JPS60233099A - 新規なペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）発明の目的 本発明は、抗ウィルス作用、細胞増殖抑制作用などの生
理活性能に優れた新規なペプチドを提供することを目的
とする。

更らに詳し、くは式（■）： Ｊ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　ＡｓｐＰｒｏ　Ｔｙｒ　
Ｖａｌ　Ｌｙｓ　（］ｕＡ１ａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ
　ＧｌｙＨｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ＡＩａ　Ａ
ｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＬｅｕ
　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙ
ｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ
　Ｍａｌ　ＳｅｒＰｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓ
ｐＡｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　
Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅＬｙｓ　（］
ｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ
　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　５ｅｒＡｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙ
ｓ　ＬｅｕＴｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　
Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＧＩｎＡｒ
ｇ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　）（ｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅ
ｕ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　ＭｅｔＡｌａ　Ｇｌｕ　
Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ
　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　
ＡｒｇＡｒｇ　Ａｌａ　５ｅｒ （但し、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、■
ａｌ、Ｌｙｓ、Ｇ１ｕ。

Ａｌ　ａ　、Ａｓｎ　、Ｌｅｕ　＋Ｐｈｅ　、Ｇｌｙ、
Ｈｉ　ｓ　＊Ｓｅｒ　、Ｔｈｒ　、　Ｉ　１ｅ　、Ｔｒ
ｐ　、ＡｒｇおよびＭｅ　ｔはチロシン、シスナイン、
グルタミン。

アスハラキン酸、フロリン、チロシン、バリン。

リジン、グルタミン酸、アラニン、アスバ２ギン酸、ロ
イシン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、セ
リン、スレオニン、イソロイシン。

トリプトファン、アルギニンおよびメチオニンの残基を
；またＪはメチオニン残基又は水素原子を表す）で表わ
されるペプチドを提供することを目的とする。

（２）発明の構成 （手段） 本発明の新規なペプチドは、従来から公知の方法、即ち
、泉屋信夫等著［合成化学シリーズ−ペプチド合成Ｊ１
９７５年丸善株式会社発行；日本生化学会編［生化学実
験講座／タンパク質の化学１−ＩＶＪ１９７７年東京化
学同大東京化学同人発行を利用することにより製造する
ことができる。

その実施態様の１つとして、固相法について以下具体的
忙説明する。α−アミノ保護基を有するアミノ酸のカル
ボン酸基なジビニルベンゼンで架橋したポリスチレン樹
脂などの支持体に結合させた後、α−アミノ保護基を選
択的に除去する。遊離したアミノ基忙、α−アミノ保護
基を有する２番目のアミノ酸と反応させる。このα−ア
ミノ保護基の除去とａ−７ミノ保護基を有するアミノ酸
の導入をくり返して目的のペプチド鎖を得る。次にペプ
チドのＣ−末端アミノ酸のカルボン酸基と樹脂との間の
共有結合を切断する。この際、共有結合を切断するのに
用いる試薬によっては、ａ−アミノ保護基や側鎖保護基
の除去を共有結合の切断と同時に行なうことができる。

上述の固相法は、すべての反応が１つの容器で行なえる
のでペプチドの製造が操作の上で簡単であり、また得ら
れた生成物は反応に用いた溶媒に可溶であるので、反応
に用いた適量の試薬および副産物を濾過により除去でき
るために、目的のペプチドが短時間でしかも高い収率で
製造できることから、いわゆる液相法より有利な方法で
ある。

第１の方法で用いられる支持体としては、一般にジビニ
ルベンゼンで架橋した架橋度２％のスチレンポリマーで
、２００〜４００メツシユのサイズのものが望ましい。

樹脂をアミノ酸と反応させて結合する前に、樹脂に官能
基を導入し反応性を付与する。一般に、樹脂忙官能基を
導入するためＫは、Ｓｎα、を触媒として用いるフリー
デル、クラツク反応によりスチレンの芳香環とクロ四メ
チルメチルエーテルとを反応させ、該スチレンの芳香環
をクロロメチル化する方法がとられる。

第１の方法で用いられるａ−アミノ保護基としては、支
持体とａ−アミノ保護基を有するアミノ酸とのカップリ
ングに際して安定であり、側鎖保−アミノ保護基として
は、第三ブトキシカルボニル（以下ｒＢｏｃＪと略称す
る）基が挙げられる。このＢｏｃ基は、ＩＩＪ）ＩＣＪ
／酢酸混合液、４　Ｎ　、ＨＣ＆／ジオキサン混合液あ
るいは５０％（Ｗ／Ｖ）’ＪｆＯＨ（テトラフルオロ酢
酸）／　ＧＶ４混合液を用いて容易忙ペプチド鎖から除
去することができる。

側鎖保護基としては、カップリング及びａ−アミノ保護
基の除去の時に安定であり、且つペプチド合成の段階で
容易に除去できる基が好ましい。

このような好ましい側鎖保護基としては、アルギニンの
側鎖保護用にはＮＯ３又はトシル基が、アスパラギン酸
の側鎖保護用にはベンジル基（以下ｒＢｚｌＪと略称す
る）基が、システィン及びグルタミン酸の側鎖保護用に
はＢｚｌ基又はＯ−メチルベンジル（以下ｒＯＢｚＪと
略称する）基が、ヒスチジンの側鎖保護用忙はＢｚｌ基
、ペンジルオキシカルボニル（以下ｒＺＪと略称する）
基又はＢｏｃ基が、リジンの側鎖保護用にはＺ基、トシ
ル基又はジイソプロピルメチルオキシカルボニル（以下
ｒＤｉｐｍｏｃＪと略称する）基が、メチオニンの側鎖
保護用にはスルホキシド基が、そしてセリン、スレオニ
ン及びチロシンの側鎖保護用にはＢｚｌ基が挙げられる
。

本発明のペプチドは以下の方法でも得られる。

まず、得ようとする本発明のペプチドのアミノ酸配列の
各アミノ酸に対応する遺伝暗号を選び出す。

この選び出した各遺伝暗号を基にして、本発明のペプチ
ドの遺伝情報を有する二重鎖鳳断片を化学合成する。得
られた二重鎖ＤＮＡ断片を複製可能な発現媒体であるベ
クターに組み込む。次にＩＩＮＡ断片を組み込んだベク
ターを宿主に挿入する。

ＤＮＡ断片を組み入れた上記ベクターを宿主忙挿入する
ことによって、該宿主は形質転換され、その結果形質転
換体が形成される。次に常法により、この形質転換体を
遺伝子発現型の有無により元の宿主から単離する。得ら
れた形質転換体を培養することによって、本発明のペプ
チドが製造される□上記の方法に用いられる宿主として
は、微生物、哺乳動物細胞および植物細胞等が挙げられ
る。これらの宿主の内、微生物と哺乳動物細胞を使用す
るのが望ましい。望ましい微生物としては大腸菌、枯草
菌、好熱菌等の細菌類、放線菌類及び酵母が挙げられる
。

