JP4912556B2 - 細胞質内及び/又は細胞核内への対象物質の侵入を促進するペプチド - Google Patents
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Description
【0001】
対象物質を、外来環境から細胞内部へ、より詳細には細胞核内へ有効に運搬し得る手段を提供することは、バイオテクノロジーの分野において、特にタンパク質又はペプチドを生産する為、遺伝子の発現を調節する為、或いは細胞内シグナル伝達の経路を分析して選択する為、更には当該細胞に関与する所定物質の特性を分析する為の、強力な武器となる。
【0002】
上記手段の更に重要な適用は、遺伝子治療の分野に関係するものである。これまでに実施されている様々な遺伝子治療の方法は、需要が充分に満たされていない以下の問題、即ち、宿主ゲノムも、運搬される有効成分の生物学的特性も変化させること無しに、治療対象である宿主生物の細胞質内及び/又は細胞核内に生物学的活性成分を自由に運搬し得るベクターを提供するという必要性に直面している。
【0003】
DNAを細胞内に運搬する為に、これまでに幾つかの手法が開発されたが、いずれも現実問題として満足し得るものではなかった。そのなかの一つの手法である、CaCl2処理による大腸菌の形質転換に対する感受性獲得に基づくMandelとHigaの手法に由来する方法は、DNAをリン酸カルシウム又はDEA−デキストランと共沈させ、得られた共沈殿物を直接、細胞又は核に導入するというものである。この方法は、毒性があるという事実に加え、選択性がないものである。
【0004】
もう1つのDNAの直接導入法であるエレクトロポレーションは、細胞に短期間数千ボルトの電気ショックを与えるものであり、これにより、DNAは細胞膜を通過して細胞内に侵入することができる。この方法は細胞毒性が極めて強く、使用細胞によっては、高い死亡率と大きな変異原性を招くものである。
【0005】
他の幾つかの方法は、膜上に存在するレセプターによる、細胞内への遺伝子取込みのふるい分けを利用するものである。これらレセプターの特異的リガンド又は膜成分の特異的抗体を介して、DNAは細胞内に侵入することができる。即ち、DNA−リガンド複合体は、エンドサイトーシスの過程によって細胞内に侵入する。この方法は、リソソーム小胞内における複合体の破壊が著しいという事実により、使用が制限されている。これらの問題点を回避する目的で幾つかの方法が開発されたが、いずれも完全に満足し得るものではない。
【0006】
米国特許第5,635,383号は、核酸を細胞内に運搬する為の、ポリリシンを主成分とする別タイプの複合ベクターを開示している。
【0007】
米国特許第5,521,291号は、抗体を介してDNAに強い親和性を有する物質に結合したウイルスから形成されるコンジュゲートを使用する方法を開示している。この様なコンジュゲートの使用は高度の技術を必要とするものであり、ウイルスの使用は、或る程度の危険を招きかねない。
【0008】
これらの不具合を克服する試みとして、WO97/02840号には、生物活性物質を細胞質内及び/又は核内に運搬する為の免疫ベクターとして、生存細胞の内部に侵入し得るマウス抗DNA抗体又はこれらのF(ab’)2断片及びFab’断片を使用することを包含する、in vitroでの試験方法が開示されている。これらのベクターは有用性が高いが、それらの使用が複雑なケースもあり得ると考えられる。更に、抗体という小さくて複雑な分子を使用することは、これらの操作と利用に当たり、重大な不都合を招く可能性もある。
【0009】
WO99/07414号には、生物活性物質の細胞質内及び核内インターナリゼーションベクターとして、上述したWO97/02840号で開示されたマウス抗DNA抗体から誘導したペプチドをin vitroで使用することが可能である旨記載されている。
【0010】
これらのマウス由来ペプチドベクターは生殖細胞系でコードされており、突然変異を含まない為、抗原的にはヒトで認められるものに近いと考えられるが、ヒトにおける免疫反応の危険性を排除することはできない。
【0011】
従って、上述した問題点を回避し得るペプチド及びアミノ酸配列、即ち、ヒトにおける細胞インターナリゼーションのベクターとして、またはベクター内で使用することが可能であり、上述した危険性のないペプチド及びアミノ酸配列が切望されている。
【0012】
極めて多くの細胞調節は、タンパク質と細胞表面のグリコサミノグリカン(GAG)との相互作用に依存することが知られている(1−6)[括弧内の太字は添付の参考文献の番号を示す]。上記相互作用は、例えば止血の制御(7)、平滑筋細胞の増殖(8)、増殖因子の活性の発現(9)、酵素の脂肪分解活性の発現(10)、細胞外基質の完全性(11)等に干渉する。所定の系におけるこれらの生物学的作用は、1個又は特定の数のタンパク質と、細胞表面のGAGとの相互作用に起因する。GAGは、全ての真核細胞表面上に存在し、進化過程で高度に維持された成分である。GAGは糖類重合体である;例えばヘパリンはニ糖類重合体であり(α−1、4−2−イズロン酸→D−グルコサミン)、コンドロイチン硫酸は、ニ糖類N−アセチルコンドロシンの重合体であり、多数の硫酸基を含む為、負に荷電している。GAGと特異的に反応するタンパク質は全て、その配列中に、これらのタンパク質とGAGとの相互作用に関与する1個又はそれ以上のペプチドセグメントを含んでいる。これらセグメントの長さは、タンパク質によって異なるが、4個から30個のアミノ酸である。これらのペプチドの殆ど全部が正に荷電しており、多くの塩基性アミノ酸、特にリシンとアルギニンを含有している。これらのアミノ酸は、上記タンパク質とGAGとの相互作用に支配的に関与することが報告されている(1−6)。
【0013】
GAG、又はより一般的にはアミノグリカン、特にヘパリン、ヘパラン硫酸及びコンドロイチン硫酸に結合するペプチド(ヘパリンはアミノグリカンの一例であるが、「ヘパリンに結合するペプチド」という意味で総括的にPLHと呼ばれるペプチド)は、上述したペプチドの様に天然由来のもの、または人工的由来のものであり得る。これらは天然の形態又は重合体(二量体、三量体等々)の形態で使用することができる。
【0014】
本発明によれば意外にも、これらのペプチドがin vitroと同様にin vivoでも細胞内での対象物質のインターナリゼーション作用物質として使用し得ることが確認された。
【0015】
実際のところ、in vitroで周知の手法をin vivoに適用することは、in vitroという閉塞空間で試験するときには関与しない幾つかのパラメータ(バイオアベイラビリティー、免疫反応、等々)を測定することを包含している。更にin vitroからin vivoへの変更は、数多くの潜在的な相互作用(免疫反応、副作用、有効成分の遮断又は阻害、拒絶反応、等々)がin vivoでの操作に干渉する可能性があるという事実から、多くの危険を伴う作業でもある;その結果、in vitroでの手法をin vivoに適用したとしても所望の結果が得られる見込みは殆どない。
【0016】
そこで第一の目的によれば、本発明は、細胞質内及び/又は細胞核内への対象物質の侵入を促進する能力を備え、in vivoでアミノグリカンと反応することができることを特徴とするアミノ酸配列に関するものである。
【0017】
もう1つの目的によれば、本発明は、細胞質内及び/又は細胞核内への対象物質の侵入を促進する能力を備えており、ヒト由来のタンパク質から生じ、アミノグリカンと反応することができることを特徴とするアミノ酸配列を対象とするものである。
【0018】
より詳細には、いずれの場合においても、上記配列はヘパリン、コンドロイチン硫酸及びそれらの誘導体と反応することを特徴とするものである。
【0019】
