ES2292567T3 - Secuencias de aminoacidos derivados de proteinas humanas que reaccionan con heparina que facilitan la transferencia de sustancias de interes al interior de las celulas y/o de los nucleos celulares. - Google Patents

Secuencias de aminoacidos derivados de proteinas humanas que reaccionan con heparina que facilitan la transferencia de sustancias de interes al interior de las celulas y/o de los nucleos celulares. Download PDF

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Abstract

Vector de transferencia intracitoplasmática y/o intranuclear para una sustancia de interés, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos que reacciona in vivo con aminoglicanos, y que deriva de la lipoproteína B humana, acoplada con al menos un fragmento de anticuerpo.

Description

Secuencias de aminoácidos derivados de proteínas humanas que reaccionan con heparina que facilitan la transferencia de sustancias de interés al interior de las células y/o de los núcleos celulares.
La presente invención tiene como objetivo una secuencia de aminoácidos que tienen la capacidad de facilitar la penetración de una sustancia de interés en el interior de células y/o de núcleos celulares.
La posibilidad de disponer de herramientas que permitan transferir eficazmente sustancias de interés desde el medio exterior hacia el interior de las células y, más particularmente, de los núcleos celulares, constituye un avance considerable en el terreno de las biotecnologías y, de forma muy especial, en lo que se refiere a la producción de proteínas, o péptidos, a la regulación de la expresión de genes, o al análisis y rastreo de las vías de señalización intracelulares, o también en el análisis de las propiedades de una sustancia administrada a dicha célula.
Otra aplicación importante de estas herramientas se refiere al campo de la terapia génica, puesto que, hasta el momento, los diversos procedimientos de terapia génica se enfrentan a la misma necesidad, que no ha sido satisfecha de manera óptima, que es la posibilidad de disponer de vectores capaces de transferir al citoplasma y/o al núcleo celular del organismo del hospedador a tratar los principios biológicamente activos, sin alterar, no obstante, el genoma del hospedador ni las propiedades biológicas de los citados principios activos transferidos.
Hasta ahora se han desarrollado numerosas técnicas para transferir ADN en las células, pero ninguna resulta realmente satisfactoria. Una de ellas, derivada de la técnica de Mandel e Higa, basada en la adquisición por parte de E. coli de la susceptibilidad a la transformación, mediante tratamiento con CaCl_{2}, consiste en coprecipitar el ADN con fosfato de calcio o DEA-dextrano, e introducir el precipitado obtenido directamente en la célula o en el núcleo. Este método, además de ser tóxico, no es selectivo.
Otro método de introducción directa de ADN, la electroporación, consiste en someter a las células a un breve choque eléctrico de algunos miles de voltios, lo que permite que el ADN atraviese la membrana citoplasmática y se introduzca en la célula. Este método resulta altamente tóxico para las células, e implica una elevada mortalidad y una gran variabilidad en función de las células utilizadas.
Otros métodos emplean un cribado de la entrada del gen en las células a través de los receptores presentes sobre su membrana. El ADN puede penetrar, por lo tanto, en la célula por medio de un ligando específico de estos receptores, o de anticuerpos específicos de los componentes de la membrana. El complejo ADN-ligando penetra, de esta forma, en la célula por un proceso de endocitosis. Este procedimiento se halla limitado por el hecho de que existe una destrucción importante del complejo utilizado en las vesículas lisosómicas. Se han desarrollado múltiples procedimientos para paliar estos inconvenientes, pero ninguno es plenamente satisfactorio.
La patente US nº 5.635.383 describe, por su parte, otro tipo de vector complejo, a base de polilisina, para la transferencia de ácidos nucleicos a las células.
La patente US nº 5.521.291 describe otro método, basado en la utilización de un conjugado formado por un virus unido a una sustancia que muestra una fuerte afinidad por el ADN por medio de un anticuerpo. Estos conjugados son difíciles de usar y el uso de virus implica ciertos riesgos.
Para intentar resolver estos inconvenientes, se ha descrito en la solicitud de patente nº WO 97/02840 un procedimiento llevado a la práctica in vitro consistente en utilizar anticuerpos anti-ADN de ratón o sus fragmentos F(ab')_{2} y Fab' capaces de penetrar en el interior de las células vivas, en forma de inmunovectores para la transferencia intracitoplásmica y/o intranuclear de sustancias biológicamente activas. Aun cuando estos vectores exhiben una eficacia importante, su uso puede resultar complejo en determinadas aplicaciones. Adicionalmente, el uso de moléculas del tamaño y complejidad de los anticuerpos puede representar un inconveniente importante para su manipulación y aplicación.
En la solicitud de patente nº WO 99/07414, se ha descrito la posibilidad de utilizar in vitro péptidos derivados de los anticuerpos anti-ADN de ratón reivindicados en la solicitud WO 97/02840 antes citada, como vectores de internalización intracitoplásmica e intranuclear de sustancias biológicamente activas.
Si bien estos vectores peptídicos de ratón están codificados para la línea germinal y no son portadores de mutaciones y, por consiguiente, deberían ser próximos a los hallados en el ser humano, no es posible excluir el riesgo de una reacción inmunológica en el hombre.
La solicitud WO 98/56938 describe la utilización de lipoproteínas, en particular de la lipoproteína B, en la transferencia in vivo de ácidos nucleicos.
Existe, por lo tanto, una necesidad real de péptidos y secuencias de aminoácidos capaces de resolver los inconvenientes anteriormente descritos, y que puedan ser utilizados a modo de, o dentro de un vector de internalización celular en el hombre, y que no presenten ninguno de los riesgos mencionados más arriba.
Es sabido que un elevado número de regulaciones celulares depende de interacciones entre las proteínas y los glicosaminoglicanos (GAG) de la superficie celular (1-6) (las cifras en negrita, entre paréntesis, remiten a la bibliografía adjunta). Dichas interacciones intervienen, por ejemplo, en el control de la hemostasia (7), en la proliferación de células musculares lisas (8), en la expresión de la actividad de factores de crecimiento (9), en la expresión de la actividad lipolítica de las enzimas (10), en la integridad de la matriz extracelular (11), entre otras. En un sistema determinado, estos efectos biológicos obedecen a la interacción de una o de un número restringido de proteínas con los GAG de la superficie celular. Los GAG son constituyentes altamente conservados en el curso de la evolución, presentes en la superficie de todas las células eucarióticas. Los GAG son polímeros de sacáridos; por ejemplo, la heparina es un polímero de disacárido (\alpha-1, ácido 4-2-idurónico). D- glucosamina y los condroitín sulfatos son polímeros del disacárido N-acetil condrosina, que contiene un elevado número de grupos sulfato y, por lo tanto, cargados negativamente. Las proteínas que reaccionan específicamente con los GAG contienen en su secuencia uno o múltiples segmentos peptídicos que son responsables de la interacción de estas proteínas con los GAG. La longitud de estos segmentos varía de una proteína a otra, y va desde cuatro hasta treinta aminoácidos. Prácticamente todos estos péptidos tienen carga positiva y contienen un número elevado de aminoácidos básicos, sobre todo lisina y arginina. Se ha demostrado que estos aminoácidos intervienen de forma preponderante en la interacción de estas proteínas con los GAG
(1-6).
Los péptidos que se unen a los GAG o, más en general, a los aminoglicanos y, en particular, a la heparina, a heparan sulfato y a los condroitín sulfatos (péptidos designados, globalmente, como PLH por "péptidos que se unen a la heparina" (en francés), aun cuando la heparina no es más que un ejemplo de aminoglicano), pueden ser de origen natural, tales como los péptidos descritos más arriba, o artificial. Se les puede utilizar en su forma nativa o polímera (dímero, trímero, etc.).
Se ha constatado de forma inesperada, según la presente invención, que estos péptidos se pueden utilizar tanto in vivo como in vitro como agentes de internalización de sustancias interesantes en las células.
De hecho, la aplicación in vivo de una técnica conocida in vitro implica determinar múltiples parámetros (biodisponibilidad, reacciones inmunológicas, etc.) que no intervienen en los ensayos in vitro, en un espacio cerrado. Además, el paso de in vitro a in vivo resulta arriesgado debido a las numerosas interacciones potenciales que pueden interferir con la manipulación in vivo (reacción inmunológica, efectos secundarios, bloqueo o inhibición de los principios activos, rechazo, etc.); por lo tanto, la esperanza de alcanzar un éxito razonable en la aplicación in vivo de una técnica in vitro es escasa.
De esta forma, según un primer aspecto, la presente invención tiene como objeto una secuencia de aminoácidos capaz de facilitar la penetración de una sustancia de interés al interior de las células y/o de los núcleos celulares, y que se distingue por su capacidad de reaccionar in vivo con los aminoglicanos.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención tiene como objeto una secuencia de aminoácidos que presenta la capacidad de facilitar la penetración de una sustancia de interés al interior de las células y/o núcleos celulares, y que se distingue porque procede de una proteína de origen humano y es capaz de reaccionar con los aminoglicanos.
De forma más particular, en uno y otro casos, esta secuencia se distingue porque reacciona con la heparina, los condroitín sulfatos y sus derivados.
Los trabajos de investigación llevados a cabo en el marco de la presente invención han permitido poner de manifiesto que la penetración de los péptidos resulta totalmente inhibida por la incubación de las células a 4ºC. Además, resulta parcialmente inhibida por los inhibidores del metabolismo celular tales como la azida sódica (inhibidor de la ATPasa), genisteína (inhibidor de la tirosín quinasa y de la unión a ATP). El mecanismo de internalización de los péptidos según la invención y, por lo tanto, de las sustancias de interés acopladas a dichos péptidos, depende, por consiguiente, de la energía. La vectorización que ponen en funcionamiento los péptidos según la invención resulta, por lo tanto, destacable por el hecho de que no constituye un sistema pasivo, sino que, por el contrario, se lleva a cabo a través de un receptor. Las secuencias de aminoácidos según la invención se caracterizan, en consecuencia, además de por su capacidad de reaccionar in vivo con los aminoglicanos, los sulfatos de aminoglicanos, las condroitinas y los condroitín sulfatos, por su capacidad para fijarse sobre un receptor de la membrana celular y atravesar dicha membrana celular gracias a ese receptor. De esta forma, las secuencias de aminoácidos de la invención se diferencian de los transportadores peptídicos de la técnica anterior, capaces de atravesar la membrana celular de manera pasiva.
Los péptidos según la invención son, por lo tanto, destacables porque presentan la capacidad de poder atravesar las membranas celulares por un mecanismo activo, de alojarse seguidamente en el citoplasma y/o el núcleo de las células, y permitir disponer, de este modo, de un vector cuyo uso no está limitado, en el paso hacia el interior de la célula, por el tamaño de las sustancias que transportan. De hecho, los vectores de la invención son capaces de transportar medicamentos que van desde pequeñas moléculas químicas (de bajo peso molecular) hasta proteínas o ácidos nucleicos de tipo plasmidio (de alto peso molecular). La utilización de estos vectores abre, de esta forma, una nueva vía de terapia proteica intracelular o de terapia génica. Esta capacidad particular de penetración de los vectores de la invención permite determinar, preferentemente, la diana de los "medicamentos" dentro de las células, contribuyendo así a una reducción potencial de la toxicidad de los medicamentos y a un potencial incremento de su índice de eficacia.
Por la expresión "derivados de la heparina o de condroitín sulfatos" o "aminoglicanos del tipo de la heparina o de condroitín sulfatos" se debe entender cualquier producto o sub-producto como los que se definen en las publicaciones citadas en las referencias (1) a (3) de la bibliografía.
Por la expresión "facilitar la penetración" se entiende facilitar el paso, o la traslocación, de una sustancia desde el medio exterior hasta el medio intracelular y, de manera muy particular, al interior del citoplasma y/o el núcleo de la célula. Esta penetración se puede determinar por diversos procedimientos tales como, por ejemplo, un ensayo de penetración celular que comprende una primera etapa de incubación de la secuencia de aminoácidos en presencia de células en cultivo, seguida de una etapa de fijación y de permeabilización de estas células, seguida por la confirmación de la presencia de dicha secuencia de aminoácidos en el interior de la célula. La etapa de confirmación se puede llevar a cabo por medio de una incubación adicional, en presencia de anticuerpos marcados y dirigidos contra dicha secuencia, seguida de una detección en el citoplasma o en las proximidades inmediatas del núcleo celular o, incluso, dentro de este mismo, de la reacción inmunológica entre la secuencia y el anticuerpo marcado. La confirmación se puede efectuar, asimismo, marcando una secuencia de aminoácidos según la invención y detectando la presencia de dicha marca en los compartimientos celulares. En la solicitud de patente nº WO 97/02840 anteriormente citada se describe, por ejemplo, un ensayo de penetración celular.
Por la expresión "sustancia de interés" se entiende cualquier producto que representa un interés, especialmente biológico, farmacéutico, diagnóstico, de rastreo, o agroalimentario. Puede tratarse de ácidos nucleicos (ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico) que pueden ser de orígenes diversos y, en especial, humano, viral, animal, eucariótico o procariótico, vegetal, sintético, etc., y que pueden tener distintos tamaños que van desde un simple oligonucleótido hasta un genoma o fragmento de genoma. Puede tratarse también de un genoma viral o de un plasmidio. Del mismo modo, la sustancia puede ser una proteína tal como una enzima, una hormona, una citoquina, una apolipoproteína, un factor de crecimiento, un antígeno, un anticuerpo, etc. Asimismo, puede tratarse de una toxina, un antibiótico, una molécula antiviral o de un inmuno-modulador.
En términos generales, la sustancia de interés puede ser cualquier principio activo de medicamento, ya sea éste un producto químico, bioquímico, natural o sintético. Puede tratarse de pequeñas moléculas, de un peso molecular del orden de 500 D, o de grandes moléculas tales como proteínas de varios miles de daltons.
La sustancia de interés puede ser directamente activa, o activarse in situ por medio de la secuencia de aminoácidos, por un agente diferente, o por las condiciones ambientales.
La invención amplía su alcance a las asociaciones de la secuencia de aminoácidos con una sustancia de interés como las anteriormente definidas.
En una forma de realización preferida de la presente invención, destinada a paliar los riesgos que se han descrito anteriormente, la secuencia de aminoácidos está codificada por la línea germinal y, por lo tanto, no porta mutaciones (sustitución, deleción, adición, etc.).
En la presente invención, se obtiene una secuencia de aminoácidos muy especialmente preferida a partir de una proteína sintetizada por una célula humana. De manera ventajosa, dicha proteína sintetizada por una célula humana se selecciona entre las proteínas que se fijan a los aminoglicanos del tipo heparina o condroitín sulfato. Se trata, por ejemplo, de una secuencia de aminoácidos derivada de la lipoproteína B humana.
De forma general, la secuencia de aminoácidos comprende un número elevado de aminoácidos básicos, como es el caso, por ejemplo, de lisina, arginina o histidina.
Por la expresión "número elevado" se debe comprender una cifra al menos igual a 3.
Un tipo de secuencias de aminoácidos preferido, para la práctica de la presente invención, está formada por, o comprende al menos un grupo de aminoácidos que responde a una de las fórmulas siguientes: a) (XBBBXXBX)_{n}; b) (XBBXBX)_{n}; c) (BBX_{m}YBBX_{o})_{n}; d) (XBBXXBX)_{n}; y e) (BXBB)_{n};
en las cuales:
B es un aminoácido básico; X es un aminoácido no básico, preferentemente hidrófobo, tal como alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina o, también, tirosina; Y representa un enlace directo ó 1 a 20 aminoácidos; m es un número entero comprendido entre 0 y 5; n es un número entero comprendido entre 1 y 10, preferentemente entre 1 y 3; y o es un número entero comprendido entre 0 y 5.
En términos generales, las secuencias de aminoácidos poseen menos de 100 aminoácidos, mejor menos de 50 aminoácidos y, de manera todavía mejor, menos de 25 aminoácidos.
De forma conveniente, las secuencias de aminoácidos según la invención comprenden desde 6 hasta 25 aminoácidos.
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Las secuencias de aminoácidos preferidas para la práctica de la presente invención son las que se identifican por SEQ ID NO: 2, 3, 5, 7, 9, 10, 13, 16, 17, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 30, 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39 en la relación anexa, que forma parte de la presente descripción. Entre ellas, se prefieren muy especialmente las secuencias identificadas por SEQ ID NO: 2, 3, 5, 7, 9, 10, 13, 16, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 30, 36 y 38.
Otro tipo adicional de secuencias preferidas para la práctica de la presente invención está compuesto por, o comprende al menos dos dominios, uno de los cuales comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula: a) XBBBXXBX; b) XBBXBX; c) BBX_{m}YBBX_{o}; d) XBBXXBX; o e) BXBB;
en tanto que el otro de estos dominios comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula: a) XBBBXXBX; b) XBBXBX; c) BBX_{m}YBBX_{o}; d) XBBXXBX; e) BXBB; o f) un fragmento de anticuerpo;
fórmulas en las cuales: B es un aminoácido básico, X es un aminoácido no básico, preferentemente hidrófobo, Y significa un enlace directo ó 1 a 20 aminoácidos, m es un número entero comprendido entre 0 y 5, o es un número entero comprendido entre 0 y 5.
Una secuencia de aminoácidos especialmente interesante es la secuencia SEQ ID NO: 1 en la medida en que (1) en estado al menos de dímero, tiene las propiedades esperadas, y (2) en estado de monómero o de polímero, confiere a una secuencia de aminoácidos adicional a la que se encuentra acoplada, las citadas propiedades o potencia considerablemente estas propiedades cuando la mencionada secuencia ya las posee. Del mismo modo, los péptidos designados HBP3, HBP7, (HBP)2, HBP6, HBP7, HBP10 y HBP13 presentan esta capacidad de potenciación.
Los péptidos como los definidos anteriormente son capaces de transportar al interior de las células moléculas que están asociadas a los mismos de manera covalente y no covalente, y representan, de esta forma, vectores eficaces para la transferencia intracelular de sustancias de interés.
Las siete secuencias descritas en la siguiente Tabla 1 son especialmente útiles para el transporte intracitoplasmático. Se trata de las secuencias (HB1)3, HBP6, (HBP3)2, HBP7, HBP11, HBP13 y HBP2.
TABLA 1
1
Dos secuencias resultan particularmente útiles para el transporte intranuclear. Se trata de las secuencias HBP10 y HBP15. Estas dos secuencias se caracterizan por su contenido elevado en aminoácidos básicos y, más en especial, por el hecho de que no contienen residuos lisina, al contrario que las secuencias útiles para el transporte intracitoplasmático.
Cada una de las secuencias descritas en la Tabla 1 posee al menos 20% de residuos de lisina, y al menos un 50% de los residuos está formado por aminoácidos básicos con respecto al número total de residuos de la secuencia.
