PT1259541E - Sequências de aminoácidos derivados de proteínas humanas que reagem com heparina facilitando a transferência de substâncias de interesse para o interior das células e/ou dos núcleos celulares - Google Patents

Sequências de aminoácidos derivados de proteínas humanas que reagem com heparina facilitando a transferência de substâncias de interesse para o interior das células e/ou dos núcleos celulares Download PDF

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PT1259541E
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Therese Ternynck
Eustrate Avrameas
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Diatos Sa
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Description

ΡΕ1259541 1
DESCRIÇÃO "SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DERIVADOS DE PROTEÍNAS HUMANAS QUE REAGEM COM HEPARINA FACILITANDO A TRANSFERÊNCIA DE SUBSTÂNCIAS DE INTERESSE PARA O INTERIOR DAS CÉLULAS E/OU DOS NÚCLEOS CELULARES" A presente invenção tem por objectivo uma sequência de aminoácidos que apresentam a capacidade de facilitar a penetração de uma substância de interesse no interior das células e/ou dos núcleos celulares.
Dispor de utensílios que permitam transferir eficazmente substâncias de interesse do meio exterior para o interior das células, e mais particularmente para os núcleos celulares, é uma vantagem considerável no domínio das biotecnologias, e mais particularmente para produzir proteínas, ou péptidos, para regular a expressão de genes, ou para analisar e seleccionar as vias de sinalização intracelulares, ou ainda para analisar propriedades de uma dada substância dobre a referida célula.
Uma outra aplicação importante de tais utensílios toca o domínio da terapia génica uma vez que, até ao presente, os diversos procedimentos de terapia génica partilham a mesma necessidade, não satisfeita de forma óptima, que é a de poder dispor de vectores capazes de 2 ΡΕ1259541 transferir para o citoplasma e/ou o núcleo das células do organismo hospedeiro a tratar dos princípios biologicamente activos, sem, no entanto, alterar o genoma do hospedeiro, ou as propriedades biológicas dos referidos princípios activos transferidos.
Foram desenvolvidas várias técnicas até ao presente para transferir o ADN para as células, mas nenhum é realmente satisfatório. Um entre estes, derivado da técnica de Mandei e Higa, baseada na aquisição pela E. coli da susceptibilidade à transformação pelo tratamento com CaCl2, consiste em co-precipitar o ADN com o fosfato de cálcio ou o DEA-dextrano, e em introduzir o precipitado obtido directamente na célula ou no núcleo. Este método, para além do facto de ser tóxico, não é selectivo.
Um outro método de introdução directa do ADN, a electroporação, consiste em submeter as células a um breve choque eléctrico de alguns milhares de volts, o que permite ao ADN passar a membrana citoplasmática e introduzir-se na célula. Este método é muito tóxico para as células, levando a uma forte mortalidade e uma grande variabilidade de acordo com as células utilizadas.
Outros modos utilizam uma selecção da entrada do gene nas células através dos receptores presentes na sua membrana. 0 ADN pode então penetrar na célula através de um intermediário, seja um ligando específico destes receptores, seja anticorpos específicos para constituintes 3 ΡΕ1259541 membranares. 0 complexo ADN-ligando penetra assim na célula através de um processo de endocitose. Este procedimento encontra-se limitado pelo facto de existir uma destruição importante do complexo utilizado nas vesículas lisossomais. Foram desenvolvidos vários procedimentos para atenuar estes inconvenientes, mas nenhum proporciona uma total satisfação. A patente US N° 5 635.383 descreve um outro tipo de vector complexo, à base de polilisina, para a transferência de ácidos nucleicos nas células. A patente US N° 5 521.291 descreve um outro método baseado na utilização de um conjugado formado por um vírus ligado a uma substância possuindo uma forte afinidade para o ADN com um anticorpo como intermediário. Tais conjugados são de utilização difícil, e certos riscos estão ligados à utilização de vírus.
Para tentar atenuar estes inconvenientes, foi descrito, no pedido de patente WO 97/02840, um procedimento efectuado in vitro que consiste em utilizar anticorpos anti-ADN de muríneos ou seus fragmentos F(ab')2 e Fab' capazes de penetrar no interior das células vivas, como imunovectores para a transferência intracitoplasmática e/ou intranuclear de substâncias biologicamente activas. Ainda que estes vectores apresentem uma eficácia importante, a sua utilização pode ser complexa em certas aplicações. Por outro lado, a utilização de moléculas de grandeza e com a 4 ΡΕ1259541 complexidade dos anticorpos pode representar um inconveniente importante na sua manipulação e realização.
No pedido de patente WO 99/07414, foi descrito que é possível utilizar in vitro péptidos derivados de anticorpos de muríneos anti-ADN, divulgados no pedido WO 97/02840 pré-citado, como vectores de internalização intracitoplasmática e intranuclear de substâncias biologicamente activas.
Ainda que estes vectores peptídicos de origem murínea sejam codificados pela linha germinal e não possuam mutação, e por consequência, devessem ser antigenicamente próximos dos encontrados no homem, o risco de uma reacçâo imunitária no homem não pode ser excluída. O pedido WO 98156938 descreve a utilização de lipoproteínas, em particular a lipoproteína B, na transferência in vivo de ácidos nucleicos.
Existe deste modo uma necessidade real em péptidos e sequências de aminoácidos que atenuem os inconvenientes descritos acima, a saber, susceptíveis de serem utilizados como, ou num, vector de internalização celular no homem e que não apresentem nenhum dos riscos acima mencionados. É conhecido que um grande número de regulações celulares dependentes das interacções entre as proteínas e 5 ΡΕ1259541 os glicosaminoglicanos (GAG) da superfície das células (1-6) [os números a negrito, entre parênteses, referem-se à lista de referências bibliográficas em anexo] . Tais interacções intervêm, por exemplo, no controlo da hemostase (7), na proliferação das células musculares lisas (8), na expressão da actividade dos factores de crescimento (9), na expressão da actividade lipolítica das enzimas (10), na integridade da matriz extracelular (11) e outros. Num determinado sistema, estes efeitos biológicos são devidos à interacção de uma ou de um número restrito de proteínas com as GAG da superfície celular. As GAG são constituintes muito conservadas ao longo da evolução, presentes à superfície de todas as células eucariotas. As GAG são polímeros de sacarídeo; por exemplo heparina é um polímero do ácido dissacárido[alfa]-1,4-2-idurónico-D-glucosamina e os sulfatos de condroitinas são polímeros do dissacárido N-acetilcondrosina, contendo um grande número de grupos sulfato e deste modo, negativamente carregadas. As proteínas que reagem especificamente com as GAG contêm todas, na sua sequência, um ou vários segmentos peptídicos que são responsáveis pela interacção destas proteínas com as GAG. O comprimento destes segmentos varia de uma proteína para outra variando de quatro a trinta aminoácidos. Quase todos estes péptidos são positivamente carregados e contêm um número elevado de aminoácidos básicos, sobretudo lisina e arginina. Foi demonstrado que estes aminoácidos participam de forma preponderante na interacção destas proteínas com as GAG (1-6). 6 ΡΕ1259541
Os péptidos ligam-se a GAG ou mais geralmente aos aminoglicanos, e em particular a heparina, a sulfato de heparano e aos sulfatos de condroitinas (péptidos globalmente designados por PLH, para "péptido que se liga a heparina", mesmo se a heparina seja um exemplo de aminoglicano) podem ser de origem natural, como os péptidos descritos acima, ou artificialmente. Estes podem ser utilizados sob a sua forma nativa ou polimero (dimero, trimero, etc...).
Constatou-se, de maneira inesperada, de acordo com a presente invenção, que estes péptidos podem ser utilizados tanto in vivo como in vitro como agentes de internalização de substâncias de interesse nas células.
Com efeito, realizar in vivo uma técnica conhecida in vitro, implica determinar vários parâmetros (biodisponibilidade, reacções imunitárias...) que não intervêm nos ensaios in vitro, em espaço fechado. Por outro lado, uma tal transferência de in vitro para in vivo, permanece suficientemente perigosa, devido às numerosas potenciais interacções susceptiveis de interferir com a manipulação in vivo (reacção imunitária, efeitos secundários, bloqueio ou inibição dos princípios activos, rejeição...); por consequência, não existe nenhuma esperança de êxito razoável numa aplicação in vivo de uma técnica in vitro. 7 ΡΕ1259541
Assim, de acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção tem por objectivo uma sequência de aminoácidos que apresenta a capacidade de facilitar a penetração de uma substância de interesse no interior das células e/ou dos núcleos celulares, e que é caracterizada por ser capaz de reagir in vivo com os aminoglicanos.
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção tem por objectivo uma sequência de aminoácidos que apresenta a capacidade de facilitar a penetração de uma substância de interesse no interior das células e/ou núcleos celulares, e que é caracterizada por ser resultado de uma proteina de origem humana e capaz de reagir com os aminoglicanos.
Mais particularmente, num e noutro caso, esta sequência é caracterizada por reagir com a heparina, sulfatos de condroitinas e seus derivados.
Os trabalhos de investigadores da área no âmbito da presente invenção permitiram colocar em evidência que a penetração dos péptidos é completamente inibida pela incubação das células a 4 °C. Por outro lado, esta é inibida, em parte pelos inibidores do metabolismo celular como a azida de sódio (inibidor de ATPase), a genisteina (inibidor da cinase de tirosina e da ligação ao ATP) . 0 mecanismo de internalização dos péptidos da invenção, e, deste modo, das substâncias de interesse acopladas aos referidos péptidos, está deste modo dependente da energia. 8 ΡΕ1259541 A vectorização que realiza os péptidos da invenção é assim notável, pelo facto de que esta não salienta um sistema passivo, mas ao contrário, efectua-se através de um receptor. As sequências de aminoácidos de acordo com a invenção são, deste modo, caracterizadas, para além da sua capacidade de reagir in vivo com os aminoglicanos, os sulfatos de aminoglicanos, as condroitinas e os sulfatos de condroitinas, pela sua capacidade de se fixarem sobre um receptor da membrana celular e de atravessar a referida membrana celular graças a este receptor. Assim, as sequências de aminoácidos da invenção distinguem-se de transportadores peptidicos da técnica anterior capazes de atravessar a membrana celular de maneira passiva.
Os péptidos de acordo com a invenção são, deste modo, notáveis por apresentarem a capacidade de poder atravessar as membranas celulares por um mecanismo activo, depois se alojarem no citoplasma e/ou no núcleo de células e de permitir assim dispor de um vector em que a utilização não é o limite, durante a passagem na célula, pelo tamanho das substâncias a transportar. Com efeito, os vectores da invenção são capazes de transportar medicamentos, levando pequenas moléculas químicas (de baixo peso molecular) às proteínas ou ácidos nucleicos de tipo plasmídeo (elevado peso molecular). A realização destes vectores abre assim uma nova via para a terapia proteica intracelular ou terapia génica. Esta capacidade particular de penetração dos vectores da invenção, permitem seleccionar, de modo preferencial, os "medicamentos" nas células, que contribuem 9 ΡΕ1259541 assim para uma redução potencial da toxicidade dos medicamentos e um aumento potencial do indice de eficácia.
Por "derivados de heparina ou de sulfatos de condroitinas" ou por "aminoglicanos do tipo da heparina ou sulfatos de condroitinas", entende-se todo o produto ou subproduto como definido nas publicações citadas nas referências (1) a (3).
Por " facilitar a penetração", entende-se facilitar a passagem, ou a translocação, de uma substância do meio exterior para o meio intracelular, e particularmente para o citoplasma e/ou núcleo da célula. Esta penetração pode ser determinada por diversos procedimentos, como por exemplo um teste de penetração celular, comportando uma primeira etapa de incubação da sequência de aminoácidos na presença de células em cultura, seguida de uma etapa de fixação e de permeabilização destas células, depois uma revelação da presença da referida sequência de aminoácidos no interior da célula. A etapa de revelação pode ser efectuada com uma outra incubação em presença de anticorpos marcados e dirigidos contra a referida sequência, seguida de uma detecção no citoplasma ou na proximidade imediata do núcleo celular, ou mesmo no seio deste, da reacção imunológica entre a sequência e o anticorpo marcado. A revelação pode também ser realizada marcando uma sequência de aminoácidos de acordo com a invenção e detectando a presença da referida marcação nestes compartimentos celulares. Foi descrito um teste de 10 ΡΕ1259541 penetração celular, por exemplo, no pedido de patente WO 97/02840 pré-citado.
Por "substância de interesse", entende-se todo o produto que apresenta um interesse, nomeadamente, biológico, farmacêutico, diagnóstico, rastreio, ou agro-alimentar. Pode tratar-se de ácidos nucleicos (ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico) que podem ter origens diversas, e nomeadamente humana, virai, animal, eucariota ou procariota, vegetal, sintética, etc., e podem ter um tamanho variável, indo desde o simples oligonucleótido ao genoma ou fragmento de genoma. Pode tratar-se também de um genoma virai ou de um plasmideo. A substância pode igualmente ser uma proteína, tal como uma enzima, uma hormona, uma citocina, uma apolipoproteína, um factor de crescimento, um antigénio, um anticorpo, etc. Pode também tratar-se de uma toxina, de um antibiótico, de uma molécula antiviral ou de um imuno-modulador.
De maneira geral, a substância de interesse pode ser todo o princípio activo de medicamento, quer se trate de um produto químico, bioquímico, natural ou sintético. Podem tratar-se de pequenas moléculas de um peso molecular da ordem de 500 D ou de grandes moléculas como proteínas de vários milhares de daltons. A substância de interesse pode ser directamente activa ou ser activável in situ pela sequência de 11 ΡΕ1259541 aminoácidos, por um agente distinto ou pelas condições ambientais. A invenção estende o seu suporte às associações da sequência de aminoácidos com uma substância de interesse tal como definido acima.
Numa forma de realização preferida da presente invenção, afim de atenuar os riscos descritos acima, a sequência de aminoácidos é codificada pela linha germinal, e deste modo não comporta mutações (substituição, deleção, adição, etc.).
Na presente invenção, uma sequência de aminoácidos particularmente preferida é derivada de uma proteina sintetizada por uma célula humana. De maneira vantajosa, a referida proteina sintetizada por uma célula humana é seleccionada a partir das proteínas que se ligam com os aminoglicanos do tipo heparina ou sulfato de condroitina.
Numa outra forma de realização particularmente preferida, a sequência de aminoácidos é derivada da lipoproteína B humana.
De maneira geral, a sequência de aminoácidos compreende um número elevado de aminoácidos básicos, como é o caso na lisina, arginina ou histidina, por exemplo. 12 ΡΕ1259541
Por "número elevado", deve entender-se pelo menos igual a 3.
Um tipo de sequências de aminoácidos preferidos, para a realização da presente invenção, é constituída por, ou comporta, pelo menos um grupo de aminoácidos que corresponde a uma das fórmulas seguintes: a) (XBBBXXBX)n; b) (XBBXBX) n; c) (BBXmIBBX0) n; d) (XBBXXBX)n; e e) (BXBB) n; em que: B é um aminoácido básico, X é um aminoácido não básico, de preferência hidrófobo, tal como alanina, isoleucina, a leucina, a metionina, a fenilalanina, o triptofano, a valina ou ainda a tirosina, I representa seja uma ligação directa, seja 1 a 20 aminoácidos, m é um número inteiro compreendido entre 0 e 5, n é um número inteiro compreendido entre 1 e 10, de preferência entre 1 e 3, e o é um número inteiro compreendido entre 0 e 5.
De maneira geral, as sequências de aminoácidos possuem menos de 100 aminoácidos, melhor, menos de 50 aminoácidos, e ainda melhor, menos de 25 aminoácidos.
Vantajosamente, as sequências de aminoácidos de acordo com a invenção compreendem de 6 a 25 aminoácidos.
As sequências de aminoácidos preferidas para a realização da presente invenção são as identificadas por 13 ΡΕ1259541 SEQ ID NO: 2, 3, 5, 7, 9, 10, 13, 16, 19, 20, 21, 23, ,25, 26, 30, 33, 34, 35, 36, 37, 38 e 39 na lista anexa que faz parte da presente descrição. Entre estas, são particularmente preferidas as sequências identificadas por SEQ ID NO : 2, 3, 5, 7, 9, 10, 13, 16, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 30, 36 e 38.
Um outro tipo de sequências preferidas, para a realização da presente invenção, é constituída por, ou comporta, pelo menos dois domínios, compreendendo um destes domínios uma sequência de aminoácidos de fórmula: a) XBBBXXBX; b) XBBXBX; c) BBXmIBBX0; d) XBBXXBX; ou e) BXBB; e compreendendo o outro desses domínios uma sequência de aminoácidos de fórmula: a) XBBBXXBX; b) XBBXBX; c) BBXmIBBX0; d) XBBXXBX; e) BXBB; ou f) um fragmento de anticorpo; fórmulas em que: B é um aminoácido básico, X é um aminoácido não básico, de preferência hidrófoba, I representa seja uma ligação directa, seja de 1 a 20 aminoácidos, m é um número inteiro compreendido entre 0 e 5, o é um número inteiro compreendido entre 0 e 5.
Uma sequência de aminoácidos particularmente interessante é a sequência SEQ ID NO:l, na medida em que (1) no estado pelo menos de dímero, ela possui as propriedades esperadas e (2) no estado de monómero ou de polímero, ela confere, a uma outra sequência de aminoácidos à qual está ligada, as referidas propriedades ou potencializar consideravelmente estas propriedades uma vez que a referida sequência já as possui. Da mesma forma os 14 ΡΕ1259541
péptidos designados HBP3, HBP7, (HBP3)2, HBP6, HBP7, HBPIO e HBP13 apresentam esta capacidade de potencialização.
Os péptidos, tal como definidos acima são capazes de transportar, no interior das células, moléculas que lhes estão associadas de forma covalente ou não covalente, e são deste modo vectores eficazes para a transferência intracelular de substâncias de interesse.
As sete sequências descritas na tabela 1 a seguir são particularmente úteis para o transporte intra-citoplásmico. (HB1)3, HBP6, (HBP3)2, HBP7, HBP11, HBP13 e HBP2 .
Tabela 1
Identidade Sequência AA %K Resíduos totais %R Resíduos totais o o K+R (HB1)3 VKRGLKLVKRGLKRVKRGLKR 28 24 52 HBP6 GRPRESGKKRKRKRKRLKP 32 31 63 (HBP)2 S E RKKRRRE S RKKRRRE S 22 44 67 HBP7 GKRKKKGKLGKKRDP 46 13 60 HBPll AKTGKRKRSG 30 20 50 HBP13 KHLKKHLKKHLK 50 0 50 HBP2 RKGKFIKRKQCKPSRGRK 33 22 55
Duas sequências são particularmente úteis para o transporte intranuclear. Trata-se das sequências HBPIO e HBP15. estas duas sequências caracterizam-se pelo seu 15 ΡΕ1259541 conteúdo elevado em aminoácidos básicos, e mais particularmente pelo facto de que estes não contêm o residuo Lisina, contrariamente às sequências úteis para o transporte intra-citoplásmico.
Cada uma das sequências descritas na tabela 1 possuem pelo menos 20% de residuos de lisina e pelo menos 50% de residuos são aminoácidos básicos no número total de residuos da sequência. A presente invenção torna evidente que o acoplamento de péptidos, tal como definidos acima, com vectores polipeptidicos capazes de penetrar no interior das células aumenta consideravelmente o poder de translocação destes vectores. A presente invenção põe também em evidência que o acoplamento de péptidos tal como definidos acima, ou de suas formas de polímeros, com um ligando, em que a função é a de reagir com um receptor presente na membrana celular, aumenta consideravelmente a capacidade deste ligando se fixar na membrana celular.
De acordo com um outro de seus aspectos, a presente invenção tem por objectivo a utilização de sequências de aminoácidos definidas acima para a preparação de composições destinadas à transferência de substâncias de interesse nas células. Esta capacidade dos péptidos da invenção é vantajosa por permitir o transporte de 16 ΡΕ1259541 substâncias activas através das membranas biológicas e mais particularmente através das barreiras hemato-encefálica, hematorretiniana, intestinal, pulmonar. Os péptidos da invenção apresentam o interesse de poder ser utilizados sob formas de administração adaptadas tanto à substância activa, à qual estes são acoplados, como ao tipo de célula alvo, nomeadamente as que necessitam da passagem das barreiras acima mencionadas.
Numa outra forma de realização, a presente invenção refere-se à utilização das referidas sequências de aminoácidos num vector peptidico. Estes vectores, devido às propriedades das referidas sequências de aminoácidos, podem ser facilmente utilizadas para a transferência intra-citoplasmática e intranuclear no homem, sem nenhum risco para este, nem qualquer degradação da substância de interesse acoplada ao vector.
Para chegar a este fim, é necessário que o vector seja capaz de veicular quantidades relativamente importantes de moléculas no interior das células e que estas não sejam reconhecidas como antigénios estranhos pelo sistema imunitário humano. A tabela 1 a seguir indica vários péptidos da invenção, o seu nivel de penetração intra-citoplásmico e/ou acoplamento intranuclear a um marcador de baixo peso molecular permitem a sua detecção como a biotina ou a 17 ΡΕ1259541 fluoresceína (Marq) ou a uma substância de interesse biológica (Subst).
Os resultados apresentados na tabela lbis são baseados nos dados experimentais apresentados a seguir.