本発明の一環として実施された研究結果から、ペプチドの侵入は4℃での細胞培養によって完全に阻止されることが明らかになった。更にアジ化ナトリウム(ATPaseの阻害因子)、ゲニステイン(チロシンキナーゼ及びATPへの結合の阻害因子)等の細胞代謝阻害因子によってもペプチドの侵入が部分的に阻害される。本発明のペプチド、更には当該ペプチドに結合した対象物質のインターナリゼーションの機序はエネルギーに依存している。即ち、本発明のペプチドを使用したベクターの調製は、受動系に属するのではなく、反対に、レセプターを介して行われるという点は注目に値すべきことである。本発明のアミノ酸配列は、in vivoでアミノグリカン、アミノグリカン硫酸、コンドロイチン及びコンドロイチン硫酸と反応する能力に加えて、細胞膜のレセプター上に固定されている為、このレセプターにより細胞膜を通過できるという能力によっても特徴付けられる。従って、本発明のアミノ酸配列は、細胞膜を受動的に通過することができる先行技術のペプチド運搬体とは区別される。
【0020】
この様に本発明のペプチドは、能動的機序により細胞膜を通過することができ、その後、細胞質内及び/又は細胞核内に入り込むことができ、細胞内への通過時に、運搬物質の大きさによって使用が制限されないベクターを使用可能にする能力を備えているという点でも注目すべきである。実際のところ、本発明のベクターは、小さな化学分子(低分子量)からプラスミド型タンパク質又は核酸分子(高分子量)までの薬剤を運搬することができる。従って、上記ベクターの使用は、細胞内タンパク質の治療また遺伝子治療の新しい手段を提供するものである。この様な本発明のベクターによる特殊な侵入能力は、「薬剤」を細胞内に選択的に導入することを可能にし、薬剤による副作用の潜在的な低減と効果指数の潜在的な上昇をもたらすものである。
【0021】
「ヘパリン又はコンドロイチン硫酸の誘導体」若しくは「ヘパリン又はコンドロイチン硫酸型アミノグリカン」とは、参考文献(1)−(3)で引用する公表文献の中で定義される全ての生成物又は副産物と解釈しなければならない。
【0022】
「侵入を促進する」とは、外部環境から細胞内環境へ、なかでも特に細胞質内及び/又は細胞核内への物質の通過又は転移であると理解される。この侵入は、例えば培養細胞の存在下にアミノ酸配列を培養する最初の工程と、引続き行なわれる上記細胞の固定と透過性上昇、次いで細胞内における当該アミノ酸配列の存在検出工程とを包含する細胞侵入試験といった様々な方法によって測定することができる。検出工程は、当該配列に対する標識抗体の存在下に新たに培養し、その後、細胞質内又は細胞核のすぐ近く、若しくは更に細胞核の内部で、当該配列と標識抗体との間の免疫反応を検出することによって行なわれる。更に検出は、本発明のアミノ酸配列を標識し、これらの細胞画分において上記標識の存在を検出することによっても行なわれる。細胞侵入試験は、例えば前に引用したWO97/02840号に記載されている。
【0023】
「対象物質」とは、特に生物学的、医薬学的、診断上、追跡上、又は農産物上の利益を有する全ての生成物と理解され、様々な起源、特にヒト、ウイルス、動物、真核生物又は原核生物、植物、合成等々に由来しており、簡単なオリゴヌクレオチドからゲノム又はゲノム断片に至る様々な大きさを有する核酸(リボ核酸、デオキシリボ核酸)であり得る。また、ウイルスゲノムまたはプラスミドであっても良い。更に上記物質は、酵素、ホルモン、サイトカイン、アポリポタンパク質、増殖因子、抗原、抗体等々であってもよい。或いは毒素、抗生物質、抗ウイルス分子または免疫調節因子であってもよい。
【0024】
一般に対象物質は、化学物質、生化学物質、天然物若しくは合成物であり、薬剤の有効成分も含まれる。分子量約500ダルトンの小さな分子、若しくは数千ダルトンのタンパク質等の大きな分子であってもよい。
【0025】
対象物質は、アミノ酸配列によって、別の作用物質によって、又は環境条件によってその場で直接活性化され得るか、又は活性化可能となり得る。
【0026】
本発明の範囲には、上記で定義した対象物質及びアミノ酸配列の結合も包含される。
【0027】
本発明の好ましい実施態様では、上述した危険性を回避する為に、アミノ酸配列は生殖細胞系でコードされており、突然変異(置換、欠失、付加等々)は含まない。
【0028】
本発明において特に好ましいアミノ酸配列は、ヒト細胞で合成されるタンパク質に由来するものである。ヒト細胞で合成される上記タンパク質は、ヘパリン型アミノグリカン又はコンドロイチン硫酸に結合するタンパク質から選択することが好ましい。例えば、ヒトリポタンパク質Bに由来するアミノ酸配列が挙げられる。
【0029】
一般にアミノ酸配列は、例えばリシン、アルギニン又はヒスチジンの様に多数の塩基性アミノ酸を含む。
【0030】
「多数」とは、少なくとも3以上を含まなければならない。
【0031】
本発明を実施する為の好ましいアミノ酸配列の一つのタイプは、下式:
a)(XBBBXXBX)n;b)(XBBXBX)n;c)(BBXmYBBXo)n;d)(XBBXXBX)n;及びe)(BXBB)n
[式中、Bは塩基性アミノ酸であり、Xは、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、又はチロシン等の、好ましくは疎水性の非塩基性アミノ酸であり、Yは直接結合又は1〜20個のアミノ酸を表わし、mは0〜5の整数であり、nは1〜10、好ましくは1〜3の整数であり、且つ、oは0〜5の整数である]
のいずれかに対応する少なくとも1個のアミノ酸群で構成されるか、又は上記アミノ酸群を含むものである。
【0032】
一般にアミノ酸配列は100個以下のアミノ酸、より好ましくは50個以下のアミノ酸、更に一層好ましくは25個以下のアミノ酸を含む。
【0033】
好ましくは本発明のアミノ酸配列は、6〜25個のアミノ酸を含む。
【0034】
本発明を実施する為の好ましいアミノ酸配列は、本明細書の一部をなす添付の配列番号:2,3,5,7,9,10、13,16,17,19,20,21,23,25,26,30,33,34,35,36,37,38及び39によって同定されるものである。このうち特に、配列番号:2,3,5,7,9,10,13,16,19,20,21,23,25,26,30,36及び38によって同定される配列が好ましい。
【0035】
本発明を実施する為の好ましい配列のもう一つのタイプは、ドメインの一方が、式:a)XBBBXXBX;b)XBBXBX;c)BBXmYBBXo;d)XBBXXBX;又はe)BXBBのアミノ酸配列を含んでおり、
且つ、ドメインの他方が、式:a)XBBBXXBX;b)XBBXBX;c)BBXmYBBXo;d)XBBXXBX;e)BXBB;又はf)抗体断片
[式中、Bは塩基性アミノ酸であり、Xは、好ましくは疎水性の非塩基性アミノ酸であり、Yは直接結合又は1〜20個のアミノ酸を表わし、mは0〜5の整数であり、且つ、oは0〜5の整数である]
のアミノ酸配列を含む、少なくとも二つのドメインで構成されるか、又は少なくとも2つのドメインを含むものである。
【0036】
特に興味深いアミノ酸配列は配列番号:1の配列であり、これは、(1)少なくともダイマーの形態で所望の特性を発揮し、そして(2)モノマー又はポリマーの形態では、それが結合している他のアミノ酸配列に上記特性を付与するか、又は当該配列が上記特性を既に有しているときには、これらの特性を顕著に増強することができる。同様にHBP3、HBP7、(HBP3)2、HBP6、HBP7、HBP10及びHBP13と呼ばれるペプチドも、この増強能力を有している。
【0037】
上記で定義したペプチドは、これらに共有結合又は非共有結合している分子を細胞内に運搬することができる為、対象物質を細胞内に運搬する有効なベクターとなる。
【0038】
下記表1に示す7個の配列は、細胞質内への運搬に当たり、特に有用である。これらは、(HB1)3、HBP6、(HBP3)2、HBP7、HBP11、HBP13及びHBP2配列である。
【0039】
【表1】
【0040】
核内への運搬に当たっては、このうち2つの配列が特に有用である。即ち、HBP10及びHBP15である。これら2つの配列は、塩基性アミノ酸を多く含有しており、より詳細には、細胞質内への運搬に有用な配列とは異なって、リシン残基を含まないという事実によって特徴付けられる。
【0041】
表1に示す各配列は、配列の総残基数に対して少なくとも20%のリシン残基を有しており、少なくとも50%の残基が塩基性アミノ酸である。
【0042】
本発明により、上記で定義したペプチドと、細胞内に侵入し得るポリペプチドベクターとの結合は、これらベクターの転移能力を顕著に向上することが明らかになった。
