacunaciones no
siempre son viables, debido a factores tales como mecanismos de
suministro inadecuados y pobreza económica, o eficaces debido a
factores tales como suministro demasiado tarde en la infección,
incapacidad del paciente para montar una respuesta inmunitaria a la
vacuna, o a la evolución del patógeno. Para otros agentes patógenos
no hay vacunas disponibles. Cuando no es posible la protección
frente a la infección, generalmente se persigue el tratamiento de
la infección. El arma principal en el arsenal de tratamientos son
los antibióticos. Aunque los antibióticos han demostrado ser
eficaces frente a muchas bacterias y así han salvado incontables
vidas, no son una panacea. El uso excesivo de antibióticos en
ciertas situaciones ha promovido la extensión de cepas bacterianas
resistentes. Y muy importante, los antibacterianos no son útiles
frente a infecciones víricas.
Una variedad de organismos produce péptidos
catiónicos (cargados positivamente), moléculas usadas como parte de
un mecanismo de defensa no específico frente a microorganismos.
Cuando se aíslan, estos péptidos son tóxicos para una amplia
variedad de microorganismos, incluyendo bacterias, hongos y ciertos
virus recubiertos. Un péptido catiónico encontrado en neutrófilos
es la indolicidina. Aunque la indolicidina actúa frente a muchos
patógenos, existen notables excepciones y grados variables de
toxicidad.
Aunque los péptidos catiónicos muestran eficacia
in vitro frente a una variedad de células patógenas
incluyendo bacterias gram positivas, bacterias gram negativas, y
hongos, estos péptidos en general son tóxicos para los mamíferos
cuando son inyectados, y los índices terapéuticos normalmente son
bastante pequeños. Los enfoques para reducir la toxicidad han
incluido el desarrollo de un derivado o sistema de suministro que
enmascara elementos estructurales implicados en la respuesta tóxica
o que mejora la eficacia con dosis menores. Entre otros enfoques en
evaluación se incluyen sistemas de liposomas y micelulares para
mejorar los efectos clínicos de péptidos, proteínas, y fármacos
hidrófobos, y ciclodextrinas para aislar superficies hidrófobas
durante la administración en medio acuoso. Por ejemplo, la unión a
polímeros de polietilenglicol (PEG), a menudo por modificación de
grupos amino, mejora el valor medicinal de algunas proteínas tales
como asparaginasa y adenosina-desaminasa, y aumenta
la semivida circulatoria de péptidos tales como interleuquinas.
Ninguno de estos enfoques ha mostrado mejorar la
administración de péptidos catiónicos. Por ejemplo, se han
desarrollado métodos para la síntesis por pasos de derivados de
polisorbato que pueden modificar péptidos por reacciones de
acilación, pero la acilación altera la carga de un péptido catiónico
modificado y frecuentemente reduce o elimina la actividad
antimicrobiana del compuesto. Por lo tanto, para el suministro de
péptidos catiónicos, así como de otros péptidos y proteínas, es
necesario un sistema que combine las propiedades de mayor semivida
circulatoria con la capacidad para formar una estructura
micelular.
La presente invención describe análogos de
indolicidina, diseñados para ampliar su variedad y eficacia, y
además proporcionar otras ventajas relacionadas. La presente
invención también describe métodos y composiciones para modificar
péptidos, proteínas, antibióticos y similares, para reducir la
toxicidad, así como para proporcionar otras ventajas. El documento
WO-A-9522338 and Peptide Chemistry,
1995, pp 229-232 describen análogos de indolicidina
truncados terminados en N- y/o C-.
La presente invención proporciona, de manera
general, análogos de indolicidina de acuerdo con las
reivindicaciones. En ciertas realizaciones, los análogos de
indolicidina se acoplan para formar un péptido ramificado. En otras
realizaciones, el análogo tiene uno o más aminoácidos cambiados por
un D-aminoácido correspondiente, y en ciertas
realizaciones preferidas, el aminoácido N-terminal
y/o el C-terminal es un
D-aminoácido. Otras modificaciones preferidas
incluyen análogos que están acetilados en el aminoácido
N-terminal, amidados en el aminoácido
C-terminal, esterificados en el aminoácido
C-terminal, modificados por incorporación de
homoserina/homoserina-lactona en el aminoácido
C-terminal, y conjugados con polietilenglicol o sus
derivados.
En otros aspectos, la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico aislada cuya secuencia comprende una o
más secuencias de codificación de los análogos de indolicidina
reivindicados, vectores de expresión, y células hospedantes
transfectadas o transformadas con el vector de expresión.
Otros aspectos proporcionan una composición
farmacéutica que comprende al menos un análogo de indolicidina
reivindicado y un tampón fisiológicamente aceptable, que
opcionalmente comprende un agente antibiótico. Las combinaciones
preferidas incluyen I L K K F P F F P F R R K y Ciprofloxacino; I L
K K F P F F P F R R K y Mupirocina; I L K K Y P Y Y P Y R R K y
Mupirocina; I L K K W P W W P W R K y Mupirocina; W R I W K P K W R
L P K W y Ciprofloxacino; W R I W K P K W R L P K W y Mupirocina; W
R I W K P K W R L P K W y Piperacilina, I L R W V W W V W R R K y
Piperacilina; e I L K K W P W W P W K y Mupirocina. En otras
realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un
agente antivírico (por ejemplo, aciclovir; hidrocloruro de
amantadina; didanosina; edoxudina; famciclovir; foscarnet;
ganciclovir; idoxuridina; interferón; lamivudina; nevirapina;
penciclovir; podofilotoxina; ribavirina; rimantadina; sorivudina;
stavudina; trifluridina; vidarabina; zalcitabina y zidovudina); un
agente antiparásito (por ejemplo, derivados de
8-hidroxiquinolina; alcaloides de cinchona;
derivados de nitroimidazol; derivados de piperazina; derivados de
pirimidina y derivados de quinolina; albendazol; atovaquona;
fosfato de cloroquina; citrato de dietilcarbamazina; eflornitina;
halofantrina; iodoquinol; ivermectina; mebendazol; hidrocloruro de
mefloquina; melarsoprol B; metronidazol; niclosamida; nifurtimox;
paromomicina; isetionato de pentamidina; piperazina; praziquantel;
fosfato de primaquina; proguanil; pamoato de pirantel; pirimetamina;
pamoato de pirivinio; gluconato de quinidina; sulfato de quinina;
estibogluconato sódico; suramina y tiabendazol); un agente
antifúngico (por ejemplo, alilaminas; imidazoles; pirimidinas y
triazoles, 5-fluorocitosina; anfotericina B;
butoconazol; clorfenesina; ciclopirox; clioquinol; clotrimazol;
econazol; fluconazol; flucitosina; griseofulvina; itraconzol;
ketoconazol; miconazol; hidrocloruro de naftitfina; nistatina;
sulfuro de selenio; sulconazol; hidrocloruro de terbinafina;
terconazol; tioconazol; tolnaftato y undecilentato). Todavía en
otras realizaciones, la composición se incorpora en un liposoma o un
vehículo de liberación lenta.
Todavía en otro aspecto, la invención
proporciona los análogos reivindicados para una usar en un método
para tratar en un método de tratamiento de una infección, que
comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente
eficaz de una composición farmacéutica. La infección puede estar
causada, por ejemplo, por un microorganismo, tal como una bacteria
(por ejemplo, bacteria Gram negativa o Gram positiva u organismo
anaerobio; son ejemplos Acinetobacter spp., Enterobacter spp., E.
cofi, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. marcescens y
S. maltophilia, Bordetella pertussis; Brucella spp.; Campylobacter
spp.; Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori; Legionella spp.;
Moraxella catarrhalis; Neisseria spp.; Salmonella spp.; Shigella
spp. y Yersinia spp.; E. faecalis, S. aureus, E. faeciurn, S.
pyogenes, S. pneumoniae y estafilococos coagulasa negativos;
Bacillus spp.; Corynebacterium spp.; Difetroides; Listeria
spp. y Estreptococos Viridans; Clostridium spp., Bacteroides
spp. y Peptostreptococcus spp.; Borrelia spp.; Chlamydia
spp.; Mycobacterium spp.; Mycoplasma spp.; Propionibacterium acne,
Rickettsia spp.; Treponerna spp. y Ureaplasma spp.),
hongos (por ejemplo, levaduras y/o mohos), parásitos (por ejemplo,
protozoos, nematodos, cestodos y trematodos, tales como Babesia
spp.; Balantidium coli, Blastocystis hominis, Cryptosporidium
parvum, Encephohalitozoon spp.; Entamoeba spp.; Giardia lamblia;
Leishmania spp.; Plasmodium spp.; Toxopiasma gondii, Trichomonas
spp., Trypanosoma spp., Ascaris lumbricoides; Clonorchis sinensis,
Echinococcus spp.; Fasciola hepatica, Fasciolopsis buski;
Heterophyes heterophyes; Hymenolepis spp.; Schistosoma spp.; Taenia
spp. y Tilchinella spiralis) o virus (por ejemplo,
Alphavirus; Arenavirus; Bunyavirus; Coronavirus; Enterovirus;
Filovirus; Flavivirus; Hantavirus; HTLV-BLV;
Influenzavirus: Lentivirus; Lyssavirus; Paramyxovirus; Reovirus;
Rhinovirus y Rotavirus, Adenovirus; Cytomegalovirus; Hepadnavirus;
Molluscipoxvirus; Orthopoxvirus; Papillomavirus; Parvovirus;
Polyomavirus; Simplexvirus y Varicellovirus).
En otros aspectos, se proporciona una
composición que comprende un análogo de indolicidina y un
antibiótico tal como se reivindica. Además, se proporciona un
dispositivo, que puede ser un dispositivo médico, que se reviste
con el análogo de indolicidina y puede comprender además un agente
antibiótico.
En otros aspectos, se proporcionan anticuerpos
que reaccionan específicamente con cualquiera de los análogos aquí
reivindicados. El anticuerpo preferiblemente es un anticuerpo
monoclonal o anticuerpo de cadena simple.
En un aspecto preferido, la divulgación
proporciona una composición que comprende un compuesto reivindicado
modificado por formación de derivado en un grupo amino con un
conjugado que comprende polioxialquilenglicol activado y un ácido
graso. En realizaciones preferidas, el conjugado además comprende
sorbitán que une el polioxialquilenglicol y el ácido grado, y más
preferiblemente es polisorbato. En realizaciones preferidas, el
ácido graso tiene 12-18 átomos de carbono, y el
polioxialquilenglicol es polioxietilenglicol, tal como con una
longitud de cadena de 2 a 100. En realizaciones preferidas, el
polioxialquilenglicol se activa por irradiación con luz
ultravioleta.
La divulgación también proporciona un método
para preparar un compuesto reivindicado modificado con un conjugado
de un polioxialquilenglicol activado y un ácido graso, que
comprende: (a) congelar la mezcla del conjugado de un
polioxialquilenglicol activado y ácido graso con el compuesto; y (b)
liofilizar la mezcla congelada; en el que el compuesto tiene un
grupo amino libre. En realizaciones preferidas, el compuesto es un
péptido o antibiótico. En otras realizaciones preferidas, la mezcla
en la etapa (a) está en un tampón de acetato. En un aspecto
relacionado, el método comprende mezclar el conjugado de un
polioxialquilenglicol activado y ácido graso con el compuesto;
durante un tiempo suficiente para formar compuestos modificados, en
el que la mezcla está en un tampón de carbonato que tiene un pH
mayor que 8,5, y el compuesto tiene un grupo amino libre. El
compuesto modificado se puede aislar por HPLC de fase inversa y/o
precipitación en un disolvente orgánico.
La divulgación también proporciona una
composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto
reivindicado modificado y un tampón fisiológicamente aceptable, y
en ciertas realizaciones, comprende además un agente antibiótico,
agente antivírico, un agente antiparásito, y/o agente antifúngico.
La composición se puede usar para tratar una infección, tal como la
causada por un microorganismo (por ejemplo, bacterias, hongos,
parásitos y virus).
Estos y otros aspectos de la descripción serán
evidentes por referencia a la siguiente descripción detallada y
dibujos adjuntos. Además, a continuación se presentan diferentes
referencias que describen con más detalle ciertos procedimientos o
composiciones (por ejemplo, plásmidos, etc.).
La Figura 1 es un SDS-PAGE que
muestra el perfil de extracción de cuerpos de inclusión (ib) de
células enteras que contienen proteína de fusión
MBI-11. La banda de la proteína de fusión se indica
con la cabeza de flecha. Carril 1, patrones de proteína; carril 2,
lisato total de XL1 Blue sin plásmido; carril 3, lisato total de XL1
Blue (pR2h-11, pGP1-2), cultivado a
30ºC; carril 4, lisato total de XL1 Blue (pR2h-11,
pGP1-2), inducido a 42ºC; carril 5, fracción
insoluble de cuerpos de inclusión después de lavado con Triton X100;
carril 6, extracto orgánico de proteína de fusión
MBI-11; carril 7, material concentrado no soluble en
disolvente orgánico de extracción.
La figura 2 es un SDS-PAGE que
muestra el perfil de expresión de la proteína de fusión
MBI-11 usando plásmido pPDR2h-11.
Carril 1, patrones de proteína; carril 2, MBI-11
extraído en disolvente orgánico; carril 3, lisato total de XL1 Blue
(pPDR2h-11, pGP1-2), cultivado a
30ºC; carril 4, lisato total de XL1 Blue (pPDR2h-11,
pGP1-2), inducido a 42ºC.
La figura 3 presenta los resultados de ensayo de
tiempo de letalidad para MBI 11CN, MBI 11F4CN y MBI 11B7CN. Se
representa el número de unidades formadoras de colonia x 10^{-4}
frente al tiempo.
La Figura 4 es una gráfica que representa la
extensión de la solubilidad del péptido MBI 11CN en diferentes
tampones.
La Figura 5 es un perfil de HPLC de fase inversa
de MBI 11CN en la formulación C1 (panel de la gráfica izquierda) y
formulación D (panel de la gráfica derecha).
La figura 6 presenta el espectro de DC de MBI
11CN y MBI 11B7CN.
La Figura 7 presenta los resultados de
liberación de colorante de ANTS/DPX de liposomas de PC de huevo con
diferentes proporciones de lípido a proteína.
La Figura 8 presenta gráficas que muestran la
actividad de MBI 11B7CN frente al crecimiento de células en mitad de
la fase logarítmica en caldo de Terrific (TB) o caldo de
Luria-Bretani (LB).
La Figura 9 muestra los resultados del
tratamiento de bacterias con MBI 10CN, MBI 11CN, o un péptido
testigo sólo o combinado con valinomicina.
La figura 10 es una gráfica que muestra el
tratamiento de bacterias con MBI 11B7CN en presencia de NaCl o
Mg^{2+}.
La figura 11 es una gráfica que presenta la
cantidad in vitro de MBI 11CN en el plasma frente al tiempo.
Se muestran los datos para péptido en formulación C1 y formulación
D.
La figura 12 es una gráfica que presenta el
cambio en los niveles de MBI 11CN in vivo en la sangre en
diferentes tiempos después de inyección intravenosa.
La figura 13 es una gráfica que presenta el
cambio en los niveles de MBI 11CN in vivo en el plasma en
diferentes tiempos después de inyección intraperitoneal.
La Figura 14 es una gráfica que muestra el
número de animales que sobreviven a una infección por SASM después
de inyección intraperitoneal de MBI 10CN, ampicilina o vehículo.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
La Figura 15 es una gráfica que muestra el
número de animales que sobreviven a una infección por SASM después
de inyección intraperitoneal de MBI 11CN, ampicilina o vehículo.
La figura 16 es una gráfica que muestra los
resultados de ensayar in vivo MBI-11A1CN
frente a S. aureus (Smith). Se administra péptido formulado
en diferentes concentraciones por inyección ip una hora después de
infección con S. aureus (Smith) por inyección ip.
La figura 17 es una gráfica que muestra los
resultados de ensayar in vivo MBI-11E3CN
frente a S. aureus (Smith). Se administra péptido formulado
en diferentes concentraciones por inyección ip una hora después de
infección con S. aureus (Smith) por inyección ip.
La figura 18 es una gráfica que muestra los
resultados de ensayar in vivo: MBI-11F3CN
frente a S. aureus (Smith). Se administra péptido formulado
en diferentes concentraciones por inyección ip una hora después de
infección con S. aureus (Smith) por inyección ip.
La figura 19 es una gráfica que muestra los
resultados de ensayar in vivo MBI-11G2CN
frente a S. aureus (Smith). Se administra péptido formulado
en diferentes concentraciones por inyección ip una hora después de
infección con S. aureus (Smith) por inyección ip.
La figura 20 es una gráfica que muestra los
resultados de ensayar in vivo MBI-11CN frente
a S. aureus (Smith). Se administra péptido formulado en
diferentes concentraciones por inyección ip una hora después de
infección con S. aureus (Smith) por inyección ip.
La figura 21 es una gráfica que muestra los
resultados de ensayar in vivo MBI-11B1CN
frente a S. aureus (Smith). Se administra péptido formulado
en diferentes concentraciones por inyección ip una hora después de
infección con S. aureus (Smith) por inyección ip.
La figura 22 es una gráfica que muestra los
resultados de ensayar in vivo MBI-11B7CN
frente a S. aureus (Smith). Se administra péptido formulado
en diferentes concentraciones por inyección ip una hora después de
infección con S. aureus (Smith) por inyección ip.