Tabela lbis Péptido SEQ ID NO intracitoplásmico intranuclear Marq Subs Marq Subs HBP1 1 +/- ND _ _ (HBP1)2 2 +/- + _ _ (HBP1)3 3 ++ ++ +/- +/- 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 HBP4 17 +/- ND _ _ HBP5 18 +/- ND - - 18 ΡΕ1259541 (HPB5)2 19 + + - _ HPB2 20 + ++ _ _ HPB6 21 +++ +++ +/- +/- 22 23 24 25 (HBP3)2 26 +++ +++ + + 27 28 29 HPB7 30 +++ +++ + +/- 31 32 HPB8 33 + /- + /- _ _ HPB9 34 + /- + /- - _ HPB10 35 + /- + /- ++ ++ HPB11 36 ++ ++ + /- + /- HPB12 37 + /- + /- - _ HPB13 38 ++ ++ + /- + /- HPB15 39 + /- + +++ +++
Estes resultados indicam que os péptidos que são capazes de uma translocação nuclear massiva são aqueles em que a carga positiva é sobretudo constituída pela presença de arginina e ausência quase total de lisina. 19 ΡΕ1259541
Um primeiro grupo de péptidos de acordo com a invenção compreende as sequências de aminoácidos capazes de permitir a penetração de uma substância de interesse na célula mais pouco ou nenhum no núcleo. A titulo de exemplo pode citar-se os péptidos de sequências SEQ ID NO: 2, 3, 17, 18, 19, 20, 21, 33, 34, 37 e 38.
Um segundo grupo de péptidos de acordo com a invenção compreende as sequências de aminoácidos capazes de permitir a penetração de uma substância de interesse na célula e no núcleo da célula. A titulo de exemplo pode citar-se os péptidos de sequências SEQ ID NO : 26, 35 e 39.
Um vector de acordo com a presente invenção é caracterizado por ser constituído por, ou compreender, uma sequência de aminoácidos tal como definido acima.
Em variante, o vector é baseado no acoplamento, de uma parte, de sequências de aminoácidos reagem com os aminoglicanos e, por outro lado, de péptidos novos derivados da parte variável de anticorpos humanos anti-ADN. O acoplamento no interior de uma mesma molécula de sequências de aminoácidos que reage com os aminoglicanos e os péptidos derivados das partes variáveis de anticorpos humanos anti-ADN conclui a preparação de um vector peptídico particularmente eficaz para a translocação e a transferência intracelular de substâncias de interesse, sobretudo quando as sequências de aminoácidos reagem com os aminoglicanos são de origem humana. 20 ΡΕ1259541
Esta associação, dá origem, para além disso, a um vector de translocação e a transferência particularmente adaptada para utilização no homem. Com efeito, como indicado acima, ainda que os vectores peptidicos de origem murínea conhecidos desde a WO 97102840 sejam codificados pela linhagem germinal e não transportem mutações, e por consequência, devam estar antigenicamente próximos destes encontros no homem, é possivel que a sua injecção no homem induza uma reacção imunitária. O vector peptidico forma PLH de acordo com a presente invenção e os péptidos derivam de anticorpos anti-ADN, os dois de origem humana, codificados pela linhagem germinal e não comportando mutações, evitam este problema.
As caracteristicas gerais destes péptidos derivados de anticorpos humanos anti-ADN são próximos dos péptidos de origem murinea descritos no pedido de patente WO 99107414, possuindo propriedades adicionais que as distinguem destes últimos, a saber: 1) eles necessitam, para penetrar o interior das células, um metabolismo activo das células (temperatura de cultura compreendida entre 25 e 39 °C, e de preferência 37 °C), uma vez que os péptidos murineos são globalmente menos dependentes; 2) estes reagem muito menos fortemente com o ADN do que com os vectores murineos; 21 ΡΕ1259541 3) a sua capacidade de penetração não é influenciada de forma significativa pela molécula que eles vão transportar para o interior da célula; 4) estes penetram melhor nas células de origem humana do que nas de outras origens.
Foi realizado, de acordo com a presente invenção, um vector constituído por um PLH e um ou mais fragmentos de anticorpos, de preferência polirreactivos, e mais particularmente um ou vários fragmentos derivados das regiões hipervariáveis dos anticorpos. De maneira preferida, o vector objecto da invenção caracteriza-se pelo facto de compreender um fragmento da cadeia pesada de um anticorpo.
No pedido de patente WO 99107414 pré-citado, só foram utilizados fragmentos de uma IgG monoclonal, que é uma imunoglobulina monomérica, de tamanho pequeno e de baixo peso molecular. A presente invenção põe em evidência pela primeira vez que é também possível utilizar um fragmento derivado de uma IgM, que é uma imunoglobulina pentamérica, de muito alto peso molecular. Com efeito, até ao presente, no conhecimento dos depositários, ninguém tinha efectuado a pesquisa de utilização de um fragmento de IgM como vector de internalização celular, devido ao carácter dissuasivo da elevado tamanho e do peso molecular elevado de tais fragmentos. 22 ΡΕ1259541 A presente invenção tem, deste modo, como objectivo, um vector de internalização celular, caracterizado por compreender um ou vários PLH e um ou vários fragmentos de uma IgM, ou de uma IgG.
De modo preferido, o referido vector compreende toda ou parte da região CDR2 de um anticorpo. Em variante, o referido vector compreende toda ou parte da região CDR3 de um anticorpo. Mais particularmente, o referido vector contém pelo menos uma região CDR3 de um anticorpo anti-ADN humano, seleccionado do grupo consistindo em RTT79, NE-1, e RT72.
Numa outra variante, o vector objectivo da presente invenção pode também compreender toda ou parte da região CDR2, e toda ou parte da região CDR3.
Por "todo ou parte" é necessário compreender que o vector da invenção pode comportar seja o conjunto da região CDR em causa, seja apenas uma parte desta, com a condição de que o vector conserva a capacidade de penetrar nas células (homólogo funcional). Por "parte de região CDR, é necessário entender uma região CDR desprovida de um ou vários aminoácidos terminais. Pode igualmente tratar-se de uma região CDR em que um ou vários resíduos internos foram removidos ou substituídos por outros aminoácidos, de preferência aminoácidos da mesma natureza (aminoácidos básicos, por exemplo). 23 ΡΕ1259541
Uma parte destes exemplos que são dados no presente pedido de patente baseiam-se no emprego da SEQ ID NO: 1 proveniente da lipoproteina B humana, mas, para especialista da técnica, é evidente que toda a PLH natural ou artificial pode ser utilizada.
Como indicado acima, um vector de acordo com a presente invenção é particularmente bem adaptada para o transporte e a transferência intracelular e intranuclear de substâncias de interesse. A presente invenção visa, deste modo, fornecer um vector tal como descrito acima, caracterizado por compreender uma substância de interesse naturalmente, ou não naturalmente, incorporável nas células e/ou nos núcleos das referidas células.
Mais particularmente, a presente invenção tem por objectivo um vector em que a capacidade de penetração é sensivelmente independente da natureza da substância de interesse que lhe é acoplada. Esta caracteristica, própria destes vectores humanos por comparação com os vectores murineos, é de um interesse capital pela utilização desejada para estes vectores. Mas a invenção interessa-se igualmente por vectores que estão adaptados à substância de interesse que lhe está acoplada.
Entende-se por "acoplamento", todo o tipo de interacção que permita uma associação física entre a 24 ΡΕ1259541 substância de interesse e o vector. Pode tratar-se de um acoplamento clivável ou não clivável em função do meio biológico e/ou da substância de interesse transportada pelos péptidos da invenção ou ainda clivável através de meios fisicos aplicados ao organismo ao qual foi administrado o vector acoplado à substância activa. Deste modo, a expressão do efeito biológico da substância pode necessitar que esta seja libertada do vector. A titulo de exemplo de uma substância de interesse em que é preferível que esta seja libertada do vector, pode citar-se a doxorrubicina. É necessário, contudo, que a interacção seja suficientemente sólida para que o vector não se dissocie antes ou durante a penetração celular. Por esta razão, o acoplamento preferido, de acordo com a invenção, é o acoplamento covalente; pode, no entanto, tratar-se de um acoplamento não covalente. A substância de interesse pode ser acoplada directamente ao péptido, seja a uma das suas extremidades terminais, seja ao nível de uma cadeia lateral de um dos aminoácidos. A substância de interesse pode também ser acoplada indirectamente através de um braço de ligação, seja a uma das extremidades terminais dos péptidos, seja ao nível de uma cadeia lateral de um dos aminoácidos. 0 acoplamento pode ser realizado através de todos os procedimentos de acoplamento químico, bioquímico ou enzimático ou genético conhecido do especialista da 25 ΡΕ1259541 técnica, mas prefere-se geralmente utilizar um reagente de ligação homo- ou heterofuncional do tipo 4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimidilo (SMCC). Pode ainda citar-se como meio de acoplamento os seleccionados a partir: dos agentes bi ou multifuncionais contendo grupos alquilo, arilo, aralquilo ou peptidico, ésteres, aldeídos ou ácidos de alquilo, arilo ou aralquilo, grupos anidrido, sulfidrilo, ou carboxilo tais como os derivados de ácido maleimilobenzóico, de ácido maleimilopropiónico e derivados de succinimidilo, grupos derivados de brometo ou cloreto de cianogénio, carbonildiimidazole, ésteres de succinimida ou halogenatos sulfónicos.
Numa outra forma de realização da presente invenção, o acoplamento da referida substância de interesse pode também ser realizada por todas as técnicas de engenharia genética conhecidas do especialista da técnica. Por "engenharia genética", entende-se a utilização de um vector de expressão em que o ADN codificante para os péptidos-vectores está clonado em fase de 5' e/ou 3' do ADN complementar do gene de interesse. A expressão da proteína de fusão é colocada sob controlo de um promotor. 0 sistema de expressão pode ser utilizado numa célula hospedeira procariota ou eucariota para a produção da proteína de fusão.
Numa primeira forma de realização, o acoplamento da referida substância de interesse é realizado ao nível da 26 ΡΕ1259541 extremidade N-terminal da sequência de aminoácidos de acordo com a invenção. Numa segunda forma de execução da invenção, o acoplamento da referida substância de interesse é realizado ao nivel da extremidade C-terminal da referida sequência.
De forma surpreendente, foi demonstrado que o vector objecto da invenção é capaz de potencializar a actividade biológica e, potencialmente, de reduzir a toxicidade da referida substância acoplada. A presente invenção tem, deste modo, também por objecto um vector caracterizado por permitir aumentar a actividade biológica da substância de interesse a que está acoplado.
Foi também demonstrado que o vector objecto da invenção permite a transfecção in vitro de células.
Numa forma de execução particular da invenção, o vector é acoplado à substância de interesse por intermédio de pelo menos uma molécula (dita "molécula de ancoragem") apresentando uma forte afinidade natural para a substância de interesse a internalizar. A afinidade natural da molécula de ancoragem para a substância de interesse permite ao transportador interagir, de forma não covalente, com a referida substância de interesse, e assim exercitar os deslocamentos intracelulares.
Uma outra vantagem particularmente interessante deste tipo de transportador consiste em que, pela afinidade 27 ΡΕ1259541 natural da molécula de ancoragem para a substância de interesse, o acoplamento entre estes dois elementos se efectua de forma totalmente natural, sem nenhuma interacção química ou bioquímica.
Este tipo de transportador é particularmente interessante no caso em que a substância de interesse, pelo seu tamanho e/ou pela sua estrutura, revela-se difícil de acoplar directamente à sequência de aminoácidos. Este tipo de transportador pode também revelar-se particularmente útil quando a substância de interesse não é muito estável, e quando qualquer interacção química para o seu acoplamento a pode deteriorar, ou modificar a sua actividade.
Por outro lado, o transportador de acordo com a invenção pode não ser específico de uma só substância de interesse, mas poderá, ao contrário, permitir a internalização nas células e/ou nos núcleos celulares de várias substâncias de interesse diferentes. A invenção refere-se igualmente a células eucariotas que contêm uma sequência de aminoácidos conforme a presente invenção. Refere-se também a células eucariotas que contêm um vector e/ou um transportador conforme a invenção. Refere-se igualmente a todo o tipo de célula eucariota que foi transfectada por um vector e/ou transportador conforme a presente invenção. 28 ΡΕ1259541 A invenção refere-se igualmente a um procedimento de transferência in vitro de uma substância de interesse para o interior de uma célula, e de aumento da actividade biológica das referidas substâncias de interesse que compreendem as etapas seguintes. a) o acoplamento da substância a uma sequência de aminoácidos, a um vector, ou a um transportador conforme a invenção, tal como descrito acima, e b) a incubação da célula com o referido produto de acoplamento a uma temperatura de cultura que permite o metabolismo activo da referida célula.
Uma tal temperatura está compreendida entre 25 e 39 °C, preferencialmente 37°C. A presente invenção refere-se ainda uma composição compreendendo, como principio activo, seja vectores ou transportadores carregados com, pelo menos, uma substância de interesse, conforme a presente invenção, seja células eucariotas que foram transfectadas de acordo com a presente invenção. Esta tem também como objective a utilização de tais composições para a formulação e a preparação de produtos biológicos, farmacêuticos, cosméticos e agro-alimentares. A invenção estende o seu alcance aos sais de adição básica ou ácida farmaceuticamente aceitáveis, 29 ΡΕ1259541 hidratos, ésteres, solvatos, precursores, metabolitos ou estereoisómeros, os referidos vectores e transportadores carregados com, pelo menos, uma substância de interesse. A invenção estende igualmente o seu alcance às formulações farmacêuticas compreendendo um vector ou um transportador carregados com, pelo menos, uma substância de interesse em associação com um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A expressão "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se aos sais não tóxicos das sequências de aminoácidos de acordo com a invenção que podem ser geralmente preparados fazendo reagir a base livre com um ácido orgânico ou inorgânico conveniente. Estes sais conservam a eficácia biológica e as propriedades das bases livres. Como exemplos representativos de tais sais, podem citar-se os sais hidro-solúveis e hidro-insolúveis, tais como acetatos, ansonatos (4,4-diaminostilbeno-22-dissulfonatos) benzenossulfonatos, benzonatos, bicarbonatos, bissulfatos, bitartaratos, boratos, brometos, butiratos, edetatos de cálcio, camsilatos, carbonatos, cloretos, citratos, clavulariatos, dicloridratos, edetatos, edisilatos, estolatos, esilatos, fumaratos, gluceptatos, gluconatos, glutamatos, glicolilarsanilatos, hexafluoro-fosfatos, hexilresorcinatos, hidrabaminas, bromidratos, cloridratos, hidroxinaftoatos, iodetos, isotionatos, lactatos, lactobionatos, lauratos, malatos, maleatos, mandelatos, mesilatos, metilbrometos, metilnitratos, metilsulfatos, mucatos, napsilatos, nitratos, 3-hidroxi-2- 30 ΡΕ1259541 naftoatos, oleatos, oxalatos, palmitatos, pamoatos (1,1-metilene-bis-2-hidroxi-3-naftoatos, emboatos), pantotena-tos, fosfatos/difosfatos, picratos, poligalacturonatos, propionatos, p-toluenossulfonatos, salicilatos, estearatos, subacetatos, succinatos, sulfatos, sulfossalicilatos, suramatos, tanatos, tartaratos, teoclatos, tosilatos, trietiodidos, valeratos e os sais de N-metilglucamina amónio.
Um sujeito pode ser tratado com uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um péptido, de um vector ou de um transportador de acordo com a invenção, carregados com, pelo menos, uma substância de interesse. A expressão "quantidade farmaceuticamente eficaz" significa uma quantidade capaz de fazer penetrar suficientemente a substância de interesse para induzir a resposta biológica ou medicinal de um tecido, sistema, animal ou humano tal como esperado pelo investigador ou o médico assistente. A invenção visa igualmente composições farmacêuticas convenientes à introdução de uma substância de interesse numa célula ou um núcleo celular. As composições compreendendo uma quantidade eficaz de um vector ou transportador de acordo com a invenção, carregado com, pelo menos, uma substância de interesse, só ou em combinação com um ou vários suportes farmaceuticamente aceitáveis. As composições são particularmente úteis no sentido em que possuem uma toxicidade muito fraca, ou não são tóxicos. 31 ΡΕ1259541 A administração de vectores ou transportadores de acordo com a invenção, ou seus sais, carregados com, pelo menos, uma substância de interesse, pode fazer-se por qualquer dos modos de administração aceites pelos agentes terapêuticos. Estes procedimentos compreendem a administração sistémica, por exemplo oral, nasal, parentérica, ou a administração tópica, por exemplo transdérmica, ou ainda a administração central, por exemplo por via cirúrgica intracraniana, ou ainda a administração intra-ocular. A administração oral pode fazer-se através de comprimidos, cápsulas duras, cápsulas moles (e compreende as formulações para a libertação diferida ou prolongada), pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Esta forma de apresentação é mais particularmente adaptada à passagem da barreira intestinal. A administração parentérica faz-se geralmente por injecção subcutânea, intramuscular ou intravenosa ou por perfusão. As composições injectáveis podem ser preparadas sob formas clássicas, seja em suspensão ou solução líquida, seja sob forma sólida conveniente para uma dissolução extemporânea num líquido. Esta forma de apresentação está mais particularmente adaptada à passagem da barreira hemato-encefálica.
Uma possibilidade para a administração parentérica utiliza a implantação de um sistema de libertação lenta ou libertação prolongada que assegure a 32 ΡΕ1259541 manutenção de um nível constante de dose, por exemplo, de acordo com US-A-3 710 795.
Para administração intra-nasal, podem utilizar-se veículos intra-nasais convenientes.
Para administração transdérmica, podem utilizar-se pensos cutâneos transdérmicos bem conhecidos do especialista da técnica. Um sistema de libertação transdérmica permite uma administração contínua.
Outras preparações tópicas preferidas compreendem os cremes, os unguentos, as loções, os sprais aerossóis e os géis.
Em função do modo de administração previsto, os compostos podem estar sob a forma sólida, semi-sólida ou líquida.
Para as composições sólidas, tais como comprimidos, pílulas, pós ou grânulos no estado livre ou incluídos em cápsulas duras, o princípio activo pode ser combinado com: a) diluentes, por exemplo a lactose, a dextrose, a sacarose, o manitol, o sorbitol, a celulose e/ou a glicina; b) lubrificantes, por exemplo a sílica, o talco, o ácido esteárico, o seu sal de magnésio ou de cálcio e/ou o polietilenoglicol: c) ligantes, por exemplo, o silicato de magnésio e de alumínio, a pasta de amido, a gelatina, a goma adragante, a metilcelulose, a 33 ΡΕ1259541 carboximetilcelulose sódica e/ou a poli-vinilpirrolidona; caso seja necessário, d) desintegrantes, por exemplo, amido, o agar, o ácido alginico ou seu sal de sódio, ou de misturas efervescentes; e/ou e) absorventes, corantes, aromatizantes e edulcorantes.
Os excipientes podem ser, por exemplo, manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glucose, sacarose, carbonato de magnésio e análogos de qualidade farmacêutica.
Para as composições semi-sólidas, tais como supositórios, o excipiente pode, por exemplo, ser uma emulsão ou suspensão gorda, ou uma base de polialquilenoglicol, tal como polipropilenoglicol.
As composições liquidas, em particular injectáveis ou a incluir numa cápsula mole, podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, dispersão, etc. do principio activo num solvente farmaceuticamente puro tal como, por exemplo, a água, o soro fisiológico, a dextrose aquosa, o glicerol, o etanol, um óleo e análogos.
Os vectores ou transportadores de acordo com a invenção, carregados com, pelo menos, uma substância de interesse, podem ser igualmente administrados sob a forma de sistemas de libertação do tipo lipossomas, tais como sob a forma de pequenas vesículas unilamelares, de grandes vesículas unilamelares e de vesículas multilamelares. Os 34 ΡΕ1259541 lipossomas podem ser formados a partir de uma diversidade de fosfolípidos, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas. Numa forma de execução, um filme de compostos líquidos podem ser hidratos com uma solução aquosa do medicamento para formar uma concha lipídica que encapsulou o medicamento, como descrito em US-Ad 262 564.
As composições de acordo com a invenção podem ser esterilizadas e/ou conter adjuvantes e substâncias auxiliares não tóxicas tais como aqentes de conservação, de estabilização, de moaqem ou de emulsificação, agentes que favorecem a dissolução, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. Por outro lado, eles podem igualmente conter outras substâncias que apresentam um interesse terapêutico. As composições são preparadas, respectivamente, por procedimentos clássicos de mistura, granulação ou de revestimento e estes contêm cerca de 0,1 a 75%, de preferência cerca de 1 a 50 %, de principio activo.
Os vectores ou transportadores de acordo com a invenção, carregados com, pelo menos, uma substância de interesse, podem ser igualmente acoplados com polímeros solúveis tais como suportes de medicamentos alvos. Estes polímeros podem compreender a polivinilpirrolidona, o copolímero pirano, o poli-hidroxipropil-metacrilamida-fenol, o poli-hidroxi-etil-aspanamido-fenol ou o poli(óxido de etileno)-polilisina substituída por residuos palmitoílo. Por outro lado, os compostos de acordo com a presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros 35 ΡΕ1259541 biodegradáveis úteis para realizar uma libertação autocontrolada de um medicamento, por exemplo, o poli(ácido láctico), a poli(epsilon-caprolactona) , o poli(ácido hidroxibutirico), os poliortoésteres, os poliacetais, os polidi-hidropiranos, os policianoacrilatos e os copolimeros de hidrogel em sequências reticuladas ou antipáticas. A posologia para administração dos vectores ou transportadores de acordo com a invenção, carregados com, pelo menos, uma substância de interesse, é seleccionada de acordo com uma diversidade de factores compreendendo o tipo, a espécie, a idade, o peso, o sexo e o estado médico do indivíduo; a gravidade do estado a tratar; a via de administração; o estado das funções renais e hepáticas do indivíduo e a natureza do composto particular, ou sal, empregue. Um médico ou veterinário com experiência normal determinará facilmente, e prescreverá, a quantidade eficaz do vector ou transportador carregado da substância de interesse requerida para prevenir, contrariar ou parar o progresso do estado médico a tratar.
Qualquer uma das composições farmacêuticas abaixo pode conter desde 0,1 até 99%, de preferência 1 até 70% de princípio activo. A título de exemplo, as posologias orais dos vectores ou transportadores de acordo com a invenção, carregados com, pelo menos, uma substância de interesse, quando eles são utilizados para os efeitos indicados, 36 ΡΕ1259541 estarão compreendidos entre cerca de 0,05 e 1 000 mg/dia por via oral e, de preferência fornecidos sob a forma de comprimidos contendo 0, 5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 e 1 000,0 mg de principio activo. Os níveis plasmáticos dos vectores ou transportadores carregados com, pelo menos, uma substância de interesse eficazes estarão compreendidos numa gama variando desde 0,002 mg a 50 mg por kg de peso corporal e por dia.