本発明で用いられる複製可能な発現媒体即ちベクターは
、前記の宿主に感染し得るものである。

このようなベクターとしては、プラスミド、ファージ、
ウィルス等が挙げられる。上記のベクター及び宿主は、
生物から生物工学的に得られた遺伝子からペプチドを製
造する場合にも用いられる。

以下に示す各アミノ酸残基に対応する遺伝暗号が本発明
の生理活性ペプチドの遺伝子を合成するために用いられ
る（但し、以下に示す遺伝暗号において、Ａはデオキシ
アデニル酸残基を、Ｇはデオキシグアニル酸残基を、Ｃ
はデオキシシチジル酸残基を、そしてＴはチミジル酸残
基を表し、遺伝暗号の左側は５′−水酸基側を、遺伝暗
号の右側は３′−水酸基側をそれぞれ表す）： フェニルアラニンに対する遺伝暗号はＴＴＴ又はＴＴＣ
、ロイシンに対する遺伝暗号はＴＴＡ、　ＴＴＧ。

ＣＴｒ　、　ＣＴＣ、ＣＴＡ　又ハＣＴＧ、インロイ’
／：／に対する遺伝暗号はＡＴＴ％ＡＴＣ又Ｇ円ＡＴＡ
　、メチオニンに対する遺伝暗号はＡＴＧ、バリンに対
する遺伝暗号はσＩＴ、ＧＴＣ％ωム又はＧＴＧ、セリ
ンに対する遺伝暗号ハＴＣＴ％′ｒＣＣ１ＴＣＡ、　Ｔ
ＵＧ、ＡＧＴ又はＡＧＣ、プロリンに対する遺伝暗号は
ＣＣＴ、　ＣＣＣ，ＣＯＡ又はＣＣＧ、スレオニンに対
する遺伝暗号はＡＣＴ　。

Ａｃｅ、ＡＣＡ又はＡＣＧ　、アラニンに対する遺伝暗
号ハＯＣＴ　、　ＧＣＣ，ＯＣＡ又はα℃、チロシンに
対する遺伝暗号はＴＡＴ又はＴＡＣ、ヒスチジンに対す
る遺伝暗号は、ＣＡＴ又はＣＡＣ、グルタミンに対する
遺伝暗号はＣＡＡ又はＣＡＧ　、アスパラギンに対する
遺伝暗号はん口又はＡＡＣ，！ｊリジン対する遺伝暗号
はＡＡＡ又はＡＡＧ　、アスパラギン酸に対する遺伝暗
号はＧＡＴ又は豊、グルタミン酸に対する遺伝暗号はＧ
ＡＡ又はＧＡＧ、システィンに対・する遺伝暗号はＴＧ
Ｔ又はＴ（９）、トリプトファンに対する遺伝暗号はＴ
ＧＧ、アルギニンに対する遺伝暗号はＣＧＴ、α℃、α
込、ＣＧＧ％ＡＧＡ又はＡＧＧ、そしてグリシンに対す
る遺伝暗号はαπ、（３ＧＣ、αｋ又はα追が用いられ
る。また、以上の遺伝暗号の他に、ＡＴＧはメチオニン
の遺伝暗号であると同時に、ペプチド合成の開始暗号と
して用いられ、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡはペプチド合
成の終止暗号として用いられる。遺伝子は、前記の４種
類のデオキシリボヌクレオシドが、３′部位と５′部位
でリン酸ジエステル結合によって連結したものである。

従って、ペプチドの遺伝子は、保護基と結合剤を用いて
化学合成できる。保護基としてはデオキシリボヌクレオ
チドの予じめ決めておいた位置を選択的に保護できるも
ので、ヌクレオチド合成の反応中安定であり、ヌクレオ
チド間の結合を切断することなく容易に除去できるもの
が望ましい。更に、反応中間体の分離精製も容易に行な
わなければならない。

例えば、ペプチドの遺伝子を合成するには以下に述べる
トリエステル法を用いることもできる。

即ち、アミノ酸暗号に対応するデオキシリボヌクレオチ
ドのトリマーブロックと要すればダイマーブロックを初
めに合成する。次いで得られたブロックを縮合して、約
１２〜２３個のヌクレオチド鎖からなるオリゴマーを形
成するこの縮合反応は、ポリマーのような支持体を用い
る同相法忙より行なうことが望ましい。得られたオリゴ
マーを鳳リガーゼを用いて伸長させ、得られるＤＮＡを
水素結合させることにより、目的とするペプチドの遺伝
子二重鎖ＤＮＡを形成する。

上記のデオキシリボヌクレオシドのアミン基の保護基と
しては、デオキシシチジン及びデオキシアデノシンには
ベンゾイル基が、デオキシグアノシンにはイソブチル基
が挙げられる。水酸基の保護基としては、トリチル基、
アシル基、シリル基及びそれらの誘導体基を用いること
ができる。これらの水酸基の保護基の中では、トリチル
基の誘導体基が好まし、＜用いられる。縮合剤としては
。

２．４．６−　）リイソプロピルベンゼンスルフォニル
テトラゾリド（以下し、ばしば［ＴＰＳＴｅＪと略称す
る）のような強力な縮合剤が望ましい。デオキシリボヌ
クレオチドの縮合により得られたオリゴヌクレオチドの
保護基は以下に述べる方法で除去することができる。ま
ず、アミン保護基及びアシル誘導体基などの３′−水酸
基の保護基はアンモニア水によって除去し、次いでトリ
チル基の誘導体基などの５′−水酸基保護基を８０容量
％の酢酸によって取り除く。

ｄＡＴＰの存在下、ターミナルトランスフェラーゼの作
用により、オリゴ（デオキシアデノシン−燐酸）〔以下
しばしば「オリゴ（ｄＡ月と略称する）を上記で得た二
重鎖Ｄａの３′−末端忙付加させる。

一方、プラスミドｐＢＲ３２２（エフ、ポリバー等、「
コンストラクション、アンド、キャラクタライゼーショ
ン、オフ、ニュー、クローニン／、グイヒクルス■；ア
、マルチパーパス、クローニング、システム」、ジーン
、１１月（１９７７）ＣＦ。

Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｌ、”ｃｏｎｓｔｒａｃｔｉ
ｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ−ｚａｔｉｏｎ　
ｏｆ　ｎｅｗ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｈｉｃｌｅｓ　Ｉ
Ｉ　；　Ａ　ｍｕｌｔｉ−ｐｕｒｐｏｓｅ　ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ″、　Ｇｅｎｅ、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ
（１９７７）））を制限酵素ＥｃｏＲＩで開裂し、次い
でＡ−エキソヌクレアーゼで処理する。続いて、ｄＴｒ
Ｐ′の存在下、ターミナルトランスフェラーゼの作用に
より、開裂したプラスミドｐＢＲ３２２の３′−末端に
オリゴ（ｄＡ）を付加させる。上記のオリゴ（（ＩＴ）
の付加した線状のプ２１スミドｐＢＲ３２２を混合し、
アニーリングする。アニーリングにより得□られたプラ
スミドを大腸菌χ１７７６株〔アメリカ□　合衆国メリ
ーランド州ロックビルのアバカン。

タイプ、カルチャー、コレクション（ＡＴＣＣ）寄託□
番号第３１２４４号）に挿入し七、該菌株を形質転換す
る。形質転換された菌株□はアンピシリンなどの薬剤耐
性で選択する。

次に１大腸菌のトリプトファンオペロンのプロモーター
、オペレーター及び□リポソーム結合部位を有し、両端
にＥｃｏＲＩ切断端な有する３００塩基対■□、　。Ｄ
ＮＡＭ第４、ｙ５ｘｉｙｐＢ□３２’２　Ｋ１１ｈＬ’
ｌｈ゛　ミドに組み込む。

た前記ＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断部位に接続し、咳プラス
７に’　イーｒ−ｒ　１ｌ−１）　’Ｉ　Ｖ　１イ塩ｅ
、　＋ｉ−＋プ４ｘ？ｋ”４大腸菌の細胞内に導入する
。

該ＤＮＡ断片が前記のプロモーターの後に、ｍＲＮＡへ
の転写方向忙正しく接続していれば大腸菌の細胞中では
、該ｃＤＮＡは前記オペロンのプロモーターの働きでｍ
ＲＮＡに転写される。更に、転写されたｍＲＮＡは開始
トリジレット暗号の部分からアミノ酸に翻訳され、目的
のペプチドがつくられる。

このよ５１Ｃして、１２の培養液中の培養した大腸菌の
細胞から、目的のペプチドを０．１　！抽出することが
できる。

つぎに、目的のペプチドを産生ずる大腸菌の細胞を培養
後集め、溶菌する。溶菌した細胞を含む□溶液中の核酸
をリボヌクレアーゼ及びデオキシリ□ボヌ□クレアーゼ
で分解した後、目的のペプチドを６５％飽和度の硫酸ア
ンモニウムで塩析する。得られた塩析沈殿画分をコンド
ロールドボアガラスピーズ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐ
ｏｒｅ　ｇｌａｓｓ　ｂｅａｄｓ）を用いて精製する。

本発明の新規なペプチドのアミノ酸配列を決定する方法
は以下の通りである。まず、最初に本発明の新規な生理
活性ペプチドのメチオニル結合をブロモシアンで切断す
る。切断して得たペプチド断片をセファデックスＧ−１
００（ファーマシア。

ファイン、ケミカル社製、スウェーデン）を用いて分離
して、各断片のアミノ酸配列を公知の高精度アミノ酸配
列分析で、各断片のＮ−末端から順に決定していく、一
方、本発明の新規な生理活性ペプチドをトリプシンで部
分分解し、得られたペプチド断片をセファデックスＱ−
１００カラムを用いて分離する。分離した各断片を上述
と同様の方法で、各断片のアミン配列を各断片のＮ−末
端から順に決定していく。ブロモシアンで切断して得ら
れたペプチドの各断片のアミノ酸配列とトリプシンで切
断して得られたペプチドの各断片のアミノ酸配列を比較
することＫよって、該ペプチドの各断片の配列を決定す
る。このようにして、本発明の新規なペプチドのアミノ
酸配列を決定する。

細胞増殖の抑制、例えば悪性腫瘍細胞の増殖抑制を目的
とする場合、本発明のペプチドは一般には静脈内、筋肉
内又は皮下に注射投与することができる。本発明のペプ
チドの１日投与量は、もちろん患者の年令、病状及び体
重により異なるが、通常、成人１人当りＩ　Ｘ　１０’
〜Ｉ　Ｘ　１０”単位７日の量で注射投与される、 ウィルス性の疾病を治療するために、軟膏剤１０ｇ当り
本発明のペプチドＩ　Ｘ　１０’〜Ｉ　Ｘ　１０’単位
含有する軟膏剤を皮膚に塗布することができる。従来公
知の医薬上許容し５る軟膏基剤を用いて、本発明のペプ
チドを含有する軟膏剤を調製することができる。本発明
のペプチドを含有する軟膏剤の１日投与量は、もちろん
患者の年令及び病状により異なるが、通常本発明のペプ
チド基準でＩ　Ｘ　１０’〜Ｉ　Ｘ　１０’単位となる
量を分割して塗布することができる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本
発明は以下の実施例に限定されるものではない。

Ｇ−ＮＯ，−アルギニン：アルギニンのグアニジノ基（
Ｇ−）Ｋニトロ基（ＮＯ，−）が結合したもの ｉｍＢｚｌ−ヒスチジン　：ヒスチジンのイミダゾリル
基（ｉｍ）　Ｋヘンシル基（Ｂｚｌ−）が結合したもの ０７Ｂｚｌ−セリン：セリンの水酸基Ｃｏ−）Ｋベンジ
ル基（Ｂｚｌ−）が結合したもの　。

Ｂｏｃ−バリン：　バリンのα−アミノ基に第三ブトキ
シカルボニル基（Ｂｏｃ−）が結合したもの ０Ｂｚｌ：側鎖保護基の１つであるオル一−メチルベン
ジル基ｖｓｖ　：水痘性口内炎ウィルス（Ｖｅｓｉｃｕ
ｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｔｔｓ）店■　
：鳥類骨髄芽球症ウィルス（Ａｖｉａｎ　陽ｅｌｏｂｌ
ａｓｔｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）ＢＳＡ　：牛血清アルブ
ミン ＳＥＡ　：マイトジェンの１種であるスタフゼロコツカ
ル。エンテロトキシンＡ （実施例） 工程ｌ（樹脂の洗浄） 樹脂（Ｂｉｏ−Ｂｅａｄ　５−Ｘ２　、２００〜４００
メツシユ（２％ジビニルベンゼン架橋スチレンポリマー
の商品名、バイオ−ラッド社製、アメリカ合衆国）〕１
５０ｇを１ノの蒸舅ベンゼンに撹拌しながら加える。３
０分後、樹脂をガラスフィルターで戸数し乾燥する。

