JP2002530274A - プロテアーゼ分解に対する安定性の高いペプチド - Google Patents
プロテアーゼ分解に対する安定性の高いペプチドInfo
- Publication number
- JP2002530274A JP2002530274A JP2000579716A JP2000579716A JP2002530274A JP 2002530274 A JP2002530274 A JP 2002530274A JP 2000579716 A JP2000579716 A JP 2000579716A JP 2000579716 A JP2000579716 A JP 2000579716A JP 2002530274 A JP2002530274 A JP 2002530274A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- trp
- pro
- peptide
- plant
- rev4
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
植物のプロテアーゼに対する安定性を高め、植物の病気の制御に有用なペプチドが開示されている。ペプチドはまた、植物、かび、ウイルス、細菌昆虫その他の起源のプロテアーゼによる分解から他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を保護する能力を有する。本発明のペプチドをエンコードするＤＮＡは、プロテアーゼによる分解から異なるペプチドを保護する方法として、遺伝形質転換植物における外因性ペプチドをエンコードする他のＤＮＡとともに共発現することができる。核酸配列と、微生物と、植物と、植物の病気の治療に有用な組成物とが同じく開示されている。
Description
【０００１】 本願は、１９９８年１０月３０日及び１９９８年１１月２日付けでそれぞれ出
願された合衆国仮特許出願第６０／１０６，３７３号及び第６０／１０６、５７
３号の利益を主張するものである。本明細書においては、これらの出願を引用し
てその説明に代える。
願された合衆国仮特許出願第６０／１０６，３７３号及び第６０／１０６、５７
３号の利益を主張するものである。本明細書においては、これらの出願を引用し
てその説明に代える。
【０００２】 （技術分野） 本発明は、耐プロテアーゼ性があり、かつ、植物におけるペプチド、ポリペプ
チド及びタンパク質のプロテアーゼ分解の程度を小さくすることができる抗微生
物ペプチド(antimicrobial peptide)に関する。
チド及びタンパク質のプロテアーゼ分解の程度を小さくすることができる抗微生
物ペプチド(antimicrobial peptide)に関する。
【０００３】 （発明の背景） 抗微生物ペプチドは、広範囲に亘る生物により、感染に対する防御の一部とし
て生産されている。TIBTECH、第１６巻、第８２−８８行（１９９８年）に掲載
のハンコック(Hancock)及びレーラー(Lehrer)の論文、並びに、ヘディン(Hedin)
、メン(Menn)及びホリングウォース(Hollingworth)の編集に係るACS Symposium
Series 551、第２７８−９１頁（１９９４年）に掲載の「第２０章、天然の及び
処理されたペスト処理剤(Chap. 20 In: Natural and Engineered Pest Manageme
nt Agents)」と題するエベレットの論文を参照されたい。かかるペプチドには、
昆虫の無細胞免疫に関するセクロピン、アタシン及びジプテリシン、ミツバチか
ら得られるアピダエシン、哺乳類の食細胞からのデフェンシン、並びに、カエル
の皮膚からのマゲイニンが含まれる。植物もまた、微生物植物病原体に対する耐
性において役割を果たすと考えられているある種の抗微生物ペプチドを生産する
。Critical Reviews in Plant Sciences、第１６巻、第２９７−３２３頁（１９
９７年）に掲載のブルッカート(Broekaert)等の論文を参照されたい。
て生産されている。TIBTECH、第１６巻、第８２−８８行（１９９８年）に掲載
のハンコック(Hancock)及びレーラー(Lehrer)の論文、並びに、ヘディン(Hedin)
、メン(Menn)及びホリングウォース(Hollingworth)の編集に係るACS Symposium
Series 551、第２７８−９１頁（１９９４年）に掲載の「第２０章、天然の及び
処理されたペスト処理剤(Chap. 20 In: Natural and Engineered Pest Manageme
nt Agents)」と題するエベレットの論文を参照されたい。かかるペプチドには、
昆虫の無細胞免疫に関するセクロピン、アタシン及びジプテリシン、ミツバチか
ら得られるアピダエシン、哺乳類の食細胞からのデフェンシン、並びに、カエル
の皮膚からのマゲイニンが含まれる。植物もまた、微生物植物病原体に対する耐
性において役割を果たすと考えられているある種の抗微生物ペプチドを生産する
。Critical Reviews in Plant Sciences、第１６巻、第２９７−３２３頁（１９
９７年）に掲載のブルッカート(Broekaert)等の論文を参照されたい。
【０００４】 植物は、天然及び合成の双方の抗微生物ペプチドを生産して、病気に対する耐
性を高めるように遺伝学的に処理されてきた。BioEssays、第６巻、第２６３−
７０頁（１９８７年）に掲載のジェイネス(Jaynes)等の論文、TIBTECH、第１６
巻、第８２−８８頁（１９９８年）に掲載のハンコック及びレーラーの論文を参
照されたい。残念なことに、この方法は、著しく制限されたものとなっている。
遺伝形質転換(transgenic)植物が生産するペプチドの量は少な過ぎ、及び／また
は、植物は植物病原体による感染を受け易い。TIBTECH、第１６巻、第８２−８
８（１９９８年）に掲載のハンコック及びレーラーの論文を参照されたい。遺伝
形質転換植物における異質なペプチドの発現は、この異質ペプチドがプロテアー
ゼによる迅速な分解を受け易いことによるものである。例えば、全ｍＲＮＡの０
．６％以下のレベルの抗微生物ペプチドセクロピンＢをエンコードする遺伝子を
発現する遺伝形質転換ポテト栽培変種は、検出可能なセクロピンＢを生産せず、
ポテトソフトロットに対する耐性を改善することができない。American Potato
Journal、第７２巻、第４３７−４５頁（１９９５年）に掲載のセフケ(Sjefke)
等の論文を参照されたい。タバコにおける同様の研究においてもまた、セクロピ
ンＢ遺伝子の発現は、検出可能なレベルのセクロピンＢペプチド及び細菌感染に
対する耐性をもたらさないことが示されている。Transgenic Research、第４巻
、第１３２−４１頁（１９９５年）に掲載のフロラック(Florack)等の論文を参
照されたい。セクロピンＢ及びマゲイニンに関する抗微生物ペプチドは、植物の
葉の細胞間流体のプロテアーゼにより、素早く分解されるとする研究も行われて
いる。Plant Science、第１０４巻、第１７−２２頁（１９９４年）に掲載のミ
ルズ(Mills)等の論文、並びに、ヘディン(Hedin)、メン(Menn)及びホリングウォ
ース(Hollingworth)の編集に係るACS Symposium Series 551、第２７８−９１頁
（１９９４年）に掲載の「第２０章、天然の及び処理されたペスト処理剤(Chap.
20 In: Natural and Engineered Pest Management Agents)」と題するエベレッ
ト(Everett)の論文を参照されたい。
性を高めるように遺伝学的に処理されてきた。BioEssays、第６巻、第２６３−
７０頁（１９８７年）に掲載のジェイネス(Jaynes)等の論文、TIBTECH、第１６
巻、第８２−８８頁（１９９８年）に掲載のハンコック及びレーラーの論文を参
照されたい。残念なことに、この方法は、著しく制限されたものとなっている。
遺伝形質転換(transgenic)植物が生産するペプチドの量は少な過ぎ、及び／また
は、植物は植物病原体による感染を受け易い。TIBTECH、第１６巻、第８２−８
８（１９９８年）に掲載のハンコック及びレーラーの論文を参照されたい。遺伝
形質転換植物における異質なペプチドの発現は、この異質ペプチドがプロテアー
ゼによる迅速な分解を受け易いことによるものである。例えば、全ｍＲＮＡの０
．６％以下のレベルの抗微生物ペプチドセクロピンＢをエンコードする遺伝子を
発現する遺伝形質転換ポテト栽培変種は、検出可能なセクロピンＢを生産せず、
ポテトソフトロットに対する耐性を改善することができない。American Potato
Journal、第７２巻、第４３７−４５頁（１９９５年）に掲載のセフケ(Sjefke)
等の論文を参照されたい。タバコにおける同様の研究においてもまた、セクロピ
ンＢ遺伝子の発現は、検出可能なレベルのセクロピンＢペプチド及び細菌感染に
対する耐性をもたらさないことが示されている。Transgenic Research、第４巻
、第１３２−４１頁（１９９５年）に掲載のフロラック(Florack)等の論文を参
照されたい。セクロピンＢ及びマゲイニンに関する抗微生物ペプチドは、植物の
葉の細胞間流体のプロテアーゼにより、素早く分解されるとする研究も行われて
いる。Plant Science、第１０４巻、第１７−２２頁（１９９４年）に掲載のミ
ルズ(Mills)等の論文、並びに、ヘディン(Hedin)、メン(Menn)及びホリングウォ
ース(Hollingworth)の編集に係るACS Symposium Series 551、第２７８−９１頁
（１９９４年）に掲載の「第２０章、天然の及び処理されたペスト処理剤(Chap.
20 In: Natural and Engineered Pest Management Agents)」と題するエベレッ
ト(Everett)の論文を参照されたい。
【０００５】 プロテアーゼ分解によるペプチドの不安定の問題に対する１つの解決策として
、特定のペプチド内のプロテアーゼ感応部位を識別し、かつ、ペプチドの抗微生
物活性を保持するとともに、植物プロテアーゼに対するペプチドの安定性を高め
るアミノ酸置換を構成するものがある。この方法によれば、植物組織の細胞間流
体において見受けられるプロテアーゼに対して高い安定性を有し、従って、植物
に使用するための改良された候補となるアミノ酸配列Met-Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-
Leu-Arg-Glu-Ala-Gly-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Lys-Pro
を有する合成マゲイニン誘導体が得られる。ヘディン、メン及びホリングウォー
スの編集に係るACS Symposium Series 551、第２７８−９１頁（１９９４年）に
掲載の「第２０章、天然の及び処理されたペスト処理剤」と題するエベレットの
論文、並びに、米国特許第５，４２４，３９５号及び同第５，５１９，１１５号
を参照されたい。
、特定のペプチド内のプロテアーゼ感応部位を識別し、かつ、ペプチドの抗微生
物活性を保持するとともに、植物プロテアーゼに対するペプチドの安定性を高め
るアミノ酸置換を構成するものがある。この方法によれば、植物組織の細胞間流
体において見受けられるプロテアーゼに対して高い安定性を有し、従って、植物
に使用するための改良された候補となるアミノ酸配列Met-Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-
Leu-Arg-Glu-Ala-Gly-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-Glu-Ile-Met-Lys-Pro
を有する合成マゲイニン誘導体が得られる。ヘディン、メン及びホリングウォー
スの編集に係るACS Symposium Series 551、第２７８−９１頁（１９９４年）に
掲載の「第２０章、天然の及び処理されたペスト処理剤」と題するエベレットの
論文、並びに、米国特許第５，４２４，３９５号及び同第５，５１９，１１５号
を参照されたい。
【０００６】 ペプチドの不安定性の問題に対する別の提案された解決方法として、天然の抗
微生物ペプチドの逆またはレトロ類似体あるいはこれらの合成誘導体を形成する
ものがある。米国特許第５，５１９，１１５号及びPNAS、第９２巻、第３４４９
−５３頁（１９９５年）に掲載のメリフィールド(Merrifield)等の論文を参照さ
れたい。かかる逆ペプチド(reverse-peptide)は、内部プロテアーゼ−感応部位
の周囲の構造並びにＮ−及びＣ−末端の特性を除き、親ペプチドと同じ一般的な
３次元構造（例えば、アルファ−ヘリックス）を保持する。逆ペプチドは、非逆
の「通常の」ペプチドの生物活性を保持するだけでなく、抗微生物活性及び低い
溶血現象をはじめとする良好な特性を有する。Biol. Pharm. Bull.、第２０巻、
第２６７−７０頁（１９９７年）に掲載のイワホリ(Iwahori)等の論文を参照さ
れたい。
微生物ペプチドの逆またはレトロ類似体あるいはこれらの合成誘導体を形成する
ものがある。米国特許第５，５１９，１１５号及びPNAS、第９２巻、第３４４９
−５３頁（１９９５年）に掲載のメリフィールド(Merrifield)等の論文を参照さ
れたい。かかる逆ペプチド(reverse-peptide)は、内部プロテアーゼ−感応部位
の周囲の構造並びにＮ−及びＣ−末端の特性を除き、親ペプチドと同じ一般的な
３次元構造（例えば、アルファ−ヘリックス）を保持する。逆ペプチドは、非逆
の「通常の」ペプチドの生物活性を保持するだけでなく、抗微生物活性及び低い
溶血現象をはじめとする良好な特性を有する。Biol. Pharm. Bull.、第２０巻、
第２６７−７０頁（１９９７年）に掲載のイワホリ(Iwahori)等の論文を参照さ
れたい。
【０００７】 アミノ酸配列Ile-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Argを有す
るインドリシジンは、有力な抗微生物トリデカペプチドである。これは、本来、
ウシのニュートロフィルの細胞質グラニュールから精製される。J. Biol. Chem.
、第２６７巻、第４２９２−９５頁（１９９３年）に掲載のセルステッド(Selst
ed)等の論文を参照されたい。これは、異なる哺乳類、海の無脊椎動物及び昆虫
の血リンパから回収されるプロリンリッチのペプチド群の１つである。TIBTECH
、第１６巻、第８２−８８頁（１９９８年）に掲載のハンコック及びレーラーの
論文を参照されたい。天然及び合成のインドリシジンの抗微生物能力と同じであ
る。Int. J. Proten Res.、第４５巻、第４０１−０９頁に掲載のファン・アベ
ール(Van Abel)等の論文を参照されたい。インドリシジンの抗微生物活性の態様
は、チャンネルの形成による細胞質膜の崩壊に基づくものと報告されている。J.
Biol. Chem.、第３２巻、第１９２９８−３０３頁に掲載のファラ(Falla)等の
論文を参照されたい。より最近になって、膜の透過が、インドリシジン及びその
類似体による経膜チャンネルの形成ではなく、膜表面の変形により生ずるものと
考えられるとする報告がなされている。J. Biosci、第２３巻、第９−１３行に
掲載のスバラクシュミ(Subbalakshmi)の論文を参照されたい。
るインドリシジンは、有力な抗微生物トリデカペプチドである。これは、本来、
ウシのニュートロフィルの細胞質グラニュールから精製される。J. Biol. Chem.
、第２６７巻、第４２９２−９５頁（１９９３年）に掲載のセルステッド(Selst
ed)等の論文を参照されたい。これは、異なる哺乳類、海の無脊椎動物及び昆虫
の血リンパから回収されるプロリンリッチのペプチド群の１つである。TIBTECH
、第１６巻、第８２−８８頁（１９９８年）に掲載のハンコック及びレーラーの
論文を参照されたい。天然及び合成のインドリシジンの抗微生物能力と同じであ
る。Int. J. Proten Res.、第４５巻、第４０１−０９頁に掲載のファン・アベ
ール(Van Abel)等の論文を参照されたい。インドリシジンの抗微生物活性の態様
は、チャンネルの形成による細胞質膜の崩壊に基づくものと報告されている。J.
Biol. Chem.、第３２巻、第１９２９８−３０３頁に掲載のファラ(Falla)等の
論文を参照されたい。より最近になって、膜の透過が、インドリシジン及びその
類似体による経膜チャンネルの形成ではなく、膜表面の変形により生ずるものと
考えられるとする報告がなされている。J. Biosci、第２３巻、第９−１３行に
掲載のスバラクシュミ(Subbalakshmi)の論文を参照されたい。
【０００８】 インドリシジンの数多くの類似体が、抗微生物及び溶血活性の要件を評価しか
つ活性を高めるために、合成されて試験に供されている。スバラクシュミ（FEBS
Letters、第３９５巻、第４８−５２頁（１９９６年））等は、プロリンがアラ
ニンと置換され、かつ、トリプトファンがフェニルアラニンで置換されているペ
プチドは、インドリシジンと匹敵する抗微生物活性を呈すると報告している。し
かしながら、トリプトファンをフェニルアラニンで置換すると、溶血活性の損失
が生ずる。ファラ(Falla)とハンコック(Hancock)（Antimicrobial Agents and C
hemotherapy、第４１巻、第７７１−７５頁（１９９７年））は、正に帯電した
残分の数を多くし、長さを短くし（１３アミノ酸）、かつ、インドリシジンに対
する両親媒性を高めるように構成された、インドリシジンに基づく合成ペプチド
であるＣＰ−１１、Ile-Leu-Lys-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Argについ
て試験を行った。ＣＰ−１１は、大腸菌、緑膿菌及びカンジダアルビカンス(Can
dida albicans)に対して良好な活性を有するが、黄色ブドウ球菌に対しては活性
が低いことがわかった。リム(Lim)等（J. Biochem. Mol. Biol.、第３０巻、第
２２９−３３頁（１９９７年））は、インドリシジンにおけるある種のトリプト
ファン、プロリンまたはアルギニンを置換する作用に関して試験を行った。イソ
ロイシンまたはグリシンによるトリプトファン残分の置換は、許容されるが、プ
ロ７(Pro7)のアラニンによる置換は、大腸菌に対する活性を有意に低くしている
。アラニンによりＡｒｇ１２またはＡｒｇ１３の置換もまた、生物活性を低下さ
せている。
つ活性を高めるために、合成されて試験に供されている。スバラクシュミ（FEBS
Letters、第３９５巻、第４８−５２頁（１９９６年））等は、プロリンがアラ
ニンと置換され、かつ、トリプトファンがフェニルアラニンで置換されているペ
プチドは、インドリシジンと匹敵する抗微生物活性を呈すると報告している。し
かしながら、トリプトファンをフェニルアラニンで置換すると、溶血活性の損失
が生ずる。ファラ(Falla)とハンコック(Hancock)（Antimicrobial Agents and C
hemotherapy、第４１巻、第７７１−７５頁（１９９７年））は、正に帯電した
残分の数を多くし、長さを短くし（１３アミノ酸）、かつ、インドリシジンに対
する両親媒性を高めるように構成された、インドリシジンに基づく合成ペプチド
であるＣＰ−１１、Ile-Leu-Lys-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Argについ
て試験を行った。ＣＰ−１１は、大腸菌、緑膿菌及びカンジダアルビカンス(Can
dida albicans)に対して良好な活性を有するが、黄色ブドウ球菌に対しては活性
が低いことがわかった。リム(Lim)等（J. Biochem. Mol. Biol.、第３０巻、第
２２９−３３頁（１９９７年））は、インドリシジンにおけるある種のトリプト
ファン、プロリンまたはアルギニンを置換する作用に関して試験を行った。イソ
ロイシンまたはグリシンによるトリプトファン残分の置換は、許容されるが、プ
ロ７(Pro7)のアラニンによる置換は、大腸菌に対する活性を有意に低くしている
。アラニンによりＡｒｇ１２またはＡｒｇ１３の置換もまた、生物活性を低下さ
せている。
【０００９】 （発明の概要） 本発明者は、インドリシジン(indolicidin)がプロテアーゼによるタンパク質
分解に対して顕著な耐性を発揮することを見出した。本発明者はまた、Ｒｅｖ４
であるインドリシジンの逆ペプチド(reverse peptide)並びにインドリシジン及
びＲｅｖ４の誘導体及び類似体は、これらの特性を共有するとともに、抗微生物
特性を保持することを見出した。本発明者はまた、農業経済上重要な外因性即ち
非天然の(non-native)ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質（以下、「農業経
済上重要なタンパク質」("proteins of agronomic interest")と云う）は、イン
ドリシジン、Ｒｅｖ４及び関連する構造体の存在下で種々の活性部位及び基質特
異性を有する複数のクラスのプロテアーゼによる分解に対して、より大きな耐性
を呈することを見出した。
分解に対して顕著な耐性を発揮することを見出した。本発明者はまた、Ｒｅｖ４
であるインドリシジンの逆ペプチド(reverse peptide)並びにインドリシジン及
びＲｅｖ４の誘導体及び類似体は、これらの特性を共有するとともに、抗微生物
特性を保持することを見出した。本発明者はまた、農業経済上重要な外因性即ち
非天然の(non-native)ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質（以下、「農業経
済上重要なタンパク質」("proteins of agronomic interest")と云う）は、イン
ドリシジン、Ｒｅｖ４及び関連する構造体の存在下で種々の活性部位及び基質特
異性を有する複数のクラスのプロテアーゼによる分解に対して、より大きな耐性
を呈することを見出した。
【００１０】 本発明の一の観点によれば、抗微生物特性を発揮し、更に／あるいは植物に施
用され及び／または植物により生産される他のタンパク質をタンパク質分解性の
分解(proteolytic degradation)に対して一層耐性のあるものとするＲｅｖ４ま
たはその機能同等物(functional equivalent)であり、該Ｒｅｖ４またはその機
能同等物を含み、あるいは該Ｒｅｖ４またはその機能同等物から実質上構成され
る、単離されかつ精製されたペプチドが提供されている。本発明のこの観点によ
ればまた、Ｒｅｖ４をエンコードする(encode)配列及びこのＲｅｖ４エンコード
配列を含むベクタのような核酸構造体を含みあるいはこれらを主成分とする核酸
も提供されている。この観点によれば更に、植物及び細菌（例えば、アグロバク
テリウムチュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のような組み換え細
胞並びにＲｅｖ４エンコード配列を含む原形質体も提供されている。Ｒｅｖ４エ
ンコード核酸を発現する遺伝形質転換植物(transgenic plant)は、植物に感染す
る微生物病原体に対して高い耐性を発揮する。遺伝形質転換植物は、形質転換さ
れた原形質体または形質転換された植物組織から植物を再生する技術を含む標準
的な技術に従ってつくることができる。本発明のこの観点に係る更に別の実施の
形態は、遺伝形質転換植物組織から得られる種子に関する。更に別の実施の形態
においては、微生物感染に対する大きな耐性は、Ｒｅｖ４タンパク質またはその
機能同等物を含む組成物を植物に施用することにより、所定の植物種に付与する
ことができる。これらの組成物は、乾燥粉末体または噴霧などに適した液体分散
体の形態とすることができる。
用され及び／または植物により生産される他のタンパク質をタンパク質分解性の
分解(proteolytic degradation)に対して一層耐性のあるものとするＲｅｖ４ま
たはその機能同等物(functional equivalent)であり、該Ｒｅｖ４またはその機
能同等物を含み、あるいは該Ｒｅｖ４またはその機能同等物から実質上構成され
る、単離されかつ精製されたペプチドが提供されている。本発明のこの観点によ
ればまた、Ｒｅｖ４をエンコードする(encode)配列及びこのＲｅｖ４エンコード
配列を含むベクタのような核酸構造体を含みあるいはこれらを主成分とする核酸