Os vectores ou transportadores de acordo com a invenção, carregados com, pelo menos, uma substância de interesse, podem ser administrados sob a forma de doses quotidianas únicas, ou a posologia quotidiana total pode ser administrada em duas, três ou quatro doses por dia.
Numa aplicação particular, a presente invenção refere-se a um agente de diagnóstico, para preparar in vitro, constituído por ou contendo, pelo menos, um vector, um transportador e/ou uma célula de acordo com a invenção. Um tal agente de diagnóstico pode igualmente ser utilizado in vivo. A presente invenção tem, deste modo, também como objectivo um kit de diagnóstico que compreende o referido agente de diagnóstico. Mais particularmente, o kit de diagnóstico compreende, um ou vários recipientes, uma quantidade pré-determinada de uma composição de acordo com a invenção. 37 ΡΕ1259541
Do mesmo modo, a sequência de aminoácidos de acordo com a invenção, ou um vector e/ou um transportador que contém esta sequência de aminoácidos, ou células transfectadas com o auxilio do referido vector são susceptiveis de serem utilizados in vivo com fins preventivos, por exemplo e de forma não limitativa, para a prevenção de infecções virais, de metástases, de apoptose celular (doenças degenerativas, isquémia tecidular...), ou com fins terapêuticos, por exemplo o tratamento de doenças infecciosas (virais, bacterianas ... ), o cancro e a neo-angiogénese patológica.
Outras vantagens e caracteristicas da invenção surgirão a partir dos exemplos de realização que se seguem fazendo referência às figuras em anexo. I - MATERIAL e MÉTODO. 1) Linhagens celulares. a) Células normais: - PtK2, fibroblastos de rim de rato canguru - 3T3, fibroblastos de embrião de murganho - HUVEC, células endoteliais humanas - CHO, células de ovários de hamster chinês - HUVEC, células endoteliais transfectadas par um gene de multiplicação celular - CHO, células de rim de hamster 38 ΡΕ1259541 - CHO-745, células da linhagem CHO defeituosas para a síntese de xilosiltransferase. b) Células tumorais: - H1299, carcinoma pulmonar humano - HH9, células epiteliais tumorais da mama humana transfectadas por um gene codificante para um factor de crescimento - MCF7, células epiteliais tumorais humanas - MCF7 ras, células MCF7 transfectadas pelo gene ras - HeLa, carcinoma do colo do útero humano HCT 116, carcinoma do cólon humano HT-29, adenocarcinoma do cólon humano LS174T, adenocarcinoma do cólon humano B16-F10, células de melanoma muríneo Daudi, linfoma humano de Burkitt c) Cultura de células: - As células são cultivadas num meio DMEM contendo 2% de L-glutamina, 1% de piruvato de sódio, de penicilina (100 U/mL), de estreptomicina (100 pg/mL) e 10% de soro de vitela fetal (meio completo) a 37 °C na presença de 5% de C02. - As células CHO e CHO-745 são cultivadas num meio MEM alfa contendo 2% de L-glutamina, 1% de piruvato de sódio, penicilina (100 U/mL), 39 ΡΕ1259541 estreptomicina (100 yg/mL) e 6% de soro de vitela fetal (meio completo) a 37 °C na presença de 5% de CO2. 2) Preparação dos péptidos. a) Síntese quimica.
As sínteses peptídicas foram realizadas de acordo com as técnicas conhecidas do especialista da técnica (Altergen e Neosystem). Estas são realizadas em fase sólida em resina Fmoc. A clivagem é realizada pelo ácido trifluoroacético (TFA) e os péptidos foram purificados em coluna HPLC-CR C5 semi-preparativa e eluída com uma solução de TFA a 0,1% e um gradiente de acetonitrilo (10-70%) em TFA. Os péptidos liofilizados foram dissolvidos em NaCl a 0,15 M. b) Construção molecular permitindo a preparação de proteínas contendo os péptidos da invenção.
As técnicas de biologia molecular permitem construir os plasmídeos que, uma vez introduzidos nas células adequadas, permitem a síntese de macromoléculas vectorizadas.
Construção dos vectores de expressão de proteínas recombinantes: A figura 10 em anexo representa a preparação de vectores permitindo a expressão de proteínas recombinantes contendo as sequências peptídicas da invenção. O vector 40 ΡΕ1259541 procariota pQE30 (Qiagen) permite a expressão de genes sob a forma de proteínas de fusão (ou proteínas recombinantes) com a sequência 6XHis. Este vector contém a origem de replicação ColEl, o promotor forte do fago T5 indutível por IPTG, o gene da β-lactamase conferindo a resistência à ampicilina e um sítio múltiplo de clonagem em 3' da sequência codificante o marcador 6XHis permitindo a clonagem de um DNA complementar em fase com a sequência 6Xhis.
Os oligonucleótidos complementares de 63-mero: .PAV1U: 5' ga t c cg taaaacgaggactaaaactacgacacgtacgaceacgag taacacgaatggacgfcaa 3* .PAV1L: 5' gatettaçgtccattcgtgttactcgfcggtcgtacgtgtcgtagt tttagtcctcgfcfcttacg-3* são hibridados. O segmento de ADN obtido possui um sítio BamHI em 5' e um sítio BglII em 3'. O código (caracteres em negrito) para a sequência peptídica PAV1: VKRGLKLRHVRPRVTRMDV. Este fragmento é clonado no sítio BamHI do vector pQE30. Os ADN complementares (ADNc) codificam para a proteína virai Zebra (BZLF1) do vírus de Epstein-Barr (EBV) ou uma proteína Zebra removida do seu domínio de localização nuclear (nls) de 35 aminoácidos 41 ΡΕ1259541 foram obtidos por PCR. Eles foram clonados no sítio BamHI do vector His-PAVl ou pQE30. Os plasmídeos resultantes permitem a expressão das proteínas recombinantes His6_ Zebra-PAVl, His6-ZebraAnls-PAVl, His6-Zebra e His6-ZebraAnls após transformação das bactérias de E. coli. - Indução, extracção e purificação das proteínas recombinantes: A produção das proteínas recombinantes é induzida a 37 °C por adição de IPTG (isopropil-p-D-tiogalacto-piranósido) a 1 mM nas culturas bacterianas em fase exponencial de crescimento em meio Luria Bertani suplementado com 40 pg/mL de ampicilina. 12 horas após a adição de IPTG, as bactérias são centrifugadas a 5700 g durante 15 min. a 4 °C. O sedimento bacteriano é ressuspenso em 5 volumes de tampão de lise desnaturante (20 mM Tris-HCl pH 7,8; 0,5 M NaCl; 10% glicerol; 6M Guanidina-HC1). Após uma incubação de 20 min. à temperatura ambiente sob agitação lenta, o lisado é clarificado por uma centrifugação de 30 min. a 15 000 g a 4°C. O sobrenadante contendo a proteína recombinante é conservado a -80 °C.
As proteínas recombinantes 6XHis são purificadas por cromatografia de afinidade sob uma coluna de resina "TALON" (CLONTECH) previamente equilibrada com tampão de lise desnaturante. Após 3 lavagens sucessivas da resina com 10 volumes de tampão de lise desnaturante contendo 10 mM de imidazole, a proteína recombinante ligada a uma coluna é 42 ΡΕ1259541 renaturada por um gradiente de 6 a 0 M de Guanidina-HCl em tampão 20 mM Tris-HCl pH 7,8; 0,5 M NaCl; 10% glicerol; 0,5 mM PMSF. A proteína recombinante é eluída por um gradiente de 20 mM até 1 M de imidazole pH 8,0. Os diferentes eluatos são analisados em gel desnaturante de SDS-Acrilamida a 12%. As fracções contendo a proteína purificada são reunidas e dialisadas 2 horas a 4 °C contra o tampão HEPES 20 mM pH 7,5, 150 mM NaCl. A proteína é concentrada, fraccionada e congelada rapidamente em azoto líquido e conservada a -80 °C. 3) Péptidos utilizados. a) Péptidos não funcionalizados.
As sequências seguintes (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 48) estão listadas em anexo, conforme a norma ST-25. SEQ ID NO: 1. Péptido reagindo com a heparina e derivado da sequência de aminoácidos (3358-3372) da lipoproteína B humana (12), também designada de aqui em diante por HBP1. SEQ ID NO: 2. Péptido reagindo com a heparina dímero da SEQ ID NO: 1, também designado de aqui em diante por (HBP1)2. SEQ ID NO: 3. Péptido reagindo com a heparina trímero da SEQ ID NO: 1, também designado de aqui em diante por (HBP1)3. SEQ ID NO: 4. Péptido correspondente à região CDR3 hipervariável do anticorpo monoclonal de muríneo anti-ADN F4.1 (13) . 43 ΡΕ1259541 SEQ ID NO: 5. Péptido contendo as SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 6. Péptido contendo uma parte das regiões CDR2 e CDR3 do anticorpo monoclonal de murineo F4.1 (13). SEQ ID NO: 7. Péptido contendo as SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 8. Péptido correspondente à região hipervariável CDR3 do anticorpo monoclonal humano anti-ADN RTT79 (14). SEQ ID NO: 9. Péptido contendo as SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 10. Péptido reagindo com heparina e contendo a SEQ ID NO: 1 e a sequência do péptido correspondente à região hipervariável CDR3 do anticorpo monoclonal humano anti-ADN NE-1 (15), também designado de aqui em diante pelo
No. 1047. SEQ ID NO: 11. Péptido contendo a SEQ ID NO: 1 e a sequência do péptido correspondente à região hipervariável CDR3 do anticorpo monoclonal humano anti-ADN RT72 (16). SEQ ID NO: 12. Péptido contendo a sequência de NLS (sinal de localização nuclear) das células 3T3 e a SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 13. Péptido contendo a SEQ ID NO: 1 e a sequência das regiões CDR2 e CDR3 do anticorpo monoclonal humano anti-ADN NE-1. SEQ ID NO: 14. Péptido contendo uma parte da região CDR3 do anticorpo monoclonal de murineo F4.1 e da SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 15. Péptido contendo duas vezes a sequência do péptido correspondente à região hipervariável CDR3 do anticorpo monoclonal humano anti-ADN NE-1. 44 ΡΕ1259541 SEQ ID NO: 16. Péptido resultante da inclusão, na posição 13-19, da SEQ ID NO: 1 na SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 17. Péptido reagindo com heparina derivado da sequência de aminoácidos da lipoproteina E humana (12), também designado HBP4. SEQ ID NO: 18. Péptido reagindo com heparina derivado da sequência de aminoácidos de agrina (17), proteína da matriz extracelular que regula a diferenciação da junção neuromuscular. SEQ ID NO: 19. Dimero da SEQ ID NO: 18. SEQ ID NO: 20. Péptido reagindo com heparina derivado da sequência de aminoácidos da "proteína de ligação ao factor de crescimento da insulina" (18). SEQ ID NO: 21. Péptido reagindo com heparina e derivado da sequência de aminoácidos da parte C terminal da cadeia A do factor de crescimento das plaquetas (19) , também designado HPB6.
SEQ ID NO: 22. Péptido contendo 12 lisinas (K) e a SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 23. Péptido contendo 12 lisinas (K) e a SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 24. Péptido apresentando uma actividade anti-microbiana (29). SEQ ID NO: 25. Péptido reagindo com heparina e correspondendo à sequência da «proteína de ligação ao factor de crescimento do tipo insulina» (18), também designado de aqui em diante por HBP2. SEQ ID NO: 26. Péptido reagindo com heparina e dimero de um péptido derivado da parte C-terminal da sequência da 45 ΡΕ1259541 superóxido dismutase humana (20), também designado de aqui em diante por (HBP3)2. SEQ ID NO: 27. Péptido reagindo com heparina e correspondendo à sequência SEQ ID NO: 26 na qual os aminoácidos estão na configuração D. SEQ ID NO: 28. Péptido reagindo com heparina e do qual a sequência derivada da sequência SEQ ID NO: 26 e contendo o motivo RGD se liga selectivamente às αν integrinas (21). SEQ ID NO: 29. Péptido reagindo com heparina e constituído pelos péptidos de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 17, também designado de aqui em diante por HBP1-HBP4. SEQ ID NO: 30. Péptido reagindo com heparina e derivado da parte C-terminal da sequência do factor de crescimento das células epidérmicas (EGF) (22), também designado de aqui em diante por HBP7. SEQ ID NO: 31. Péptido reagindo com heparina e correspondendo ao péptido do qual a sequência é SEQ ID NO: 12 onde os aminoácidos estão na posição reversa. SEQ ID NO: 32. Péptido reagindo com heparina e correspondendo à sequência SEQ ID NO: 30 na qual os aminoácidos estão na configuração D. SEQ ID NO: 33. Péptido reagindo com heparina e contendo uma parte da sequência do factor ácido de crescimento (aFGF) dos fibroblastos (6), também designado de aqui em diante por HBP8. SEQ ID NO: 34. Péptido reagindo com heparina e contendo uma parte da sequência do factor básico de crescimento (bFGF) dos fibroblastos, também designado de aqui em diante por HBP9. (23). 46 ΡΕ1259541 SEQ ID NO: 35. Péptido reagindo com heparina e correspondendo à parte C-terminal da sequência das mucinas intestinais (24) , também designado de aqui em diante por HBP10. SEQ ID NO: 36. Péptido reagindo com heparina e contendo uma parte da sequência C-terminal do interferão γ humano (25), também designado de aqui em diante por HBP11. SEQ ID NO: 37. Péptido reagindo com heparina e contendo uma parte da sequência da subunidade p40 da interleucina 12 humana (26), também designado de aqui em diante HBP12. SEQ ID NO: 38. Péptido reagindo com heparina e contendo uma parte da sequência do factor Ia derivado das células do estroma (27), também designado de aqui em diante por HBP13. SEQ ID NO: 39. Péptido reagindo com heparina e compreendendo uma parte da sequência da «proteína de ligação à heparina» (CAP37) (28), também designado de aqui em diante por HBP15. SEQ ID NO: 40. Péptido reagindo com heparina correspondendo ao péptido da sequência SEQ ID NO: 10 (1047) adicionado com 13 lisinas no terminal N. SEQ ID NO: 41. Péptido reagindo com heparina correspondendo ao péptido de sequência SEQ ID NO: 28 ((HBP3) 2) adicionado com 13 lisinas no terminal N. SEQ ID NO: 42. Péptido reagindo com heparina correspondendo ao péptido da sequência SEQ ID NO: 39 (HBP10) adicionado em 13 lisinas no terminal N. SEQ ID NO: 43. Péptido apresentando uma actividade anti-microbiana e contendo os péptidos das sequências SEQ ID NO: 10 (1047) e SEQ ID NO: 24. 47 ΡΕ1259541 SEQ ID NO: 44. Péptido apresentando uma actividade anti-microbiana e contendo os péptidos das sequências SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 30 (HBP7). SEQ ID NO: 45. Péptido apresentando uma actividade anti-microbiana e contendo os péptidos das sequências SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 38 (HBP13). SEQ ID NO: 46. Péptido compreendendo o péptido da sequência SEQ ID NO: 26 (HBP3)2 adicionado no terminal N da glicina-ftaloil. SEQ ID NO: 47. Péptido compreendendo o péptido de sequência SEQ ID NO: 21 (HBP6) adicionado no terminal N de um motivo salicililo. SEQ ID NO: 48. Péptido compreendendo o péptido da sequência SEQ ID NO: 21 (HBP6) adicionado no terminal C de um motivo salicililo. b) Péptidos funcionalizados.
Estes péptidos correspondem às SEQ ID NO: 1 até 48 abaixo mas contendo, do lado N-terminal, ou uma cisteina que permite a ligação covalente às substâncias de interesse (ver abaixo) ou a biotina permitindo a associação não-covalente dos péptidos com a estreptavidina ou a avidina conjugada à peroxidase (ver pontos (1) e (2) abaixo) II - Mecanismo de penetração dos péptidos. 1) Implicação dos glicosaminoqlicanos (GAG). 48 ΡΕ1259541
Os péptidos penetram nas células por endocitose mediada pelos GAG presentes sobre as membranas de todas as células eucariotas. Os testes foram efectuados para ver o seu papel na penetração dos péptidos. a) A heparina (50 pg/mL) foi incubada com as células durante 1 hora antes de adicionar os conjugados péptido-peroxidase a 0,2 pg/mL durante 2 horas. As células foram seguidamente lisadas e a peroxidase foi doseada. A heparina a 50 pg/mL inibe totalmente a internalização de todos os péptidos nas células H1299 e HeLa. A quantidade de heparina necessária para inibir 50% da penetração dos péptidos acoplados à peroxidase foi avaliada com estes dois tipos de células, incubando as células com os conjugados péptido-peroxidase com as concentrações crescentes de heparina. Os resultados da inibição da internalização dos péptidos são expressos em concentração de heparina (pg/mL) na tabela 2 abaixo.
Tabela 2 Péptido SEQ ID NO: Péptido SEQ ID NO: 21 26 (HBP3)2 (HBP6) Células 3T3 14,5 pg/mL 4,1 Células HeLa 8,5 2,3
Estas experiências demonstram o papel dos sulfatos de heparano na penetração dos péptidos. 49 ΡΕ1259541 b) As células CHO-745 são derivadas das células CHO. Elas são deficientes em xilosiltransferase que participa na formação dos sulfatos de condroitina e de heparano da membrana. Os complexos péptidos-avidina peroxidase não penetram nas células CHO-745 qualquer que seja o péptido testado.
Isto demonstra a importância das condroitinas de sulfato de heparano da membrana celular na penetração dos péptidos. 2) Implicação do metabolismo celular.
Para compreender os mecanismos biológicos para que aqueles péptidos penetrem nas células e sua compartimentalização, são feitas experiências com os fármacos, pelos quais a acção sobre certos compartimentos celulares é especifica. Os péptido-peroxidase foram incubados com as células H1299 a uma concentração de 0,2 pg/mL durante 2 horas na presença ou não do fármaco. As células foram lisadas e a peroxidase doseada no lisado celular. A tabela 3 abaixo apresenta a percentagem de inibição da internalização dos péptidos calculada em relação aos valores fornecidos pelo lisado das células incubadas sem fármaco. 50 ΡΕ1259541
Tabela 3 Péptido Péptido Péptido SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 26 NO: 30 NO: 35 (HBP3)2 (HBP7) (HBP10) a temperatura (4 °C) 100 100 100 a azida de sódio (0,1%) 70 70 50 o cloreto de sódio (80 51 69 27 mM) o cloreto de amónio (50 76 70 30 mM) a genisteina (200 μΜ) 59 68 70 a cloroquina (100 μΜ) 82 79 76 A penetração dos péptidos testados é completamente inibida pela incubação das células a 4 °C com todos os péptidos. Ela é inibida, em parte, pelos inibidores do metabolismo celular como a azida de sódio (inibidor da ATPase), a genisteina (inibidor da tirosina cinase e da ligação a ATP). O mecanismo de internalização é, por isso, dependente da energia. A penetração dos péptidos HBP3 e HBP7 é inibida na mesma ordem de grandeza por uma cloroquina que reflecte uma internalização nos mesmos compartimentos do citoplasma celular (vesículas endossómicas, retículo endoplásmico) enquanto que o cloreto de sódio e o cloreto de amónio (que evitam a acidificação das vesículas endossómicas inibem deste modo o tráfico intracelular) intervêm muito menos na 51 ΡΕ1259541 internalizaçâo do péptido de sequência SED ID NO: 35. Aqui sugere-se que os péptidos penetrem nas células através dos mecanismos semelhantes aos utilizados por diferentes toxinas sem no entanto apresentar toxicidade. As vias intracelulares até à zona do Golgi e o tráfico retrógrado parecem distintos, de acordo com os péptidos. III - RESULTADOS. 1) Avaliação da capacidade dos péptidos para reagirem com o ADN e com a heparina. A capacidade dos péptidos SEQ ID NO: 1 a 21 para se fixarem sobre o ADN e a heparina é avaliada sobre as placas de ELISA sensibilizadas com o ADN ou a heparina. As diluições dos péptidos biotinilados são depositadas sobre as placas e a sua fixação é evidenciada com o auxilio de estreptavidina conjugada com a peroxidase. A actividade da peroxidase é revelada com a ortodianisidina e H2O2 como substrato. A avidez de cada um dos péptidos para o ADN ou a heparina é avaliada para a quantidade (x 10“6 M) de péptidos necessária para obter 50% de fixação. Os resultados obtidos são apresentados na tabela 4 abaixo.
Tabela 4 SEQ ADN Heparina Condroitina Condroitina Condroitina ID NO A B C 1 >100 >100 >100 >100 >100 2 2,2 0,76 0,55 0, 6 0,55 52 ΡΕ1259541 3 0, 05 0,041 0,037 0, 041 0,035 4 4 5 5, 6 6,2 5 5 0,11 0,11 0,13 0,11 0,11 6 0,19 0,16 0,24 0,25 0,22 7 0, 05 0,05 0,06 0,04 0,06 8 >150 >150 >150 >150 >150 9 3,7 3,7 0,017 0,5 >8 15 3 >30 0,2 4 5 16 0,019 0,024 0, 012 0,009 0,002 17 >150 >150 >150 >150 >150 18 >134 >134 >134 >134 >134 19 >74 >74 >74 >74 >74 20 0,09 0,07 0,06 0,04 0,1 21 0,2 0, 07 0,12 0,12 0,12
Ressalta desta tabela que a afinidade da SEQ ID NO: 1 para o ADN é muito fraca enquanto que a do seu dímero (SEQ ID NO: 2) e do seu trímero (SEQ ID NO: 3) é muito grande. Parece por outro lado que a associação da SEQ ID NO: 1 com os vectores peptidicos aumenta consideravelmente a afinidade desses vectores para o ADN [comparar as SEQ ID NO: 4 e 5, 6 e 7, 8 e 9, e 15 e 16].