次に乾燥した樹脂を１ノのメタノール中に撹拌しながら
加え、３０分後にガラスフィルターで戸数して乾燥する
。乾燥し、て得られる樹脂をメタノール、メタノール／
水及び水で順次洗浄する。洗浄した樹脂を１ノのｌＮＮ
ａＯＨ水溶液中に加える。得られる混合物を沸騰水浴中
で１時間撹拌した後、樹脂をＦ取し、水洗する。次ｋ、
得られる樹脂をＩＪのＩＮ塩酸水溶液中に加え、沸騰水
浴中で１時間撹拌する。次いで樹脂を戸数し、水洗する
。

水洗して得られる樹脂を４ノの蒸留水に懸濁した後、静
置する。静置３０分後、浮遊する微細な樹脂をデカンテ
ーションにより除去する。このようにして、樹脂を沈殿
物として得る。沈殿した樹脂はガラスフィルター上１ｃ
Ｆ取し、メタノールで洗浄する。洗浄した樹・脂を少量
のジメチルホルムアミド（以下ｒＤＭＦＪと略称する）
ＩＣ加え、３０分間８０℃で撹拌した後、撹拌を戸数し
てＤＭＦおよびメタノールで洗浄する。更に、樹脂を２
４のメタノール中で１時間撹拌した後戸数する。得られ
る樹脂を風乾した後、さらに１００℃で２時間真空乾燥
する。

工程２（クロロメチル樹脂の製造） 工程１で得られた樹脂２５９と蒸留したクロロメチルメ
チルエーテル１００−をｌ１３の丸底三頚フラスコに入
れて、２５℃で静かに１時間撹拌して樹脂を膨潤させた
後、０℃に冷却する。この膨潤した樹脂にｔ　Ｂ　８　
ｙｎｌ　ｆ）　Ｓｎｕｇ、を含有する５０１のクロロメ
チルメチルエーテルを０℃に保ったまま撹拌しながら３
０分間かけて加えた後、さらに３０分間撹拌し、て反応
生成物を得る。このようにして得られた生成物をガラス
フィルターでＦ取し、５００１のジオキサン−水（１：
１）、次いで５００ｍ１のジオキサン−３Ｎ塩酸（ａ：
１）で静かに洗浄する。更に、生成物を水、ジオキサン
−水及びメタノールで順次洗浄した後、減圧下１００℃
で乾燥する。

工程３ Ａ、（ε−Ｚ−リジン） ｌｉｇσ）Ｌ−リジン銅塩１ｃ、ＩＯＪのＮａＨＣＯｓ
と１２１のＺ−Ｃ，、ｇを４分の１ずつ１０分おきに水
冷下撹拌しながら加え、さらＶｃ＆５時間撹拌する。

このようにして得られる沈殿物を戸数し、水、エタノー
ルおよびアセトン／エーテルで順次洗浄する。洗浄した
沈殿物を２５０−の水に懸濁し、次にこの懸濁液ＩＣ４
１２ｍＪの６Ｎ塩酸水溶液を加えるととにより上記沈殿
物を溶解させる。次いで、得られる溶液ＶｃルＳガスを
１〜２時間通気する。その結果生成するＣｕＳをハイフ
四スーパーセル（和光紬薬製、日本）を用いてＦ去し、
このＣｕＳをＩＮ塩酸水溶液で洗浄する。上述の操作で
得られるろ液及び洗浄を集めて、空気を通しＨ，Ｓを除
去する。

その後、この溶液を水冷下濃アンモニア水を加えてｐＨ
６，５にし、冷蔵庫で２時間放置する。その結果得られ
る沈殿物を戸数し、水、エタノール及びエーテルで順次
洗浄する。このようにして、融点２５４℃のε−２−リ
ジンｌＯ９が得られる。生成するε−２−リジンの収率
は６５％である。得られるｔ−Ｚ−リジンの再結晶は、
希塩酸に溶解した後、アンモニア水で中和して行う。

Ｂ、（Ｇ−（支）、−アルギニン） 発煙硝酸１２０ｄと発煙硫酸７４’ａＪの混合液を水冷
し、この混合液に１１０ｐｆ）Ｌ−アルギニン塩酸塩を
撹拌しながら徐々に加える。更ｋ、濃硫酸４５１ｄを上
記の混合液に加える。得られる混合液を１時間撹拌した
後、氷片中に注ぎ、濃アンモニア水でｐＨ８に調節する
。次に該混合液を酢酸でｐＨ６に調節した後、冷菓庫内
で約４時間放置する。

その結果生じる沈殿を戸取し、熱水より再結晶する。得
られる結晶をエタノール及びジエチルエーテルで順次洗
浄し乾燥する。

このよ５にして融点２５１℃のＧ　−Ｎｏ、−アルギニ
ン６０ｇが得られる。Ｇ　−ＮＯ，−アルギニンの収率
は５０％である。

Ｃ，（１ｍ１３ｚｌ　−ヒＸｆシｙ） ２０ＩのＬ−ヒスチジン塩酸塩Ｈ，Ｏを、ドライアイス
−アセトンの浴中で一３０℃に冷却した２００−の液体
アンモニアに溶かし、この溶液に金属ナトリウムの小片
を、溶液の青色が消えずに残るようになるまで撹拌しな
がら加える。次に少量のヒスチジンを、該溶液の青色が
消えるまで加えた後、塩化べ／ジルを該溶液に滴下する
。この混合溶液を３０分間撹拌した後、この混合溶液中
の凪を室温で大気圧下蒸発させ、次いで水流ポンプを用
いて減圧下ＮＨ，を除去する。凪除去彼の残渣を１００
ｍの氷水忙注ぎ入れる。得られる混合液をジエチルエー
テルで抽出した後、不溶分はＦ去子る。得られる溶液に
希硫酸を加えてｐＨｓ＜調節し、冷厳庫内で３時間放置
する。その結果生じる沈殿物を戸取し、７０重量％エタ
ノールから再結晶する。融点２４８℃のｉｍＢｚｌ−ヒ
スチジン１３Ｉが得られる。ｉｍＢｚｌ−ヒスチジンの
収率は５０％である。

Ｄ、（０−Ｂｚｌ−セリン） ２３７Ｉの７セチルーＬ−セリンを２３５１の５ＮＮａ
ＯＨ水溶液に溶かし、比を７．３に調節する。この溶液
に４，９＋のタカジャスターゼ（三共株式会社製）を２
５ｄの０．１　Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨｓ、　７、Ｃａ
（Ａ。