【0043】
更に本発明により、上記で定義したペプチド又はこれらのポリマー形態と、細胞膜上に存在するレセプターと反応する作用を有するリガンドとの結合は、当該リガンドの細胞膜上に固着する能力を顕著に高めることが明らかになった。
【0044】
もう1つの目的によれば、本発明は、対象物質を細胞内に運搬することを意図した組成物を調製する為の、上記で定義したアミノ酸配列の使用を対象とするものである。この様な本発明ペプチドの能力は、生体膜を通過して、特に血液脳関門、血液網膜関門、腸関門、肺関門を超えて活性物質を運搬するのに有用である。本発明のペプチドは、それらが結合している活性物質及び標的細胞の種類、特に上記関門の通過を必要とする細胞の種類に適合した投与形態によって使用できるという利点を有している。
【0045】
もう一つの実施態様では、本発明はペプチドベクターにおけるアミノ酸配列の使用に関するものである。上記アミノ酸配列の特性により、これらのベクターはヒトへの危険性も無く、ベクターに結合した対象物質の分解も伴うこと無しに、ヒトの細胞質内及び細胞核内への運搬目的で、容易に使用することができる。
【0046】
上記目的を達成する為には、特に、比較的大きなサイズの分子を細胞内部に運搬することができなければならず、且つ、ヒト免疫系によって異種抗原として認識されてはならない。
【0047】
下記表1に、本発明の幾つかのペプチドについて、ビオチン又はフルオレセイン(Marq)の様にこれらの検出を可能にする低分子量マーカーまたは生物学的対象物質(Subst)に結合した細胞質内及び/又は細胞核内の侵入レベルを示す。
【0048】
表1の2に示す結果は、以下に記載の実験データに基づくものである。
【0049】
【表1−2】
【0050】
これらの結果により、大量に核転移し得るペプチドは、正電荷が特にアルギニンの存在と、リシンのほぼ完全な不在によって構成されることが示唆される。
【0051】
本発明によるペプチドの1番目の群は、対象物質を細胞内に侵入させることができるが、核内へは殆ど又は全く侵入させないアミノ酸配列を含有している。例えば配列番号:2,3,17,18,19、20,21、33、34、37及び38の配列のペプチドが挙げられる。
【0052】
本発明によるペプチドの2番目の群は、細胞内及び細胞核内に対象物質を侵入させることが可能なアミノ酸配列を含有している。例えば配列番号:26、35及び39が挙げられる。
【0053】
本発明によるベクターは、上記で定義したアミノ酸配列で構成されるか、又は当該アミノ酸配列を含有することを特徴とするものである。
【0054】
或いは上記ベクターは、一方でアミノグリカンと反応するアミノ酸配列と、他方でヒト抗DNA抗体の可変部分に由来する核ペプチドと結合するものである。特にアミノグリカンと反応するアミノ酸配列がヒト由来の場合、同一分子内で、アミノグリカンと反応するアミノ酸配列と、ヒト抗DNA抗体の可変部分から誘導されるペプチドとが結合することは、対象物質の細胞内転移及び運搬に当たって特に有用なペプチドベクターの調製を実現可能とするものである。
【0055】
更に上記結合により、特に、ヒトの使用に適合した転移及び運搬ベクターが得られる。実際に上記で指摘した様に、WO97/02840号では、既知のマウス由来のペプチドベクターは生殖細胞系でコードされており、突然変異を含まない為、抗原的にヒトに認められるものに近い筈であるが、これらをヒトに注入すると、免疫反応を誘発する可能性がある。本発明によるPLH形態のペプチドベクター及び抗DNA抗体から誘導されるペプチドは、いずれもヒト由来であり、突然変異を含まず、生殖細胞系でコードされている為、上記の問題を回避することができる。
【0056】
ヒト抗DNAから誘導される上記ペプチドの一般的特徴は、WO99/07414号に記載されているマウス由来のペプチドのものに近いが、これらと区別し得る付加的な特性も有している。即ち:
1)細胞内に侵入する為には細胞の活性代謝(25〜39℃、好ましくは37℃の培養温度)を必要とするのに対し、マウスペプチドの場合は明らかに依存性が低い;
2)マウスベクターに比べ、DNAとの反応性が非常に弱い;
3)侵入能力は、細胞内に輸送しようとする分子により、有意に影響されない;
4)ヒト由来細胞は、他の由来細胞に比べて容易に侵入する。
【0057】
本発明に従い、PLH、及び、好ましくは多反応性の、1又はそれ以上の抗体断片、より詳細には抗体の超可変領域から生じる1又はそれ以上の断片で構成されるベクターを調製した。本発明の対象であるベクターは、好ましくは、抗体のH鎖断片を含むことを特徴とする。
【0058】
上記で引用したWO99/07414号では、サイズが小さく分子量も小さい、単量体免疫グロブリンであるモノクローナルIgGの断片のみしか使用していなかった。本発明により、非常に高分子量の、五量体免疫グロブリンであるIgMから生じる断片も使用できることが初めて明らかになった。実際のところ、現在に至るまで、本出願者の知る限り、この様な断片は大きなサイズと高い分子量を有するという特性による制限の為、IgM断片の細胞インターナリゼーションベクターとしての使用に関する研究は全く行なわれていなかった。
【0059】
従って、本発明は、1又はそれ以上のPLH、及び1又はそれ以上のIgM、若しくはIgG断片を含有することを特徴とする、細胞インターナリゼーションベクターを対象とするものである。
【0060】
好ましくは上記ベクターは、抗体のCDR2領域の全部又は一部を含有する。或いは上記ベクターは、抗体のCDR3領域の全部又は一部を含有する。より詳細には上記ベクターは、RTT79、NE−1及びRT72よりなる群から選択される、ヒト抗DNA抗体の少なくとも一つのCDR3領域を含むものである。
【0061】
もう1つの変法では、更に本発明の対象であるベクターは、CDR2領域の全部又は一部、若しくはCDR3領域の全部又は一部も含み得る。
【0062】
「全部又は一部」とは、ベクターが細胞内に侵入する能力を維持している(機能的同族体)ことを条件として、本発明のベクターが関与するCDR領域全体、又はその一部のみを含み得るものと解釈しなければならない。「CDR領域の一部」とは、1又はそれ以上のアミノ酸末端を欠くCDR領域と解釈しなければならない。同時に1又はそれ以上の内部残基が欠失されている、若しくは別のアミノ酸、好ましくは同じ性質のアミノ酸(例えば塩基性アミノ酸)で置換されているCDR領域であってもよい。
【0063】
本特許明細書に示す例の一部は、ヒトリポタンパク質Bから生じる配列番号:1の使用に基づくものであるが、当業者であれば、明らかに、あらゆる天然又は人工PLHを使用することができる。
【0064】
上記で述べた様に本発明によるペプチドは、特に、対象物質の細胞内運搬及び転移に非常に適合するものである。
【0065】
従って、本発明は、自然に又は人為的に、細胞及び/又は当該細胞の核に組込まれ得る対象物質を含有することを特徴とする、上記ベクターの提供を目的とするものである。
【0066】
より詳細には本発明は、侵入能力が、結合している対象物質の性質に殆ど依存しないベクターを対象とするものである。マウスベクターと比較した場合における上記ヒトベクターに固有の特徴は、これらのベクターの予測される用途に対し、何よりも重要な利点である。しかし、本発明は同時に、結合している対象物質に適合するベクターにも考慮している。
【0067】
「結合」とは、対象物質とベクターとの間の物理的結合を可能にするあらゆる種類の相互作用であると理解され、生物学的環境及び/又は本発明のペプチドによって運搬される対象物質によって開裂可能な又は非開裂可能な結合、更には活性物質に結合したベクターを投与する生物に適用される物理的手段によって開裂可能な結合も包含される。対象物質の生物学的作用が発現する為には、当該物質がベクターから遊離することが必要な場合がある。ベクターから遊離することが好ましい対象物質の例として、ドキソルビシンが挙げられる。
【0068】
しかし、ベクターが細胞へ侵入する前に又は侵入中に分離しない様、相互作用は充分強固でなければならない。上記理由により、本発明による好ましい結合は共有結合であるが、非共有結合であっても構わない。対象物質は、両末端のいずれかで、若しくはアミノ酸の1つの側鎖で、ペプチドに直接結合することができる。更に対象物質は、ペプチドの両末端のいずれかで、若しくはアミノ酸の1つの側鎖で、結合鎖を介して間接的に結合することも可能である。