La figura 23 es una gráfica que muestra los
resultados de ensayar in vivo MBI-11B8CN
frente a S. aureus (Smith). Se administra péptido formulado
en diferentes concentraciones por inyección ip una hora después de
infección con S. aureus (Smith) por inyección ip.
La figura 24 es una gráfica que muestra los
resultados de ensayar in vivo MBI-11G4CN
frente a S. aureus (Smith). Se administra péptido formulado
en diferentes concentraciones por inyección ip una hora después de
infección con S. aureus (Smith) por inyección ip.
Las Figuras 25A y B presentan una gráfica que
muestra el número de animales que sobreviven a una infección por
S. epidermidis después de inyección intravenosa de MBI 10CN,
gentamicina, o vehículo. Panel A, inyección i.v. 15 min después de
infección; panel B, inyección i.v. 60 min después de infección.
La figura 26 es una gráfica que muestra el
número de animales que sobreviven a una infección por SARM de
ratones después de inyección intravenosa de MBI 11CN, gentamicina o
vehículo.
La Figura 27 presenta señales de
RP-HPLC que analizan muestras de la formación de
APS-péptido después de tratamiento de polisorbato
activado con un agente de reducción. Los péptidos
APS-MBI-11CN se forman por
liofilización en ácido acético-NaOH 200 mM, pH 4,6,
MBI 11CN 1 mg/ml, y polisorbato 80 al 0,5% activado. La solución
madre de polisorbato al 2,0% activado se trata con (a) agente de no
reducción, (b) 2-mercaptoetanol 150 mM, o (c)
borohidruro sódico 150 mM durante 1 hora inmediatamente antes de
usar.
La figura 28 presenta señales de
RP-HPLC que controlan la formación de
APS-MBI 11CN frente al tiempo en solución acuosa. La
reacción se produce en tampón de carbonato sódico 200 mM pH 10, MBI
11CN 0,1 mg/ml, polisorbato 80 al 0,5% activado. Se separan partes
alícuotas del recipiente de reacción en los tiempos indicados y se
analizan inmediatamente por RP-HPLC.
Antes de exponer la invención, puede ser útil
para entenderla exponer definiciones de ciertos términos que se usan
aquí.
Las denominaciones de aminoácidos aquí se
exponen como el código patrón de una o tres letras. Una letra
mayúscula indica un aminoácido de forma L; una letra minúscula
indica un aminoácido de forma D.
Tal como se usa aquí, "indolicidina" se
refiere a un péptido catiónico antimicrobiano. Las indolicidinas se
pueden aislar de una variedad de organismos. Una indolicidina se
aísla de neutrófilos bovinos y es un péptido de 13 aminoácidos
amidado en el carboxi terminal en su forma natural (Selsted et
al., J. Biol. Chem. 267:4292, 1992). Se presenta una secuencia
de aminoácidos de indolicidina en SEQ ID NO: 1.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Tal como se usa aquí, un "análogo de
péptido", "análogo" o "variante" de indolicidina tiene
hasta 5 aminoácidos de longitud, tiene al menos un aminoácido
básico (por ejemplo, arginina y lisina) y tiene actividad
antimicrobiana. Salvo que se indique otra cosa, un aminoácido
concreto se refiere a la forma L. Entre los aminoácidos básicos se
incluyen arginina, lisina y derivados. Entre los restos hidrófobos
se incluyen triptófano, fenilalanina, isoleucina, leucina, valina, y
derivados.
También se divulgan derivados de aminoácidos que
se han alterado por metilación (por ejemplo,
\alpha-metilvalina), amidación, especialmente del
aminoácido C-terminal por una alquilamina (por
ejemplo, etilamina, etanolamina, y etilendiamina) y acilación del
grupo \varepsilon-amino de lisina. Entre otros
aminoácidos que se pueden incorporar en el análogo se incluyen
cualesquiera de los D-aminoácidos correspondientes a
los L-aminoácidos que se encuentran en los
compuestos de la invención. Un análogo de péptido puede tener
ninguno, o uno o más de estos derivados y
D-aminoácidos. Además, un péptido puede también ser
sintetizado como retro-, inverto- o
retro-inverto-péptido.
Como se ha indicado antes, la presente invención
proporciona los análogos de indolicidina reivindicados. Estos
análogos se pueden sintetizar por métodos químicos, especialmente
usando un sintetizador de péptidos automatizado, o se pueden
producir por métodos recombinantes. La elección de una secuencia de
aminoácidos es guiada por una fórmula general presentada aquí.
La presente invención proporciona los análogos
de indolicidina reivindicados. Se prefieren los análogos de 9 a 14
restos.
Como se ha descrito antes, la modificación de
cualquiera de los restos incluyendo el N- o
C-terminal, está dentro del alcance de la
descripción. Una modificación preferida del extremo
C-terminal es amidación. Otras modificaciones del
extremo C-terminal incluyen esterificación y
formación de lactona. Entre las modificaciones
N-terminales se incluyen acetilación, acilación,
alquilación, PEG-ilación, miristilación, y
similares. Adicionalmente, el péptido se puede modificar para
formar un APS-péptido como se ha descrito antes. Los
péptidos también se pueden marcar, tal como con un marcador
radiactivo, un marcador fluorescente, una marca para espectrometría
de masas, biotina y similares.
Los análogos de péptidos de acuerdo con la
invención se pueden sintetizar por métodos químicos patrón,
incluyendo síntesis por procedimiento automatizado. En general, los
análogos de péptidos se sintetizan basándose en la estrategia
patrón de protección con Fmoc en fase sólida, con HATU como agente
de acoplamiento. El péptido se escinde de la resina de la fase
sólida con ácido trifluoroacético que contiene depuradores
adecuados, que también desprotege los grupos funcionales de las
cadenas laterales. Después el péptido bruto se purifica usando
cromatografía en fase inversa preparativa. Se pueden usar otros
métodos de purificación, tales como cromatografía de partición,
filtración en gel, electroforesis en gel, o cromatografía de
intercambio iónico.
Se pueden usar otras técnicas de síntesis,
conocidas en la técnica, tales como estrategia de protección con
tBoc, o uso de diferentes reactivos de acoplamiento o similares,
para preparar péptidos equivalentes.
Los péptidos se pueden sintetizar como una
molécula lineal o como moléculas ramificadas. Los péptidos
ramificados típicamente contienen un núcleo peptídico que
proporciona una serie de puntos de unión para péptidos adicionales.
La lisina es la más comúnmente usada para el núcleo peptídico porque
tiene un grupo funcional carboxilo y dos grupos funcionales amina
(alfa y epsilon). También se pueden usar otros diaminoácidos.
Preferiblemente, se usan dos o tres niveles de lisinas
geométricamente ramificadas; estos núcleos forman una estructura de
núcleo tetrámero u octámero, respectivamente (Tam, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:5409, 1988). Esquemáticamente, se representan
ejemplos de estos núcleos como se muestra:
Los puntos de unión para los péptidos
típicamente están en su grupo funcional carboxilo a los grupos amina
alfa o epsilon de las lisinas. Para sintetizar estos péptidos
multímeros, se forma un derivado de la resina de la fase sólida con
la matriz del núcleo, y la posterior síntesis y escisión de la
resina siguen los procedimientos patrón. Después el péptido
multímero típicamente se purifica por diálisis frente a hidrocloruro
de guanidina 4 M y después agua, usando una membrana con un tamaño
de poro para retener sólo multímeros. Los péptidos multímeros se
pueden usar dentro del contexto de esta descripción como cualquiera
de los péptidos lineales y se prefieren para usar para generar
anticuerpos para los péptidos.
Los análogos de péptidos de acuerdo con la
invención se pueden sintetizar alternativamente por producción
recombinante (véase por ejemplo, patente de EE.UU. No. 5.593.866).
Son adecuados una variedad de sistemas hospedantes para producir
análogos de péptidos, incluyendo bacterias (por ejemplo, E.
coli), levaduras (por ejemplo, Saccharomyces
cerevisiae), insectos (por ejemplo, Sf9), y células de mamíferos
(por ejemplo, CHO, COS-7). Se han desarrollado
muchos vectores de expresión y están disponibles para cada uno de
estos hospedantes. En general, en esta invención se usan células
bacterianas y vectores que son funcionales en bacterias. Sin
embargo, a veces puede ser preferible tener vectores que son
funcionales en otros hospedantes. Aquí se discuten vectores y
procedimientos para clonación y expresión en E. coli, y por
ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, 1987) y en Ausubel et al. (Current Protocols
in Molecular Biology, Greene Publishing Co., 1995).
Se introduce una secuencia de DNA que codifica
uno o más análogos de indolicidina en un vector de expresión
adecuado para el hospedante. En realizaciones preferidas, el gen
análogo se clona en un vector para crear una proteína de fusión. La
pareja de fusión se elige para que contenga una región aniónica, de
forma que un hospedante bacteriano esté protegido del efecto tóxico
del péptido. La región protectora neutraliza eficazmente los
efectos antimicrobianos del péptido y también puede evitar la
degradación del péptido por las proteasas del hospedante. La pareja
de fusión (proteína vehículo) aquí descrita puede funcionar además
para transportar el péptido de fusión a cuerpos de inclusión, el
periplasma, la membrana exterior, o el entorno extracelular. Entre
las proteínas vehículo adecuadas en el contexto de esta descripción
se incluyen específicamente, pero no se limitan,
glutatión-S-transferasa (GST),
proteína A de Staphylococcus aureus, dos dominios de unión
de IgG sintéticos (ZZ) de la proteína A, proteína F de membrana
exterior, \beta-galactosidasa (IacZ), y
diferentes productos de bacteriófago \lambda y bacteriófago T7. A
partir de las enseñanzas que se proporciona aquí, es evidente que
se pueden usar otras proteínas como vehículos. Además, no es
necesario usar la proteína vehículo entera, siempre que la región
aniónica protectora esté presente. Para facilitar el aislamiento de
la secuencia de péptido, se usan aminoácidos susceptibles de
escisión química (por ejemplo, CNBr) o escisión enzimática (por
ejemplo, proteasa V8, tripsina) para unir el péptido y la pareja de
fusión. Para expresión en E. coli, la pareja de fusión
preferiblemente es una proteína intracelular normal que dirige la
expresión hacia la formación de cuerpo de inclusión. En dicho caso,
después de escisión para liberar el producto final, no es necesario
renaturalizar el péptido. En esta descripción el casete de DNA, que
comprende la pareja de fusión y el gen del péptido, se puede
insertar en un vector de expresión, que puede ser un plásmido, virus
u otro vehículo conocido en la técnica. Preferiblemente, el vector
de expresión es un plásmido que contiene un promotor inducible o
constitutivo para facilitar la transcripción eficaz de la secuencia
de DNA insertada en el hospedante. La transformación de la célula
hospedante con el DNA recombinante se puede llevar a cabo por
técnicas mediadas por Ca^{++}, por electroporación, u otros
métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Brevemente, un fragmento de DNA que codifica un
análogo de péptido se obtiene de un cDNA existente o clon genómico,
o se sintetiza. Un método conveniente es la amplificación del gen a
partir de un molde de hebra simple. El molde generalmente es el
producto de una síntesis de oligonucleótido automatizada. Los
cebadores de amplificación se obtienen de los extremos 5' y 3' del
molde y típicamente incorporan sitios de restricción elegidos
teniendo en cuenta el sitio de clonación del vector. Si es
necesario, los codones de iniciación y terminación de traducción se
pueden construir en las secuencias del cebador. En la secuencia que
codifica la proteína se puede optimizar el codón para expresión en
el hospedante particular. Así, por ejemplo, si la proteína de
fusión análoga se expresa en bacterias, los codones se optimizan
para el uso bacteriano. La optimización de codón se lleva a cabo
por síntesis automatizada del gen entero o región del gen, unión de
oligonucleótidos múltiples, mutagénesis de la secuencia nativa, u
otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Como mínimo, el vector de expresión debe
contener una secuencia de promotor. Sin embargo, también se pueden
incluir otras secuencias reguladoras. Entre dichas secuencias se
incluyen un activador, sitio de unión de ribosoma, secuencia de
señal de terminación de transcripción, secuencia de señal de
secreción, origen de replicación, marcador seleccionable, y
similares. Las secuencias reguladoras están asociadas en
funcionamiento entre sí para permitir la transcripción y posterior
traducción. En aspectos preferidos, los plásmidos usados aquí para
expresión incluyen un promotor diseñado para expresar proteínas en
bacterias. Los promotores adecuados, incluyendo tanto promotores
constitutivos como inducibles, están ampliamente disponibles y son
conocidos en la técnica. Entre los promotores usados normalmente
para expresar en bacterias se incluyen promotores de fagos T7, T3,
T5 y SP6, y los operones trp, lpp y lac. También se
pueden usar promotores híbridos (véase, patente de EE.UU. nº
4.551.433), tales
como tac y trc.
como tac y trc.
En realizaciones preferidas, el vector incluye
una secuencia terminadora de transcripción. Una "región
terminadora de transcripción" es una secuencia que proporciona
una señal que termina la transcripción por la polimerasa que
reconoce el promotor seleccionado. El terminador de transcripción se
puede obtener del gen de la pareja de fusión o de otro gen, siempre
que funcione en el hospedante.
En una realización preferida, el vector es capaz
de replicación en células bacterianas. Por lo tanto, el vector
puede contener un origen de replicación bacteriano. Entre los
orígenes de replicación bacterianos preferidos se incluyen
f1-ori y col E1 ori, especialmente el ori derivado
de plásmidos pUC. También se pueden usar vectores de bajo número de
copias (por ejemplo, pPD100), especialmente cuando el producto es
perjudicial para el hospedante.
Los plásmidos preferiblemente también incluyen
al menos un marcador seleccionable que funciona en el hospedante.
Un gen marcador seleccionable confiere un fenotipo al hospedante que
permite identificar y/o hacer crecer selectivamente las células
transformadas. Entre los genes de marcadores seleccionables
adecuados para hospedantes bacterianos se incluyen gen de
resistencia al cloranfenicol (Cm^{r}), gen de resistencia a la
ampicilina (Amp^{r}), gen de resistencia a la tetraciclina
(Tc^{r}), gen de resistencia a la kanamicina (Kan^{r}), y otros
conocidos en la técnica. Para funcionar en la selección, algunos
marcadores pueden necesitar una deficiencia complementaria en el
hospedante.
En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos
que codifica el análogo de péptido, también codifica una señal de
secreción, de forma que el péptido resultante se sintetiza como una
proteína precursora, que posteriormente es procesada y secretada.
La proteína secretada resultante se puede recuperar del espacio
periplásmico o del medio de fermentación. Las secuencias de señales
de secreción adecuadas para usar, están ampliamente disponibles y
son conocidas (von Hejine, J. Mol. Biol.
184:99-105, 1985).
El vector también puede contener un gen que
codifica una proteína represora, que es capaz de reprimir la
transcripción de un promotor que contiene un sitio de unión del
represor. La alteración de las condiciones fisiológicas de la
célula puede deprimir al promotor. Por ejemplo, se puede añadir una
molécula que se une competitivamente al represor, o se puede
alterar la temperatura del medio de crecimiento. Entre las proteínas
represoras se incluyen, pero no se limita, el represor lacl de
E. coli (responsable de inducción por IPTG), el represor
\lambdacl857 sensible a la temperatura, y similares.
Entre los ejemplos de plásmidos para expresar en
bacterias se incluyen los vectores de expresión pET: pET 3a, pET
11a, pET 12a-c, y pET 15b (véase patente de EE.UU.
4.952.496; disponible en Novagen, Madison, WI). Se pueden usar
vectores de bajo número de copias (por ejemplo, pPD100) para la
sobreproducción eficaz de péptidos perjudiciales para el hospedante
E. coli (Dersch et al., FEMS Micobiol. Lett. 123: 19,
1994).
Los hospedantes bacterianos para los vectores de
expresión T7 pueden contener copias cromosómicas de DNA que
codifica la RNA-polimerasa T7 unido de forma
factible a un promotor unducible (por ejemplo, promotor lacUV;
véase patente de EE.UU.. nº 4.952.496), tal como el encontrado en
cepas de E. coli HMS174(DE3)pLysS,
BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) y
BL21(DE3). La RNA-polimerasa T7 también puede
estar presente en plásmidos compatibles con el vector de expresión
T7. La polimerasa puede estar controlada por un promotor y represor
lambda (por ejemplo, pGP1-2; Tabor and Richardson,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1074, 1985).
El péptido análogo de proteína se aísla por
técnicas patrón, tales como cromatografía de afinidad, de exclusión
por tamaño, o de intercambio iónico, HPLC y similares. Un péptido
aislado debe mostrar preferiblemente una banda principal por teñido
con azul Coomassie del SDS-PAGE que es al menos 90%
del material.
Los análogos de indolicidina de acuerdo con la
invención, se pueden generar usando un procedimiento basado en
amplificación (por ejemplo, PCR) en el que los cebadores son
designados a secuencias objetivo en los extremos 5' y 3' de un
péptido relacionado codificado, por ejemplo indolicidina. Las
condiciones de amplificación se eligen para facilitar la mala
incorporación de nucleótidos por la polimerasa termoestable durante
la síntesis. Por lo tanto, se introducen mutaciones aleatorias en
la secuencia original, algunas de las cuales dan como resultado
alteración(es) de aminoácido(s). Los productos de
amplificación se pueden clonar en una proteína de revestimiento de
un vector fago, tal como un vector fagémido, empaquetar y amplificar
en un hospedante aceptable para producir una biblioteca de
muestra.