も提供されている。この観点によれば更に、植物及び細菌（例えば、アグロバク
テリウムチュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のような組み換え細
胞並びにＲｅｖ４エンコード配列を含む原形質体も提供されている。Ｒｅｖ４エ
ンコード核酸を発現する遺伝形質転換植物(transgenic plant)は、植物に感染す
る微生物病原体に対して高い耐性を発揮する。遺伝形質転換植物は、形質転換さ
れた原形質体または形質転換された植物組織から植物を再生する技術を含む標準
的な技術に従ってつくることができる。本発明のこの観点に係る更に別の実施の
形態は、遺伝形質転換植物組織から得られる種子に関する。更に別の実施の形態
においては、微生物感染に対する大きな耐性は、Ｒｅｖ４タンパク質またはその
機能同等物を含む組成物を植物に施用することにより、所定の植物種に付与する
ことができる。これらの組成物は、乾燥粉末体または噴霧などに適した液体分散
体の形態とすることができる。
【００１１】 本発明の別の観点は、タンパク質分解性の分解を受け易い非天然の(non-nativ
e)タンパク質のタンパク質分解性の分解の程度を低減させ、あるいはかかる分解
を抑制する方法に関する。この方法は、植物インドリシジンに、抗病原性タンパ
ク質のような問題の非天然タンパク質の投与と同時にまたはこの投与の後に、Ｒ
ｅｖ４またはその機能同等物を投与するものである。上記したＲｅｖ４含有組成
物の場合のようなＲｅｖ４またはインドリシジンの「投与」は、植物への直接施
用によりまたは遺伝子工学技術により行うことができ、これにより遺伝形質転換
植物が生産される。遺伝形質転換の場合には、Ｒｅｖ４またはインドリシジンを
含む非天然構造体は、問題の非天然タンパク質をエンコードする非天然ＤＮＡの
発現の前、発現の際または発現の後に適宜発現するように構成することができる
。この方法はまた、植物に施用されまたは植物により生産される所定の非天然タ
ンパク質の活性を保存しまたは高める方法として説明することもでき、この非天
然タンパク質は、タンパク質分解性の分解を受け易い。好ましい実施の形態にお
いては、遺伝形質転換植物は、Ｒｅｖ４、インドリシジンまたはその機能同等物
をエンコードする第１の配列と、問題のタンパク質をエンコードする第２の配列
とを含む組み換え核酸分子を含む。
e)タンパク質のタンパク質分解性の分解の程度を低減させ、あるいはかかる分解
を抑制する方法に関する。この方法は、植物インドリシジンに、抗病原性タンパ
ク質のような問題の非天然タンパク質の投与と同時にまたはこの投与の後に、Ｒ
ｅｖ４またはその機能同等物を投与するものである。上記したＲｅｖ４含有組成
物の場合のようなＲｅｖ４またはインドリシジンの「投与」は、植物への直接施
用によりまたは遺伝子工学技術により行うことができ、これにより遺伝形質転換
植物が生産される。遺伝形質転換の場合には、Ｒｅｖ４またはインドリシジンを
含む非天然構造体は、問題の非天然タンパク質をエンコードする非天然ＤＮＡの
発現の前、発現の際または発現の後に適宜発現するように構成することができる
。この方法はまた、植物に施用されまたは植物により生産される所定の非天然タ
ンパク質の活性を保存しまたは高める方法として説明することもでき、この非天
然タンパク質は、タンパク質分解性の分解を受け易い。好ましい実施の形態にお
いては、遺伝形質転換植物は、Ｒｅｖ４、インドリシジンまたはその機能同等物
をエンコードする第１の配列と、問題のタンパク質をエンコードする第２の配列
とを含む組み換え核酸分子を含む。
【００１２】 本発明の一の観点は、アミノ酸配列Arg-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Lys-Tr
p-Pro-Leu-Ile (「Rev4」)、抗微生物及び抗タンパク質分解特性とを有するＲｅ
ｖ４の類似体及び誘導体、これらのペプチドをエンコードする核酸、更には核酸
構造体からなる合成ペプチドに関するものであり、核酸を含むベクタ及びホスト
も開示されている。
p-Pro-Leu-Ile (「Rev4」)、抗微生物及び抗タンパク質分解特性とを有するＲｅ
ｖ４の類似体及び誘導体、これらのペプチドをエンコードする核酸、更には核酸
構造体からなる合成ペプチドに関するものであり、核酸を含むベクタ及びホスト
も開示されている。
【００１３】 本発明の他の観点によれば、プロテアーゼによる分解または不活性化に対する
農業経済上重要なタンパク質、ペプチド及びポリペプチドの耐性を高める、即ち
、プロテアーゼ分解の程度を低くする方法が提供されている。好ましい実施の形
態においては、本発明のペプチドをエンコードするＤＮＡは、抗かび性(antifun
gal)、抗細菌性(antibacterial)、抗ウイルス性及び殺虫性タンパク質をエンコ
ードする他の非天然核酸と共発現され(co-expressed)、あるいは問題の他の好ま
しいタンパク質は、植物にとって有利であり及び／または植物の病気や病原体に
対する耐性を付与する。
農業経済上重要なタンパク質、ペプチド及びポリペプチドの耐性を高める、即ち
、プロテアーゼ分解の程度を低くする方法が提供されている。好ましい実施の形
態においては、本発明のペプチドをエンコードするＤＮＡは、抗かび性(antifun
gal)、抗細菌性(antibacterial)、抗ウイルス性及び殺虫性タンパク質をエンコ
ードする他の非天然核酸と共発現され(co-expressed)、あるいは問題の他の好ま
しいタンパク質は、植物にとって有利であり及び／または植物の病気や病原体に
対する耐性を付与する。
【００１４】 本発明によればまた、Ｒｅｖ４及びその生物学的機能同等物をエンコードする
配列を有する核酸及び遺伝構造体が提供されているとともに、かかる核酸シーケ
ンス及び遺伝構造体を宿主細胞に挿入し、これによりエンコードされるペプチド
を生産する方法が提供されている。
配列を有する核酸及び遺伝構造体が提供されているとともに、かかる核酸シーケ
ンス及び遺伝構造体を宿主細胞に挿入し、これによりエンコードされるペプチド
を生産する方法が提供されている。
【００１５】 遺伝形質転換植物、その一部またはその細胞及び植物から得られる種子も含ま
れる。
れる。
【００１６】 本発明によれば更に、本発明に係るペプチドをエンコードする核酸配列を含む
組み換え微生物及び原形質体が提供されている。
組み換え微生物及び原形質体が提供されている。
【００１７】 本発明によればまた、本発明のペプチドの少なくとも１つを、少なくとも１つ
の抗かび剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤または殺虫剤とともに含む抗病原体組成物
が提供されている。
の抗かび剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤または殺虫剤とともに含む抗病原体組成物
が提供されている。
【００１８】 本発明の組成物はまた、本発明のペプチドを生産する細菌（例えば、アグロバ
クテリウムチュメファシエンス）及びかび細胞(fungal cell)のような組み換え
宿主細胞と、少なくとも１つの抗病原体タンパク質とを含む。好ましい実施の形
態においては、この組成物は、根及び／または葉に施用される。細胞は、植物の
根及び／または葉に棲みつく。
クテリウムチュメファシエンス）及びかび細胞(fungal cell)のような組み換え
宿主細胞と、少なくとも１つの抗病原体タンパク質とを含む。好ましい実施の形
態においては、この組成物は、根及び／または葉に施用される。細胞は、植物の
根及び／または葉に棲みつく。
【００１９】 （発明の詳細な説明） 本明細書においては、文献をはじめとする本明細書に記載の刊行物の内容を引
用して、その説明に代える。
用して、その説明に代える。
【００２０】 「機能同等ペプチド」("functional equivalent peptide")とは、インドリシ
ジン及びＲｅｖ４と配列類似性を示すとともに、同じまたは類似の抗微生物活性
及び／またはプロテアーゼによる分解もしくは不活性化に対する他のタンパク質
の耐性を高める能力を示すインドリシジン及びＲｅｖ４のペプチド、ポリペプチ
ド、タンパク質誘導体及び類似体を含むものである。これらの特性は、本明細書
に記載の実施例７−１３に説明されている方法により定めることができる。
ジン及びＲｅｖ４と配列類似性を示すとともに、同じまたは類似の抗微生物活性
及び／またはプロテアーゼによる分解もしくは不活性化に対する他のタンパク質
の耐性を高める能力を示すインドリシジン及びＲｅｖ４のペプチド、ポリペプチ
ド、タンパク質誘導体及び類似体を含むものである。これらの特性は、本明細書
に記載の実施例７−１３に説明されている方法により定めることができる。
【００２１】 機能同等ペプチドはまた、保存アミノ酸変更体(conservative amino acid cha
nges)を含有するアミノ酸配列も含む。かかるアミノ酸配列においては、基本的
な配列における１つ以上のアミノ酸は、別のアミノ酸で置換され、その電荷及び
極性は天然アミノ酸、即ち、保存アミノ酸置換体と同様であるので、沈黙変更体
(silent change)である。このアミノ酸は、タンパク質において広く見受けられ
る２０Ｌ−アミノ酸に対応するＤ−アミノ酸、イミノアミノ酸、ヒドロキシリシ
ンのような稀アミノ酸(rare amino acid)、ホムセリン(homserine)及びオルニチ
ン(ornithine)のような非タンパク質アミノ酸のいずれも含むことができる。ペ
プチドは、これらの誘導体及びＤ−アミノ酸を含まなくてもよく、あるいは１つ
または２つ以上を含むことができる。
nges)を含有するアミノ酸配列も含む。かかるアミノ酸配列においては、基本的
な配列における１つ以上のアミノ酸は、別のアミノ酸で置換され、その電荷及び
極性は天然アミノ酸、即ち、保存アミノ酸置換体と同様であるので、沈黙変更体
(silent change)である。このアミノ酸は、タンパク質において広く見受けられ
る２０Ｌ−アミノ酸に対応するＤ−アミノ酸、イミノアミノ酸、ヒドロキシリシ
ンのような稀アミノ酸(rare amino acid)、ホムセリン(homserine)及びオルニチ
ン(ornithine)のような非タンパク質アミノ酸のいずれも含むことができる。ペ
プチドは、これらの誘導体及びＤ−アミノ酸を含まなくてもよく、あるいは１つ
または２つ以上を含むことができる。
【００２２】 アミノ酸残分(reside)の置換体、付加物、欠失体(deletion)及び非天然産誘導
体もまた、本発明の機能同等ペプチドの範囲に含まれる。
体もまた、本発明の機能同等ペプチドの範囲に含まれる。
【００２３】 基本ポリペプチド配列内のアミノ酸置換体は、天然産のアミノ酸が属するクラ
スの他の要素から選択するのが好ましい。表１を参照されたい。アミノ酸は、典
型的には、（１）酸性アミノ酸、（２）塩基性アミノ酸、（３）中性の極性アミ
ノ酸及び（４）中性の非極性アミノ酸の４つのグループに分けられる。基本ポリ
ペプチド配列内の保存アミノ酸変更体は、同じグループ内の１つのアミノ酸を置
換することによりつくられる。
スの他の要素から選択するのが好ましい。表１を参照されたい。アミノ酸は、典
型的には、（１）酸性アミノ酸、（２）塩基性アミノ酸、（３）中性の極性アミ
ノ酸及び（４）中性の非極性アミノ酸の４つのグループに分けられる。基本ポリ
ペプチド配列内の保存アミノ酸変更体は、同じグループ内の１つのアミノ酸を置
換することによりつくられる。
【表１】
【００２４】 インドリシジン及びＲｅｖ４の好ましい同等物は、下記の配列（１）及び（２
）により表される。 (1) Y-Y-Y-Y-X-Y-Y-Y-Y-Y-X-X (2) X-X-Y-Y-Y-Y-Y-X-Y-Y-Y-Y
）により表される。 (1) Y-Y-Y-Y-X-Y-Y-Y-Y-Y-X-X (2) X-X-Y-Y-Y-Y-Y-X-Y-Y-Y-Y
【００２５】 上記配列において、各Ｘは個別に、アルギニン、リシンまたはヒスチジンであ
り、各Ｙは個別に、トリプトファン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンまたはリシンである。
り、各Ｙは個別に、トリプトファン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンまたはリシンである。
【００２６】 別の好ましい実施の形態においては、本発明に含まれる機能同等蛋白質は、約
７０％以上の配列類似性、より好ましくは約８０％以上の配列類似性、最も好ま
しくは９０％以上の配列類似性を有する。
７０％以上の配列類似性、より好ましくは約８０％以上の配列類似性、最も好ま
しくは９０％以上の配列類似性を有する。
【００２７】 Ｎ−またはＣ−末端(terminal)残分を含む、配列におけるペプチド残分のいず
れかを変更することも本発明の範囲に含まれる。ペプチドは、例えば、メチル化
及びアミド化、並びに、アシル化のごときアミノ酸側鎖の変更のような化学的ま
たは生物学的手段により変えることができる。ペプチドは、放射性ラベル、蛍光
ラベル、質量分析タグ、ビオチンなどを用いるなどにより標識処理をすることが
できる。ペプチドはまた、Ｎ−及びＣ−末端に対するアミノ酸の付加物も含む。
例えば、グリシン残分をＣ−末端に付加して、Ｃ−末端アミド化の前駆体を提供
することができる。TIBS、第１６巻、第１１２頁（１９９１年）に掲載のエイエ
フ・ブラッドバリー(A.F. Bradburry)及びディージー・スミス(D.G. Smyth)の論
文を参照されたい。
れかを変更することも本発明の範囲に含まれる。ペプチドは、例えば、メチル化
及びアミド化、並びに、アシル化のごときアミノ酸側鎖の変更のような化学的ま
たは生物学的手段により変えることができる。ペプチドは、放射性ラベル、蛍光
ラベル、質量分析タグ、ビオチンなどを用いるなどにより標識処理をすることが
できる。ペプチドはまた、Ｎ−及びＣ−末端に対するアミノ酸の付加物も含む。
例えば、グリシン残分をＣ−末端に付加して、Ｃ−末端アミド化の前駆体を提供
することができる。TIBS、第１６巻、第１１２頁（１９９１年）に掲載のエイエ
フ・ブラッドバリー(A.F. Bradburry)及びディージー・スミス(D.G. Smyth)の論
文を参照されたい。
【００２８】 ペプチドはまた、問題のタンパク質に共役させ(conjugate)、融合させ(fuse)
あるいは架橋させることができる。これには、例えば、アミノ酸配列Ser-Arg-Ar
g-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Leu-Ileを有するSer-Rev4-OH及びアミ
ノ酸配列Arg-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-=Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Leu-Ile-Gly-Gly-Gly
-Tyr-Asp-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Proを有するＲｅｖ４−Ｃ−融合が含ま
れる。
あるいは架橋させることができる。これには、例えば、アミノ酸配列Ser-Arg-Ar
g-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Leu-Ileを有するSer-Rev4-OH及びアミ
ノ酸配列Arg-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-=Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Leu-Ile-Gly-Gly-Gly
-Tyr-Asp-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Proを有するＲｅｖ４−Ｃ−融合が含ま
れる。
【００２９】 本発明のペプチドは、例えば、化学合成、自動化処理による合成、微生物、植
物及び動物系のような異種生物系における合成、組織培養、細胞培養またはビト
ロ翻訳系をはじめとする標準的な技術に従って合成することができる。例えば、
ペプチドは、ＨＡＴＵを用いた標準的な固相Ｆｍｏｃ保護技術をカップリング剤
として使用して合成することができる。別の合成技術には、ｔ−Ｂｏｃ保護技術
及び異なるカップリング試薬の使用が含まれる。
物及び動物系のような異種生物系における合成、組織培養、細胞培養またはビト
ロ翻訳系をはじめとする標準的な技術に従って合成することができる。例えば、
ペプチドは、ＨＡＴＵを用いた標準的な固相Ｆｍｏｃ保護技術をカップリング剤
として使用して合成することができる。別の合成技術には、ｔ−Ｂｏｃ保護技術
及び異なるカップリング試薬の使用が含まれる。
【００３０】 本発明はまた、本発明のペプチドをエンコードする配列からなるまたは実質上
なる核酸配列を含む。核酸配列には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコン
ドリアＤＮＡ、クロロプラストＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮ
Ａ及びｍＲＮＡヌクレオチド配列が含まれる。
なる核酸配列を含む。核酸配列には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコン
ドリアＤＮＡ、クロロプラストＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮ
Ａ及びｍＲＮＡヌクレオチド配列が含まれる。
【００３１】 本発明はまた、本発明の核酸を備えた核酸構造体及びかかる核酸を宿主細胞に
挿入する方法に関する。好ましくは、核酸構造体は、プロモータ配列と、Ｒｅｖ
４または機能同等物をエンコードする配列とを含む。核酸配列は、例えば、微生
物、かび及び植物を含むペプチドの生産に適した種々の宿主系に挿入することが
できる。本発明において使用するのに適したプロモータには、例えば、ＣａＭＶ
及びブラジカ(Brassica)ＡＬＳ３のような広範な発現プロモータ、トウモロコシ
ＺＲＰ２のような組織／細胞タイプの特定のプロモータ、ＨＭＧ２及びタバコｈ
ｓｒ２０３Ｊのような病原体誘導プロモータ、ジャガイモｐｉｎＩＩ、ジャガイ
モｗｕｎ１及びポプラＷｉｎ６のような害虫／傷誘導性プロモータ、アラビドプ
シス(Arabidopsis)ｒｄ２９Ａ及びアラビドプシスａｄｈのようなストレス誘導
性プロモータ、並びに、小麦Ｅｍ、ダイズＧＨ３及びジャガイモＣＤＩのような
化学的に誘導されるプロモータが含まれる。
挿入する方法に関する。好ましくは、核酸構造体は、プロモータ配列と、Ｒｅｖ
４または機能同等物をエンコードする配列とを含む。核酸配列は、例えば、微生
物、かび及び植物を含むペプチドの生産に適した種々の宿主系に挿入することが
できる。本発明において使用するのに適したプロモータには、例えば、ＣａＭＶ
及びブラジカ(Brassica)ＡＬＳ３のような広範な発現プロモータ、トウモロコシ
ＺＲＰ２のような組織／細胞タイプの特定のプロモータ、ＨＭＧ２及びタバコｈ
ｓｒ２０３Ｊのような病原体誘導プロモータ、ジャガイモｐｉｎＩＩ、ジャガイ
モｗｕｎ１及びポプラＷｉｎ６のような害虫／傷誘導性プロモータ、アラビドプ
シス(Arabidopsis)ｒｄ２９Ａ及びアラビドプシスａｄｈのようなストレス誘導
性プロモータ、並びに、小麦Ｅｍ、ダイズＧＨ３及びジャガイモＣＤＩのような
化学的に誘導されるプロモータが含まれる。
【００３２】 別の調整配列もまた、この構造体に含ませることができる。かかる配列には、
例えば、エンハンサ、リプレッサ、リボゾーム結合部位、転写終結信号配列、分
泌信号配列、複製の起源、選択性マーカなどが含まれる。調整配列は、操作上互
いに連係させることにより、転写及びその後の翻訳を許容することができる。
例えば、エンハンサ、リプレッサ、リボゾーム結合部位、転写終結信号配列、分
泌信号配列、複製の起源、選択性マーカなどが含まれる。調整配列は、操作上互
いに連係させることにより、転写及びその後の翻訳を許容することができる。
【００３３】 リポータ遺伝子もまた、転写及び翻訳を監視するために構造体に含ませること
ができる。好ましい実施の形態においては、Ｒｅｖ４または機能同等物をエンコ
ードする核酸配列は、発現ベクタを使用して植物に導入される。多くの発現ベク
タが、細菌、プラスミド及びウイルスを含む組み換え植物の生産のために開発さ
れている。本発明に適した植物ウイルスベクタには、例えば、米国特許第５，３
１６，９３１号に記載されているものがる。本発明のタンパク質及び核酸は、植
物に投与される。Ｒｅｖ４を発現する遺伝形質転換植物は、微生物植物病原体に
よる感染に対して耐性を呈する。
ができる。好ましい実施の形態においては、Ｒｅｖ４または機能同等物をエンコ
ードする核酸配列は、発現ベクタを使用して植物に導入される。多くの発現ベク
タが、細菌、プラスミド及びウイルスを含む組み換え植物の生産のために開発さ
れている。本発明に適した植物ウイルスベクタには、例えば、米国特許第５，３
１６，９３１号に記載されているものがる。本発明のタンパク質及び核酸は、植
物に投与される。Ｒｅｖ４を発現する遺伝形質転換植物は、微生物植物病原体に
よる感染に対して耐性を呈する。
【００３４】 別の実施の形態においては、遺伝形質転換植物は、インドリシジンまたはＲｅ
ｖ４と、非天然タンパク質の双方を生産する。遺伝形質転換植物は、インドリシ
ジン、Ｒｅｖ４または発現する機能同等物をエンコードするＤＮＡ配列を含むゲ
ノムを有する植物をつくることにより生産される。好ましくは、遺伝形質転換植
物は、原形質体を、インドリシジン、Ｒｅｖ４または機能同等物をエンコードす
るＤＮＡ配列で安定に形質転換することにより得られる。遺伝形質転換植物はま
た、この植物を、ＤＮＡ分子を含む植物組織から導入して再生することにより得
ることもできる。
ｖ４と、非天然タンパク質の双方を生産する。遺伝形質転換植物は、インドリシ
ジン、Ｒｅｖ４または発現する機能同等物をエンコードするＤＮＡ配列を含むゲ
ノムを有する植物をつくることにより生産される。好ましくは、遺伝形質転換植
物は、原形質体を、インドリシジン、Ｒｅｖ４または機能同等物をエンコードす
るＤＮＡ配列で安定に形質転換することにより得られる。遺伝形質転換植物はま
た、この植物を、ＤＮＡ分子を含む植物組織から導入して再生することにより得
ることもできる。
【００３５】 好ましくは、本発明のペプチドは、抗細菌性、抗かび性、抗ウイルス性及び／
または殺虫性タンパク質とともに共発現され、農業経済上重要なタンパク質には
、バチルスサリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)（Ｂ．ｔ．）、他のバチ
ルス種またはフォトルハブダス(Photorhabdus)もしくはキセノルハブダス(Xenor
habdus)種から得られるタンパク質；植物生産物の質または植物の農業経済性の
改良に関するタンパク質、並びに、抽出のために植物において生産されるべきで
あり、かつ、薬剤生成物、農業生産物、飼料もしくは食品添加物、工業的な酵素
として使用されるペプチドまたはタンパク質；抽出することができ、かつ、商業
上の価値がある殺かび剤もしくは殺虫剤及び特殊化学薬品もしくは化学中間物の
ような薬剤生成物、飼料及び食品添加物、農業製品として使用することができる
代謝産物を生産することができる植物代謝を変更させるペプチドまたはタンパク
質が含まれる。
または殺虫性タンパク質とともに共発現され、農業経済上重要なタンパク質には
、バチルスサリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)（Ｂ．ｔ．）、他のバチ
ルス種またはフォトルハブダス(Photorhabdus)もしくはキセノルハブダス(Xenor
habdus)種から得られるタンパク質；植物生産物の質または植物の農業経済性の
改良に関するタンパク質、並びに、抽出のために植物において生産されるべきで
あり、かつ、薬剤生成物、農業生産物、飼料もしくは食品添加物、工業的な酵素
として使用されるペプチドまたはタンパク質；抽出することができ、かつ、商業
上の価値がある殺かび剤もしくは殺虫剤及び特殊化学薬品もしくは化学中間物の
ような薬剤生成物、飼料及び食品添加物、農業製品として使用することができる
代謝産物を生産することができる植物代謝を変更させるペプチドまたはタンパク
質が含まれる。
【００３６】 より好ましい実施の形態においては、遺伝形質転換植物は、インドリシジンま