La presente invención pone de manifiesto que el acoplamiento de péptidos tales como los que se han definido anteriormente con vectores polipeptídicos capaces de penetrar en el interior de las células, aumenta considerablemente el poder de traslocación de estos vectores.
La presente invención pone también de manifiesto que el acoplamiento de péptidos tales como los que se han definido anteriormente, o de sus formas polímeras, con un ligando, cuya función es la de reaccionar con un receptor presente en la membrana celular, aumenta considerablemente la capacidad de dicho ligando para fijarse sobre la membrana celular.
De acuerdo con otro de sus aspectos, la presente invención tiene por objeto el uso de las secuencias de aminoácidos definidas anteriormente para preparar composiciones destinadas a la transferencia de sustancias de interés al interior de las células. Esta capacidad de los péptidos según la invención representa una ventaja al permitir el transporte de sustancias activas a través de membranas biológicas y, de manera muy particular, a través de las barreras hemato-encefálica, hemato-retiniana, intestinal, pulmonar. Los péptidos de la invención presentan el interés de poder ser utilizados bajo formas de administración adaptadas tanto a la sustancia activa a la que se encuentran acoplados, como al tipo de célula diana, en especial aquéllas que requieren el paso a través de las citadas barreras.
En una forma de realización adicional, la presente invención se refiere al uso de las mencionadas secuencias de aminoácidos en un vector peptídico. Estos vectores, debido a las propiedades de las citadas secuencias de aminoácidos, se pueden utilizar fácilmente para la transferencia intracitoplasmática e intranuclear en el hombre, sin ningún riesgo para éste, ni degradación alguna de la sustancia de interés acoplada al vector.
Para alcanzar este objetivo, es preciso, en especial, que un vector sea capaz de vehicular cantidades relativamente importantes de moléculas hacia el interior de las células, y que no sea reconocido como antígeno extraño por el sistema inmunológico humano.
La tabla 1 siguiente indica para múltiples péptidos según la invención su nivel de penetración intracitoplásmica y/o intranuclear acoplado a un marcador de bajo peso molecular que permite su detección, tales como biotina o fluoresceína (Marc), o a una sustancia de interés biológico (Sust.).
Los resultados comunicados en la tabla 1 bis se basan en datos experimentales de los que se informa más adelante.
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TABLA 1 bis
2
Estos resultados indican que los péptidos que son capaces de una traslocación nuclear masiva son aquellos cuya carga positiva está determinada, sobre todo, por la presencia de arginina y la ausencia prácticamente total de lisina.
Un primer grupo de péptidos según la invención comprende secuencias de aminoácidos capaces de permitir la penetración de una sustancia de interés en la célula, pero de manera regular en el núcleo. Como ejemplos, pueden citarse los péptidos de las secuencias SEQ ID NO: 2, 3, 17, 18, 19, 20, 21, 33, 34, 37 y 38.
Un segundo grupo de péptidos según la invención comprende secuencias de aminoácidos capaces de permitir la penetración de una sustancia de interés en la célula y en su núcleo. Como ejemplos, pueden citarse los péptidos de las secuencias SEQ ID NO: 26, 35 y 39.
De acuerdo con la presente invención, un vector se caracteriza porque está formado por, o comprende una secuencia de aminoácidos tal como se ha definido anteriormente.
A modo de variación, el vector se basa en el acoplamiento, por una parte, de secuencias de aminoácidos que reaccionan con aminoglicanos y, por otra parte, de péptidos nuevos, generados por la parte variable de anticuerpos humanos anti-ADN. El acoplamiento en el interior de una misma molécula de secuencias de aminoácidos que reaccionan con aminoglicanos y de péptidos derivados de partes variables de anticuerpos humanos anti-ADN, da lugar a la preparación de un vector peptídico especialmente eficaz para la traslocación y la transferencia intracelular de sustancias de interés, sobre todo cuando las secuencias de aminoácidos que reaccionan con aminoglicanos son de origen humano.
Esta asociación, además, da lugar a un vector de traslocación y de transferencia particularmente adaptado para ser utilizado en el hombre. De hecho, tal como se ha indicado anteriormente, aun cuando los vectores peptídicos procedentes del ratón, conocidos por el documento WO 97/02840, estén codificados por la línea germinal y no porten mutaciones, siendo, por lo tanto, antigénicamente próximos a los hallados en el ser humano, existe la posibilidad de que su inyección en el hombre induzca una reacción inmunológica. El vector peptídico formado por PLH según la presente invención y de péptidos derivados de anticuerpos anti-ADN, ambos de origen humano, codificados por la línea germinal y que no son portadores de mutaciones, evita este problema.
Las características generales de estos péptidos derivados de anticuerpos humanos anti-ADN son semejantes a las de péptidos procedentes del ratón, descritos en la solicitud de patente WO 99/07414, si bien poseen propiedades adicionales que les distinguen de estos últimos, a saber:
1)
para penetrar en el interior de las células, necesitan un metabolismo activo de las células (temperatura de cultivo comprendida entre 25 y 39ºC y, preferentemente, 37ºC), en tanto que los péptidos de ratón son claramente menos dependientes;
2)
reaccionan con mucho menor intensidad con el ADN que los vectores de ratón;
3)
su capacidad de penetración no está influida de manera significativa por la molécula que van a transportar hacia el interior de la célula;
4)
penetran mejor en las células de origen humano que en las de otros orígenes.
De acuerdo con la presente invención, se ha desarrollado un vector constituido por un PLH y uno o múltiples fragmentos de anticuerpo, preferentemente poli-reactivos y, de manera más particular, uno o múltiples fragmentos procedentes de regiones hipervariables de los anticuerpos. De forma preferida, el vector objeto de la invención se distingue por el hecho de que comprende un fragmento de la cadena pesada de un anticuerpo.
En la solicitud de patente WO 99/07414 antes citada, no se habían utilizado más que fragmentos de una IgG monoclonal, que es una inmunoglobulina monómera, de pequeño tamaño y de bajo peso molecular. La presente invención pone de manifiesto, por primera vez, que resulta posible también utilizar un fragmento procedente de una IgM, que es una inmunoglobulina pentámera, de peso molecular muy alto. Hasta la fecha, y de acuerdo con los conocimientos de la demandante, no se han llevado a cabo investigaciones sobre el uso de un fragmento de IgM como vector de internalización celular, debido al carácter disuasorio del gran tamaño y peso molecular elevado de tales fragmentos.
Por consiguiente, la presente invención tiene como objeto un vector de internalización celular, que se distingue porque comprende uno o múltiples PLH y uno o múltiples fragmentos de una IgM o de una IgG.
De forma preferida, dicho vector comprende la totalidad o parte de la región CDR2 de un anticuerpo. A modo de variante, dicho vector comprende la totalidad o parte de la región CDR3 de un anticuerpo. Más particularmente, dicho vector contiene al menos una región CDR3 de un anticuerpo anti-ADN humano, seleccionado del grupo consistente en RTT79, NE-1 y RT72.
En una variante adicional, el vector objeto de la presente invención puede comprender, también, la totalidad o parte de la región CDR2 y la totalidad o parte de la región CDR3.
Por la expresión "la totalidad o parte" se debe comprender que el vector según la invención puede comprender la totalidad de la región CDR correspondiente, o solamente una parte de la misma, con la condición de que el vector conserve la capacidad de penetrar en las células (homólogo funcional). Por la expresión "parte de la región CDR" se debe entender una región CDR desprovista de uno o múltiples aminoácidos terminales. Igualmente, puede tratarse de una región CDR en la que uno o múltiples residuos internos han sido eliminados o sustituidos por otros aminoácidos, preferentemente aminoácidos de la misma naturaleza (aminoácidos básicos, por ejemplo).
Una parte de los ejemplos que se ofrecen en la presente solicitud de patente se basa en el empleo de la SEQ ID NO: 1, procedente de la lipoproteína B humana, pero, para el experto en la técnica, resulta evidente que se puede utilizar cualquier PLH natural o artificial.
Como se ha indicado anteriormente, el vector según la presente invención está especialmente bien adaptado para el transporte y la transferencia intracelular e intranuclear de sustancias de interés.
La presente invención aspira, por lo tanto, a proporcionar un vector como se ha descrito más arriba, que se distingue por comprender una sustancia de interés que se puede incorporar, de forma natural o no, a las células y/o a los núcleos de dichas células.
De forma más particular, la presente invención tiene por objeto un vector cuya capacidad de penetración es sensiblemente independiente de la naturaleza de la sustancia de interés a la que se encuentra acoplado. Esta característica, propia de estos vectores humanos, en comparación con los de ratón, tiene un interés primordial para la utilización prevista de estos vectores. No obstante, la invención se interesa, igualmente, por vectores que están adaptados a la sustancia de interés que se les acopla.
Por "acoplamiento" se entiende cualquier tipo de interacción que permite una asociación física entre la sustancia de interés y el vector. Puede tratarse de un acoplamiento escindible o no escindible en función del medio biológico y/o de la sustancia de interés transportada por los péptidos según la invención, o también escindible a través de los medios físicos aplicados al organismo al que se administra el vector acoplado con la sustancia de interés. De esta forma, la expresión del efecto biológico de la sustancia puede requerir su liberación del vector. Como ejemplo de sustancia de interés que es preferible que se encuentre liberada del vector, se puede mencionar la doxorrubicina.
Sin embargo, es necesario que la interacción sea suficientemente sólida para que el vector no se disocie antes ni durante la penetración celular. Por este motivo, el acoplamiento preferido según la invención es un acoplamiento covalente, aunque, sin embargo, podría tratarse también de un acoplamiento no covalente. La sustancia de interés puede estar acoplada directamente al péptido, ya sea a uno de los extremos terminales, o en una cadena lateral de uno de los aminoácidos. Asimismo, la sustancia de interés puede estar acoplada de manera indirecta a través del desvío de un punto de enlace en uno de los extremos terminales del péptido, o en una cadena lateral de uno de los
aminoácidos.
El acoplamiento se puede llevar a cabo por cualquier procedimiento apropiado de acoplamiento químico, bioquímico, enzimático o genético conocido por el experto en la técnica, pero en general se prefiere utilizar un reactivo de puenteo homo- o heterofuncional del tipo 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC). Adicionalmente, como medio de acoplamiento cabe citar también aquellos seleccionados entre: agentes bi- o multifuncionales que contienen grupos alquilo, arilo, aralquilo, o peptídico, ésteres, aldehídos o ácidos de alquilo, arilo o aralquilo, grupos anhídrido, sulfhidrilo o carboxilo tales como los derivados del ácido maleimilbenzoico, ácido maleimilpropiónico y derivados succinimidilo, grupos derivados de bromuro o cloruro de cianógeno, carbonil-diimidazol, ésteres de succinimida, o halogenuros sulfónicos.
En otra forma de realización de la presente invención, el acoplamiento de dicha sustancia de interés se puede efectuar también por cualquier técnica de ingeniería genética conocida por los expertos en la técnica. Por "ingeniería genética" se entiende el uso de un vector de expresión en el que el ADN que codifica los péptidos-vectores se ha clonado en fase en 5' y/o 3' del ADN complementario del gen de interés. La expresión de la proteína de fusión se coloca bajo el control de un promotor. El sistema de expresión se puede utilizar en una célula hospedadora procariótica o eucariótica para la producción de la proteína de fusión.
En una primera forma de realización, el acoplamiento de la citada sustancia de interés se lleva a cabo sobre el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos según la invención. En una segunda forma de ejecución de la invención, el acoplamiento de dicha sustancia de interés se efectúa sobre el extremo C-terminal de la citada secuencia.
De forma sorprendente, se ha demostrado que el vector objeto de la invención es capaz de potenciar la actividad biológica y, potencialmente, de reducir la toxicidad de la citada sustancia acoplada. La presente invención tiene también como objeto, por lo tanto, un vector que se distingue porque permite aumentar la actividad biológica de la sustancia de interés a la cual se encuentra acoplado.
Asimismo, se ha demostrado que el vector objeto de la invención permite la transfección in vitro de células.
En una forma de ejecución particular de la invención, el vector se halla acoplado a la sustancia de interés por medio de al menos una molécula (llamada "molécula de anclaje"), que exhibe una fuerte afinidad natural por la sustancia de interés que se debe internalizar. La afinidad natural de la molécula de anclaje por la sustancia de interés permite que el transportador interactúe, de manera no covalente, con dicha sustancia de interés y, de esta forma, la transportar durante los desplazamientos intracelulares.
Una ventaja adicional, especialmente interesante de este tipo de transportador consiste en que, gracias a la afinidad natural de la molécula de anclaje por la sustancia de interés, el acoplamiento entre estos dos elementos se lleva a cabo de forma totalmente natural, sin ninguna interacción química o bioquímica.
Este tipo de transportador es especialmente interesante en el caso en que la sustancia de interés, debido a su tamaño y/o su estructura, resulta difícil de acoplar directamente a la secuencia de aminoácidos. Este tipo de transportador puede ser también de gran utilidad cuando la sustancia de interés no es demasiado estable y cualquier interacción química para su acoplamiento podría deteriorarla, o modificar su actividad.
Adicionalmente, el transportador según la invención puede no ser específico para una única sustancia de interés, sino que, por el contrario, puede permitir la internalización en las células y/o los núcleos celulares de múltiples sustancias de interés diferentes.
La invención se refiere, igualmente, a células eucarióticas que incluyen una secuencia de aminoácidos en conformidad con la presente invención. Se refiere también a células eucarióticas que incluyen un vector y/o un transportador conformes con la invención. Asimismo, se refiere a cualquier tipo de célula eucariótica que haya sido transfectada con un vector y/o transportador de acuerdo con la presente invención.
La invención se refiere, asimismo, a un procedimiento de transferencia in vitro de una sustancia de interés al interior de una célula, y al incremento de la actividad biológica de dichas sustancias de interés, que comprende las etapas siguientes:
a)
acoplamiento de la sustancia a una secuencia de aminoácidos, a un vector, o a un transportador según la invención, tales como se han descrito anteriormente, y
b)
incubación de la célula con dicho producto de acoplamiento a una temperatura de cultivo que permite el metabolismo activo de dicha célula.
La temperatura indicada está comprendida entre 25 y 39ºC, preferentemente 37ºC.
La presente invención se refiere, igualmente, a una composición que comprende, como principio activo, vectores o transportadores cargados con al menos una sustancia de interés, según la presente invención, o células eucarióticas que han sido ya transfectadas de acuerdo con la presente invención. Asimismo, tiene como objeto el uso de dichas composiciones para la formulación y la preparación de productos biológicos, farmacéuticos, cosméticos y
agroalimentarios.
La invención extiende su alcance a las sales de adición de bases o ácidos farmacéuticamente aceptables, hidratos, ésteres, solvatos, precursores, metabolitos o estereoisómeros de los citados vectores y transportadores cargados con al menos una sustancia de interés. La invención extiende, igualmente, su alcance a las formulaciones farmacéuticas que comprenden un vector o transportador cargado con al menos una sustancia de interés, en asociación con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales atóxicas de las secuencias de aminoácidos según la invención que, por lo general, se pueden preparar haciendo reaccionar la base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado. Estas sales conservan la eficacia biológica y las propiedades de las bases libres. Como ejemplos representativos de estas sales, se pueden citar las sales hidrosolubles e insolubles en agua tales como acetatos, ansonatos (2,2'-disulfonatos de 4,4-diamino-estilbenos), bencenosulfonatos, benzoatos, bicarbonatos, bisulfatos, bitartratos, boratos, bromuros, butiratos, edetatos de calcio, camsilatos, carbonatos, cloruros, citratos, clavulariatos, dihidrocloruros, edetatos, edisilatos, estolatos, esilatos, fumaratos, gluceptatos, gluconatos, glutamatos, glicolil-arsanilatos, hexafluorofosfatos, hexil-resorcinatos, hidrabaminas, hidrobromuros, hidrocloruros, hidroxinaftoatos, yoduros, isotianatos, lactatos, lactobionatos, lauratos, maleatos, mandelatos, mesilatos, metilbromuros, metilnitratos, metilsulfatos, mucatos, napsilatos, nitratos, 3-hidroxi-2-naftoatos, oleatos, oxalatos, palmitatos, pamoatos (1,1-metilen-bis-2-hidroxi-3-naftoatos, emboatos), pantotenatos, fosfatos/difosfatos, picratos, poligalacturonatos, propionatos, p-toluenosulfonatos, salicilatos, estearatos, subacetatos, succinatos, sulfatos, sulfosalicilatos, suramatos, tannatos, tartratos, teoclatos, tosilatos, trietilyoduros, valeratos y las sales de N-metilglucamina.
Un sujeto puede ser tratado con una cantidad farmacéuticamente eficaz de un péptido, un vector o un transportador según la invención, cargado con al menos una sustancia de interés. La expresión "cantidad farmacéuticamente eficaz" significa una cantidad capaz de hacer penetrar la sustancia de interés en grado suficiente para inducir la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o humano, tal como espera el investigador o el médico responsable del tratamiento.
La invención contempla igualmente a composiciones farmacéuticas dirigidas a la introducción de una sustancia de interés en una célula o un núcleo celular. Las composiciones comprenden una cantidad eficaz de un vector o transportador según la invención, cargado con al menos una sustancia de interés, sola o en combinación con uno o múltiples soportes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones son especialmente útiles debido a que tienen una muy baja toxicidad, o son atóxicas.
La administración de los vectores o transportadores según la invención, o de sus sales, cargados con al menos una sustancia de interés se puede llevar a cabo por cualquiera de las formas de administración aceptada por los agentes terapéuticos. Estos procedimientos comprenden la administración sistémica, por ejemplo, por vía oral, nasal, parenteral, o la administración tópica, por ejemplo transdérmica, o también la administración central, por ejemplo, por vía quirúrgica intracraneal, o también la administración intraocular.
La administración oral se puede efectuar por medio de comprimidos, cápsulas, cápsulas blandas (incluidas las formulaciones de liberación diferida o prolongada), píldoras, polvos, granulados, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. Esta forma de presentación está adaptada de manera más particular al paso de la barrera intestinal.
La administración parenteral se realiza, por lo general, por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa, o por perfusión. Las composiciones inyectables se pueden preparar en las formas clásicas, es decir, suspensión o solución líquida, o en forma sólida que se somete a disolución extemporánea en un líquido. Esta forma de presentación está adaptada de manera más particular al paso de la barrera hemato-encefálica.
Una posibilidad para la administración parenteral utiliza el implante de un sistema de liberación lenta o prolongada, que garantiza el mantenimiento de un nivel constante de dosis, por ejemplo, según el documento US-A-3.710.795.
Para la administración intranasal, se pueden utilizar vehículos intranasales apropiados.
Para la administración transdérmica, se pueden usar parches cutáneos transdérmicos, bien conocidos por el experto en la técnica. Un sistema de liberación transdérmica permite la administración continua.