Después en estas bibliotecas se puede ensayar la
actividad antibiótica de los péptidos. Brevemente, bacterias
infectadas con la biblioteca se cultivan en placa, se hacen crecer,
y se recubren con agarosa que contiene una cepa bacteriana que los
fagos son incapaces de infectar. Se observan las zonas de inhibición
de crecimiento en el recubrimiento de agarosa en la zona del fago
que expresa un análogo con actividad antibacteriana. Estos fagos
inhibidores se aíslan y se determina la secuencia de péptido clonada
por análisis de secuencia de DNA. Después el péptido se puede
sintetizar independientemente y posteriormente investigar su
actividad antibiótica.
Los anticuerpos típicamente se generan para un
análogo de péptido específico usando péptidos antigénicos múltiples
(MAP) que contienen aproximadamente ocho copias del péptido unido a
un pequeño núcleo de peptidilo no inmunogénico para formar un
inmunogen. (Véase, en general, Harlow and Lane, véase antes). Los
MAP se inyectan vía subcutánea en conejos o en ratones u otros
roedores, donde pueden tener semividas suficientemente largas para
facilitar la producción de anticuerpos. Después de doce semanas se
toman muestras de sangre, se separa el suero y se ensaya en un
ensayo ELISA frente al péptido original, indicando un resultado
positivo la presencia de anticuerpos específicos para el péptido
objetivo. Después este suero se puede almacenar y usar en ensayos
ELISA para medir específicamente la cantidad de análogo específico.
Alternativamente, se pueden usar otros métodos patrón de producción
de anticuerpos, por ejemplo, generación de anticuerpos
monoclonales.
En el contexto de la presente divulgación, se
entiende que anticuerpos incluye anticuerpos monoclonales,
anticuerpos policlonales, anticuerpos
anti-idiotípicos, fragmentos de anticuerpo (por
ejemplo, Fab, y F(ab')_{2}, regiones variables F_{v}, o
regiones que determinan complementaridad). Los anticuerpos se
aceptan en general como específicos frente a análogos de
indolicidina de acuerdo con la invención, si se unen con una K_{d}
mayor o igual a 10^{-7} M, preferiblemente mayor o igual a
10^{-8} M. La afinidad de un anticuerpo monoclonal o pareja de
unión puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica
(véase Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:
660-672, 1949). Una vez que se han obtenido los
anticuerpos adecuados, se pueden aislar y purificar por técnicas
conocidas por los expertos en la técnica.
Los anticuerpos monoclonales también se pueden
generar fácilmente a partir de células de hibridoma usando técnicas
convencionales (véase patente de EE.UU. nº RE 32.011, 4.902.614,
4.543.439, y 4.411.993; véase también Antibodies: A Laboratroy
Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1988). Brevemente, en una realización, se inyecta péptido en
un sujeto animal tal como una rata o ratón, generalmente
administrado como una emulsión en un adyuvante tal como adyuvante
completo o incompleto de Freunds con el fin de aumentar la
respuesta inmunitaria. Generalmente el animal se vuelve a inyectar
al menos una vez antes de recoger el bazo y/o nodos linfáticos e
inmortalizar estas células. Se pueden usar diferentes técnicas de
inmortalización, tales como mediadas por virus
Epstein-Barr o fusión para producir un hibridoma. En
una realización preferida, la inmortalización se produce por fusión
con una línea celular de mieloma adecuada para crear un hibridoma
que segrega anticuerpo monoclonal. Entre las líneas de mieloma
adecuadas se incluyen, por ejemplo, NS-1 (ATCC nº
TIB 18) y P3X63 - Ag 8.653 (ATCC nº CRL 1580). Las parejas de fusión
preferidas no expresan genes de anticuerpos endógenos. Después de
aproximadamente siete días, se puede seleccionar en los hibridomas
la presencia de anticuerpos que son reactivos frente a una proteína
telomerasa. Se puede usar una gran variedad de ensayos (véase
Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.),
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
También se pueden usar otras técnicas para
construir anticuerpos monoclonales (véase Huse et al., Science
246: 1275-1281, 1989; Sastry et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-5732, 1989;
Alting-Mees et al., Strategies in
Molecular Biology 3: 1-9, 1990; que describe
técnicas recombinantes). Estas técnicas incluyen clonación de la
cadena pesada y ligera de cDNA de inmunoglobulina en vectores
adecuados tales como \lambdaInmunoZap(H) y
\lambdaInmunoZap(L). Estos productos recombinantes se
pueden seleccionar individualmente o se pueden coexpresar para
formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huse et al., véase
antes; Sastry et al., véase antes). Posteriormente las
placas positivas se pueden convertir en un plásmido no lítico que
permite un alto nivel de expresión de fragmentos de anticuerpo
monoclonal a partir de E. coli.
Igualmente, también se pueden construir
porciones o fragmentos Fab y Fv de anticuerpos usando digestión
enzimática convencional o técnicas de DNA recombinante para dar
regiones variables aisladas de un anticuerpo. En una realización,
los genes que codifican la región variable de un hibridoma que
produce un anticuerpo monoclonal interesante, se amplifican usando
cebadores nucleótidos para la región variable. Además, se pueden
usar técnicas para cambiar un anticuerpo "murino" por un
anticuerpo "humano", sin alterar la especificidad de unión del
anticuerpo.
Se evalúa en los análogos de indolicidina de
esta descripción solos o combinados con un agente antibiótico u
otro análogo, su potencial como agentes terapéuticos antibióticos
usando una serie de ensayos. Preferiblemente, todos los péptidos se
evalúan inicialmente in vitro, se seleccionan los candidatos
más prometedores para la posterior evaluación in vivo, y
usando los resultados de estos ensayos, se seleccionan los
candidatos para los estudios preclínicos. Entre los ensayos in
vitro se incluyen medición de la actividad antibiótica,
toxicidad, solubilidad, farmacología, estructura secundaria,
permeabilización de liposoma y similares. Entre los ensayos in
vivo se incluyen la evaluación de la eficacia en modelos
animales, antigenicidad, toxicidad, y similares. En general, se
llevan a cabo inicialmente los ensayos in vitro, seguidos de
los ensayos in vivo.
Se evalúa la actividad antibiótica de los
análogos de indolicidina por un ensayo tal como un ensayo de CIM
por dilución en agarosa o un ensayo de dilución en caldo o de tiempo
de letalidad. La actividad antibiótica se mide como la inhibición
del crecimiento o muerte de un microorganismo (por ejemplo,
bacterias, hongos). Brevemente, un análogo candidato en caldo de
Mueller Hinton complementado con calcio y magnesio se mezcla con
agarosa fundida. Se pueden usar otras formulaciones de caldos y agar
con la condición de que el análogo de péptido se pueda difundir
libremente por el medio. La agarosa se vierte en placas petri o
pocillos, se deja solidificar, y se aplica una cepa de ensayo a la
placa de agarosa. La cepa de ensayo se elige, en parte, por la
aplicación pretendida del análogo. Por lo tanto, a modo de ejemplo,
si se desea un análogo con actividad frente a S. aureus, se
usa una cepa de S. aureus. Puede ser conveniente ensayar el
análogo en varias cepas y/o en aislados clínicos de las especies de
ensayo. Las placas se incuban toda la noche, y al día siguiente se
inspecciona visualmente el crecimiento bacteriano. La concentración
inhibidora mínima (CIM) de un análogo es la concentración más baja
de péptido que inhibe completamente el crecimiento del organismo.
Los análogos que presentan una buena actividad frente a la cepa de
ensayo, o grupo de cepas, que típicamente tienen una CIM menor o
igual que 16 \mug/ml se seleccionan para posterior ensayo.
En los análogos seleccionados se puede ensayar
además su toxicidad para células normales de mamífero. Un ensayo de
ejemplo es un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos (GR)
(eritrocitos). Brevemente, se aíslan glóbulos rojos de sangre
entera, típicamente por centrifugación, y se lavan de los
componentes del plasma. Se incuba una suspensión al 1% (vol/vol) de
eritrocitos en solución salina isotónica con diferentes
concentraciones de análogo de péptido. En general, el análogo
estará en un tampón de formulación adecuado. Después de incubar
durante aproximadamente 1 hora a 37ºC, las células se centrifugan, y
se determina la absorbancia del líquido sobrenadante a 540 nm. Se
determina una medida relativa de lisis por comparación de la
absorbancia después de la lisis completa de eritrocitos usando
NH_{4}Cl o equivalente (que establece un valor de 100%). Un
análogo que no es lítico o sólo es moderadamente lítico, como se
ejemplifica en el Ejemplo 8, es conveniente y es adecuado para la
posterior selección. Se pueden usar otros ensayos de toxicidad in
vitro, por ejemplo medición de la toxicidad frente a células de
mamífero cultivadas, para ensayar la toxicidad in vitro.
La solubilidad del análogo de péptido en tampón
de formulación es un parámetro adicional que se puede examinar. Se
pueden usar varios ensayos diferentes, tal como el aspecto en el
tampón. Brevemente, el análogo de péptido se suspende en solución,
tal como caldo o tampón de formulación. Se evalúa el aspecto de
acuerdo con una escala que varía desde (a) transparente, no
precipita, (b) claro, precipitado difuso, a (c) turbio, precipitado
pesado. Se pueden usar graduaciones más finas. En general, es
conveniente menos precipitado. Sin embargo, puede ser aceptable algo
de precipitado.
Se pueden llevar a cabo ensayos in vitro
adicionales para evaluar el potencial del análogo como un agente
terapéutico. Dichos ensayos incluyen solubilidad del péptido en
formulaciones, farmacología en la sangre o plasma, unión a
proteínas del suero, análisis de estructura secundaria, por ejemplo,
dicroísmo circular, permeabilización de liposoma, y
permeabilización de la membrana interior bacteriana. En general, es
conveniente que los análogos sean solubles y se comporten mejor que
la indolicidina.
\vskip1.000000\baselineskip
En los análogos seleccionados basándose en los
resultados de los ensayos in vitro, se puede ensayar in
vivo la eficacia, toxicidad y similares.
La actividad antibiótica de análogos
seleccionados se puede evaluar in vivo por su capacidad para
mejorar infecciones microbianas usando modelos animales. En estos
ensayos, un análogo es útil como un agente terapéutico si la
inhibición del crecimiento de microorganismos comparada con la
inhibición con vehículo solo es estadísticamente significativa.
Esta medición se puede hacer directamente a partir de cultivos
aislados de fluidos o sitios corporales, o indirectamente,
evaluando las tasas de supervivencia de animales infectados. Para
evaluar la actividad antibacteriana hay disponibles varios modelos
animales, tales como modelos de infección aguda incluyendo aquellos
en los que (a) ratones normales reciben una dosis letal de
microorganismos, (b) ratones neutropénicos reciben una dosis letal
de microorganismos o (c) conejos reciben un inóculo en el corazón, y
modelos de infección crónica. El modelo seleccionado dependerá en
parte de la indicación clínica pretendida del análogo.
A modo de ejemplo, en uno de dichos modelos de
ratón normal, los ratones se inoculan vía ip o iv con una dosis
letal de bacterias. Típicamente, la dosis es tal que
90-100% de los animales mueren en 2 días. La
elección de la cepa de microorganismo para este ensayo depende, en
parte, de la aplicación pretendida del análogo, y en los ejemplos
que acompañan los ensayos se llevan a cabo en tres cepas diferentes
de Staphylococcus. Brevemente, poco antes o después de la
inoculación (generalmente en 60 minutos), se inyecta análogo en un
tampón de formulación adecuado. Se pueden administrar inyecciones
múltiples del análogo. Los animales se observan durante hasta 8
días después de infección y se registra la supervivencia de los
animales. El tratamiento satisfactorio rescata a los animales de la
muerte o retrasa la muerta a un nivel estadísticamente
significativo, comparado con animales testigo sin tratamiento. Se
prefieren los análogos que muestran mejor eficacia que la propia
indolicidina.
La toxicidad in vivo de un análogo se
mide por administración de un intervalo de dosis a animales,
típicamente ratones, por una vía definida en parte por el uso
clínico pretendido. Se registra la supervivencia de los animales, y
se puede calcular la DL_{50}, DL_{90-100}, y
dosis máxima tolerada (DMT) para permitir la comparación de los
análogos. Se prefieren los análogos menos tóxicos que la
indolicidina.
Se pueden llevar a cabo ensayos in vivo
adicionales para ayudar a la selección de análogos para el
desarrollo clínico. Por ejemplo, se puede evaluar la
inmunogenicidad de los análogos, típicamente por inyección del
análogo en tampón de formulación en animales normales, generalmente
ratones, ratas o conejos. Se obtiene suero en diferentes tiempos
después de inyección, y se ensaya la presencia de anticuerpos que se
unen al análogo. También se pueden llevar a cabo ensayos después de
inyecciones múltiples, protocolos de tratamiento mimético. Los
anticuerpos para los análogos se pueden identificar por ELISA,
ensayos de inmunoprecipitación, transferencias Western, y otros
métodos. (Véase, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1988). Se prefieren los análogos que no provocan o
provocan la producción mínima de anticuerpos. Adicionalmente, se
pueden determinar las farmacocinéticas de los análogos en animales y
la histopatología de animales tratados con los análogos.
\newpage
La selección de los análogos de indolicidina
como potenciales agentes terapéuticos se basa en resultados de
ensayos in vitro e in vivo. En general, los análogos
de péptidos que presentan baja toxicidad con altos niveles de dosis
y alta eficacia con bajos niveles de dosis son candidatos
preferidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar análogos combinados con un
antibiótico u otro análogo, la combinación se puede someter a las
series de ensayos anteriores. Los antibióticos incluyen cualquier
producto químico que tienda a prevenir, inhibir o destruir vida y
como tales, los antibióticos incluyen agentes antibacterianos,
antifungicidas, agentes antivíricos, y agentes antiparásitos.
Simplemente a modo de ejemplo, se discuten los antibióticos
antibacterianos. Los métodos para mezclar y administrar los
componentes varían dependiendo del uso clínico pretendido de la
combinación.
Brevemente, un ensayo de la actividad
antibacteriana in vitro, el ensayo de dilución en agarosa, se
inicia con una matriz de placas que contiene cada una, una
combinación de análogo de péptido y antibiótico en diferentes
concentraciones. Las placas se inoculan con aislados bacterianos, se
incuban, y se registran las CIM de los componentes. Después, estos
resultados se usan para calcular la CIF. Entre los antibióticos
usados en el ensayo se incluyen, pero no se limitan, penicilinas,
cefalosporinas, carbacefems, cefamicinas, carbapenems, monobctamas,
aminoglicósidos, glicopéptidos, quinolonas, tetraciclinas,
macrólidos, y fluoroquinolonas (véase la siguiente Tabla 1).