【0069】
結合は、当業者に周知の化学的、生化学的、又は酵素的若しくは遺伝学的結合といったあらゆる方法によって行なわれるが、一般に4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボン酸スクシニミジル(SMCC)型のホモ又はヘテロ官能性架橋試薬を使用することが好ましい。更に結合手段として、アルキル、アリール、アルアルキル又はペプチド基、エステル、アルキル、アリール又はアルアルキルのアルデヒド又は酸、マレイミル安息香酸、マレイミルプロピオン酸の誘導体及びスクシニミジル誘導体等の無水物、スルフヒドリル又はカルボキシル基、臭化又は塩化シアンの誘導体、カルボニルジイミダゾール、スクシニミドのエステル、又はハロゲン化スルホン酸を含む二又は多官能性作用物質より選択されるものが挙げられる。
【0070】
本発明のもう一つの実施態様によれば、上記対象物質の結合は、当業者に周知のあらゆる遺伝子工学手法によっても実施することができる。「遺伝子工学」とは、ペプチドベクターをコードするDNA対象遺伝子の相補的DNAの5’及び/又は3’の相でクローン化される発現ベクターの使用であると理解される。融合タンパク質の発現はプロモーターの制御下になされる。発現系は、融合タンパク質の生成の為、原核又は真核宿主細胞で使用することができる。
【0071】
最初の実施態様では、本発明によるアミノ酸配列のN末端で上記対象物質の結合を行なう。本発明の第二の実施態様では、上記配列のC末端で当該対象物質の結合を行なう。
【0072】
意外にも本発明の対象であるベクターは、生物活性を増強し得ると共に、結合する上記物質の毒性を、潜在的に低減し得ることが示された。従って、本発明は更に、結合している対象物質の生物活性を高めることができることを特徴とするベクターを対象とするものである。
【0073】
また、本発明の対象であるベクターは、in vitroで細胞をトランスフェクションし得ることも示された。
【0074】
本発明の特定の実施態様では、ベクターは、インターナリゼーションする対象物質に対し、強い親和性を有する少なくとも一つの天然の分子(所謂「固定分子」)を介して対象物質に結合される。対象物質に対する天然の固定分子の親和性により、運搬体が上記対象物質と非共有結合的に相互作用し、しかも細胞内転移の際に相互作用することが可能になる。
【0075】
この種の運搬体における特に興味深いもう一つの利点は、対象物質に対する天然の固定分子の親和性によって、これら二つの結合が、化学的又は生化学的相互作用を伴うこと無く、全く自然に行われるということである。
【0076】
この種の運搬体は、その大きさ及び/又は構造の為に、アミノ酸配列に直接結合するのが困難であると判明したときに特に有用である。また、この種の運搬体は、対象物質があまり安定でなく、その結合に関与する何らかの化学的相互作用によって物質が破壊され得るか、又はその活性が変化され得るときにも、非常に有用であると考えられる。
【0077】
更に本発明による運搬体は、一つの対象物質のみに特異的なものではなく、逆に幾つかの異なる対象物質を細胞内及び/又は細胞核内にインターナリゼーションすることができる。
【0078】
更に本発明は、本発明によるアミノ酸配列を含む真核細胞に関するものである。また本発明は、本発明のベクター及び/又は運搬体を含む真核細胞に関するものである。本発明はまた、本発明のベクター及び/又は運搬体によってトランスフェクションされたあらゆる種類の真核細胞に関するものである。
【0079】
更に本発明は、in vitroで対象物質を細胞内に運搬し、当該対象物質の生物活性を向上させる方法に関し、以下の工程を包含するものである:
a)上記で述べた本発明によるアミノ酸配列、ベクター、又は運搬体へ物質を結合させる工程、及び
b)上記細胞の能動代謝を可能にする培養温度において、上記結合産物と細胞をインキュベーションする工程。
【0080】
この様な温度は25〜39℃、好ましくは37℃である。
【0081】
更に本発明は、有効成分として、本発明による少なくとも一つの対象物質を担うベクター若しくは運搬体、又は本発明に従ってトランスフェクションされた真核細胞を含む組成物に関するものである。本発明はまた、上記組成物を、生物学的、医薬、化粧品及び農産物の製剤化及び調製に使用することを対象とするものである。
【0082】
本発明は、少なくとも一つの対象物質を担うベクター及び運搬体の、医薬的に許容される塩又は酸付加塩、水和物、エステル、溶媒和物、前駆物質、代謝産物又は立体異性体を包含するものである。更に本発明は、医薬的に許容される溶媒、希釈剤又は賦形剤と結合する少なくとも一つの対象物質を担うベクター及び運搬体を含む医薬製剤を包含するものである。
【0083】
「医薬的に許容される塩」という表現は、一般に遊離塩基を適当な有機酸又は無機酸と反応させて調製することが可能な本発明によるアミノ酸配列の無毒性塩を意味する。これらの塩は、遊離塩基の生物学的効果と同等の特性を有している。この様な塩の代表的な例として、酢酸塩、アンソネート(4,4−ジアミノスチルベン−2,2’−ジスルホネート)、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、カムシレート(camsylates)、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、ジクロロヒドレート、エデト酸塩、エディシレート、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキサフルオロリン酸塩、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、ブロムヒドレート、クロルヒドレート、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオネート、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシレート、硝酸塩、3−ヒドロキシ−2−ナフトエート、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモエート(1,1−メチレン−ビス−2−ヒドロキシ−3−ナフトエート、エンボエート)、パントテン酸塩、リン酸塩/ニリン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロネート、プロピオン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリチル酸塩、スラメート、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクレート、トシレート、トリエチオダイド、吉草酸塩及びN−メチルグルカミンアンモニウム塩等の水溶性及び水不溶性の塩が挙げられる。
【0084】
対象者は、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のペプチド、ベクター又は運搬体の医薬上有効な量で治療することができる。「医薬上有効な量」という表現は、研究者又は担当医師が期待する組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を得る為に、対象物質を充分侵入させることができる量を意味する。
【0085】
更に本発明は、対象物質の細胞内又は細胞核内への導入に適した医薬組成物を対象とするものである。上記組成物は、単独で、或いは1又はそれ以上の医薬上許容される担体と組合わせて、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明によるベクター又は運搬体の有効量を含む。上記組成物は、非常に毒性が低いか、又は全く毒性がないという意味で特に有用である。
【0086】