０．０２５Ｍ含有）忙溶解して得られる溶液を加え、更
忙トルエン数滴を滴下後、得られる混合液を３６℃で１
０日間放置する。生じる沈殿を炉去し、Ｆ液を濃縮した
後、この濃縮Ｆ液にアセトンを加えて結晶を得る。この
ようにして１００ｇの〇−Ｂｚｌ−セリンが得られる。

同様の方法に従って２４０．９のアセチル−Ｌ−スレオ
ニ゛ンかう１００ｐの０−Ｂｚｌ−スレオニンが得うｔ
ｔ、る。

Ｂ、（０−Ｂｚｌ−チロシン） １．８１のＬ−チロシンと１．２　、＠のＣｕ５Ｏ，，
５Ｈ！０を５ｄの２　Ｎ　ＮａＯＨ水溶液と１ｏｄ（Ｑ
水との溶液に懸濁して２時間撹拌する。この懸濁液に６
　ｏｍのメタノールを加え、次いで１．２−の臭化ベン
ジル及び０７−の２　Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を徐々に加え
る。

１５分後０．３ｄの臭化ベンジル及び０．８ｄの２ＮＮ
ａＯＨ水溶液を更に加える。得られた混合液を１時間撹
拌した後、生じる沈殿を戸数し、この沈殿をメタノール
−水（１：３）で洗浄する。このようにして、２ＩＩの
０−Ｂｚｌ−チロシンの銅塩を得る。この０−Ｂｚｌ−
チロシンの銅塩と２０−のＩＮ　ＥＤＴＡ水溶液とを乳
鉢内でこねて得られる混合物から固形分を戸数し、この
固形分を水洗する。

洗浄した生成物を少量のＥＤＴＡを含有する熱水から再
結晶することｋより、融点２２３℃を有する０−Ｂｚｌ
−チロシンｉｐが得られる。０−Ｂｚｌ−チロシンの収
率は３０％である。

Ｆ−（Ｓ−Ｂｚｌ−システィン） １５７ｇのＬ−システィン塩酸塩を２ノの２ＮＮａＯＨ
水溶液に溶かし、この溶液に２５６９の臭化ベンジルを
水冷下激しく撹拌しながら添加後、冷室で５時間撹拌す
る。その後、該溶液を酢酸でｐＨ５に調節して沈殿物を
生成させる。生成した沈殿物をＦ取し水洗する。このよ
うにして、融点２１２℃の５−ＢｚＪ−システィｙｔｓ
ｏｙが得られる。５−Ｂｚｌ−システィンの収率は７０
％である。

上述と同様の方法で１６０１のアスパラギン酸からｉ　
５ｏｇの０−Ｂｚｌ−アスパラギン酸が、１６０Ｉのグ
ルタミン酸から１５０ＪＦの０−Ｂｚｌ−グルタミン酸
が得られる。

Ｇ、（Ｂｏｃ−アミノ酸） ２９ｐのＬ−バリンを２５ｏＷＬｌのＩ　Ｎ　ＮａＯＨ
水溶液に溶かして得られる溶液に水を加えて４００ａｇ
の溶液とする。この溶液に１５０ｆｆ／のテトラヒドロ
７ランを添加後、１０℃で激しく撹拌しながら、該溶液
にｌｏｏｗｌのＢｏｃ−Ｃ４を５分の１ずつ１０分毎に
加える。一方、２　Ｎ　ＮａＯＨを前記のＢｏｃ−（Ｉ
Ｊを加えるたびに該溶液に加えて、溶液のＤＨを８〜９
に保つようにする。２時間後、この混合液をジエチルエ
ーテルで抽出し１．得ちれる水層な０．５Ｍクエン酸水
溶液で酸性にし、析出する油状物質を酢酸エチルで抽出
する。得られる抽出物を少量の水で洗浄り、　ＮａｔＳ
（％で乾燥後、減圧下で濃縮する、識縮抽出物に石油エ
ーテルを加えて、冷蔵庫内に放置し結晶を生成させる。

生成結晶を戸数して乾燥する。

このようにして融点７８℃のＢｏｃ−バリン３０ｇを得
る。Ｂｏｃ−バリンの収率は５５％である。

Ｈ，（その他のｌ３ｏｃ−アミノ酸） 上述と同様の方法を行うととｋより、Ｂｏｃ−グリシン
ｉｓ、９．Ｂｏｃ−アラニン１６１ｓＢｏｃ−ロイシン
１５Ｊｉｒ、Ｂｏｃ−インロイシン１５．Ｓ！、ＢＯＣ
−セリン（Ｂｚｌ）　１４　Ｊｉｌ　、　ｌ３ｏｃ　−
ｘしｉ二ｙ　（Ｂｚｌ）１４Ｊ、Ｂｏｃ−システィｙ　
（ＢＺＩ）　１５７７、Ｂｏｃ　−メチオニｙ１５ＩＩ
、Ｂｏｃ−プロリン１２ｇ、Ｂｏｃ−アスパラギン酸（
ＯＢｚｌ）１５９　、　Ｂｏｃ−グルタミン酸（ＯＢｚ
ｌ）１５９　、　Ｂｏｃ−グルタミン１５Ｉ。

Ｂｏｃ−ヒスチジン（Ｂｚｌ）　１２　ｇ、Ｂｏｃ　−
ｏインｙ（Ｚ）　１３９、Ｂｏｃ−アルギニｙ（Ｎｏ、
）ｉ　５ｊｌ、Ｂｏｃ−フェニルアラニン１５ｇ、Ｂｏ
ｃ−チロシン（Ｂｚ　Ｉ　）１５９及びＢｏｃ　−）リ
プトファン１０ＩＩがそれぞし、グリシン３０，９＋、
アラニン３０ＪＩ、ロイシン３０９、イソ四イシｙ３０
　ｇ、セリン（ＢＺＩ）　３０ｇ、スレオニ：／　（Ｂ
ｚｌ）　３　ｏ　ｉ　、システィｙ（Ｂｚｌ）ａｏｌｌ
、メチオニン３０ｇ、グリシン３０ｇ、アスパラギン酸
（ＯＢｚｌ）３０１ｉ、グルタミン酸（ＯＢｚ　ｌ　）
３０ＩＩ、グルタミツ３０９．ヒスチジン（Ｂｚ　１　
）ｓ　ｏ　ｇ、＋）　シｙ　（Ｚ）　３ｏ　Ｉｌ、　ｙ
ルａｆニン（Ｎｏ、）ａ。