たはＲｅｖ４及びマゲイニン(Magainins)、逆(reverse)マゲイニン、ＰＧＬｃ、
逆ＰＧＬｃ、ＰＩ、逆ＰＩ、セクロピン(Cecropins)、逆セクロピン、サルコト
キシン(Sarcotoxins)、逆サルコトキシン、ボンビニン(Bombinin)、逆ボンビニ
ン、ＸＰＦ、逆ＸＰＦ、チオニン、逆チオニン、デフェンシン(Defensin)、逆デ
フェンシン、メリチン(Melittins)、逆メリチン、ＰＧＬａ、逆ＰＧＬａ、デル
マセプチン(Dermaseptin)、逆デルマセプチン、ヒスタチン(Histatin)、逆ヒス
タチン、ブタ骨髄細胞から誘導されるペプチド、ヒト好中球カテプシンＧから誘
導されるペプチド、ウシ好中球から誘導される抗微生物ペプチド、セミナルプラ
スミン(Seminalplasmin)、ラクトフェリン(Lactoferrin)から誘導される抗微生
物剤、ドロソシン(Drosocin)、タチプレシン(Tachyplesin)、逆タチプレシン、
トウモロコシ塩基ペプチドＩ、トラキアル(Tracheal)抗微生物ペプチド、アマラ
ンス(amaranth)の種子からの抗微生物ペプチド、ミラビリスジャラパ(Mirabilis
jalapa)の種子からの抗微生物ペプチド、ラナレキシン(Ranalexin)、ブレベニ
ン(Brevenin)、スブチリン(Subtilin)、ニシン(Nishin)、エピダーミン(Epiderm
in)、ラクタシン(Lactacin)４８１及び塩基性の両親媒性(amphipathic)ペプチド
を共生産する。
たはＲｅｖ４及びマゲイニン(Magainins)、逆(reverse)マゲイニン、ＰＧＬｃ、
逆ＰＧＬｃ、ＰＩ、逆ＰＩ、セクロピン(Cecropins)、逆セクロピン、サルコト
キシン(Sarcotoxins)、逆サルコトキシン、ボンビニン(Bombinin)、逆ボンビニ
ン、ＸＰＦ、逆ＸＰＦ、チオニン、逆チオニン、デフェンシン(Defensin)、逆デ
フェンシン、メリチン(Melittins)、逆メリチン、ＰＧＬａ、逆ＰＧＬａ、デル
マセプチン(Dermaseptin)、逆デルマセプチン、ヒスタチン(Histatin)、逆ヒス
タチン、ブタ骨髄細胞から誘導されるペプチド、ヒト好中球カテプシンＧから誘
導されるペプチド、ウシ好中球から誘導される抗微生物ペプチド、セミナルプラ
スミン(Seminalplasmin)、ラクトフェリン(Lactoferrin)から誘導される抗微生
物剤、ドロソシン(Drosocin)、タチプレシン(Tachyplesin)、逆タチプレシン、
トウモロコシ塩基ペプチドＩ、トラキアル(Tracheal)抗微生物ペプチド、アマラ
ンス(amaranth)の種子からの抗微生物ペプチド、ミラビリスジャラパ(Mirabilis
jalapa)の種子からの抗微生物ペプチド、ラナレキシン(Ranalexin)、ブレベニ
ン(Brevenin)、スブチリン(Subtilin)、ニシン(Nishin)、エピダーミン(Epiderm
in)、ラクタシン(Lactacin)４８１及び塩基性の両親媒性(amphipathic)ペプチド
を共生産する。
【００３７】 植物において見出されるプロテアーゼによる分解または不活性化から第２のタ
ンパク質を保護することができるペプチドの共生産(co-production)は、多くの
異なる状況において有利である。例えば、第２のタンパク質が、抗かび性、抗細
菌性、抗ウイルス性または殺虫活性を有するが、植物プロテアーゼによる分解ま
たは不活性化を受けやすい場合には、本発明は、２つ以上の作用モードをとる複
数の抗微生物タンパク質を使用して、病原体により引き起こされる病気から植物
を保護することができる。かくして、この共生産により、病原体の耐性株の発現
の可能性を低くし、かつ、植物の耐病気性の範囲を広げるとともに、植物病原体
の相乗的な制御を行うことができる。第２のペプチド、ポリペプチドまたはタン
パク質が、侵入する植物病原体に固有のプロテアーゼによる分解または不活性化
を受けやすい場合には、本発明を使用することにより、特定の抗病原体タンパク
質が活性となる病原体の範囲を広げることができる。かくして、植物組織の細胞
抽出物全体に存在するプロテアーゼの複雑な混合物による分解または不活性化に
対するペプチドを著しく安定にすることができるので、本発明は、昆虫または収
穫後の取り扱いにより損傷を受けた植物組織の抗微生物活性を保持するのに特に
有用である。
ンパク質を保護することができるペプチドの共生産(co-production)は、多くの
異なる状況において有利である。例えば、第２のタンパク質が、抗かび性、抗細
菌性、抗ウイルス性または殺虫活性を有するが、植物プロテアーゼによる分解ま
たは不活性化を受けやすい場合には、本発明は、２つ以上の作用モードをとる複
数の抗微生物タンパク質を使用して、病原体により引き起こされる病気から植物
を保護することができる。かくして、この共生産により、病原体の耐性株の発現
の可能性を低くし、かつ、植物の耐病気性の範囲を広げるとともに、植物病原体
の相乗的な制御を行うことができる。第２のペプチド、ポリペプチドまたはタン
パク質が、侵入する植物病原体に固有のプロテアーゼによる分解または不活性化
を受けやすい場合には、本発明を使用することにより、特定の抗病原体タンパク
質が活性となる病原体の範囲を広げることができる。かくして、植物組織の細胞
抽出物全体に存在するプロテアーゼの複雑な混合物による分解または不活性化に
対するペプチドを著しく安定にすることができるので、本発明は、昆虫または収
穫後の取り扱いにより損傷を受けた植物組織の抗微生物活性を保持するのに特に
有用である。
【００３８】 同様に、潜在的に不安定なタンパク質を、植物組織からの抽出の際に過度のプ
ロテアーゼ分解または不活性化から保護することができる。第２のタンパク質が
殺虫性を有する場合には、本発明は、殺虫性タンパク質を植物プロテアーゼに対
して安定にするとともに、植物の健康な植物組織及び生きている別のプロテアー
ゼまたは昆虫に高濃度で蓄積する機構を提供することができる。昆虫または微生
物により引き起こされる損傷から、飼料、食品その他の製品を保護するためには
、インドリシジン及びＲｅｖ４ペプチドは、飼料、食品その他の製品の成分であ
る植物の部分により生産されてはならない。ペプチドは、収穫後の処理及び配合
の際に加えることができる。
ロテアーゼ分解または不活性化から保護することができる。第２のタンパク質が
殺虫性を有する場合には、本発明は、殺虫性タンパク質を植物プロテアーゼに対
して安定にするとともに、植物の健康な植物組織及び生きている別のプロテアー
ゼまたは昆虫に高濃度で蓄積する機構を提供することができる。昆虫または微生
物により引き起こされる損傷から、飼料、食品その他の製品を保護するためには
、インドリシジン及びＲｅｖ４ペプチドは、飼料、食品その他の製品の成分であ
る植物の部分により生産されてはならない。ペプチドは、収穫後の処理及び配合
の際に加えることができる。
【００３９】 本発明におけるペプチドの発現または施用に適した植物には、顕花植物、好ま
しくは、作物植物、例えば、単子葉植物及び双子葉植物がある。より好ましくは
、トウモロコシ、トマト、芝生草(turfglass)、アスパラガス、パパイヤ、ヒマ
ワリ、ライ麦、豆、ショウガ、ハス、竹、ジャガイモ、米、ピーナツ、大麦、麦
芽、小麦、アルファルファ、大豆、オート麦、ナス、玉ネギ、ブロッコリ、サト
ウキビ、甜菜、ビート、リンゴ、オレンジ、グレープフルーツ、西洋ナシ、プラ
ム、モモ、パイナップル、ブドウ、バラ、カーネーション、ひなぎく、チューリ
ップ、ベイマツ、西洋スギ、ストロブマツ、欧州アカマツ、トウヒ、エンドウ、
綿、亜麻、コーヒー及びタバコが含まれる。
しくは、作物植物、例えば、単子葉植物及び双子葉植物がある。より好ましくは
、トウモロコシ、トマト、芝生草(turfglass)、アスパラガス、パパイヤ、ヒマ
ワリ、ライ麦、豆、ショウガ、ハス、竹、ジャガイモ、米、ピーナツ、大麦、麦
芽、小麦、アルファルファ、大豆、オート麦、ナス、玉ネギ、ブロッコリ、サト
ウキビ、甜菜、ビート、リンゴ、オレンジ、グレープフルーツ、西洋ナシ、プラ
ム、モモ、パイナップル、ブドウ、バラ、カーネーション、ひなぎく、チューリ
ップ、ベイマツ、西洋スギ、ストロブマツ、欧州アカマツ、トウヒ、エンドウ、
綿、亜麻、コーヒー及びタバコが含まれる。
【００４０】 本発明においてはまた、インドリシジンまたはＲｅｖ４をエンコードする核酸
配列または構造体を使用して、組み換えベクタ、例えば、植物の病気に対する耐
性を付与するとともにペプチド、ポリペプチド及びタンパク質に対して安定性を
付与するペプチドをエンコードする関連のある核酸配列を識別するのに有用なプ
ライマ、プラスミド、組み換え微生物及びプローブを得ることができる。ペプチ
ドは、細菌、酵母、昆虫及び哺乳類の細胞を含む種々の宿主系を使用して組み換
え生産により合成することができる。
配列または構造体を使用して、組み換えベクタ、例えば、植物の病気に対する耐
性を付与するとともにペプチド、ポリペプチド及びタンパク質に対して安定性を
付与するペプチドをエンコードする関連のある核酸配列を識別するのに有用なプ
ライマ、プラスミド、組み換え微生物及びプローブを得ることができる。ペプチ
ドは、細菌、酵母、昆虫及び哺乳類の細胞を含む種々の宿主系を使用して組み換
え生産により合成することができる。
【００４１】 本発明によればまた、インドリシジンまたはＲｅｖ４を、少なくとも１つの他
の抗かび性、抗細菌性、抗ウイルス性または殺虫性タンパク質とともに含む抗病
原体組成物が提供されている。この組成物は、適宜のキャリヤを使用して従来の
方法により配合することができる。本技術分野において周知の不活性材料、界面
活性剤、溶媒その他の添加物のような他の成分も、組成物に加えることができる
。この組成物はまた、肥料、殺虫剤、抗かび剤、誘因剤、殺菌剤、ダニ駆除剤、
線虫駆除剤(nematode)及び除草剤と組み合わせることもできる。
の抗かび性、抗細菌性、抗ウイルス性または殺虫性タンパク質とともに含む抗病
原体組成物が提供されている。この組成物は、適宜のキャリヤを使用して従来の
方法により配合することができる。本技術分野において周知の不活性材料、界面
活性剤、溶媒その他の添加物のような他の成分も、組成物に加えることができる
。この組成物はまた、肥料、殺虫剤、抗かび剤、誘因剤、殺菌剤、ダニ駆除剤、
線虫駆除剤(nematode)及び除草剤と組み合わせることもできる。
【００４２】 インドリシジンまたはＲｅｖ４は、約１μｇ／ｍｌ乃至約５０μｇ／ｍｌの範
囲の濃度で施用して、抗微生物活性を得るとともに、約１μｇ／ｍｌ乃至約１０
０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で施用して他のペプチド、ポリペプチド及びタンパク
質をプロテアーゼ分解から保護するのが好ましい。
囲の濃度で施用して、抗微生物活性を得るとともに、約１μｇ／ｍｌ乃至約１０
０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で施用して他のペプチド、ポリペプチド及びタンパク
質をプロテアーゼ分解から保護するのが好ましい。
【００４３】 本発明の組成物はまた、インドリシジンまたはＲｅｖ４を生産するとともに、
植物の根及び／または葉に棲みつく、細菌細胞及びかび細胞のような組み換え宿
主細胞の形態をなすものも含む。本発明のプロテアーゼ抑制ペプチドは、種々の
態様で互いに組み合わせて使用して、相乗的な活性を得ることができ及び／また
は種々の活性部位と基質特異性とを有する種々のクラスのプロテアーゼに対する
広範な保護を提供することができる。例えば、Ｒｅｖ４は、特定のクラスのペプ
チド、ポリペプチドまたはタンパク質を保護するうえで高い活性を示しまたは特
定のプロテアーゼに対して高い活性を示すプロテアーゼ抑制ペプチドのインドリ
シジン／Ｒｅｖ４ファミリからの他のペプチドと組み合わせることができる。
植物の根及び／または葉に棲みつく、細菌細胞及びかび細胞のような組み換え宿
主細胞の形態をなすものも含む。本発明のプロテアーゼ抑制ペプチドは、種々の
態様で互いに組み合わせて使用して、相乗的な活性を得ることができ及び／また
は種々の活性部位と基質特異性とを有する種々のクラスのプロテアーゼに対する
広範な保護を提供することができる。例えば、Ｒｅｖ４は、特定のクラスのペプ
チド、ポリペプチドまたはタンパク質を保護するうえで高い活性を示しまたは特
定のプロテアーゼに対して高い活性を示すプロテアーゼ抑制ペプチドのインドリ
シジン／Ｒｅｖ４ファミリからの他のペプチドと組み合わせることができる。
【００４４】 本発明についての詳細な説明は、当業者が本発明を容易に実施することができ
るようにするために提供されているものである。しかしながら、当業者であれば
、本明細書に記載の実施の形態において種々の修正と変更を本発明の範囲から逸
脱することなく行うことができるので、かかる詳細な説明は本発明を限定するも
のと解されるべきではない。本発明は、本発明を例示するものであって、本発明
を限定するものではない以下の実施例により、一層良好に理解することができる
ものである。
るようにするために提供されているものである。しかしながら、当業者であれば
、本明細書に記載の実施の形態において種々の修正と変更を本発明の範囲から逸
脱することなく行うことができるので、かかる詳細な説明は本発明を限定するも
のと解されるべきではない。本発明は、本発明を例示するものであって、本発明
を限定するものではない以下の実施例により、一層良好に理解することができる
ものである。
【００４５】 実施例１ Ｒｅｖ４（アミド）の化学合成と精製 本明細書に記載されているタイプのペプチドは、米国特許第５，４２４，３９
５号及び同第５，５１９，１１５号に詳細に説明されているような標準的な技術
により合成しかつ精製することができる。便宜上説明すると、このペプチドは、
注文に応じてペプチドの合成を行う多くの企業の１つから購入することができる
。かかる企業の１つに、テキサス州７７２４０、ヒューストン、郵便番号４１０
２７に所在するゲノシス・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッド(Genos
ys Biotechnologies, Inc.)（電話番号：２８１−３６３−３６９３）がある。
Ｒｅｖ４ペプチド（Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile）
のＣ−末端アミド形態物の合成について、ゲノシス・バイオテクノロジーズ・イ
ンコーポレーテッドと契約を行った。ＨＰＬＣ分析を、１０−９０％勾配のアセ
トニトリルで溶離されるバイダック（ＶＹＤＡＣ）逆相Ｃ８カラムを使用して、
１．５ｍｌ／分の流量で３４分間に亘って行ったところ、ペプチドの純度は９５
％を越えており、単一のピークが２４．５４８分後に溶離することがわかった。
５号及び同第５，５１９，１１５号に詳細に説明されているような標準的な技術
により合成しかつ精製することができる。便宜上説明すると、このペプチドは、
注文に応じてペプチドの合成を行う多くの企業の１つから購入することができる
。かかる企業の１つに、テキサス州７７２４０、ヒューストン、郵便番号４１０
２７に所在するゲノシス・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッド(Genos
ys Biotechnologies, Inc.)（電話番号：２８１−３６３−３６９３）がある。
Ｒｅｖ４ペプチド（Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile）
のＣ−末端アミド形態物の合成について、ゲノシス・バイオテクノロジーズ・イ
ンコーポレーテッドと契約を行った。ＨＰＬＣ分析を、１０−９０％勾配のアセ
トニトリルで溶離されるバイダック（ＶＹＤＡＣ）逆相Ｃ８カラムを使用して、
１．５ｍｌ／分の流量で３４分間に亘って行ったところ、ペプチドの純度は９５
％を越えており、単一のピークが２４．５４８分後に溶離することがわかった。
【００４６】 実施例２ インドリシジンの化学合成及び精製 インドリシジンのＣ−末端アミド形態物(Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp T
rp Pro Trp Arg Arg)の合成について、ゲノシス・バイオテクノロジーズ・イン
コーポレーテッドと契約を行った。ＨＰＬＣ分析を、１０−９０％勾配のアセト
ニトリルで溶離されるバイダック逆相Ｃ８カラムを使用して、１．５ｍｌ／分の
流量で３４分間に亘って行ったところ、ペプチドの純度は９５％を越えており、
単一のピークが２３．２３２分後に溶離することがわかった。
rp Pro Trp Arg Arg)の合成について、ゲノシス・バイオテクノロジーズ・イン
コーポレーテッドと契約を行った。ＨＰＬＣ分析を、１０−９０％勾配のアセト
ニトリルで溶離されるバイダック逆相Ｃ８カラムを使用して、１．５ｍｌ／分の
流量で３４分間に亘って行ったところ、ペプチドの純度は９５％を越えており、
単一のピークが２３．２３２分後に溶離することがわかった。
【００４７】 実施例３ Ｓｅｒ−Ｒｅｖ４の化学合成及び精製 更なるＳｅｒがＮ−末端に加えられたＲｅｖ４の非−Ｃ−末端アミド(Ser Arg
Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile)の合成について、ゲノシ
ス・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッドと契約を行った。ＨＰＬＣ分
析を、１０−９０％勾配のアセトニトリルで溶離されるバイダック逆相Ｃ８カラ
ムを使用して、１．５ｍｌ／分の流量で３４分間に亘って行ったところ、ペプチ
ドの純度は９５％を越えており、単一のピークが２２．３６３分後に溶離するこ
とがわかった。
Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile)の合成について、ゲノシ
ス・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッドと契約を行った。ＨＰＬＣ分
析を、１０−９０％勾配のアセトニトリルで溶離されるバイダック逆相Ｃ８カラ
ムを使用して、１．５ｍｌ／分の流量で３４分間に亘って行ったところ、ペプチ
ドの純度は９５％を越えており、単一のピークが２２．３６３分後に溶離するこ
とがわかった。
【００４８】 実施例４ Ｒｅｖ４−Ｃ−端末融合ペプチドの化学合成及び精製 １３個のアミノ酸のＣ−末端延長を有するＲｅｖ４(Arg Arg Trp Pro Trp Trp
Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile Gly Gly Gly Tyr Asp Pro Ala Pro Pro Pro Pro
Pro Pro)の合成について、ゲノシス・バイオテクノロジーズ・インコーポレー
テッドと契約を行った。ＨＰＬＣ分析を、１０−９０％勾配のアセトニトリルで
溶離されるバイダック逆相Ｃ８カラムを使用して、１．５ｍｌ／分の流量で３４
分間に亘って行ったところ、ペプチドの純度は９５％を越えており、単一のピー
クが２１．２１３分後に溶離することがわかった。
Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile Gly Gly Gly Tyr Asp Pro Ala Pro Pro Pro Pro
Pro Pro)の合成について、ゲノシス・バイオテクノロジーズ・インコーポレー
テッドと契約を行った。ＨＰＬＣ分析を、１０−９０％勾配のアセトニトリルで
溶離されるバイダック逆相Ｃ８カラムを使用して、１．５ｍｌ／分の流量で３４
分間に亘って行ったところ、ペプチドの純度は９５％を越えており、単一のピー
クが２１．２１３分後に溶離することがわかった。
【００４９】 実施例５ インドリシジンＦ（アミド）の化学合成及び精製 Ｔｒｐ残分をＰｈｅで置換したＣ−アミド化インドリシジン (Ile Leu Pro Ph
e Lys Phe Pro Phe Phe Pro Phe Arg Arg)の合成について、ゲノシス・バイオテ
クノロジーズ・インコーポレーテッドと契約を行った。ＨＰＬＣ分析を、１０−
９０％勾配のアセトニトリルで溶離されるバイダック逆相Ｃ８カラムを使用して
、１．５ｍｌ／分の流量で３４分間に亘って行ったところ、ペプチドの純度は９
５％を越えており、単一のピークが２０．４１５分後に溶離したことがわかった
。
e Lys Phe Pro Phe Phe Pro Phe Arg Arg)の合成について、ゲノシス・バイオテ
クノロジーズ・インコーポレーテッドと契約を行った。ＨＰＬＣ分析を、１０−
９０％勾配のアセトニトリルで溶離されるバイダック逆相Ｃ８カラムを使用して
、１．５ｍｌ／分の流量で３４分間に亘って行ったところ、ペプチドの純度は９
５％を越えており、単一のピークが２０．４１５分後に溶離したことがわかった
。
【００５０】 実施例６ インドリシジンＦ−Ｐ（アミド）の化学合成及び精製 Ｔｒｐ残分がＰｈｅにより置換され、かつ、Ｐｒｏ残分をなくしたインドリシ
ジンのＣ−アミド化誘導体(Ile Leu Lys Gly Phe Pro Gly Phe Pro Arg Arg Lys
)の合成について、ゲノシス・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッドと
契約を行った。ＨＰＬＣ分析を、１０−９０％勾配のアセトニトリルで溶離され
るバイダック逆相Ｃ８カラムを使用して、１．５ｍｌ／分の流量で３４分間に亘
って行ったところ、ペプチドの純度は９５％を越えており、単一のピークが１５
．５２７分後に溶離したことがわかった。
ジンのＣ−アミド化誘導体(Ile Leu Lys Gly Phe Pro Gly Phe Pro Arg Arg Lys
)の合成について、ゲノシス・バイオテクノロジーズ・インコーポレーテッドと
契約を行った。ＨＰＬＣ分析を、１０−９０％勾配のアセトニトリルで溶離され
るバイダック逆相Ｃ８カラムを使用して、１．５ｍｌ／分の流量で３４分間に亘
って行ったところ、ペプチドの純度は９５％を越えており、単一のピークが１５
．５２７分後に溶離したことがわかった。
【００５１】 実施例７ 植物細胞外流体（ＥＦＣ）に存在するプロテアーゼに対する逆ペプチドの安定性 天然に産するペプチドの種々の逆ペプチド変種の安定性を、逆ペプチドをＥＣ
Ｆの種々の希釈体で培養し、次いで、培養期間の最後に残っている親ペプチドの
割合をＨＰＬＣ分析により測定することにより特定した。図２を参照されたい。
ＥＣＦは、米国特許第５，４２４，３９５号に記載の方法に従ってタバコの葉か
ら得た。各ペプチドの５０マイクログラムをＥＣＦの量が異なる５０ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、全容量５０マイクロリットルを用いて、３７℃
で１時間培養を行った。反応を、１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えるこ
とにより停止させた。反応混合物のサンプル（２０μＬ）を、５１５ポンプ、４
８６検出器及びミレニウム(Millenium)ソフトウエアを備えるウォーターズ(Wate
rs)ＨＰＬＣ系のバイダックＣ４カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）に注入した。サ
ンプルを、ＴＦＡの０．１％水溶液から０．１％ＴＦＡにおける６０％アセトニ
トリル溶液の勾配で溶離した。未消化のペプチドに対応するピークの面積を積分
して、０％ＥＣＦ対照からの同等のピークと比較した。非逆ペプチドであるＭＹ
Ｐ３０ (Met Gly Ile Gly Lys Phe Leu Arg Glu Ala Gly Lys Phe Gly Lys Ala
Phe Val Gly Glu Ile Met Lys Pro)を、対照として含ませた。図２に示すペプチ
ド安定性のランキングは、Rev4 (逆インドリシジン; Arg Arg Trp Pro Trp Trp
Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile)>Rev6 (逆 PGLc; Leu Ala Lys Leu Ala Val Lys
Ala Ile Lys Gly Ala Ile Ala Gly Ala Lys Ser Ala Met Gly)> Rev3 (逆セクロ
ピンP1; Arg Pro Gly Gly Gln Ile Ala Ile Ala Ile Gly Glu Ser Ile Arg Lys