Entre los ejemplos de antibióticos se incluyen,
pero no se limitan, Penicilina G (Registro CAS Nº:
61-33-6); Meticilina (Registro CAS
Nº: 61-32-5); Nafcilina (Registro
CAS Nº: 147-52-4); Oxacilina
(Registro CAS Nº: 66-79-5);
Cloxacilina (Registro CAS Nº:
61-72-3); Dicloxacilina (Registro
CAS Nº: 3116-76-5); Ampicilina
(Registro CAS Nº: 69-53-4);
Amoxicilina (Registro CAS Nº:
26787-78-0); Ticarcilina (Registro
CAS Nº: 34787-01-4); Carbenicilina
(Registro CAS Nº: 4697-36-3);
Mezlocilina (Registro CAS Nº:
51481-65-3); Azlocilina (Registro
CAS Nº: 37091-66-0); Piperacilina
(Registro CAS Nº: 61477-96-1);
Imipenem (Registro CAS Nº:
74431-23-5); Aztreonam (Registro CAS
Nº: 78110-38-0); Cefalotina
(Registro CAS Nº: 153-61-7);
Cefazolina (Registro CAS Nº:
25953-19-9); Cefaclor (Registro CAS
Nº: 70356-03-5);
Cefamandol-formiato sódico (Registro CAS Nº:
42540-40-9); Cefoxitina (Registro
CAS Nº: 35607-66-0); Cefuroxima
(Registro CAS Nº: 55268-75-2);
Cefonicid (Registro CAS Nº:
61270-58-4); Cefmetazol (Registro
CAS Nº: 56796-20-4); Cefotetan
(Registro CAS Nº: 69712-56-7);
Cefprozil (Registro CAS Nº:
92665-29-7); Loracarbef (Registro
CAS Nº: 121961-22-6); Cefetamet
(Registro CAS Nº: 65052-63-3);
Cefoperazona (Registro CAS Nº:
62893-19-0); Cefotaxima (Registro
CAS Nº: 63527-52-6); Ceftizoxima
(Registro CAS Nº: 68401-81-0);
Ceftriaxona (Registro CAS Nº:
73384-59-5); Ceftazidima (Registro
CAS Nº: 72558-82-8); Cefepima
(Registro CAS Nº: 88040-23-7);
Cefixima (Registro CAS Nº:
79350-37-1); Cefpodoxima (Registro
CAS Nº: 80210-62-4); Cefsulodina
(Registro CAS Nº: 62587-73-9);
Fleroxacino (Registro CAS Nº:
79660-72-3); Ácido nalidíxico
(Registro CAS Nº: 389-08-2);
Norfloxacino (Registro CAS Nº:
70458-96-7); Ciprofloxacino
(Registro CAS Nº: 85721-33-1);
Ofloxacino (Registro CAS Nº:
82419-36-1); Enoxacino (Registro CAS
Nº: 74011-58-8); Lomefloxacino
(Registro CAS Nº: 98079-51-7);
Cinoxacino (Registro CAS Nº:
28657-80-9); Doxiciclina (Registro
CAS Nº: 564-25-0); Minociclina
(Registro CAS Nº: 10118-90-8);
Tetraciclina (Registro CAS Nº:
60-54-8); Amikacina (Registro CAS
Nº: 37517-28-5); Gentamicina
(Registro CAS Nº: 1403-66-3);
Kanamicina (Registro CAS Nº:
8063-07-8); Netilmicina (Registro
CAS Nº: 56391-56-1); Tobramicina
(Registro CAS Nº: 32986-56-4);
Estreptomicina (Registro CAS Nº:
57-92-1); Azitromicina (Registro
CAS Nº: 83905-01-5); Claritromicina
(Registro CAS Nº: 81103-11-9);
Eritromicina (Registro CAS Nº:
114-07-8); estolato de Eritromicina
(Registro CAS Nº: 3521-62-8);
succinato de Eritromicina y etilo (Registro CAS Nº:
41342-53-4); glucoheptonato de
Eritromicina (Registro CAS Nº:
23067-13-2); lactobionato de
Eritromicina (Registro CAS Nº:
3847-29-8); estearato de
Eritromicina (Registro CAS Nº:
643-22-1); Vancomicina (Registro CAS
Nº: 1404-90-6); Teicoplanina
(Registro CAS Nº: 61036-64-4);
Cloranfenicol (Registro CAS Nº:
56-75-7); Clindamicina (Registro
CAS Nº: 18323-44-9); Trimetoprim
(Registro CAS Nº: 738-70-5);
Sulfametoxazol (Registro CAS Nº:
723-46-6); Nitrofurantoína
(Registro CAS Nº: 67-20-9);
Rifampina (Registro CAS Nº:
13292-46-1); Mupirocina (Registro
CAS Nº: 12650-69-0); Metronidazol
(Registro CAS Nº: 443-48-1);
Cefalexina (Registro CAS Nº:
15686-71-2); Roxitromicina
(Registro CAS Nº: 80214-83-1);
Co-amoxiclavulanato; combinaciones de Piperacilina y
Tazobactam; y sus diferentes sales, ácidos, bases y otros
derivados.
El sinergismo se calcula de acuerdo con la
siguiente fórmula. Una CIF de \leq 0,5 es evidencia de sinergismo,
aunque pueden ser terapéuticamente útiles combinaciones con valores
mayores.
Por ejemplo, se pueden usar antibióticos de los
grupos de penicilinas, cefalosporinas, carbacefems, cefamicinas,
carbapenems, monobctams, aminoglicósidos, glicopéptidos, quinolonas,
tetraciclinas, macrólidos, floroquinolonas y otros antibióticos
variados, combinados con cualquiera de los péptidos aquí
descritos.
Como se indica aquí, la presente invención
proporciona métodos y composiciones para modificar un compuesto con
un grupo amino libre, tales como péptidos, proteínas, ciertos
antibióticos y similares, con un éster de polisorbato activado y
derivados. Cuando los compuestos son péptidos o proteínas, las
formas modificadas o derivadas se denominan "péptidos modificados
con APS" o "proteínas modificadas con APS". Simularmente,
las formas modificadas de antibióticos se denominan aquí
"antibióticos modificados con APS". Los compuestos modificados
con APS (por ejemplo, APS-péptidos catiónicos)
tienen propiedades farmacológicas mejoradas.
Además de los péptidos y proteínas, también son
adecuados para su modificación los antibióticos, antifúngicos,
fármacos antirítmicos, y cualquier otro compuesto con un amina
primaria o de otro tipo libre. Por ejemplo, las cefalosporinas,
aminopenicilinas, etambutol, pirazinamida, sulfonaminas, quinolonas
(por ejemplo ciprofloxacino, clinafloxacino), aminoglucósidos y
especinomicinas, incluyendo, pero no limitados a, estreptomicina,
neomicina, kanamicina y gentamicina tienen aminas libres para su
modificación. Los antifúngicos tales como amfotericina B,
nistatina, 5-fluorocitosina y similares tienen
aminas disponibles para su derivatización. Los antivíricos tales
como aminas tricíclicas (por ejemplo amantadina) y los agentes
antiparasíticos (por ejemplo dapsone) pueden ser todos
derivatizados. Sólo con propósito ilustrativo, la presente discusión
va dirigida a péptidos y proteínas modificados.
Tal como se discute aquí, un reactivo adecuado
para formar compuestos modificados con APS de acuerdo con la
invención (por ejemplo, péptidos y proteínas) comprende una región
hidrófoba y una región hidrófila, y opcionalmente un ligador. La
región hidrófoba es un compuesto lipófilo con un grupo funcional
adecuado para conjugar con la región hidrófila o el ligador. La
región hidrófila es un polialquilenglicol. Tal como se usa aquí,
"polialquilenglicol" se refiere a polímeros de glicoles de 2 ó
3 átomos de carbono. Los polialquilenos de dos átomos de carbono
incluyen polietilenglicol (PEG) de diferentes pesos moleculares, y
sus derivados, tales como polisorbatos. Los polialquilenos de tres
átomos de carbono incluyen polipropilenglicol y sus derivados.
La región hidrófoba generalmente es un ácido
graso, pero puede ser un alcohol graso, tiol graso, y similares,
que también son compuestos lipófilos. El ácido graso puede ser
saturado o insaturado. La longitud de la cadena no parece ser
importante, aunque típicamente se usan ácidos grasos disponibles en
el comercio y tienen longitudes de cadena de
C_{12-18}. Sin embargo, la longitud puede estar
limitada por la solubilidad o solidificación del compuesto, es
decir mayores longitudes de ácidos grasos son sólidos a temperatura
ambiente. Los ácidos grasos de 12 átomos de carbono (laurilo), 14
átomos de carbono, 16 átomos de carbono (palmitato) y 18 átomos de
carbono (monoestearato u oleato) son longitudes de cadena
preferidas.
La región hidrófila es un polialquilenglicol,
polietilen- o
poliporopilen-glicol-monoéter. La
función éter se forma por la unión entre la cadena de
polioxietileno, que preferiblemente tiene una longitud de cadena de
2 a 100 unidades monómeras, y el grupo sorbitán. El
polimetilenglicol no es adecuado para administrar a animales debido
a la formación de formaldehídos, y los glicoles con una longitud de
cadena de \geq 4 pueden ser insolubles. También son adecuadas las
cadenas de polioxietileno-polioxipropileno
mixtas.
No es necesario un ligador para unir las
regiones hidrófila e hidrófoba, pero si se usa, debe ser un
nucleófilo bifuncional capaz de reaccionar tanto con el
polialquilenglicol como con la región hidrófoba. El ligador
proporciona electrones para una reacción nucleófila con el
polialquilenglicol, típicamente formado por reacción con óxido de
etilo u óxido de propileno. Entre los ligadores adecuados se
incluyen sorbitán, alcoholes de azúcares, etanolamina, etanotiol,
2-mercaptoetanol, 1,6-diaminohexano,
un aminoácido (por ejemplo, glutamina, lisina), otros azúcares
reducidos, y similares. Por ejemplo, el sorbitán forma una unión
éster con el ácido graso en un polisorbato.
Entre los compuestos adecuados se incluyen
polioxietilensorbitanes, tales como ésteres de monolaurato,
monooleato, monopalmitato, monoestearato, trioleato, y
triestearato. Estos y otros compuestos adecuados se pueden
sintetizar por métodos químicos patrón o se pueden obtener en el
comercio (por ejemplo, Sigma Chemical Co., MO; Aldrich Chemical Co.,
WI; J.B. Baker, NJ).
\vskip1.000000\baselineskip
El reactivo, generalmente un polisorbato, se
activa por exposición a la luz UV con intercambio libre de aire. La
activación se logra usando una lámpara que irradia a 254 nm o 302
nm. Preferiblemente, la salida se centra en 254 nm. Longitudes de
onda mayores pueden requerir tiempo de activación mayor. Aunque
existe alguna evidencia de que la luz ambiente fluorescente puede
activar los polisorbatos, los experimentos han mostrado que el uso
de luz UV a 254 nm da activación máxima antes de que la luz ambiente
dé un nivel detectable de activación.
El aire juega un papel importante en la
activación de los polisorbatos. El acceso al aire duplica la
velocidad de activación relativa a las activaciones realizadas en
recipientes herméticamente cerrados. Todavía no se sabe que gas es
el responsable; es probable que sea un derivado de oxígeno, aunque
no hay peróxidos implicados. Se sabe que la exposición a la luz UV
de los compuestos con uniones éter genera peróxidos, que se pueden
detectar y cuantificar usando tiras de ensayo de peróxido. En una
reacción, se añadió peróxido de hidrógeno en un nivel de 1 a 10
veces mayor que el encontrado en material activado por luz UV, a una
solución de polisorbato en ausencia de luz. No se obtuvo
activación.
El reactivo se pone en un recipiente adecuado
para irradiar. Una consideración para el recipiente es la capacidad
de lograr irradiación uniforme. Por lo tanto, si el camino de onda
es largo, el reactivo se puede mezclar o agitar. La activación
requiere aire; los peróxidos no están implicados en la activación.
El reactivo se puede activar en cualquier solución acuosa y no es
necesario tamponar.
Una activación ilustrativa se produce en una
cubeta con 1 cm de espesor de líquido. El reactivo se irradia a una
distancia menor de 9 cm a 1500 \muW/cm^{2} (salida inicial de la
fuente) durante aproximadamente 24 horas. En estas condiciones, el
reactivo activado convierte un mínimo de 85% del péptido en
APS-péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos o proteínas se hacen reaccionar con
el reactivo APS en una fase líquida o sólida y son modificados por
la unión del derivado de APS. Los métodos aquí descritos para la
unión ofrecen la ventaja de mantener la carga del péptido o
proteína. Cuando la carga del péptido es crítica para su función,
tal como la actividad antibiótica de péptidos catiónicos aquí
descritos, estos métodos de unión ofrecen ventajas adicionales. Los
métodos que unen grupos por acilación dan como resultado la perdida
de carga positiva por conversión de los grupos amino en amido.
Además, se sabe introducir ligador no voluminoso o potencialmente
antigénico, tal como un grupo triazina, por los métodos aquí
descritos.
Como se ha indicado antes, la formación de
APS-péptido se produce en fase sólida o en solución
acuosa. Brevemente, en el método en fase sólida, el péptido se
suspende en un tampón adecuado, tal como un tampón acetato. También
se pueden usar otros tampones adecuados que ayudan a la formación de
APS-péptido. El tampón de acetato puede ser de
sodio, rubidio, litio y similares. También son adecuadas otras
soluciones de acetato, tales como HAc o HAc-NaOH.
Un intervalo de pH preferido para el tampón es de 2 a 8,3, aunque se
puede usar un intervalo más amplio. Cuando el pH inicial del tampón
ácido acético-NaOH se varía, la posterior
liofilización en tampón de ácido acético 200 mM da sólo péptido
modificado de Tipo I (véase Ejemplo 14). La presencia de un
componente de tampón alcalino da como resultado la formación de
péptidos modificados de Tipo II. Una concentración de péptido
típica es 1 mg/ml, que da como resultado 85-95% de
péptido modificado, sin embargo son adecuadas otras
concentraciones. La principal consideración para determinar la
concentración parece ser económica. El polímero activado (APS) se
añade con exceso molar al péptido, de forma que se genera un péptido
modificado con APS con una relación molar 1:1. Generalmente, una
relación inicial de aproximadamente 2,5:1 (APS:péptido) a 5:1
(APS:péptido) da un péptido modificado con APS 1:1.
Después la mezcla de reacción se congela (por
ejemplo a -80ºC) y se liofiliza. El acetato sódico se desproporciona
en ácido acético y NaOH durante la liofilización; la separación del
ácido acético volátil a vacío deja el NaOH disperso por toda la
matriz sólida resultante. Esta pérdida de ácido acético se confirma
por un aumento del pH detectado al disolver el liofilizado. No se
forma péptido modificado con APS en tampón de acetato si las
muestras sólo se congelan y después descongelan.
La reacción de modificación también puede tener
lugar en solución acuosa. Sin embargo, las modificaciones con APS
no se producen a temperatura ambiente en ningún sistema de tampón de
acetato ensayado a pesar del pH. Las modificaciones con APS tampoco
se forman en tampones de fosfato tan altos como pH 11,5. La
modificación con APS se produce en un tampón de carbonato sódico a
un pH mayor que aproximadamente 8,5. También se pueden usar otros
tampones si soportan la formación de derivados. Un intervalo de pH
de 9-11 también es adecuado, y se usa más
normalmente pH 10. La reacción se produce en dos fases: primero se
forma los péptidos de Tipo I, seguido de formación de péptidos de
Tipo II.
En la presente invención, la unión se produce en
un grupo amino. Para un péptido, la unión se puede producir en el
\alpha-NH_{2} del aminoácido
N-terminal o en el grupo
\varepsilon-NH_{2} de la lisina. También se
pueden modificar otras aminas primarias y secundarias. El bloqueo
completo de todos los grupos amino por acilación (MBI
11CN-Y1) inhibe la formación de
APS-péptido. Por lo tanto, no se produce
modificación de los restos de arginina o triptófano. Si el único
grupo amino disponible es el grupo \alpha-amino
(por ejemplo, MBI 11B9CN y MBI 11G14CN), se observa la forma de
Tipo I. La inclusión de una sola lisina (por ejemplo, MBI 11B1CN,
MBI 11B7CN, MBI 11B8CN), que proporciona un grupo
\varepsilon-amino, da como resultado las formas
de tipo II también. La cantidad de Tipo II formado aumenta para
péptidos con más restos lisina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos modificados con APS se pueden
purificar. En casos en los que el péptido libre es tóxico, la
purificación puede ser necesaria para separar péptido no modificado
y/o polisorbato sin reaccionar. Se puede usar cualquiera de una
variedad de métodos de purificación. Dichos métodos incluyen HPLC de
fase inversa, precipitación con disolvente orgánico para separar el
polisorbato, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía
de intercambio iónico, filtración y similares. Se prefiere el
RP-HPLC. Los procedimientos para estos métodos de
separación son conocidos.
La formación del APS-péptido (o
proteína) da como resultado la generación de productos que contienen
péptido que son más hidrófobos que el péptido relacionado. Esta
propiedad se puede explotar para realizar la separación del
conjugado del péptido libre por RP-HPLC. Los
conjugados se resuelven en dos poblaciones basadas en su
hidrofobicidad determinada por RP-HPLC; la población
de Tipo I eluye ligeramente antes que la población de Tipo II.
Las series MBI 11 de péptidos tienen pesos
moleculares entre 1600 y 2500. Cuando se hacen correr en una columna
de Superose 12, una columna de exclusión por tamaños, estos
péptidos no eluyen antes que el volumen del lecho, indicando una
masa molecular por debajo de 20 kDa. En contraste, los péptidos
modificados con APS eluyen a 50 kDa, demostrando así un gran aumento
de la masa molecular aparente.
Un aumento de la masa molecular aparente puede
potenciar las farmacocinéticas de los péptidos catiónicos porque la
mayor masa molecular reduce la velocidad a la que los péptidos y
proteínas se eliminan de la sangre. La formación de micela puede
ofrecer beneficios adicionales suministrando "paquetes" de
moléculas de péptido a los microorganismos más que basándose en la
unión múltiple de moléculas de péptido sencillas. Además, los
péptidos modificados con APS son solubles en cloruro de metileno o
cloroformo, mientras que el péptido relacionado es esencialmente
insoluble. Este aumento de solubilidad orgánica puede potenciar
significativamente la capacidad para penetrar las barreras
tisulares.
Además, por estudios de dicroísmo circular (DC),
se observa que los péptidos modificados con APS tienen una
conformación 3-dimensional alterada. Como se muestra
en los ejemplos, MBI 11CN y MBI 11B7CN tienen estructuras
desordenadas en tampón fosfato o trifluoroetanol (TFE) acuoso al 40%
y forman una conformación de lámina \beta sólo por inserción en
liposomas. En contraste, los espectros de DC de MBI 11CN modificado
con APS y MBI 11B7CN modificado con APS indican estructura de lámina
\beta en tampón fosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha indicado antes, la presente invención
proporciona análogos para uso en métodos para tratar y prevenir
infecciones administrando a un paciente una cantidad
terapéuticamente eficaz de un análogo de péptido de indolicidina
tal como se ha descrito aquí. Los pacientes adecuados para dicho
tratamiento se pueden identificar por características bien
establecidas de una infección, tales como fiebre, pus, cultivo de
organismos, y similares. Las infecciones que se pueden tratar con
análogos de péptido incluyen las producidas o debidas a
microorganismos. Entre los ejemplos de microorganismos se incluyen
bacterias (por ejemplo, Gram positivas, Gram negativas), hongos (por
ejemplo, levaduras y mohos), parásitos (por ejemplo, protozoos,
nematodos, cestodos y trematodos), virus, y priones. Los organismos
específicos en estas clases son bien conocidos (véase por ejemplo,
Davis et al., Microbiology, 3^{rd} edition, Harper &
Row, 1980). Entre las infecciones se incluyen, pero no se limita,
síndrome de choque tóxico, difteria, cólera, tifus, meningitis, tos
ferina, botulismo, tétano, infecciones piogénicas, disentería,
gastroenteritis, ántrax, enfermedad de Lyme, sífilis, rubéola,
septicemia y plaga.