Otras preparaciones tópicas preferidas comprenden las cremas, ungüentos, lociones, nebulizadores de aerosol, y geles.
En función de la forma de administración prevista, los compuestos pueden estar en forma sólida, semisólida o líquida.
Para las composiciones sólidas, tales como comprimidos, píldoras, polvos o granulados en estado libre o incluidos dentro de cápsulas, el principio activo se puede combinar con: a) diluyentes, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina; b) lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o de calcio, y/o polietilenglicol; c) aglutinantes, por ejemplo, silicato de magnesio y de aluminio, pasta de almidón, gelatina, goma adragante, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona; eventualmente, d) desintegrantes, por ejemplo, almidón, agar, ácido algínico o su sal sódica, o mezclas efervescentes; y/o e) absorbentes, colorantes, aromatizantes y edulcorantes. Los excipientes pueden ser, por ejemplo, manitol, lactosa, almidón, estearato de mag-
nesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio y análogos, de calidad farmacéutica.
Para las composiciones semisólidas tales como supositorios, el excipiente puede ser, por ejemplo, una emulsión o suspensión grasa, o basada en polietilenglicol tal como polipropilenglicol.
Las composiciones líquidas, en especial las inyectables o que se deben incluir en una cápsula blanda, se pueden preparar, por ejemplo, por disolución, dispersión, etc. del principio activo en un disolvente farmacéuticamente puro tal como, por ejemplo, agua, suero fisiológico, dextrosa acuosa, glicerol, etanol, un aceite y similares.
Los vectores o transportadores según la invención, cargados con al menos una sustancia de interés, se pueden administrar igualmente en forma de sistemas de liberación del tipo lisosomas tales como en la forma de pequeñas vesículas monolaminales, grandes vesículas monolaminales, y de vesículas multilaminales. Los lisosomas se pueden formar a partir de una diversidad de fosfolípidos que contienen colesterol, estearilamina o fosfatidilcolina. En una forma de realización, resulta posible hidratar con una solución acuosa del medicamento una película de componentes líquidos, para formar una capa líquida que encapsula el medicamento, tal como se describe en el documento US-A-5.262.564.
Las composiciones según la invención pueden ser esterilizadas y/o contener coadyuvantes y sustancias auxiliares atóxicas tales como conservantes, estabilizadores, plastificantes o emulsionantes, agentes que favorecen la disolución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, pueden contener igualmente otras sustancias que presentan un interés terapéutico. Las composiciones se preparan, respectivamente, por medio de procedimientos clásicos de mezclado, granulación o recubrimiento, y contienen alrededor de 0,1 a 75%, preferentemente alrededor de 1 a 50% de principio activo.
Asimismo, los vectores o transportadores según la invención, cargados con al menos una sustancia de interés, se pueden acoplar con polímeros solubles tales como los soportes de los medicamentos diana. Tales polímeros pueden comprender la polivinilpirrolidona, el copolímero pirano, polihidroxi-propil-metacrilamida-fenol, polihidroxi-etil-aspanamida-fenol, o poli(óxido de etileno)-polilisina, sustituida con restos palmitoílo. Adicionalmente, los compuestos según la invención pueden estar acoplados a una clase de polímeros biodegradables útiles para llevar a cabo una liberación controlada de un medicamento, por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(ypsilon-caprolactona), poli(ácido hidroxibutírico), poliortoésteres, poliacetales, polihidropiranos, policiano-acrilatos, y copolímeros de hidrogel secuenciales, reticulados o anfipáticos.
La posología para la administración de vectores o transportadores según la invención, cargados con al menos una sustancia de interés, se selecciona en función de una diversidad de factores que incluyen el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y la condición médica del sujeto; la gravedad del trastorno a tratar; la vía de administración; el estado de las funciones renal y hepática del sujeto, y la naturaleza del compuesto, o sal, particular empleado. Un médico o veterinario con experiencia normal determinará y prescribirá fácilmente la cantidad eficaz del vector o transportador cargado con la sustancia de interés deseada para prevenir, invertir o detener el progreso del trastorno médico que se debe tratar.
Cualquiera de las composiciones farmacéuticas anteriores puede contener de 0,1 a 99%, preferentemente 1 a 70% de principio activo.
A modo de ejemplos, las posologías orales de los vectores o transportadores según la invención, cargados con al menos una sustancia de interés, cuando se les utiliza para obtener los efectos indicados, estarán comprendidas entre aproximadamente 0,05 y 1.000 mg/día por vía oral y, preferentemente se administrarán en forma de comprimidos que contienen 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 y 1.000,0 mg de principio activo. Las concentraciones plasmáticas eficaces de los vectores o transportadores cargados con al menos una sustancia de interés estarán comprendidas dentro del intervalo que va desde 0,002 mg hasta 50 mg por kg de peso corporal y por día.
Los vectores o transportadores según la invención, cargados con al menos una sustancia de interés, se pueden administrar en forma de dosis diarias únicas, o la posología diaria total se puede administrar en dos, tres o cuatro dosis al día.
En una aplicación particular, la presente invención se refiere a un agente de diagnóstico, de utilización in vitro, formado por o que comprende al menos un vector, un transportador y/o una célula según la invención. Un agente de diagnóstico de este tipo se puede usar igualmente in vivo.
Por lo tanto, la presente invención tiene también como objeto un kit de diagnóstico que comprende el citado agente de diagnóstico. De manera más particular, el kit de diagnóstico comprende, en uno o múltiples envases, una cantidad predeterminada de una composición según la invención.
Asimismo, la secuencia de aminoácidos según la invención, o un vector y/o un transportador que incluye esa secuencia de aminoácidos, o células transfectadas con ayuda del dicho vector, pueden ser utilizados in vivo con fines de prevención, por ejemplo, y de manera no limitativa, para la prevención de infecciones virales, metástasis, apoptosis celular (enfermedades degenerativas, isquemia tisular, ...), o con fines terapéuticos, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades infecciosas (virales, bacterianas,...), cáncer y la neo-angiogénesis patológica.
De los ejemplos de realización siguientes, que hacen referencia a los diseños anexos, se deducirán ventajas y características adicionales de la invención.
I - Material y método 1) Líneas celulares a) Células normales
-
PtK2, fibroblastos de riñón de la rata canguro;
-
3T3, fibroblastos de embrión de ratón;
-
HUVEC, células endoteliales humanas;
-
CHO, células de ovario de hámster chino;
-
HUVEC, células endoteliales transfectadas con un gen de multiplicación celular;
-
CHO, células de riñón de hámster;
-
CHO-745. células de la línea CHO defectuosas para la síntesis de xilosil-transferasa.
b) Células tumorales
-
H129, carcinoma pulmonar humano;
-
HH9, células epiteliales tumorales de mama humana, transfectadas con un gen que codifica un factor de crecimiento;
-
MCF7, células epiteliales tumorales humanas;
-
MCF7 ras, células MCF7 transfectadas con el gen ras;
-
HeLa, carcinoma de cuello del útero humano;
-
HCT 118, carcinoma de colon humano;
-
HT-29, adenocarcinoma de colon humano;
-
LS174T, adenocarcinoma de colon humano;
-
B16-F10, células del melanoma de ratón;
-
Daudi, linfoma humano de Burkitt.
c) Cultivo de células
-
Las células se cultivan en un medio DMEM que contiene 2% de L-glutamina, 1% de piruvato sódico, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), y 10% de suero bovino fetal (medio completo) a 37ºC, en presencia de CO_{2} al 5%.
-
Las células CHO y CHO-745 se cultivan en medio MEM alfa que contiene 2% de L-glutamina, 1% de piruvato sódico, penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml), y 6% de suero bovino fetal (medio completo) a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5%.
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2) Preparación de los péptidos a) Síntesis química
Las síntesis de péptidos se llevan a cabo según técnicas conocidas por el experto en la materia (Allergen y Neosystem). Se les utiliza en fase sólida sobre resina Fmoc. La escisión se efectúa con ácido trifluoroacético (TFA) y los péptidos se purifican en columna HPLC-CR C5 semi-preparativa y se eluyen con una solución de TFA al 0,1% y un gradiente de acetonitrilo (10-70%) en TFA. Los péptidos liofilizados se disolvieron en NaCl 0,15M.
b) Construcción molecular que permite la preparación de proteínas que comprenden los péptidos de la invención
Las técnicas de biología molecular permiten construir plasmidios que, una vez introducidos en las células apropiadas, permiten la síntesis de macromoléculas vectorizadas.
- Construcción de vectores de expresión de proteínas recombinantes
La Figura 10 adjunta representa la preparación de vectores que permiten la expresión de proteínas recombinantes que contienen las secuencias peptídicas de la invención. El vector procariótico pQE30 (Qiagen) permite la expresión de genes bajo la forma de proteínas de fusión (o proteínas recombinantes) con la secuencia 6XHis. Este vector porta el origen de replicación ColE1, el promotor fuerte del fago T5 que es inducible por IPTG, el gen de la p-lactamasa que contiene la resistencia para ampicilina, y un sitio múltiple de clonación en 3' de la secuencia que codifica la etiqueta 6XHis, lo que permite la clonación de un ADN complementario en fase con la secuencia 6XHis.
Los oligonucleótidos complementarios de 63-mer:
\bullet
\vtcortauna PAV1U:
\quad
5' gatccgtaaaacgaggactaaaactacgacacgtacgaccacgagtaacacgaatggacgtaa 3'
\bullet
\vtcortauna PAV1L:
\quad
5' gatcttacgtccattcgtgttactcgtggtcgtacgtgtcgtagttttagtcctcgttttacg-3'
son híbridos. El segmento de ADN obtenido posee un sitio BamHI en 5' y un sitio BgIII en 3'. Codifica (caracteres en negrita) la secuencia peptídica PAV1: VKRGLKLRHVRPRVTRMDV. Este fragmento se clona en el sitio BamHI del vector pQE30. Los ADN complementarios (ADNc) que codifican la proteína viral Zebra (BZLF1) del virus de Epstein-Barr (EBV) o la proteína Zebra eliminada de su dominio de localización nuclear (nis) de 35 aminoácidos, se han obtenido por PCR. Han sido clonados en el sitio BamHI del vector His-PAV1 o pQE30. Los plasmidios resultantes permiten la expresión de proteínas recombinantes His_{6}-Zebra-PAV1, His_{6}-Zebra y His_{6}-Zebra\Deltanis después de la transformación de las bacterias E. coli.
- Inducción, extracción y purificación de proteínas recombinantes
La producción de proteínas recombinantes se induce a 37ºC mediante la adición de IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido) 1 mM a los cultivos bacterianos en fase exponencial de crecimiento en medio de Luria Bertani suplementado con 40 \mug/ml de ampicilina. 12 horas después de la adición de IPTG, las bacterias se centrifugan a 5700 g durante 15 min a 4ºC. El residuo bacteriano se recoge en 5 volúmenes de tampón de lisis de desnaturalización (Tris-HCl 20 mM pH 7,8; NaCl 0,5M; 10% de glicerol; guanidina-HCl 6M). Después de una incubación de 20 min a temperatura ambiente bajo agitación lenta, el lisado se clarifica por centrifugación de 30 min a 15.000 g a 4ºC. El sobrenadante que contiene la proteína recombinante se conserva a -80ºC.
Las proteínas recombinantes 6XHis se purifican por cromatografía de afinidad sobre una columna de resina "TALON" (CLONTECH) previamente equilibrada con tampón de lisis de desnaturalización. Después de 3 lavados sucesivos de la resina con 10 volúmenes de tampón de lisis de desnaturalización que contiene imidazol 10 mM, se renaturaliza la proteína recombinante unida a la columna por medio de un gradiente de guanidina-HCl 6 a 0M en tampón Tris-HCl 20 mM, pH 7,8; NaCl 0,5M; 10% de glicerol; PMSF 0,5 mM. La proteína recombinante se eluye con un gradiente de imidazol 20 mM a 1 M a pH 8,0. Los diferentes eluatos se analizan sobre gel de desnaturalización de SDS-acrilamida al 12%. Las fracciones que contienen la proteína purificada se combinan y se someten a diálisis durante 2 horas a 4ºC contra el tampón HEPES 20 mM a pH 7,5, NaCl 150 mM. La proteína se concentra, se divide en partes alícuotas y se congela rápidamente en nitrógeno líquido, conservándola a -80ºC.
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3) Péptidos utilizados a) Péptidos no funcionalizados
En conformidad con la norma ST-25, las siguientes secuencias (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 48) se relacionan en el anexo.
SEQ ID NO: 1.
Péptido que reacciona con heparina y derivado de la secuencia de aminoácidos (3358-3372) de la lipoproteína B humana (12), designado también en lo sucesivo HBP1.
SEQ ID NO: 2.
Péptido que reacciona con la heparina, dímero de SEQ ID NO: 1, también designado en lo sucesivo (HBP1)2.
SEQ ID NO: 3.
Péptido que reacciona con la heparina, trímero de SEQ ID NO: 1, designado también en lo sucesivo (HBP1)3.
SEQ ID NO: 4.
Péptido correspondiente a la región CDR3 hipervariable del anticuerpo monoclonal de ratón anti-ADN F4.1 (13).
SEQ ID NO: 5.
Péptido que contiene las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 6.
Péptido que contiene una parte de las regiones CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal de ratón anti-ADN F4.1 (13).
SEQ ID NO: 7.
Péptido que contiene las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 8.
Péptido correspondiente a la región CDR3 hipervariable del anticuerpo monoclonal humano anti-ADN RTT79 (14).
SEQ ID NO: 9.
Péptido que contiene las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 8.
SEQ ID NO: 10.
Péptido que reacciona con la heparina y que contiene la SEQ ID NO: 1 y la secuencia del péptido correspondiente a la región CDR3 hipervariable del anticuerpo monoclonal humano anti-ADN NE-1 (15), también designado en lo sucesivo bajo el nº 1047.
SEQ ID NO: 11.
Péptido que contiene la SEQ ID NO: 1 y la secuencia del péptido correspondiente a la región CDR3 hipervariable del anticuerpo monoclonal humano anti-ADN RT72 (16).
SEQ ID NO: 12.
Péptido que contiene la secuencia de la NLS (señal de localización nuclear, en sus siglas en inglés) de las células 3T3, y la SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 13.
Péptido que contiene la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de las regiones CDR2 y CDR3 del anticuerpo monoclonal humano anti-ADN NE-1.
SEQ ID NO: 14.
Péptido que contiene una parte de la región CDR3 del anticuerpo monoclonal de ratón F4.1, y de la SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 15.
Péptido que contiene dos veces la secuencia del péptido correspondiente a la región CDR3 hipervariable del anticuerpo monoclonal humano anti-ADN NE-1.
SEQ ID NO: 16.
Péptido resultante de la inclusión, en posición 13-19, de la SEQ ID NO: 1 en la SEQ ID NO: 15.
SEQ ID NO: 17.
Péptido que reacciona con la heparina, derivado de la secuencia de aminoácidos de la lipoproteína E humana (12), designado también HBP4.
SEQ ID NO: 18.
Péptido que reacciona con la heparina, derivado de la secuencia de aminoácidos de la agrina (17), proteína de la matriz extracelular que regula la diferenciación de una unión neuro- muscular.
SEQ ID NO: 19.
Dímero de la SEQ ID NO: 18.
SEQ ID NO: 20.
Péptido que reacciona con la heparina, derivado de la secuencia de aminoácidos de la "proteína de unión al factor de crecimiento insulínico" (18).
SEQ ID NO: 21.
Péptido que reacciona con la heparina, derivado de la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de la cadena A del factor de crecimiento plaquetario (19), designado también HPB6.
SEQ ID NO: 22.
Péptido que contiene 12 lisinas (K) y la SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 23.
Péptido que contiene 12 lisinas (K) y la SEQ ID NO: 5.
SEQ ID NO: 24.
Péptido que presenta actividad antimicrobiana (29).
SEQ ID NO: 25.
Péptido que reacciona con la heparina, y correspondiente a la secuencia de la "proteína de unión al factor de crecimiento insulínico" (18), designado también en lo sucesivo HBP2.
SEQ ID NO: 26.
Péptido que reacciona con la heparina, y dímero de un péptido derivado de la parte C-terminal de la secuencia de la superóxido dismutasa humana (20), designado también en lo sucesivo (HBP3)_{2}.
SEQ ID NO: 27.
Péptido que reacciona con la heparina, y correspondiente a la secuencia SEQ ID NO: 26, en la cual los aminoácidos están en configuración D.
SEQ ID NO: 28.
Péptido que reacciona con la heparina, y, por lo tanto, la secuencia derivada de la secuencia SEQ ID NO: 26, y contiene el resto RGD que fija de forma selectiva los \alphav integrinas (21).
SEQ ID NO: 29.
Péptido que reacciona con la heparina, y que está formado por los péptidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 17, designado también en lo sucesivo HBP1-HBP4.
SEQ ID NO: 30.
Péptido que reacciona con la heparina, y derivado de la parte C-terminal de la secuencia del factor de crecimiento de las células epidérmicas (EGF, en sus siglas en inglés) (22), designado también en lo sucesivo HBP7.
SEQ ID NO: 31.
Péptido que reacciona con la heparina y que corresponde al péptido cuya secuencia es SEQ ID NO: 12, en donde los aminoácidos están en posición recto verso.
SEQ ID NO: 32.
Péptido que reacciona con la heparina, y que corresponde a la secuencia SEQ ID NO: 30, en la cual los aminoácidos están en configuración D.
SEQ ID NO: 33.
Péptido que reacciona con la heparina, y que contiene una parte de la \gammasecuencia del factor ácido de crecimiento (aFGF, en sus siglas en inglés) de los fibroblastos (6), designado también en lo sucesivo HBP8.
SEQ ID NO: 34.
Péptido que reacciona con la heparina, y que contiene una parte de la secuencia del factor básico de crecimiento (bFGF, en sus siglas en inglés) de los fibroblastos, designado también en lo sucesivo HBP9 (23).
SEQ ID NO: 35.
Péptido que reacciona con la heparina, y que corresponde a una parte C-terminal de la secuencia de las mucinas intestinales (24), designado también en lo sucesivo HBP10.
SEQ ID NO: 36.
Péptido que reacciona con la heparina, y que contiene una parte de la secuencia C-terminal del interferón \gamma humano (26), designado también en lo sucesivo HBP11.
SEQ ID NO: 37.
Péptido que reacciona con la heparina, y que contiene una parte de la secuencia de la subunidad p40 de la interleuquina 12 humana (26), designado también en lo sucesivo HBP12.
SEQ ID NO: 38.
Péptido que reacciona con la heparina, y que contiene una parte de la secuencia del factor Ia derivado de las células estromáticas (27), designado también en lo sucesivo HBP13.
SEQ ID NO: 39.
Péptido que reacciona con la heparina, y que comprende una parte de la secuencia de la "proteína de unión a la heparina" (CAP37) (28), designado también en lo sucesivo HBP15.