Lys Ala Ser Asn Glu Leu Lys Lys Ala Thr Lys Ser Leu Trp Ser)>MYP30 (Met
Gly Ile Gly Lys Phe Leu Arg Glu Ala Gly Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly
Glu Ile Met Lys Pro)>Rev2 (逆セクロピンアミド; Lys Ala Ile Gln Thr Ala G
ln Gly Val Val Ala Val Ala Pro Gly Ala Lys Ile Ile Gly Asp Arg Ile Asn G
ln Gly Val Lys Glu Ile Lys Lys Phe Leu Lys Trp Lys)>Rev8 (逆ボンビニン状
ペプチド; Asn Ala Phe His Glu Ala Leu Gly Lys Ala Leu Gly Lys Leu Ala Se
r Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Ala Gly Ile Gly)であった。
Ｆの種々の希釈体で培養し、次いで、培養期間の最後に残っている親ペプチドの
割合をＨＰＬＣ分析により測定することにより特定した。図２を参照されたい。
ＥＣＦは、米国特許第５，４２４，３９５号に記載の方法に従ってタバコの葉か
ら得た。各ペプチドの５０マイクログラムをＥＣＦの量が異なる５０ｍＭのトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、全容量５０マイクロリットルを用いて、３７℃
で１時間培養を行った。反応を、１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えるこ
とにより停止させた。反応混合物のサンプル（２０μＬ）を、５１５ポンプ、４
８６検出器及びミレニウム(Millenium)ソフトウエアを備えるウォーターズ(Wate
rs)ＨＰＬＣ系のバイダックＣ４カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）に注入した。サ
ンプルを、ＴＦＡの０．１％水溶液から０．１％ＴＦＡにおける６０％アセトニ
トリル溶液の勾配で溶離した。未消化のペプチドに対応するピークの面積を積分
して、０％ＥＣＦ対照からの同等のピークと比較した。非逆ペプチドであるＭＹ
Ｐ３０ (Met Gly Ile Gly Lys Phe Leu Arg Glu Ala Gly Lys Phe Gly Lys Ala
Phe Val Gly Glu Ile Met Lys Pro)を、対照として含ませた。図２に示すペプチ
ド安定性のランキングは、Rev4 (逆インドリシジン; Arg Arg Trp Pro Trp Trp
Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile)>Rev6 (逆 PGLc; Leu Ala Lys Leu Ala Val Lys
Ala Ile Lys Gly Ala Ile Ala Gly Ala Lys Ser Ala Met Gly)> Rev3 (逆セクロ
ピンP1; Arg Pro Gly Gly Gln Ile Ala Ile Ala Ile Gly Glu Ser Ile Arg Lys
Lys Ala Ser Asn Glu Leu Lys Lys Ala Thr Lys Ser Leu Trp Ser)>MYP30 (Met
Gly Ile Gly Lys Phe Leu Arg Glu Ala Gly Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly
Glu Ile Met Lys Pro)>Rev2 (逆セクロピンアミド; Lys Ala Ile Gln Thr Ala G
ln Gly Val Val Ala Val Ala Pro Gly Ala Lys Ile Ile Gly Asp Arg Ile Asn G
ln Gly Val Lys Glu Ile Lys Lys Phe Leu Lys Trp Lys)>Rev8 (逆ボンビニン状
ペプチド; Asn Ala Phe His Glu Ala Leu Gly Lys Ala Leu Gly Lys Leu Ala Se
r Lys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Ala Gly Ile Gly)であった。
【００５２】 実施例８ 全細胞抽出物（ＷＣＥ）に存在するプロテアーゼに対するＲｅｖ４の安定性 全細胞抽出物（ＷＣＥ）を、ケンタッキー１４タバコ葉組織１グラムを液体窒
素中で粉砕し、次いで、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、５０ｍ
ＭＮａＣｌの３ｍＬを用いて抽出することによりつくった。この混合物をマイク
ロ遠心分離器において回転させる（１４，０００ｒｐｍ、５分間）ことにより清
澄にした。上澄み（ＷＣＥ）を、検定に必要となるまで、−８０℃のアリコート
として凍結保存した。各ペプチド５０マイクログラムを、ＷＣＥの量が異なる５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、全容量５０マイクロリットルを用い
、３７℃で１時間培養に供した。１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えること
により反応を停止させた。反応混合物のサンプル（２０μＬ）を、５１５ポンプ
、４８６検出器及びミレニウムソフトウエアを備えるウォーターズ(Waters)ＨＰ
ＬＣ系のバイダックＣ４カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）に注入した。サンプルを
、ＴＦＡの０．１％水溶液から０．１％ＴＦＡにおける６０％アセトニトリル溶
液の勾配で溶離した。未消化のペプチドに対応するピークの面積を積分して、０
％ＥＣＦ対照からの同等のピークと比較した。 MYP 30 (Met Gly Ile Gly Lys P
he Leu Arg Glu Ala Gly Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met Lys P
ro) は、ＥＣＦよりもＷＣＥによる分解を受けやすいが、 Rev4 (Arg Arg Trp P
ro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile) は、MYP30または マゲイニン２(Gly
Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu
Ile Met Asn Ser)よりもＷＣＥに対してはるかに安定である。
素中で粉砕し、次いで、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、５０ｍ
ＭＮａＣｌの３ｍＬを用いて抽出することによりつくった。この混合物をマイク
ロ遠心分離器において回転させる（１４，０００ｒｐｍ、５分間）ことにより清
澄にした。上澄み（ＷＣＥ）を、検定に必要となるまで、−８０℃のアリコート
として凍結保存した。各ペプチド５０マイクログラムを、ＷＣＥの量が異なる５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、全容量５０マイクロリットルを用い
、３７℃で１時間培養に供した。１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えること
により反応を停止させた。反応混合物のサンプル（２０μＬ）を、５１５ポンプ
、４８６検出器及びミレニウムソフトウエアを備えるウォーターズ(Waters)ＨＰ
ＬＣ系のバイダックＣ４カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）に注入した。サンプルを
、ＴＦＡの０．１％水溶液から０．１％ＴＦＡにおける６０％アセトニトリル溶
液の勾配で溶離した。未消化のペプチドに対応するピークの面積を積分して、０
％ＥＣＦ対照からの同等のピークと比較した。 MYP 30 (Met Gly Ile Gly Lys P
he Leu Arg Glu Ala Gly Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met Lys P
ro) は、ＥＣＦよりもＷＣＥによる分解を受けやすいが、 Rev4 (Arg Arg Trp P
ro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile) は、MYP30または マゲイニン２(Gly
Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu
Ile Met Asn Ser)よりもＷＣＥに対してはるかに安定である。
【００５３】 実施例９ マゲイニン２をＷＣＥによる分解から保護するＲｅｖ４の能力 ＷＣＥプロテアーゼ分解の検定を、サンプルの１つがＷＣＥの添加前にＲｅｖ
４と混合したマゲイニン２を示す点を除いて、実施例８に記載のようにして行っ
た。混合物に残ったマゲイニン２とＲｅｖ４の量は、実施例７及び８に関して記
載のようにしてＨＰＬＣにより測定した。Ｒｅｖ４は、Ｒｅｖ４自体と同等のＷ
ＣＥに対する安定性をマゲイニン２に付与することができた（表２）。
４と混合したマゲイニン２を示す点を除いて、実施例８に記載のようにして行っ
た。混合物に残ったマゲイニン２とＲｅｖ４の量は、実施例７及び８に関して記
載のようにしてＨＰＬＣにより測定した。Ｒｅｖ４は、Ｒｅｖ４自体と同等のＷ
ＣＥに対する安定性をマゲイニン２に付与することができた（表２）。
【表２】
【００５４】 実施例１０ 商業的なプロテアーゼによる分解からタンパク質を保護するＲｅｖ４の能力 ４つの異なるクラスのプロテアーゼを抑制するＲｅｖ４の能力を、蛍光標識を
付したカゼインを以下の条件の下で基質として使用して試験を行った。
付したカゼインを以下の条件の下で基質として使用して試験を行った。
【表３】
【００５５】 各プロテアーゼを、９６個の溜めを有するマイクロタイタプレートにおいて全
容量２００μｌで基質（５μｇ／ｍｌの蛍光標識を付したカゼイン、オレゴン州
ユージンに所在するモレキュラー・プローブズ・インコーポレーテッド(Molecul
ar Probes Inc.)）とペプチドを用いて培養した。使用に先立ち、パパインをシ
ステインを用いて活性化した（Methods in Enzymology、第１９巻、第２２６−
４４頁（１９７０年）に掲載のアーノン(Arnon)の論文）。室温で１時間培養後
、カゼイン消化による蛍光を、５０５ｎｍの励起波長及び５１３ｎｍの発光波長
を用いて、ルミネッセンススペクトロメータ(Luminescence Spectrometer）（Ｌ
Ｓ５０Ｂ、英国のパーキン・エルマー・リミテッド(Perkin Elmer Ltd.)）にお
いて測定した。ブランク対照は、基質、緩衝液及びペプチドを含んでいたが、プ
ロテアーゼは含んでいなかった。このような条件下においては、Ｒｅｖ４は、キ
モトリプシン、カルボペプチアーゼ及びパパインを抑制したが、ペプシンを抑制
しないことがわかった（表４）。
容量２００μｌで基質（５μｇ／ｍｌの蛍光標識を付したカゼイン、オレゴン州
ユージンに所在するモレキュラー・プローブズ・インコーポレーテッド(Molecul
ar Probes Inc.)）とペプチドを用いて培養した。使用に先立ち、パパインをシ
ステインを用いて活性化した（Methods in Enzymology、第１９巻、第２２６−
４４頁（１９７０年）に掲載のアーノン(Arnon)の論文）。室温で１時間培養後
、カゼイン消化による蛍光を、５０５ｎｍの励起波長及び５１３ｎｍの発光波長
を用いて、ルミネッセンススペクトロメータ(Luminescence Spectrometer）（Ｌ
Ｓ５０Ｂ、英国のパーキン・エルマー・リミテッド(Perkin Elmer Ltd.)）にお
いて測定した。ブランク対照は、基質、緩衝液及びペプチドを含んでいたが、プ
ロテアーゼは含んでいなかった。このような条件下においては、Ｒｅｖ４は、キ
モトリプシン、カルボペプチアーゼ及びパパインを抑制したが、ペプシンを抑制
しないことがわかった（表４）。
【表４】
【００５６】 実施例１１ Ｒｅｖ４の抗かび活性 Ｒｅｖ４を独立した研究グループによるブラインド試験に供したところ、Ｒｅ
ｖ４は、セルコスポラｓｐｐ(Cercospora spp)、コレトトリカムｓｐｐ(Colleto
trichum spp)、フサリウムｓｐｐ(Fusarium spp)及びヘルミントスポリウムｓｐ
ｐ(Helminthosporium spp)を含む重要な病原体に対して広いスペクトル活性を有
することがわかった。
ｖ４は、セルコスポラｓｐｐ(Cercospora spp)、コレトトリカムｓｐｐ(Colleto
trichum spp)、フサリウムｓｐｐ(Fusarium spp)及びヘルミントスポリウムｓｐ
ｐ(Helminthosporium spp)を含む重要な病原体に対して広いスペクトル活性を有
することがわかった。
【００５７】 タバコ青かび（ペロノスポラタバシナ(Peronospora tabacina)）を使用して、
Ｒｅｖ４の抗かび活性をＭＹＰ３０の抗かび活性を比較した。ペロノスポラタバ
シナの胞子即ち芽胞を、感染したタバコの葉から無菌の水を用いて取り入れ、３
回洗浄した。胞子の懸濁液をｍｌ当たり２，０００個の胞子に希釈した。暗所に
おいて室温で２４時間培養した後、発芽した胞子の数を顕微鏡で測定した。Ｒｅ
ｖ４は、ＭＹＰ３０よりも有意に効能があることがわかった。
Ｒｅｖ４の抗かび活性をＭＹＰ３０の抗かび活性を比較した。ペロノスポラタバ
シナの胞子即ち芽胞を、感染したタバコの葉から無菌の水を用いて取り入れ、３
回洗浄した。胞子の懸濁液をｍｌ当たり２，０００個の胞子に希釈した。暗所に
おいて室温で２４時間培養した後、発芽した胞子の数を顕微鏡で測定した。Ｒｅ
ｖ４は、ＭＹＰ３０よりも有意に効能があることがわかった。
【表５】
【００５８】 Ｒｅｖ４及び関連するペプチドの抗かび活性の比較も、２つのタバコ病原体、
即ちベルチシリウムダリアエラセル(Verticillium dahliae racel)及びアルテル
ナリアアルテルナタｆ．ｓｐ．リコペルシシ(Alternaria alternata f.sp. lyco
persici)を使用して行った。胞子は、Ｖ８媒体で成長させた純水の培養基から取
り入れ、ｍｌ当たり５０００個の胞子に希釈し、米国特許第５，４２４，３９５
号に記載のようにして９６個の溜めを有するプレートにおいて一連の希釈ペプチ
ドに対して試験を行った。少なくとも４８時間胞子の発芽を完全に抑制するのに
必要な最小濃度を、３回測定した。
即ちベルチシリウムダリアエラセル(Verticillium dahliae racel)及びアルテル
ナリアアルテルナタｆ．ｓｐ．リコペルシシ(Alternaria alternata f.sp. lyco
persici)を使用して行った。胞子は、Ｖ８媒体で成長させた純水の培養基から取
り入れ、ｍｌ当たり５０００個の胞子に希釈し、米国特許第５，４２４，３９５
号に記載のようにして９６個の溜めを有するプレートにおいて一連の希釈ペプチ
ドに対して試験を行った。少なくとも４８時間胞子の発芽を完全に抑制するのに
必要な最小濃度を、３回測定した。
【表６】
【００５９】 実施例１２ Ｒｅｖ４関連ペプチドの抗かび活性 実施例１、３、４、５及び６において配列識別番号(SEQ. ID. No.)４、５、６
、７及び８として記載したペプチドを、実施例１１に記載のように抗かび活性に
関して試験に供した。２μｇ／ｍｌの最終濃度で試験を行ったところ、Ｒｅｖ４
関連ペプチドの全てが、ペロノスポラタバシナ胞子の発芽を有意に抑制すること
がわかった。
、７及び８として記載したペプチドを、実施例１１に記載のように抗かび活性に
関して試験に供した。２μｇ／ｍｌの最終濃度で試験を行ったところ、Ｒｅｖ４
関連ペプチドの全てが、ペロノスポラタバシナ胞子の発芽を有意に抑制すること
がわかった。
【表７】
【００６０】 実施例１３ キモトリプシンに対してタンパク質を保護するＲｅｖ４−関連ペプチドの能力 実施例１２に記載のペプチドを、実施例１０に記載の方法を使用してカゼイン
に対するキモトリプシンの作用の影響に関して試験を行った。Ｒｅｖ４に関する
ものであるが、Ｎ−末端(Ser Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro L
eu Ile) またはＣ−末端(Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu I
le Gly Gly Gly Tyr Asp Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro) にアミノ酸延長(e
xtension)を備えているペプチドは、蛍光標識の付されたカゼインをキモトリプ
シンの作用から保護を行った。Ｔｒｐ残分がPhe (Ile Leu Pro Phe Lys Phe Pro
Phe Phe Pro Phe Arg Arg; Ile Leu Lys Gly Phe Pro Gly Phe Pro Arg Arg Ly
s)により置換されているインドリシジンに関連するペプチド(Ile Leu Pro Trp L
ys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg) は、抗かび活性を有していても、保護作
用は行わなかった（実施例１２）。
に対するキモトリプシンの作用の影響に関して試験を行った。Ｒｅｖ４に関する
ものであるが、Ｎ−末端(Ser Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro L
eu Ile) またはＣ−末端(Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu I
le Gly Gly Gly Tyr Asp Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro) にアミノ酸延長(e
xtension)を備えているペプチドは、蛍光標識の付されたカゼインをキモトリプ
シンの作用から保護を行った。Ｔｒｐ残分がPhe (Ile Leu Pro Phe Lys Phe Pro
Phe Phe Pro Phe Arg Arg; Ile Leu Lys Gly Phe Pro Gly Phe Pro Arg Arg Ly
s)により置換されているインドリシジンに関連するペプチド(Ile Leu Pro Trp L
ys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg) は、抗かび活性を有していても、保護作
用は行わなかった（実施例１２）。
【表８】
【００６１】 実施例１４ Ｒｅｖ４ペプチドをエンコードする遺伝子（「ＲＩＬ」）の構造 Ｒｅｖ４をエンコードするＤＮＡ配列 (Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Ly
s Trp Pro Leu Ile, Ｃ−末端アミドなし）を、標準的な遺伝コドン及びタバコ
コドン使用テーブル（ウエブサイトhjttp://www.dna.affrc.go.jpにおいて見ら
れる）に従って構成した。２つのオリゴヌクレオチドプライマ(AGGAGATGGCCTTGG
TGGCCTTGGAAATGGCCTCTTATT及びCCAGTCTCTAGAACCATGAGGAGATGGCCTTGG)を使用して
、発現ベクタにクローンする完全にコード化した配列をつくった。完全長(full-
length)のＤＮＡを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ：コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリ・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)発行（１
９８９年）、サンブルック(Sambrook)等著のモレキュラ・クローニング、ア・ラ
ボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)）によりつ
くった。ＤＮＡポリメラーゼは、ギブコ・ビーアールエル(Gibco BRL)から購入
し、反応は、この製造者が提案するように設定した。これら２つのプライマはオ
ーバーラップする領域（１５個のヌクレオチド）を有しているので、ＰＣＲ反応
にはテンプレートは必要とされなかった。遺伝子のクローニングを容易にするた
めに、２つの制限部位（ＸｂａＩ及びＳａｃＩ）が遺伝子の両端において処理さ
れ、別のヌクレオチドがこれらの端部に加えられて、これらの酵素消化を確保し
た。
s Trp Pro Leu Ile, Ｃ−末端アミドなし）を、標準的な遺伝コドン及びタバコ
コドン使用テーブル（ウエブサイトhjttp://www.dna.affrc.go.jpにおいて見ら
れる）に従って構成した。２つのオリゴヌクレオチドプライマ(AGGAGATGGCCTTGG
TGGCCTTGGAAATGGCCTCTTATT及びCCAGTCTCTAGAACCATGAGGAGATGGCCTTGG)を使用して
、発現ベクタにクローンする完全にコード化した配列をつくった。完全長(full-
length)のＤＮＡを、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ：コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリ・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)発行（１
９８９年）、サンブルック(Sambrook)等著のモレキュラ・クローニング、ア・ラ
ボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)）によりつ
くった。ＤＮＡポリメラーゼは、ギブコ・ビーアールエル(Gibco BRL)から購入
し、反応は、この製造者が提案するように設定した。これら２つのプライマはオ
ーバーラップする領域（１５個のヌクレオチド）を有しているので、ＰＣＲ反応
にはテンプレートは必要とされなかった。遺伝子のクローニングを容易にするた
めに、２つの制限部位（ＸｂａＩ及びＳａｃＩ）が遺伝子の両端において処理さ
れ、別のヌクレオチドがこれらの端部に加えられて、これらの酵素消化を確保し
た。
【００６２】 消化されたＰＣＲ生成物は、複数のクローニング部位に５’ＡＭＶ配列を有す
るピーブルースクリプト(pBluescript)ＩＩ ＫＳ＋（即ち、ｐＢＳ、カリフォ
ルニア州、ラヨラ(LaJolla)に所在するストラタジーン(Stratagene)）プラスミ
ドベクタにクローニングした。アルファルファモザイクウイルスの５’リーダ配
列（５’ＡＭＶ、Nature、第３２５巻、第６２２−２５頁に掲載のジョブリング
(Jobling)及びゲールケ(Gehrke)）からの翻訳エンハンサである５’ＡＭＶ配列
を使用して、ｍＲＮＡの翻訳を高めた。ＲＩＬ遺伝子コード化配列を、この５’
ＡＭＶ配列を越えてベクタに挿入した（図１参照）。この構造体である５’ＡＭ
Ｖ−ＲＩＬは、ＸｈｏＩとＳａｃＩによる消化により切除され、二元ベクタであ
るｐＫＬＰ３６（Biochem. Biophys. Res. Comm.、第２４４巻、第４４０−４４
頁に記載のマイチ(Maiti)及びシェファード(Shepherd)の論文）に挿入され、ｐ
ＫＬＰＲＩＬと称する構造体を形成した。ｐＫＬＰ３６ベクタは、植物ゲノムへ
の遺伝子挿入のための転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の左右のボーダ(border)を含む
とともに、（カナマイシン耐性の）ＮＰＴＩＩを植物の形質転換の選択可能なマ
ーカとして含み、更に、落花生クロロチックストリークカウリモウイルス(cauli
movirus)からの３６Ｓプロモータと、ラビスコ小サブユニット遺伝子(Rubisco s
mall subunit gene)からの３’未翻訳配列（ｒｂｃｓ３’、図１）を含み、組み
立てられたＲＩＬの発現を促す。
るピーブルースクリプト(pBluescript)ＩＩ ＫＳ＋（即ち、ｐＢＳ、カリフォ
ルニア州、ラヨラ(LaJolla)に所在するストラタジーン(Stratagene)）プラスミ