El tratamiento eficaz de la infección se puede
examinar de varias formas diferentes. El paciente puede presentar
menos fiebre, menor número de organismos, menor nivel de moléculas
inflamatorias (por ejemplo, IFN-\gamma,
IL-12, IL-1, TNF), y similares.
Los análogos de péptidos de la presente
invención, preferiblemente se administran como una composición
farmacéutica. Brevemente, las composiciones farmacéuticas de la
presente invención pueden comprender uno o más de los análogos de
péptido aquí reivindicados, en combinación con uno o más vehículos,
diluyentes o excipientes fisiológicamente aceptables. Como se
indica aquí el tampón de formulación usado puede afectar a la
eficacia o actividad del análogo de péptido. Un tampón de
formulación adecuado contiene tampón y solubilizador. El tampón de
formulación puede comprender tampones tales como acetato sódico,
citrato sódico, solución salina tamponada neutra, solución salina
tamponada con fosfato, y similares, o sales tales como NaCl. Se
prefiere el acetato sódico. En general, se usa un tampón de acetato
de 5 a 500 mM, y preferiblemente de 100 a 200 mM. El pH de la
formulación final puede estar en el intervalo de 3 a 10, y
preferiblemente es aproximadamente neutro (aproximadamente pH
7-8). También se pueden añadir solubilizadores
tales como polioxietilensorbitanes (por ejemplo, Tween 80, Tween 20)
y polioxietilen-éteres (por ejemplo, Brij 56) si el compuesto
todavía no se ha modificado con APS.
Aunque el tampón de formulación se ilustra aquí
con análogos de péptidos de la presente invención, este tampón es
generalmente útil y deseable para administrar otros péptidos. Los
péptidos que pueden ser administrados con este tampón de
formulación incluyen indolicidina, otros análogos de indolicidina
(véase PCT WO 95/22338), bacteriocinas, gramicidina, bactenecina,
drosocina, polifemusinas, defensinas, cecropinas, melitinas,
híbridos cecropin/melitina, magaininas, sapecinas, apidaecinas,
protegrinas, taquiplesinas, tioninas, IL-1 hasta 15,
hormona de liberación de corticotropina, hormona del crecimiento
humana, insulina, eritropoyetina, trombopoyetina, péptidos de
proteína básica de mielina, diversos factores de estimulación de
colonias tales como M-CSF, GM-CSF,
kit ligando, y péptidos y análogos de estas y similares
proteínas.
Se pueden incluir compuestos adicionales en las
composiciones. Estos incluyen, por ejemplo, carbohidratos tales
como glucosa, manosa, sacarosa o dextrosa, manitol, otras proteínas,
polipéptidos o aminoácidos, agentes de quelación tales como EDTA o
glutatión, adyuvantes y conservantes. Como se indica aquí, las
composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden
contener uno o más ingredientes activos adicionales, tales como un
antibiótico (véase aquí la discusión de sinergismo) o citoquina.
Las composiciones se pueden administrar en un
vehículo de suministro. Por ejemplo, la composición se puede
encapsular en un liposoma (véase, por ejemplo, los documentos WO
96/10585; WO 95/35094), formar complejo con lípidos, encapsular en
vehículos de liberación lenta o de liberación sostenida, tales como
poligalactida, y similares. En otras realizaciones, las
composiciones se pueden preparar como un liofilizado, usando
excipientes adecuados para proporcionar estabilidad.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se pueden administrar en diferentes formas. Por ejemplo,
se pueden administrar análogos de péptido por inyección intravenosa,
inyección o implante intraperitoneal, inyección o implante
subcutáneo, inyección intradérmica, lavado, inhalación, implante,
inyección o implante intramuscular, inyección intratecal, lavado de
vejiga, supositorios, pesarios, aplicación tópica (por ejemplo,
cremas, pomadas, parches dérmicos, gotas oculares, gotas para el
oído, champús), vía entérica, oral o nasal. El análogo se puede
aplicar localmente como una inyección, gotas, pulverizador,
comprimidos, crema, pomada, gel y similares. El análogo se puede
administrar como un bolo o como dosis múltiples en un periodo de
tiempo.
El nivel de péptido en el suero y otros tejidos
después de administración se puede controlar por diferentes técnicas
bien establecidas tales como ensayos bacterianos, cromatográficos o
basados en anticuerpos, tales como ELISA.
Las composiciones farmacéuticas aquí descritas
se administran de una forma adecuada para la infección o enfermedad
que se va a tratar. La cantidad y frecuencia de administración se
determinará por factores tales como el estado del paciente, la
causa de la infección, y la gravedad de la infección. Las
dosificaciones adecuadas se pueden determinar por ensayos clínicos,
pero generalmente estarán en el intervalo de aproximadamente 0,1 a
50 mg/kg.
Además, los análogos de la presente invención se
pueden usar de la forma de los desinfectantes comunes o en
cualquier situación en la que los microorganismos son indeseables.
Por ejemplo, estos péptidos se pueden usar como desinfectantes de
superficie, revestimientos, incluyendo unión covalente, para
dispositivos médicos, revestimientos para ropa, tal como para
inhibir el crecimiento de bacterias o repeler mosquitos, en filtros
para purificar aire, tal como en un avión, en purificación de agua,
constituyentes de champús y jabones, conservantes alimentarios,
conservantes cosméticos, conservantes de medios, herbicidas o
insecticidas, constituyentes de materiales de construcción, tales
como selladores de silicona, y en el procesamiento de productos
animales, tales como curado de pieles de animales. Tal como se usa
aquí, "dispositivo médico" se refiere a cualquier dispositivo
para usar en un paciente, tal como un implante o prótesis. Entre
dichos dispositivos se incluyen stents, tubos, sondas, cánulas,
catéteres, injertos vasculares sintéticos, dispositivos
controladores de la sangre, válvulas del corazón artificiales,
agujas, y
similares.
similares.
Para estos propósitos, típicamente se incluyen
los péptidos solos o junto con un antibiótico en composiciones
normalmente usadas o en un aplicador adecuado, tal como para aplicar
a ropa. Se pueden incorporar o impregnar en el material durante la
fabricación, tal como para un filtro de aire, o aplicado de otro
modo a dispositivos. Los péptidos y antibióticos sólo es necesario
suspenderlos en una solución adecuada para el dispositivo o
artículo. Los polímeros son un tipo de vehículo que se puede
usar.
\newpage
Los análogos, especialmente análogos marcados,
se pueden usar en análisis de imagen y ensayos de diagnóstico o
para marcar sitios en organismos unicelulares y multicelulares
eucariotas y en procariotas. Como sistema de marcaje, los análogos
se puede acoplar con otros péptidos, proteínas, ácidos nucleicos,
antibióticos y similares.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración, y no a modo de limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de péptidos se basa en la estrategia
patrón de protección con Fmoc en fase sólida. El instrumento usado
es un 9050 Plus PepSynthesiser (PerSeptive BioSystems Inc.). Se usan
resinas de injerto de polietilenglicol-poliestireno
(PEG-PS) como fase sólida, y se forman derivados con
un ligador aminoácido protegido con Fmoc para la síntesis de amida
C-terminal. Se usa HATU (hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio)
como agente de acoplamiento. Durante la síntesis, las etapas de
acoplamiento se controlan continuamente para asegurar que cada
aminoácido se incorpora con un alto rendimiento. El péptido se
escinde de la resina de la fase sólida usando ácido
trifluoroacético y depuradores adecuados, y el péptido bruto se
purifica usando cromatografía preparativa de fase inversa.
Todos los péptidos se analizan por
espectrometría de masas para asegurar que el producto tiene la masa
molecular esperada. El producto debe tener un solo pico que da
cuenta de >95% del área de pico total cuando se somete a
cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa
(RP-HPLC). Además, el péptido debe mostrar una sola
banda que da cuenta de >90% de la intensidad de banda total
cuando se somete a electroforesis de gel de
ácido-urea.
ácido-urea.
El contenido en péptido, la cantidad de producto
que es péptido más que agua retenida, sal o disolvente, se mide por
análisis cuantitativo de aminoácidos, formación de derivado de amina
libre o cuantificación espectrofotométrica. El análisis de
aminoácidos también proporciona información de la relación de
aminoácidos presentes en el péptido, que ayuda a confirmar la
autenticidad del péptido.
Los análogos de péptidos y sus nombres están
listados en la Tabla 2. En esta tabla, y en el resto, los
aminoácidos se indican con el código de aminoácidos de una letra, y
las letras minúsculas representan la forma D del aminoácido.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los análogos de indolicidina son modificados
para alterar las propiedades físicas del péptido original. Dichas
modificaciones incluyen: acetilación en el extremo
N-terminal, extremo N-terminal
formando derivado con Fmoc, polimetilación, peracetilación, y
derivados ramificados.
Acetilación
\alpha-N-terminal. Antes de
escindir el péptido de la resina y desprotegerlo, el péptido
completamente protegido se trata con
N-acetilimidazol en DMF durante 1 hora a temperatura
ambiente, que da como resultado la reacción selectiva en el extremo
\alpha-N-terminal. Después el
péptido se desprotege/escinde y purifica como para un péptido sin
modificar.
Extremo
\alpha-N-terminal formando
derivado con Fmoc. Si la etapa final de desprotección de Fmoc no
se lleva a cabo, el grupo
\alpha-N-terminal-Fmoc
permanece en el péptido. Después se desprotege la cadena
lateral/escinde el péptido y se purifica como para un péptido sin
modificar.
Polimetilación. El péptido purificado en
una solución de metanol se trata con exceso de bicarbonato sódico,
seguido de exceso de yoduro de metilo. La mezcla de reacción se
agita toda la noche a temperatura ambiente, se extrae con
disolvente orgánico, se neutraliza y purifica como para un péptido
sin modificar. Usando este procedimiento, un péptido no se metila
completamente; la metilación de MBI 11CN dio una media de 6 grupos
metilo. Por lo tanto, el péptido modificado es una mezcla de
productos metilados.
Peracetilación. Un péptido purificado en
solución de DMF se trata con N-acetilimidazol
durante 1 hora a temperatura ambiente. El producto bruto se
concentra, se disuelve en agua, se liofiliza, se vuelve a disolver
en agua y se purifica como para un péptido sin modificar. Se observa
la acetilación completa de los grupos amina primarios.
Derivados de cuatro/ocho ramificaciones.
Los péptidos ramificados se sintetizan en un núcleo de cuatro u
ocho ramificaciones unido a la resina. La síntesis y
desrpotección/escisión proceden como para el péptido sin modificar.
Estos péptidos se purifican por diálisis frente a hidrocloruro de
guanidina 4 M y después agua, y se analizan por espectrometría de
masas.
Los péptidos modificados usando los
procedimientos anteriores están listados en la Tabla 3.
Los análogos de péptidos se preparan
alternativamente por técnica de DNA recombinante en células
hospedantes bacterianas. El péptido se prepara como una proteína de
fusión, elegida para ayudar al transporte del péptido de fusión a
cuerpos de inclusión, periplasma, membrana exterior o entorno
extracelular.
Se usa la amplificación por la reacción en
cadena de la polimerasa para sintetizar DNA de doble hebra que
codifica los genes del péptido MBI a partir de moldes de hebra
simple. Para MBI-11, se preparan 100 \mul de
mezcla de reacción que contiene de 50 a 100 ng de molde, 25 pm de
cada cebador, MgCl_{2} 1,5 mM, 200 \muM de cada dNTP, 2U de
Taq-polimerasa en el tampón del suministrador. Las
reacciones proceden con 25 ciclos de 94ºC durante 30 s, 55ºC
durante 30 s, 74ºC durante 30 s, seguido de 74ºC durante 1 min. El
producto amplificado se hace digerir con BamHI y
HindIII y se clona en un vector de expresión plásmido que
codifica la pareja de fusión y un marcador de selección
adecuado.
El plásmido pR2h-11 se
co-electropora con pGP1-2 en la cepa
XL1-Blue de E. coli, usando un promotor T7,
origen de replicación de alto número de copias, marcador Ap^{r} y
conteniendo el gen de la proteína de fusión. El plásmido
pGP1-2 contiene un gen de la
RNA-polimerasa T7 controlado por un promotor lambda
y gen represor cl857. La expresión de la proteína de fusión es
inducida por un desplazamiento de la temperatura de 30ºC a 42ºC.
Los cuerpos de inclusión se lavan con solución que contiene
solubilizador y se extraen con disolvente orgánico de extracción.
Se analizan los perfiles de las muestras por
SDS-PAGE. La Figura 1 muestra el análisis por
SDS-PAGE y un perfil de extracción del cuerpo de
inclusión de la célula entera. El contaminante principal en el
disolvente orgánico extraído es \beta-lactamasa
(Figura 1). El nivel de expresión en estas células se presenta en la
Tabla 4.
Además, se usa un vector de bajo número de
copias, pPD100, que contiene un gen de resistencia al cloranfenicol,
para expresar MBI-11 con el fin de eliminar la
necesidad de usar ampicilina, reduciendo así la aparición de
\beta-lactamasa en el material extraído. El
plásmido permite la expresión del gen selectiva y alto nivel de
sobreproducción de proteína en E. coli usando el bacteriófago
con el sistema RNA-polimerasa T7/promotor T7
(Dersch et al., FEMS Microbiol. Lett. 123:
19-26, 1994). pPD100 contiene un gen de resistencia
al cloranfenicol (CAT) como un marcador selectivo, un sitio de
clonación múltiple, y una secuencia ori obtenida del vector
pSC101 de bajo número de copias. Sólo hay aproximadamente de 4 a 6
copias de estos plásmidos por célula hospedante. La construcción
resultante que contiene MBI-11 se llama
pDR2h-11. La figura 2 presenta un análisis por
electroforesis en gel de la proteína de fusión
MBI-11 expresada en este vector. El nivel de
expresión de la proteína de fusión MBI-11 es
comparable al obtenido del plásmido pR2h-11. El
producto del gen CAT no aparece, probablemente debido a la
naturaleza de bajo número de copias de este plásmido, la proteína
CAT no se expresa con altos niveles en pDR2h-11.
El ensayo de dilución en agarosa mide la
actividad antimicrobiana de péptidos y análogos de péptidos, que se
expresa como la concentración inhibidora mínima (CIM) de los
péptidos.
Con el fin de mimetizar las condiciones in
vivo, se usa caldo Mueller Hinton complementado con calcio y
magnesio combinado con una agarosa con bajo EEO como medio de
crecimiento bacteriano. El agar más comúnmente usado se sustituye
por agarosa ya que los grupos cargados en el agar evitan la difusión
del péptido por el medio. El medio se trata en autoclave y después
se enfría a 50-55ºC en un baño de agua antes de la
adición aséptica de soluciones antimicrobianas. Se añade el mismo
volumen de diferentes concentraciones de solución de péptido a la
agarosa fundida enfriada que después se vierte a una profundidad de
3-4 mm.
El inóculo bacteriano se ajusta a un patrón de
turbidez McFarland 0,5 (PML Microbiological) y después se diluye
1:10 antes de aplicarlo sobre la placa de agarosa. El inóculo final
aplicado a la agarosa es aproximadamente 10^{4} UFC en una mancha
de 5-8 mm de diámetro. Las placas de agarosa se
incuban a 35-37ºC durante de 16 a 20 horas.
Se registra la CIM como la concentración más
baja de péptido que inhibe completamente el crecimiento del
organismo, determinado por inspección visual. Se muestran las CIM
representativas para diferentes análogos de indolicidina en la
siguiente Tabla 5.
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Este ensayo también usa caldo Mueller Hinton
complementado con calcio y magnesio como medio de crecimiento.
Típicamente se dispensan 100 \mul de caldo en cada pocillo de una
placa de microvaloración de 96 pocillos, y se hacen diluciones
seriadas dobles de volúmenes de 100 \mul del análogo de péptido a
lo largo de la placa. Una fila de pocillos no recibe péptido y se
usa como testigo de crecimiento. Cada pocillo se inocula con
aproximadamente 5 x 10^{5} UFC de bacterias y la placa se incuba
a 35-37ºC durante 16-20 horas. Se
registra otra vez la CIM como la menor concentración de péptido que
inhibe completamente el crecimiento del organismo determinado por
inspección visual.
Por ejemplo, se establecieron los valores de CIM
para una serie de análogos de péptidos frente a cepas de S.
aureus. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 6.