少なくとも一つの対象物質を担う、本発明によるベクター若しくは運搬体、またはそれらの塩の投与は、治療薬が許容し得る任意の投与方法によって行なうことができる。これらの方法には、例えば経口、鼻腔、非経口的な全身投与、又は例えば経皮的な局所投与、若しくは更に例えば外科的頭蓋内経路による中枢投与、或いは更に眼内投与が含まれる。
【0087】
経口投与は、錠剤、ゼラチンカプセル、軟カプセル(遅延又は持続放出性製剤を含む)、丸剤、粉末、顆粒剤、エリキシル、チンキ剤、懸濁液、シロップ及び乳剤によって行なわれる。これらの剤型は特に、腸関門の通過に適している。
【0088】
非経口投与は、一般に皮下、筋肉内又は静脈内注射、或いは持続注入によって行なわれる。注射用組成物は、懸濁液又は溶液の一般形態、或いは液体中への即時溶解に適した固体形態として調製することができる。これらの剤型は特に、血液脳関門の通過に適している。
【0089】
非経口投与に関する可能性の一つとして、例えばUS−A−3 710 795号では、一定用量レベルの維持を保証する徐放性又は持続放出性システムの移植を使用する。
【0090】
鼻内投与に当たっては、適切な鼻内ビヒクルを使用することができる。
【0091】
経皮投与に当たっては、当業者に周知の経皮パッチを使用することができる。経皮放出システムにより、持続的投与が可能になる。
【0092】
その他の好ましい局所製剤として、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー及びゲルが挙げられる。
【0093】
予想される投与方法に応じて、化合物は固体、半固体又は液体の形態とすることができる。
【0094】
遊離状態又はゼラチンカプセルに封入された状態の錠剤、丸剤、粉末又は顆粒剤等の固体組成物では、有効成分を以下に記載のものと組合わて使用することができる:a)希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース及び/又はグリシン;b)潤滑剤、例えばシリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウム又はカルシウム塩及び/又はポリエチレングリコール;c)結合剤、例えばケイ酸マグネシウム及びケイ酸アルミニウム、アミドンペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び/又はポリビニルピロリドン;必要に応じてd)崩壊剤、例えばアミドン、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩、又は発泡性混合物;及び/又はe)吸収剤、着色料、香料及び甘味剤。賦形剤としては、例えばマンニトール、ラクトース、アミドン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム及び製剤品質上の類似化合物が挙げられる。
【0095】
坐剤等の半固形組成物では、賦形剤は、例えば乳剤又は脂肪懸濁液であるか、又はポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコールを主成分とすることができる。
【0096】
特に注射用又は軟カプセルに封入する液体組成物は、例えば水、生理的血清、水性デキストロース、グリセロール、エタノール、油及び類似化合物等の医薬上純粋な溶媒への有効成分の溶解、分散等々によって調製することができる。
【0097】
更に、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のベクター又は運搬体は、単層小胞、単層大型胞及び多層小胞の形態等の、リポソームタイプの放出系形態で投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンを含む様々なリン脂質から生成される。一実施態様では、US−A−5 262 564号に記載されている様に、液体成分の薄層を薬剤の水溶液で水和し、当該薬剤を包み込む脂質層を形成することができる。
【0098】
本発明による組成物には、滅菌する、及び/又はアジュバント及び防腐剤、安定剤、湿潤剤又は乳化剤、溶解を促進する作用物質、浸透圧を調節する為の塩及び/又は緩衝剤等の無毒性の補助剤が含まれる。更に本発明の組成物には、治療上有用な他の物質が含まれる。上記組成物は夫々、混合、顆粒化又は被覆等の一般的な方法で調製することができ、約0.1−75%、好ましくは約1−50%の有効成分を含有する。
【0099】
更に、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のベクター又は運搬体は、標的可能な薬剤の保持体等の可溶性ポリマーと結合することができる。この様なポリマーとして、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシ−エチル−アスパナミド−フェノール又はパルミトイル残基で置換されたポリ(エチレンオキシド)−ポリリシンが挙げられる。更に本発明の化合物は、制御された薬剤の放出を実施する為に有用な一連の生分解性ポリマー、例えばポリ(乳酸)、ポリ(エプシロン−カプロラクトン)、ポリ(ヒドロキシ酪酸)、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート及び網状又は両親媒性の連続するヒドロゲルのコポリマーに結合することができる。
【0100】
少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のベクター又は運搬体の投与用量は、対象者のタイプ、種、年齢、体重、性別及び医学的状態;治療状態の重症度;投与経路;対象者の腎及び肝機能の状態、並びに使用する個々の化合物又は塩の性質を含めて、様々な因子に応じて選択される。試験を担当する医師又は獣医師であれば、一般に、治療する医学的状態の進行を予防する、阻止する若しくは停止させる為に必要な対象物質を担うベクター又は運搬内の有効量を容易に決定し、処方するだろう。
【0101】
上記医薬組成物の一つは、0.1〜99%、好ましくは1〜70%の有効成分を含み得る。
【0102】
一例として、少なくとも一つの対象物質を担う、本発明によるベクター又は運搬体の経口投与用量は、指示される作用目的で使用するとき、経口経路で約0.05〜1,000mg/日であり、好ましくは0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100.0、250.0、500.0及び1,000.0mgの有効成分を含む錠剤の形態で投与される。少なくとも一つの対象物質を担うベクター又は運搬体の有効血漿レベルは、1日当り0.002mg−50mg/kg体重の範囲内である。
【0103】
少なくとも一つの対象物質を担う、本発明のベクター又は運搬体は、1日1回の用量で投与しても良いし、1日当たりの合計量を1日2回、3回又は4回用量に分けて投与しても良い。
【0104】
特定の適用に当たっては本発明は、本発明による少なくとも一つのベクター、運搬体及び/又は細胞によって構成されるか、又はこれらを含む、in vitroで使用する為の診断薬に関するものである。この様な診断薬は、in vivoで使用することもできる。
【0105】
従って、本発明は、上記診断薬を含む診断キットも対象とするものである。より詳細には上記診断キットは、一又はそれ以上の容器中に、予め定められた量の本発明組成物を含んでいる。
【0106】
同様に本発明によるアミノ酸配列、若しくは上記アミノ酸配列を含むベクター及び/又は運搬体、或いは当該ベクターを用いてトランスフェクションされる細胞は、予防目的で、例えば非制限的に、ウイルス感染、転移、細胞のアポトーシス(変性性疾患、組織虚血…)の予防目的で、或いは治療目的で、例えば感染症(ウイルス、細菌…)、癌及び血管新生性疾患の治療目的で、in vivoで使用され得る。
【0107】
本発明の他の利点及び特徴は、添付の図面を参照して、下記の実施例によって明らかになるだろう。
【0108】
I−実験材料及び方法
1)細胞系
a)正常細胞:
−PtK2、カンガルーラット腎線維芽細胞
−3T3、マウス胚線維芽細胞
−HUVEC、ヒト内皮細胞
−CHO、チャイニーズハムスター卵巣細胞
−HUVEC、細胞増殖遺伝子によってトランスフェクションした内皮細胞
−CHO、ハムスター腎細胞