ドベクタにクローニングした。アルファルファモザイクウイルスの５’リーダ配
列（５’ＡＭＶ、Nature、第３２５巻、第６２２−２５頁に掲載のジョブリング
(Jobling)及びゲールケ(Gehrke)）からの翻訳エンハンサである５’ＡＭＶ配列
を使用して、ｍＲＮＡの翻訳を高めた。ＲＩＬ遺伝子コード化配列を、この５’
ＡＭＶ配列を越えてベクタに挿入した（図１参照）。この構造体である５’ＡＭ
Ｖ−ＲＩＬは、ＸｈｏＩとＳａｃＩによる消化により切除され、二元ベクタであ
るｐＫＬＰ３６（Biochem. Biophys. Res. Comm.、第２４４巻、第４４０−４４
頁に記載のマイチ(Maiti)及びシェファード(Shepherd)の論文）に挿入され、ｐ
ＫＬＰＲＩＬと称する構造体を形成した。ｐＫＬＰ３６ベクタは、植物ゲノムへ
の遺伝子挿入のための転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の左右のボーダ(border)を含む
とともに、（カナマイシン耐性の）ＮＰＴＩＩを植物の形質転換の選択可能なマ
ーカとして含み、更に、落花生クロロチックストリークカウリモウイルス(cauli
movirus)からの３６Ｓプロモータと、ラビスコ小サブユニット遺伝子(Rubisco s
mall subunit gene)からの３’未翻訳配列（ｒｂｃｓ３’、図１）を含み、組み
立てられたＲＩＬの発現を促す。
【００６３】 実施例１５ 植物のＲｅｖ４の分泌のＰｒｅＲＩＬ遺伝子の組み立て タバコＰＲｌｂ（EMBO J.、第５巻、第３４−４０頁（１９８６年）に掲載の
コーネリッセン(Cornelissen)等の論文）からの分泌信号ペプチド配列をＲＩＬ
に加えて、侵入する病原体が最初に遭遇する可能性がある植物の組織の細胞外空
間へのＲｅｖ４の分泌を容易にした。２つのプライマ(GACTGGAGCTCTTAAATAAGAGG
CCATTTCCAAGGCCACCAAGGCCATCTCCT及びAGCTGGGAATTCTAGGAGATGGCCTTGGTGGC)を設
計して信号配列を導入するとともに、天然の分割部位を、処理のために保存した
。
コーネリッセン(Cornelissen)等の論文）からの分泌信号ペプチド配列をＲＩＬ
に加えて、侵入する病原体が最初に遭遇する可能性がある植物の組織の細胞外空
間へのＲｅｖ４の分泌を容易にした。２つのプライマ(GACTGGAGCTCTTAAATAAGAGG
CCATTTCCAAGGCCACCAAGGCCATCTCCT及びAGCTGGGAATTCTAGGAGATGGCCTTGGTGGC)を設
計して信号配列を導入するとともに、天然の分割部位を、処理のために保存した
。
【００６４】 ＰＣＲ生成物（６７塩基対）を沈降させ、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化させ
、次いで、５’ＡＭＶ及びＰＲ−ｌｂ配列を既に含んでいるｐＢＳプラスミドに
クローニングして、プラスミドｐＢＳ ＰｒｅＲＩＬを得た。配列の同一性を、
ＤＮＡ配列により確認した。次いで、５’ＡＭＶ−ＰＲ−ｌｂ−ＲＩＬカセット
をＸｈｏＩ及びＸｂａＩを用いて切除し、ｐＫＬＰ３６に挿入してｐＫＬＰＰｒ
ｅＲＩＬを形成した。
、次いで、５’ＡＭＶ及びＰＲ−ｌｂ配列を既に含んでいるｐＢＳプラスミドに
クローニングして、プラスミドｐＢＳ ＰｒｅＲＩＬを得た。配列の同一性を、
ＤＮＡ配列により確認した。次いで、５’ＡＭＶ−ＰＲ−ｌｂ−ＲＩＬカセット
をＸｈｏＩ及びＸｂａＩを用いて切除し、ｐＫＬＰ３６に挿入してｐＫＬＰＰｒ
ｅＲＩＬを形成した。
【００６５】 実施例１６ Ｒｅｖ４ペプチドをエンコードするプロペプチドＰＰＲＩＬの組み立て 先づ、天然のペプチドホルモンを、より小さい活性ペプチドを形成するように
処理される大きなプレプロ−ホルモン前駆体として合成する。プロ配列により、
ペプチドのトランスメンブラン(trans-membrane)の動きを容易にするとともに、
活性ペプチドが正しい細胞区画室に入るまで活性ペプチドの放出を妨げることが
できる。この実施例においては、天然のマゲイニン遺伝子において見受けられる
プロ配列（PNAS、第８４巻、第５４４９−５３頁に掲載のザスロフ(Zasloff)の
論文；ATGGACTCTAGATTAAATAAGAGGCCATTTCCAAGGCCACCAAGGCCATCTCCT）を使用し、
これを、植物の細胞外プロテアーゼが天然のマゲイニンを分割する部位に対応す
るＨｉｓ−Ｓｅｒモチーフを介してＲｅｖ４コード化配列に結合させた（ヘディ
ン(Hedin)、メン(Menn)及びホリングウォース(Hollingworth)の編集に係るACS S
ymposium Series 551、第２７８−９１頁（１９９４年）に掲載の「第２０章、
天然の及び処理されたペスト処理剤(Chap. 20 In: Natural and Engineered Pes
t Management Agents)」と題するエベレットの論文）。この部位での正しい処理
は、Ｒｅｖ４のＮ−末端に追加のＳｅｒ残分を残すべきであり、生物学的活性を
有意に減じないことが示された変更（実施例１２及び１３）である。２つのオリ
ゴヌクレオチドプライマ(AGCTGGGAATTCTAGGAGATGGCCTTGGTGGC及びLeu-Pro-Gln-P
ro-Glu-Ala-Ser-Ala-Asp-Glu-Gly-Val-Asp-Glu-Arg-Glu-Leu-Hisx-Serに対応す
る核酸配列）を使用して、上記実施例において説明したようにＰＣＲにより全長
遺伝子を形成した。
処理される大きなプレプロ−ホルモン前駆体として合成する。プロ配列により、
ペプチドのトランスメンブラン(trans-membrane)の動きを容易にするとともに、
活性ペプチドが正しい細胞区画室に入るまで活性ペプチドの放出を妨げることが
できる。この実施例においては、天然のマゲイニン遺伝子において見受けられる
プロ配列（PNAS、第８４巻、第５４４９−５３頁に掲載のザスロフ(Zasloff)の
論文；ATGGACTCTAGATTAAATAAGAGGCCATTTCCAAGGCCACCAAGGCCATCTCCT）を使用し、
これを、植物の細胞外プロテアーゼが天然のマゲイニンを分割する部位に対応す
るＨｉｓ−Ｓｅｒモチーフを介してＲｅｖ４コード化配列に結合させた（ヘディ
ン(Hedin)、メン(Menn)及びホリングウォース(Hollingworth)の編集に係るACS S
ymposium Series 551、第２７８−９１頁（１９９４年）に掲載の「第２０章、
天然の及び処理されたペスト処理剤(Chap. 20 In: Natural and Engineered Pes
t Management Agents)」と題するエベレットの論文）。この部位での正しい処理
は、Ｒｅｖ４のＮ−末端に追加のＳｅｒ残分を残すべきであり、生物学的活性を
有意に減じないことが示された変更（実施例１２及び１３）である。２つのオリ
ゴヌクレオチドプライマ(AGCTGGGAATTCTAGGAGATGGCCTTGGTGGC及びLeu-Pro-Gln-P
ro-Glu-Ala-Ser-Ala-Asp-Glu-Gly-Val-Asp-Glu-Arg-Glu-Leu-Hisx-Serに対応す
る核酸配列）を使用して、上記実施例において説明したようにＰＣＲにより全長
遺伝子を形成した。
【００６６】 ＰＣＲ生成物を、実施例１５と同様にｐＢＳプラスミドベクタにクローニング
して、ｐＢＳ ＰＰＲＩＬを形成した。次に、上記のように、遺伝子カセット（
５’ＡＭＶ−ＰＲ−ｌｂ−Ｐｒｏ−ＲＩＬ）を、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩフラグメン
トとしてｐＫＬＰ３６に挿入し、ｐＫＬＰ ＰＰＲＩＬと名付けた。
して、ｐＢＳ ＰＰＲＩＬを形成した。次に、上記のように、遺伝子カセット（
５’ＡＭＶ−ＰＲ−ｌｂ−Ｐｒｏ−ＲＩＬ）を、ＸｈｏＩ／ＸｂａＩフラグメン
トとしてｐＫＬＰ３６に挿入し、ｐＫＬＰ ＰＰＲＩＬと名付けた。
【００６７】 実施例１７ ＰＲ−ｌｂのフラグメントに対する融合体としてのＲｅｖ４をエンコードするＰ
ＣＲＩＬ遺伝子の組み立て Ｒｅｖ４及び関連するペプチドの通常でないアミノ酸組成及び構造は、Ｒｅｖ
４が天然の信号ペプチド処理部位に直接隣接している場合には、正しいペプチド
分泌または処理を妨害する可能性がある。これは、トランシット(transit)ペプ
チドと、タンパク質をクロロプラストへの輸送のための輸送タンパク質配列との
双方の重要性と同様であると考えられる（Mol. Gen. Genet.、第２０５巻、第４
４６−５３頁に掲載のワスマン(Wassman)等の論文）。従って、ＰＣＲＩＬは、
Ｒｅｖ４ペプチドが、ＰＲ−ｌｂ信号配列に自然になるＰＲ−ｌｂコード化配列
の最初の２０のアミノ酸に対応するペプチドのＣ−末端に融合されるように設計
した。ＰＲ−ｌｂ−Ｒｅｖ４融合生成物からのＲｅｖ４ペプチドの解放を容易に
するため、ＰＲ−ｌｂとＲｅｖ４との接合は、Ｒｅｖ４により抑制されるべきで
はなく（実施例１０）、かつ、多くのかびにより生産される（J. Bio. Chem.、
第２７２巻、第１８８５５−６１頁（１９９７年）に掲載のシンタニ(Shintani)
等の論文、Arch. Biochem. Biophys.、第１５７巻、第５６１−７２頁に掲載の
モリハラ(Morihara)及びオカ(Oka)の論文）ペプシン状酸プロテアーゼにより認
識される分解部位(Ala-Ala-Lys-Ile-)を含むように処理された。
ＣＲＩＬ遺伝子の組み立て Ｒｅｖ４及び関連するペプチドの通常でないアミノ酸組成及び構造は、Ｒｅｖ
４が天然の信号ペプチド処理部位に直接隣接している場合には、正しいペプチド
分泌または処理を妨害する可能性がある。これは、トランシット(transit)ペプ
チドと、タンパク質をクロロプラストへの輸送のための輸送タンパク質配列との
双方の重要性と同様であると考えられる（Mol. Gen. Genet.、第２０５巻、第４
４６−５３頁に掲載のワスマン(Wassman)等の論文）。従って、ＰＣＲＩＬは、
Ｒｅｖ４ペプチドが、ＰＲ−ｌｂ信号配列に自然になるＰＲ−ｌｂコード化配列
の最初の２０のアミノ酸に対応するペプチドのＣ−末端に融合されるように設計
した。ＰＲ−ｌｂ−Ｒｅｖ４融合生成物からのＲｅｖ４ペプチドの解放を容易に
するため、ＰＲ−ｌｂとＲｅｖ４との接合は、Ｒｅｖ４により抑制されるべきで
はなく（実施例１０）、かつ、多くのかびにより生産される（J. Bio. Chem.、
第２７２巻、第１８８５５−６１頁（１９９７年）に掲載のシンタニ(Shintani)
等の論文、Arch. Biochem. Biophys.、第１５７巻、第５６１−７２頁に掲載の
モリハラ(Morihara)及びオカ(Oka)の論文）ペプシン状酸プロテアーゼにより認
識される分解部位(Ala-Ala-Lys-Ile-)を含むように処理された。
【００６８】 ＰＲ−ｌｂ信号ペプチドをエンコードするＤＮＡ及び熟成したＰＲ−ｌｂタン
パク質の最初の２０のアミノ酸を、２つのオリゴヌクレオチド(AGCACTGAATTCTCT
TCCACAACCAGAGGCTTCTGCTGATGAAGGTGTTGATGAAAGAGAGCTCCATTCTAGGAGATGGCCTTGGTG
G及びGTCACCTGCAGCCACGCCTACATCTGCAC)を使用して、ニコチアナタバキュムｃｖ
サムサン(Nicotiana tabacum cv Samsun)ＮＮのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより
クローニングした。ＰＲ−ｌｂタンパク質コード化配列のクローニングを一致す
るように、ＲＩＬの５’クローニング部位を、CCAGTCTCTAGAACCATGAGGAGATGGCCT
TGG及び新しいプライマACGAAGCTTACCATGGGATTTTTTCTCを使用するＰＣＲ反応によ
り変えた。クローニングされた配列を、ＤＮＡ配列により確認した。この構造物
のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、それぞれ、AGTCACTGCAGCTAAGATTAGGAGATGGCCTTGG
TG及びATGGGATTTTTTCTCTTTTCACAAATGCCCTCATTTTTTCTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTA
ATAATATCTCACTCTTCTCATGCCCAAAACTCTCAACAAGACTATTTGGATGCCCATAACACAGCTCGTGCA
GATGTAGGCGTGGCTGCAGCTAAGATTAGGAGATGGCCTTGGTGGCCTTGGAAATGGCCTCTTATTTAAで
掲げられる。図１に示すような遺伝子カセットＰＣＲＩＬを先づｐＢＳで組み立
て、上記実施例において説明したようにｐＫＬＰ３６に移動させた。得られた新
しいプラスミドは、ｐＫＬＰ ＰＣＲＩＬであった。
パク質の最初の２０のアミノ酸を、２つのオリゴヌクレオチド(AGCACTGAATTCTCT
TCCACAACCAGAGGCTTCTGCTGATGAAGGTGTTGATGAAAGAGAGCTCCATTCTAGGAGATGGCCTTGGTG
G及びGTCACCTGCAGCCACGCCTACATCTGCAC)を使用して、ニコチアナタバキュムｃｖ
サムサン(Nicotiana tabacum cv Samsun)ＮＮのゲノムＤＮＡからＰＣＲにより
クローニングした。ＰＲ−ｌｂタンパク質コード化配列のクローニングを一致す
るように、ＲＩＬの５’クローニング部位を、CCAGTCTCTAGAACCATGAGGAGATGGCCT
TGG及び新しいプライマACGAAGCTTACCATGGGATTTTTTCTCを使用するＰＣＲ反応によ
り変えた。クローニングされた配列を、ＤＮＡ配列により確認した。この構造物
のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、それぞれ、AGTCACTGCAGCTAAGATTAGGAGATGGCCTTGG
TG及びATGGGATTTTTTCTCTTTTCACAAATGCCCTCATTTTTTCTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTA
ATAATATCTCACTCTTCTCATGCCCAAAACTCTCAACAAGACTATTTGGATGCCCATAACACAGCTCGTGCA
GATGTAGGCGTGGCTGCAGCTAAGATTAGGAGATGGCCTTGGTGGCCTTGGAAATGGCCTCTTATTTAAで
掲げられる。図１に示すような遺伝子カセットＰＣＲＩＬを先づｐＢＳで組み立
て、上記実施例において説明したようにｐＫＬＰ３６に移動させた。得られた新
しいプラスミドは、ｐＫＬＰ ＰＣＲＩＬであった。
【００６９】 実施例１８ ｐＰＺＰ及びｐＰＺＰ ＡＰＭの組み立て インビボにおけるＭｙｐ３０に対するＲｅｖ４の保護活性を試験するために、
Ｍｙｐ３０遺伝子を、植物選択マーカとしてゲンタマイシンの抵抗遺伝子を含む
第２の二元ベクタｐＰＺＰ（Plant Molecular Biology、第２５巻、第９８９−
９４頁に掲載のハユヂュキーウィックス(Hajdukiewicz)の論文）をクローニング
した。これにより、第２の形質転換細胞をゲンタマイシン抵抗植物として選択す
ることができるので、Ｍｙｐ３０遺伝子を含む植物を含むＲｅｖ４に二重の形質
転換を行うことができる。
Ｍｙｐ３０遺伝子を、植物選択マーカとしてゲンタマイシンの抵抗遺伝子を含む
第２の二元ベクタｐＰＺＰ（Plant Molecular Biology、第２５巻、第９８９−
９４頁に掲載のハユヂュキーウィックス(Hajdukiewicz)の論文）をクローニング
した。これにより、第２の形質転換細胞をゲンタマイシン抵抗植物として選択す
ることができるので、Ｍｙｐ３０遺伝子を含む植物を含むＲｅｖ４に二重の形質
転換を行うことができる。
【００７０】 Ｍｙｐ３０（ＡＭＹ）及びＰＲ−ｌｂ−Ｍｙｐ３０（ＡＰＭ）を、ＸｈｏＩ及
びＳａｃｌフラグメントとしてｐＢＳ−ＡＭＹ及びｐＢＳ−ＡＰＭ構造物から切
除し（１９９９年に刊行物に提出されたリ(Li)等の論文）、ｐＫＹＬＸに関して
プロモータＥＭＶ−ＦＬＴ−１０に結合させた（Transgenic Research、第６巻
、第１４３−５６頁（１９９７年）に掲載のマイタ(Maita)等の論文）。次に、
ｒｂｃＳ３’ＵＴＲ配列を有するプロモータＡＭＹまたはＡＰＭを、ＥｃｏＲｌ
及びＣｌａｌにより切除（ブランと化）し、（ＥｃｏＲｌ及びＳｍａＩカッティ
ングとして得られた）ｐＰＺＰ２２１ベクタに結合し、得られたプラスミドは、
ｐＰＺＰ−ＡＭＹ及びｐＰＺＰ−ＡＰＭとそれぞれ命名した。
びＳａｃｌフラグメントとしてｐＢＳ−ＡＭＹ及びｐＢＳ−ＡＰＭ構造物から切
除し（１９９９年に刊行物に提出されたリ(Li)等の論文）、ｐＫＹＬＸに関して
プロモータＥＭＶ−ＦＬＴ−１０に結合させた（Transgenic Research、第６巻
、第１４３−５６頁（１９９７年）に掲載のマイタ(Maita)等の論文）。次に、
ｒｂｃＳ３’ＵＴＲ配列を有するプロモータＡＭＹまたはＡＰＭを、ＥｃｏＲｌ
及びＣｌａｌにより切除（ブランと化）し、（ＥｃｏＲｌ及びＳｍａＩカッティ
ングとして得られた）ｐＰＺＰ２２１ベクタに結合し、得られたプラスミドは、
ｐＰＺＰ−ＡＭＹ及びｐＰＺＰ−ＡＰＭとそれぞれ命名した。
【００７１】 実施例１９ Ｒｅｖ４に対する単クローン性抗体の生産 実施例１からの合成Ｒｅｖ４ペプチドを、ディーン(Deen)等の論文（J. Immun
ol. Methods第１２９巻、第１１９−２５頁（１９９０年））の手順に従ってキ
ーホールカサガイ(keyhole limpet)のヘモシアニン（カルビオケム・インコーポ
レーテッド(Calbiochem, Inc.)）と共役させた。共役及び非共役ペプチドをいず
れも、オースベル(Ausubel)等（ワイリー・インターナショナル・プレス発行（
１９８７年）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラ・バイオロジー(C
urrent Protocols in Molecular Biology)）により説明されているようにニュー
ジーランドラビットに注入した。４組の注入後、血清を集め、０．０１％のアジ
化ナトリウムを加え、血清を−８０℃で保存した。
ol. Methods第１２９巻、第１１９−２５頁（１９９０年））の手順に従ってキ
ーホールカサガイ(keyhole limpet)のヘモシアニン（カルビオケム・インコーポ
レーテッド(Calbiochem, Inc.)）と共役させた。共役及び非共役ペプチドをいず
れも、オースベル(Ausubel)等（ワイリー・インターナショナル・プレス発行（
１９８７年）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラ・バイオロジー(C
urrent Protocols in Molecular Biology)）により説明されているようにニュー
ジーランドラビットに注入した。４組の注入後、血清を集め、０．０１％のアジ
化ナトリウムを加え、血清を−８０℃で保存した。
【００７２】 実施例２０ Ｒｅｖ４遺伝子構造物を発現する遺伝形質転換植物の生産 本明細書に記載の研究により、植物プロテアーゼに対して高い安定性を有し、
かつ、植物、かび、昆虫その他の起源のプロテアーゼによる分解に対して他のペ
プチド、ポリペプチドまたはタンパク質を安定にすることができるペプチドのク
ラス及びこれに対応するＤＮＡ配列を識別した。農業経済、園芸、装飾その他の
経済的または商業的に有用な植物は、これらのＤＮＡが、かかる遺伝形質転換植
物に改良された病気耐性を提供しまたはＲｅｖ４に関するペプチドの発現により
得られる他の改良を提供するのに有用なレベルで発現するように、これらのＤＮ
Ａを機能的に動作する態様で導入することにより本発明の利点を得ることができ
る。
かつ、植物、かび、昆虫その他の起源のプロテアーゼによる分解に対して他のペ
プチド、ポリペプチドまたはタンパク質を安定にすることができるペプチドのク
ラス及びこれに対応するＤＮＡ配列を識別した。農業経済、園芸、装飾その他の
経済的または商業的に有用な植物は、これらのＤＮＡが、かかる遺伝形質転換植
物に改良された病気耐性を提供しまたはＲｅｖ４に関するペプチドの発現により
得られる他の改良を提供するのに有用なレベルで発現するように、これらのＤＮ
Ａを機能的に動作する態様で導入することにより本発明の利点を得ることができ
る。
【００７３】 本発明の重要な用途は、Ｒｅｖ４関連ペプチドをエンコードする第１の遺伝子
を導入して、プロテアーゼ分解に対する第２の遺伝子のペプチド、ポリペプチド
またはタンパク質を保護することにあるので、第２の遺伝子を形質転換されるべ
き植物に既に存在させることができ、あるいは第１及び第２の遺伝子を、一方が
第１の遺伝子を含み、他方が第２の遺伝子を含む２つの独立した形質転換植物の
性的ハイブリッド化により一方の植物において組み合わせることができ、あるい
は２つの遺伝子を同時に導入することができる。更にまた、異なるプロモータ及
び他の遺伝子発現成分が提供される異なる転写ユニットから得られる第１及び第
２の遺伝子の遺伝子生成物の代わりに、２つのペプチド、ポリペプチドまたはタ
ンパク質を、１つのプロモータの制御の下で１つの転写ユニットから生産するこ
とができる。かかる単一の転写ユニットは、第１と第２の遺伝子配列が、翻訳の
再開始を許容するＤＮＡ配列により分けられるジシストロン(dicistronic)ユニ
ットを表すことができ、あるいは第２の遺伝子のペプチド、ポリペプチドまたは
タンパク質に融合された第１の遺伝子のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク
質生成物からなるタンパク質融合生成物を生産する単一の翻訳ユニットを表すこ
とができる。かかる融合生成物は、第１及び第２の遺伝子の個々の生成物の活性
及び機能を保持することができ、あるいは２つの個々の生成物はその後の分割に
より融合から解放することができる。生物学的に有効な量のＲｅｖ４及びその生
物学的な機能同等物を発現する遺伝形質転換植物は、 （ａ）（ｉ）植物の遺伝子の形質転換を支配するプロモータ領域、 （ｉｉ）分泌系におけるタンパク質の選別を支配する信号配列をエンコード
する任意のＤＮＡ配列（例えば、Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
、第４２巻、第２１−５３頁（１９９１年）に掲載のクリスピールズ(Chrispeel
s)の論文参照）、 （ｉｉｉ）Ｒｅｖ４と略同じまたは同様の生物学的特性を有する、Ｒｅｖ４
をエンコードする配列を備えたＲＮＡ配列をエンコードするＤＮＡコード化配列
、 （ｉｖ）分泌系におけるタンパク質の選別を支配する信号をエンコードする
任意のＤＮＡ配列（例えば、Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.、第
４２巻、第２１−５３頁（１９９１年）に掲載のクリスピールズの論文参照）、 （ｖ）転写終結及び前記ＲＮＡ配列の３’端部にポリアデニレートヌクレオ
チドの付加をもたらすように植物細胞において機能するポリアデニル化信号をエ
ンコードする３’非翻訳領域 からなり、５’乃至３’方向の配列で作動結合された組み替えＤＮＡ分子で植物
細胞を形質転換し、 （ｂ）形質転換された植物細胞を選択し、 （ｃ）分化され、繁殖力がある遺伝形質転換植物を生産するように形質転換さ
れた植物細胞を再生し、 （ｄ）前記ＤＮＡコード化配列を発現しかつ生物学的機能同等物を生産する細
胞を有する形質転換された植物を選択することにより生産することができる。
を導入して、プロテアーゼ分解に対する第２の遺伝子のペプチド、ポリペプチド
またはタンパク質を保護することにあるので、第２の遺伝子を形質転換されるべ
き植物に既に存在させることができ、あるいは第１及び第２の遺伝子を、一方が
第１の遺伝子を含み、他方が第２の遺伝子を含む２つの独立した形質転換植物の
性的ハイブリッド化により一方の植物において組み合わせることができ、あるい
は２つの遺伝子を同時に導入することができる。更にまた、異なるプロモータ及
び他の遺伝子発現成分が提供される異なる転写ユニットから得られる第１及び第
２の遺伝子の遺伝子生成物の代わりに、２つのペプチド、ポリペプチドまたはタ
ンパク質を、１つのプロモータの制御の下で１つの転写ユニットから生産するこ
とができる。かかる単一の転写ユニットは、第１と第２の遺伝子配列が、翻訳の