Las curvas de tiempo letal se usan para
determinar la actividad antimicrobiana de péptidos catiónicos en un
intervalo de tiempo. Brevemente, en este ensayo, se prepara una
suspensión de microorganismos equivalente a un patrón McFarland 0,5
en solución salina al 0,9%. Después esta suspensión se diluye de
forma que cuando se añade a un volumen total de 9 ml de caldo
Mueller Hinton ajustado con catión, el tamaño de inóculo es 1 x
10^{6} UFC/ml. Se separa una parte alícuota de 0,1 ml de cada tubo
a intervalos predeterminados hasta 24 horas, se diluyen en solución
salina al 0,9% y se cultivan en placa por triplicado para determinar
el recuento de colonia viable. Se representa el número de bacterias
que quedan en cada muestra frente al tiempo para determinar la tasa
de péptido catiónico letal. Generalmente, una reducción de tres o
más log_{10} en recuentos bacterianos en la suspensión
antimicrobiana comparado con los testigos de crecimiento indica una
respuesta bactericida adecuada.
Como se muestra en la Figura 3, todos los
péptidos demostraron una reducción de tres o más log_{10} en los
recuentos bacterianos en la suspensión antimicrobiana comparado con
los testigos de crecimiento, indicando que esto péptidos cumplen los
criterios para una respuesta bactericida.
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El tratamiento con una combinación de análogos
de péptidos y antibióticos convencionales puede tener un efecto
sinergético. El sinergismo se ensaya usando la técnica de dilución
en agarosa, en la que una matriz de placas, cada una conteniendo
una combinación de péptido y antibiótico en una mezcla de
concentración única, se inocula con los aislados bacterianos. Se
investiga el sinergismo de los análogos de péptidos combinados con
una serie de antibióticos convencionales incluyendo, pero sin
limitar, penicilinas, cefalosporinas, carbapenems, monobactams,
aminoglicósidos, macrólidos, fluoroquinolonas.
El sinergismo se expresa como una concentración
inhibidora fraccionaria (CIF), que se calcula de acuerdo con la
siguiente ecuación. Una CIF menor o igual que 0,5 es evidencia de
sinergismo, aunque combinaciones con valores más altos pueden ser
terapéuticamente útiles.
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La Tabla 7 muestra datos de sinergismo ejemplo
de combinaciones de análogos de indolicidina y mupirocina.
Los valores de CIM de mupirocina frente a cepas
de E. coli, S. aureus, P. aeruginosa se reducen al menos tres
veces combinados con análogos de indolicidina en concentraciones que
son \leq 1/2 del valor de la CIM del péptido solo.
La Tabla 9 muestra datos de ejemplo de
sinergismo para combinaciones de análogos de indolicidina y
Ciprofloxacino.
Los valores de CIM de Ciprofloxacino frente a
cepas de S. aureus y P. aeruginosa se reducen al menos
dos veces combinado con análogos de indolicidina con concentraciones
que son \leq 1/2 de valor de la CIM del péptido solo.
El factor principal que afecta a la solubilidad
de un péptido es su secuencia de aminoácidos. Los péptidos
policatiónicos preferiblemente son libremente solubles en soluciones
acuosas, especialmente en condiciones de pH bajo. Sin embargo, en
ciertas formulaciones, los péptidos policatiónicos pueden formar un
agregado que se separa en una etapa de filtración. Cuando las
soluciones de péptido para ensayos in vivo se filtran antes
de administrar, se examinan la precisión y reproducibilidad de los
niveles de dosificación después de filtrar.
Los péptidos disueltos en formulaciones se
filtran por una membrana de filtro 0,2 \mum hidrófila, y después
se analiza el contenido total de péptido usando HPLC de fase
inversa. Se prepara un patrón 100% soluble para cada concentración
disolviendo el péptido en agua MilliQ. Se mide el área total de pico
para cada condición y se compara con el área de pico del patrón con
el fin de proporcionar un valor de recuperación relativo para cada
combinación de concentración/formulación.
Se preparó MBI 11CN en cuatro sistemas de tampón
diferentes (A, B, C y C1) (Tabla 10, a continuación) con
concentraciones de péptido de 50, 100, 200 y 400 \mug/ml. Con las
formulaciones A o B, ambas usadas normalmente para solvatar
péptidos y proteínas, se perdió péptido por filtración de una forma
dependiente de la concentración (Figura 4). La recuperación sólo
alcanzó un máximo de 70% con una concentración de 400 \mug/ml. En
contraste, los péptidos disueltos en las formulaciones C y C1 se
recuperaron completamente. Los tampones que contienen iones
polianiónicos parece que fomentan la agregación, y es probable que
el agregado tome la forma de una matriz que es atrapada por el
filtro. Los contraiones monoaniónicos son más adecuados para
mantener los péptidos de una forma soluble, no agregada, mientras
que la adición de otros agentes de solubilización puede mejorar más
la formulación.
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La solubilidad de los análogos de péptidos se
evalúa en caldo de Mueller Hinton complementado con calcio y
magnesio, por inspección visual. El procedimiento empleado es el
usado para el ensayo de dilución en caldo, excepto que no se añaden
bacterias a los pocillos. El aspecto de la solución de cada pocillo
se evalúa de acuerdo con la escala: (a) transparente, no precipita,
(b) claro, precipitado difuso y (c) turbio, precipitado pesado. Los
resultados muestran que, por ejemplo, MBI 10CN es menos soluble que
MBI 11CN en estas condiciones y que los análogos de MBI 11CN son
menos solubles que los análogos de MBI 11ACN.
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Se usa el HPLC de fase inversa, que proporciona
un método analítico para la cuantificación de péptido, para
examinar los péptidos en dos formulaciones diferentes. Se analiza
una solución de 400 \mug/ml de MBI 11CN preparada en
formulaciones C1 y D, usando un gradiente por pasos para resolver el
péptido libre de las otras especies. Se usan las siguientes
condiciones cromatográficas patrón:
- Disolvente A: ácido trifluoroacético (TFA) al
0,1% en agua
- Disolvente B: TFA al 0,1%/acetonitrilo al 95%
en agua
- Medio: POROS® R2-20
(poliestireno-divinilbenceno)
Como se muestra en la Figura 5, MBI 11CN se
podía separar de dos formas, como péptido libre en formulación C1,
y como complejo de péptido-formulación
principalmente en formulación D. Este complejo sobrevive el
protocolo de separación en gradientes que contienen acetonitrilo,
que se podría esperar que rompieran la estabilidad del complejo.
También se observa un pico correspondiente a una pequeña cantidad
(<10%) de péptido libre en formulación D. Si se cambia la forma
del gradiente de elución, el péptido asociado eluye como un pico
bajo ancho, que indica que los complejos de péptido en la
formulación son heterogéneos.
El dicroísmo circular (DC) es una técnica
espectroscópica que mide las estructuras secundarias de péptidos y
proteínas en solución, véase por ejemplo, R.W. Woody, (Methods in
Enzymology, 246: 34, 1995). El espectro de DC de péptidos con
hélice \alpha se puede interpretar más fácilmente debido a los
mínimos dobles característicos a 208 y 222 nm. Sin embargo, para
péptidos con otra estructura secundaria, la interpretación del
espectro de DC es más complicado y menos fiable. Los datos de DC
para péptidos se usan para relacionar estructura en solución con
actividad in vitro.
Las mediciones de DC de análogos de indolicidina
se llevan a cabo en tres medios acuosos diferentes, (1) tampón de
fosfato sódico 10 mM, pH 7,2, (2) tampón de fosfato y
trifluoroetanol (TFE) al 40% (vol/vol), y (3) tampón de fosfato y
vesículas grandes (liposomas) de fosfolípidos unilamelares (100 nm
de diámetro) (Tabla 11). El disolvente orgánico TFE y los liposomas
proporcionan un entorno hidrófobo que se pretende que mimetice la
membrana bacteriana donde se supone que los péptidos adoptan una
conformación activa.
Los resultados indican que los péptidos están
principalmente desordenados en tampón de fosfato (un mínimo
negativo alrededor de 200 nm) con la excepción de MBI 11F4CN, que
presenta un mínimo adicional a 220 nm (véase a continuación). La
presencia de TFE induce estructura de lámina \beta en MBI 11 y MBI
11G4CN, y aumenta la forma de hélice \alpha en MBI 11F4CN, aunque
la mayoría de los péptidos permanecen desordenados. En presencia de
liposomas, los péptidos MBI 11CN y MBI 11B7CN, que están
desordenados en TFE, presentan estructura en lámina \beta (un
mínimo negativo alrededor de 230 nm) (Figura 6). Por lo tanto,
parece que los liposomas inducen estructura secundaria más ordenada
que el TFE.
Un giro \beta es la estructura secundaria
predominante que aparece en un entorno hidrófobo, sugiriendo que es
la conformación principal en la forma activa asociada a membrana. En
contraste, MBI 11F4CN presenta mayor conformación de hélice
\alpha en presencia de TFE. El péptido MBI 11F4CN también es el
más insoluble y hemolítico de los péptidos ensayados, sugiriendo
que la estructura secundaria de hélice \alpha puede introducir
propiedades no deseadas en estos análogos.
Adicionalmente se registran espectros de DC para
péptidos modificados con APS (Tabla 11). Los resultados muestran que
estos compuestos tienen estructura secundaria de lámina \beta
significativa en tampón de fosfato, que es alterada sólo ligeramente
en TFE.
Otra vez, los resultados de DC sugieren que una
estructura de lámina \beta (es decir, asociada a membrana) es la
conformación activa preferida entre los análogos de indolicidina
ensayados.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se describe un método para medir la capacidad de
los péptidos para permeabilizar bicapas de fosfolípidos (Parente
et al., Biochemistry, 29, 8720, 1990). Brevemente, se
preparan liposomas de una composición de fosfolípidos definida en
presencia de una molécula colorante fluorescente. En este ejemplo,
se usa una pareja de colorante que consta de la molécula
fluorescente ácido
8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfónico
(ANTS) y su molécula de extinción bromuro de
p-xileno-bis-pirdinio
(DPX). La mezcla de moléculas colorantes libres, liposomas sin
colorante, y liposomas que contienen ANTS-DPX
encapsulado se separa por cromatografía de exclusión por tamaños. En
este ensayo, el péptido de ensayo se incuba con liposomas que
contienen ANTS-DPX y se mide la fluorescencia debida
a liberación de ANTS al exterior del liposoma frente al tiempo.
Usando este ensayo, se muestra que la actividad
del péptido, medida por la liberación de colorante, es
extremadamente sensible a la composición de los liposomas en muchas
proporciones de liposoma a péptido (L/P) (Figura 7).
Específicamente, la adición de colesterol a los liposomas compuestos
de fosfatidilcolina (PC) de huevo suprime prácticamente la
actividad de permeabilización de la membrana de MBI 11CN, incluso en
proporciones molares de lípido a péptido muy altas (comparado con
liposomas de PC de huevo que no contienen colesterol). Esta
selectividad in vitro puede mimetizar la observada in
vitro para células bacterianas en presencia de células de
mamíferos.
Además, hay una limitación de tamaño a la
interrupción de membrana inducida por MBI 11CN. ANTS/DPX se puede
sustituir por dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína
(FD-4), peso molecular 4.400, en los liposomas de
PC de huevo. No se detecta aumento en la fluorescencia de
FD-4 por incubación con MBI 11CN. Estos resultados
indican que la interrupción de membrana mediada por MBI 11CN permite
la liberación de las moléculas de ANTS/DPX relativamente más
pequeñas (\sim400 Da), pero no de las moléculas
FD-4 más voluminosas.
Un método alternativo para medir la interacción
péptido-membrana usa la cepa ML-35
de E. coli (Lehrer et al., J. Clin. Invest., 84:553,
1989), que contiene una copia cromosómica del gen lacZ que
codifica la \beta-galactosidasa y es deficiente
en permeasa. Esta cepa se usa para medir el efecto del péptido en
la membrana interior por liberación de
\beta-galactosidasa en el periplasma. La
liberación de \beta-galactosidasa se mide por
control espectrofotométrico de la hidrólisis de su sustrato
o-nitrofenol-\beta-D-galactopiranósido
(ONPG). Se determina la velocidad máxima de hidrólisis (V_{max})
para partes alícuotas de células cogidas en diferentes puntos de
crecimiento.
Un experimento preliminar para determinar la
concentración de péptido necesaria para la actividad máxima frente
a células en mitad de la fase logarítmica, diluido a 4 x 10^{7}
UFC/ml, da un valor de 50 \mug/ml, que se usa en todos los
experimentos posteriores. Las células se hacen crecer en dos medios
de crecimiento diferentes, caldo de Terrific (TB) y caldo Luria
(LB) y se ensayan cantidades equivalentes de células durante sus
ciclos de crecimiento. El perfil de actividad resultante de MBI
11B7CN se muestra en la figura 8. Para las células que se han hecho
crecer en el medio TB enriquecido, se produce actividad máxima al
principio de la mitad de la fase logarítmica (140 min), mientras
que para las células que se han hecho crecer en medio LB, el máximo
se produce al final de la mitad de la fase logarítmica (230 min).
Adicionalmente, sólo en LB, se observa una bajada de actividad a
140 min. Esta disminución de actividad puede estar relacionada con
una transición en el metabolismo, tal como un requisito para usar
una nueva fuente de energía debido a la reducción de la fuente
original, que no se produce en el medio TB más enriquecido. Como
consecuencia de un cambio de metabolismo se producirían cambios en
el potencial de membrana.
Para ensayar si el potencial de membrana tiene
un efecto en la actividad del péptido, se examina el efecto de
interrumpir el gradiente electroquímico usando el ionóforo de
potasio valinomicina. Las células previamente incubadas con
valinomicina se tratan con péptido, y para MBI 10CN y MBI 11CN la
hidrólisis de ONPG disminuye aproximadamente 50% comparado con
valinomicina no incubada previamente (Figura 9). Se usa otro péptido
catiónico que no es sensible a la valinomicina como testigo
positivo.
Se ensaya una delineación adicional de los
factores que influyen en la actividad permeabilizante de la
membrana. En un ensayo de ejemplo, MBI 11B7CN se incuba previamente
con tampón de HEPES/sacarosa isotónico que contiene cloruro sódico
150 mM (NaCl) o iones magnesio 5 mM (Mg^{2+}) y se ensaya como se
ha descrito antes. En la figura 10, se observa una inhibición
significativa con cualquiera de las soluciones, sugiriendo la
implicación de interacciones electrostáticas en la acción
permeabilizante de péptidos.
Se usa un ensayo de lisis de glóbulos rojos (GR)
para agrupar péptidos de acuerdo con su capacidad para la lisis de
GR en condiciones patrón comparado con MBI 11CN y
gramicidina-S. Las muestras de péptido y GR de
oveja lavados se preparan en solución salina isotónica con el pH
final ajustado entre 6 y 7. Las muestras de péptidos y suspensión
de GR se mezclan entre sí para dar soluciones que tienen 1%
(vol/vol) de GR y 5,50 ó 500 \mug/ml de péptido. Las mezclas de
ensayo se incuban durante 1 hora a 37ºC con agitación constante, se
centrifugan, y se mide la absorbancia a 540 nm del líquido
sobrenadante, que detecta la hemoglobina liberada. El porcentaje de
hemoglobina liberada se determina por comparación con una serie de
lisatos patrón conocidos, en agua. Cada serie de ensayos también
incluye MBI 11CN (500 \mug/ml) y gramicidina-S (5
\mug/ml) como testigos de "lisis baja" y "lisis alta",
respectivamente.
Se ensayan
MBI-11B7CN-HCl,
MBI-11F3CN-HCl y
MBI-11F4CN-HCl usando este
procedimiento y los resultados se presentan en la siguiente Tabla
13.
Los péptidos que con 5 \mug/ml producen la
lisis de GR en una extensión igual o mayor que la
gramicidina-S, el testigo de "lisis alta", se
consideran que son altamente líticos. Los péptidos que con 500
\mug/ml producen la lisis de los GR en una extensión igual o
menor que MBI 11CN, el testigo de "lisis baja", se considera
que no son líticos. Los tres análogos ensayados son todos
"moderadamente líticos" puesto que producen más lisis que MBI
11CN y menos que la gramicidina-S. Además uno de los
análogos, MBI 11F3CN-HCl, es significativamente
menos lítico que las otras dos variantes en las tres concentraciones
ensayadas.
Se preparan péptidos antigénicos múltiples
(MAP), que contienen cuatro u ocho copias del péptido objetivo
unido a un pequeño núcleo de peptidilo no inmunogénico, como
inmunogenes. Alternativamente, el péptido objetivo se conjuga con
albúmina de suero bovino (BSA) u ovoalbúmina. Por ejemplo, se usan
MBI 11CN y sus fragmentos N-terminal y
C-terminal de siete aminoácidos como secuencias de
péptido objetivo. Los inmunogenes se inyectan vía subcutánea en
conejos usando protocolos patrón (véase, Harlow and Lane,
Antibodies: A Laboratroy Manual, Harlow and Lane (eds.),
Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1988). Después de repetir
las inyecciones (normalmente mensualmente), se ensaya el suero de
una muestra de sangre en un ensayo ELISA frente al péptido
objetivo. Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos y
posteriores ensayos determinan la especificidad de la unión del
anticuerpo al péptido objetivo. Después se pueden aislar los
anticuerpos purificados de este suero y se pueden usar en ensayos
ELISA para identificar selectivamente y medir la cantidad de péptido
objetivo en muestras de investigación y clínicas.