SEQ ID NO: 40.
Péptido que reacciona con la heparina, correspondiente al péptido de la secuencia SEQ ID NO: 10 (1047), con la adición N-terminal de 13 lisinas.
SEQ ID NO: 41.
Péptido que reacciona con la heparina, correspondiente al péptido de la secuencia SEQ ID NO: 28 ((HBP3)_{2}), con la adición N-terminal de 13 lisinas.
SEQ ID NO: 42.
Péptido que reacciona con la heparina, correspondiente al péptido de la secuencia SEQ ID NO: 39 (HBP10), con la adición N-terminal de 13 lisinas.
SEQ ID NO: 43.
Péptido que presenta actividad antimicrobiana, y que contiene los péptidos de las secuencias SEQ ID NO: 10 (1047) y SEQ ID NO: 24.
SEQ ID NO: 44.
Péptido que presenta actividad antimicrobiana, y que contiene los péptidos de las secuencias SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 30 (HBP7).
SEQ ID NO: 45.
Péptido que presenta actividad antimicrobiana, y que contiene los péptidos de las secuencias SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 38 (HBP13).
SEQ ID NO: 46.
Péptido que comprende el péptido de la secuencia SEQ ID NO: 26 (HBP3)_{2}, con la adición N-terminal de glicina-ftaloílo.
SEQ ID NO: 47.
Péptido que comprende el péptido de la secuencia SEQ ID NO: 21 (HBP6), con la adición N-terminal de un resto salicililo.
SEQ ID NO: 48.
Péptido que comprende el péptido de la secuencia SEQ ID NO: 21 (HBP6), con la adición C-terminal de un resto salicililo.
b) Péptidos funcionalizados
Estos péptidos corresponden a las SEQ ID NO: 1 a 48 anteriores, pero portan, en el extremo N-terminal, una cisteína que permite el acoplamiento covalente con las sustancias de interés (véase más adelante), o biotina, que permite la asociación no covalente de los péptidos con estreptavidina o avidina conjugada con peroxidasa (véanse los puntos (1) y (2) más adelante).
II- Mecanismo de penetración de los péptidos 1) Implicación de los glicosaminoglicanos (GAG)
Los péptidos penetran en las células por endocitosis mediada por los GAG presentes sobre las membranas de todas las células eucarióticas. Se han llevado a cabo ensayos para determinar su papel en la penetración de los péptidos.
a) Se ha incubado heparina (50 \mug/ml) con células durante 1 hora, antes de agregar los conjugados péptido-peroxidasa a 0,2 \mug/ml durante 2 horas. A continuación, se lisaron las células y se determinó el nivel de peroxidasa.
La heparina, a la dosis de 50 \mug/ml, inhibe totalmente la internalización de todos los péptidos en las células H1299 y HeLa. La cantidad de heparina necesaria para inhibir 50% de la penetración de los péptidos acoplados con peroxidasa se ha evaluado con estos dos tipos de células, incubándolas con los conjugados de péptido-peroxidasa con concentraciones crecientes de heparina. Los resultados de la inhibición de la internalización de los péptidos se expresan en concentración de heparina (\mug/ml) en la siguiente Tabla 2.
TABLA 2
3
Estos ensayos demuestran la función de los sulfatos de heparano en la penetración de los péptidos.
b) Las células CHO-745 son derivadas de las células CHO. Son deficitarias en xilosil-transferasa que interviene en la formación de los sulfatos de condroitina y de heparano de la membrana. Los complejos péptidos-avidina no penetran en las células CHO-745, independientemente del péptido analizado.
Esto pone de manifiesto la importancia de los sulfatos de condroitina y heparano de la membrana celular en la penetración de péptidos.
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2) Implicación del metabolismo celular
Con el fin de comprender los mecanismos biológicos a través de los cuales los péptidos penetran en las células y su compartimentalización, se han llevado a cabo ensayos con medicamentos cuya acción sobre determinados compartimientos celulares es específica. Se han incubado complejos de péptido-peroxidasa con células H1299 a una concentración de 0,2 \mug/ml durante 2 horas, en presencia o ausencia de medicamento. Las células se lisaron y se determinó la concentración de peroxidasa en el lisado celular.
La Tabla 3 siguiente informa sobre el porcentaje de inhibición de la internalización de péptidos, calculado en relación con los valores obtenidos del lisado de células incubadas sin medicamento.
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TABLA 3 
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4 
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La penetración de los péptidos analizados resulta completamente inhibida por la incubación de las células a 4ºC con todos los péptidos. Resulta parcialmente inhibida con los inhibidores del metabolismo celular tales como azida sódica (inhibidor de la ATPasa), genisteína (inhibidor de la tirosín quinasa y del enlace con ATP). El mecanismo de internalización depende, por lo tanto, de la energía.
La penetración de los péptidos HBP3 y HBP7 resulta inhibida en un mismo orden de magnitud con cloroquina, lo que refleja una internalización en los mismos compartimientos del citoplasma celular (vesículas endosómicas, retículo endoplásmico), en tanto que el clorato sódico y el cloruro de amonio (que evita la acidificación de las vesículas endosómicas, que inhibe de esta forma el tránsito intracelular) intervienen en mucho menor grado sobre la internalización del péptido de la secuencia SEQ ID NO: 35. Esto sugiere que los péptidos penetran en las células por mecanismos similares a los utilizados por diferentes toxinas, sin presentar, no obstante, ningún tipo de toxicidad. Las vías intracelulares hasta la zona del Golgi y el tránsito retrógrado parecen ser distintos según los péptidos.
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III- Resultados 1) Evaluación de la capacidad de los péptidos para reaccionar con el ADN y con heparina
La capacidad de los péptidos SEQ ID NO: 1 a 21 para fijarse sobre el ADN y la heparina se evaluó en placas ELISA sensibilizadas con ADN o heparina. Se depositan diluciones de péptidos biotinilados sobre las placas y se determina su fijación con ayuda de estreptavidina conjugada con peroxidasa. La actividad de la peroxidasa se establece con ortodianisidina y H_{2}O como sustrato. La avidez de cada uno de los péptidos por el ADN o la heparina se evalúa por la cantidad (x 10^{-6} M) de péptido necesaria para obtener 50% de fijación. Los resultados obtenidos se reflejan en la siguiente Tabla 4.
TABLA 4
5
De esta tabla se deduce que la afinidad de la SEQ ID NO: 1 por el ADN es muy baja, en tanto que la de su dímero (SEQ ID NO: 2) y de su trímero (SEQ ID NO: 3) es muy elevada. Además, la asociación de la SEQ ID NO: 1 con los vectores peptídicos aumenta considerablemente la afinidad de estos vectores por el ADN [véanse las SEQ ID NO: 4 y 5, 6 y 7, 8 y 9, y 15 y 16].
De manera similar, la afinidad de la SEQ ID NO: 17 y de la SEQ ID NO: 18 por el ADN, la heparina y los condroitín sulfatos es muy baja. Por el contrario, la afinidad por estas moléculas del dímero de la SEQ ID NO: 18 (SEQ ID NO: 19) es mayor. Las SEQ ID NO: 20 y 21, que contienen un número mayor de aminoácidos, entre ellos un número elevado de aminoácidos básicos, poseen una elevada afinidad por el ADN, la heparina y los condroitín sulfatos.
La avidez de los péptidos SEQ ID NO: 25 a 39 por diversos proteoglicanos (Kd x 10^{-9} M), la heparina y los sulfatos de condroitina se evalúa por la cantidad de péptidos necesaria para obtener 50% de fijación sobre los diversos antígenos. Los resultados se ofrecen en la Tabla 5 siguiente.
TABLA 5
6
De esta tabla se deduce que la avidez por la heparina de los péptidos SEQ ID NO: 33 (HBP8), 36 (HBP11) y 37 (HBP12) es claramente más baja (>100 x 10^{-9} M) que la de los otros péptidos que, en promedio, está comprendida entre 20 y 80 x 10^{-9} M. La avidez de los distintos péptidos por los sulfatos de condroitina A, B y C se encuentra, en conjunto, dentro del mismo orden de magnitud que la de la heparina. De esta forma, la avidez de los péptidos SEQ ID NO: 34 (HBP9) y SEQ ID NO: 38 (HBP13), tanto para la heparina como para las 3 condroitinas, es de 46-50 x 10^{-9} M, en tanto que la de los péptidos SEQ ID NO: 33 (HBP8), 36 (HBP11) y 37 (HBP12), tanto para la heparina como para las 3 condroitinas, es >100 x 10^{-9}M. El péptido modificado SEQ ID NO: 28 (HBP3 + RGD) ha perdido su afinidad por la heparina.
2) Evaluación de la penetración de los péptidos en las células
Las células se cultivan en presencia de diferentes péptidos portadores, en el extremo N-terminal, de biotina, a concentraciones decrecientes (50 a 6 \mug/ml), en el medio de cultivo durante períodos variables de tiempo (1-18 horas).
Al final del cultivo, las células se lavan tres veces con PBS (NaCl 0,15 M, tamponado con tampón fosfato de potasio 0,01 M a pH 7,4) y, seguidamente, se fijan durante 15 minutos en etanol a -20ºC. La penetración del péptido se evalúa después de la incubación, durante 30 minutos, con estreptavidina conjugada con peroxidasa (abreviado S-PO por estreptavidina-peroxidasa). A continuación, se elimina la S-PO y se lavan las células. La actividad de la peroxidasa internalizada se determina por diaminobenzidina en presencia de H_{2}O_{2}, y las células se analizan al microscopio
(30).
El examen al microscopio demuestra que algunos de los péptidos utilizados (SEQ ID NO: 1, 4, 11, 12, 17 y 18) no confieren coloración citoquímica positiva intracelular. Con los otros péptidos, se observan coloraciones positivas, pero de intensidad variable. Se ha observado una coloración débil con las SEQ ID NO: 2, 6, 8 y 19, en tanto que con los péptidos restantes se han obtenido coloraciones intensas.
Resulta interesante señalar que todos los péptidos que contienen la SEQ ID NO: 1, es decir, el PLH de la lipoproteína B humana, confieren una coloración positiva, excepto la propia SEQ ID NO: 1 (monómero) y la SEQ ID NO: 11.
En lo que se refiere a las SEQ ID NO: 1, 17 y 18, se trata de péptidos cortos que corresponden a los PLH de la lipoproteína B y la lipoproteína E humanas, y a agrina. A diferencia de estos péptidos monómeros, sus dímeros (SEQ ID NO: 2) y, sobre todo, el trímero de la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 3) confieren coloraciones claramente positivas.
Con respecto a la SEQ ID NO: 11, está formada por la SEQ ID NO: 1 y la CDR3 del anticuerpo monoclonal humano anti-ADN RT72 (codificado por la línea germinal), que no contiene más que un único aminoácido básico (K). A diferencia de la SEQ ID NO: 11, las SEQ ID NO: 5, 7, 9 y 10, formadas por la SEQ ID NO: 1 y las CDR2 y/o CDR3 de anticuerpos monoclonales anti-ADN (codificados por la línea germinal(, contienen un número elevado de aminoácidos básicos, proporcionando coloraciones intensas.
Por una parte, estos resultados sugieren que la secuencia de los péptidos debe contener un exceso mínimo de 3 a 5 aminoácidos básicos para que el péptido sea capaz de penetrar en el interior de las células. Por otra parte, la SEQ ID NO: 1 no es capaz de aumentar el poder de traslocación de las CDR2 y/o CDR3 anti-ADN que, en estos últimos, poseen un número elevado de aminoácidos básicos.
El examen al microscopio ha demostrado que todos los péptidos SEQ ID NO: 25 a 48 confieren coloraciones histoquímicas positivas a una concentración de 6 \mug/ml, si bien la intensidad es variable en función de los péptidos.
3) Evaluación de la penetración celular de los complejos de péptido/estreptavidina o péptido/avidina acoplados a la peroxidasa o de los conjugados péptidos/peroxidasa
a)
Se ha preparado, de manera extemporánea, un complejo de péptido biotinilado/S-PO o biotinilado/A-PO (A-PO por avidina-peroxidasa) de dos formas:
-
en una relación molar péptido: S-PO o A-PO de 4:1 (por ejemplo, 1,4 \mug de péptido de peso molecular 3500 para 10 \mug de S-PO; el peso de S-PO utilizado varía en función de los péptidos, dado que sus pesos moleculares son diferentes).
-
en una relación molar péptido: S-PO o A-PO de 25:1 (por ejemplo, 1,7 \mug de péptido de peso molecular 3500 para 1 \mug de S-PO).
Los complejos se preparan incubando el péptido biotinilado con S-PO o A-PO en PBS bajo un volumen de 5 a 10 \mul durante 15 minutos, a la temperatura del laboratorio. Seguidamente, se les diluye en 1 ml de medio completo de cultivo, se filtran sobre membrana de 0,2 micrómetros, y se incuban con las células durante 4 horas. A continuación, las células se lavan tres veces con PBS.
Para evaluar al microscopio la penetración de los complejos, las células se fijan como anteriormente durante 15 minutos en etanol a -20ºC, se lavan con PBS, y se determina la actividad de la peroxidasa internalizada por diaminobenzidina en presencia de H_{2}O_{2}.
Para medir la cantidad de complejos de péptido/S-PO o A-PO internalizados, las células se tripsinizan, se transfieren a microtubos y se someten a recuento. Se las lava dos veces por centrifugación y, a continuación, el residuo se suspende en 200 \mul de tampón de lisis (tampón Tris, 0,1 M, pH 8, 0,5% de Nonidet). Después de 15 minutos, la peroxidasa contenida en el tampón se dosifica sobre las placas de 96 pocillos con orto-dianisidina y H_{2}O_{2} por comparación con una curva estándar de S-PO. La lectura se lleva a cabo a 450 nm. La cantidad contenida en las diferentes muestras se expresa en picogramos (pg) para 10^{4} células.
En general, los resultados obtenidos del examen de las células al microscopio óptico se correlacionan correctamente con los resultados obtenidos de la medición de la peroxidasa internalizada. Por esta razón, en esta serie solamente se ofrecen los resultados cuantitativos obtenidos con un número determinado de péptidos en las Tablas 6 y 7, y en las Figuras 1 a 3.
La Tabla 6 representa la evaluación de la capacidad de penetración de péptidos formados por diferentes PLH, procedentes de proteínas diversas en las células H1299, utilizando los complejos de péptido:S-PO de 4:1 y una concentración de péptido de 1 \mug.
TABLA 6
7
Los resultados demuestran claramente que, para que un vector sea eficaz en la transferencia intracelular del complejo S-PO (PM = 100.000), debe haber presente un mínimo de 6 aminoácidos básicos (SEQ ID NO: 2, 3, 19-21).
La Tabla 7 siguiente recoge los resultados de la evaluación de la influencia de la SEQ ID NO: 1 sobre la penetración, en las células H1299, de péptidos acoplados a la SEQ ID NO: 1, en donde:
Concentración a: 25 péptidos por una molécula de S-PO (1 \mug)
Concentración b: 4 péptidos por una molécula de S-PO (10 \mug)
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TABLA 7
8
De la Tabla 7 se deduce que el acoplamiento de la SEQ ID NO: 1 con los vectores peptídicos procedentes de anticuerpos anti-ADN humanos o de ratón potencia considerablemente el poder de traslocación de estos vectores.
La Figura 1 es un gráfico de barras que ilustra la internalización de estreptavidina-peroxidasa transportada por diversos péptidos biotinilados durante una noche a 37ºC, a la concentración a (0,5 nmol de péptido biotinilado por 0,02 nmol de estreptavidina-peroxidasa).
Tal como se deduce de esta Figura 1, el acoplamiento de la SEQ ID NO: 1 con un vector dado (SEQ ID NO: 6), que da lugar a la SEQ ID NO: 7, aumenta significativamente la capacidad de transferencia de dicho vector. Sin embargo, el acoplamiento, con este mismo vector (SEQ ID NO: 6), de un péptido de la misma longitud que la SEQ ID NO: 1 y de composición próxima en aminoácidos, que da lugar a la SEQ ID NO: 12, apenas incrementa el poder de traslocación de este vector. Incluso el acoplamiento de una segunda CDR3 idéntica sobre dicha SEQ ID NO: 6, lo que da lugar a la SEQ ID NO: 14, no genera un incremento tan fuerte como el del acoplamiento con la SEQ ID NO: 1. En general, la asociación de la SEQ ID NO: 1 con vectores de origen humano (SEQ ID NO: 10 y 13) o de ratón (SEQ ID NO: 5), da lugar a vectores especialmente eficaces.
La Figura 2 es un gráfico de barras que ilustra la internalización de la estreptavidina-peroxidasa (S-PO) y de la avidina-peroxidasa (A-PO) transportadas por diversos péptidos biotinilados (2 horas a 37ºC) a la concentración b (0,25 nmol de péptidos biotinilados por 0,01 nmol de S-PO o de A-PO).
La Figura 3 es un gráfico de barras que ilustra la relación entre la internalización de la S-PO y la de A-PO para estos mismos péptidos biotinilados, 2 horas a 37ºC, a la concentración b (0,25 nmol de péptido biotinilado por 0,01 nmol de S-PO o A-PO).
La comparación, de acuerdo con estas Figuras 2 y 3, de la transferencia de la S-PO y de A-PO a través de los vectores indica que la naturaleza de la sustancias que se desean transferir influye más sobre la capacidad de traslocación de los vectores de origen totalmente murino (SEQ ID NO: 14) que sobre la de vectores que comprenden el PLH de origen humano (SEQ ID NO: 7. 10 y 13).
La Figura 4 es un gráfico de barras que ilustra la relación entre la internalización de la S-PO transportada por dos péptidos biotinilados a 37ºC durante 2 horas y a 4ºC durante 2 horas.
Los resultados obtenidos indican que el poder de traslocación del vector de origen humano (SEQ ID NO: 10) depende mucho más de la temperatura (metabolismo activo de las células) que el del vector de origen murino (SEQ ID NO: 14).
b) Para evaluar de manera más directa la penetración de los péptidos, evitando el efecto de la avidina-peroxidasa, se han conjugado algunos de los péptidos de secuencia SEQ ID NO: 25 a 48 de forma covalente por medio de cisteína en posición C-terminal del péptido a peroxidasa.
El acoplamiento de péptidos con peroxidasa se ha llevado a cabo del modo siguiente:
A un mg de peroxidasa activada con maleimida (Sigma) en 100 \mul de tampón fosfato sódico, NaCl 0,15 M, EDTA 5 mM se agrega 1 mg de péptido. Después de 2 horas a temperatura del laboratorio, se agrega \beta-mercaptoetanol a una concentración final de 1,5 mM durante 15 minutos. La eliminación del péptido no acoplado se efectúa por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración (umbral de corte = 30.000 daltons, Sartorius), seguida de tres lavados en tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 7,4, que contiene NaCl 0,15 M.