再開始を許容するＤＮＡ配列により分けられるジシストロン(dicistronic)ユニ
ットを表すことができ、あるいは第２の遺伝子のペプチド、ポリペプチドまたは
タンパク質に融合された第１の遺伝子のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク
質生成物からなるタンパク質融合生成物を生産する単一の翻訳ユニットを表すこ
とができる。かかる融合生成物は、第１及び第２の遺伝子の個々の生成物の活性
及び機能を保持することができ、あるいは２つの個々の生成物はその後の分割に
より融合から解放することができる。生物学的に有効な量のＲｅｖ４及びその生
物学的な機能同等物を発現する遺伝形質転換植物は、 （ａ）（ｉ）植物の遺伝子の形質転換を支配するプロモータ領域、 （ｉｉ）分泌系におけるタンパク質の選別を支配する信号配列をエンコード
する任意のＤＮＡ配列（例えば、Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
、第４２巻、第２１−５３頁（１９９１年）に掲載のクリスピールズ(Chrispeel
s)の論文参照）、 （ｉｉｉ）Ｒｅｖ４と略同じまたは同様の生物学的特性を有する、Ｒｅｖ４
をエンコードする配列を備えたＲＮＡ配列をエンコードするＤＮＡコード化配列
、 （ｉｖ）分泌系におけるタンパク質の選別を支配する信号をエンコードする
任意のＤＮＡ配列（例えば、Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.、第
４２巻、第２１−５３頁（１９９１年）に掲載のクリスピールズの論文参照）、 （ｖ）転写終結及び前記ＲＮＡ配列の３’端部にポリアデニレートヌクレオ
チドの付加をもたらすように植物細胞において機能するポリアデニル化信号をエ
ンコードする３’非翻訳領域 からなり、５’乃至３’方向の配列で作動結合された組み替えＤＮＡ分子で植物
細胞を形質転換し、 （ｂ）形質転換された植物細胞を選択し、 （ｃ）分化され、繁殖力がある遺伝形質転換植物を生産するように形質転換さ
れた植物細胞を再生し、 （ｄ）前記ＤＮＡコード化配列を発現しかつ生物学的機能同等物を生産する細
胞を有する形質転換された植物を選択することにより生産することができる。
【００７４】 種々の双子葉及び単子葉植物を形質転換する方法は、文献において広く記載さ
れている（例えば、米国特許第５，７７３，６９６号及び該特許で引用されてい
る文献）。かかる方法は、生物学的有効量のＲｅｖ４関連ペプチドまたはその生
物学的機能同等物を発現する遺伝形質転換植物を生産するのに、当業者が使用す
ることができるものである。
れている（例えば、米国特許第５，７７３，６９６号及び該特許で引用されてい
る文献）。かかる方法は、生物学的有効量のＲｅｖ４関連ペプチドまたはその生
物学的機能同等物を発現する遺伝形質転換植物を生産するのに、当業者が使用す
ることができるものである。
【００７５】 本発明を限定するものではない実施例によれば、Ｒｅｖ４関連ペプチドをエン
コードする遺伝子構造体のタバコへの導入が説明されている。アグロバクテリウ
ム媒介の形質転換を使用することができるように、実施例１４、１５、１６及び
１７に記載のｐＫＬＰを、ディッタ(Ditta)等が報告（PNAS、第７７巻、第７３
４７−５１頁、１９８０年）する三親交配(triparent mating)手順により大腸菌
からアグロバクテリウムチュメファシエンスＣ５８に転移させた。
コードする遺伝子構造体のタバコへの導入が説明されている。アグロバクテリウ
ム媒介の形質転換を使用することができるように、実施例１４、１５、１６及び
１７に記載のｐＫＬＰを、ディッタ(Ditta)等が報告（PNAS、第７７巻、第７３
４７−５１頁、１９８０年）する三親交配(triparent mating)手順により大腸菌
からアグロバクテリウムチュメファシエンスＣ５８に転移させた。
【００７６】 次に、ＲＩＬ構造体を含むこのアグロバクテリウムを、ホルシュ(Horsh)等の
報告（PNAS、第８３巻、第２５７１−７５頁、１９８６年）のように、タバコを
形質転換するのに使用した。簡単に説明すると、殺菌した葉のディスクを非選択
培地（３％のスクロースと２．５ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン、更に１ｍｇ
／ｌのインドール−３−酢酸を含むＭＳ寒天培地）を用い２日間アグロバクテリ
アで共培養し(co-culture)、次いで、選択培地［３００ｍｇ／ｌのカナマイシン
（セントルイスに所在するシグマ(Sigma)）と５００ｍｇ／ｌのメフォキシン（
ペンシルバニア州、ウエスト・ポイントに所在するメルク・アンド・カンパニー
(Merck and Co.)）を含む点を除いて非選択培地と同じ］で（週１回新鮮な培地
に移して）培養を継続した。再生されたカナマイシン耐性植物が３−４葉段階(l
eaf stage)にあるときに、植物を、根成長培地（３％のスクロースと５００ｍｇ
／ｌのメフォキシン(mefoxin)を含むＭＳ寒天培地）に移して根誘導に供した。
根を有する小植物を土に移し、標準的な温室において成熟させた。
報告（PNAS、第８３巻、第２５７１−７５頁、１９８６年）のように、タバコを
形質転換するのに使用した。簡単に説明すると、殺菌した葉のディスクを非選択
培地（３％のスクロースと２．５ｍｇ／ｌのベンジルアミノプリン、更に１ｍｇ
／ｌのインドール−３−酢酸を含むＭＳ寒天培地）を用い２日間アグロバクテリ
アで共培養し(co-culture)、次いで、選択培地［３００ｍｇ／ｌのカナマイシン
（セントルイスに所在するシグマ(Sigma)）と５００ｍｇ／ｌのメフォキシン（
ペンシルバニア州、ウエスト・ポイントに所在するメルク・アンド・カンパニー
(Merck and Co.)）を含む点を除いて非選択培地と同じ］で（週１回新鮮な培地
に移して）培養を継続した。再生されたカナマイシン耐性植物が３−４葉段階(l
eaf stage)にあるときに、植物を、根成長培地（３％のスクロースと５００ｍｇ
／ｌのメフォキシン(mefoxin)を含むＭＳ寒天培地）に移して根誘導に供した。
根を有する小植物を土に移し、標準的な温室において成熟させた。
【００７７】 同じセットのアグロバクテリアを使用して、真空浸透プロトコール（Science
、第２６５巻、第１８５６−６０頁（１９９４年）に掲載のベント(Bent)等）に
よりアラビドプシスタリアナ(Arabidopsis thaliana)生態型コロンビア(Columbi
a)を形質転換するのに使用した。即ち、開花アラビドプシス植物をアグロバクテ
リア懸濁液に浸け、次いで、３分間真空にかけた。処理された植物からの種子を
取り入れ、適宜の選択マーカ（カナマイシン及びゲンタマイシンの双方を含む５
０ｍｇ／ｌ）でスクリーン処理した。アラビドプシスにおけるｐＫＬＰ及びｐＰ
ＺＰ構造体の二重形質転換を、アグロバクテリアを含有するｐＰＺＰを、既に形
質転換されたｐＫＬＰ ＲＩＬ、ＰＣＲＩＬ ＰＰＲＩＬ及びＰｒｃＲＩＬアラ
ビドプシス植物に形質転換することにより行った。
、第２６５巻、第１８５６−６０頁（１９９４年）に掲載のベント(Bent)等）に
よりアラビドプシスタリアナ(Arabidopsis thaliana)生態型コロンビア(Columbi
a)を形質転換するのに使用した。即ち、開花アラビドプシス植物をアグロバクテ
リア懸濁液に浸け、次いで、３分間真空にかけた。処理された植物からの種子を
取り入れ、適宜の選択マーカ（カナマイシン及びゲンタマイシンの双方を含む５
０ｍｇ／ｌ）でスクリーン処理した。アラビドプシスにおけるｐＫＬＰ及びｐＰ
ＺＰ構造体の二重形質転換を、アグロバクテリアを含有するｐＰＺＰを、既に形
質転換されたｐＫＬＰ ＲＩＬ、ＰＣＲＩＬ ＰＰＲＩＬ及びＰｒｃＲＩＬアラ
ビドプシス植物に形質転換することにより行った。
【００７８】 実施例２１ 遺伝形質転換植物におけるＲｅｖ４ ｍＲＮＡの検出 形質転換遺伝子(transgene)の発現のレベルは、形質転換が異なるごとにかな
り変化することができるので、形質転換細胞を、更なる分析のために高、中及び
低イクスプレッサ(expressor)に分類するのに有用である。全ＲＮＡを、ＲＮＡ
水性(RNAqueous)で、フェノールを含まない全ＲＮＡ単離キット（テキサス州、
オースチンに所在するアンビオン・インコーポレイテッド(Ambion Inc.)）を使
用して年齢が７乃至８週の遺伝形質転換植物の葉から単離した。個々の形質転換
細胞からの等量の全ＲＮＡ（１０μｇ／）を、１．２％アガロースゲルで分離し
、ナイトラン(Nytran)（ニューハンプシャー州、キーン(Keene)に所在するシュ
ウライハー・アンド・シェル(Schleicher & Schell)に移し、３２Ｐ−標識化Ｒ
ＩＬ ＤＮＡプローブでハイブリッド化し、標準的なプロトコール（コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory
Press)１９８９年発行、サムブルック(Sambrook)等著のモレキュラー・クロー
ニング(Molecular cloning)、ア・ラボラトリー・マニュアル(a Laboratory Man
ual)）を使用して洗浄した。ブロット(blot)（図示せず）を、オートラジオグラ
フィ法及び燐光物質イメージャ（日本国、フジに所在するフジフィルムのフルオ
レセント・イメージ・アナライザ(fluorescent Image Analyzer)ＦＬＡ−２００
０）により可視化した。
り変化することができるので、形質転換細胞を、更なる分析のために高、中及び
低イクスプレッサ(expressor)に分類するのに有用である。全ＲＮＡを、ＲＮＡ
水性(RNAqueous)で、フェノールを含まない全ＲＮＡ単離キット（テキサス州、
オースチンに所在するアンビオン・インコーポレイテッド(Ambion Inc.)）を使
用して年齢が７乃至８週の遺伝形質転換植物の葉から単離した。個々の形質転換
細胞からの等量の全ＲＮＡ（１０μｇ／）を、１．２％アガロースゲルで分離し
、ナイトラン(Nytran)（ニューハンプシャー州、キーン(Keene)に所在するシュ
ウライハー・アンド・シェル(Schleicher & Schell)に移し、３２Ｐ−標識化Ｒ
ＩＬ ＤＮＡプローブでハイブリッド化し、標準的なプロトコール（コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory
Press)１９８９年発行、サムブルック(Sambrook)等著のモレキュラー・クロー
ニング(Molecular cloning)、ア・ラボラトリー・マニュアル(a Laboratory Man
ual)）を使用して洗浄した。ブロット(blot)（図示せず）を、オートラジオグラ
フィ法及び燐光物質イメージャ（日本国、フジに所在するフジフィルムのフルオ
レセント・イメージ・アナライザ(fluorescent Image Analyzer)ＦＬＡ−２００
０）により可視化した。
【００７９】 実施例２２ 遺伝形質転換植物における高い細菌病原体耐性の検出 葉組織（３００ｍｇ）を、若い植物（４−６葉段階）の葉から集め、乳鉢と乳
棒を使用して、２００μｌの２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（０．１２５
ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ６．８、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）
ＳＤＳ、１０％（ｖ／ｖ）ベータ−メルカプトエタノール及び０．００１％（ｗ
／ｖ）ブロモフェノールブルー）において均質化した。サンプルを１０分間煮沸
し、遠心分離して細胞デブリをペレットにし、上澄みをその後の分析のために−
２０℃で保存した。
棒を使用して、２００μｌの２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（０．１２５
ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ６．８、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｗ／ｖ）
ＳＤＳ、１０％（ｖ／ｖ）ベータ−メルカプトエタノール及び０．００１％（ｗ
／ｖ）ブロモフェノールブルー）において均質化した。サンプルを１０分間煮沸
し、遠心分離して細胞デブリをペレットにし、上澄みをその後の分析のために−
２０℃で保存した。
【００８０】 免疫染色(immunoblot)分析のために、タンパク質を、３０ｍｇの葉組織から、
１６．５％のトリス−トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Anal. Biochem.、第１６６巻
、第３６８−７９頁（１９８７年）に掲載のシャガー(Schagger)及びジャゴウ(J
agow)の論文、バイオ−ラッド・ラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories)からの
プレキャストゲル）により分離し、製造者の勧めに従ってトランスブロットセル
(Trans Blot Cell)（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ）を使用してニトロセル
ロース膜に移した。即ち、フィルタをＲｅｖ４ペプチド（実施例１８）特異多ク
ローン性抗体でプローブ処理(probe)した。即ち、移されたタンパク質を含むフ
ィルタを、ＴＴＢＳ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣ
ｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン(Tween)２０、３％（ｗ／ｖ）無脂肪乾燥ミ
ルク）において室温で３０分間培養し、次いで、同じ緩衝液において１時間Ｒｅ
ｖ４特異抗体を用いて培養した。過剰の抗体を、ＴＴＢＳで４回洗浄（各５分）
して除去してから、フィルタを、ペルオキシダーゼ共役やぎ抗うさぎ(goat anti
rabbit)ＩｇＧ（ペンシルバニア州、ウエスト・グローブに所在するジャクソン
・イミュノ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド(Jackson Immun
o Research Laboratories, Inc.)）を含む３％ミルク−ＴＴＢＳを用いて３０分
間培養に供した。過剰の第２の抗体を、ＴＴＢＳで４回洗浄しかつ水で２回洗浄
することにより除去した。次に、フィルタを、ケミルミネッセンス・リアジェン
ト・プラス・キット(Chemiluminescence Reagent Plus Kit)（マサチューセッツ
州、ボストンに所在するデュポン・ネン・リサーチ・プロダクツ(DuPont NEN Re
search Products)で現像し、得られたケミルミネッセンスを写真フィルムに露光
することにより検出した。
１６．５％のトリス−トリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Anal. Biochem.、第１６６巻
、第３６８−７９頁（１９８７年）に掲載のシャガー(Schagger)及びジャゴウ(J
agow)の論文、バイオ−ラッド・ラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories)からの
プレキャストゲル）により分離し、製造者の勧めに従ってトランスブロットセル
(Trans Blot Cell)（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ）を使用してニトロセル
ロース膜に移した。即ち、フィルタをＲｅｖ４ペプチド（実施例１８）特異多ク
ローン性抗体でプローブ処理(probe)した。即ち、移されたタンパク質を含むフ
ィルタを、ＴＴＢＳ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣ
ｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン(Tween)２０、３％（ｗ／ｖ）無脂肪乾燥ミ
ルク）において室温で３０分間培養し、次いで、同じ緩衝液において１時間Ｒｅ
ｖ４特異抗体を用いて培養した。過剰の抗体を、ＴＴＢＳで４回洗浄（各５分）
して除去してから、フィルタを、ペルオキシダーゼ共役やぎ抗うさぎ(goat anti
rabbit)ＩｇＧ（ペンシルバニア州、ウエスト・グローブに所在するジャクソン
・イミュノ・リサーチ・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド(Jackson Immun
o Research Laboratories, Inc.)）を含む３％ミルク−ＴＴＢＳを用いて３０分
間培養に供した。過剰の第２の抗体を、ＴＴＢＳで４回洗浄しかつ水で２回洗浄
することにより除去した。次に、フィルタを、ケミルミネッセンス・リアジェン
ト・プラス・キット(Chemiluminescence Reagent Plus Kit)（マサチューセッツ
州、ボストンに所在するデュポン・ネン・リサーチ・プロダクツ(DuPont NEN Re
search Products)で現像し、得られたケミルミネッセンスを写真フィルムに露光
することにより検出した。
【００８１】 遺伝形質転換植物におけるＲＩＬ遺伝子の発現はまた、高い病気耐性のような
、またはＲｅｖ４−関連ペプチドの生物学的特性を第２の生物学的に活性なペプ
チド、ポリペプチドもしくはタンパク質と組み合わせることにより得られる他の
好都合な表現型のような表現型分析を使用して検出することができる。
、またはＲｅｖ４−関連ペプチドの生物学的特性を第２の生物学的に活性なペプ
チド、ポリペプチドもしくはタンパク質と組み合わせることにより得られる他の
好都合な表現型のような表現型分析を使用して検出することができる。
【００８２】 実施例２３ 遺伝形質転換植物における高い細菌病原体耐性の検出 細菌による病気の耐性の増加は、一次形質転換細胞の後代において行うことが
できる。タバコ細菌病原体であるエルウィニアカロトボラ亜種カロトボラ(Erwin
ia carotovora subsp. carotovora)（Molecular Plant-Microbe Interactions、
第４巻、第２７６−８３頁（１９９１年）に掲載のパーホネン(Pirhonen)等の論
文）を使用して、タバコ植物の試験を行った。細菌を一晩培養したものを、遠心
分離（１０００ｘｇ）し、ペレットを、ＯＤ６００−０．８を有する溶液が得ら
れるまで、無菌の水において再懸濁させた。バクテリア即ち細菌懸濁液２μｌを
、Ｍ２４個の溜めを有するマイクロタイタプレートのＳ培地において成長させた
個々のタバコの実生(seedling)（年齢５−６週）の引き延ばした葉に滴下した。
２３−２４℃の成長室において１０時間明／１４時間暗の周期で培養を行った。
１４日後、死んだ植物の数を記録した。
できる。タバコ細菌病原体であるエルウィニアカロトボラ亜種カロトボラ(Erwin
ia carotovora subsp. carotovora)（Molecular Plant-Microbe Interactions、
第４巻、第２７６−８３頁（１９９１年）に掲載のパーホネン(Pirhonen)等の論
文）を使用して、タバコ植物の試験を行った。細菌を一晩培養したものを、遠心
分離（１０００ｘｇ）し、ペレットを、ＯＤ６００−０．８を有する溶液が得ら
れるまで、無菌の水において再懸濁させた。バクテリア即ち細菌懸濁液２μｌを
、Ｍ２４個の溜めを有するマイクロタイタプレートのＳ培地において成長させた
個々のタバコの実生(seedling)（年齢５−６週）の引き延ばした葉に滴下した。
２３−２４℃の成長室において１０時間明／１４時間暗の周期で培養を行った。
１４日後、死んだ植物の数を記録した。
【表９】
【００８３】 表は、Ｒｅｖ４遺伝形質転換タバコ植物のエルウィニアカロトボラ耐性試験を
示す。細菌懸濁液即ち細菌サスペンション２μｌを、各タバコ実生（年齢４週間
）の葉に接種し、ＭＳ培地を含む２４個の溜めを有するプレートで培養した。各
試験は、各遺伝形質転換ライン及びＫＹＬＸ対照に関して、６つの植物の８つの
複製に関して行った。
示す。細菌懸濁液即ち細菌サスペンション２μｌを、各タバコ実生（年齢４週間
）の葉に接種し、ＭＳ培地を含む２４個の溜めを有するプレートで培養した。各
試験は、各遺伝形質転換ライン及びＫＹＬＸ対照に関して、６つの植物の８つの
複製に関して行った。
【００８４】 Ｒｅｖ４の細菌即ちバクテリア耐性の試験には、アラビドプシス、プソイドモ
ナスシリンガエパソバールマクリコラ(Pseudomonas syringae pv. maculicola)
ＥＳ４３２６を使用した。細菌を一晩培養したものを、回転に供し、シルウェッ
ト(Silwet)１−７７（２００μｌ／リットル）を含む１０ｍＭのＭｇＳＯ４にお
いて再懸濁させて、ＯＤ６００−０．００１をつくった。年齢が４週のアラビド
プシス植物（８時間明／１６時間暗、２３℃で成長させた）を、細菌の溶液に浸
し、簡単に水を切り、成長室に戻した。４日後、写真を撮り、各グループの平均
感染葉を粉砕し、ＬＢ培地に拡げ、細菌の係数を行った。
ナスシリンガエパソバールマクリコラ(Pseudomonas syringae pv. maculicola)
ＥＳ４３２６を使用した。細菌を一晩培養したものを、回転に供し、シルウェッ
ト(Silwet)１−７７（２００μｌ／リットル）を含む１０ｍＭのＭｇＳＯ４にお
いて再懸濁させて、ＯＤ６００−０．００１をつくった。年齢が４週のアラビド
プシス植物（８時間明／１６時間暗、２３℃で成長させた）を、細菌の溶液に浸
し、簡単に水を切り、成長室に戻した。４日後、写真を撮り、各グループの平均
感染葉を粉砕し、ＬＢ培地に拡げ、細菌の係数を行った。
【００８５】 実施例２４ 遺伝形質転換植物の高いかび病原体耐性の検出 タバコ青かびを使用し、このかび病原体に対する高い病気耐性について遺伝形
質転換タバコ植物の試験を行った。タバコの葉のパネル（葉当たり８つのパネル
、同じ年齢の植物当たり葉１枚、各ライン３つの植物）に、水溶液（１０μｌ）
において１００個の胞子を浸透させた。７日後、個々の葉の全感染面積を測定し
た。病気のひどさの低減を、水対照で見られた病気のひどさのパーセントとして
算出した。
質転換タバコ植物の試験を行った。タバコの葉のパネル（葉当たり８つのパネル
、同じ年齢の植物当たり葉１枚、各ライン３つの植物）に、水溶液（１０μｌ）
において１００個の胞子を浸透させた。７日後、個々の葉の全感染面積を測定し
た。病気のひどさの低減を、水対照で見られた病気のひどさのパーセントとして
算出した。
【００８６】 アラビドプシスＲｅｖ４遺伝形質転換植物のかび耐性については、ペロノスポ
ラパラジチカパソバールノコ２(Peronospora parasitica var. Noco 2)を使用し
て試験を行った。かびの活性胞子（水中、５００００個の胞子／ｍｌ）を年齢が
２週のアラビドプシスの実生に噴霧した。６日後、症候を写真により記録した。
アラビドプシス植物の成長条件は、実施例２２と同じであった。
ラパラジチカパソバールノコ２(Peronospora parasitica var. Noco 2)を使用し
て試験を行った。かびの活性胞子（水中、５００００個の胞子／ｍｌ）を年齢が
２週のアラビドプシスの実生に噴霧した。６日後、症候を写真により記録した。
アラビドプシス植物の成長条件は、実施例２２と同じであった。
【表１０】
【００８７】 （産業上の利用可能性） 本発明は、農業に関する。
【００８８】 （配列リスト） 配列識別番号１（２４のアミノ酸）[MYP30] Met Gly Ile Gly Lys Phe Leu Arg Glu Ala Gly Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val
Gly Glu Ile Met Lys Pro 配列識別番号２（１３のアミノ酸）[インドリシジン（アミド）] Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg 配列識別番号３（１３のアミノ酸） [CP-11] Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys 配列識別番号４（１３のアミノ酸） [Rev4 (アミド)] Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile 配列識別番号５（１４のアミノ酸） [Ser-Rev4-OH] Ser Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile 配列識別番号６（２６のアミノ酸） [Rev4-C-融合] Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile Gly Gly Gly Tyr Asp
Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro 配列識別番号７（１３のアミノ酸） [インドリシジンF (アミド)] Ile Leu Pro Phe Lys Phe Pro Phe Phe Pro Phe Arg Arg 配列識別番号８（１２のアミノ酸） [インドリシジンF-P (アミド)] Ile Leu Lys Gly Phe Pro Gly Phe Pro Arg Arg Lys 配列識別番号９（２１のアミノ酸） [逆PGLc] Leu Ala Lys Leu Ala Val Lys Ala Ile Lys Gly Ala Ile Ala Gly Ala Lys Ser
Ala Met Gly 配列識別番号１０(３１のアミノ酸) [逆セクロピンP1] Arg Pro Gly Gly Gln Ile Ala Ile Ala Ile Gly Glu Ser Ile Arg Lys Lys Ala
Ser Asn Glu Leu Lys Lys Ala Thr Lys Ser Leu Trp Ser 配列識別番号１１（３７のアミノ酸）[逆セクロピンＡアミド] Lys Ala Ile Gln Thr Ala Gln Gly Val Val Ala Val Ala Pro Gly Ala Lys Ile
Ile Gly Asp Arg Ile Asn Gln Gly Val Lys Glu Ile Lys Lys Phe Leu Lys Trp
Lys 配列識別番号１２（２７のアミノ酸）[逆ボンビニン状ペプチドアミド] Asn Ala Phe His Glu Ala Leu Gly Lys Ala Leu Gly Lys Leu Ala Ser Lys Gly
Ala Ser Leu Ile Ser Ala Gly Ile Gly 配列識別番号１３（２３のアミノ酸）[マゲイニン２] Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly
Glu Ile Met Asn Ser 配列識別番号１４（ＲＩＬ） Arg-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Leu-Ile 配列識別番号１５（ＲＩＬコード化） AGGAGATGGCCTTGGTGGCCTTGGAAATGGCCTCTTATT 配列識別番号１６（プライマＲＩＬ５’ＸｂａＩ） CCAGTCTCTAGAACCATGAGGAGATGGCCTTGG 配列識別番号１７（プライマＲＩＬ３’ＳａｃＩ） GACTGGAGCTCTTAAATAAGAGGCCATTTCCAAGGCCACCAAGGCCATCTCCT 配列識別番号１８（プライマＲＩＬ５’ＥｃｏＲＩ） AGCTGGGAATTCTAGGAGATGGCCTTGGTGGC 配列識別番号１９（プライマＲＩＬ３’ＸｂａＩ） ATGGACTCTAGATTAAATAAGAGGCCATTTCCAAGGCCACCAAGGCCATCTCCT 配列識別番号２０（Ｐｒｏ） Leu-Pro-Gln-Pro-Glu-Ala-Ser-Ala-Asp-Glu-Gly-Val-Asp-Glu-Arg-Glu-Leu- His
*-Ser 配列識別番号２１（プライマＰＲＩＬ５’） AGCACTGAATTCTCTTCCACAACCAGAGGCTTCTGCTGATGAAGGTGTTGATGAAAGAGAGCTCCATTCTAG
GAGATGGCCTTGGTGG 配列識別番号２２（プライマｃＰＲ１ｂ３’ＰｓｔＩ） GTCACCTGCAGCCACGCCTACATCTGCAC 配列識別番号２３（プライマＰＲ−ｌｂ５’ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｎｃｏｌ） ACGAAGCTTACCATGGGATTTTTTCTC 配列識別番号２４（プライマＲＩＬ５’ＰｓｔＩ） AGTCACTGCAGCTAAGATTAGGAGATGGCCTTGGTG 配列識別番号２５ (PCRIL DNA コード化配列） ATGGGATTTTTTCTCTTTTCACAAATGCCCTCATTTTTTCTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTAATAATA
TCTCACTCTTCTCATGCCCAAAACTCTCAACAAGACTATTTGGATGCCCATAACACAGCTCGTGCAGATGTA
GGCGTGGCTGCAGCTAAGATTAGGAGATGGCCTTGGTGGCCTTGGAAATGGCCTCTTATTTAA 配列識別番号２６(PCRILの全配列) Met Gly Phe Phe Leu Phe Ser Gln Met Pro Ser Phe Phe Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Ile Ile Ser His Ser Ser His Ala* Gln Asn Ser Gln Gln
Asp Tyr Leu Asp Ala His Asn Thr Ala Arg Ala Asp Val Gly Val Ala Ala Al
a Lys#Ile Arg ArgTrp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile * 及び# は、それぞれ、PR-1b 信号ペプチド及びPR-1bコード化分割部位である
。ＲＩＬペプチド配列には下線が付されている。
Gly Glu Ile Met Lys Pro 配列識別番号２（１３のアミノ酸）[インドリシジン（アミド）] Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg 配列識別番号３（１３のアミノ酸） [CP-11] Ile Leu Lys Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Lys 配列識別番号４（１３のアミノ酸） [Rev4 (アミド)] Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile 配列識別番号５（１４のアミノ酸） [Ser-Rev4-OH] Ser Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile 配列識別番号６（２６のアミノ酸） [Rev4-C-融合] Arg Arg Trp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile Gly Gly Gly Tyr Asp
Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro 配列識別番号７（１３のアミノ酸） [インドリシジンF (アミド)] Ile Leu Pro Phe Lys Phe Pro Phe Phe Pro Phe Arg Arg 配列識別番号８（１２のアミノ酸） [インドリシジンF-P (アミド)] Ile Leu Lys Gly Phe Pro Gly Phe Pro Arg Arg Lys 配列識別番号９（２１のアミノ酸） [逆PGLc] Leu Ala Lys Leu Ala Val Lys Ala Ile Lys Gly Ala Ile Ala Gly Ala Lys Ser
Ala Met Gly 配列識別番号１０(３１のアミノ酸) [逆セクロピンP1] Arg Pro Gly Gly Gln Ile Ala Ile Ala Ile Gly Glu Ser Ile Arg Lys Lys Ala
Ser Asn Glu Leu Lys Lys Ala Thr Lys Ser Leu Trp Ser 配列識別番号１１（３７のアミノ酸）[逆セクロピンＡアミド] Lys Ala Ile Gln Thr Ala Gln Gly Val Val Ala Val Ala Pro Gly Ala Lys Ile
Ile Gly Asp Arg Ile Asn Gln Gly Val Lys Glu Ile Lys Lys Phe Leu Lys Trp
Lys 配列識別番号１２（２７のアミノ酸）[逆ボンビニン状ペプチドアミド] Asn Ala Phe His Glu Ala Leu Gly Lys Ala Leu Gly Lys Leu Ala Ser Lys Gly
Ala Ser Leu Ile Ser Ala Gly Ile Gly 配列識別番号１３（２３のアミノ酸）[マゲイニン２] Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly
Glu Ile Met Asn Ser 配列識別番号１４（ＲＩＬ） Arg-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Leu-Ile 配列識別番号１５（ＲＩＬコード化） AGGAGATGGCCTTGGTGGCCTTGGAAATGGCCTCTTATT 配列識別番号１６（プライマＲＩＬ５’ＸｂａＩ） CCAGTCTCTAGAACCATGAGGAGATGGCCTTGG 配列識別番号１７（プライマＲＩＬ３’ＳａｃＩ） GACTGGAGCTCTTAAATAAGAGGCCATTTCCAAGGCCACCAAGGCCATCTCCT 配列識別番号１８（プライマＲＩＬ５’ＥｃｏＲＩ） AGCTGGGAATTCTAGGAGATGGCCTTGGTGGC 配列識別番号１９（プライマＲＩＬ３’ＸｂａＩ） ATGGACTCTAGATTAAATAAGAGGCCATTTCCAAGGCCACCAAGGCCATCTCCT 配列識別番号２０（Ｐｒｏ） Leu-Pro-Gln-Pro-Glu-Ala-Ser-Ala-Asp-Glu-Gly-Val-Asp-Glu-Arg-Glu-Leu- His
*-Ser 配列識別番号２１（プライマＰＲＩＬ５’） AGCACTGAATTCTCTTCCACAACCAGAGGCTTCTGCTGATGAAGGTGTTGATGAAAGAGAGCTCCATTCTAG
GAGATGGCCTTGGTGG 配列識別番号２２（プライマｃＰＲ１ｂ３’ＰｓｔＩ） GTCACCTGCAGCCACGCCTACATCTGCAC 配列識別番号２３（プライマＰＲ−ｌｂ５’ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｎｃｏｌ） ACGAAGCTTACCATGGGATTTTTTCTC 配列識別番号２４（プライマＲＩＬ５’ＰｓｔＩ） AGTCACTGCAGCTAAGATTAGGAGATGGCCTTGGTG 配列識別番号２５ (PCRIL DNA コード化配列） ATGGGATTTTTTCTCTTTTCACAAATGCCCTCATTTTTTCTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTAATAATA
TCTCACTCTTCTCATGCCCAAAACTCTCAACAAGACTATTTGGATGCCCATAACACAGCTCGTGCAGATGTA
GGCGTGGCTGCAGCTAAGATTAGGAGATGGCCTTGGTGGCCTTGGAAATGGCCTCTTATTTAA 配列識別番号２６(PCRILの全配列) Met Gly Phe Phe Leu Phe Ser Gln Met Pro Ser Phe Phe Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Ile Ile Ser His Ser Ser His Ala* Gln Asn Ser Gln Gln
Asp Tyr Leu Asp Ala His Asn Thr Ala Arg Ala Asp Val Gly Val Ala Ala Al
a Lys#Ile Arg ArgTrp Pro Trp Trp Pro Trp Lys Trp Pro Leu Ile * 及び# は、それぞれ、PR-1b 信号ペプチド及びPR-1bコード化分割部位である
。ＲＩＬペプチド配列には下線が付されている。
【図１】 Ｒｅｖ４をエンコードする核酸配列を有する遺伝子構造体ＲＩＬを示す図であ
る。
る。
【図２】 タンパク質分解に対するＲｅｖ４及び関連構造体の安定性を示すグラフ図であ
る。
る。
【図３】 Ｒｅｖ４を含む遺伝形質転換植物の細菌病原体を示すグラフ図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年６月４日（２００１．６．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】 インドリシジンの数多くの類似体が、抗微生物及び溶血活性の要件を評価しか
つ活性を高めるために、合成されて試験に供されている。スバラクシュミ（FEBS
Letters、第３９５巻、第４８−５２頁（１９９６年））等は、プロリンがアラ
ニンと置換され、かつ、トリプトファンがフェニルアラニンで置換されているペ
プチドは、インドリシジンと匹敵する抗微生物活性を呈すると報告している。し
かしながら、トリプトファンをフェニルアラニンで置換すると、溶血活性の損失
が生ずる。ファラ(Falla)とハンコック(Hancock)（Antimicrobial Agents and C
hemotherapy、第４１巻、第７７１−７５頁（１９９７年））は、正に帯電した
残分の数を多くし、長さを短くし（１３アミノ酸）、かつ、インドリシジンに対
する両親媒性を高めるように構成された、インドリシジンに基づく合成ペプチド
であるＣＰ−１１、Ile-Leu-Lys-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lysに
ついて試験を行った。ＣＰ−１１は、大腸菌、緑膿菌及びカンジダアルビカンス
(Candida albicans)に対して良好な活性を有するが、黄色ブドウ球菌に対しては
活性が低いことがわかった。リム(Lim)等（J. Biochem. Mol. Biol.、第３０巻
、第２２９−３３頁（１９９７年））は、インドリシジンにおけるある種のトリ
プトファン、プロリンまたはアルギニンを置換する作用に関して試験を行った。
イソロイシンまたはグリシンによるトリプトファン残分の置換は、許容されるが
、プロ７(Pro7)のアラニンによる置換は、大腸菌に対する活性を有意に低くして
いる。アラニンによりＡｒｇ１２またはＡｒｇ１３の置換もまた、生物活性を低
下させている。
つ活性を高めるために、合成されて試験に供されている。スバラクシュミ（FEBS
Letters、第３９５巻、第４８−５２頁（１９９６年））等は、プロリンがアラ
ニンと置換され、かつ、トリプトファンがフェニルアラニンで置換されているペ
プチドは、インドリシジンと匹敵する抗微生物活性を呈すると報告している。し
かしながら、トリプトファンをフェニルアラニンで置換すると、溶血活性の損失
が生ずる。ファラ(Falla)とハンコック(Hancock)（Antimicrobial Agents and C
hemotherapy、第４１巻、第７７１−７５頁（１９９７年））は、正に帯電した
残分の数を多くし、長さを短くし（１３アミノ酸）、かつ、インドリシジンに対
する両親媒性を高めるように構成された、インドリシジンに基づく合成ペプチド
であるＣＰ−１１、Ile-Leu-Lys-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-Lysに
ついて試験を行った。ＣＰ−１１は、大腸菌、緑膿菌及びカンジダアルビカンス
(Candida albicans)に対して良好な活性を有するが、黄色ブドウ球菌に対しては
活性が低いことがわかった。リム(Lim)等（J. Biochem. Mol. Biol.、第３０巻
、第２２９−３３頁（１９９７年））は、インドリシジンにおけるある種のトリ
プトファン、プロリンまたはアルギニンを置換する作用に関して試験を行った。
イソロイシンまたはグリシンによるトリプトファン残分の置換は、許容されるが
、プロ７(Pro7)のアラニンによる置換は、大腸菌に対する活性を有意に低くして
いる。アラニンによりＡｒｇ１２またはＡｒｇ１３の置換もまた、生物活性を低
下させている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＴ，ＡＵ，Ｂ Ｒ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者 エヴァレット，ニコラス，ピー． アメリカ合衆国95722カリフォルニア州メ ドウ・ヴィスタ，アップル・トゥリー・レ イン・604 (72)発明者 リー，キンシャン アメリカ合衆国40515ケンタッキー州レキ シントン，カンブレリング・ドライヴ・ 2268 (72)発明者 ローレンス，クリストファー アメリカ合衆国40503ケンタッキー州レキ シントン，シェリダン・ドライヴ・625 (72)発明者 デイヴィーズ，エイチ．，メイロー アメリカ合衆国40515ケンタッキー州レキ シントン，リーフランド・プレイス・2137 Ｆターム(参考） 2B030 AD08 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 EA04 GA11 4B065 AA88X AA90Y AB01 AC20 BA02 CA24 CA53 4H011 AA01 AA03 AA04 BA01 BB06 BC18 DA14 DD03 4H045 AA10 AA30 BA16 BA18 CA40 DA56 EA05
Claims (48)
- 【請求項１】植物に施用されまたは植物により生産されるタンパク質のプロ
テアーゼ分解の程度を低減させる方法であって、植物またはその一部にインドリ
シジン、Arg-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Leu-Ile (Rev4) また
はその機能同等物よりなるペプチドを投与する工程を備えることを特徴とする方
法。 - 【請求項２】前記機能同等物は X-X-Y-Y-Y-Y-Y-Y-X-Y-Y-Y-Y; または Y-Y-Y-Y-X-Y-Y-Y-Y-Y-Y-X-X の式を有し、 該式において、各Ｘは個別にアルギニン、リシンまたはヒスチジンであり、 各Ｙは個別にトリプトファン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソ
ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンまたはリシンであることを
特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記ペプチドはSer-Arg-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Lys-Tr
p-Pro-Leu-Ile (Ser-Rev4-OH)であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記ペプチドはArg-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Lys-Trp-Pr
o-Leu-Ile-Gly-Gly-Gly-Tyr-Asp-Pro-Ala-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro (Rev4-C-融
合)であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】前記タンパク質は抗病原体剤であることを特徴とする請求項１
に記載の方法。 - 【請求項６】前記タンパク質は抗細菌剤であることを特徴とする請求項５に
記載の方法。 - 【請求項７】前記タンパク質は抗かび剤であることを特徴とする請求項５に
記載の方法。 - 【請求項８】前記タンパク質は抗ウイルス剤であることを特徴とする請求項
５に記載の方法。 - 【請求項９】前記タンパク質は殺虫剤であることを特徴とする請求項５に記
載の方法。 - 【請求項１０】前記タンパク質はマゲイニン、逆マゲイニン、ＰＧＬｃ、逆
ＰＧＬｃ、ＰＩ、逆ＰＩ、セクロピン、逆セクロピン、サルコトキシン、逆サル
コトキシン、ボンビニン、逆ボンビニン、ＸＰＦ、逆ＸＰＦ、チオニン、逆チオ
ニン、デフェンシン、逆デフェンシン、メリチン、逆メリチン、ＰＧＬａ、逆Ｐ
ＧＬａ、デルマセプチン、逆デルマセプチン、ヒスタチン、逆ヒスタチン、ブタ
骨髄細胞から誘導されるペプチド、ヒト好中球カテプシンＧから誘導されるペプ
チド、ウシ好中球から誘導される抗微生物ペプチド、セミナルプラスミン、ラク
トフェリンから誘導される抗微生物剤、ドロソシン、タチプレシン、逆タチプレ
シン、トウモロコシ塩基ペプチドＩ、トラキアル抗微生物ペプチド、アマランス
の種子からの抗微生物ペプチド、ミラビリスジャラパの種子からの抗微生物ペプ
チド、ラナレキシン、ブレベニン、スブチリン、ニシン、エピダーミン、ラクタ
シン４８１及び塩基性の両親媒性ペプチドよりなる群から選ばれることを特徴と
する請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】前記タンパク質は酵素、薬剤、農業生産物、飼料添加物及び
食品添加物よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】前記ペプチドはＲｅｖ４であり、前記タンパク質はマゲイニ
ン及び逆マゲイニンよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１３】前記投与は前記植物またはその一部を前記ペプチドをエンコ
ードする配列からなる非天然ＤＮＡで形質転換することにより行われることを特
徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】前記投与は前記植物またはその一部に前記ペプチド機能同等
物からなる組成物を噴霧することにより行われることを特徴とする請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１５】前記組成物は前記タンパク質を更に含むことを特徴とする請
求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】前記植物またはその一部に対する前記噴霧は前記植物または
その一部が取り入れられた後に行われることを特徴とする請求項１４に記載の方
法。 - 【請求項１７】前記植物またはその一部に対する前記噴霧は前記植物または
その一部の処理または処方の際に行われることを特徴とする請求項１４に記載の
方法。 - 【請求項１８】前記プロテアーゼは植物プロテアーゼであることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項１９】前記プロテアーゼは細菌プロテアーゼであることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項２０】前記プロテアーゼはウイルスプロテアーゼであることを特徴
とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項２１】前記プロテアーゼはかびプロテアーゼであることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項２２】前記プロテアーゼは昆虫プロテアーゼであることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項２３】前記植物またはその一部はトウモロコシ、トマト、芝生草、
アスパラガス、パパイヤ、ヒマワリ、ライ麦、豆、ショウガ、ハス、竹、ジャガ
イモ、米、ピーナツ、大麦、麦芽、小麦、アルファルファ、大豆、オート麦、ナ
ス、カボチャ、玉ネギ、ブロッコリ、サトウキビ、甜菜、ビート、リンゴ、オレ
ンジ、グレープフルーツ、西洋ナシ、プラム、モモ、パイナップル、ブドウ、バ
ラ、カーネーション、ひなぎく、チューリップ、ベイマツ、西洋スギ、マツ、ト
ウヒ、エンドウ、綿、亜麻、コーヒー及びタバコよりなる群から選ばれることを
特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項２４】前記ペプチドは少なくとも１つの別のペプチドと融合される