−CHO−745、キシロシルトランスフェラーゼ合成欠損のCHO系統細胞
b)腫瘍細胞:
−H1299、ヒト肺癌
−HH9、増殖因子をコードする遺伝子によってトランスフェクションしたヒト乳房腫瘍上皮細胞
−MCF7、ヒト腫瘍上皮細胞
−ras MCF7、ras遺伝子によってトランスフェクションしたMCF7細胞
−HeLa、ヒト子宮頸癌
−HCT116、ヒト結腸癌
−HT−29、ヒト結腸腺癌
−LS174T、ヒト結腸腺癌
−B16−F10、マウス黒色腫細胞
−Daudi、ヒトバーキットリンパ腫
c)細胞培養:
−2%L−グルタミン、1%ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)及び10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地(完全培地)中、5%CO2の存在下に37℃で細胞を培養した。−CHO及びCHO−745細胞は、2%L−グルタミン、1%ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)及び6%ウシ胎児血清を含むαMEM培地(完全培地)中、5%CO2の存在下に37℃で培養した。
【0109】
2)ペプチドの調製
a)化学合成
当業者に既知の手法に従い、(Altergen and Neosystem)ペプチド合成を行った。ペプチド合成は、Fmoc樹脂上の固相で実施した。トリフルオロ酢酸(TFA)で開裂させ、ペプチドを半分採取してHPLC−CR C5カラムで精製し、0.1%TFA溶液及びTFA中アセトニトリルの勾配(10−70%)にかけて溶出した。凍結乾燥したペプチドを0.15M NaClに溶解した。
【0110】
b)本発明のペプチドを含むタンパク質の調製を可能にする分子の構築
分子生物学的手法により、一旦、適切な細胞内に導入すると、ベクター化された高分子の合成が可能なプラスミドを構築することができる。
−組換えタンパク質の発現ベクターの構築:
添付の図10は、本発明のペプチド配列を含む組換えタンパク質の発現が可能なベクターの調製法を示す。原核生物pQE30ベクター(Qiagen)は、6XHis配列との融合タンパク質(又は組換えタンパク質)の形態における遺伝子発現を可能にする。このベクターは、ColEl複製起点、IPTGによって誘導されるT5ファージの強力なプロモーター、アンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子及び6XHis配列の相補的DNAのクローン化を可能にする、6XHis標識をコードする配列の3’側のマルチクローニングサイトを担っている。
【0111】
63merの相補的オリゴヌクレオチド:
・PAV1U:
5' gatccgtaaaacgaggactaaaactacgacacgtacgaccacgagtaacacgaatggacgtaa3'
PAV1L:
5' gatcttacgtccattcgtgttactcgtggtcgtacgtgtcgtagttttagtcctcgttttacg 3'をハイブリダイズした。得られたDNAセグメントは、5’側にBamHI部位及び3’側にBglII部位を有していた。このセグメントはペプチド配列PAV1:VKRGLKLRHVRPRVTRMDVをコードする。この断片をpQE30ベクターのBamHI部位でクローン化した。エプスタイン−バーウイルス(EBV)のシマウマウイルスタンパク質(BZLF1)又は35アミノ酸の核局在ドメインを欠失したシマウマタンパク質をコードする相補的DNA(cDNA)をPCRによって得た。これらをHis−PAV1又はpQE30ベクターのBamHI部位でクローン化した。生じたプラスミドは、大腸菌の形質転換後His6−シマウマ−PAV1、His6−シマウマΔnls−PAV1、His6−シマウマ及びHis6−シマウマΔnls組換えタンパク質の発現を可能にする。
【0112】
−組換えタンパク質の誘導、抽出及び精製
40μg/mlのアンピシリンを添加したルリアベルタニ培地中の指数増殖期の菌培養物に、1mMのIPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を添加し、37℃で組換えタンパク質の産生を誘導した。IPTGの添加から12時間後、菌を5700gで15分間遠心分離にかけた。得られた沈殿物を5溶の変性溶解緩衝液(20mMトリス−HCl pH7.8;0.5M NaCl;10%グリセロール;6Mグアニジン−HCl)に加えた。ゆっくり攪拌しながら外気温度で20分間インキュベーションした後、得られた溶解物を4℃、15000gで30分間遠心分離にかけて清澄化した。組換えタンパク質を含む上清を−80℃で保存した。
【0113】
組換えタンパク質6XHisを、予め変性溶解緩衝液で平衡化させた「TALON」(CLONTECH)樹脂カラムでのアフィニティークロマトグラフィーで精製した。10mMイミダゾールを含む変性溶解緩衝液10溶で樹脂を連続して3回洗浄した後、カラムに結合した組換えタンパク質を、20mMトリス−HCl pH7.8;0.5M NaCl;10%グリセロール;0.5mM PMSF緩衝液中、グアニジン−HClの6Mから0Mまでの勾配にかけて精製した。イミダゾールpH8.0の20mMから1Mまでの勾配によって組換えタンパク質を溶出した。種々の溶出物を12%変性SDS−アクリルアミドゲルで分析した。精製タンパク質を含む分画を収集し、20mM HEPES pH7.5、150mM NaCl緩衝液に対して4℃で2時間透析した。タンパク質を濃縮し、アリコートに分けて液体窒素中で速やかに冷凍し、−80℃で保存した。
【0114】
3)使用したペプチド
a)非官能基化ペプチド
以下の配列(配列番号1−配列番号48)をST−25規格に従って付属物にリストする。
【0115】
配列番号1。以下HBP1とも称される。ヘパリンと反応し、ヒトリポタンパク質Bのアミノ酸配列(3358−3372)に由来するペプチド(12)。
【0116】
配列番号2。以下(HBP1)2とも称される、配列番号1の二量体ヘパリンと反応するペプチド。
【0117】
配列番号3。以下(HBP1)3とも称される、配列番号1の三量体ヘパリンと反応するペプチド。
【0118】
配列番号4。マウス抗DNAモノクローナル抗体F4.1の超可変領域CDR3に対応するペプチド(13)。
【0119】
配列番号5。配列番号1及び配列番号4を含むペプチド。
【0120】
配列番号6。マウスモノクローナル抗体F4.1のCDR2及びCDR3領域の一部を含むペプチド(13)。
【0121】
配列番号7。配列番号1及び配列番号6を含むペプチド。
【0122】
配列番号8。ヒト抗DNAモノクローナル抗体RTT79の超可変領域CDR3に対応するペプチド(14)。
【0123】
配列番号9。配列番号1及び配列番号8を含むペプチド。
【0124】
配列番号10。以下No.1047とも称される。ヘパリンと反応し、配列番号1及びヒト抗DNAモノクローナル抗体NE−1の超可変領域CDR3に対応するペプチドの配列を含むペプチド(15)。
【0125】
配列番号11。配列番号1及びヒト抗DNAモノクローナル抗体RT72の超可変領域CDR3に対応するペプチドの配列を含むペプチド(16)。
【0126】
配列番号12。3T3細胞のNLS(核局在シグナル)配列及び配列番号6を含むペプチド。
【0127】
配列番号13。配列番号1及びヒト抗DNAモノクローナル抗体NE−1のCDR2及びCDR3領域の配列を含むペプチド。
【0128】
配列番号14。マウスモノクローナル抗体F4.1のCDR3領域の一部及び配列番号6を含むペプチド。
【0129】
配列番号15。ヒト抗DNAモノクローナル抗体NE−1の超過片領域CDR3に対応するペプチドの配列を2回含むペプチド。
【0130】
配列番号16。配列番号15中、13−19位に配列番号1を含むことから生じるペプチド。
【0131】
配列番号17。HBP4とも称される。ヒトリポタンパク質Eのアミノ酸配列から誘導される、ヘパリンと反応するペプチド(12)。
【0132】
配列番号18。神経筋接合部の分化を調節する細胞外基質タンパク質、アグリン(agrine)(17)のアミノ酸配列から誘導され、ヘパリンと反応するペプチド。
【0133】