９、フェニルアラニン３０ＪＦ、チロシン（Ｂｚｌ）３
０．９及びトリプトファン３０ｐから得られる。

工程４　（Ｂｏｃ−セリン（Ｂｚυと樹脂との結合）２
Ｉｉのクロａメチル樹脂（ＣＪ総含量４ミリモル）、２
ミリモルのＢｏａ　−Ｌ−セリｙ　（Ｂｚυ、１．８ミ
リモルのトリエチルアミン及び１２１１１／のジメチル
ホルムアミドの混合物を室温で２４時間振と５する。次
にガラスフィルターを用いて上記混合物から固形分を戸
数し、得られる固形生成物をそれぞれ７００ｄのジメチ
ルホルムアミド、エタノール、酢酸／エタノール及び塩
化メチレンで順次洗浄する。その後生成物を室温で減圧
下乾燥する。

生成物のアミノ酸含量を測定するために、該生成物５０
Ｉｎｇを秤量し、１２Ｎ塩酸水溶液とジオキサンの１＝
１容量比の混合物中に入れて２４時間加水分解した後、
アミノ酸分析計で測定する、生成物のアミノ酸含量は０
．２ミリモル／９である。

工程ｓ　（Ｂｏｃ　−Ａ、Ｉａ　−５ｅｒ（Ｂｚｌ）−
樹脂）工程４で得られた２ＩのＢｏｃ−セリン（Ｂｚ　
Ｉ　）（以下ｒ　Ｂｏ　ｃ−Ｇ１　ｎＪと略称する）樹
脂を１６０ｄの酢酸中に入れて室温で６時間放置する。

次にこの混合物をガラスフィルターで濾過する。得られ
た固形物を１６０ｔｎｌの酢酸中に入れて振とうし、戸
数する。この操作を３回くりかえす。次に上記の固形物
を１６０１１Ｉ７１のＩＮ塩酸水溶液／酢酸中に入れて
室温で３０分間振とうし、樹脂からＢｏｃ基を除去する
。このようにして得られた生成物をＦ取し、酢酸、エタ
ノール及びジメチルホルムアミドで、それぞれ３回ずつ
順次洗浄する。洗浄生成物を１６０ｄの１０重量％トリ
エチルアミン／ジメチルホルムアミド中に入れて１０分
間振とうして中和反応を行なう。その結果、得られる生
成物を戸数してジメチルホルムアミドで洗浄し、次いで
塩化メチレンで洗浄する。洗浄生成物を１２ｍの塩化メ
チレンに２ミリモルのＢｏｃ−７２ニンを溶かした溶液
中に入れ、振と５する。１０分後、この混合物Ｋ　６０
　ｒｄの塩化メチレンに２０ミリモルのジシクロへキシ
ルカルボジイミドを溶かした溶液中に加え、室温で２時
間振とうしてカップリングを行なう。その結果書られる
生成物を戸数し、塩化メチレン及びエタノールで順次洗
浄する。

工程６　（Ｂｏｃ−ペプチジル樹脂） 工程５と同様の操作を繰り返してアミノ酸を伸長させて
下記Ｂｏｃ−ペプチジル樹脂を得る。

Ｂｏｃ　Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）　Ｃｙｓ　（Ｂｚｌ）　Ｇｌ
ｎ　Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）　Ｐｒ。

Ｔｙｒ　（Ｉ３ｚｌ）Ｖａｌ　Ｌｙｓ　（Ｚ）Ｇｌｕ　
（ＯＢｚｌ）Ａｌａ　Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）　Ａｓｎ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ｔｙｒ　（Ｂ
ｚｌ）　ＰｈｅＡｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　（Ｂ
ＺＩ）　Ｓｅｔ　（Ｂｚｌ）　Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）Ｖ
ａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）Ａ５ｎ　Ｑｌｙ　
Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）Ｌｅｕ　ＰｈｅＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉ
ｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙ
ｓ　（Ｚ）　Ｇｌｕ、　（ＯＢｚｌ）　Ｇｌｕ　（ＯＢ
ｚｌ）　Ｓｅｔ　（Ｂｚｌ）　Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）　
Ａｒｇ、　（ＮＯＪ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ
　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）　Ｇｌｎ　ｌ１ｅＶａｌ
　Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　（ＢＺＩ）Ｐｈ
ｅ　Ｌｙｓ　（Ｚ）ＬｅｕＰｈｅ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ａ
ｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）
　Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）Ｉｌ
ｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　（Ｚ）Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）Ｖａｌ　
Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ）Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）Ｉｌｅ　Ｌｙ
ｓ　（Ｚ）Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ）Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）
Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　（Ｚ）Ｐｈｅ　Ｐｈ
ｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）Ａｓｎ　Ｌｙｓ　（Ｚ
）Ｌｙｓ　（Ｚ）Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ａｒｇ　（ＮＯＪ　
Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）　Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）　Ｐｈｅ
Ｇｉｎ　Ａｒｇ　（ＮＯＪ　Ｌｙｓ　（Ｚ）Ａｌａ　Ｉ
ｌｅ　Ｈｉｓ　（Ｂｚｌ）ＧＪｕ（ＯＢｚｌ）　Ｌｅｕ
　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　
（ＯＢｚｌ）Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）Ｐｒｏ　Ａｌ
ａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　（Ｚ）Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）Ｇｌｙ
　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ａｒｇ　（ＮＯＪ　Ｌｙｓ　（Ｚ）
　Ａｒｇ　（ＮＯ？）　５ｅｔ（Ｂｚｌ）　Ｇｉｎ　Ｍ
ｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　（ＮｏρＧｌｙ　Ａｒ
ｇ　（ＮＯ２）Ａｒｇ　（ＮＯ，）　Ａｌａ　Ｓｅｒ　
（Ｂｚｌ）−樹脂前記Ｂｏｃ−ペプチジル樹脂とＢｏｃ
−メチオニンを用いて、工程５と同様の操作釦より下記
Ｂｏｃ　−メチオニルペプチジル樹脂を得る。

Ｂｏｃ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　（Ｂｚｌ）　Ｔｙｒ　（Ｂｚ
ｌ）　Ｃｙｓ　（ＢＺＩ）　ＧｌｎＡｓｐ　（ＯＢｚｌ
）　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　（Ｂｚｌ）　Ｖａ！　Ｌｙｓ　（
Ｚ）　Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）　Ａｌａ　Ｇｌｕ　（ＯＢｚ
ｌ）　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ｌｙｓ（Ｚ）
　Ｔｙｒ　（Ｂｚｌ）　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌ
ｙ　Ｈｉｓ　（Ｂｚｌ）Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）　Ａｓｐ　
（ＯＢｚｌ）　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）
Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ。

Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ａｓｎ　Ｔｒｐ、Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ｇ
ｌｕ　（ＯＢｚｌ）　Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）　Ｓｅｔ　（
Ｂｚｌ）　Ａｓｐ　（ＯＢ−ｚ、１）　Ａｒｇ　（ＮＯ
Ｊ　Ｌｙｓ（Ｚ）　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　
（Ｂｚｌ）　Ｇｌｎ　Ｌｉｅ　Ｖａｌ　５ｅｒ（Ｂｚｌ
）　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　（Ｂｚｌ）　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　（
Ｚ）　Ｌｅｕ　ＰｈｅＬｙｓ　（Ｚ）　Ａｓｎ　Ｐｈｅ
　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）　Ａｓｐ（Ｏ
Ｂｚｌ）　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　（ＢＺＩ）　Ｉｌｅ　Ｇｉ
ｎ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　５ｅｔ（Ｂｚｌ）　Ｖａｌ　Ｇｌ
ｕ　（ＯＢｚｌ）　Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）　Ｉｌｅ　Ｌｙ
ｓ　（Ｚ）Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ）　Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ
）　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　（Ｚ）Ｐｈｅ　
Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）　Ａｓｎ　Ｌｙｓ
　（Ｚ）　Ｌｙｓ　（Ｚ）− Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ａｒｇ　（ＮＯ，Ｊ　Ａｓｐ　（ＯＢ
ｚｌ）　Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　（ＯＢ
ｚｌ）Ｌｙｓ　（Ｚ）Ｉ、ｅｕ　Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）Ａ
ｓｎＴｙｒ　（Ｂｚｌ）Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）Ｖａｌ　Ｔ
ｈｒ　（Ｂｚｌ）Ａｓｐ（ＯＢｚｌ　）　Ｌｅｕ　Ａｓ
ｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａ、ｒｇ　（ＮＯり　Ｌｙｓ　（
Ｚ）Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｈ４ｓ　（ＢＺＩ）Ｇｌｕ　（Ｏ
ＢＺＩ）Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　ＧｉｎＶａｌ　Ｍｅｔ　Ａｌ
ａ　Ｇ１．ｕ−（ＯＢｚｌ）Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ
）Ｐｒ。

Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）
　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ａｒｇ（Ｎｏｗ）Ｌｙｓ　
（Ｚ）Ａｒｇ　（ＮＯＪ　Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）Ｇｌｎ　
ＭｅｔＬｅｕ　Ｐｈｅ　Ａ、ｒｇ　（ＮＯ，）　Ｇｌｙ
　Ａｒｇ　（Ｎｏ、）　Ａｒｇ　（ＮｏりＡｌａ　Ｓｅ
ｒ　（Ｂｚｌ）−樹脂、 工程７（樹脂からのペプチドの切断） 工程６で得られた１、４１のＢｏｃ−ペプチジル−樹脂
と１．４１のＢｏｃ−メチオニルペプチジル樹脂の各々
とＩＷＬｌのアニソールを、ポリテトラフルオロエチレ
ンでカバーした撹拌子の入った反応容器に入れて、ドラ
イアイス−アセトンで冷却しながらフッ化水素２ｏｗｌ
を該反応容器忙導入し、０℃で１時間撹拌後、０℃の減
圧下反応容器中のフッ化水素を除去する。得られる残渣
に１重量％酢酸水溶液を加えて撹拌後ペプチドを抽出し
、抽出物を分ｉロートに入れてエーテルで洗浄して凍結
乾燥する。このようにして保護基を持たない各ペプチド
を分離する。Ｂｏｃ−ペプチジル−樹脂から得られるペ
プチドをペプチド１　＊　Ｂｏｃ−メチオニルペプチジ
ル−樹脂から得られるペプチドをペプチド２と呼ぶ。

工程８（合成ペプチドの物性） 工程７で得られる各ペプチドの分子量、アミノ酸組成及
びアミノ酸配列を測定する。

各ペプチドの分子量はＳＤＳゲル電気泳動測定での移動
度からめる。

アミノ酸組成（モル％）は、一定量の各ペプチドを６Ｎ
塩酸水溶液中で２４時間１１０℃で加水分解し、得られ
る混合物を二次元ペーパークロマトグラフィーに供して
決定する。この方法では、トリプトファン、シスチン及
びシスティンは検出されない。従って、別の一定量の各
ペプチドを蛋白分解酵素で分解することにより、トリプ
トファン及びシスチン又はシスティンの組成をめる。

なお、グルタミン酸とグルタミン、及びアスパラギン酸
とアスパラギンの区別はっかない。

各ペプチドのアミノ酸配列は、日立製作所製の自動アミ
ノ酸分析機によって分析する。

ペプチド１ 分子量：約２０．０００９１モル アミノ酸組成（モル％）： ヒスチジン（１，４））リプドア７ン（０，３）リプｙ
（１３，６）　アルギニン（ｓ、　ｓ　）　アスパラギ
ン酸／アスパラギン（１３，６）　セリン（７，６）　
グルタミン酸／グルタミン（１０，６）スレオニン（３
，４）　グリシン（３，４）　プロリン（１４）　アラ
ニン（５，５）　バリン（ｓ、ｓ）・・％シスチン（０
，７）　メチオニン（１７）　イソロイシン（４，８）
　ロイシン（６，８）　フェニルアラニン（ｔｙ、　ｓ
　）　チロシン（３，４）アミノ酸配列： Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖ
ａｌ　Ｌｙｓ　ＧｌｕＡ、ｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａ、Ｉ
ａｒ↓Ｉ％ｒ　ＬＹｉ　、、（：！Ａ＋　ＡＩ　−１１
−＋　ＡＩ−Ａ　Ａ−／Ｍ冒−−ＩＴＩＬ−Ｌｅｕ　Ｐ
ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓ
ｎ　Ｔｒｐ　ＬｙｓＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　
Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　５ｅｒＧｉ
ｎ　Ｉｌｅ　Ｍａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ
　Ｌｙ＊　Ｌｅｕ　ＰｈｅＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｉ
ｎＬｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＭｅｔＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙ
ｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ
　ＬｙｓＬｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇ
ｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＡｓｎＴｙｒ　Ｓｅｒ
　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　
Ｇｌｎ　ＡｒｇＬｙｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｈ４ｓ　Ｇｌ
ｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　ＭｅｔＡｌａ　
Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌ
ｙｓ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＬｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ
　３ｅｒ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＡｒｇＧ
ｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒペプチド２ 分子量：約２０，０ＯＯＩＩ１モル アミノ酸組成（モル％）： ヒスチジン（１，４））リプトファン（０３）リジン（
１１６）　アルギニン（５，４）　アスパラギン酸／ア
スパラギン（１λ６）　セリン（ｙ、　ｓ　）　グルタ
ミン酸／グルタミン（１０，４）スレオニン（ａ、　４
　）　グリシン（３，４＞　プロリ、ン（１４）　アラ
ニン（ｓ、　４　）　バリン（５，４）２シスチン（０
７）　メチオニン（ａ、　４　）　イソロイシン（４，
８）　ロイシン（６，８）　フェニルアラニン（ｅ、　
ｓ　）　チロシン（３４）アミノ酸配列： Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔ
ｙｒ　Ｍａｌ　ＬｙｓＧｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ
　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＡｓｎＡ
ｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌ
ａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔ
ｒｐＬｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ
　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇ１ｎ５ｅｒ　Ｇｌｎ　Ｉ
ｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙ
ｓ　ＬｅｕＰｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　
Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　ｌ１ｅＧｉｎ　Ｌｙ
ｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ
　Ｇｌｕ　ＡｓｐＭｅｔ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐ
ｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＬｙｓＬｙｓ
　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　
Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＡｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａ
ｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＧＩｎ
Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　ＶａｌＭｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ
　Ｌｅｕ　Ｓｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　
ＴｈｒＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＡｒｇ　Ｇｌｙ　
Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ工程９（抗ウィルス活
性の測定） 工程７で得られる各ペプチドの抗ウィルス活性の測定は
、ビー、シー、メリガン著−ヒト新生児皮膚繊維芽細胞
の単層とウシ水痘性口内炎ウィルスを用いるヒトインタ
ーフェロンのプラーク形成阻害の評価−［細胞媒介免疫
におけるイン、ピトｏ法Ｊイー、ディー、ビー、アール
、ブルーム及びビー、アール、グレード編アカデミツク
、プレス社刊、ニューヨーク１９７１年、４８９頁（ｐ
。