Las células H1299 se incuban durante 2 horas con los conjugados a concentraciones crecientes de péptido-peroxidasa en el medio de cultivo y, a continuación, se lavan con PBS. Las células se lisan y se evalúa la cantidad de péptido internalizada por medio de la dosificación de peroxidasa en el lisado de los cultivos, con referencia a una curva establecida con el péptido-peroxidasa.
La cantidad de péptido internalizada (pg/10^{3} células) según las concentraciones de conjugado en el medio de cultivo se muestra en la siguiente Tabla 8.
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TABLA 8
9
Aparentemente, cuanto más elevada es la concentración del conjugado péptido-peroxidasa en el medio de cultivo, más aumenta la cantidad internalizada.
Para comparar la penetración de los conjugados en función del tipo de células, se han incubado células de diferentes líneas con 0,2 \mug/ml de conjugado de péptido-peroxidasa durante 2 horas, determinando la cantidad de peroxidasa en los lisados. La Tabla 9 y la Tabla 9 bis siguientes ofrecen los resultados obtenidos, expresados en pg/10^{3} células. La cantidad de cada péptido internalizada en las diferentes líneas no varía más que se simple a doble en general.
La internalización de los péptidos HBP3 (SEQ ID NO: 26) y HBP7 (SEQ ID NO: 32) en configuración D es del mismo orden de magnitud que la de los péptidos homólogos en configuración L. Lo mismo ocurre con el péptido de la SEQ ID NO: 30 y su homólogo SEQ ID NO: 31, que posee una secuencia de aminoácidos en posición recto-verso.
TABLA 9 Internalización de péptido-peroxidasa (pg/10^{3} células)
10 
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TABLA 9 bis Internalización de péptido-peroxidasa (pg/10^{3} células)
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4) Evaluación de la penetración de los conjugados de péptidos-IgG en las células
A 2 mg de anticuerpo IgG monoclonal o de su fragmento F(ab')_{2} en 1 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 7 que contiene NaCl 0,15 M, se agregan 200 \mug de SMCC [4-(N-maleimido-metil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo] en 10 \mul de dimetilsulfóxido, y la solución se incuba durante 30 minutos a la temperatura del laboratorio. La eliminación del exceso de reactivo se efectúa por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración [umbral de corte = 10.000 daltons (Da), Vivascience], seguida de tres lavados en tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M.
A continuación, se lleva a cabo el acoplamiento con el péptido en una relación molar de 6 péptidos por 1 IgG en el tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M, durante 3 horas a temperatura del laboratorio. Seguidamente, se elimina el exceso de péptido no acoplado por centrifugación sobre membranas, como en la etapa anterior.
Para evaluar al microscopio la penetración de los conjugados, las células se cultivan en presencia de diferentes conjugados de anticuerpo-péptidos a concentraciones decrecientes (50 a 6 \mug/ml) en el medio de cultivo durante 4 horas a 37ºC.
Al final del cultivo, las células se lavan tres veces con PBS, se fijan, entonces, durante 15 minutos en etanol a -20ºC. La penetración del conjugado IgG-péptido se evalúa después de la incubación durante 1 hora con un anticuerpo anti-IgG de ratón acoplado a la peroxidasa. A continuación, las células se lavan con PBS y se determina la actividad de peroxidasa por diaminobenzidina en presencia de H_{2}O_{2}.
Para medir la cantidad de conjugados de péptidos-IgG internalizados, se tripsinizan las células, se les transfiere a microtubos y se someten a recuento. Se las lava dos veces por centrifugación y, a continuación, el residuo de suspende en 200 \mul de tampón de lisis (tampón Tris 0,1 M, pH 8, 0,5% de Nonidet 40). La cantidad de IgG de ratón presente en el lisado se mide por ELISA sobre placas empapadas con el anticuerpo de carnero anti-IgG de ratón, y se determina por medio de un conjugado de anticuerpo de carnero anti-IgG de ratón acoplado a peroxidasa, haciendo referencia a una curva estándar establecida con el mismo anticuerpo monoclonal conjugado con el péptido.
Los resultados se recogen en la Tabla 10, que informa sobre la penetración de anticuerpos monoclonales de ratón o de sus fragmentos F(ab')_{2} al interior de células humanas H1299, en donde:
a: anticuerpo monoclonal murino específico de la proteína p53, y
b: anticuerpo monoclonal murino específico de la proteína p21, procedente de un hibridoma rata-rata.
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TABLA 10
12 
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Tal como de deduce de esta tabla, el uso de vectores de origen humano asociados a la SEQ ID NO: 1 permite una internalización eficaz del anticuerpo en células humanas. Se debe destacar, igualmente, que se transfieren cantidades mayores de anticuerpo al interior de las células cuando los vectores están conjugados con F(ab')_{2} más que al anticuerpo completo. La Figura 5 es un gráfico de barras que ilustra la internalización de un anticuerpo monoclonal murino IgG_{1} acoplado con diferentes péptidos (4 horas a 37ºC; 30 \mug/ml de conjugado depositado) sobre células humanas H1299, y células del ovario de hámster CHO.
Tal como se desprende de este gráfico, los vectores de origen humano (SEQ ID NO: 10 y 13) son más eficaces para la transferencia de sustancias de interés al interior de células humanas que los vectores de origen murino acoplados a la SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 7 y 5). Adicionalmente, los vectores de origen humano (SEQ ID NO: 10 y 13) son más eficaces para la transferencia de sustancias al interior de células humanas que al interior de las células de hámster.
5) Evaluación de las capacidades de penetración intracelular de las proteínas recombinantes por inmunofluorescencia
Células HeLa se siembran a la concentración de 0,5 x 10^{4} células en una placa de 24 pocillos, cada uno de los cuales contiene una laminilla estéril; 24 horas más tarde, se depositan 50 \mug/ml de proteína recombinante sobre las células. 6 ó 18 horas más tarde, se lavan las células 2 veces en PBS (solución salina fisiológica, tamponada con fosfato) y se fijan por medio de una solución de PFA (paraformaldehído) al 4% en PBS durante 10 min a temperatura ambiente, o se disocian mediante tripsina y se continúa su cultivo durante 18 horas, sobre la laminilla, fijándolas después. Tras lavar 3 veces con PBS, las células se permeabilizan por medio de una solución de Triton X-100 al 0,25% en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Después de 3 lavados de 5 minutos en PBS, las células se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda con el anticuerpo monoclonal anti-RGS-His (Qiagen) diluido a 1/50 en PBS-BSA (albúmina de suero bovino) al 0,1%. Después de 3 lavados en PBS de 10 min, se incuban las laminillas durante 30 min a temperatura ambiente en cámara húmeda con antisuero de cabra anti-IgG de ratón conjugado con FITC diluido a 1/200 en PBS-BSA al 0,1%. Las células se lavan 2 veces con PBS durante 10 min y, a continuación, las laminillas se montan sobre láminas con líquido de montaje (Mounting Media de Sigma). Las células se analizan bajo microscopio confocal (Leica).
Las células HeLa se incuban durante 18 horas con la proteína recombinante HIS6-Zebra-PAV1 y se fijan (Figura 17A), o se disocian y se continúa su cultivo durante 18 horas, antes de la fijación (Figura 17B). La observación de las células bajo microscopio confocal revela que las células incubadas durante 18 horas presentan en su superficie una fluorescencia importante. No parece detectarse ninguna fluorescencia intracelular en este ensayo. Sin embargo, la contra-tinción de los núcleos con DAPI o HOECHST permite confirmarlo. No cabe excluir la posibilidad de que una reducida proporción de proteína haya sido internalizada. Además, parece ser que basta con un único resto peptídico PAV1 para dirigir una proteína recombinante a la superficie de las células. Tras la disociación de las células, la fluorescencia se localiza en las vesículas endosómicas de diferentes tamaños. La proteína recombinante HIS6-Zebra-PAV1 ha sido internalizada, pero no parece ser nuclear a pesar del dominio nis de la proteína Zebra.
Las células HeLa se incuban durante 6 ó 18 horas con la proteína recombinante His_{6}-Zebra\Deltanis-PAV1 y se fijan (Figuras 18A y 18B), o se disocian después de 18 horas, y se devuelven a cultivo durante 18 horas antes de la fijación (Figura 18C). A partir de las 6 horas se observa fluorescencia nuclear que aumenta a las 18 horas. Las zonas nucleares marcadas por las flechas presentan una fluorescencia más importante. Para las células disociadas, se localiza una fluorescencia más marcada alrededor de los nucléolos. Al contrario que la proteína recombinante His_{6}-Zebra-PAV1, la proteína recombinante His_{6}-Zebra\Deltanis-PAV1, desprovista del dominio nis, muestra una localización nuclear. La secuencia PAV1 parece dirigir la proteína al núcleo.
Para las células HeLa de control (sin proteína), o las células HeLa incubadas con proteínas recombinantes His_{6}-Zebra y His_{6}-Zebra\Deltanis, no se observa fluorescencia.
6) Evaluación in vitro de la actividad de la ribonucleasa A (RNasa) conjugada con péptidos
Se disuelven 5 mg de RNasa A bovina en 1 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 7, que contiene NaCl 0,15M.
Se disuelve 1 mg de SMCC en 50 \mul de dimetilsulfóxido (solución final 20 mg/ml).
La activación de la RNasa A se efectúa agregando 12,5 \mul de la solución de SMCC a 200 \mul de la solución de RNasa A (relación molar = 10 moléculas de SMCC por 1 molécula de RNasa A).
La reacción se lleva a cabo durante 30 min a temperatura ambiente.
El exceso de reactivo se elimina por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración (umbral de corte = 5.000 Da, Vivascience), seguida de 3 lavados con un tampón de fosfato sódico 0,1 M que contiene NaCl 0,15 M.
El acoplamiento con el péptido se efectúa a continuación, en una relación molar de péptidos:RNasa A de 8:1 en el tampón fosfato sódico 0,1 M, a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M, durante 3 horas a temperatura ambiente.
El exceso de péptido no acoplado se elimina por centrifugación como en la etapa anterior.
La cantidad de péptido acoplado a la RNasa A se evalúa por el peso molecular de las bandas obtenidas después del acoplamiento sobre un gel de SDS-poliacrilamida al 15% en acrilamida.
El resultado de la electroforesis, en el que se compara la RNasa A sola (banda 1) con la RNasa A acoplada con la SEQ ID NO: 10, se reproduce en la Figura 6, en la que se presentan dos ensayos de acoplamiento (bandas 2 y 3).
La Figura 7 muestra el resultado de una electroforesis, aplicada de la misma forma, y que permite comparar la migración de la RNasa A sola (banda 5) y la de la SEQ ID NO: 14 sola (banda 6) con la del producto de acoplamiento de la RNasa A con SEQ ID NO: 14 (dos ensayos: bandas 1 y 2), con la SEQ ID NO: 5 (banda 3) y con la SEQ ID NO: 10 (banda 4).
Se ha analizado la actividad citotóxica de la RNasa A acoplada a los vectores de origen humano (SEQ ID NO: 10, 15 y 16) sobre células HH9 en cultivo, en comparación con la RNasa A nativa.
a) Evaluación in vitro de la actividad citotóxica de la RNasa sobre las células HH9
El día anterior, las células se siembran sobre placas de 96 pocillos, a razón de 10^{3} células por pocillo.
Al día siguiente, se aspira el sobrenadante y se sustituye por 100 \mul de medio que contiene diluciones sucesivas de RNasa A-vector o RNasa A nativa, y se continúa el cultivo durante 72 horas.
A continuación, se agregan a los pocillos 50 \mul de una solución de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) a 1 mg/ml en el medio de cultivo, y se cultiva durante 4 horas.
Se retira el sobrenadante y se agregan a los pocillos 100 \mul de dimetilsulfóxido. Después de la dilución de los cristales, se lee la coloración a 550 nm.
Los resultados se calculan en porcentaje de la densidad óptica media obtenida en los pocillos de células que contienen diluciones de muestras que se deben analizar, y de la densidad óptica de los pocillos que no recibieron el medio. Estos resultados se representan gráficamente en la Figura 8.
Tal como se deduce de la Figura 8, la RNasa A nativa carece de cualquier actividad citotóxica. La citotoxicidad media de 50% se obtiene a concentraciones de RNasa A-vector comprendidas entre 33 y 100 \mug/ml, es decir, entre las concentraciones molares de 2 a 7 x 10^{-7} M.
b) Evaluación in vitro de la actividad citotóxica de los conjugados de péptido-RNasa sobre células HeLa
Se han ensayado los diferentes conjugados de péptido-RNasa sobre diversas líneas celulares. Los resultados se expresan en CI_{50} que corresponden a la concentración del conjugado de péptido-RNasa que produce una inhibición de 50% del crecimiento de las células después de 72 horas de cultivo.
La Tabla 11 resume los resultados obtenidos. Aparentemente, todos los conjugados poseen actividades citotóxicas diferentes, y que algunos de ellos tienen escaso poder citotóxico.
TABLA 11
13
7) Evaluación in vitro de la actividad citotóxica de la RNasa A conjugada con péptidos sobre los tumores humanos injertados en el ratón atímico (desnudo) a) Protocolo 1
Ratones desnudos hembras de 6 semanas recibieron inyecciones subcutáneas con 3 x 10^{6} células HH9 en un volumen de 50 \mul en la lado izquierdo. El día 17 después del injerto, se midieron los tumores y los ratones se dividieron en 3 grupos: grupo 1 (7 ratones) inyectado con 100 \mug de un acoplamiento de SEQ ID NO: 10-RNasa A en 50 \mul de PBS; grupo 2 (7 ratones) inyectado con 50 \mug de RNasa A nativa en 100 \mul de PBS; grupo 3 (6 ratones) inyectado con 50 \mul de PBS. Las inyecciones se administraron tres veces a la semana bajo las mismas condiciones. En cada ocasión, se midieron los tumores y se calculó su volumen de acuerdo con la fórmula V = 4/3 x L^{2} (L>l), en donde L corresponde al diámetro mayor del tumor y l al diámetro menor del tumor.
Los resultados se recogen gráficamente en la Figura 9.
Tal como muestra esta figura, a partir de día 33, la progresión del volumen tumoral ha experimentado una ralentización manifiesta por la RNasa A acoplada con la SEQ ID NO: 10.
Aparentemente, la citotoxicidad es más importante para determinadas células que para otras.
b) Protocolo 2
Los ratones desnudos recibieron injertos subcutáneos de células tumorales HH9, tal como se ha descrito anteriormente. El día 9 después del injerto, los ratones recibieron 2 veces a la semana, mediante inyecciones peritumorales, 100 \mug de RNasa, o 65 \mug de péptido (HBP3)_{2}, o 65 \mug de péptido (HBP3)_{2} + 100 \mug de RNasa, o 100 \mug de conjugado de péptido (HBP3)_{2}-RNasa, o del conjugado HBP6-RNasa. Los ratones fueron sacrificados el día 26 y se pesaron sus tumores.
La inhibición del crecimiento de los tumores HH9 tratados con los conjugados de péptido-RNasa aparece en la Tabla 12. La inhibición del crecimiento de los tumores de los ratones se calcula en relación con el peso medio de los tumores de los ratones que recibieron NaCl.
TABLA 12
14
Los 3 conjugados de péptido-RNasa inhiben el crecimiento tumoral de manera equivalente, en tanto que el péptido solo o agregado a RNasa tiene escaso efecto.
8) Transfección in vitro de células con el plasmidio de la luciferasa, con ayuda de los péptidos a) Transfección de células CHO
El plasmidio utilizado es el PCMV-LUC (6,4 kb), portador del gen de la luciferasa bajo el control del promotor del citomegalovirus humano.
Los complejos plasmidio-péptido se preparan agregando 3 \mug de plasmidio en 50 \mul de NaCl 0,15 M y 3,3 nmol de SEQ ID NO: 22 y 23 durante 15 min. Los complejos se preparan por triplicado.
Se cultivan células CHO en medio MEM Alpha completo, que contiene 6% de suero bovino fetal, con la siembra de 5 x 10^{4} células por pocillo de una placa de 24 pocillos, el día anterior al ensayo. Seguidamente, se retira el medio de los pocillos y se agrega el complejo de plasmidio-péptido (3 \mug de plasmidio y 3,3 nmol de péptido en 0,5 ml de medio completo durante 5 horas a 37ºC). Entonces, se sustituye el medio por medio completo, y se continúa el cultivo durante 18-20 horas. Las células se lavan, entonces, tres veces con PBS y, seguidamente, se lisan con 100 \mul de tampón de lisis (Promega), que contiene 1% de Triton X-100 y DTT 2 mM.
A continuación, se extraen 15 \mul de lisado para medir la luciferasa con el kit de Promega para luciferina, y otros 15 \mul para calcular la cantidad de proteínas en el lisado, a través del ensayo de Bradford. Las unidades relativas de luciferasa (RLU) se expresan con respecto a mg de proteínas.
Los resultados se recogen en la siguiente Tabla 13.
TABLA 13
15
Los resultados demuestran que la expresión de luciferasa es posible por medio de la formación del complejo de plasmidio con uno de los vectores, y que esta expresión está aumentada 6 veces (SEQ ID NO: 23) por la adición de PLH de la apolipoproteína de la SEQ ID NO: 22.
b) Transfección de células 3T3
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Técnica: Se utiliza el plasmidio pCMVLUC (portador del gen de la luciferasa), proporcionado por Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. El día anterior, se siembran las células 3T3 en placas de 24 pocillos (8x10^{4} células/pocillo), en medio de cultivo completo.
Los péptidos y el plasmidio forman el complejo con una relación de 1,6 nmol/\mug en 50 \mul de NaCl 0,15 M durante 20 min a la temperatura del laboratorio. A continuación, se lavan las células y se añade el complejo péptido-plasmidio a las células en 0,5 ml de medio completo. Después de 5 horas de incubación a 37ºC, se retira el medio de reacción y se agrega 1 ml de medio completo a las células. Después de 24 horas de cultivo, las células se lavan 3 veces con PBS y se lisan con 100 \mul de tampón de lisis (Promega), que contiene 1% de Triton X-100 y DTT 2 mM durante 15 min. El ensayo de luciferasa se lleva a cabo en el lisado de células tras la centrifugación. Se mide la cantidad de proteína en el lisado con ayuda del ensayo de Bradford (Bio-Rad) y se calcula de acuerdo con una curva establecida con gammaglobulina bovina. Se determina la actividad de luciferasa en 15 \mul de lisado al que se han agregado 100 \mul de reactivo de luciferasa, que contiene luciferina (Promega). Las unidades relativas (RLU) de luciferasa se miden en un luminómetro (Berthold Systems) y se expresan en relación con mg de proteína.
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Resultados: La cantidad de luciferasa expresada por las células transfectadas se muestra en la siguiente Tabla 14.