De modo semelhante, a afinidade da SEQ ID NO: 17 e da SEQ ID NO: 18 para o ADN, a heparina e os sulfatos de condroitina é muito fraca. Pelo contrário, a afinidade para essas moléculas do dimero da SEQ ID NO: 18 (SEQ ID NO: 19) é muito grande. As SEQ ID NO: 20 e 21 que contêm um número 53 ΡΕ1259541 muito grande de aminoácidos entre os quais um número elevado de aminoácidos básicos possuem uma grande afinidade para o ADN, a heparina e os sulfatos de condroitinas. A avidez dos péptidos SEQ ID NO: 25 a 39 para diversos proteoglicanos (Kd x IO"9 M) a heparina e os seus sulfatos de condroitinas é avaliada para a quantidade de péptidos necessários para obter 50% de fixação sobre os diferentes antigénios. Os resultados são apresentados na tabela 5 abaixo.
Tabela 5 Péptidos Heparina Condroitina Condroitina Condroitina A B C (HBP1)3 41 37 41 35 HBP2 70 60 40 100 (HBP3)2 20 51 43 6 (HBP3) 2RGD 407 nt nt nt HBP6 16 135 110 12 HBP7 54 78 58 19 HBP8 168 225 260 110 HBP9 45 47 47 25 HBP10 78 112 229 39 HBP11 382 287 301 205 HBP12 295 176 173 93 HBP13 56 56 38 16 HBP15 100 100 100 100 54 ΡΕ1259541
Ressalta desta tabela que a avidez para a heparina dos péptidos SEQ ID NO: 33 (HBP8), 36 (HBP11) e 37 (HBP12) é claramente mais fraca (>100xl0“9 M) que a de outros péptidos que estão em média compreendidos entre 20 e 80xl0“9 Μ. A avidez dos diferentes péptidos com os sulfatos de condroitinas A, B, e C está no conjunto da mesma ordem de grandeza que aquela para a heparina. No entanto, a avidez dos péptidos SEQ ID NO: 34 (HBP9) e SEQ ID NO: 38 (HBP13) assim como para a heparina e para as 3 condroitinas é 46-50 xl0~9 M, enquanto que a dos péptidos SEQ ID NO: 33 (HBP8), 36 (HBPll) e 37 (HBP12), tanto para a heparina como para as 3 condroitinas, é >100xl0~9 Μ. o péptido modificado SEQ ID NO: 28 (HBP3 +RGD) perdeu a sua afinidade para a heparina. 2) Avaliação da penetração de péptidos nas células.
As células são cultivadas na presença de diferentes péptidos de suporte, ao lado do terminal N, de biotina a concentrações decrescentes (50 a 6 pg/mL) no meio de cultura durante os tempos variáveis (1-18 horas).
No final da cultura, as células são lavadas três vezes com PBS (0,15 M NaCl tamponado com 0,01 M de tampão fosfato de potássio pH 7,4) depois fixadas durante 15 minutos em etanol a -20 °C. A penetração do péptido é avaliada após incubação durante 30 minutos com a estreptavidina conjugada com a peroxidase (em abreviatura S-PO para estreptavidina-peroxidase) . De seguida, a S-PO é 55 ΡΕ1259541 eliminada e as células são lavadas. A actividade da peroxidase internalizada é revelada para a diaminobenzidina na presença de H2C>2 e as células são examinadas ao microscópio (30). O exame ao microscópio mostrou que alguns dos péptidos utilizados (SEQ ID NO: 1, 4, 11, 12, 17 e 18) não provocam a coloração citoquímica positiva intracelular. Com os outros péptidos, as colorações positivas, mas de intensidade variável, foram observadas. Foi observada uma coloração fraca com as SEQ ID NO: 2, 6, 8 e 19 enquanto que com os outros péptidos foram obtidas colorações intensas. É interessante notar que todos os péptidos que contêm a SEQ ID NO: 1, ou seja o PLH da lipoproteina B humana, provocam uma coloração positiva à excepção da própria SEQ ID NO: 1 (monómero) e da SEQ ID NO: 11.
No que diz respeito à SEQ ID NO: 1, 17 e 18, trata-se de péptidos curtos que correspondem a PLH da lipoproteina B e a lipoproteina E humanas, e a agrina. Contrariamente a esses péptidos monómeros, os seus dímeros (SEQ ID NO: 2) e sobretudo o trimero da SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 3) dão as colorações claramente positivas.
Para esta SEQ ID NO: 11, é constituída da SEQ ID NO: 1 e da CDR3 do anticorpo monoclonal humano anti-ADN RT72 (codificado pela linhagem germinal) que não contêm mais do que um único aminoácido básico (K). Contrariamente 56 ΡΕ1259541 à SEQ ID NO: 11, as SEQ ID NO: 5, 7, 9 e 10 constituídas da SEQ ID NO: 1 e das CDR2 e/ou CDR3 dos anticorpos monoclonais anti-ADN (codificados para a linhagem germinal), contêm um número elevado de aminoácidos básicos, provocando colorações intensas.
Por um lado, os resultados sugerem que um mínimo de 3 a 5 aminoácidos básicos em excesso devem estar presentes na sequência dos péptidos para que o péptido seja capaz de penetrar no interior das células. Por outro lado, a SEQ ID NO: 1 não é capaz de aumentar o poder de translocação dos CDR2 e/ou CDR3 anti-ADN sem que estes últimos possuam um número elevado de aminoácidos básicos. O exame ao microscópio demonstrou que todos os péptidos SEQ ID NO: 25 a 48 produzem colorações citoquímicas positivas a uma concentração de 6 pg/mL, assim como intensidade variável de acordo com os péptidos. 3) Avaliação da penetração nas células dos complexos péptido/estreptavidina ou péptido/avitidina acoplados à peroxidase ou dos conjugados péptidos/peroxidase. a) um complexo péptido biotinilado/S-PO ou biotinilado/A-PO (A-PO para avidina-peroxidase) é preparado extemporaneamente de dois modos: - seja numa proporção molar de péptido:S-PO ou A-PO de 4:1 (por exemplo 1,4 pg de péptido de peso 57 ΡΕ1259541 molecular de 3500 para 10 pg de S-PO; o peso de S-PO utilizado varia de acordo com os péptidos, uma vez que os seus pesos moleculares são diferentes).
- seja numa proporção molar de péptido:S-PO ou A-PO de 25:1 (por exemplo 1,7 pg de péptido de peso molecular 3500 para 1 pg de S-PO)
Os complexos são preparados incubando o péptido biotinilado com um S-PO ou um A-PO em PBS num volume de 5 à 10 pL durante 15 minutos à temperatura do laboratório. Eles são diluídos de seguida em 1 mL de meio completo de cultura, filtrados através de uma membrana de 0,2 micron e incubados com as células durante 4 horas. As células são de seguida lavadas três vezes com PBS.
Para avaliar ao microscópio a penetração dos complexos, as células são fixadas como anteriormente durante 15 minutos em etanol a -20 °C, lavadas com PBS, e a actividade da peroxidase internalizada é revelada por uma diaminobenzidina na presença de H2O2.
Para medir a quantidade dos complexos péptido/S-PO ou A-PO internalizados, as células são tripsinizadas, transferidas para microtubos e contadas. Elas são lavadas duas vezes por centrifugação, depois 0 sedimento é colocado em suspensão em 200 pL de tampão de lise (tampão Tris, 0,1 M, pH 8, 0,5% Nonidet). Após 15 minutos, a peroxidase 58 ΡΕ1259541 contida no tampão de lise é doseada sobre placas de 96 poços com a orto-dianisidina e H2O2 por comparação com uma curva padrão de S-PO. A leitura é realizada a 450 nm. A quantidade contida nas diferentes amostras é expressa em picogramas (pg) para 104 células.
Em geral, os resultados obtidos no exame das células ao microscópio óptico estão em boa correlação com os resultados obtidos na medição da peroxidase internalizada. É por esta razão que, de seguida, apenas os resultados quantitativos obtidos com um dado número de péptidos são fornecidos nas tabelas 6 e 7 e nas figuras 1 a 3. A tabela 6 representa a avaliação da capacidade de penetração de péptidos constituídos por diferentes PLH, derivados de proteínas variadas nas células H1299, utilizando os complexos péptido: S-PO de 4:1 e uma concentração de péptido de 1 pg.
Tabela 6 Células H1299 (pigmentação/104 células) SEQ ID NO: 1 3 SEQ ID NO: 2 84 SEQ ID NO: 3 642 SEQ ID NO: 17 3 SEQ ID NO: 18 3 SEQ ID NO: 19 167 59 ΡΕ1259541 SEQ ID NO: 20 431 SEQ ID NO: 21 1680
Os resultados mostram claramente que, para que um vector seja eficaz na transferência intracelular do complexo SPO (PM = 100 000), deve estar presente um minimo de 6 aminoácidos básicos (SEQ ID NO: 2, 3, 19-21). A tabela 7 abaixo apresenta os resultados da avaliação da influência da SEQ ID NO: 1 sobre a penetração, nas células H1299, dos péptidos acoplados à SEQ ID NO: 1, em que:
Concentração a: 25 péptidos para uma molécula S-PO d pg),
Concentração b: 4 péptidos para uma molécula de S-PO (10 pg).
Tabela 7 PÉPTIDOS NÃO SEQ ID NO. células) INCLUINDO A 1 (p/q 104 PÉPTIDOS INCLUINDO A SEQ ID NO: 1 (pq/104 células) SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 conc. a 2 conc. a 100 com. b 280 com. b 6250 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 conc. a 1 conc. a 240 com. b 130 com. b 220 60 ΡΕ1259541 SEQ ID NO: 8 conc. a com. b 50 1310 SEQ ID NO: 9 conc. a com. b 340 8289 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 conc. a 250 conc. a 430 com. b 6670 com. b 5220
Ressalta da tabela 7 que a ligação da SEQ ID NO: 1 com os vectores peptídicos derivados dos anticorpos anti-ADN humanos ou de murídeos potencializam consideravelmente o poder de translocação desses vectores. A figura 1 é um gráfico de barras ilustrando a internalização da estreptavidina-peroxidase transportada por vários péptidos biotinilados uma noite a 37 °C, a uma concentração de (0,5 nmole de péptido biotinilado para 0,02 nmole de estreptavidina-peroxidase).
Como ressalta desta figura 1, a ligação da SEQ ID NO: 1 com um dado vector (SEQ ID NO: 6), que é derivado da SEQ ID NO: 7, aumenta significativamente a capacidade de transferência do referido vector. Não obstante, a ligação, com o mesmo vector (SEQ ID NO: 6), de um péptido do mesmo comprimento que a SEQ ID NO: 1 e de composição idêntica em aminoácidos, a que deriva da SEQ ID NO: 12, aumenta muito pouco o poder de translocação desse vector. Mesmo a ligação de um segundo CDR3 idêntico em relação à referida SEQ ID NO: 6, a que deriva da SEQ ID NO: 14, não resulta num 61 ΡΕ1259541 aumento tão forte quanto a ligação com a SEQ ID NO: 1. Em geral, a associação da SEQ ID NO: 1 aos vectores de origem humana (SEQ ID NO: 10 e 13) ou muríneo (SEQ ID NO: 5) dão origem aos vectores particularmente eficazes. A figura 2 é um gráfico de barras que ilustra a internalização da estreptavidina-peroxidase (S-PO) e da avidina-peroxidase (A-PO) transportadas por diversos péptidos biotinilados (2 horas a 37 °C) à concentração b (0,25 nmole de péptidos biotinilados para 0,01 nmole de S-PO ou de A-PO). A figura 3 é um gráfico de barras que ilustra a razão entre a internalização da S-PO e a da A-PO por esses mesmos péptidos biotinilados, 2 horas à 37 °C, à concentração b (0,25 nmole de péptido biotinilado para 0,01 nmole de S-PO ou de A-PO). A comparação, de acordo com as figuras 2 e 3, da transferência da S-PO e da A-PO pelos vectores sugerem que a natureza das substâncias a transferir influenciam mais a capacidade de translocação dos vectores de origem totalmente de murineo (SEQ ID NO: 14) que a dos vectores contendo o PLH de origem humana (SEQ ID NO: 7, 10 e 13). A figura 4 é um gráfico de barras que ilustram a razão entre a internalização da S-PO transportada pelos dois péptidos biotinilados a 37 °C durante 2 horas e a 4 °C durante 2 horas. 62 ΡΕ1259541
Os resultados obtidos indicam que o poder de translocação do vector de origem humana (SEQ ID NO: 10) é muito mais dependente da temperatura (metabolismo activo das células) que o do vector de origem de murineo (SEQ ID NO: 14) . b) para avaliar, de uma forma mais directa a penetração dos péptidos evitando o enviesamento da avidina-peroxidase, alguns dos péptidos da sequência SEQ ID NO: 25 a 48 foram conjugados de modo covalente pelo intermediário da cisteina na posição C-terminal do péptido em relação à peroxidase. A ligação dos péptidos com a peroxidase foi realizada do seguinte modo:
Um mg de peroxidase activada com maleimida (Sigma) em 100 pL de tampão fosfato de sódio, NaCl 0,15 M, EDTA 5 mM, é adicionada com 1 mg de péptido. Após 2 horas à temperatura do laboratório, o β-mercaptoetanol é ajustado para uma concentração final de 1,5 mM durante 15 minutos. A eliminação do péptido não acoplado é feita por centrifugação através de membranas de ultrafiltração (limite de exclusão = 30 000 daltons, Sartorius), seguida de três lavagens em tampão fosfato de sódio 0,1M, pH7,4 contendo 0,15 M NaCl.
As células H1299 são incubadas 2 horas com os conjugados a concentrações crescentes de péptido-peroxidase 63 ΡΕ1259541 no meio de cultura após lavagem em PBS. As células são lisadas e a quantidade de péptido internalizada é avaliada pela dosagem da peroxidase no lisado de células em referência a uma curva estabelecida com o péptido-peroxidase. A quantidade de péptido internalizado (pg/103 células), de acordo com as concentrações de conjugado no meio de cultura é mostrada na tabela 8 abaixo.
Tabela 8
Concentração (pg/mL) 0,01 0,1 0,5 1 Péptido SEQ ID NO: 28 0,006 1,7 37,9 8860 (0,006)* (1,6) (7,6) (8,8) Péptido SEQ ID NO: 34 0,002 1,4 40,7 109 (0,01) (1,4) (8,14) (10,9) *:percentagem da quantidade de peroxidase internalizada em relação à quantidade depositada
Parece que quanto mais a concentração de conjugado péptido-peroxidase é elevada no meio de cultura, tanto mais a quantidade internalizada aumenta.
Para comparar a penetração dos conjugados de acordo com o tipo celular, as células de diferentes linhagens foram incubadas com 0,2 pg/mL de conjugado péptido-peroxidase durante 2 horas e a quantidade de peroxidase é doseada nos lisados. A tabela 9 e a tabela 9bis abaixo apresentam os resultados obtidos expressos em 64 ΡΕ1259541 pg/103 células. A quantidade de cada péptido internalizado nas diferentes linhagens não varia para além do simples para p dobro em geral. A internalização dos péptidos HBP3 (SEQ ID NO: 26) e HBP7 (SEQ ID NO: 32) na configuração D é, da mesma ordem de grandeza que os péptidos homólogos em configuração L. Passa-se o mesmo com o péptido de SEQ ID NO: 30 e o seu homólogo de SEQ ID NO: 31, que possui uma sequência de aminoácidos na posição reversa.
Tabela 9: Internalização dos péptido-peroxidase (pg/103 células)
Lin has celulares Péptidos 3T3 H1299 HeLa 1047 35 10 4,7 (HBP1)3 24,6 17,7 11,2 (HBP3)2 41 27,8 14,9 HBP6 83,7 21,9 13,2 HBP7 48,8 22,5 11 HBP8* 7,6 3,6 2,1 HBP9* 9 3,8 3,4 HBP10 23,3 7,9 5,3 HBP11 20,3 10,6 4,4 HBP12* 5,7 4,3 2,5 HBP13 18,1 9,1 4,1 65 ΡΕ1259541
Tabela 9bis: Internalização dos péptido-peroxidase (pg/103 células) _
Linhas celulares Péptidos 3T3 H1299 HeLa (HBP3)22 72,9 67,4 11,4 (HBP3)2Configuração 63,7 59,1 4,1 D HBP7 44,2 63, 3 3, 6 HBP7Configuração D 50 56, 7 7,7 HBP7 reversa 75, 9 70, 6 8,7 * no limite do método de dosagem e por consequência do significado. 4) Avaliação da penetração de conjugados péptidos-IgG nas células
Dois mg de anticorpo IgG monoclonal ou seu fragmento F(ab')2 em 1 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7 contendo 0,15 M NaCl são adicionados de 200 pg de SMCC[4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimidilo] em 10 pL de dimetilsulfóxido e a solução é incubada durante 30 minutos à temperatura do laboratório. A eliminação do excesso de reagente é feita por centrifugação através de membranas de ultrafiltração [limite de exclusão = 10 000 Daltons (Da), Vivascience], seguida por três lavagens em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7 contendo 0,15M de NaCl. 66 ΡΕ1259541 A ligação com o péptido é feita de seguida numa proporção molar de 6 péptidos para 1 IgG em tampão fosfato de sódio, 0,1M, pH 7, contendo 0,15 M NaCl durante 3 horas à temperatura do laboratório. De seguida, o excesso de péptido não ligado é eliminado por centrifugação através das membranas, como a etapa precedente.
Para avaliar ao microscópio a penetração dos conjugados, as células são cultivadas na presença de diferentes conjugados anticorpo-péptidos a concentrações decrescentes (50 a 6 pg/mL) no meio de cultura durante 4 horas a 37 °C.
No final da cultura, as células são lavadas três vezes com PBS, depois fixadas 15 minutos em etanol a -20 °C. A penetração do conjugado IgG-péptido é avaliada após incubação durante 1 hora com um anticorpo anti-IgG de murganho acoplado à peroxidase. As células são seguidamente lavadas com PBS e a actividade da peroxidase é revelada pela diaminobenzidina na presença de H2O2.
Para medir a quantidade dos conjugados péptidos-IgG internalizados, as células são tripsinizadas, transferidas para microtubos e contadas. Elas são lavadas duas vezes por centrifugação, depois o sedimento é colocado em suspensão em 200 pL de tampão de lise (tampão TRIS, 0,1M, pH 8, 0,5% Nonidet 40). A quantidade de IgG de murganho presente no lisado é medida por ELISA nas placas revestidas com os anticorpos de ovelha anti-IgG de murganho 67 ΡΕ1259541 e reveladas por um conjugado de anticorpo de ovelha anti-IgG de murganho acoplada à peroxidase, por referência a uma curva padrão estabelecida com o mesmo anticorpo monoclonal antes de ser conjugado ao péptido.
Os resultados são reagrupados na tabela 10, que apresenta a penetração de anticorpos monoclonais de murineos ou seus fragmentos F(ab')2 no interior de células humanas H1299, em que: a: anticorpo monoclonal de murineo especifico da proteína p53, e b: anticorpo monoclonal de murineo específico da proteína p21 derivada de um hibridoma rato-rato.
Tabela 10
Quantidade de Conjugado SEQ Conjugado Conjugado anticorpos ID NO: 10 SEQ ID NO: SEQ ID NO: internalizados IgGb 10 F (ab') 2b 10 F (ab') 2a pg/104 células 137 620 383
Como ressalta da tabela, a utilização dos vectores de origem humana associados à SEQ ID NO: 1 permite uma internalização eficaz de anticorpo nas células humanas. É também de notar que grandes quantidades de anticorpos são transferidas para as células quando os vectores são conjugados com F(ab')2 em vez de com o anticorpo inteiro. A figura 5 é um gráfico de barras ilustrando a internalização de um anticorpo monoclonal de murineo IgGl 68 ΡΕ1259541 ligado a diferentes péptidos (4 horas a 37 °C; 30 pg/mL de conjugado depositado) sobre as células humanas H1299 e as células de ovários de hamster CHO.
Como ressalta deste gráfico, os vectores de origem humana (SEQ ID NO: 10 e 13) são mais eficazes para a transferência de substâncias para o interior de células humanas que os vectores de origem de muríneo ligados à SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 7 e 5). Por outro lado, os vectores de origem humana (SEQ ID NO: 10 e 13) são mais eficazes para a transferência de substâncias para o interior das células humanas que o interior das células de hamster. 5) Avaliação das capacidades de penetração intracelular das proteínas recombinantes por imuno-fluorescência.
As células Hela são semeadas a uma concentração de 0,5 x 104 células numa placa de 24 poços contendo cada, uma lamela estéril. 24 horas depois, 50 pg/mL de proteína recombinante são depositadas nas células. Seis ou dezoito horas depois, as células são lavadas 2 vezes em PBS (solução salina tamponada com fosfato) e fixadas por uma solução 4% PFA (paraformaldeído) em PBS durante 10 min. à temperatura ambiente ou dissociadas por uma tripsina e permanecem 18 horas em cultura sobre a lamela depois de fixadas. Após 3 lavagens em PBS, as células são permeabilizadas por uma solução 0,25% Triton X-100 em PBS durante 5 min. à temperatura ambiente. Após 3 lavagens de 5 69 ΡΕ1259541 minutos em PBS, as células são incubadas 1 hora à temperatura ambiente em câmara húmida com o anticorpo monoclonal anti-RGS.His (Qiagen) diluído a 1/50 em PBS-0,1% BSA (albumina de soro bovina). Após três lavagens em PBS de 10 minutos, as lamelas são incubadas 30 minutos à temperatura ambiente em câmara húmida com o anti-soro de cabra anti-murganho IgG conjugado com FITC diluído a 1/200 em PBS-0,1% BSA. As células são lavadas duas vezes em PBS durante 10 minutos depois as lamelas são montadas sobre a lâmina com o líquido de montagem (Mounting Médium da Sigma). As células são observadas sob microscópio confocal (Leica).