配列番号19。配列番号18の二量体。
【0134】
配列番号20。「インスリン増殖因子結合タンパク質」のアミノ酸配列から誘導される、ヘパリンと反応するペプチド(18)。
【0135】
配列番号21。HBP6とも称される。血小板増殖因子のA鎖のC末端部分のアミノ酸配列から誘導される、ヘパリンと反応するペプチド(19)。
【0136】
配列番号22。12個のリシン(K)及び配列番号6を含むペプチド。
【0137】
配列番号23。12個のリシン(K)及び配列番号5を含むペプチド。
【0138】
配列番号24。抗菌作用を有するペプチド(29)。
【0139】
配列番号25。以下HBP2とも称される。ヘパリンと反応し、「インスリン様増殖因子結合タンパク質」の配列に対応するペプチド(18)。
【0140】
配列番号26。以下(HBP3)2とも称される。ヘパリンと反応する、ヒトスーパーオキシドジスムターゼの配列のC末端部分から誘導されるペプチドの二量体ペプチド(20)。
【0141】
配列番号27。ヘパリンと反応し、アミノ酸がD立体配置にある配列番号26の配列に対応するペプチド。
【0142】
配列番号28。その配列が配列番号26の配列から誘導され、αvインテグリンに選択的に結合するRGDモチーフを含む、ヘパリンと反応するペプチド(21)。
【0143】
配列番号29。以下HBP1−HBP4とも称される。ヘパリンと反応し、配列番号1及び配列番号17のペプチドで構成されるペプチド。
【0144】
配列番号30。以下HBP7とも称される。ヘパリンと反応し、表皮細胞増殖因子(EGF)の配列のC末端部分から誘導されるペプチド(22)。
【0145】
配列番号31。ヘパリンと反応し、その配列が、アミノ酸が表裏の位置にある配列番号12であるペプチド。
【0146】
配列番号32。ヘパリンと反応し、アミノ酸がD立体配置にある配列番号30の配列に対応するペプチド。
【0147】
配列番号33。以下HBP8とも称される。ヘパリンと反応し、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)の配列の一部を含むペプチド(6)。
【0148】
配列番号34。以下HBP9とも称される。ヘパリンと反応し、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の配列の一部を含むペプチド(23)。
【0149】
配列番号35。以下HBP10とも称される。ヘパリンと反応し、腸粘素の配列のC末端部分に対応するペプチド(24)。
【0150】
配列番号36。以下HBP11とも称される。ヘパリンと反応し、ヒトインターフェロンγのC末端配列の一部を含むペプチド(25)。
【0151】
配列番号37。以下HBP12とも称される。ヘパリンと反応し、ヒトインターロイキン12のサブユニットp40の配列の一部を含むペプチド(26)。
【0152】
配列番号38。以下HBP13とも称される。ヘパリンと反応し、間質細胞から誘導される1α因子の配列の一部を含むペプチド(27)。
【0153】
配列番号39。以下HBP15とも称される。ヘパリンと反応し、「ヘパリン結合たんぱく質」(CAP37)の配列の一部を含むペプチド(28)。
【0154】
配列番号40。N末端に13個のリシンが付加された配列番号10(1047)の配列のペプチドに対応する、ヘパリンと反応するペプチド。
【0155】
配列番号41。N末端に13個のリシンが付加された配列番号28((HBP3)2)の配列のペプチドに対応する、ヘパリンと反応するペプチド。
【0156】
配列番号42。N末端に13個のリシンが付加された配列番号39(HBP10)の配列のペプチドに対応する、ヘパリンと反応するペプチド。
【0157】
配列番号43。抗菌作用を有し、配列番号10(1047)及び配列番号24の配列のペプチドを含むペプチド。
【0158】
配列番号44。抗菌作用を有し、配列番号24及び配列番号30(HBP7)の配列のペプチドを含むペプチド。
【0159】
配列番号45。抗菌作用を有し、配列番号24及び配列番号38(HBP13)の配列のペプチドを含むペプチド。
【0160】
配列番号46。N末端にグリシン−フタロイルが付加された配列番号26(HBP3)2の配列のペプチドを含むペプチド。
【0161】
配列番号47。N末端にサリチリルモチーフが付加された配列番号21(HBP6)の配列のペプチドを含むペプチド。
【0162】
配列番号48。C末端にサリチリルモチーフが付加された配列番号21(HBP6)の配列のペプチドを含むペプチド。
【0163】
b)官能基化されたペプチド
これらのペプチドは上記の配列番号1〜48に対応するが、N末端側に、対象物質への共有結合を可能にする1個のシステイン(下記参照)若しくはストレプトアビジン又はペルオキシダーゼに複合したアビジンとペプチドの非共有結合を可能にするビオチン(下記の(1)及び(2)参照)を担っている。
【0164】
II−ペプチドの侵入機序
1)グリコサミノグリカン(GAG)の関与
ペプチドは、全ての真核細胞の膜上に存在するGAGを介したエンドサイトーシスによって細胞内に侵入する。ペプチドの侵入におけるこれらの役割を調べる為、以下の試験を行なった。
【0165】
a)ヘパリン(50μg/ml)を細胞と共に1時間インキュベーションした後、0.2μg/mlのペプチド−ペルオキシダーゼ複合体を2時間にわたって加えた。次に細胞を溶解し、ペルオキシダーゼを定量した。
【0166】
50μg/mlのヘパリンは、H1299及びHeLa細胞において全てのペプチドのインターナリゼーションを完全に阻害した。
【0167】
これら2つの細胞型について、ペルオキシダーゼに結合したペプチドの侵入の50%を阻害する為に必要なヘパリンの量を、漸増濃度のヘパリンとペプチド−ペルオキシダーゼ複合体と共に細胞をインキュベーションして評価した。下記表2に、ペプチドのインターナリゼーション阻害結果をヘパリンの濃度(μg/ml)で示す。
【0168】
【表2】
【0169】
これらの実験により、ペプチドの侵入における硫酸ヘパリンの役割が明らかになった。
【0170】
b)CHO−745細胞をCHO細胞から誘導した。これらは、膜のコンドロイチン硫酸及びヘパランの形成に関与するキシロシルトランスフェラーゼを欠損している。ペプチド−アビジンペルオキシダーゼ複合体は、試験したペプチドに関わりなく、CHO−745細胞内には侵入しない。
【0171】
このことは、ペプチドの侵入における細胞膜のコンドロイチンヘパラン硫酸が重要であることを示している。
【0172】
2)細胞代謝の関与
細胞内に侵入するペプチドの生物学的機序及びこれらの分画を理解する為に、或る細胞画分への作用が特異的な薬剤を用いて実験を行った。ペプチド−ペルオキシダーゼを0.2μg/ml濃度のH1299細胞と共に薬剤の存在下又は不存在下でインキュベーションした。細胞を溶解し、細胞溶解産物中のペルオキシダーゼを定量した。
【0173】
下記表3に、薬剤なしでインキュベーションした細胞溶解産物に基づいて得られた数値と対比させることにより算出した、ペプチドのインターナリゼーション阻害率を示す。
【0174】
【表3】
【0175】
試験に用いたペプチドの侵入は、全てのペプチドにおいて、細胞を4℃でインキュベーションすると完全に阻止された。ペプチドの侵入は、アジ化ナトリウム(ATPase阻害因子)、ゲニステイン(チロシンキナーゼ及びATPへの結合の阻害因子)等の細胞代謝阻害因子によって一部阻害された。従って、インターナリゼーションの機序はエネルギーに依存することが分かる。
【0176】
ペプチドHBP3及びHBP7の侵入は、クロロキンにより、同程度に阻害されるが、これは、同じ画分(エンドソーム小胞、小胞体)への細胞質のインターナリゼーションを反映しているのに対し、塩素酸ナトリウム及び塩化アンモニウム(細胞内輸送を妨げるエンドソーム小胞の酸性化を回避する)では、配列番号35のペプチドのインターナリゼーションに対し、遥かに低い割合しか作用しなかった。このことは、上記ペプチドは、種々の毒素が作用するのと同様の機序によるが毒性を発揮すること無く、細胞内に侵入することを示唆している。ゴルジ体までの細胞内経路及び逆行輸送は、ペプチドによって異なるものと思われる。
【0177】
III.結果