TABLA 14
16
El péptido unido en forma de complejo al plasmidio permite la transferencia de este último al interior de las células, así como la expresión del gen de la luciferasa. La eficacia de la transfección, expresada por la cantidad de luciferasa (RLU/mg de proteínas), varía en función de los péptidos utilizados. El péptido SEQ ID NO: 42 y el péptido SEQ ID NO: 40 ofrecen, respectivamente, valores 5,5 y 2,6 veces más elevados que el péptido SEQ ID NO: 41.
9) Evaluación de la penetración de sustancias con ayuda de transportadores acoplados a los péptidos
Si se analizan ahora los transportadores según la invención, la Tabla 15 siguiente ofrece algunos ejemplos de transportadores y de sustancias de interés por las que exhiben una fuerte afinidad.
TABLA 15
17
En la tabla anterior, el término genérico "péptido" significa "secuencia de aminoácidos según la invención".
La proteína A es una proteína aislada a partir de Staphylococcus aureus con un peso molecular de 42.000 Da. La propiedad característica de esta proteína es su gran afinidad por la parte Fc de las IgG. Esta propiedad le permite fijar 2 a 4 moléculas de IgG sin interactuar con los sitios activos de los anticuerpos. La proteína A es interesante para las IgG humanas, de conejo y de rata, y determinadas IgG de ratón.
La proteína G, originalmente, es una proteína de 30.000 a 35.000 Da, aislada de la pared celular de cepas bacterianas C ó D de estreptococos. La proteína G comercializada por SIGMA es una proteína recombinante de 17.000 Da que contiene dos dominios de fijación de IgG. Al igual que la proteína A, la proteína G muestra una fuerte afinidad por la fracción Fc de las IgG, pero se utilizará, principalmente, para las IgG bovinas, de ratón y de cordero.
Los F(ab')_{2} proceden de anticuerpos. Se utilizarán como ejemplos IgG de cordero anti-IgG de ratón, obtenidas a partir de inmunosuero de cordero. Se les purifica por cromatografía de afinidad, en la que la fase sólida está formada por IgG de ratón fijadas sobre perlas de poliacrilamida-agarosa. Una purificación a través de un inmuno-absorbente permite la fijación específica de las IgG de cordero anti-IgG de ratón por medio de una reacción antígeno-anticuerpo. Esta unión antígeno-anticuerpo se disocia por un pH ácido. La digestión de las IgG mediada por enzimas proteolíticas permite obtener diferentes fragmentos de anticuerpos. Con ayuda de la pepsina, se obtienen fragmentos F(ab')_{2} bivalentes, de tamaño reducido (PM = 92.000 Da), y los fragmentos Fc totalmente digeridos en pequeños polipéptidos. La supresión del fragmento Fc permite reducir el tamaño del anticuerpo y simplifica el acoplamiento con los péptidos. La realización de un transportador de péptido-F(ab')_{2} anti-IgG permite internalizar en cantidades elevadas una gran variedad de IgG de ratón.
La IgG anti-peroxidasa es un anticuerpo monoclonal de isotipo IgG1, que se aísla a partir de la ascitis de ratón. Se purifica por cromatografía de afinidad sobre proteína G (GammaBind Plus Sepharose: Pharmacia). Este anticuerpo presente una fuerte afinidad por la peroxidasa y, por este motivo, por cualquier molécula que contenga peroxidasa. La peroxidasa (PO) es una enzima extraída del rábano negro, y tiene un peso molecular de 44.000 Da, que se puede asociar con mucha facilidad a numerosas moléculas. La realización de un transportador de péptido-IgG anti-PO permitirá internalizar en las células PO y cualquier sustancia que contenga PO.
La concanavalina, extraída de Canavalia ensiformis, es una lectina que presenta una afinidad por los grupos \alpha-D-manosilo y \alpha-D-glicosilo terminales de las proteínas. Esta propiedad le permite reaccionar con múltiples glicoproteínas. La realización de un transportador de péptido-concanavalina permitirá internalizar, en las células, numerosas glicoproteínas o moléculas glicolizadas.
La estreptavidina, molécula de 60.000 Da extraída de Streptomyces avidinii, y la avidina, extraída de la clara de huevo, tienen los cuatro sitios de reconocimiento para la biotina. Su constante de afinidad por esta pequeña molécula es muy elevada (KD = 10^{-13}M), lo cual les permite interactuar con todas las sustancias que contienen biotina. La realización de un transportador de péptido-estreptavidina o péptido-avidina permitirá internalizar, en las células, biotina y cualquier molécula que contenga biotina.
Los siguientes ejemplos ilustran la realización y utilización de tales transportadores.
a) Evaluación de la penetración de la ribonucleasa A bovina (RNasa A), transportada por un transportador de péptido-F(ab')_{2} anti-RNasa, en las células
La digestión de las IgG anti-RNasa mediada por una enzima proteolítica, pepsina, permite obtener fragmentos
F(ab')_{2}. Esta digestión, que se lleva a cabo en una solución de acetato sódico a pH 4,5 con 2% de pepsina, permite la fragmentación del fragmento Fc de las IgG sin alterar los sitios activos del anticuerpo.
Se agregan 2 mg de anticuerpo F(ab')_{2} anti-RNasa en 1 ml de tampón fosfato de potasio 0,1 M a pH 7,4, a 110 \mug de SMCC [4-(N-maleimido-metil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo] en 11 \mul de dimetilsulfóxido. La solución se incuba durante 45 min a la temperatura del laboratorio. La eliminación del exceso de reactivos se efectúa por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración (umbral de corte = 10.000 Da, Vivascience), seguida de tres lavados en tampón fosfato sódico 10 mM a pH 7, que contiene NaCl 0,5 M y EDTA 5 mM.
A continuación se lleva a cabo el acoplamiento con el péptido, en una relación molar de 6 péptidos por 1 F(ab')_{2}
en tampón fosfato sódico 10 mM, a pH 7, que contiene NaCl 0,5 M y EDTA 5 mM, durante 3 horas, a la temperatura del laboratorio. Seguidamente, se elimina totalmente el exceso de péptido no acoplado por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración, como en la etapa anterior.
Estos transportadores [péptido-F(ab')_{2} anti-RNasa] se agregan a la ribonucleasa A en medio de cultivo completo, y la solución se incuba durante 1 hora a la temperatura del laboratorio. La relación molar de esta reacción es de 2 RNasa/1 F(ab')_{2}.
Para la evaluación al microscopio de la penetración de la RNasa A, las células se cultivan en presencia de complejos [péptido-F(ab')_{2} anti-RNasa]-RNasa A diluidos a concentraciones decrecientes de RNasa A (de 100 a 6 \mug/ml) en medio de cultivo durante 4 horas, a 37ºC.
Al final de la incubación, las células se lavan tres veces con PBS, y, a continuación, se fijan durante 15 min en etanol absoluto a -20ºC. La penetración de RNasa se evalúa después de la incubación, durante 1 hora, con un anticuerpo anti-RNasa acoplado a peroxidasa. Seguidamente, se lavan las células en PBS y se determina la actividad de la peroxidasa por medio de diaminobenzidina en presencia de H_{2}O_{2}.
Para medir la cantidad de RNasa A internalizada, se tripsinizan las células, se transfieren a microtubos y se someten a recuento. Se las lava dos veces por centrifugación con PBS y, entonces, el residuo se suspende en 220 \mul de tampón de lisis (tampón Tris 0,1 M, pH 8, 0,5% de Nonidet 40). La cantidad de RNasa A presente en el lisado celular se mide por ELISA sobre placas sensibilizadas con el anticuerpo de conejo anti-RNasa A, y reveladas con un conjugado de anticuerpo de conejo anti-RNasa A acoplado a peroxidasa, haciendo referencia a una curva estándar establecida con la RNasa.
Los resultados expuestos en la Tabla 16 ilustran la internalización de RNasa mediante el transportador F(ab')_{2} anti-RNasa, y la internalización de RNasa acoplada de forma covalente con el péptido, al interior de células HeLa.
TABLA 16
18
b) Evaluación de la penetración de IgG de ratón (IgG), transportada por un transportador de péptido-F(ab')_{2} anti-IgG de ratón, en las células
Los transportadores de péptido-F(ab')_{2} anti-IgG de ratón se obtienen según la técnica descrita anteriormente.
Estos transportadores [péptido-F(ab')_{2} anti-IgG] se agregan a las IgG de ratón en tampón NaCl 0,5 M. La solución se incuba durante 1 hora a la temperatura del laboratorio. La relación molar de esta reacción es de 1 F(ab')_{2}/1 IgG. Después de 1 hora de incubación, los complejos formados se diluyen en medio de cultivo completo.
Para la evaluación al microscopio de la penetración de IgG, las células se cultivan en presencia de complejos [péptido-F(ab')_{2} anti-IgG]-IgG diluidos a concentraciones decrecientes de IgG (de 100 a 6 \mug/ml) en medio de cultivo completo durante 4 horas, a 37ºC.
Al final de la incubación, las células se lavan tres veces con PBS, se fijan a continuación durante 15 min en etanol absoluto a -20ºC. La penetración de IgG se evalúa después de la incubación durante 1 hora, con un anticuerpo anti-IgG acoplado a la peroxidasa. Seguidamente, las células se lavan con PBS y la actividad de peroxidasa se revela por medio de diaminobenzidina en presencia de H_{2}O_{2}.
Para medir la cantidad de IgG internalizada, se tripsinizan las células, se transfiere a microtubos, y se someten a recuento. Se las lava dos veces por centrifugación con PBS, y el residuo se suspende en 220 \mul de tampón de lisis (tampón tris 0,1 M, pH 8, 0,5% de Nonidet 40). La cantidad de IgG presente en el lisado celular se mide por ELISA en placas sensibilizadas con anticuerpo de cordero anti-IgG, y se revela por un conjugado de anticuerpo de cordero anti-IgG acoplado a peroxidasa, haciendo referencia a una curva estándar establecida con IgG. La actividad de la peroxidasa se determina con orto-dianisidina y H_{2}O_{2}.
Un mismo transportador [péptido-F(ab')_{2} anti-IgG] puede transportar una gran variedad de IgG de ratón al interior de las células.
Los resultados expuestos en la Tabla 17 ilustran la internalización de diferentes IgG de ratón o, eventualmente, de rata al interior de células HeLa, por medio del mismo transportador [péptido-F(ab')_{2} anti-IgG].
TABLA 17
19
c) Evaluación de la penetración de la peroxidasa (PO), o de moléculas que contienen peroxidasa, transportadas por un transportador de péptido-IgG anti-PO, en las células
Se agregan 2 mg de anticuerpo IgG monoclonal específico de la peroxidasa, o de su fragmento F(ab')_{2} en 1 ml de tampón fosfato de potasio 0,1 M, a pH 7,4, a 110 \mug de SMCC [4-(N-maleimido-metil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo] en 11 \mul de dimetilsulfóxido. La solución se incuba durante 45 min a la temperatura del laboratorio. Se elimina el exceso de reactivos por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración (umbral de corte = 10.000 Da, Vivascience), seguida de tres lavados en tampón fosfato sódico 10 mM, a pH 7, que contiene NaCl 0,5 M y EDTA 5 mM.
A continuación, se lleva a cabo el acoplamiento con el péptido, en una relación molar de 6 péptidos por 1 IgG o 1 F(ab')_{2} en tampón fosfato sódico 10 mM, a pH 7, que contiene NaCl 0,5M y EDTA 5 mM, durante 3 horas a la temperatura del laboratorio. Seguidamente, se elimina totalmente el exceso de péptido no acoplado por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración, como en la etapa anterior.
Estos transportadores [péptido-F(ab')_{2} anti-PO] se agregan a la peroxidasa o a la peroxidasa biotinilada en un tampón NaCl 0,5 M. La solución se incuba durante 1 hora a la temperatura del laboratorio. La relación molar de esta reacción es de 2 PO/1 IgG o F(ab')_{2}.
Para la evaluación al microscopio de la penetración de la PO o de moléculas que contienen PO, las células se cultivan en presencia de complejos [péptido-IgG anti-PO]-PO a concentraciones decrecientes de PO o de moléculas que contienen PO (100 a 6 \mug/ml) en medio de cultivo durante 4 horas, a 37ºC.
Al final del cultivo, las células se lavan tres veces con PBS, y, a continuación, se fijan durante 15 min en etanol absoluto a -20ºC. Seguidamente, las células se lavan con PBS y se evalúa la penetración de PO o de moléculas que contienen PO por la actividad de la peroxidasa, determinada por diaminobenzidina en presencia de H_{2}O_{2}.
Para medir la cantidad de PO internalizada, se tripsinizan las células, se transfieren a microtubos, y se someten a recuento. Se las lava dos veces por centrifugación con PBS y, entonces, el residuo se suspende en 220 \mul de tampón de lisis (tampón Tris 0,1 M, pH 8, 0,5% de Nonidet 40). La cantidad de PO presente en el lisado celular se mide por ELISA sobre placas sensibilizadas con el anticuerpo de ratón anti-peroxidasa, y reveladas con orto-dianisidina y H_{2}O_{2} en referencia a una curva estándar de PO.
Los resultados expuestos en la Tabla 18 ilustran la internalización de PO y de la PO biotinilada mediante el transportador [péptido-IgG anti-PO], al interior de células HeLa.
TABLA 18
20
d) Evaluación de la penetración de IgG transportadas por un transportador de péptido-proteína A, en las células
Se agrega 1 mg de proteína A en 0,5 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 7 a 120 \mug de SMCC [4-(N-maleimido-metil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo] en 12 \mul de dimetilsulfóxido. La solución se incuba durante 45 min a la temperatura del laboratorio. Se elimina el exceso de reactivos por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración (umbral de corte = 10.000 Da, Vivascience), seguida de tres lavados en tampón fosfato sódico 0,1 M, a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M.
A continuación, se lleva a cabo el acoplamiento con el péptido, en una relación molar de 6 péptidos por 1 proteína A en tampón fosfato sódico 0,1 M, a pH 7, que contiene NaCl 0,15M, durante 3 horas a la temperatura del laboratorio. Seguidamente, se elimina totalmente el exceso de péptido no acoplado por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración, como en la etapa anterior.
Estos transportadores [péptido-proteína A] se agregan a IgG en un tampón NaCl 0,15 M. La solución se incuba durante 20 min a la temperatura del laboratorio. La relación molar de esta reacción es de 2 IgG/1 proteína A.
Para la evaluación al microscopio de la penetración de la IgG, las células se cultivan en presencia de complejos [péptido-proteína A]-IgG diluidas a concentraciones decrecientes de IgG (100 a 6 \mug/ml) en medio de cultivo durante 4 horas, a 37ºC.
Al final del cultivo, las células se lavan tres veces con PBS, y, a continuación, se fijan durante 15 min en etanol absoluto a -20ºC. La penetración de IgG se evalúa tras la incubación durante 1 hora con un anticuerpo anti-IgG acoplado a la PO (por ejemplo, IgG de conejo-PO). Seguidamente, las células se lavan con PBS y la actividad de la peroxidasa se determina por diaminobenzidina en presencia de H_{2}O_{2}.
Para medir la cantidad de IgG internalizada, se tripsinizan las células, se transfieren a microtubos, y se someten a recuento. Se las lava dos veces por centrifugación con PBS y, entonces, el residuo se suspende en 220 \mul de tampón de lisis (tampón Tris 0,1 M, pH 8, 0,5% de Nonidet 40). La cantidad de IgG presente en el lisado celular se mide por ELISA sobre placas sensibilizadas con el anticuerpo anti-IgG, y reveladas por un conjugado de anticuerpo anti-IgG acoplado a peroxidasa, haciendo referencia a una curva estándar establecida con las IgG. La actividad de la PO se determina con orto-dianisidina y H_{2}O_{2}. Los resultados expuestos en la Tabla 19 ilustran la internalización de diferentes IgG mediante el transportador [péptido-proteína A], al interior de células HeLa.
TABLA 19
21
10) Transporte del anticuerpo anti-CEA a las células del cáncer de colon
a) Se han llevado a cabo ensayos con el anticuerpo anti-CEA 35A7 y los péptidos de secuencia SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 35, designados también 1047, HBP7 y HBP10, respectivamente.
El péptido 1047 ha sido acoplado a 35A7 y a Herceptin®. Después de controlar las actividades del anticuerpo de los conjugados por ELISA, se ha estudiado la internalización por inmunofluorescencia, en comparación con el anticuerpo de partida a 37ºC y 4ºC. En las células LS174T, carcinoma de colon humano CEA+, el conjugado 35A7-1047 internaliza desde 1 h 15, en tanto que el 35A7 no exhibe ninguna internalización hasta las 5 h. En células SKOv3, carcinoma de ovario humano ErbB2+, el conjugado Herceptin®-1047 presenta una internalización rápida, próxima a la obtenida con Herceptin®.Después del marcado radioactivo con ^{125}I, los conjugados exhiben una inmuno-reactividad próxima a la del anticuerpo de partida sobre el antígeno inmovilizado en Sepharose. Un análisis por filtración sobre gel demuestra la ausencia de agregados.
b) Comparación de los péptidos 1047, HBP7 y HBP10. Esta comparación no se refiere más que al anticuerpo 35A7
- Ensayos in vitro
Un estudio cinético de internalización de diferentes conjugados (35A7-1047, 35A7-HBP7 y 35A7-HBP10) sobre células LS147T muestra una internalización más importante con el péptido HBP7 que con el 1047 y HBP10. Estos dos péptidos ofrecen resultados comparables. Sobre células SKOv3, CEA-, 1047 y HBP7 inducen una internalización comparable a la obtenida sobre LS147T, en tanto que HBP10 proporciona un resultado reducido a la mitad.
- Ensayos in vivo
Se han estudiado los 3 conjugados 35A7-1047, 35A7-HBP7 y 35A7-HBP10, marcados con ^{125}I, en el ratón desnudo portador de tumores LS147T, en comparación con 35A7 marcado. ^{131}I-35A7 muestra una captación tumoral de aproximadamente 13% de la dosis inyectada por gramo (%DI/g) 6 h después de la inyección. Esta captación afecta a entre 20 y 25% DI/g del tumor 24 h después de la inyección. El conjugado ^{125}I-35A7-1047 muestra una eliminación algo más rápida y una captación tumoral ligeramente disminuida con respecto a ^{131}I-35A7 (18,6 frente a 21,2% DI/g a las 24 h). El conjugado ^{125}I-HBP7 exhibe una captación hepática importante desde las 6 h. Esto determina una eliminación rápida y una débil captación tumoral (8,5% DI/g a las 24 h). El conjugado ^{125}I-35A7-HBP10, con una biodistribución muy cercana a la del anticuerpo nativo, muestra la mejor captación tumoral de los 3 conjugados.
c) El efecto de inducción de la internalización por medio del péptido 1047 es particularmente visible sobre 35A7, anticuerpo dirigido contra CEA, que es un antígeno que no se internaliza. El efecto es menos evidente sobre Herceptin®, que se internaliza rápidamente después de la fijación a su antígeno ErbB2.