As células Hela são incubadas 18 horas com a proteína recombinante HiSê-Zebra-PAVl e fixadas (Figura 17A) ou dissociadas e mantidas em cultura 18 horas antes da fixação (Figura 17B). A observação das células ao microscópio confocal revelou que as células incubadas 18 horas apresentam na sua superfície uma fluorescência importante. Nenhuma fluorescência intracelular parece ter sido detectada nesta experiência. No entanto, uma contra coloração dos núcleos por DAPI ou HOECHST permitiu afirmá-lo. Não pode ser excluído que uma proporção fraca de proteína não foi internalizada. Por outro lado, parece que um motivo único peptídico de PAV1 é suficiente para direccionar uma proteína recombinante para a superfície das células. Após dissociação das células, a fluorescência localiza-se nas vesículas endossómicas de diferentes tamanhos. A proteína recombinante HiSê-Zebra-PAVl é 70 ΡΕ1259541 internalizada mas não parece ser nuclear apesar do domínio nls da proteína Zebra.
As células Hela são incubadas 6 ou 18 horas com a proteína recombinante His6-ZebraAnls-PAVl e fixadas (Figura 18A e 18B) ou dissociadas após 18 horas e são mantidas em cultura 18 horas antes da fixação (Figura 18C) . A partir das 6 horas, observa-se uma fluorescência nuclear que se acentua às 18 horas. As zonas nucleares indicadas pelas setas, apresentam uma fluorescência mais importante. Para as células dissociadas, uma fluorescência mais marcada localiza-se em redor dos nucléolos. Contrariamente à proteína recombinante His6-Zebra-PAV1, a proteína recombinante His6-ZebraAnls-PAVl desprovida do domínio nls numa localização nuclear. A sequência PAV1 parece localizar a proteína no núcleo.
Para as células Hela testemunhas (sem proteína) ou as células Hela incubadas com as proteínas recombinantes His6-Zebra e His6-ZebraAnls, não foi observada fluorescência . 6) Avaliação in vitro da actividade citotóxica da ribonuclease A (RNase A) conjugada com os péptidos. 5 mg de RNase A de bovino são dissolvidas em 1 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7 contendo 0,15 NaCl. 71 ΡΕ1259541 1 mg de SMCC é dissolvido em 50 pL de dimetilsulfóxido (solução final 20 mg/mL). A activação da RNase A é adicionada de 12,5 pL de solução de SMCC em 200 pL da solução de RNase A (proporção molar = 10 moléculas de SMCC para 1 molécula de RNase A). A reacção é realizada durante 30 minutos à temperatura do laboratório. A eliminação do excesso de reagente é realizada por centrifugação em membranas de ultrafiltração (limite de exclusão = 5 000 Da, Vivascience) seguida por 3 lavagens com um tampão 0,1 M fosfato de sódio contendo 0,15 M NaCl. A ligação com o péptido é realizada de seguida numa proporção molar dos péptidos:RNase A de 6:1 no tampão 0,1 M fosfato de sódio, pH 7, contendo 0,15 M NaCl durante 3 horas à temperatura ambiente. O excesso de péptido não acoplado é eliminado por centrifugação como a etapa precedente. A quantidade de péptido ligada à RNase A é avaliada pelo peso molecular das bandas obtidas após ligação num gel de SDS-Poliacrilamida a 15% em acrilamida. O resultado da electroforese, comparando a RNase A isolada (banda 1) com a RNase A acoplada com a SEQ ID NO: 72 ΡΕ1259541 10, é reproduzido na figura 6 onde são apresentados dois ensaios de ligação (bandas 2 e 3). A figura 7 mostra o resultado de uma electroforese, realizada do mesmo modo, e permitindo comparar a migração da RNase A isoladamente (banda 5) e a da SEQ ID NO: 14 isoladamente (banda 6) com aquela do produto de ligação da RNase A com a SEQ ID NO: 14 (dois ensaios: bandas 1 e 2), com a SEQ ID NO: 5 (banda 3) e com a SEQ ID NO: 10 (banda 4). A RNase A ligada a estes vectores de origem humana (SEQ ID NO: 10, 15 e 16) foi testada para a sua actividade citotóxica nas células HH9 em cultura por comparação com a RNase A nativa. a) Avaliação in vitro da actividade citotóxica da Rnase nas células HH9.
As células são semeadas de véspera nas placas de 96 poços à razão de 103 células por poço.
No dia seguinte, o sobrenadante é aspirado e substituído por 100 pL de meio contendo as diluições sucessivas de RNase A-vector ou de RNase A nativa e a cultura prosseguiu durante 72 horas.
Os poços são de seguida adicionados com 50 pL de uma solução de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 73 ΡΕ1259541 2,5-difenil tetrazólio) a 1 mg/mL no meio de cultura e cultivados durante 4 horas. 0 sobrenadante é removido e os poços são adicionados com 100 pL de dimetilsulfóxido. Após dissolução dos cristais, a coloração é lida a 550 nm.
Os resultados são calculados em percentagem da densidade óptica média obtida nos poços de células contendo as diluições das amostras a testar e da densidade óptica dos poços que só receberam meio. Estes resultados são representados graficamente na figura 8.
Como ressalta da figura 8, a RNase A nativa não tem nenhuma actividade citotóxica. A citotoxicidade média de 50% é obtida nas concentrações de RNase A-vector compreendidas entre 33 e 100 pg/mL, ou seja entre as concentrações molares de 2 a 7xl0“7 M. b) Avaliação in vitro da actividade citotóxica dos conjugados péptido-RNase nas células Hela.
Os diferentes conjugados péptido-RNase foram testados nas linhagens celulares variadas. Os resultados são expressos em IC50 que corresponde à concentração do conjugado péptido-RNase produzindo 50% de inibição do crescimento das células após 72 horas de cultura. 74 ΡΕ1259541 A tabela 11 resume os resultados obtidos. Parece que todos os conjugados possuíam actividades citotóxicas distintas e que alguns de entre estes têm pouco poder citotóxico.
Tabela 11
Linhas Celulares Péptido-ARNase HT29 H1299 HH9 HUVEC 3T3 MCF7 HeLa B16.F10 (HBP1)3- 70 100 20 80 40 90 60 25 (HBP1)2- nt* 25 nt nt nt nt nt nt HBP1-4- nt 25 nt nt nt nt 6 nt HBP3- 10 12 2 15 3 15 7 12 HBP6- 45 3 3 50 3 20 12 nt HBP-7 45 50 2 50 6 25 15 nt HBP8- nt nt nt nt nt nt >100 nt HBP9- nt nt 100 nt nt nt >100 nt HBP 10- >100 150 33 >100 50 150 25 nt HBP 11- >100 >100 60 >100 60 >100 20 nt HBP 12- >100 >100 >100 >100 40 >100 >100 nt HBP 13- 40 100 8 65 14 >100 3 nt HBP 14- >100 250 >100 >100 55 90 25 nt HBP 1047- >100 250 60 >100 55 90 30 >100 *nt: não 7) Avaliação in vitro da actividade citotóxica da RNase A conjugada com os péptidos em tumores humanos enxertados num murganho atímico (sem pêlo). 75 ΡΕ1259541 a) Protocolo 1. Murganhos fêmea sem pêlo de 6 semanas foram injectados subcutaneamente com 3xl06 células HH9 num volume de 50 pL no flanco esquerdo. No dia 17 após o enxerto, os tumores são medidos e os murganhos são divididos em 3 grupos: grupo 1 (7 murganhos) injectados com 100 pg de uma ligação SEQ ID NO: 10/RNase A em 50 pL de PBS, grupo 2 (7 murganhos) injectados com 50 pg de RNase A nativa em 100 pL de PBS, grupo 3 (6 murganhos) injectados com 50 pL de PBS. As injecções são administradas três vezes por semana nas mesmas condições. A cada vez, os tumores são medidos e o seu volume é calculado de acordo com a fórmula V = 4/3nxL2l (L>1) em que L corresponde ao diâmetro maior do tumor e 1 ao diâmetro menor do tumor.
Os resultados são apresentados graficamente na figura 9.
Como apresentado nesta figura, à partir do 33° dia, a progressão do volume dos tumores está directamente relacionada com a RNase A acoplada à SEQ ID NO: 10. Parece que a citotoxicidade é mais importante para algumas células tumorais que para outras. b) Protocolo 2. Os murganhos sem pêlo foram enxertados subcutaneamente com as células tumorais HH9 como descrito anteriormente. No dia 9 após o enxerto, os murganhos receberam 2 vezes por semana, por injecção peritumoral, 100 pg de Rnase, ou 65 pg de péptido (HBP3)2 ou 65 pg de péptido (HBP3)2 + 100 pg de Rnase, ou 100 pg de conjugado 76 ΡΕ1259541 péptido (HBP3) 2-RNase ou de conjugado HBP6-Rnase. No dia 26, os murganhos foram sacrificados e os seus tumores foram pesados. A inibição do crescimento dos tumores HH9 tratados pelos conjugados péptido-RNase é apresentada na tabela 12. A inibição do crescimento dos tumores dos murganhos tratados é calculada em relação ao peso médio dos tumores de murganho antes de receberem NaCl.
Tabela 12
Grupo de Rnase NaCl (HBP3)2 (HBP3)2 +RNase (HBP3)2-RNase HBP6- RNase HBP7- RNase Tumores* 1720 1560 1500 790 810 830 Inibição** - 10 13 54 53 52 *peso médio dos tumores de 6 murganhos do mesmo grupo em mg o
Os 3 conjugados péptido-RNase inibem o crescimento dos tumores de modo equivalente, enquanto que o péptido isolado ou adicionado de RNase tem pouco efeito. 8) Transfecção in vitro de células com o plasmídeo da luciferase com o auxílio dos péptidos. a) Transfecção de células CHO, 77 ΡΕ1259541 0 plasmídeo utilizado é o PCMV-LUC (6,4 kb) contendo o gene da luciferase sob o controlo do promotor do citomegalovirus humano.
Os complexos plasmideo-péptido são preparados adicionando 3 pg de plasmídeo em 50 pL de NaCl, 0,15 M e 3,3 nmoles de SEQ ID NO: 22 e 23 durante 15 minutos. Os complexos são preparados em triplicado. As células CHO são cultivadas em meio MEM Alpha completo contendo 6% de soro de vitela fetal e semeadas a 5xl04 células por poço de uma placa de 24 poços na véspera da experiência. Os poços são então eliminados de meio e adicionados com complexo plasmideo-péptido (3 pg de plasmídeo e 3,3 nmoles de péptido em 0,5 mL de meio completo durante 5 horas a 37 °C) . O meio é então substituído por meio completo e a cultura prossegue durante 18-20 horas. As células são então lavadas três vezes com PBS depois lisadas com 100 pL de tampão de lise (Promega) contendo 1% Triton X-100 e 2 mM DTT. É então extraído 15 pL do lisado para medir a luciferase com o kit Promega luciferina e 15 outros pL para calcular a quantidade de proteínas no lisado pelo teste de Bradford. As unidades relativas de luciferase (RLU) são apresentadas em mg de proteínas .
Os resultados são apresentados na tabela 13 abaixo. ΡΕ1259541 78
Tabela 13 RLU 106/mg de proteínas SEQ ID NO: 22 1,9 SEQ ID NO: 23 11,5
Os resultados mostram que a expressão da luciferase é possível complexando o plasmídeo com um dos vectores e que essa expressão é aumentada em 6 vezes (SEQ ID NO: 23) através da adição de PLH da apolipoproteína à SEQ ID NO: 22. b) Transfecção das células 3T3. - Técnica: o plasmídeo pCMVLUC (contendo o gene da luciferase) fornecido pela Qiagen é utilizado de acordo com as suas instruções. As células 3T3 são semeadas de véspera nas placas de 24 poços (8xl04 células/poços) num meio de cultura completo.
Os péptidos e o plasmídeo são complexados numa proporção de 1,6 nmoles/pg em 50 pL de NaCl 0,15 M durante 20 minutos à temperatura do laboratório. As células são então lavadas e o complexo péptido-plasmídeo adicionado sobre as células em 0,5 mL de meio completo. Após 5 horas de incubação a 37 °C, o meio de reacção é eliminado e é adicionado 1 mL de meio completo às células. Após 24 horas de cultura, as células são lavadas então 3 vezes com PBS e lisadas por 100 pL de tampão de lise (Promega) contendo 1% de 79 ΡΕ1259541
Triton X-100 e 2 mM DTT durante 15 minutos. 0 teste da luciferase é efectuado sobre o lisado de células após centrifugação. A quantidade de proteina no lisado é medida com o auxilio do teste de Bradford (Bio-Rad) e calculada de acordo com uma curva estabelecida com as globulinas gama de vitela. A actividade da luciferase é estimada a partir de 15 pL de lisado adicionado de 100 pL do reagente da luciferase contendo a luciferina (Promega). As unidades relativas (RLU) de luciferase são medidas num luminómetro (Berthold Systems) e apresentados em mg de proteina. - Resultados: a Quantidade de luciferase expressa pelas células transfectadas é apresentada na tabela 14 abaixo.
Tabela L4 pCMVLUC Isolado Péptido SEQ Péptido SEQ Péptido SEQ ID NO: 40 ID NO: 41 ID NO: 42 RLU 0,004* 1,9 0,9 5 * x 106/mg de proteínas O péptido complexado com o plasmideo permite a sua transferência para o interior das células assim como a expressão do gene da luciferase. A eficácia de transfecção expressa pela quantidade de luciferase (RLU/mg de proteínas) varie de acordo com os péptidos utilizados. O péptido SEQ ID NO: 42 e o péptido SEQ ID NO: 40 originam os valores, respectivamente de 5,5 vezes e 2,6 vezes mais elevados que o péptido SEQ ID NO: 41. 80 ΡΕ1259541 9) Avaliação da penetração de substâncias com o auxilio de transportadores ligados aos péptidos.
Referindo-se agora aos transportadores de acordo com a invenção, a tabela 15 abaixo apresenta alguns exemplos de transportadores e de substâncias de interesse para os quais eles apresentam uma forte afinidade.
Tabela 15 TRANSPORTADORES SUBSTÂNCIAS DE INTERESSE Péptido - Proteína A IgG humanas ou de coelho Péptido - Proteína G IgG bovinos, de cabra ou de murganho Péptido - F(abl)2 anti- Todos os IgG de uma mesma IgG espécie Péptido - IgG anti- Peroxidase e toda a molécula peroxidase contendo a peroxidase Péptido -F(abl)2 anti- Ribonuclease A RNase Péptido - Concavalina A Um grande número de glicoproteínas Péptido - Estreptavidina Biotina e toda a molécula -Avidina contendo biotina
Na tabela acima, o termo genérico "péptido" significa "sequência de aminoácidos de acordo com a invenção". 81 ΡΕ1259541 A proteína A é uma proteína isolada a partir de Staphyloccocus aureus que tem um peso molecular de 42.000 Da. A propriedade característica desta proteína tem a sua grande afinidade para a parte Fc de IgG. Esta propriedade permite-lhe fixar 2 a 4 moléculas de IgG sem interagir com os sítios activos dos anticorpos. A proteína A é interessante para as IgG humanas, de coelho e de rato, e certas IgG de murganho. A proteína G, na sua origem, é uma proteína de 30 000 a 35 000 Da isolada a partir da parede celular das estirpes bacterianas C ou D de estreptococos. A proteína G comercializada pela SIGMA é uma proteína recombinante de 17 000 Da que contém dois domínios de fixação de IgG. Tal como a proteína A, a proteína G possui uma forte afinidade para a fracção Fc de IgG, mas ela será sobretudo utilizada para as IgG bovinas, de murganho e de ovelha.
As F(ab')2 provêm de anticorpos. São utilizadas como exemplos de IgG de ovelha anti-IgG de murganho obtidas a partir de um imunossoro de ovelha. Elas são purificadas por uma cromatografia de afinidade, na qual a fase sólida é constituída por IgG de murganho fixada sobre as esferas de poliacrilamida-agarose. É uma purificação por um imunoabsorvente que permite a fixação específica de IgG de ovelha anti-IgG de murganho por uma reacção antigénio-anticorpo. Essa ligação antigénio-anticorpo é dissociada por um pH ácido. A digestão programada de IgG pelas enzimas proteoliticas permite obter fragmentos de anticorpos 82 ΡΕ1259541 diferentes. Com o auxílio de pepsina, obtêm-se fragmentos F(ab')2 bivalentes, de tamanho reduzido (PM=92 000 Da), e os fragmentos Fc totalmente digeridos em pequenos polipéptidos. A supressão do fragmento Fc permite reduzir o tamanho dos anticorpos e simplificar a ligação com os péptidos. A realização de um transportador péptido-F(ab')2 anti-IgG permitirá internalizar em forte quantidade uma grande variedade de IgG de murganho. O IgG anti-peroxidase é um anticorpo monoclonal de isotipo igGl que é isolado a partir do líquido ascítico de murganho. Ele é purificado por uma cromatografia de afinidade em proteína G (GammaBind Plus Sepharose: Pharmacia) . Esse anticorpo apresente uma forte afinidade para a peroxidase, e de igual modo, para todas as moléculas contendo peroxidase. A peroxidase (PO) é uma enzima extraída de rábano possuindo um peso molecular de 44 000 Da, que pode ser associada muito facilmente a numerosas moléculas. A realização de um transportador péptido-IgG anti-PO permitirá internalizar, nas células, a PO e toda a substância contendo a PO. A concanavalina, extraída de Canavalia ensiformis, é uma lectina que apresenta uma afinidade para os agrupamentos α-D-manosilo e α-D-glucosilo terminais das proteínas. Esta propriedade permite reagir com numerosas glicoproteínas. A realização de um transportador péptido-concanavalina permitirá internalizar, nas células, numerosas glicoproteínas ou moléculas glicolisadas. 83 ΡΕ1259541 A estreptavidina, molécula de 60 000 Da extraída de Streptomyces avidinii, e a avidina, extraída da clara do ovo, possuem ambas quatro sítios de reconhecimento para a biotina. A sua constante de afinidade para esta molécula pequena é muito elevada (KD =10“13 Μ) o que lhe permite interagir com todas as substâncias contendo a biotina. A realização de um transportador péptido-estreptavidina ou péptido-avidina permitirá internalizar, nas células, a biotina e toda a molécula contendo biotina.
Os exemplos detalhados abaixo ilustram a realização e a utilização desses transportadores. a) Avaliação da penetração da ribonuclease A bovina (RNase A) transportada por um transportador péptido-F(ab')2, anti-RNase nas células.
Uma digestão programada de IgG anti-RNase por uma enzima proteolítica, a pepsina, permite a obtenção de fragmentos F(ab')2. Esta digestão, que se efectua numa solução de acetato de sódio pH 4,5 com 2% de pepsina, permite a fragmentação do fragmento Fc de IgG sem alterar os sítios activos de anticorpos. Dois mg de anticorpos F(ab')2 anti-RNase em 1 mL de tampão fosfato de potássio 0,1 M pH 7,4 são adicionados a 110 pg de SMCC [ 4 — (N— maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimidilo] em 11 pL de dimetilsulfóxido. A solução é incubada durante 45 minutos à temperatura do laboratório. A eliminação do excesso de reagentes é feita por centrifugação através de 84 ΡΕ1259541 membranas de ultrafiltração (limite de exclusão = 10 000 Da, Vivascience), seguida por três lavagens em tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7 contendo 0,5 M de NaCl e 5 mM de EDTA. A ligação com o péptido é feita de seguida numa relação molar de 6 péptidos para 1 F(ab')2 em tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7, contendo 0,5 M de NaCl e 5 mM de EDTA durante três horas à temperatura do laboratório. De seguida, o excesso de péptido não acoplado é totalmente eliminado por centrifugação através de membranas de ultrafiltração, como na etapa anterior.
Os transportadores [péptido-F(ab')2 anti-RNase] são adicionados à ribonuclease A num meio de cultura completo e a solução é incubada durante 1 hora à temperatura do laboratório. A relação molar desta reacção é de 2 RNase/1 F(ab')2.
Para avaliar ao microscópio a penetração da RNase A, as células são cultivadas na presença de complexos [péptido-F(ab')2 anti-RNase]-RNase A diluídos a concentrações decrescentes de RNase A (de 100 a 6 pg/mL) num meio de cultura durante 4 horas a 37 °C.
No final da incubação, as células são lavadas três vezes com PBS, depois fixadas 15 minutos em etanol absoluto a -20 °C. A penetração da RNase é avaliada após incubação durante 1 hora com um anticorpo anti-RNase acoplada a peroxidase. As células são seguidamente lavadas com PBS e a actividade da peroxidase é revelada pela 85 ΡΕ1259541 diaminobenzidina na presença de H2O2. Para medir a quantidade de RNase A internalizada, as células são tripsinizadas, transferida nos microtubos e contadas. Elas são lavadas duas vezes por centrifugação com PBS após o sedimento ser colocado em suspensão em 220 pL de tampão de lise (tampão tris, 0,1 M, pH 8, 0,5% Nonidet 40). A quantidade de RNase A presente no lisado celular é medida por ELISA nas placas sensibilizadas com os anticorpos de coelho anti-RNase A e revelada por um conjugado anticorpo de coelho anti-RNase A acoplado à peroxidase, por referência a uma curva padrão estabelecida com a RNase.
Os resultados reagrupados na tabela 16, ilustram a internalizaçâo da RNase A pelo transportador F(ab')2 anti-RNase e a internalizaçâo da RNase acoplada de modo covalente ao péptido no interior das células HeLa.
Tabela 16
Transportador + RNase A Péptido -RNase A RNase nativa Quantidade de RNase 476 433 0 internalizada (pg/104 células) b) Avaliação da penetração de IgG de murganho (IgG) transportados por um transportador péptido-F' (ab')2, anti-IgG de murganho nas células. 86 ΡΕ1259541
Os transportadores péptido-F (ab')2 anti-IgG de murganho são obtidos de acordo com a técnica descrita anteriormente.
Os transportadores [péptido-F(ab')2 anti-_IgG] são adicionados aos IgG de murganho no tampão NaCl 0,5 Μ. A solução é incubada durante 1 hora à temperatura do laboratório. A relação molar desta reacção é de 1 F (ab')2/l IgG. Após uma hora de incubação, os complexos formados são diluidos num meio de cultura completo.