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項２５】前記ペプチドは少なくとも１つの他のペプチドと共役される
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項２６】前記ペプチドは前記ペプチドを前記植物またはその一部に施
用することにより投与され、前記ペプチドは少なくとも１つの他のペプチドと架
橋されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項２７】植物またはその一部にＲｅｖ４またはその機能同等物を投与
する工程を備えることを特徴とする植物病原体の生長を抑制する方法。 - 【請求項２８】Ｒｅｖ４(Arg-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-L
eu-Ile)またはその機能同等物からなることを特徴とするペプチド。 - 【請求項２９】Ｒｅｖ４(Arg-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-L
eu-Ile)またはその機能同等物をエンコードする配列を備えることを特徴とする
核酸分子。 - 【請求項３０】AGGAGATGGCCTTGGTGGCCTTGGAAATGGCCTCTTATTまたはその補体
からなることを特徴とする請求項２９に記載の核酸分子。 - 【請求項３１】ＤＮＡであることを特徴とする請求項２９に記載の核酸分子
。 - 【請求項３２】ＲＮＡであることを特徴とする請求項２９に記載の核酸分子
。 - 【請求項３３】植物において機能を行う５’乃至３’転写開始領域と、Ｒｅ
ｖ４またはその機能同等物をエンコードする核酸と、転写終結配列とを備えるこ
とを特徴とする核酸構造体。 - 【請求項３４】調整核酸配列を更に備えることを特徴とする請求項３３に記
載の核酸構造体。 - 【請求項３５】リポータ遺伝子を更に備えることを特徴とする請求項３３に
記載の核酸構造体。 - 【請求項３６】Ｒｅｖ４またはその機能同等物をエンコードする配列を有す
る核酸からなることを特徴とする遺伝形質転換植物。 - 【請求項３７】前記配列はX-X-Y-Y-Y-Y-Y-Y-X-Y-Y-Y-Yなる式を有する機能
同等物またはＲｅｖ４をエンコードし、 上記式において、各Ｘは個別にアルギニン、リシンまたはヒスチジンであり、 各Ｙは個別にトリプトファン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソ
ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンまたはリシンであることを
特徴とする請求項３６に記載の遺伝形質転換植物。 - 【請求項３８】農業経済上重要なタンパク質をエンコードする少なくとも１
つの核酸を更に備えることを特徴とする請求項３６に記載の遺伝形質転換植物。 - 【請求項３９】Ｒｅｖ４またはその機能同等物をエンコードするＤＮＡ配列
を含むゲノムを有する植物をつくる工程を備え、前記配列は発現されることを特
徴とする植物の製造方法。 - 【請求項４０】原形質体を前記ＤＮＡ分子で安定に形質転換する工程と、 植物を形質転換された原形質から得る工程とを備えることを特徴とする請求項
３９に記載の方法。 - 【請求項４１】ＤＮＡ分子を植物組織に導入する工程と、 ＤＮＡ分子を含む植物組織を再生する工程とを備えることを特徴とする請求項
３９に記載の方法。 - 【請求項４２】前記植物は農業経済上重要なタンパク質をエンコードするＤ
ＮＡ配列を更に含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。 - 【請求項４３】請求項３６に記載の植物から得られることを特徴とする種子
。 - 【請求項４４】Arg-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Leu-Ile (R
ev4)またはその機能同等物をエンコードする核酸配列を備えることを特徴とする
植物細胞。 - 【請求項４５】農業経済上重要なタンパク質をエンコードする核酸配列を更
に備えることを特徴とする請求項４４に記載の植物細胞。 - 【請求項４６】Ｒｅｖ４またはその機能同等物と、キャリヤとを備えること
を特徴とするペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をプロテアーゼ分解から
保護するのに使用する組成物。 - 【請求項４７】前記機能同等物は式X-X-Y-Y-Y-Y-Y-Y-X-Y-Y-Y-Yを備え、 上記式において、各Ｘは個別にアルギニン、リシンまたはヒスチジンであり、 各Ｙは個別にトリプトファン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソ
ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンまたはリシンであることを
特徴とする請求項４６に記載の組成物。 - 【請求項４８】農業経済上重要なタンパク質を更に備えることを特徴とする
請求項４６に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10637398P | 1998-10-30 | 1998-10-30 | |
| US60/106,373 | 1998-10-30 | ||
| US10653798P | 1998-11-02 | 1998-11-02 | |
| US60/106,573 | 1998-11-02 | ||
| PCT/US1999/025561 WO2000026344A1 (en) | 1998-10-30 | 1999-10-29 | Peptides with enhanced stability to protease degradation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002530274A true JP2002530274A (ja) | 2002-09-17 |
Family
ID=26803598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000579716A Pending JP2002530274A (ja) | 1998-10-30 | 1999-10-29 | プロテアーゼ分解に対する安定性の高いペプチド |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7214766B2 (ja) |
| JP (1) | JP2002530274A (ja) |
| BR (1) | BR9914922A (ja) |
| WO (1) | WO2000026344A1 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6835868B1 (en) | 1999-03-17 | 2004-12-28 | University Of Victoria Innovation And Development Corporation | Transgenic plants expressing dermaseptin peptides providing broad spectrum resistance to pathogens |
| EP1163352A1 (en) * | 1999-03-17 | 2001-12-19 | University Of Victoria Innovation And Development Corporation | Transgenic plants that are resistant to a broad spectrum of pathogens |
| EP1130104A1 (en) * | 2000-02-16 | 2001-09-05 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Reduction of in planta degradation of recombinant plant products |
| US7550558B2 (en) * | 2001-06-01 | 2009-06-23 | Fundacao De Ampara A Pesquiso Do Estado De Sao Paolo (Fapesp) | Antimicrobial peptides and methods for identifying and using such peptides |
| JP2008500835A (ja) * | 2004-05-28 | 2008-01-17 | カーギル インコーポレイテッド | ヒスチジン含有量を増強した動物飼料組成物 |
| SI1771463T1 (sl) * | 2004-07-16 | 2008-06-30 | Lonza Ag | Postopek za sintezo peptidov |
| US7538187B2 (en) * | 2005-08-01 | 2009-05-26 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Coloring compositions with peptide-based dispersants and binders |
| CN102206250B (zh) | 2010-03-29 | 2017-03-15 | 翔升科技股份有限公司 | 低血球溶解性的抗微生物肽、药物组合物及其用途 |
| CA2811797C (en) | 2010-09-20 | 2023-08-15 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Mosquitocidal xenorhabdus, lipopeptide and methods |
| BR112017007929A2 (pt) | 2014-10-15 | 2018-01-23 | Du Pont | polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, construto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente, composição, método para controlar uma população de praga, método para exterminar uma praga, método para produzir um polipeptídeo, planta ou célula vegetal, método para proteger uma planta |
| RU2678985C2 (ru) * | 2017-02-06 | 2019-02-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная фирма ВЕРТА" | Биоцидный пептид и препарат на его основе |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995022338A1 (en) * | 1994-02-16 | 1995-08-24 | The Regents Of The University Of California | Broad spectrum antimicrobial compounds and methods of use |
| WO1997008199A2 (en) * | 1995-08-23 | 1997-03-06 | University Of British Columbia | Antimicrobial cationic peptides and methods of screening for the same |
| WO1998007745A2 (en) * | 1996-08-21 | 1998-02-26 | Micrologix Biotech, Inc. | Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin |
| WO1998040401A2 (en) * | 1997-03-10 | 1998-09-17 | Micrologix Biotech Inc. | Compositions and methods for treating infections using cationic peptides alone or in combination with antibiotics |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE118788T1 (de) * | 1990-06-15 | 1995-03-15 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Antifungisches polypeptid, verfahren zu seiner herstellung. |
| ATE308562T1 (de) * | 1990-08-10 | 2005-11-15 | Virtual Drug Dev Inc | Antimikrobielle peptide wirksam gegen pflanzenpathogene, ihre verwendung und auf sie bezogene nachweismethoden |
| AU648140B2 (en) * | 1991-02-01 | 1994-04-14 | Virtual Drug Development, Inc. | Reverse antimicrobial peptides and antimicrobial compositions |
| AU2420592A (en) * | 1991-07-24 | 1993-02-23 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleotide sequences of galactinol synthase from zucchini and soybean |
| US5538525A (en) * | 1991-08-29 | 1996-07-23 | Zeneca Limited | Biocidal proteins |
| US5850025A (en) * | 1991-09-19 | 1998-12-15 | Sibia Neurosciences, Inc. | Protection of plants against plant pathogens |
| US5773696A (en) * | 1996-03-29 | 1998-06-30 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| US6015941A (en) * | 1997-10-31 | 2000-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Peptide derivatives of tachyplesin having antimicrobial activity |
-
1999
- 1999-10-29 WO PCT/US1999/025561 patent/WO2000026344A1/en active IP Right Grant
- 1999-10-29 BR BR9914922-2A patent/BR9914922A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-10-29 JP JP2000579716A patent/JP2002530274A/ja active Pending
-
2002
- 2002-09-23 US US10/252,773 patent/US7214766B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995022338A1 (en) * | 1994-02-16 | 1995-08-24 | The Regents Of The University Of California | Broad spectrum antimicrobial compounds and methods of use |
| WO1997008199A2 (en) * | 1995-08-23 | 1997-03-06 | University Of British Columbia | Antimicrobial cationic peptides and methods of screening for the same |
| WO1998007745A2 (en) * | 1996-08-21 | 1998-02-26 | Micrologix Biotech, Inc. | Compositions and methods for treating infections using analogues of indolicidin |
| WO1998040401A2 (en) * | 1997-03-10 | 1998-09-17 | Micrologix Biotech Inc. | Compositions and methods for treating infections using cationic peptides alone or in combination with antibiotics |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000026344A1 (en) | 2000-05-11 |
| US20030131383A1 (en) | 2003-07-10 |
| BR9914922A (pt) | 2001-07-10 |
| US7214766B2 (en) | 2007-05-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chakrabarti et al. | MSI-99, a magainin analogue, imparts enhanced disease resistance in transgenic tobacco and banana | |
| CA2060455C (en) | Reverse antimicrobial peptides, antimicrobial oligopeptides and other antimicrobial compositions, and methods of their production and use, particularly to provide protection against plant pathogens | |
| AU2008241364B2 (en) | Modified plant defensin | |
| Ponti et al. | An amphibian antimicrobial peptide variant expressed in Nicotiana tabacum confers resistance to phytopathogens | |
| JP2001510995A (ja) | 抗微生物性タンパク質 | |
| US7214766B2 (en) | Peptides with enhanced stability to protease degradation | |
| US7109397B2 (en) | Pseudomonas syringae harpins, HopPtoP and HopPmaHPto, and their uses | |
| WO1998004687A1 (en) | Antimicrobial peptides | |
| AU2001284482B2 (en) | Disease-resistant plants and method of constructing the same | |
| US6784337B1 (en) | Method of improving nematode resistance in plants via transformation with a DNA encoding a proteinase inhibitor fusion protein | |
| US7081568B2 (en) | Transgenic plants expressing temporin peptides | |
| US7919601B2 (en) | Identification and use of genes encoding holins and holin-like proteins in plants for the control of microbes and pests | |
| US20210054034A1 (en) | Compositions and methods for protecting hosts against pathogen infections | |
| US6235973B1 (en) | Expression of magainin and PGL classes of antimicrobial peptide genes in plants, and their use in creating resistance to multiple plant pathogens | |
| CA2110403A1 (en) | Biocidal proteins | |
| AU772335B2 (en) | Peptides with enhanced stability to protease degradation | |
| CA2391128C (en) | A method of making transgenic plants expressing a cecropin-mellitin hybrid cationic peptide imparting broad-spectrum pathogen resistance | |
| US20130067616A1 (en) | Plant Defensive Peptides | |
| MXPA01004316A (en) | Peptides with enhanced stability to protease degradation | |
| NZ580505A (en) | Modified plant defensin comprising a signal peptide, a mature domain from a Class I defensin and a C-terminal propeptide tail from a Class II plant defensin | |
| AU2018210030B2 (en) | Compositions and methods for protecting hosts against pathogen infections | |
| Catranis | Transgenic hybrid poplar expressing genes encoding antimicrobial peptides | |
| Montesinos Barreda | Rice seeds as biofactories of the production of antimicrobial peptides | |
| US20050120409A1 (en) | Pseudomonas syringae harpins, hopptop and hoppmahpto, and their uses | |
| KR20050028129A (ko) | 식물체에서 발현된 소-유래 락토페리신 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061030 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090804 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091104 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091111 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100323 |