Los ensayos in vitro llevados a cabo con 1047, HBP7 y HBP10 demuestran que los tres péptidos inducen una internalización de 35A7. HBP7 parece ser el más activo, pero HBP10 es el que parece respetar mejor la especificidad del anticuerpo (marcado efecto sobre células CEA+, efecto disminuido sobre células CEA-). Los ensayos in vivo confirman los resultados obtenidos in vitro.
c) Las Figuras 11 a 16 adjuntas ilustran los resultados descritos.
- Péptidos:
\bullet
1047: 2420 Da \bullet sobre anticuerpo anti-ACE y anti-erbB2
\bullet
HBP7: 1827 Da \bullet sobre anticuerpo anti-ACE solamente
\bullet
HBP10: 1696 DA \bullet sobre anticuerpo anti-ACE solamente
\vskip1.000000\baselineskip
- Acoplamiento:
Después de su puesta a punto, las condiciones definidas para un acoplamiento (evitando la formación de agregados de anticuerpos), son: 18 SMCC/lg y 12 pépt/lg-SMCC.
\vskip1.000000\baselineskip
- Ensayo de internalización sobre células en cultivos:
\bullet Las Figuras 11A y B representan el ensayo 1: sobre células A375 (ACE negativas) y 5F12 (ACE positivas), 40.000 células por pocillo (placa de 24 pocillos). Incubación con anticuerpo (Ac) nativo: 35A7 frente a Ac conjugado: 35A7-1047, 4 h a 37ºC. Lavados, fijación, incubación con Ac secundario-peroxidasa, revelado OPD, lectura a 490 nm. DO en función de la concentración del anticuerpo en \mug/ml.
\bullet La Figura 12 representa el ensayo de la prueba 1, con anticuerpos marcados con yodo 125.
\bullet Las Figuras 13 A y B representan el ensayo 2: sobre células A375 (erbB2 negativas) y SKOv3 (erbB2 positivas), 40.000 células por pocillo (placa de 24 pocillos). Incubación con el anticuerpo (Ac) nativo: Herceptin® frente a Ac conjugado: HER-1047, 4 h a 37ºC. Lavados, fijación, incubación con Ac secundario-peroxidasa, revelado OPD, lectura a 490 nm.
\bullet Las Figuras 14 A y B representan el ensayo 3: disminución de la concentración del anticuerpo con variación de la duración de la incubación 1 h ó 4 h.
\bullet Las Figuras 15A a F representan el ensayo 4: protocolo idéntico, pero con comparación de los 3 péptidos (1047-HBP7-HBP10) sobre células SKOv3 (ACE-) y LS174T (ACE+).
Las Figuras 16 A a F ilustran los experimentos in vivo: distribución de los anticuerpos 35A7-1047, 35A7-HBP7, 35A7-HBP10 marcados radiactivamente con yodo 125, frente a 35A7-Yodo 131; ratón suizo desnudo/desnudo con injertos de LS174T (carcinoma de colon humano, CEA+); co-inyección de 5 \mug de Ac-pépt* y de 5 \mug de Ac* nativo por ratón, vía i.v.; disección 6 h/24 h después de la inyección, expresión de los resultados en porcentajes de dosis inyectada por gramo de tejido. Barra negra: Ac conjugado - 125I; Barra blanca: Ac nativo - 131I.
11) Transporte de partículas con ayuda de un derivado de péptido-IgG
El vector utilizado en los ejemplos siguientes es un anticuerpo monoclonal de ratón (IgG1) acoplado al péptido de secuencia SEQ ID NO: 10 (1047). El acoplamiento del péptido al anticuerpo se realiza de la forma descrita anteriormente.
a) Perlas fluorescentes: Preparación del complejo de péptido IgG-microesfera:
Microesferas de poliestireno fluorescentes de 70 a 900 nm, portadoras de anticuerpos anti-IgG de ratón en su superficie (Estapor, Merck eurolab), se diluyen a 1/100 en NaCl 0,15 M. Se agregan 4 \mul de esta preparación a un volumen de 50 \mul que contienen 10 \mug de IgG monoclonal de ratón, conjugados con el péptido SEQ ID NO: 2, y se dejan en incubación durante 30 min a la temperatura del laboratorio. Este medio de reacción se deposita sobre las células H1299 sembradas (5x10^{4} células/pocillo) el día anterior, durante 18 horas.
Las células se lavan y observan al microscopio de fluorescencia: las células incubadas con los complejos de péptido-IgG-perlas fluorescentes se encuentran fuertemente marcadas, independientemente del tamaño de las perlas, en tanto que los controles (perlas fluorescentes sin péptido-IgG, o con IgG normales) son negativas.
- Oro coloidal: preparación del complejo de péptido-IgG-oro coloidal:
Perlas de oro coloidal (British Biocell International) de 10 nm se complejan con IgG monoclonales de ratón, previamente conjugadas al péptido 1047, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en una relación de 750 \mug de IgG por 1 ml de la solución de oro coloidal. Para la penetración del complejo en las células, el residuo de la suspensión se diluye a la mitad en medio de cultivo.
c) Evaluación de la internalización de los complejos de péptido-IgG-perlas fluorescentes y/u oro coloidal a microscopia electrónica
Después de las etapas de conjugación, las preparaciones se depositan sobre células H1299 cultivadas desde el día anterior, de la forma anteriormente descrita. Después de 18 horas de cultivo para el complejo de IgG-perlas fluorescentes, o de 4 horas para el complejo de IgG-oro coloidal, las células se lavan en PBS tres veces, y a continuación, se fijan en una solución de glutaraldehído al 1,6% en tampón fosfato sódico 0,1 M durante 1 hora, y después se tratan de la manera habitual para microscopia electrónica.
d) Resultados: Los complejos de péptidos IgG-microesferas de 70 nm (Figura 19), así como los complejos de péptido-IgG-oro coloidal (Figura 20) son visibles en las vesículas y en el interior del retículo endoplásmico del citoplasma, y alrededor de la región de Golgi.
12) Transporte de doxorrubicina
Las antraciclinas tales como doxorrubicina se encuentran entre los agentes de mayor actividad en el tratamiento de cánceres humanos. Todavía no se ha establecido su modo de entrada en las células. Lo que sí se conoce es que son rápidamente transportadas hacia el interior del núcleo celular. Su toxicidad, debida probablemente a su gran difusión en todo el organismo, representa una limitación en el tratamiento, impidiendo su uso en grandes cantidades.
Los presentes inventores han querido definir si el acoplamiento de doxorrubicina a los péptidos HBP mejora su poder de inhibición del crecimiento de tumores humanos, reduciendo, además, la toxicidad del medicamento.
a) Acoplamiento de los péptidos a doxorrubicina
La doxorrubicina, cuyo grupo aminado se halla protegido, se trata con ácido 4-maleimido-butírico en presencia de carbodiimida, lo que da lugar a la formación de un enlace entre el hidróxido de la doxorrubicina y el carboxilo del ácido maleimido-butírico. El grupo maleimido introducido de este modo en la doxorrubicina reacciona con la cisteína presente en el extremo C- o N-terminal del péptido.
De acuerdo con el esquema general, se han preparado los siguientes conjugados:
1047-doxorrubicina; HBP1-doxorrubicina; HBP3-doxorrubicina; HBP6-doxorrubicina, HBP7-doxorrubicina;
HBP10-doxorrubicina; HBP13-doxorrubicina.
b) Evaluación in vitro de la actividad biológica de doxorrubicina conjugada con los péptidos
Para evaluar la actividad biológica de los conjugados de péptido-doxorrubicina, se mide la inhibición del crecimiento de las células tumorales en cultivo.
El día anterior, las células se siembran sobre placas de 96 pocillos, a razón de 10^{3} células por pocillo. Al día siguiente, se aspira el sobrenadante y se sustituye por 100 \mul de medio que contiene diluciones sucesivas de péptido-doxorrubicina o de doxorrubicina nativa (10^{-6} M-10^{-8} M), y se prosigue el cultivo durante 48 horas.
A continuación, se agregan a los pocillos 50 \mul de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) a 1 mg/ml en el medio de cultivo, y se cultiva durante 4 horas. Se retira el sobrenadante y se agregan a los pocillos 100 \mul de dimetilsulfóxido. Después de la disolución de los cristales, se lee la coloración a 550 nm.
Los resultados se calculan como porcentaje de la densidad óptica media obtenida en los pocillos de células que contienen las diluciones de las muestras a analizar, y de la densidad óptica de los pocillos que no han recibido más que medio. Se expresan en concentraciones molares que dan 50% de inhibición del crecimiento de las células, que se resumen en la Tabla 20 siguiente.
TABLA 20
22
Aparentemente, in vitro, la sensibilidad de las células a los conjugados de péptido-doxorrubicina es del mismo orden de magnitud de la de doxorrubicina nativa. Las líneas resistentes a la doxorrubicina (K562R y MCF7R) requieren una concentración mayor de doxorrubicina.
c) Evaluación in vivo de la actividad antitumoral de los conjugados de péptido-doxorrubicina
Ratones desnudos reciben inyecciones de 3x10^{6} células HH9 por vía subcutánea en un costado. El día 19 después del injerto celular, se miden los tumores y se forman 4 grupos de 6 ratones, que reciben por inyección peritumoral NaCl, doxorrubicina nativa, o los conjugados 1047-doxorrubicina o HBP1-doxorrubicina, a razón de 30 \mug de doxorrubicina o equivalente de conjugados cada dos semanas. Se miden los tumores y se calcula su volumen. El día 60, después de la inyección de un total de 120 \mug de doxorrubicina o equivalente, el crecimiento tumoral está inhibido, respectivamente, en 77% de el conjugado de 1047-doxorrubicina, 84% con el conjugado de HBP1-doxorrubicina, y 79% con doxorrubicina sola, lo que demuestra que, en condiciones in vivo, estos conjugados son al menos tan eficaces como la doxorrubicina nativa.
d) Evaluación in vivo de la toxicidad de los conjugados de péptido-doxorrubicina
La inyección por vía intravenosa de doxorrubicina o de doxorrubicina-péptido permite comparar la toxicidad de las diferentes preparaciones. El cálculo se realiza por la pérdida de peso de los ratones (5 ratones por grupo). Se han llevado a cabo dos ensayos:
Ensayo 1: los ratones recibieron 200 \mug por inyección, a intervalos de 3 días, es decir, 600 \mug de doxorrubicina o equivalente de péptido-doxorrubicina en total. Los ratones se pesan al día siguiente después de la última inyección.
Ensayo 2: los ratones recibieron 2 inyecciones de 200 \mug de doxorrubicina o equivalente de péptido-doxorrubicina, a intervalos de 1 semana, es decir, 499 \mug en total, y se pesan al día siguiente después de la última inyección.
La Tabla 21 siguiente refleja la pérdida de peso de los ratones tratados con doxorrubicina o conjugados de péptido-doxorrubicina. La pérdida de peso media se calcula en relación con el peso medio de los ratones que recibieron NaCl.
TABLA 21
23
A la dosis de 600 \mug, los ratones que recibieron doxorrubicina nativa perdieron 31% de su peso, en tanto que los que recibieron péptido-doxorrubicina no perdieron más que 18 a 8% de su peso. La dosis de 400 \mug comprende una pérdida de peso de 15% entre los ratones que recibieron doxorrubicina nativa, mientras que con los conjugados de péptido-doxorrubicina, la pérdida no resulta significativa.
13) Transporte de ubiquitina
La ubiquitina es un polipéptido de 76 aminoácidos, altamente conservado durante la evolución, presente en el organismo de todos los eucariotas, con un peso molecular de 8500 daltons. La ubiquitina intracelular interviene en diversas funciones celulares tales como la degradación de proteínas tras su ligación con ubiquitina, la progresión del ciclo celular, la regulación de la activación del factor de transcripción NF_{-kB}- La ubiquitina extracelular tiene la propiedad de inhibir la proliferación de las células básicas hematopoyéticas () por inducción de apoptosis.
a) Acoplamiento de ubiquitina a los péptidos
Se agrega 1 mg de ubiquitina en 0,3 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M a 390 \mug de SMCC (4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo) en 39 \mul de dimetilsulfóxido, y la solución se incuba durante 30 min a la temperatura del laboratorio. El exceso de reactivo se elimina por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración (umbral de corte = 5.000 daltons, Sartorius), seguida de tres lavados en tampón fosfato sódico 0,1 M, a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M. El acoplamiento con el péptido se efectúa, a continuación, en una relación molar de 5 péptidos por 1 ubiquitina en 1 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, a pH 7, a la temperatura del laboratorio. Seguidamente, se elimina el exceso de péptido no acoplado por centrifugación sobre membranas, como en la etapa anterior.
b) Evaluación de la penetración de los conjugados de péptido-ubiquitina
La evaluación de la penetración de los conjugados de péptido-ubiquitina se lleva a cabo con los conjugados preparados con péptidos portadores de una biotina en el extremo N-terminal.
El día anterior, se siembran células HT29 sobre placas de 24 pocillos (5x10^{4}/pocillo).
Se agregan los diferentes conjugados de péptido (biotinilado)-ubiquitina a concentraciones decrecientes (100 a 25 \mug/ml) en el medio de cultivo durante 4 horas a 37ºC. Al final del cultivo, se lavan las células tres veces con PBS, se fijan, a continuación, durante 15 min en etanol a -20ºC. La penetración del conjugado péptido-biotina-ubiquitina se evalúa después de la incubación durante 60 min con avidina acoplada a peroxidasa. La actividad de la peroxidasa se determina por diaminobenzidina en presencia de H_{2}O_{2}.
La penetración, dependiente de la concentración de los conjugados en el medio de cultivo, se evalúa al microscopio por la intensidad de la coloración expresada en cruces. La siguiente Tabla 22 indica la penetración de los conjugados de péptido-biotina-ubiquitina en las células.
TABLA 22
24
c) Evaluación de la actividad biológica de los conjugados de péptido-ubiquitina
La proliferación celular se mide mediante el ensayo de MTT. Se cultivan células Daudi (3x10^{4} células/pocillo) en placas de 96 pocillos durante 48 horas a 37ºC, en medio de cultivo RPMI completo, al que se agregan concentraciones decrecientes (200 a 12,5 \mug/ml) de ubiquitina nativa o conjugada con péptidos, y se continúa el cultivo durante 48 horas.
A continuación, se agregan a los pocillos 50 \mul de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) a 1 mg/ml en medio de cultivo, y se cultiva durante 4 horas.
El sobrenadante se retira y se agregan a los pocillos 100 \mul de dimetilsulfóxido. Después de la disolución de los cristales, se lee la coloración a 550 nm.
La tabla 23 indica la inhibición del crecimiento de las células Daudi por medio de los conjugados de péptido-ubiquitina. Los resultados, que se muestran en la Tabla 23, se calculan como porcentaje de la densidad óptica media obtenida en los pocillos de células que contiene diluciones de las muestras a analizar, y de la densidad óptica de los pocillos que no han recibido el medio. Se expresan como concentración que inhibe en 50% el crecimiento celular.
TABLA 23
25
La ubiquitina nativa no inhibe el crecimiento de las células Daudi. El conjugado preparado con el péptido HBP10 lo inhibe poco, en tanto que el conjugado preparado con el péptido HBP7 es eficaz y produce todavía 35% de inhibición a 50 \mug/ml. El conjugado preparado con el péptido 1047 produce valores de inhibición intermedios.
14) Transporte del citocromo C
El citocromo C es una proteína hemática que constituye el complejo de lípido-proteínas mitocondriales. Juega un papel vital en la oxidación celular de vegetales y mamíferos. Está formado por una única cadena de polipéptidos de 104 aminoácidos (masa molecular 13.000 daltons), con el grupo heme unido a los restos cisteína. La precipitación del citocromo C por sales ("relargage" o "salting out") desde las mitocondrias hacia el citosol implica una apoptosis de las células por activación de las caspasas.
a) Acoplamiento del citocromo C a los péptidos
Se agregan 4 mg de citocromo C en 930 \mul de tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M, a 540 \mug de SMCC [4-(N-maleimido-metil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo] en 54 \mul de dimetilsulfóxido, y la solución se incuba durante 30 min a la temperatura del laboratorio. El exceso de reactivo se elimina por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración (umbral de corte = 10.000 daltons, Sartorius), seguida de tres lavados en tampón fosfato sódico 0,1 M, a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M.
A continuación, se lleva a cabo el acoplamiento a los péptidos en una relación molar de 10 péptidos por 1 citocromo C en 1 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M, durante 3 horas a la temperatura del laboratorio. Seguidamente, se elimina el exceso de péptido no acoplado por centrifugación/filtración como en la etapa anterior.
b) Evaluación de la penetración de los conjugados de péptido-citocromo C en las células
La evaluación de la penetración de los conjugados de péptido-citocromo C se efectúa con conjugados preparados con péptidos portadores de biotina en el extremo N-terminal.
Células H1299 se cultivan en presencia de diferentes conjugados de péptidos (biotinilados)-citocromo C, a concentraciones decrecientes (100 a 25 \mug/ml), en el medio de cultivo durante 4 horas a 37ºC. AL final del cultivo, se lavan las células tres veces en PBS, y se fijan seguidamente durante 15 min en etanol a -20ºC. La penetración del conjugado de péptido-biotina-citocromo C se evalúa después de la incubación, durante 60 min con avidina acoplada a peroxidasa. A continuación, las células se lavan con PBS y la actividad de la peroxidasa se determina con diaminobenzidina en presencia de H_{2}O_{2}.
La penetración dependiente de la concentración de los conjugados en el medio de cultivo se evalúa al microscopio a través de la intensidad de la coloración, expresada en cruces. La Tabla 24 indica la penetración de los conjugados de péptido-citocromo C en las células.
TABLA 24
26
La tabla anterior demuestra que el citocromo C nativo no penetra en las células, y que el conjugado de 1047-citocromo C penetra de manera eficaz incluso a la concentración de 25 \mug/ml.
c) Evaluación de la actividad biológica in vitro de los conjugados de péptido-citocromo C
Se cultivan células H1299 o HT29 (3x10^{4} células/pocillo) en placas de 96 pocillos durante 48 horas, a 37ºC, en medio de cultivo RPMI completo, al que se han agregado concentraciones decrecientes (200-3 \mug/ml) de citocromo C nativo o conjugado a péptidos, y el cultivo se continúa durante 48 horas.
A continuación, se agregan a los pocillos 50 \mul de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) a 1 mg/ml en el medio de cultivo, y se cultiva durante 4 horas.
El sobrenadante se retira y se agregan a los pocillos 100 \mul de dimetilsulfóxido. Después de la disociación de los cristales, se lee la coloración a 550 nm.