Para avaliar ao microscópio a penetração de IgG, as células são cultivadas na presença de complexos [péptido-F(ab')2 anti-IgG]-IgG diluidos a concentrações decrescentes de IgG (de 100 a 6 pg/mL) num meio de cultura completo durante 4 horas a 37 °C.
Ao fim da incubação, as células são lavadas três vezes com PBS, depois fixadas 15 minutos em etanol absoluto a -20 °C. A penetração de IgG é avaliada após incubação durante 1 hora com um anticorpos anti-IgG acoplado à peroxidase. As células são seguidamente lavadas com PBS e a actividade da peroxidase é revelada pela diaminobenzidina na presença de H2O2.
Para medir a quantidade de IgG internalizada, as células são tripsinizadas, transferidas para microtubos e contadas. Estas são lavadas duas vezes por centrifugação com PBS, depois o depósito é colocado em suspensão em 87 ΡΕ1259541 220 μL de tampão de lise (tampão tris 0,1 M, pH 8, 0,5% Nonidet 40) . A quantidade de IgG presente no lisado celular é medida por ELISA em placas sensibilizadas com anticorpos de ovelha anti-IgG e revelada por um conjugado anticorpo de ovelha anti-IgG acoplado a peroxidase, por referência a uma curva padrão estabelecida com as IgG. A actividade da peroxidase é revelada com ortodianisidina e H2O2.
Um mesmo transportador [péptido-F(ab')2 anti-IgG] pode transportar uma grande variedade de IgG de murganho no interior das células.
Os resultados reagrupados na tabela 17, ilustram a internalização dos diferentes IgG de murganho ou eventualmente de rato no interior das células HeLa por intermédio do mesmo transportador [péptido-F(ab')2 anti-IgG] .
Tabe^ La 17 Quantidade de IgG internalizada (yg/104 células) Transportador + IqG anti-p53 1100 Transportador + IqG anti-p21 1200 Transportador + IqG anti-PO 695 Transportador + IqG biotinilada 153 Transportador + IqG de murganho 5960 88 ΡΕ1259541
Transportador + F.4.1 _3200_ _F.4.1.__1299_ IgG anti-p53: anticorpo monoclonal de muríneo específico da proteína p53. IgG anti-p21: anticorpo monoclonal específico da proteína p21 derivada de um hibridoma rato-rato, que reage com os anticorpos anti-lgG de murganho. IgG anti-PO: anticorpo monoclonal de muríneo específico da peroxidase F.4.1: anticorpo monoclonal de muríneo anti-ADN que por si só penetra no interior das células._ c) Avaliação da penetração da peroxidase (PO) ou de moléculas contendo a Peroxidase transportadas por um transportador péptido-IgG anti-PO nas células.
Duas mg de anticorpo IgG monoclonal específico para a peroxidase ou seu fragmento F(ab')2 em 1 mL de tampão fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,4 são adicionadas a 110 pg de SMCC [4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidilo] em 11 pL de dimetilsulfóxido. A solução é incubada durante 45 minutos à temperatura do laboratório. A eliminação do excesso de reagentes faz-se por centrifugação em membranas de ultrafiltração (limite de exclusão = 10 000 Da, Vivascience), seguido de três lavagens em tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7 contendo 0,5 M de NaCl e 5 mM de EDTA. O acoplamento com o péptido faz-se a seguir numa relação molar de 6 péptidos para 1 IgG ou 1 F(ab')2 no tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7, contendo 0,5 M de NaCl 89 ΡΕ1259541 e 5 mM de EDTA durante três horas à temperatura do laboratório. A seguir, o excesso de péptido não acoplado é totalmente eliminado por centrifugação em membranas de ultrafiltração, como na etapa anterior.
Estes transportadores [péptido-IgG anti-PO] são adicionados à peroxidase ou à peroxidase biotinilada no tampão 0,5 M NaCl. A solução é incubada durante 1 hora à temperatura do laboratório. A relação molar desta reacção é de 2 PO/1 IgG ou F(ab')2.
Para avaliar ao microscópio a penetração da PO ou das moléculas contendo a PO, as células são cultivadas na presença dos complexos [péptido-IgG anti-PO]-PO em concentrações decrescentes de PO ou de moléculas contendo a PO (100 a 6 pg/mL) num meio de cultura durante 4 horas à 37°C.
No final da cultura, as células são lavadas três vezes com PBS, depois fixadas durante 15 minutos em etanol absoluto a -20 °C. As células são a seguir lavadas com PBS e a penetração da PO ou das moléculas contendo a PO é avaliada pela actividade da peroxidase revelada por diaminobenzidina na presença de H2O2 para medir a quantidade de PO internalizada, as células são tripsinizadas, transferidas para microtubos e contadas. Estas são lavadas duas vezes por centrifugação com PBS, depois o depósito é colocado em suspensão em 220 pL de tampão de lise (tampão tris 0,1 M, pH 8, 0,5% de Nonidet 90 ΡΕ1259541 40). A quantidade de PO presente no lisado celular é medida por ELISA em placas sensibilizadas com anticorpos de murganho anti-peroxidase e reveladas com orto-dianisidina e H2O2 por referência a uma curva padrão de PO.
Os resultados reagrupados na tabela 18, ilustram a internalização da PO e da PO-biotinilada no interior das células HeLa por intermédio do transportador [péptido-IgG anti-PO].
Tabela 18
Peroxidase (PO) PO-biotinilada Quantidade de moléculas internalizadas (pg/104 células) 2100 1700 d) Avaliação da penetração de IqG transportada por um transportador péptido-proteina A nas células.
Um mg de proteína A em 0,5 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 7 é suplementado com 120 pg de SMCC [4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato de succinimi-dilo] em 12 pL de dimetilsulfóxido. A solução é incubada durante 45 minutos à temperatura do laboratório. A eliminação do excesso de reagentes faz-se por centrifugação em membranas de ultrafiltração (limite de exclusão = 10 000 Da, Vivascience), seguido de três lavagens em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7 contendo 0,15 M de NaCl. 91 ΡΕ1259541 0 acoplamento com o péptido faz-se a seguir numa relação molar de 6 péptidos para 1 proteína A no tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7, contendo 0,15 M de NaCl durante três horas à temperatura do laboratório. A seguir, o excesso de péptido não acoplado é totalmente eliminado por centrifugação em membranas de ultrafiltração, como na etapa anterior.
Estes transportadores [péptido-proteína A] são adicionados às IgG no tampão 0,15 M de NaCl. A solução é incubada durante 20 minutos à temperatura do laboratório. A relação molar desta reacção é de 2 IgG/1 proteína A.
Para avaliar ao microscópio a penetração das IgG, as células são cultivadas na presença dos complexos [péptido-proteína A]-IGG diluídos em concentrações decrescentes de IgG (100 a 6 pg/mL) num meio de cultura, durante 4 horas a 37°C.
No final da cultura, as células são lavadas três vezes com do PBS, depois fixadas durante 15 minutos em etanol absoluto a -20 °C. A penetração das IgG é avaliada após incubação durante 1 hora com um anticorpo anti-IgG acoplado a PO ou com apenas PO para as IgG anti-PO. Esta etapa não é necessária aquando da internalização de IgG conjugadas a PO (por exemplo: IgG de coelho-PO). As células são a seguir lavadas com PBS e a actividade da peroxidase é revelada por diaminobenzidina na presença de H2O2. 92 ΡΕ1259541
Para medir a quantidade de IgG internalizada, as células são tripsinizadas, transferidas para microtubos e contadas. Estas são lavadas duas vezes por centrifugação com PBS, depois o depósito é colocado em suspensão em 220 pL de tampão de lise (tampão tris 0,1 M, pH 8, 0,5% de Nonidet 40). A quantidade de IgG presente no lisado celular é medida por ELISA em placas sensibilizadas com o anticorpo anti-IgG e revelada por um conjugado anticorpos anti-lgG acoplado a peroxidase, por referência a uma curva padrão estabelecida com as IgG. A actividade da PO é revelada com orto-dianisidina e H2O2. Os resultados reagrupados na tabela 19, ilustram a internalização de diferentes IgG no interior das células HeLa por intermédio do transportador [péptido-proteina A].
Tabela 19
IgG de coelho-PO IgG de murganho anti-PO IVIg Quantidade de IgG internalizada (pg/104 células) 10800 480 26000 10) Transporte do anticorpo anti-CEA nas células de cancro do cólon. a) As Experiências têm sido realizadas com o Ac anti-CEA 35A7 e os péptidos de sequência SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 35 também designados respectivamente 93 ΡΕ1259541 1047, ΗΒΡ7 e HBP10. 0 péptido 1047 foi acoplado ao 35A7 e a Herceptin®. Após controlo das actividades dos anticorpos dos conjugados por ELISA, a internalização foi estudada por imunofluorescência em comparação com o anticorpo de partida a 37 °C e 4°C. Nas células LS174T, de carcinoma eólico humano CEA+, o conjugado 35A7-1047 internaliza desde 1 h 15 enquanto que ο 35A7 não mostra nenhuma internalização até às 5 h. Em células SKOv3, de carcinoma ovariano humano ErbB2+, o conjugado Herceptin®-1047 apresenta uma internalização rápida próxima da obtida comHerceptin®. Após radiomarcação com 1251, os conjugados mostram uma imunorreactividade próxima do Ac de partida no Ag imobilizado em Sepharose. Uma análise em filtração em gel demonstra a ausência de agregado. b) Comparação dos péptidos 1047, HBP7 e HBP10. Esta comparação refere-se apenas ao Ac 35A7. - Experiências in vitro
Um estudo cinético de internalização dos diferentes conjugados (35A7-1047, 35A7-HBP7 e 35A7-HBP10) em células LS174T mostram uma internalização mais importante com o péptido HBP7 do que com o 1047 e ο HBP10. Estes dois péptidos apresentam resultados comparáveis. Em células SKOv3, CEA-, 1047 e HBP7 induzem uma internalização comparável à obtida em LS174T enquanto que HBP10 apresenta um resultado dimunuído em metade. - Experiências in vivo 94 ΡΕ1259541
Os 3 conjugados 35A7-1047, 35A7-HBP7 e 35A7-HBP10 marcados com I têm sido estudados nos murganhos sem pelo portadores de tumores LS174T em comparação com ο 35A7 marcado. 0 131I-35A7 mostra uma captação tumoral de cerca de 13% da dose injectada por grama (% ID/g) 6 h pós-injecção. Esta captação situa-se entre 20 e 25% ID/g de tumor 24 h pós-injecção. O conjugado 125I-35A7-1047 mostra uma eliminação um pouco mais rápida e uma captação tumoral ligeiramente diminuída em relação ao 131I-35A7 (18,6 vs 21,2% ID/g a 24 h) . O conjugado 125I-35A7-HBP7 mostra uma captação hepática importante desde as 6 h. Isto leva uma eliminação rápida e uma fraca captação tumoral (8,5% ID/g a 24 h). O conjugado 125I-35A7-HBP10, com uma biodistribuição muito próxima da do anticorpo nativo, mostra a melhor captação tumoral dos 3 conjugados. c) O efeito de indução de internalizaçâo pelo péptido 1047 é particularmente visível no 35A7, Ac dirigido contra o CEA que é um Ag que não internaliza. O efeito é menos evidente em Herceptin® que internaliza rapidamente após fixação ao seu Ag, ErbB2.
As Experiências in vitro realizadas com 1047, HBP7 e HBP10 mostram que os três péptidos induzem uma internalizaçâo do 35A7. HBP7 parece ser o mais activo mas HBP10 é o que parece o melhor no que respeita à especificidade do anticorpo (efeito marcado em células CEA+, efeito diminuído em células CEA-). As Experiências in vivo confirmam os resultados obtidos in vitro. 95 ΡΕ1259541 d) As figuras 11 a 16 em anexo ilustram os resultados a seguir. - Os péptidos: • 1047: 2420 Da => em Ac anti-ACE e anti-erbB2 • HBP7: 1827 Da => em Ac anti-ACE isolado • HBP10: 1696 Da => em Ac anti-ACE isolado - O Acoplamento:
Após colocação no ponto, as condições definidas para um acoplamento (evitando a formação de agregados de
Anticorpos) são: 18 SMCC/Ig e 12 pept/Ig-SMCC - Ensaio de internalização em células em cultura: • As figuras 11 A e B representam o teste 1: em células A375 (ACE negativas) e 5F12 (ACE positivos), 40 000 células por poço (caixa 24 poços). Incubação com o Anticorpo (Ac) nativo: 35A7 versus Ac conjugado: 35A7-1047, 4h a 37 °C. Lavagens, fixação, incubação com Ac secundário-Peroxidase, revelação OPD, leitura 490 nm. DO em função da concentração do Anticorpo em pg/mL. • A figura 12 representa o ensaio do teste 1 com os anticorpos marcados com iodo 125. • As figuras 13 A e B representam o teste 2: em células A375 (erbB2 negativos) e SKOV3 (erbB2 positivos), 40 000 células por poço (caixa 24 poços) . Incubação com o Anticorpo (Ac) nativo: Herceptina versus Ac conjugado: HER-1047, 4h a 37 °C. Lavagens, fixação, incubação com Ac secundário-Peroxidase, revelação OPD, leitura 490nm. 96 ΡΕ1259541 • As figuras 14 A e B representam o teste 3: diminuindo a concentração dos Anticorpos e fazendo variar a duração da incubação 1 h ou 4h. • As figuras 15 A a F representam o teste 4: protocolo idêntico mas comparando os três péptidos (1047-HBP7-HBP10) em células SK0V3 (ACE -) , e LS174T (ACE+). As figuras 16 A a F ilustram a experimentação in vivo: distribuição dos Anticorpos 35A7-1047, 35A7-HBP7, 35A7-HBP10 radiomarcados com iodo 125, versus 35A7-iodo 131; Murganho Swiss nu/nu enxertados com LS174T (carcinoma eólico humano, CEA+); co-injecção de 5 pg Ac-pept* e de 5ug de Ac* nativo por murganho, em i.v.; dissecação 6h/24h pós-injecção, expressão dos resultados em percentagem de dose injectada por grama de tecido. Barra negra: Ac conjugado - 1251 Barra branca: Ac nativo- 1311. 11) Transporte de partículas com o auxílio de um derivado péptido-IgG. 0 vector utilizado nos exemplos seguintes é um anticorpo monoclonal de murganho (IgGl) acoplado ao péptido de sequência ID NO: 10 (1047). O acoplamento do péptido ao anticorpo monoclonal foi realizado como descrito anteriormente. a) Esferas fluorescentes: Preparação do complexo péptido IgG-microsfera:
As microsferas de poliestireno fluorescentes de 70 a 900 nm transportando anticorpos anti-IgG de murganho à 97 ΡΕ1259541 sua superfície (Estapor, Merck eurolab) são diluídas de 1/100 em NaCl 0,15 M. São adicionados 4 pL desta preparação a um volume de 50 pL contendo 10 pg de IgG monoclonais de murganho conjugadas com o péptido SEQ ID NO: 2 e deixadas em incubação durante 30 minutos à temperatura do laboratório. Este meio reaccional é depositado sobre as células H1299 semeadas (5xl04 células/poço) de véspera durante 18 horas.
As células são lavadas e observadas ao microscópio de fluorescência: as células incubadas com os complexos péptido-IgG-esferas fluorescentes são fortemente marcadas, qualquer que seja o tamanho das esferas dos controlos (esferas fluorescentes sem péptido-IgG, ou com as IgG normais) estas são negativas. - Ouro coloidal: preparação do complexo péptido-IgG-ouro coloidal:
As esferas de ouro coloidal (British Biocell
International) de 10 nm são complexadas com as IgG monoclonais de murganho, previamente conjugadas com o péptido 1047, de acordo com as instruções do fabricante numa relação de 750 pg de IgG para 1 mL da solução de ouro coloidal. Para a penetração do complexo nas células, o depósito da suspensão é diluída para metade no meio de cultura. c) Avaliação da internalização dos complexos péptido-IgG-esferas. 98 ΡΕ1259541 fluorescentes e - ouro coloidal ao microscópio electrónico.
Após as etapas de conjugação, as preparações são depositadas sobre as células H1299 cultivadas desde a véspera, como descrito anteriormente. Após 18 horas de cultura para o complexo IgG-esferas fluorescentes ou 4 horas para o complexo IgG-ouro coloidal, as células são lavadas com PBS três vezes, depois fixadas numa solução de glutaraldeido a 1,6% no tampão fosfato de sódio, 0,1 M durante uma hora, depois tratadas como habitualmente para o microscópio electrónico. d) Resultados:
Os complexos péptidos IgG-microsferas de 70 nm (figura 19) assim como os complexos péptido-IgG ouro coloidal (figura 20) são visíveis nas vesículas e no retículo endoplasmático do citoplasma e em redor da região golgiana 12) Transporte da doxorrubicina.
As antraciclinas como a doxorrubicina estão entre os agentes mais activos no tratamento dos cancros humanos. O seu modo de entrada nas células não é ainda conhecido. O que se sabe é que estas são rapidamente transportadas no núcleo das células. A sua toxicidade, provavelmente devida à sua ampla difusão em todo o organismo, é uma limitação no 99 ΡΕ1259541 tratamento, empregando a utilização de uma grande quantidade.
Pretendeu-se definir se o acoplamento da doxorrubicina aos péptidos HBP melhorava o seu poder de inibição de crescimento dos tumores humanos reduzindo a toxicidade do fármaco. a) Acoplamento de péptidos com doxorrubicina. A doxorrubicina cujo grupo aminado está protegido é tratado pelo ácido 4-maleimidobutirico na presença de carbodiimida, o que permite a formação de uma ligação éster entre o hidroxilo da doxorrubicina e o carboxilo do ácido maleimidobutirico. 0 grupo maleimida assim introduzido na doxorrubicina reage com a cisteina presente no terminal -C ou -N do péptido.
Seguindo o esquema geral, têm sido preparados os conjugados seguintes: 1047-_doxorubicina; HBP1- doxorubicina; HBP3-doxorubicina; HBP6-doxorubicina; HBP7-doxorubicina; HBPlO-doxorubicina; HBP13-doxorubicina. b) Avaliação in vitro da actividade biológica da doxorrubicina conjugada aos péptidos.
Para avaliar a actividade biológica dos conjugados péptido-doxorrubicina, é medida a inibição de crescimento das células tumorais em cultura. 100 ΡΕ1259541
As células são semeadas de véspera em placas de 96 poços na proporção de 103 células por poço. No dia seguinte, o sobrenadante é aspirado e substituído por 100 pL de meio contendo as diluições sucessivas de péptido-doxorrubicina ou de doxorrubicina nativa (10‘6 M - 10~8 M) e a cultura prosseguiu durante 48 horas.
Os poços são a seguir adicionados de 50 pL de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil-tetrazolium) a 1 mg/mL no meio de cultura e cultivados durante 4 horas. O sobrenadante é aspirado e os poços são suplementados com 100 pL de dimetilsulf óxido. Após dissolução dos cristais, a coloração é lida a 550 nm. Os resultados são calculados em percentagem da densidade óptica média obtida nos poços de células contendo as diluições das amostras a testar e da densidade óptica dos poços que só receberam meio. Estes são expressos em concentração molar dando 50% de inibição de crescimento das células e são relacionadas na tabela 20 a seguir. ΡΕ1259541 101
Tabela 20
Linhagens celulares H1299 HH9 HeLa B16.F10 K562 K562R * MCF7 MCF7R * Doxorrubicina nativa 3x10"7 3xl0"7 2xl0"7 lxl O"7 4xl0"8 3xl0"6 2xl0"7 2xl0"4 (HBPl)3-Doxo 7x1 CT7 nt* nt* nt* 2x1 CT7 5x10"6 6x10~7 lxl0~4 (HBP3)2-DOXO nt* nt* nt* nt* lxl CT7 3xl0"6 5x10_1 2, 5xl0~4 ΗΒΡβ-DoxO nt* nt* nt* nt* 3x10"7 5x10"6 6x10"7 6, 5xl0~4 HBP7- Doxo nt* nt* nt* nt* lxl CT6 lxl O-5 7x10-7 4xl0~4 HBPlO-Doxo nt* nt* nt* nt* 8xl0“7 lxl O"5 5x10~7 3, 5xl0"4 HBP13-DOXO nt* nt* nt* nt* 4x10 7 5x10"5 6x10-7 4,5x10"4 HBP-1047-DOXO 7x10-7 nt* 2,5x1 O'7 5xl0"7 2xl0"7 2xl0~7 2xl0“7 8xl0~7 lxlO"3
Parece que, in vitro, a sensibilidade das células aos conjugados péptido-doxorrubicina é da mesma ordem de grandeza que o da doxorrubicina nativa. As linhagens resistentes à doxorrubicina (K562R e MCF7R) necessitam de uma maior concentração de doxorrubicina. c) Avaliação in vivo da actividade antitumoral dos conjugados péptido-doxorrubicina.
Os murganhos sem pelo são injectados com 3xl06 células HH9 de forma subcutânea no flanco. O dia 19 após a enxertia das células, os tumores são medidos e são formados 4 grupos de 6 murganhos que recebem, em injecção 102 ΡΕ1259541 peritumoral, seja NaCl, seja doxorrubicina nativa ou os conjugados 1047-doxorubicina ou HBPl-doxorubina na proporção de 30 pg de doxorrubicina ou equivalente de conjugados a cada duas semanas. Os tumores são medidos e o seu volume calculado. Ao dia 60, após a injecção de um total de 120 pg de doxorrubicina ou equivalente, o crescimento dos tumores é respectivamente inibido em 77% com o conjugado 1047-doxorubicina, em 84% com o conjugado HBPl-doxorubicina e em 79% com apenas doxorrubicina, o que demonstra que in vivo os conjugados são, pelo menos, tão eficazes como a doxorrubicina nativa. d) Avaliação in vivo da toxicidade dos conjugados péptido-doxorrubicina. A injecção por via intravenosa de doxorrubicina ou de doxorrubicina-péptido permite comparar a toxicidade das diferentes preparações. A estimativa faz-se pela perda de peso dos murganhos (5 murganhos por grupo). Duas experiências têm sido realizadas:
Experiência 1: os murganhos receberam 200 hg por injecção com 3 dias de intervalo, seja 600 pg de doxorubicina ou equivalente péptido-doxorrubicina no total.