Se determina el tiempo de vida in vitro
de análogos de péptido libres en el plasma y en la sangre midiendo
la cantidad de péptido presente después de una serie de tiempos de
incubación. Se recoge sangre de ovejas, se trata con anticoagulante
(no heparina) y para preparar el plasma, se centrifuga para separar
las células. Se añade péptido formulado a la fracción de plasma o
sangre entera y se incuba. Después de incubar, el péptido se
identifica y cuantifica directamente por HPLC de fase inversa. No es
necesaria la extracción cuando el pico de péptido libre no se
superpone con ningún pico de la sangre o plasma.
Se añade una solución de 1 mg/ml de MBI 11CN en
formulaciones C1 y D a plasma de oveja recién preparado, con una
concentración final de péptido de 100 \mug/ml y se incuba a 37ºC.
Se separan partes alícuotas de plasma a diferentes tiempos y se
analizan los péptidos libres por HPLC de fase inversa. Para cada
cromatograma, se integra el área del pico correspondiente al
péptido libre y se representa frente al tiempo de incubación. Como
se muestra en la Figura 11, los niveles de péptido disminuyen frente
al tiempo. Además, cuando se administra en formulación D, hasta 50%
del péptido se libera inmediatamente del complejo
formulación-péptido al añadirlo a la sangre. La
curva de desintegración para el péptido libre da una semivida
aparente en la sangre de 90 minutos tanto para la formulación C1
como D. Estos resultados indican que en sangre de oveja, MBI 11CN es
relativamente resistente a las peptidasas y proteasas del plasma.
Los nuevos picos que aparecen durante la incubación pueden ser
productos de ruptura del péptido.
Los niveles de péptido en el plasma in
vivo se miden después de administración vía iv o ip de
80-100% de la dosis máxima tolerada de análogo de
péptido en formulación C1 o D. MBI 11CN en formulación C1 se inyecta
vía intravenosa en la vena de la cola de ratones de cepa CD1 ICRBR.
A diferentes tiempos después de inyección, los ratones se
anestesian y se extrae sangre por pinchazo cardiaco. La sangre de
los ratones individuales se centrifuga para separar el plasma de
las células. Después el plasma se analiza por columna de HPLC de
fase inversa. En los perfiles de elución resultantes se analiza el
contenido de péptido libre por absorbancia UV a 280 nm, y estos
datos se convierten en concentraciones en la sangre basándose en un
patrón calibrado. Cada punto de dato representa el nivel en sangre
medio de dos ratones. En este ensayo, el límite de detección es
aproximadamente 1 \mug/ml, menos de 3% de la dosis
administrada.
El punto de tiempo más temprano al que se puede
medir el péptido es tres minutos después de inyección, por lo
tanto, la concentración máxima observada (en \mug/ml) se extrapola
hacia atrás a tiempo cero (Figura 21). La concentración inicial
proyectada se corresponde bien con la concentración esperada de
entre 35 y 45 \mug/ml. Sin embargo, la desintegración es rápida,
y cuando la curva se ajusta a la ecuación para la desintegración
exponencial, se calcula que el péptido libre que circula tiene una
semivida de 2,1 minutos. El péptido libre que circula no era
detectable en la sangre de ratones a los que se inyectó MBI 11CN en
formulación D, sugiriendo que el péptido no es liberado tan
rápidamente del complejo como in vitro.
Además, MBI 11CN también se administra a ratones
de la cepa CD1 ICRBR por una sola inyección ip con un nivel de
dosis eficaz de 40 mg/kg. El péptido se administra tanto en
formulación C1 como D para determinar si la formación de complejo
del péptido tiene algún efecto en los niveles en la sangre. A
diferentes tiempos después de inyección, los ratones se anestesian
y se extrae sangre por pinchazo cardiaco. La sangre se recoge y se
analiza como para la inyección iv.
El MBI 11CN administrado por esta vía demostró
un perfil farmacológico bastante diferente (Figura 13). En
formulación C1, el péptido entró en la corriente sanguínea
rápidamente, con una concentración máxima de casi 5 \mug/ml
después de 15 minutos, que disminuyó a niveles no detectables
después de 60 minutos. En contraste, el péptido en formulación D
está presente en un nivel por encima de 2 \mug/ml durante
aproximadamente dos horas. Por lo tanto, la formulación afecta a la
entrada y al mantenimiento de los niveles de péptido en la
sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensaya la toxicidad aguda de una sola dosis
de diferentes análogos de indolicidina en ratones Swiss CD1 usando
diferentes vías de administración. Con el fin de determinar las
toxicidades inherentes a los análogos de péptidos en ausencia de
cualesquiera efectos de la formulación/vehículo de suministro, todos
los péptidos se administran en solución salina isotónica con el pH
final entre 6 y 7.
Vía intraperitoneal. Se inyectan grupos
de 6 ratones con dosis de péptidos entre 80 y 5 mg/kg en volúmenes
de dosis de 500 \mul. Después de la administración de péptido, los
ratones se observan durante un periodo de 5 días, momento en el que
se determinan los niveles de dosis que producen 50% de mortalidad
(DL_{50}), dosis que produce 90-100% de
mortalidad (DL_{90-100}) y dosis máxima tolerada
(DMT). Los valores de DL_{50} se calculan usando el método de
Reed y Muench (J. of Amer. Hyg. 27: 493-497,
1938). Los resultados presentados en la Tabla 14 muestran que los
valores de DL_{50} para MBI 11CN y análogos están en el intervalo
de 21 a 52 mg/kg.
\vskip1.000000\baselineskip
Vía intravenosa. Se inyectan grupos de 6
ratones con dosis de péptido de 20, 16, 12, 8, 4 y 0 mg/kg en
volúmenes de 100 \mul (4 ml/kg). Después de administración, los
ratones se observan durante un periodo de 5 días, momento en el que
se determinan los niveles de DL_{50},
DL_{90-100} y DMT. Los resultados del ensayo de
toxicidad iv de MBI 11CN y tres análogos se muestran en la Tabla 15.
Los valores de DL_{50}, DL_{90-100} y DMT están
en el intervalo de 5,8 a 15 mg/kg, de 8 a 20 mg/kg y de <4 a 12
mg/kg, respectivamente.
Vía subcutánea. La toxicidad de MBI 11CN
también se determina después de administración subcutánea (SC).
Para el ensayo de toxicidad SC, se inyectan grupos de 6 ratones con
dosis de péptido de 128, 96, 64, 32 y 0 mg/kg en volúmenes de dosis
de 300 \mul (12 ml/kg). Después de administración, los ratones se
observan durante un periodo de 5 días. Ninguno de los animales
murió con ninguno de los niveles de dosis dentro del periodo de
observación de 5 días. Por lo tanto, los valores de DL_{50},
DL_{90-100} y DMT se ha considerado que son todos
mayores que 128 mg/kg. Los ratones que recibieron niveles de dosis
mayores mostraron síntomas similares a los vistos después de
inyección iv, sugiriendo que el péptido entró en la circulación
sistémica. Estos síntomas son reversibles, desapareciendo en todos
los ratones al segundo día de observaciones.
También se examina la toxicidad de una sola
dosis de MBI 10CN y MBI 11CN en diferentes formulaciones en ratones
ICR de cría exogénica (Tabla 16). La inyección intraperitoneal
(grupos de 2 ratones) de MBI 10CN en formulación D no muestra
toxicidad hasta 29 mg/kg y en las mismas condiciones MBI 11CN no
muestra toxicidad hasta 40 mg/kg.
La inyección intravenosa (grupos de 10 ratones)
de MBI 10CN en formulación D muestra una dosis máxima tolerada
(DMT) de 5,6 mg/kg (Tabla 16). La inyección de 11 mg/kg dio 40% de
toxicidad y 22 mg/kg dieron como resultado 100% de toxicidad. La
inyección intravenosa de MBI 11CN en formulación C (liofilizado)
muestra una DMT de 3,0 mg/kg. La inyección de 6,1 mg/kg da como
resultado 10% de toxicidad y con 12 mg/kg 100% de toxicidad.
Estos resultados se obtienen usando soluciones
de péptido/tampón que se liofilizan después de preparar y se
reconstituyen con agua. Si la solución de péptido no se liofiliza
antes de inyectar, si no que se usa inmediatamente después de
preparar, se observa un aumento de toxicidad, y la dosis máxima
tolerada puede disminuir hasta en cuatro veces. Por ejemplo, una
inyección intravenosa de MBI 11CN como una solución no liofilizada,
formulación C1, de 1,5 mg/kg da como resultado 20% de toxicidad y
de 3,0 mg/kg dio 100% de toxicidad. El análisis por HPLC de las
formulaciones no liofilizada y liofilizada indica que MBI 11CN forma
un complejo con polisorbato, y esta complejación del péptido reduce
su toxicidad en ratones.
Además, los ratones se inyectan múltiples veces
por una vía intravenosa con MBI 11CN (Tabla 17). En un experimento
representativo, el péptido administrado en 10 inyecciones de 0,84
mg/kg en intervalos de 5 minutos no es letal. Sin embargo, dos
inyecciones de péptido de 4,1 mg/kg administradas con un intervalo
de 10 minutos, dan como resultado 60% de mortalidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar el impacto de ratones dosificados
con análogo de péptido, se pueden llevar a cabo una serie de
investigaciones de histopatología. Se administra a grupos de ratones
análogo con niveles de dosis que están en, o por debajo de la DMT,
o por encima de la DMT, o una dosis letal. Se pueden usar múltiples
inyecciones para mimetizar posibles regímenes de tratamiento. Los
grupos de ratones testigo no se inyectan o se les inyecta sólo con
tampón.
Después de inyección, los ratones se sacrifican
en tiempos especificados y sus órganos se ponen inmediatamente en
una solución de formalina equilibrada al 10%. Los órganos de los
ratones que mueren como resultado de los efectos tóxicos del
análogo también se conservan inmediatamente. Se toman muestras de
tejido y se preparan como microsecciones teñidas en portaobjetos
que después se examinan en el microscopio. Se evalúa el daño a
tejidos y esta información se puede usar para desarrollar análogos
mejorados, métodos mejorados de administración o regímenes de
dosificación mejorados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensaya en los análogos su capacidad de
rescatar ratones de infecciones bacterianas letales. El modelo
animal usado es una inoculación intraperitoneal (ip) de ratones con
10^{6}-10^{8} organismos Gram positivos con
posterior administración de péptido. Los tres patógenos
investigados, S. aureus sensible a meticilina (SASM), S.
aureus resistente a meticilina (SARM), o S. epidermidis,
se inyectan vía ip en ratones. Para los ratones no tratados, la
muerte se produce en 12-18 horas con SASM y S.
epidermis y en 6-10 horas con SARM.
El péptido se administra por dos vías, vía
intraperitoneal, una hora después de infección, o vía intravenosa,
con una sola dosis o dosis múltiples dadas en diferentes tiempos
antes y después de infección.
Infección por SASM. En un protocolo
típico, se infectan grupos de 10 ratones vía intraperitoneal con una
dosis DL_{90-100} (5,2 x 10^{6} UFC/ratón) de
SASM (Smith, ATCC # 19640) inyectada en infusión
cerebro-corazón que contiene 5% de mucina. Esta
cepa de S. aureus no es resistente a ningún antibiótico
común. A los 60 minutos después de infección, se inyecta vía
intraperitoneal MBI 10CN o MBI 11CN en formulación D, con los
niveles de dosis establecidos. Una inyección de formulación sola
sirve como testigo negativo, y la administración de ampicilina
sirve como testigo positivo. La supervivencia de los ratones se
controla a las 1 2, 3 y 4 horas después de infección, y después dos
veces diarias durante un total de 8 días.
Como se muestra en la Figura 14, MBI 10CN es
activo de forma máxima frente a SASM (70-80% de
supervivencia) con dosis de 14,5 a 38,0 mg/kg, aunque no se logra
100% de supervivencia. Por debajo de 14,5 mg/kg, hay una clara
supervivencia dependiente de la dosis. Con estos niveles de dosis
más bajos, parece que hay un umbral dependiente del animal, de
forma que los ratones mueren el día 2 o sobreviven el periodo entero
de ocho días. Como se ve en la Figura 15, por otra parte, MBI 11CN
rescata 100% de los ratones de infección por SASM con un nivel de
dosis de 35,7 mg/kg, y por lo tanto era tan eficaz como la
ampicilina. Había muy poca o no había actividad con ninguno de los
niveles de dosis más bajos, lo cual indica que se debe lograr un
nivel de péptido mínimo en la corriente sanguínea durante el tiempo
que las bacterias son un peligro para el hospedante.
Como se ha mostrado antes, los niveles de MBI
11CN se pueden mantener a un nivel mayor que 2 \mug/ml durante un
periodo de dos horas, infiriendo que éste es mayor que el nivel
mínimo.
Adicionalmente, se ensayan ocho variantes
basados en la secuencia de MBI 11CN frente a SASM usando el sistema
experimental antes descrito. Los péptidos preparados en formulación
D se administran con niveles de dosis en el intervalo de 12 a 24
mg/kg, y se controla la supervivencia de los ratones infectados
durante ocho días (Figuras 16-24). El porcentaje de
supervivencia al final del periodo de observación para cada variante
se resume en la Tabla 18. Como se muestra en la tabla, varias de
las variantes mostraron mayor eficacia o igual que MBI 11CN en las
mismas condiciones.
Infección por S. epidermidis. Los
análogos de péptidos generalmente tienen valores de CIM más bajos
frente a S. epidermidis in vitro, por lo tanto, niveles más
bajos de péptido en la sangre deben ser más eficaces frente a la
infección.
En un protocolo típico, se inyectan grupos de 10
ratones vía intraperitoneal con una dosis
DL_{90-100} (2,0 x 10^{8} UFC/ratón) de S.
epidermidis (ATCC # 12228) en caldo de infusión
cerebro-corazón que contiene 5% de mucina. Esta
cepa de S. epidermidis es 90% letal después de 5 días. A los
15 min y 60 min después de infección, se inyectan diferentes dosis
de MBI 11CN en formulación D vía intravenosa en la vena de la cola.
Una inyección de formulación sola sirve como testigo negativo, y la
inyección de gentamicina sirve como testigo positivo; ambos se
inyectan a los 60 minutos después de infección. La supervivencia de
los ratones se controla a las 1, 2, 3, 4, 6 y 8 horas después de
infección, y después dos veces diarias durante un total de 8
días.
Como se muestra en las Figuras 25A y 25B, MBI
11CN prolonga la supervivencia de los ratones. Se observa eficacia
con los tres niveles de dosis con tratamiento 15 minutos después de
inyección, sin embargo, hay menos actividad a los 30 minutos
después de infección y no hay efecto significativo 60 minutos
después de infección. El tiempo de administración parece ser
importante en este sistema modelo, dando la mejor tasa de
supervivencia una sola inyección de 6,1 mg/kg 15 minutos después de
inyección.
Infección por SARM. La infección por
SARM, aunque es letal en un corto periodo de tiempo, requiere una
carga bacteriana mucho mayor que SASM. En un protocolo típico, se
inyectan grupos de 10 ratones vía intraperitoneal con una dosis
DL_{90-100} (4,2 x 10^{7} UFC/ratón) de SARM
(ATCC #33591) en infusión cerebro-corazón que
contiene 5% de mucina. Los protocolos del tratamiento son los
siguientes, con los tiempos de tratamiento relativos al tiempo de
infección:
- 0 mg/kg Formulación D sola (testigo negativo),
inyectada a los 0 min
- 5 mg/kg Tres inyecciones de 5,5 mg/kg a los
-5, +55 y +115 min
- 1 mg/kg (2 h) Cinco inyecciones de 1,1 mg/kg a
los -5, +55, +115, +175 y +235 min
- 1 mg/kg (20 min) Cinco inyecciones de 1,1
mg/kg a los -10, -5, 0, +5 y +10 min
- Vancomicina (testigo positivo) inyectada a los
0 min
Se inyecta MBI 11CN vía intravenosa en la vena
de la cola en formulación D. Se registra la supervivencia de los
ratones a las 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 20, 24 y 30 horas después de
infección y después dos veces diarias durante un total de 8 días.
No hubo cambios en el número de ratones que sobreviven después de 24
h (Figura 26).
El protocolo de tratamiento de 1 mg/kg (20 min)
con inyecciones separadas 5 minutos centradas en el tiempo de
infección, retrasó la muerte de los ratones en una extensión
significativa, quedando un superviviente al final del estudio. Los
resultados presentados en la Tabla 19 sugieren que un nivel
suficientemente alto de MBI 11CN mantenido durante un periodo de
tiempo más largo amentaría el número de ratones que sobreviven. Los
resultados con 5 mg/kg y 1 mg/kg (2 h), donde no hay mejora en la
supervivencia frente al testigo negativo, indican que las
inyecciones separadas 1 hora, incluso con un nivel mayor, no son
eficaces frente a SARM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una solución de polisorbato 80 al 2%
(peso/peso) en agua y se pone en un recipiente de reacción
adecuado, tal como una celda de cuarzo. Se pueden usar otros
recipientes que son traslúcidos a la luz UV o incluso opacos si se
prevé un camino de luz transparente o un tiempo de reacción
prolongado. Además, el recipiente debe permitir el intercambio de
aire, pero minimizar la evaporación.
La solución se irradia con luz ultravioleta
usando una lámpara que emite a 254 nm. La irradiación también se
puede llevar a cabo usando una lámpara que emite a 302 nm. La
activación se completa en 1-14 días dependiendo del
recipiente, la profundidad de la solución, y de la tasa de
intercambio de aire. La reacción se controla por un ensayo de HPLC
de fase inversa, que mide la formación de MBI 11CN modificado con
APS cuando se hace reaccionar el polisorbato activado por la luz con
MBI 11CN.