Los resultados se calculan como porcentaje de la densidad óptica media obtenida en los pocillos de células que contienen diluciones de las muestras a ensayar, y de la densidad óptica de los pocillos que no recibieron más que medio. La Tabla 25 indica la inhibición del crecimiento de las células por medio de los conjugados de péptido-ubiquitina (?).
TABLA 25
27
La tabla anterior demuestra la eficacia de los conjugados de péptido-citocromo C sobre dos tipos de células. El citocromo C nativo no inhibe el crecimiento. A 50 \mug/ml, el péptido más eficaz sobre las células HT29 es el péptido 1047, los péptidos HBP3 y HBP6 ofrecen valores intermedios, en tanto que el péptido HBP7 es poco activo a esta concentración.
15) Transporte de sustancias antitumorales y antiinflamatorias con ayuda de los péptidos de la invención a) Transporte de derivado de la aspirina
Analgésicos tales como la aspirina, utilizados desde hace mucho tiempo en la terapia, han demostrado poseer otros efectos tales como, por ejemplo, la prevención de tumores del colon en hombres y mujeres que toman aspirina de forma regular durante tiempo prolongado. En el animal, el efecto anticanceroso se ha puesto de manifiesto en diversos tumores. Estos efectos han sido atribuidos, en parte, a su capacidad para inhibir la producción de prostaglandinas, por inhibición de la enzima prostaglandina H sintetasa y las ciclooxigenasas.
Se ha analizado la capacidad para inhibir el crecimiento de células tumorales HT29 de dos derivados de la aspirina conjugados al péptido de secuencia SEQ ID NO: 30: un derivado de salicililo-HBP6 en posición N-terminal (péotido SEQ ID NO: 47), y un derivado en HBP6-salicililo en posición C-terminal (SEQ ID NO: 48), comparándolos con el péptido nativo.
Se cultivan células HT29 (3x10^{4} células/pocillo) sobre placas de 96 pocillos durante 48 horas a 37ºC, en medio de cultivo DMEM completo, al que se han agregado concentraciones decrecientes (200-3 \mug/ml) de aspirina o de conjugado de péptido-salicililo, y se continúa el cultivo durante 48 horas.
A continuación, se agregan a los pocillos 50 \mul de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) a 1 mg/ml en el medio de cultivo, y se cultiva durante 4 horas.
Se retira el sobrenadante y se agregan a los pocillos 100 \mul de dimetilsulfóxido. Después de la disolución de los cristales, se lee la coloración a 550 nm.
Los resultados de inhibición del crecimiento de las células HT29 se muestran en la Tabla 26, y se calculan como porcentaje de la densidad óptica media obtenida en los pocillos de células que contienen diluciones de las muestras a analizar, y de la densidad óptica de los pocillos que recibieron solamente medio de cultivo.
TABLA 26
28
La adición del péptido al ácido salicílico aumenta el poder de la aspirina de inhibir el crecimiento celular.
b) Transporte de derivado del ácido ftálico
La N-ftalimido-glutarimida (talidomida) es una molécula que posee una gran variedad de propiedades tales como el efecto teratogénico, la reducción de la producción de TNF-\alpha por los monocitos, supresión de la angiogénesis. Se ha demostrado que la actividad teratogénica depende del residuo glutarimida, en tanto que el efecto anti-angiogénico depende del grupo ftaloílo. Por lo tanto, los presentes inventores han preparado el péptido SEQ ID NO: 46, derivado del péptido SEQ ID NO: 26 (HBP3)_{2}, al cual se ha agregado glicil-ftaloílo en posición N-terminal. pocillos que sólo han recibido medio. La técnica empleada para ensayar la actividad de ftaloílo-HBP3 es la misma que la descrita anteriormente para aspirina.
Los resultados de la inhibición del crecimiento (%) de células HT29 que se muestran en la Tabla 27 se calculan como porcentaje de la densidad óptica media obtenida en los pocillos de células que contienen las diluciones de las muestras a analizar, y de la densidad óptica media de pocillos de células que recibieron solamente medio de cultivo.
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TABLA 27
29
Aparentemente, el derivado ftaloílo inhibe el crecimiento de células HT29.
16) Incremento de la actividad de sustancias antimicrobianas con ayuda de los péptidos de la invención a) Lisozima
La lisozima es uno de los constituyentes más importantes de los gránulos de linfocitos polinucleares humanos. Se encuentra presente también e las secreciones. Se trata de una muraminidasa. La lisozima lisa y elimina los microorganismos Gram-positivos por la modificación de los peptidoglicanos de su superficie. Dado que la lisozima no es capaz de atravesar fácilmente la membrana exterior de la bacteria, el acoplamiento de lisozima a los péptidos puede ayudar a la penetración.
- Acoplamiento de péptidos a la lisozima
A 8 mg de lisozima en 2,7 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M se agregan 1,8 mg de SMCC [4-(N-maleimido-metil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo] en 186 ml \mul de dimetilsulfóxido, y la solución se incuba durante 30 min a la temperatura del laboratorio. El exceso de reactivo se elimina por centrifugación sobre membranas de ultrafiltración (umbral de corte = 5.000 daltons, Sartorius), seguida de tres lavados en tampón fosfato sódico 0,1 M, a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M.
A continuación, se lleva a cabo el acoplamiento con el péptido en una relación molar de 5 péptidos por 1 lisozima en 1 ml de tampón fosfato sódico 0,1 M, a pH 7, que contiene NaCl 0,15 M, durante 3 horas a la temperatura del laboratorio. Seguidamente, el exceso de péptido no acoplado se elimina por centrifugación sobre membranas, como en la etapa anterior.
- Evaluación de la actividad de lisozima acoplada a los péptidos
Se cultiva la cepa bacteriana gram-positiva Escherichia coli (ATCC25922) hasta la fase semi-logarítmica en medio Luria-Bertani (LB). Las bacterias se recolectan por centrifugación y se resuspenden en el medio con 1% de bacto-peptona a una concentración de 5x10^{5} ufc/ml (unidades formadoras de colonias/ml). La lisozima o los conjugados de péptido-lisozima se diluyen de mitad en mitad (256 a 0,5 \mug/ml) en medio bacto-peptona y se distribuyen 50 \mul sobre placas de 96 pocillos. A continuación, se agregan 50 \mul de la dilución de bacterias a cada pocillo. Después de 16 horas de incubación a 37ºC, se extienden 10 \mul de cada pocillo sobre cajas de gelosa en medio LB. Después de 18 horas de incubación a 37ºC, se determina la concentración bactericida mínima (CBM) como la concentración de lisozima o de lisozima-péptido que inhibe 75% del crecimiento.
- Resultados
La Tabla 28 recoge la inhibición del crecimiento de E. coli (CBM \mug/ml)
TABLA 28
30
Los conjugados de péptido-lisozima tienen una actividad antibacteriana más eficaz que la de la lisozima nativa.
b) Péptidos antimicrobianos
Desde hace algunos años, se ha despertado un interés considerable por el estudio de la estructura y función de péptidos cortos que poseen actividades antibacterianas y antifúngicas. Múltiples péptidos naturales, de secuencias variables, hallados en los reinos animal y vegetal, poseen modos de acción similares contra una gran variedad de microorganismos.
Por lo general, los péptidos antimicrobianos poseen un número equivalente de residuos polares y no polares en el interior de dominios anfipáticos, y suficientes residuos básicos para otorgar al péptido una carga global positiva a pH neutro.
Los péptidos objeto de la presente invención son también péptidos fundamentalmente básicos, de alta afinidad por la heparina y, en los ejemplos que se dan más adelante, se demuestra que muchos de ellos poseen una actividad antibacteriana in vitro a concentraciones a las que no son tóxicos para las células eucarióticas.
- Evaluación de la actividad antimicrobiana de los péptidos catiónicos
Se cultivan las cepas bacterianas gram-positivas Enterococcus faecalis (ATCC 29212) y Staphylococcus aureus (ATCC 25923), y las cepas gram-negativas Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Salmonella typhimurium (aislado clínico), y Salmonella typhi Ty2 (OMS). Las bacterias se cultivan con agitación durante una noche a 37ºC, a continuación, se cultivan nuevamente a la dilución de 1:50 en medio fresco de Luria-Bertani (LB) durante 2 horas. La concentración bacteriana se ajusta a 106 ufc/ml y se distribuyen 50 \mul sobre placas de 96 pocillos, con idéntico volumen de péptidos diluidos de mitad en mitad (256-0m5 \mug/ml) en medio LB. Después de 16 horas a 37ºC, se determina la concentración inhibitoria mínima (CIM) como la concentración más baja que inhibe totalmente el crecimiento de las bacterias (ausencia total de turbidez). Para determinar la concentración bactericida mínima, se extienden 10 \mul de cada pocillo sobre cajas de gelosa en medio LB. Después de 18 horas de incubación a 37ºC, la concentración bactericida mínima (CBM) se define como la concentración de péptidos que permite la supervivencia de sólo 0,01% de las bacterias vivas.
- Resultados
Los resultados se expresan en concentración de péptido en CBM (\muM).
TABLA 29
31
Los resultados de la tabla anterior demuestran que el péptido (HBP1)3 posee una actividad bactericida, en tanto que los péptidos HBP1)2 y HBP13 no son activos. Sin embargo, cuando el péptido HBP13 (SEQ ID NO: 38) se acopla con el péptido SEQ ID NO: 24, aumenta su actividad en un factor de 50 a 100 (péptido SEQ ID NO: 45). Lo mismo ocurre con el péptido SEQ ID NO: 24 cuando se acopla con el péptido SEQ ID NO: 30 (HBP7) que carece de actividad antimicrobiana. La concentración bactericida mínima (CBM) de todos los péptidos de la tabla anterior es equivalente a la CIM, o difiere en una dilución (CBM = 2 x CIM). Ninguno de estos péptidos es activo sobre bacterias Gram-positivas.
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<140> PCT/FR00/02621
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<151> 01-03-2000
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<160> 48
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<170> PatentIn version 3.0
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<210> 1
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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\sa{Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu}
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<210> 2
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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\sa{Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu}
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<210> 3
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<211> 21
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 3
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\sa{Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Val Lys}
\sac{Arg Gly Leu Lys Leu}
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<210> 4
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Mus musculus x Rattus norvegicus 
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<400> 4
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\sa{Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Met Asp Tyr}
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<210> 5
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens-Mus musculus-Rattus Norvegicus 
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<400> 5
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\sa{Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Met}
\sac{Asp Tyr}
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<210> 6
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Mus musculus x Rattus norvegicus 
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<400> 6
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\sa{Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr}
\sac{Asn Lys Arg Ala}
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<210> 7
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<211> 27
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens-Mus musculus-Rattus Norvegicus 
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<400> 7
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\sa{Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly}
\sac{Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala}
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<210> 8
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 8
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\sa{Val Arg Arg Ser Gly Arg Val Val Val Pro Ala Ala Pro Arg Asn Arg}
\sac{Asp}
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<210> 9
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<211> 24
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
\newpage
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<400> 9
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\sa{Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Val Arg Arg Ser Gly Arg Val Val Val}
\sac{Pro Ala Ala Pro Arg Asn Arg Asp}
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<210> 10
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<211> 19
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 10
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\sa{Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg}
\sac{Met Asp Val}
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<210> 11
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<211> 19
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Gly Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Pro}
\sac{Gly Lys Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus x Rattus norvegicus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Val Lys Lys Pro Lys Leu Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys Gly}
\sac{Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser}
\sac{Leu Lys Ser Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus x Rattus norvegicus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val Lys}
\sac{Gly Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val Arg His Val Arg}
\sac{Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val Val Lys Arg Gly}
\sac{Ley Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ser Arg Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ser Arg Lys Ser Arg Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Lys Gly Phe Tyr Lys Arg Lys Gln Cys Lys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys}
\sac{Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus x Rattus norvegicus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Tyr Tyr Ser}
\sac{Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus x Rattus norvegicus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Val Lys Arg Gly}
\sac{Leu Lys Leu Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Met Asp Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Lys Gly Lys Phe Tyr Lys Arg Lys Gln Cys Lys Pro Ser Arg Gly}
\sac{Arg Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg}
\sac{Glu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> () .. ()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todos los aminoácidos están en configuración D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Glu Arg Lys Lys Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg}
\sac{Glu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Lys Lys Arg Arg Arg Gly Asp Arg Lys Lys Arg Arg Arg Gly Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> () .. ()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los aminoácidos están en posición recto verso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Asp Arg Lys Lys Gly Leu Lys Gly Lys Lys Lys Arg Lys Lys Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ( ) .. ( )
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todos los aminoácidos están en configuración D.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Lys Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr Tyr Ala Leu Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Gly Ser Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Leu Lys Lys His Leu Lys Lys His Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Ser Gln Ser}
\sac{Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Val Lys Arg}
\sac{Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Glu Arg}
\sac{Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Arg Arg}
\sac{ala Lys Leu Ala Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu}
\sac{Ala Lys Leu Ala Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Gly Lys}
\sac{Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu _Ala Lys Lys His}
\sac{Leu Lys Lys His Leu Lys Lys His Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> () .. ()
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Resto de glicina-ftaloilo en posición N-terminal (X).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gly Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg}
\sac{Glu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ( ) .. ( )
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Presenta un resto salicililo (llamado X) en posición N-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu}
\sac{Lys Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> ( ) .. ( )
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Presenta un resto salicililo (llamado X) en posición C-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys}
\sac{Xaa Pro Gly}
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (37)

1. Vector de transferencia intracitoplasmática y/o intranuclear para una sustancia de interés, caracterizado porque comprende al menos una secuencia de aminoácidos que reacciona in vivo con aminoglicanos, y que deriva de la lipoproteína B humana, acoplada con al menos un fragmento de anticuerpo.
2. Vector según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos que reacciona con aminoglicanos y que deriva de la lipoproteína B humana, es capaz de reaccionar con la heparina, heparan sulfato, condroitín sulfatos, y sus derivados.
3. Vector según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos que reacciona con aminoglicanos y que deriva de la lipoproteína B humana, está codificada por la línea germinal.
4. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos que reacciona con aminoglicanos y que deriva de la lipoproteína B humana, comprende un número de aminoácidos básicos al menos igual a 3.
5. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos que reacciona con aminoglicanos y que deriva de la lipoproteína B humana, está formada por, o comprende, al menos un grupo de aminoácidos que responden a una de las fórmulas siguientes: a) (XBBBXXBX)_{n}; b) (XBBXBX)_{n};
c) (BBX_{m}YBBX_{o})_{n}; d) (XBBXXBX)_{n}; o e) (BXBB)_{n},
en las cuales: B es un aminoácido básico, X es un aminoácido no básico, Y significa un enlace directo o 1 a 20 aminoácidos, m es un número entero comprendido entre 0 y 5, n es un número entero comprendido entre 1 y 10, y o es un número entero comprendido entre 0 y 5.
6. Vector según la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos que reacciona con aminoglicanos y que deriva de la lipoproteína B humana, está formada por, o comprende, un grupo de aminoácidos que responde a la fórmula siguiente: (XBBXXBX)_{n}.
7. Vector según una de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque X es un aminoácido no básico hidrófobo.
8. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende menos de 100 aminoácidos.
9. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende menos de 50 aminoácidos.
10. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende menos de 25 aminoácidos.
11. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos que reacciona con aminoglicanos y que deriva de la lipoproteína B humana, se selecciona del grupo que comprende SEQ ID NO: 1 en estado de monómero, dímero (SEQ ID NO: 2), trímero (SEQ ID NO: 3), polímero.
12. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo poli-reactivo.
13. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es una región hipervariable de un anticuerpo.
14. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento de la cadena pesada de un anticuerpo.
15. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo anti-ADN humano.
16. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento de IgM.
17. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento de IgG.
18. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es la totalidad o una parte de al menos una región CDR2 de un anticuerpo.
\newpage
19. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es la totalidad o una parte de al menos una región CDR3 de un anticuerpo.
20. Vector según la reivindicación 19, caracterizado porque la región CDR3 se selecciona en el grupo consistente en RTT79, NE-1, y RT72.
21. Vector según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende una de las secuencias siguientes: SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7: SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 23.
22. Asociación de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, con una sustancia de interés.
23. Asociación según la reivindicación 22, caracterizada porque el vector y la sustancia de interés están conjugados.
24. Asociación según la reivindicación 22, caracterizada porque el vector y la sustancia de interés se encuentran asociados por un acoplamiento químico.
25. Asociación según la reivindicación 24, caracterizada porque dicha sustancia de interés se encuentra acoplada al extremo N- o C-terminal de la secuencia de aminoácidos del vector.
26. Asociación según una de las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizada porque el acoplamiento se lleva a cabo por medio de reactivos de puenteo homo- o heterofuncionales, del tipo 4-(N-maleimido-metil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC).
27. Asociación según una de las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizada porque el acoplamiento se lleva a cabo por medio de una molécula de anclaje seleccionada entre la proteína A, la proteína G, el fragmento F(ab')_{2} anti-IgG, IgG anti-peroxidasa, la F(ab')_{2}-anti-RNasa, concanavalina A, estreptavidina y avidina.
28. Asociación según una de las reivindicaciones 24 ó 25, caracterizada porque el acoplamiento se lleva a cabo por ingeniería genética.
29. Asociación según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, caracterizada porque dicha sustancia de interés se selecciona del grupo que comprende: un ácido nucleico, una proteína, un medicamento, un antígeno, un anticuerpo.
30. Asociación según la reivindicación 29, caracterizada porque dicha sustancia de interés es doxorrubicina.
31. Célula eucariótica hospedadora, caracterizada porque comprende un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, o una asociación según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 30.
32. Procedimiento de transferencia in vitro de una sustancia de interés al interior de una célula, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
a)
asociación de dicha sustancia de interés a un vector según una de las reivindicaciones 1 a 21, y
b)
incubación de la célula con dicha asociación, a una temperatura de cultivo que permite el metabolismo activo de dicha célula.
33. Procedimiento según la reivindicación 32, caracterizado porque la incubación de la etapa b) de efectúa a una temperatura comprendida entre 25ºC y 39ºC.
34. Procedimiento según la reivindicación 33, caracterizado porque la incubación de la etapa b) se efectúa a 37ºC.
35. Composición biológica, farmacéutica, cosmética, agroalimentaria, de diagnóstico o de rastreo, caracterizada porque comprende, como principio activo, un vector según una de las reivindicaciones 1 a 21, o una asociación según una de las reivindicaciones 22 a 30, o células según la reivindicación 31.
36. Agente de diagnóstico caracterizado porque comprende al menos un vector según una de las reivindicaciones 1 a 21, o una asociación según una de las reivindicaciones 22 a 30, o una célula según la reivindicación 31.
37. Kit de diagnóstico caracterizado porque comprende, en uno o múltiples recipientes, una cantidad predeterminada de un agente según la reivindicación 36.
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