Os murganhos são pesados no dia seguinte à última inj ecção. 103 ΡΕ1259541
Experiência 2: Os murganhos receberam 2 injecções de 200 pg de doxorrubicina ou equivalente péptido-doxorrubicina com uma semana de intervalo, ou seja 400 pg no total e são pesados no dia seguinte à última injecção. A tabela 21 a seguir relaciona a perda de peso dos murganhos tratados com a doxorrubicina ou dos conjugados péptido-doxorrubicina. A perda de peso média é calculada por relação ao peso médio dos murganhos que receberam NaCl.
Tabela 21
Grupos NaCl Doxo. HBP3 HBP6 HBP7 HBP10 HBP13 Exp. 1 Peso 23,11 16,06 21,45 20,3 19,11 21,15 **nt Perda* _ 31* 8 12 18 9 — Exp. 2 Peso 31,4 26,7 29,5 29,5 31,4 32,5 30 Perda* _ 15 6 6 0 0 4 * - 9-• o **: não testado À dose de 600 pg, os murganhos que receberam doxorubicina nativa perdem 31% do seu peso enquanto que os que receberam o péptido-doxorrubicina só perdem 18 a 8% do seu peso. A dose de 400 pg desencadeia uma perda de peso de 15% nos murganhos que receberam a doxorrubicina nativa, enquanto que com os conjugados péptido-doxorrubicina, a perda não é significativa. 104 ΡΕ1259541 13) Transporte de ubiquitina. A ubiquitina é um polipéptido de 76 aminoácidos, altamente conservado durante a evolução, presente no organismo em todos os eucariotas, de peso molecular de 8500 daltons. A ubiquitina intracelular está implicada nas diversas funções celulares tais como a degradação das proteínas. Após a sua ligação com ubiquitina, a progressão do ciclo celular, a regulação da activação do factor de transcrição NF-κΒ. A ubiquitina extracelular tem a propriedade de inibir a proliferação das células das estirpes hematopoiéticas () por indução de apoptose. a) Acoplamento de ubiquitina ao péptido. 1 mg de ubiquitina em 0,3 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7 contendo 0,15 M NaCl são adicionados de 390 pg de SMCC (4-(N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidilo) em 39 pL de dimetilsulfóxido e a solução é incubada 30 minutos à temperatura do laboratório. A eliminação de excesso de reagente faz-se por centrifugação em membranas de ultrafiltração (limite de exclusão = 5000 daltons, Sartorius), seguido de três lavagens em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7 contendo 0,15 M NaCl. O acoplamento com o péptido faz-se a seguir numa relação molar de 5 péptidos para 1 ubiquitina em 1 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH7, à temperatura do laboratório. A seguir, o excesso de péptido não acoplado é 105 ΡΕ1259541 eliminado por centrifugação em membranas, como na etapa anterior. b) Avaliação da penetração dos conjugados péptido-ubiquitina. A avaliação da penetração dos conjugados péptido-ubiquitina faz-se com conjugados preparados com péptidos que comportam uma biotina do lado N-terminal.
As células HT29 são semeadas de véspera em placas de 24 poço (5xl04/poço).
Os diferentes conjugados péptidos (biotinilados)-ubiquitina são adicionados a concentrações decrescentes (100 a 25 pg/mL) no meio de cultura durante 4 horas a 37°C. No final da cultura, as células são lavadas três vezes com do PBS, depois fixadas 15 minutos em etanol a -20 °C. A penetração do conjugado péptido-biotina-ubiquitina é avaliada após incubação durante 60 minutos com avidina acoplada a peroxidase. A actividade da peroxidase é revelada por diaminobenzidina na presença de H2O2. A penetração, dependente da concentração dos conjugados no meio de cultura, é avaliada ao microscópio pela intensidade da coloração expressa por cruzes. 106 ΡΕ1259541
Tabela 22
Concentração(pg/mL) 100 50 25 Ubiquitina nativa +/-* +/- +/- 1047-ubiquitina +++ ++ + HBP7-ubiquitina ++++ +++ ++ HBP10-ubiquitina +++ ++ ++ ++++: muito intenso; +++ intenso; ++: positivo; + fracamente positivo; +/- no limite da leitura. A tabela 22 acima indica a penetração dos conjugados péptido-ubiquitina nas células. c) Avaliação da actividade biológica dos conjugados péptido-ubiquitina. A proliferação das células é medida pelo teste ao MTT. As células Daudi (3xl04 células/poço) são cultivadas em placas de 96 poços durante 48 horas a 37 °C no meio de cultura RPMI completo suplementado com concentrações decrescentes (200-12,5 pg/mL) de ubiquitina nativa ou conjugada aos péptidos e a cultura prosseguiu durante 48 horas.
Os poços são a seguir adicionados de 50 pL de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil-tetrazolium) a 1 mg/mL no meio de cultura e cultivados durante 4 horas._ O sobrenadante é aspirado e os poços são suplementados com 100 pL de dimetilsulf óxido. Após dissolução dos cristais, a coloração é lida a 550 nm. 107 ΡΕ1259541 A tabela 23 indica a inibição do crescimento das células Daudi pelos conjugados péptido-ubiquitina. Os resultados, apresentados na tabela 23, são calculados em percentagem da densidade óptica média obtida nos poços de células contendo as diluições das amostras a testar e da densidade óptica dos poços que só receberam meio. Estes são expressos em concentração dando 50% de inibição de crescimento de células.
Tabela 23
Concentração(pg/mL) 200 100 50 Ubiquitina nativa 0* 0 0 1047-ubiquitina 60 21 0 HBP7-ubiquitina 96 68 35 HBP10-ubiquitina 16 11 0 *% de inibição calculada em relação ao crescimento das células que receberam apenas meio de cultura A ubiquitina nativa não inibe o crescimento das células Daudi. O conjugado preparado com o péptido HBP10 inibe pouco, ainda que o conjugado preparado com o péptido HBP7 seja eficaz e dê ainda 35% de inibição a 50 pg/mL. O conjugado preparado com o péptido 1047 dá valores de inibição intermédios. 108 ΡΕ1259541 14) Transporte do citocromo C. O citocromo C é uma hemoproteína que constitui o complexo lipido-proteinas mitocondriais. Este desempenha um papel vital nas oxidações celulares das plantas e dos mamíferos. É formado por uma única cadeia polipeptídica de 104 aminoácidos (massa molecular 13000 daltons) com o grupo hemo ligado aos resíduos cisteínas. A libertação do citocromo C das mitocôndrias no citosol desencadeia uma apoptose das células por activação das caspases. a) Acoplamento de citocromo C aos péptidos. 4 mg de citocromo C em 930 pL de tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7 contendo 0,15 M NaCl são adicionados a 540 pg de SMCC (4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidilo) em 54 pL de dimetilsulfóxido e a solução é incubada 30 minutos à temperatura do laboratório. A eliminação do excesso de reagente faz-se por centrifugação em membranas de ultrafiltração (limite de exclusão = 10000 daltons, Sartorius), seguido de três lavagens em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH7 contendo 0,15 M NaCl. O acoplamento com o péptido faz-se a seguir numa relação molar de 10 péptidos para 1 citocromo C em 1 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7 contendo 0,15 M NaCl, durante 3 horas à temperatura do laboratório. A seguir, o 109 ΡΕ1259541 excesso de péptido não acoplado é eliminado por centrifugação/filtração como na etapa anterior. b) Avaliação da penetração dos conjugados péptido-citocromo C nas células. A avaliação da penetração dos conjugados péptido-citocromo C faz-se com conjugados preparados com péptidos contendo uma biotina do lado N-terminal.
As células H1299 são cultivadas na presença dos diferentes conjugados péptidos (biotinilados)-citocromo C a concentrações decrescentes (100 a 25 pg/mL) no meio de cultura durante 4 horas a 37°C. No fim da cultura, as células são lavadas três vezes com PBS, depois fixadas 15 minutos em etanol a -20 °C. A penetração do conjugado péptido-biotina-citocromo C é avaliada após incubação durante 60 minutos com avidina acoplada a peroxidase. As células são a seguir lavadas com o PBS e a actividade da peroxidase é revelada por diaminobenzidina na presença de H202. A penetração dependente da concentração dos conjugados no meio de cultura é avaliada ao microscópio para a intensidade da coloração expressa por cruzes. A tabela 24 indica a penetração dos conjugados péptido-citocromo C nas células. 110 ΡΕ1259541
Tabela 24
Concentração(pg/mL) 100 50 25 Citocromo C nativo _* _ _ 1047-citocromo C +++ ++ + +++ intenso; ++: positivo; + fracamente positivo; -negativo. A tabela acima mostra que o citocromo C nativo não penetra nas células e que o conjugado 1047-citocromo C penetra de uma forma eficaz até 25 pg/mL. c) Avaliação da actividade biológica in vitro dos conjugados péptido-citocromo C.
As células H1299 ou HT29 (3 x 104 células/poço) são cultivadas em placas de 96 poços durante 48 horas a 37 °C no meio de cultura RPMI completo suplementado com concentrações decrescentes (200-3 pg/mL) de citocromo C nativo ou conjugado aos péptidos e a cultura prosseguiu durante 48 horas.
Os poços são a seguir suplementados com 50 pL de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil-tetrazolium) a 1 mg/mL no meio de cultura e cultivados durante 4 horas. O sobrenadante é aspirado e os poços são suplementados com 100 pL de dimetilsulfóxido. Após dissolução dos cristais, a coloração é lida a 550 nm. 111 ΡΕ1259541
Os resultados são calculados em percentagem da densidade óptica média obtida nos poços de células contendo as diluições das amostras a testar e da densidade óptica dos poços que só receberam meio. A tabela 25 indique inibição do crescimento das células por os conjugados péptido-ubiquitina.
Tabela 25
Em células H1299 Concentração (pg/mL) 100 50 25 12,5 6 3 Citocromo C nativo 0* 0 0 0 0 0 1047- citocromo C 46 40 29 15 14 0 Em células HT29 Concentração (pg/mL) 200 100 50 25 12,5 Citocromo C nativo 12* 19 10 0 0 1047- citocromo C 28 23 23 0 0 HBP3- citocromo C 42 22 15 0 0 HBP6- 41 18 12 2 0 112 ΡΕ1259541 citocromo C HBP7- citocromo C 35 14 5 0 0 *% de inibição calculada em relação ao crescimento das células que só receberam meio de cultura A tabela acima mostra a eficácia dos conjugados péptido-citocromo C em dois tipos de células. 0 citocromo C nativo não inibe o crescimento. A 50 pg/mL o péptido mais eficaz nas células HT29 é o péptido 1047, os péptidos HBP3 e HBP6 dão valores intermédios, uma vez que o péptido HBP) é pouco activo a esta concentração. 15) Transporte de substâncias anti-tumorais e anti-inflamatórias com o auxílio dos péptidos da invenção. a) Transporte de derivados da aspirina.
Os analgésicos como a aspirina utilizados há muito em terapêutica revelaram possuir outros efeitos como por exemplo, a prevenção de tumores do cólon nos homens e nas mulheres que tomam aspirina regularmente há bastante tempo. No animal, o efeito anti-canceroso mostrou-se em tumores variados. Estes efeitos têm sido atribuídos em parte à sua capacidade de inibir a produção de prostaglandinas, por inibição da enzima prostaglandina H sintetase e ciclooxigenases. 113 ΡΕ1259541
Dois derivados da aspirina conjugada ao péptido de sequência SEQ ID NO: 30: um derivado sacililil-HBP6 no terminal N (péptido SEQ ID NO: 47) e um derivado HBP6-salicililo no terminal C (SEQ ID NO: 48) têm sido testados para a sua capacidade de inibir o crescimento das células tumorais HT29 por comparação com o péptido nativo.
As células HT29 (3xl04 células/poço) são cultivadas em placas de 96 poços durante 48 horas a 37 °C no meio de cultura DMEM completo suplementado com concentrações decrescentes (200-3 pg/mL) de aspirina ou de conjugado péptido-salicililo e a cultura prosseguiu durante 48 horas.
Os poços são de seguida adicionados de 50 pL de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolium) a 1 mg/mL no meio de cultura e cultivados durante 4 horas. O sobrenadante é retirado e os poços são suplementados com 100 pL de dimetilsulf óxido. Após dissolução dos cristais, a coloração é lida a 550 nm.
Os resultados de inibição de crescimento das células HT29 são apresentados na tabela 26 e são calculados em percentagem da densidade óptica média obtida nos poços de células contendo as diluições das amostras a testar e da densidade óptica dos poços que só receberam meio. 114 ΡΕ1259541
Tabela 26
Concentração(pg/mL) 1000 500 200 100 Aspirina nativa co * 6 3 0 Salicilil-HBP6 51 35 30 30 HBP6-salicililo 50 45 20 20 *% de inibição A adição do péptido a ácido salicilico aumenta o poder da aspirina inibir o crescimento das células. b) Transporte de derivado do ácido ftálico. A N-ftalimidoglutarimida (talidomida) é uma molécula que possui uma grande variedade de propriedades como o efeito teratogénico, a redução da produção de TNF-a pelos monócitos, a supressão da angiogénese. Foi mostrado que a actividade teratogénica depende do resíduo glutarimida uma vez que o efeito anti-angiogénico depende do grupo ftaloilo. Preparou-se então o péptido SEQ ID NO: 46 derivado do péptido SEQ ID NO: 26 (HBP3)2 ao qual foi adicionado glicilftaloilo no terminal N. Os poços receberam apenas meio. A técnica empregue para testar a actividade do ftaloil-HBP3 é a mesma que a descrita anteriormente para a aspirina
Os resultados da inibição do crescimento (%) das células HT29 mostrados na tabela 27 são calculados em percentagem da densidade óptica média obtida nos poços de células contendo as diluições das amostras a testar e da 115 ΡΕ1259541 densidade óptica média dos poços de células que só receberam meio.
Tabela 27
Concentração(pg/mL) 1000 500 200 100 Ftaloil-HBP3 66 28 29 20 HBP3 2 0 0 *0. 0
Parece que o derivado ftaloilo inibe o crescimento das células HT29. 16) Aumento da actividade de substâncias Anti-microbianas com o auxilio de péptidos da invenção. a) A lisozima. A lisozima é um dos constituintes principais de grânulos de linfócitos polinucleares humanos. Encontra-se também nas secreções. É uma muraminidase. A lisozima lisa e mata os microrganismos Gram-positivos modificando os peptidoglicanos da sua superfície. Como a lisozima não pode facilmente penetrar a membrana exterior da bactéria, o acoplamento da lisozima aos péptidos pode auxiliar a penetração - Acoplamento dos péptidos à lisozima. 116 ΡΕ1259541 8 mg de lisozima em 2,7 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7 contendo 0,15 M NaCl são adicionados de 1,8 mg de SMCC (4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidilo) em 186 mL pL de dimetilsulfóxido e a solução é incubada 30 minutos à temperatura do laboratório. A eliminação do excesso de reagente faz-se por centrifugação em membranas de ultrafiltração (limite de exclusão = 5000 daltons, Sartorius), seguido de três lavagens em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7 contendo 0,15 M NaCl. O acoplamento com o péptido faz-se a seguir numa relação molar de 5 péptidos para 1 lisozima em 1 mL de tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7 contendo 0,15 M NaCl, durante 3 horas à temperatura do laboratório. A seguir, o excesso de péptido não acoplado é eliminado por centrifugação em membranas, como na etapa anterior. - Avaliação da actividade da lisozima acoplada aos péptidos. A estirpe bacteriana gram-positiva: Escherischia coli (ATCC25922) é cultivada até à fase semi-logaritmica no meio Luria-Bertani (LB). As bactérias são recolhidas por centrifugação e ressuspendidas no meio 1% bacto-peptona a uma concentração de 5xl05 cfu/mL (unidade formadora de colónia/mL). A lisozima ou os conjugados péptido-lisozima são diluídos de meia em meia (256 à 0,5 pg/mL no meio bacto-peptona e 50 pL são distribuídos em placas de 96 117 ΡΕ1259541 poços. 50 pL da diluição de bactérias são então adicionados em cada poço Após 16 horas de incubação a 37 °C, 10 pL de cada poço é colocado em caixas de gelose em meio LB. Após 18 horas de incubação a 37 °C, a concentração bactericida minima (MBC) é determinada como a concentração de lisozima ou lisozima-péptido que inibe 75% do crescimento. - Resultados. A tabela 28 refere-se a inibição de crescimento de E. coli (MBC pg/mL).
Tabela 28
Lisozima nativa > 256 104 7-Lisozima 32 (HBP1)3-Lisozima 4 (HBP3)2-Lisozima 16 HBP6- Lisozima 16
Os conjugados péptido-lisozima têm uma actividade antibacteriana mais eficaz que a da lisozima nativa. b) Péptidos antimicrobianos.
Desde alguns anos, desenvolveu-se um interesse considerável para o estudo estrutura-função de péptidos curtos possuindo actividades antibacterianas e antifúngicas. Muitos péptidos naturais, de sequências variadas, encontradas no mundo animal e vegetal, possuem 118 ΡΕ1259541 modos de acção semelhantes contra uma vasta variedade de micróbios.
Os péptidos antimicrobianos possuem em geral um número equivalente de residuos polares e não polares no interior de domínios antipáticos e suficientemente de resíduos básicos para dar um péptido de uma carga global positiva a pH neutro. Os péptidos objectivo da presente invenção são também péptidos principalmente básicos, de elevada afinidade para a heparina, e nos exemplos dados a seguir, é mostrado que vários, de entre estes, possuem uma actividade antibacteriana in vitro a concentrações em estes não são tóxicos para as células eucariotas. - Avaliação da actividade antimicrobiana dos péptidos catiónicos.
As estirpes bacterianas gram-positivas: Enterococcus faecalis (ATCC 29212), e Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e as estirpes gram-negativas: Escherichia.coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Salmonella typhimurium (isolado clínico) , Salmonella typhiTy2 (WHO). As bactérias são cultivadas com agitação durante a noite a 37 °C, depois recultivadas a uma diluição de 1:50 num meio fresco de Luria-Bertani (LB) durante 2 horas. A concentração bacteriana é ajustada a 106 cfu/mL e 50 pL são distribuídos nas placas de 96 poços com um igual volume dos péptidos diluídos de meia em meia (256-0,5 pg/mL) no meio LB. Após 16 horas a 37 °C, a concentração 119 ΡΕ1259541 mínima inibitória (MIC) é determinada como a concentração mais fraca que inibe totalmente o crescimento das bactérias (ausência total de turbidez). Para determinar a concentração mínima bactericida, 10 μ]3 de cada poço é colocado sobre caixas de gelose em meio LB. Após 18 horas de incubação a 37 °C, a concentração bactericida mínima (CMB) é definida como a concentração de péptido que não deixa subsistir mais do que 0,01% de bactérias vivas. - Resultados.
Os resultados são expressos em concentração de péptido em MBC (μΜ).
Tabela 29
Estirpes Péptido E. colí S. typhimurium S. typhiTy2 P. aeruginosa s. aureus E. fascalis SEQ ID NO: 2 >160* >160 nt >160 >160 >160 SEQ ID NO: 3 13,2 5 13,25 1, 65 26,5 >106 >106 SEQ ID NO: 38 >170 >170 >170 >170 >170 >170 SEQ ID NO: 24 55 110 27,5 27,5 >110 >110 SEQ ID NO: 44 1,7 1,27 0, 64 >110 >110 >110 120 ΡΕ1259541 SEQ ID NO: 45 1 1 0, 66 0,5 >680 >680 Ampicilina 22 11 5,5 >696 <0, 68 2,75 *μΜ
Os resultados da tabela acima mostram que o péptido (HBP1)3 possuem uma actividade bactericida, uma vez que os péptidos (HBP1)2 e HBP13 não são activos. Contudo, quando o péptido HPB13 (SEQ ID No: 38) é acoplado ao péptido SEQ ID NO: 24, este aumenta a sua actividade de um factor de 50 a 100 (péptido SEQ ID NO: 45) . Acontece o mesmo quando o péptido SEQ ID No: 24 é acoplado ao péptido SEQ ID No: 30 (HPB7) que, por si, não possui actividade antimicrobiana. A concentração minima bactericida (CMB) de todos os péptidos da tabela acima é equivalente à CMI ou difere de uma diluição (CMB = 2 x CMI) . Todos estes péptidos não são activos sobre as bactérias Gram-positivas. 121 ΡΕ1259541
REFERÊNCIAS 1) Cardin A.D. & Weintraub H.J.R. Artheriosclerosis 9: 21 (1989) 2) Merton B. et al.Annu. Rev. Cell Biol. 8:365 (1992) 3) David G. FASEB J. 7: 1023 (1993) 4) Salmivira M & Jalkanen M Experentia 51:863 (1995) 5) Caldwell et al. int. J. Biochem. Cell Biol. 28:203 (1996) 6) Fromm J.R. et al.Arch. Biochem. Bioph. 343:92 (1997) 7) Hirsch J. New Engl. J. Med. 324:1565 (1991) 8) Castellot J.J. et al. J. Cell Biol. 102:1979 (1986) 9) Ruoslahti E. & Yamazuchi Y. Cell 64:867 (1991) 10) Robinson D.S. Adv.Lip. Res. 1:1 (1963) 11) Kallunski P. & Tryggvason K. J. Cell Biol. 116:559 (1992) 12) Cardin A.D. et al. Biochem. Biophys. Res. Com. 154:741 (1988) 13) Avrameas A. et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. 95:5601 (1998) 14) Stevenson F.K. et al. J. Autoimmunity 6:809 (1993) 15) Hirabayashi Y. et al. Scand. J. Immunol. 37:533 (1993) 16) Kalsi J.K. et al. Lupus 4:375 (1995) 17) Campanelli JT, Gayer GG e Scheller RH Development (1996) 122: 1663-1672 18) Fowlkes JL, Thrailkill KM, George-Nascimento C., Rosenberg CK & Serra DM. Endocrinol (1997) 138:2280-2285. 19) Maher DW, Lee BA & Donoghue DJ Mol Cell Biol (1989) 9:2251-2253. 122 ΡΕ1259541 20) Inoue M., Watanabe N., Morino Y., Tanaka Y., Amachi T & Sasaki J. FEBS (1990) 269:89-92. 21) Pasqualini R., Koivunen E. & Ruoslahti E. Natura Biotech. (1997) 15:542-546 22) Arkonac BM, Foster LC, Sibinga NES, Patterson C, Lai K, Tsai JC, Lee ME, Perrella MA & Haber E. J Biol Chem (1998) 273: 4400-4405. 23) Yayon A, Klagsbrun M, Esko JD, Leder P. & Ornitz DM.