Ｃ，Ｍｅｒｉｇａｎ、Ｐｌａｑｕｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉ
ｏｎ　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒ　ＨｕｍａｎＩｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ　Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　Ｈｕｍａｎ　Ｎｅｏｎａ
ｔＱ’　５ｋｉｎＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｍｏｎｏｌａ
ｙｅｒｓ　＆　Ｂｏｖｉｎｅ　ＶｅｓｔｉｃｕｌａｒＳ
ｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ、”Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ
　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｇｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　
Ｉｒｒｍｕｎｉｔｙ”、ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｅ、Ｄ、
Ｂ、Ｒ，Ｂｌｏｏｍ＆　Ｐ、Ｒ，Ｇｒａｄｅ、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｆｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、１９７１．ｐｐ４８９
３に記載の方法と同様の方法で測定する。

詳しくは、工程７で得られる各ペプチドを種々に希釈し
て、１０容量％の胎児性小生血清を含有する増殖培地に
入れる。この培地にはＦＳ−４細胞（ヒト新生児皮膚繊
維芽細胞）が単層に培養されている。１８時間後、細胞
当り２０個のプラーク形成能を有する水痘性口内炎ウィ
ルス（’ｖｓｖ）を該細胞に感染させ、さらに１時間３
７℃で培養する。

次に該細胞を上記の増殖培地で２回洗浄した後、再び該
増殖培地中３７℃で２４時間培養する。ウィルスが発生
したかと５かは、培養後の該細胞を顕微鏡観察すること
ｋより検査する。その結果認められる細胞の損傷はウィ
ルスによるものである。

ペプチドが１μｇｍの濃度で抗ウィルス活性を示す。

ＩＦＮ−γ一様ペプチドとそれぞれ同じアミノ酸配列を
有するペプチドを前記の同相合成法忙より調製し、上記
の方法で細胞増殖抑制作用を測定する。

結果を以下に示す。

工程７で得られるペプチド１とペプチド２の抗ウィルス
活性の結果を以下に示す。

抗ウィルス活性が希釈無しで認められ、培希釈で認めら
れない場合を１単位とし、ｎ倍希釈で詔められ、２Ｈ倍
希釈で認められない場合をｎ単位とする。

工程１０（細胞増殖抑制作用の測定） ２Ｘｔｏ’ＦＳ−４細胞を直径６０ｍのシャーレに入れ
た工程９で記述した増殖信地に移植する。５時間後に増
殖培地を除去し、代わりＫ　Ｏ，１μν値の濃度の工程
で得られるペプチドを含む新鮮な培地を上記のシャーレ
に注ぎ入れて、３７℃で１８時間培養を続ける。培養後
、培養を除去し、５μＣｉ／ｙｄの濃度の３Ｈ−チミジ
ンを含む培地を加え、さらに３７℃で２時間培養する。

培養後、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄した後、洗浄し
た細胞に５重量％のトリクロロ酢酸を加える。゛その結
果得られる沈殿の一定量を乾燥し、液体シンチレーショ
ンカウンター（パラカード社製、アメリカ合衆国）を用
いて乾燥した沈殿物のｓＨの放射能を測定する。

工程？で得られるペプチド１とペプチド２の細胞増殖抑
制作用の結果を以下に示す。

（３）発明の効果 本発明のペプチドは抗ウィルス作用、細胞増殖抑制作用
などの増殖抑制作用などの生理活性能に優れた新規なペ
プチドである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式（■）： Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａ
   ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＬｅｕ　Ｇｌｙ
   　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　
   Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌ
   ｅ　Ｍｅｔ、　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｖａ
   ｌ　５ｅｒＰｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　
   Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＡｓｐＡｓ
   ｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ
   　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅ１１ｙｓ　Ｇｌｕ　
   Ａｒ５ｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　’Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ
   　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　５ｅｒＡｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌ
   ｙｓ　Ａｒｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙ
   ｓ　ＬｅｕＴｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　
   ’Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＧｉｎＡ
   ｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌ’ｕ　Ｌ
   ｅｉ　１１ｅ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　ＭｅｔＡｌａ　Ｇｌｕ
   　Ｌｅｕ　８ｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　
   Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅ
   ｒ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ
   　ＡｒｇＡｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　、。 （但し、Ｔｙｒ　＊Ｃｙｓ　、Ｇｌｎ、Ａｓｐ＊Ｐｒｏ
   、Ｖａｌ　、Ｌｙｓ　＊Ｇｌ　ｕ　、Ａｌ　ａ　、Ａｓ
   ｎ　、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ　、Ｇｌ　ｙ、Ｈｉ　ｓ　、Ｓｅ
   ｒ　、Ｔｈｒ　、　Ｉ　ｌ　ｅ　、Ｔｒ　ｐ　、Ａｒｇ
   およびＭｅ　ｔはチロシン、シスナイン、グルタミン。 アスバツギン酸、プロリン、チνシン、バリン。 リジン、グルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、Ｏ
   イシン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、セ
   リン、スレオニン、イソ四イシン。 トリグトファン、アルギニンおよびメチオニンの残基を
   ；またＪはメチオニン残基又は水素原子を表す）で表わ
   されるペプチド