Se determinan algunas propiedades del
polisorbato activado. Debido a que los peróxidos son un subproducto
conocido de exponer los éteres a la luz UV, se examina la formación
de peróxido por el efecto de agentes de reducción en el polisorbato
activado. Como se ve en la Figura 27A, el polisorbato activado
reacciona fácilmente con MBI 11CN. El tratamiento previo con
2-mercaptoetanol (Figura 27B), un agente de
reducción suave, elimina los peróxidos detectables, pero no produce
una perdida de capacidad de formar conjugado. El tratamiento con
borohidruro sódico (Figura 27C), elimina peróxidos y eventualmente
elimina la capacidad del polisorbato activado de modificar
péptidos. La hidrólisis del borohidruro en agua sube el pH y produce
borato como un producto de hidrólisis. Sin embargo, ni el cambio de
pH, ni el borato son los responsables.
Estos datos indican que los peróxidos no están
implicados en la modificación de péptidos por el polisorbato
activado. El borohidruro sódico no debe afectar a epóxidos o ésteres
en medio acuoso, sugiriendo que el grupo reactivo es un aldehído o
cetona. La presencia de aldehídos en el polisorbato activado se
confirma usando un ensayo de formaldehído, que es específico para
aldehídos, incluyendo aldehídos distintos del formaldehído.
\newpage
Además, el polisorbato activado se trata con
2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) en un intento de
capturar las especies reactivas. Tres componentes atrapados con
DNPH se purifican y analizan por espectroscopía de masas. Estos
componentes son derivados de polisorbato con pesos moleculares entre
1000 y 1400. Esto indica que están implicados aldehídos de bajo
peso molecular, tales como formaldehído o acetaldehído.
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos modificados con APS se preparan en
fase sólida o fase líquida. Para la preparación en fase sólida, se
añaden 0,25 ml de MBI 11CN 4 mg/ml, a 0,5 ml de ácido
acético-NaOH 0,4 M, pH 4,6, seguido de adición de
0,25 ml de polisorbato activado con luz UV. La mezcla de reacción se
congela poniéndola en un congelador a -80ºC. Después de congelar, la
mezcla de reacción se liofiliza toda la noche.
Para preparar los conjugados en una fase acuosa,
primero una muestra de polisorbato 80 activado por la luz UV se
ajusta a pH 7,5 por adición de NaOH 0,1 M. Esta solución de pH
ajustado (0,5 ml) se añade a 1,0 ml de carbonato sódico 100 mM, pH
10,0, seguido inmediatamente por adición de 0,5 ml de MBI 11CN 4
mg/ml. La mezcla de reacción se incuba a temperatura ambiente
durante 22 horas. El progreso de la reacción se controla por
análisis en distintos puntos de tiempo usando
RP-HPLC (Figura 28). En la figura 28, el pico 2 es
péptido sin reaccionar, el pico 3 es péptido modificado con APS. El
tipo 1 es el que está más a la izquierda del pico 3 y el Tipo 2 es
el de más a la derecha del pico 3.
La Tabla 20 resume datos de varios experimentos.
Salvo que se indique otra cosa en la tabla 20, los péptidos
modificados con APS se preparan por el método de liofilización en
tampón de ácido acético-NaOH 200 mM, pH 4,6.
\vskip1.000000\baselineskip
La modificación de los grupos amino se analiza
más determinando el número de grupos amino primarios perdidos
durante la unión. Los péptidos sin modificar y modificados se tratan
con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS)
(R.L. Lundblad en Techniques in Protein Modification and
Analysis pp. 151-154, 1995) (Tabla 21).
Brevemente, se prepara una solución madre de MBI
11CN 4 mg/ml y una solución equimolar de MBI 11CN modificado con
APS. Una parte alícuota de 0,225 ml de MBI 11CN o MBI 11CN
modificado con APS se mezcla con 0,225 ml de tampón de fosfato
sódico 200 mM, pH 8,8. Se añade una parte alícuota de 0,450 ml de
TNBS al 1% a cada muestra, y la reacción se incuba a 37ºC durante
30 minutos. Se mide la absorbancia a 367 nm, y se calcula el número
de grupos amino primarios modificados por molécula usando un
coeficiente de extinción de 10.500 M^{-1} cm^{-1} para los
derivados de trinitrofenilo (TNP).
Después el contenido de grupos amino primarios
del péptido relacionado se compara con el del correspondiente
péptido modificado con APS. Como se muestra a continuación, se
produce la pérdida de un solo grupo amino primario durante la
formación del péptido modificado. Los péptidos que tienen una pareja
3,4 lisina dan consistentemente resultados que son 1 residuo menos
de lo esperado, lo cual puede reflejar impedimento estérico después
de valoración de un miembro del doblete.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos modificados con APS demuestran un
alto grado de estabilidad en condiciones que promueven la
disociación de complejos iónicos o hidrófobos. Se prepara el
péptido modificado con APS en formulación D, como soluciones de 800
\mug/ml en agua, solución salina al 0,9%, urea 8 M,
guanidina-HCl 8 M, 1-propanol al
67%, HCl 1 M y NaOH 1 M, y se incuban durante 1 hora a temperatura
ambiente. Se analiza en las muestras la presencia de péptido libre
usando HPLC de fase inversa y las siguientes condiciones
cromatográficas:
Disolvente A: ácido trifluoroacético (TFA) al
0,1% en agua
Disolvente B: TFA al 0,1%/acetonitrilo al 95% en
agua
Medio: POROS R2-20
(poliestireno-divinilbenceno)
Elución: 0% de B para 5 volúmenes de columna
0-25% de B en 3 volúmenes de
columna
25% de B para 10 volúmenes de columna
25-95% de B en 3 volúmenes de
columna
95% de B para 10 volúmenes de columna
En estas condiciones, el péptido libre eluye
exclusivamente durante la etapa de 25% de B, y el complejo de
formulación-péptido durante la etapa de 95% de B.
Ninguna de las condiciones de disociación antes mencionadas,
excepto NaOH 1 M en la que se observa algo de degradación, consiguen
liberar el péptido libre del péptido modificado con APS. Se llevan
a cabo estudios adicionales con incubación a 55ºC u 85ºC durante una
hora. El péptido modificado con APS es igualmente estable a 55ºC, y
es sólo ligeramente menos estable a 85ºC. Se observa algo de
hidrólisis ácida, indicada por la presencia de nuevos picos en el
cromatograma de HPLC, con la muestra de HCl 1 M incubada a 85ºC
durante una hora.
Se purifica una preparación a gran escala de MBI
11CN modificado con APS. Aproximadamente 400 mg de MBI 11CN se
modifican con APS y se disuelven en 20 ml de agua. Se separa el MBI
11CN sin reaccionar por RP-HPLC. Después el
disolvente se evapora del conjunto de MBI 11CN modificado con APS, y
el residuo se disuelve en 10 ml de cloruro de metileno. Después, el
péptido modificado se precipita con 10 ml de éter dietílico. Después
de 5 min a temperatura ambiente, el precipitado se recoge por
centrifugación a 5000xg durante 10 minutos. El sedimento se lava
con 5 ml de éter dietílico y se recoge otra vez por centrifugación a
5000xg durante 10 minutos. Los líquidos sobrenadantes se agrupan
para analizar los subproductos de polisorbato sin reaccionar. El
precipitado se disuelve en 6 ml de agua y después se lava por
barrido con nitrógeno burbujeando durante 30 minutos para separar el
éter residual. El rendimiento total a partir del MBI 11CN inicial
era 43%.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los ensayos biológicos que comparan los
péptidos modificados con APS con los péptidos sin modificar se
llevan a cabo en una relación equimolar. La concentración de
péptidos modificados con APS se puede determinar por medición
espectrofotométrica que se usa para normalizar las concentraciones
para ensayos biológicas. Por ejemplo, una solución de MBI 11CN
modificado con APS de 1 mg/ml contiene la misma cantidad de péptido
que una solución de MBI 11CN de 1 mg/ml, permitiendo así la
comparación directa de datos de toxicidad y eficacia.
Los péptidos modificados con APS son al menos
tan potentes como los péptidos relacionados, en ensayos in
vitro llevados a cabo como se describe aquí. Se presentan los
valores de las CIM frente a bacterias gram positivas para varios
péptidos modificados con APS y se comparan con los valores obtenidos
usando los péptidos relacionados (Tabla 22). Los resultados indican
que los péptidos modificados son al menos tan potentes in
vitro como los péptidos relacionados y pueden ser más potentes
que los péptidos relacionados frente a cepas de E.
faecalis.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Se examinan las toxicidades de MBI 11CN
modificado con APS y MBI 11CN sin modificar en ratones Swiss
CD-1. Se inyectan grupos de 6 ratones vía iv con
dosis simples de 0,1 ml de péptido en solución salina al 0,9%. Los
niveles de dosis usados son 0, 3, 5, 8, 10, y 13 mg/kg. Los ratones
se controlan a las 1, 3 y 6 horas después de inyección durante el
primer día, y después dos veces diarias durante 4 días. Los datos de
supervivencia para los ratones MBI 11CN se presentan en la Tabla
23. Para el MBI 11CN modificado con APS, 100% de los ratones
sobrevivieron con todas las dosis, incluyendo la dosis máxima de 13
mg/kg.
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Como se resume a continuación, la DL_{50} para
MBI 11CN es 7 mg/kg (Tabla 24), muriendo todos los sujetos con una
dosis de 8 mg/ml. La dosis más alta de MBI 11CN que da 100% de
supervivencia era 5 mg/kg. Los datos muestran que los péptidos
modificados con APS son significativamente menos tóxicos que los
péptidos relacionados.
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Se apreciará que, aunque aquí se han descrito
realizaciones específicas de la invención con propósito ilustrativo,
sin embargo pueden realizarse diversas modificaciones sin apartarse
de la invención. Consecuentemente, la invención no está limitada más
que por las reivindicaciones anexas.
Claims (37)
1. Un análogo de indolicidina, que consiste en
una de las siguientes secuencias:
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2. El análogo de indolicidina de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho análogo tiene uno o más
aminoácidos cambiados por un D-aminoácido
correspondiente.
3. El análogo de indolicidina de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que el aminoácido N-terminal
y/o el C-terminal es un
D-aminoácido.
4. El análogo de indolicidina de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el análogo está acetilado en el
aminoácido N-terminal.
5. El análogo de indolicidina de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el análogo está amidado en el aminoácido
C-terminal.
6. El análogo de indolicidina de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el análogo está esterificado en el
aminoácido C-terminal.
7. El análogo de indolicidina de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el análogo está modificado por
incorporación de homoserina/homoserina-lactona en el
aminoácido C-terminal.
8. El análogo de indolicidina de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el análogo está conjugado con
polietilénglicol o sus derivados.
9. Una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de ácido nucleico que codifica un análogo de
indolicidina de acuerdo con la reivindicación 1.
10. Un vector de expresión que comprende un
promotor en unión factible con la molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 9.
11. Una célula hospedante transfectada o
transformada con el vector de expresión de la reivindicación 10.
12. Una composición farmacéutica que comprende
un análogo de indolicidina de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, y un tampón fisiológicamente aceptable.
13. La composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 12, que comprende además un antibiótico.
14. La composición farmacéutica de la
reivindicación 13, en la que el antibiótico se selecciona del grupo
que consiste en penicilinas, cefalosporinas, carbacefems,
cefamicinas, carbapenems, monobactams, quinolonas, tetraciclinas,
aminoglicósidos, macrólidos, glicopéptidos, cloranfenicoles,
glicilciclinas, licosamidas y fluoroquinolonas.
15. La composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 13, en la que el antibiótico se selecciona del
grupo que consiste en Amikacina; Amoxicilina; Ampicilina;
Azitromicina; Azlocilina; Aztreonam; Carbenicilina; Cefaclor;
Cefamandol-formiato sódico; Cefazolina; Cefepima;
Cefetamet; Cefixima; Cefmetazol; Cefonicid; Cefoperazona;
Cefotaxima; Cefotetan; Cefoxitin; Cefpodoxima; Cefprozil;
Cefsulodina; Ceftazidima; Ceftizoxima; Ceftriaxona; Cefuroxima;
Cefalexina; Cefalotin; Cloranfenicol; Cinoxacino; Ciprofloxacino;
Claritromicina; Clindamicina; Cloxacilina;
Co-amoxiclavulanato; Dicloxacilina; Doxiciclina;
Enoxacino; Eritromicina; estolato de Eritromicina; succinato de
Eritromicina y etilo; glucoheptonato de Eritromicina; lactobionato
de Eritromicina; estearato de Eritromicina; Etambutol; Fleroxacino;
Gentamicina; Imipenem; Isoniazid; Kanamicina; Lomefloxacino;
Loracarbef; Meropenem; Meticilina; Metronidazol; Meziocilina;
hidrocloruro de Minociclina; Mupirocina; Nafcilina; Ácido
Nalidíxico; Netilmicina; Nitrofurantoína; Norfloxacino; Ofloxacino;
Oxacilina; Penicilina G; Piperacilina; Pirazinamida; Rifabutin;
Rifampicina; Roxitromicina; Estreptomicina; Sulfametoxazol;
Sinercid; Teicoplanina; Tetraciclina; Ticarcilina; Tobramicina;
Trimetoprim; Vancomicina; una combinación de Piperacilina y
Tazobactam; y sus derivados.
16. La composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 13, en la que el antibiótico se selecciona del
grupo que consiste en Amikacina; Azitromicina; Cefoxitina;
Ceftriaxona; Ciprofloxacino; Co-amoxiclavulanato;
Doxiciclina; Gentamicina; Mupirocina; Vancomicina; y una combinación
de Piperacilina y Tazobactam.
17. La composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en la que la
composición está incorporada en un liposoma.
18. La composición farmacéutica de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en la que la
composición está incorporada en un vehículo de liberación lenta.
19. Un análogo de indolicidina de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una composición
farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
12 a 18, para uso terapéutico.
20. Uso de un análogo de indolicidina de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una
composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 18, para fabricar un medicamento para tratar
infecciones.
21. Uso de acuerdo con la reivindicación 20, en
el que dicha infección se debe a un microorganismo.
22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, en
el que el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en
bacterias, hongos, parásitos y virus.
23. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, en
el que el hongo es una levadura y/o un moho.
24. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, en
el que la bacteria es una bacteria Gram negativa.
25. Uso de acuerdo con la reivindicación 24, en
el que la bacteria Gram negativa se selecciona del grupo que
consiste en Acinetobacter spp.; Enterobacter spp.; E. coli; H.
influenzae; K. pneumoniae; P. aeruginosa; S. marcescens y S.
maltophilia.
26. Uso de acuerdo con la reivindicación 24, en
el que la bacteria Gram negativa se selecciona del grupo que
consiste en Bordetella pertussis; Brucella spp.; Campylobacter
spp.; Haemophilus ducreyl; Helicobacter pylori; Legionella spp.;
Moraxella catarrhalis; Neisseria spp.; Salmonella spp.; Shigella
spp. y Yersinia spp.
27. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, en
el que la bacteria es una bacteria Gram positiva.
28. Uso de acuerdo con la reivindicación 27, en
el que la bacteria Gram positiva se selecciona del grupo que
consiste en E. faecalis; S. aureus; E. faecium; S. pyogenes; S.
pneumoniae y estafilococos coagulasa negativos.
29. Uso de acuerdo con la reivindicación 28, en
el que la bacteria Gram positiva se selecciona del grupo que
consiste en Bacillus spp.; Corynebacterium spp.;
Difteroides: Listeria spp. y Estreptococos Viridans.
30. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, en
el que la bacteria es una bacteria anaerobia.
31. Uso de acuerdo con la reivindicación 30, en
el que la bacteria anaerobia se selecciona del grupo que consiste en
Clostridium spp., Bacteroides spp. y Peptostreptococcus
spp.
32. Uso de acuerdo con la reivindicación 30, en
el que la bacteria se selecciona del grupo que consiste en
Borrelia spp.; Chlamydia spp.; Mycobacterium spp.; Mycoplasma
spp.; Propionibacterium acne; Rickettsia spp.; Treponema spp. y
Ureaplasma spp.
33. Uso de acuerdo con la reivindicación 20, en
el que el análogo de indolicidina se administra por inyección
intravenosa, inyección o implante intraperitoneal, inyección o
implante intramuscular, inyección intratecal, inyección o implante
subcutáneo, inyección intradérmica, lavado, lavado de vejiga,
supositorios, pesarios, ingestión oral, aplicación tópica,
aplicación entérica, inhalación, administración en aerosol o
pulverización o gotas nasales.
34. Un dispositivo recubierto con una
composición que comprende un análogo de indolicidina de acuerdo con
las reivindicaciones 1-8.
35. El dispositivo de acuerdo con la
reivindicación 34, en el que la composición comprende además un
agente antibiótico.
36. El dispositivo de una de las
reivindicaciones 34 ó 35, en el que el dispositivo es un dispositivo
médico.
37. El dispositivo médico de acuerdo con la
reivindicación 36, en el que dicho dispositivo se selecciona del
grupo que consiste en catéteres, válvulas cardiacas artificiales,
cánulas y stents.
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