Cell (1991) 64:841-848. 24) Gongqiao XU, Fornster GG & Fornster JF Glyconjug J. (1996) 13:81-90. 25) Lortat-Jacob H & Grimaud JA. FEBS (1991) 280: 152-154. 26) Hasan M., Najjam S., Gordon MY, Gibbs RV & Rider CC. J Immunol (1999) 162:1064-1070. 27) Amara A, Lorthioir O, Valenzuela A, Magerus A, Thelen M, Montes M, Virelizier JL, Delepierre M, Baleux F, J.
Biol. Chem. (1999) 272:200-204. 28) Pohl J, Pereira HA, Martin NM & Spitznagel JK.
Aminoacid sequence of CAP37 FEBS (1990) 272: 200-204. 29) Javadpour MM, Juban MM, Lo WCJ, Bishop SM, lberty JB. Cowell SSM, Becher CL & McLaughilin ML. j Med Chem (1996) 39: 3107-3113 30) Ternynck T. e Avrameas S. "Thecniques immunoenzymatiques" Editions INSERM (1987) 123 ΡΕ1259541
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> DlATOS S.A. <120> SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS QUE FACILITAM A PENETRAÇÃO DE UMA SUBSTÂNCIA DE INTERESSE NO INTERIOR DAS CÉLULAS E/OU DOS NÚCLEOS CELULARES. <130> 12052-PCT-DIATOS A o T-1 V PCT/FR00/02621 Λ \—1 \—1 V 2001-03-01 <150> FR00/02 621 Λ T—1 LO τ—1 V 2000-03-01 Λ o QD \—1 V 48 Λ o r- τ—1 V Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens Λ O O V 1 Vai Lysj Arg Gly I*eu I»ys Leu 1 5 Λ o τ—1 0\| V 2 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens Λ o o V 2
Vai 1
Xys Arg Gly Leu Lys hsu Vai Arg Gly L$u ly& Leu S 10 124 ΡΕ1259541
<210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 3
Vai Lya Arg 61 y Leu Lys leu Vai Lys Arg Giy Leu Lya Leu Vai Lya 1 S 10 IS
Arg Qly Leu Lys Leu 20
<210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus x Rattus norvegicus <400> 4
Arg Gin Lyst Tyr Asn Lys Arg Ala Met Asp Tyr t 5 10
<210> 5 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens-Mus musculus-Rattus norvegicus <400> 5
Vai Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg QXn Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Met 1 S 10 is
Asp Tyr 125 ΡΕ1259541
<210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus χ Rattus norvegicus <400> 6
Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Vai Lye Sly Arg Phe Thr Arg Gin Lys Tyr 1 δ 10 is
Asn Lye Arg Ala 20
<210> 7 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens-Mus musculus-Rattus norvegicus <400> 7
Vai Lys Arg Gly Leu Lye Leu Thr tyr Tyr ser Asp Thr vai Lys Giy l & IO IS
Arg Phe Thr Arg Gin Lys Tyr Asn. Lye Arg Ala 20 25
<210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 8 126 ΡΕ1259541
Vai Arg Arg Ser Gly Arg Vai Vai Vai Pr© Ala Ala Pr© Arg Asn Arg 1 5 10 1*
Asp
<210> 9 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Vai t>ys Arg Qly Lau Ly® X»eu Vai Arg Arg Ser Qly Arg Vai Vai Vai 1 S 10 IS
Pr© Ala Ala Fra Arg Asn Arg Asp <210> 10 20 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens Λ o o V 10
Vai Lys Arg Qly Leu Lys leu Arg His vai Arg Pr© Arg Vai Thr Arg 1 5 10 15
Mefc Asp Vai
<210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 127 ΡΕ1259541 vai Lys Arg Giy Leu Lys Leu Giy Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Pro 1 § 10 15
Gly Lys Mu
<210 > 12 <211> 27 <212> PRT <213> Mus musculus x Rattus norvegicus <4 0 0> 12 A«n Vai Lys Lys Pro Lys Leu Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Vai Lye Giy 1 S 10 15
Arg Phe Thr Arg Gin Lys Tyr Asn Lys Arg Ala 20 25
<210> 13 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 13
Vai Lys Arg Gly Leu Lys Leu ser Gly Ser Thr Am Tyr Am Pro Ser 1 S 10 3,5
Leu Lys Ser Arg His Vai Arg Pro Arg Vai Thr Arg Ket Asp Vai 20 25 30
<210 > 14 <211> 28 <212> PRT <213> Mus musculus x Rattus norvegicus 128 ΡΕ1259541 < 4 Ο Ο > 14
Asg 01» ϊ*γ» Tyr Α»β Lys Arg Ala Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Vai tye X S '10 15
Oly Arg Phe Thr Arg Gin lys Tyr Asa X»ys Arg Ala 30 2§
<210> 15 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15
Arg Hia Vai Arg Pr© Arg Vai Thr Arg Met Asp Vai Arg His Vai Arg 15 10 15
Pr© Arg Vai Thr .Arg Hefc Asp Vai 20
<210> 16 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 16
Arg His Vai Arg Pr© Arg Vai Thr Arg Het Asp Vai Vai Lys Arg GXy 1 S 10 15 X*eu Lys Leu. Arg Eia Vai Arg Pro Arg Vai Thr Arg Met Asp Vai 20 25 30
<210> 17 <211> 8 <212> PRT 129 ΡΕ1259541 <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 17
hm àrg Lya Arg Lmi Leu Arg âsp 1 S
<210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 O O > 18
Lyss Ser Arg Lys 1
<210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 O O > 19
Lys Ser Arg Lys Lys Ser Arg Lys 1 s
<210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 130 ΡΕ1259541
Arg Ltys Gly Phe Tyr Lys Arg hym Qla Cys Lys pro 1 5 10
<210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 21
Sly Arg Pro Arg Glu Ser Giy Lys Lys Arg Lys Arg hye Arg Leu Lys 1 5 10 ΡϊΏ
<210> 22 <211> 32 <212> PRT <213> Mus musculus x Rattus norvegicus <400> 22
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ttar Tyr Tyr Ser 1 S 10 is
Asp Thr Vai Lys Gly Arg Phe Tfer Arg Gin Lys Tyr Asa Lys Arg Ala 20 25 ao
<210> 23 <211> 30 <212> PRT <213> Mus musculus x Rattus norvegicus <400> 23 131 ΡΕ1259541 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Péptido sintético A o o V 24
Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Aia Lys Leu Ala Lys 1 5 10 <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens Λ o o V 25
Arg I»y# Gly Ly« FAe fyr Lye Arg Lys ala Cys Lye Pro Ser Arg Qly 15 10 15
Arg ; Lye <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens Λ o o 'PT V 26
Ser Glu .Arg Lye Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lye Lye Arg Arg Arg 1 5 10 15
Glu Ser 132 ΡΕ1259541
<210> 27 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 Ο > <221> misc_característica <222> () .. () <223> Todos os aminoácidos estão em configuração D <400> 27
Ser Glu Arg Ly® Lya Arg Arg Arg 01¾ Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg
15 XO IS CUu Ser
<210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Arg Lye Lys Arg Arg Arg 01y Aap Arg Lys Lys Arg Arg .Arg Gly Mg 1 5 XO 15
<210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 133 ΡΕ1259541 ¥al Lys Arg Gly Le« Lys Leu Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp 1 5 10 15
<210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Qly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro 1 5 10 15
<210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_característica <222> () .. () <223> Os aminoácidos estão em posição recto-verso <400> 31
Pra Asp Arg Lys Lys Qly Leu Lys Gly Lys Lys Lys Arg Lys Lys Gly 1 S 10 15 <210> 32 <211> 14
<212> PRT <213> Homo sapiens 134 ΡΕ1259541 <2 2 Ο > <221> misc_característica <222> ( ) .. ( ) <223> Todos os aminoácidos estão em configuração D. <400> 32
Gly Lys Arg Lys Lys Lya Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp 1 5 10
<210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33
Gly Leu Lys Lys Mn Gly Ser cys Lys Arg Gly Fxo Arg 1 5 10
<210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34
Tyr .Arg Ser .Arg Lys Tyr Ser Ser Trp Tyr Tyr Ale Leu Lys Arg 1 S" 10 15 <210> 35 <211> 14
<212> PRT 135 ΡΕ1259541 <213> Homo sapiens <4 Ο Ο> 35
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Gly Ser Gly 1 5 10
<210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 s 1 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 37
Gl» Gly Lys Sar lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg ¥al Pha 1 S 10
<210> 38 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 136 ΡΕ1259541 I.ys Hls Leu Ly© Lys Ri© leu Lyss Lya Ris Leu Ly© 1 S 10 <210> 39 <211> 17
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39
Leu Arg .Arg SXu Arg Ôin Set Arg Leu Arg Asg βΐ« Arg Ser gi» g«r i 5 10 15 Arg <210> 40 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens A o o V 40 Lys Ií ys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Vai Lys Arg 1 s 10 IS Gly Leu Lys Leu Arg His ¥al Arg Pro Arg Vai Thr Arg Met Asp Vai 20 as AO <210> 41 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 137 ΡΕ1259541
Lys Lys Lys Lys Lyu Lys Lvs Lya Lys I»ys Lys Lya Lyst Ser Glu Arg 1 S 20 15 í.ys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lya Lys Arg Arg Arg Glu Ser ao 25 30
<210> 42 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42
Lys Ly® lys Lys Ly& Lye Lyo Lys Ly# Lys Lys i»yi Lye Ser Arg Arg 1 s XO 15
Ala Arg Arg §er Pvc- Arg His l»eu Sly Ser Gly ao as
<210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Péptido sintético <400> 43
Vai X»ys Arg Gly Leu Ly» Leu Lye Leu Ala Lys Leu Ala Lya Lya Leu 1 s 10 15
Ala í*ys Leu Ala Lya 20
<210> 44 <211> 29 <212> PRT <213> Péptido sintético <400> 44 138 ΡΕ1259541
Lys Lea Ala Lys Leu Ala lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Qly Lys 1 5 10 IS
Arg Lys Lys Lys Oly Lys Leu Gly Ly» Lys Arg Asp Pro 20 25
<210> 45 <211> 26 <212> PRT <213> Péptido sintético <400> 45
Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lye Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys His 1 5 10 IS hm Lys Lys His Leu Lys Lys hís Leu Lys 20 25
<210> 46 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_caracteristica <222> () .. () <223> Resíduo de glicina-ftaloilo em posição N-terminal (X) . <400> 46
Xaa Oly Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg 1 S 10 15 Glu Ser 139 ΡΕ1259541
<210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <2 2 0> <221> misc_característica <222 > ( ) .. ( ) <223> Presente um motivo salicililo (denominado X) em posição N-_terminal. <400> 47
Xaa Gly Arg Pro Arg 3lU Ser Gly by& Lys Arg Lys Arg Ly® Arg Leu 1 S 10 15
Lys Pro
<210> 48 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_caracteristica <222> ( ) .. ( ) <223> Presente um motivo salicililo(denominado X) em posição C-terminal. <400> 48 140 ΡΕ1259541
Qly Arg Pro Arg Giti Ser ely Lys t>y& Arg Lys Arg Lye Arg Leu Lys l 5 10 15
Xaa Fro Gly
Lisboa, 5 de Dezembro de 2007

Claims (37)

  1. ΡΕ1259541 1 REIVINDICAÇÕES 1. Vector de transferência intra-citoplásmica e/ou intranuclear de uma substância de interesse, caracterizado por compreender, pelo menos, uma sequência de aminoácidos que reaqe in vivo com os aminoglicanos e que é parte da lipoproteína B humana, acoplada a, pelo menos, um fragmento de anticorpo.
  2. 2. Vector de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de aminoácidos que reage com os aminoglicanos, e que é parte da lipoproteína B humana, ser capaz de reagir com a heparina, o sulfato de heparano, os sulfatos de condroitinas, e seus derivados.
  3. 3. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a sequência de aminoácidos que reage com os aminoglicanos, e que é parte da lipoproteína B humana, ser codificada pela linhagem germinal.
  4. 4. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a sequência de aminoácidos que reage com os aminoglicanos, e que é parte da lipoproteína B humana, compreender vários aminoácidos básicos, pelo menos, igual a 3. 2 PE1259541
  5. 5. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a sequência de aminoácidos que reage com os aminoglicanos, e que é parte da lipoproteína B humana, ser constituída por, ou comporta, pelo menos, um grupo de aminoácidos que corresponde a uma das fórmulas seguintes: a) (XBBBXXBX)n; b) (XBBXBX)n; c) (BBXmYBBX0) n; d) (XBBXXBX)n; ou e) (BXBB)n; em que: B é um aminoácido básico, X é um aminoácido não básico, Y representa seja uma ligação directa seja 1 a 20 aminoácidos, m é um número inteiro compreendido entre 0 e 5, n é um número inteiro compreendido entre 1 e 10, e o é um número inteiro compreendido entre 0 e 5.
  6. 6. Vector de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a sequência de aminoácidos que reage com os aminoglicanos, e que é parte da lipoproteína B humana, ser constituída por, ou comportar, um grupo de aminoácidos que corresponde à fórmula seguinte: (XBBXXBX)n.
  7. 7. Vector de acordo com uma das reivindicações 5 ou 6, caracterizado por X ser um aminoácido não básico hidrófobo.
  8. 8. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender menos de 100 aminoácidos. 3 ΡΕ1259541
  9. 9. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender menos de 50 aminoácidos.
  10. 10. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por compreender menos de 25 aminoácidos.
  11. 11. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a sequência de aminoácidos que reage com os aminoglicanos, e que é parte da lipoproteína B humana, ser seleccionada do grupo compreendendo SEQ ID NO. 1 no estado de monómero, dímero (SEQ ID. 2), trimero (SEQ ID NO. 3), polimero.
  12. 12. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o fragmento de anticorpo ser um fragmento de anticorpo polirreactivo.
  13. 13. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o fragmento de anticorpo ser uma região hipervariável do anticorpo.
  14. 14. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o fragmento de anticorpo ser um fragmento da cadeia pesada de um anticorpo. 4 ΡΕ1259541
  15. 15. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o fragmento de anticorpo ser um fragmento de anticorpo anti-ADN humano.
  16. 16. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por o fragmento de anticorpo ser um fragmento de IgM.
  17. 17. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por o fragmento de anticorpo ser um fragmento de IgG.
  18. 18. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o fragmento de anticorpo ser no todo, ou em parte, de pelo menos uma região CDR2 de um anticorpo.
  19. 19. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por o fragmento de anticorpo ser no todo, ou em parte, pelo menos uma região CDR3 de um anticorpo.
  20. 20. Vector de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a região CDR3 ser seleccionada do grupo consistindo em RTT79, NE-1, e RT72. 5 ΡΕ1259541
  21. 21. Vector de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender uma das sequências seguintes: SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 23.
  22. 22. Associação de um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 com uma substância de interesse.
  23. 23. Associação de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por o vector e a substância de interesse estarem conjugados.
  24. 24. Associação de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por o vector e a substância de interesse estarem associados por um acoplamento quimico.
  25. 25. Associação de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por a a referida substância de interesse estar acoplada ao nivel da extremidade N ou C-terminal da sequência de aminoácidos do vector.
  26. 26. Associação de acordo com uma das reivindicações 24 ou 25, caracterizada por o acoplamento ser realizado por intermédio dos reagentes de ponte homo- ou 6 ΡΕ1259541 heterofuncionais, do tipo 4-(N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC).
  27. 27. Associação de acordo com uma das reivindicações 24 ou 25, caracterizada por o acoplamento ser realizado por intermédio de uma molécula de ancoragem seleccionada de entre a proteína A, a proteína G, o fragmento F(ab')2 anti-IgG, a IgG antiperoxidase, a F(ab')2 anti-RNase, a concanavalina A, a estreptavidina e a avidina.
  28. 28. Associação de acordo com uma das reivindicações 24 ou 25, caracterizada por o acoplamento ser realizado por engenharia genética.
  29. 29. Associação de acordo com gualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizada por a referida substância de interesse ser seleccionada do grupo compreendendo: um ácido nucleico, uma proteína, um medicamento, um antigénio, um anticorpo.
  30. 30. Associação de acordo com a reivindicação 29, caracterizada por a referida substância de interesse ser a doxorrubicina.
  31. 31. Célula eucariota hospedeira, caracterizada por compreender um vector de acordo com qualquer uma das 7 ΡΕ1259541 reivindicações 1 a 21 ou uma associação de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 30.
  32. 32. Procedimento de transferência in vitro de uma substância de interesse para o interior de uma célula, caracterizado por compreender as etapas seguintes: a) a associação da referida substância de interesse a um vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 21, e b) a incubação da célula com a referida associação a uma temperatura de cultura que permite o metabolismo activo da referida célula.
  33. 33. Procedimento de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a incubação da etapa b) se efectuar a uma temperatura compreendida entre 25 °C e 39 °C.
  34. 34. Procedimento de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por a incubação da etapa b) se efectuar a 37 °C.
  35. 35. Composição biológica, farmacêutica, cosmética, agro-alimentar, de diagnóstico ou de rastreio, caracterizada por compreender como principio activo, seja um vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 21, seja uma associação de acordo com uma das reivindicações 22 a 30, seja células de acordo com a reivindicação 31. 8 ΡΕ1259541
  36. 36. Agente de diagnóstico caracterizado por compreender, pelo menos, um vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 21, ou uma associação de acordo com uma das reivindicações 22 a 30, ou uma célula de acordo com a reivindicação 31.
  37. 37. Kit de diagnóstico caracterizado por compreender, em um ou vários recipientes, uma quantidade pré-determinada de um agente de acordo com a reivindicação 36. Lisboa, 5 de Dezembro de 2007
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8003595B2 (en) 2000-03-01 2011-08-23 Cellectis Amino acid sequences facilitating penetration of a substance of interest into cells and/or cell nuclei
US7033597B2 (en) 2000-10-13 2006-04-25 Université de Lausanne Intracellular delivery of biological effectors
EP1345956A2 (en) 2000-10-13 2003-09-24 University of Lausanne Intracellular delivery of biological effectors by novel transporter peptide sequences
US7049286B2 (en) 2001-08-30 2006-05-23 Diatos, S.A. Insulin conjugates and methods of use thereof
FR2841902A1 (fr) * 2002-07-08 2004-01-09 Diatos Peptides lineaires cationiques ayant des proprietes antibacteriennes et/ou antifongiques
WO2005016960A2 (en) * 2003-08-14 2005-02-24 Diatos Amino acid sequences facilitating penetration of a substance of interest into cells and/or cell nuclei
FR2858772A1 (fr) * 2003-08-14 2005-02-18 Diatos Composition anti bacterienne, plus particulierement contre les bacteries gram negatif, comprenant un peptide et un agent anti-bacterien avantageusement hydrophobe
EP1512696A1 (en) * 2003-08-14 2005-03-09 Diatos Amino acid sequences facilitating penetration of a substance of interest into cells and/or cell nuclei
CA2629376C (en) 2005-11-14 2015-06-09 Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs Inhibitors of parp activity and uses thereof
EP1797901A1 (en) 2005-12-16 2007-06-20 Diatos Cell penetrating peptide conjugates for delivering nucleic acids into cells
EP1818395A1 (en) * 2006-02-08 2007-08-15 Diatos Compositions and methods for treating lysosomal storage diseases
CA2658015A1 (en) 2006-03-30 2007-10-11 Diatos S.A. Camptothecin-peptide conjugates and pharmaceutical compositions containing the same
EP2172209A1 (en) 2008-10-03 2010-04-07 Universite Pierre Et Marie Curie Treatment of mood and anxiety disorders
CA2791116A1 (en) 2010-02-26 2011-09-01 Olivier Danos Use of endonucleases for inserting transgenes into safe harbor loci
FR2968662B1 (fr) 2010-12-10 2013-11-22 Roussy Inst Gustave Nouveaux derives d'oxazaphosphorines pre-activees, utilisation et methode de preparation
CA2834577A1 (en) * 2011-05-23 2012-11-29 Phylogica Limited Method of determining, identifying or isolating cell-penetrating peptides
EP2812024B1 (en) * 2012-02-09 2018-04-11 Var2 Pharmaceuticals ApS Targeting of chondroitin sulfate glycans
GB201322396D0 (en) 2013-12-18 2014-02-05 Univ Nottingham Transduction
CN112457383B (zh) * 2020-12-16 2022-06-17 阿南达 一种多肽、制备方法及其医药用途
EP4448556A1 (en) 2021-12-16 2024-10-23 RDP Pharma AG Cell penetrating polypeptides (cpps) and their use in human therapy

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60233099A (ja) * 1984-05-04 1985-11-19 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規なペプチド
DK455789D0 (da) * 1989-09-15 1989-09-15 Symbicom Ab Polypeptid
AU3724495A (en) * 1994-09-13 1996-03-29 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor with targeted agents
FR2736642B1 (fr) 1995-07-10 1997-09-12 Pasteur Institut Immunovecteurs, notamment anticorps et fragments d'anticorps utilisables pour le transport intracellulaire et intranucleaire de principes biologiquement actifs notamment d'haptenes, de proteines et d'acides nucleiques
US6635623B1 (en) * 1997-06-13 2003-10-21 Baylor College Of Medicine Lipoproteins as nucleic acid vectors
FR2766826B1 (fr) * 1997-08-04 2001-05-18 Pasteur Institut Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules

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