DNA及びヘパリンと反応するペプチド能の評価
DNA上及びヘパリン上への、ペプチド配列番号1〜21の固定能を、DNAまたはヘパリンで感作したELISAプレート上で評価する。ビオチニル化ペプチドの希釈液を上記プレート上に置き、ペルオキシダーゼに接合されたストレプトアビジンを用いてその固定能を定量化する。ペルオキシダーゼ活性は、基質としてオルトジアニシジン及びH2O2を用いて定量する。DNAまたはヘパリンへの各ペプチドの結合活性は、50%の固定率を得るのに必要なペプチドの量(×10-6M)で評価する。得られた結果を下記表4に示す。
【0178】
【表4】
【0179】
この表より、配列番号1のDNAへの親和性は非常に低いのに対し、その二量体(配列番号2)及び三量体(配列番号3)の親和性は非常に高いことが分かる。更に配列番号1とペプチドベクターとの会合は、上記ベクターのDNAへの親和性をかなり高めている様に思われる(配列番号4と5、配列番号6と7、配列番号8と9、及び配列番号15と16とを比較すること)。
【0180】
同様に配列番号17及び配列番号18のDNA、ヘパリン、及びコンドロイチン硫酸への親和性は非常に低い。これに対し、配列番号18(配列番号19)の二量体の上記分子に対する親和性は、非常に高い。配列番号20及び21は非常に多数のアミノ酸を含んでおり、そのうち多数の塩基性アミノ酸が、DNA、ヘパリン、及びコンドロイチン硫酸に対して優れた親和性を有している。
【0181】
様々なプロテオグリカン(Kd×10-9M)、ヘパリン、及びコンドロイチン硫酸に対するペプチド配列番号25〜39の結合活性を、様々な抗原上で50%固定率を得るのに必要なペプチド量で評価する。これらの結果を下記表5に示す。
【0182】
【表5】
【0183】
この表より、ヘパリンへのペプチド配列番号33(HBP8)、36(HBP11)、及び37(HBP12)の親和性は、親和性が平均で20〜80×10-9Mである他のペプチドに比べて明らかに低い(>100×10-9M)ことが分かる。コンドロイチン硫酸A、B、及びCとの様々なペプチドの結合活性は、ヘパリンへの結合活性と概ね同程度である。従って、ペプチド配列番号34(HBP9)及び配列番号38(HBP13)の結合活性は、ヘパリンに対しても三種のコンドロイチンに対しても46〜50×10-9Mであるが、一方、ペプチド配列番号33(HBP8)、36(HBP11)、及び37(HBP12)の結合活性は、ヘパリンに対しても三種のコンドロイチンに対しても>100×10-9Mである。修飾ペプチド配列番号28(HBP3+RGD)では、ヘパリンへの結合活性が消失している。
【0184】
2)細胞内へのペプチドの浸透性評価
N−末端にビオチンを有する様々なペプチドの存在下に、培養培地中の濃度を漸減させて(50〜6μg/ml)種々の時間(1〜18時間)、細胞を培養する。
【0185】
培養終了後、上記細胞を、PBS(0.01Mリン酸カリウム緩衝液pH7.4で緩衝させた0.15MのNaCl)で3回洗浄した後、エタノール中にて−20℃で15分間固定する。ペプチドの浸透性は、ペルオキシドに接合されたストレプトアビジンと30分間培養させた後、評価する(ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼをS−POと略す)。次いで、このS−POを除去し、上記細胞を洗浄する。内部化されたペルオキシダーゼの活性をH2O2の存在下、ジアミノベンジジンで定量し、上記細胞を顕微鏡で検査する(30)。
【0186】
顕微鏡検査により、使用したペプチドの幾つか(配列番号1、4、11、12、17、及び18)は、細胞内細胞化学検査上、陽性染色が見られないことが分かった。その他のペプチドを用いた場合、陽性染色が認められたが、多様な強度を有していた。配列番号2、6、8、及び19では、弱い着色が観察されたが、その他のペプチドでは、染色が強く認められた。
【0187】
配列番号1を含む全てのペプチド、即ち、ヒトリポタンパク質BのPLHでは、配列 番号1それ自体(単量体)及び配列番号11を除いて陽性染色が見られたことは注目に値し、興味深い。
【0188】
配列番号1、17及び18においては、リポタンパク質B及びヒトリポタンパク質EのPLHに対応する短いペプチド、及びアグリンが挙げられる。前述した単量体ペプチドとは異なり、これらの二量体(配列番号2)、特に配列番号1の三量体(配列番号3)は、明らかな陽性染色が認められた。
【0189】
配列番号11の場合、これは、配列番号1と、単一の塩基性アミノ酸(K)しか含まない(生殖系列によってコードされた)抗DNA RT72ヒトモノクローナル抗体のCDR3とから構成されている。配列番号11とは異なり、配列番号1と、(生殖系列によってコードされた)抗DNAモノクローナル抗体のCDR2及び/又はCDR3とから構成される配列番号5、7、9、及び10は、多数の塩基性アミノ酸を含んでおり、強い染色が認められる。
【0190】
一方、上記結果により導かれる事項は、ペプチドが細胞内部に浸透し得る様になるには、最低で3〜5個の過剰塩基性アミノ酸がペプチド配列内に存在しなけばならないということである。他方で、配列番号1の場合、これらが多数の塩基性アミノ酸を有するときでなければ、抗DNA CDR2及び/又はCDR3のトランスロケーション能を高めることはできないということである。
【0191】
顕微鏡検査により、全てのペプチド配列番号25〜48は、ペプチドによって様々な強度を有しているが、6μg/mlの濃度では細胞化学上、陽性染色が認められることが分かった。
【0192】
3)ペルオキシダーゼに共役されたペプチド/ストレプトアビジン複合体若しくはペプチド/アビジン複合体、またはペプチド/ペルオキシダーゼ接合体の細胞内への浸透性評価
a)以下に示す二つの方法に従い、ビオチニル化ペプチド/S−POまたはビオチニル化ペプチド/A−PO(A−POはアビジン−ペルオキシダーゼの省略形である)複合体を用時調製する。
【0193】
−ペプチド:S−POまたはA−POをモル比4:1の比率で(例えば10μgのS−POに対して分子量3500のペプチド1.4μg;使用するS−POの重量は、分子量が異なる為、ペプチドによって様々である);
−或いはペプチド:S−POまたはA−POをモル比25:1の比率で(例えば1μgのS−POに対して分子量3500のペプチド1.7μg)。
【0194】
これらの複合体は、5〜10μlの容積下、PBS中S−POまたはA−POとビオチニル化ペプチドとを実験室温度で15分間培養して調製する。次いで、これらを完全培養培地1ml中に希釈し、0.2ミクロンの膜上で濾過し、上記細胞と4時間培養する。次に、これらの細胞をPBSで3回洗浄する。
【0195】
上記複合体の浸透性を顕微鏡で評価する目的で、上記細胞を、前述した様にエタノール中にて20℃で15分間固定した後、PBSで洗浄し、内部化されたペルオキシダーゼの活性を、H2O2の存在下ジアミノベンジジンで定量する。
【0196】
内部化されたペプチド/S−POまたはA−PO複合体の量を測定する為、これらの細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらを2回遠心分離した後、得られる沈殿物を、溶解緩衝液(トリス緩衝液、0.1M、pH8、0.5%Nonidet)200μl中に懸濁させる。15分後、溶解緩衝液中に含まれているペルオキシダーゼを、S−POの標準曲線と対比させ、オルト−ジアニシジン及びH2O2を用いて96ウエルプレート上で秤量する。読取は450nmで行なう。様々な試料中に含まれる量は、104細胞に対するピコグラム(pg)で表わされる。
【0197】
一般に、光学顕微鏡で細胞を検査して得られる結果は、内部化されたペルオキシダーゼを測定して得られる結果と良好な相関関係にある。この理由により、以下の記載においては、幾つかのペプチドを用いて得られた定量結果のみを、表6及び7、並びに図1〜3に示す。
【0198】
表6に、4:1のペプチド:S−PO複合体及び1μgのペプチド濃度で処理したときにおける、様々なタンパク質から生じる種々のPLHで構成されるペプチドの、H1299細胞内への浸透能の結果を示す。
【0199】
【表6】
【0200】
これらの結果により、ベクターがS−PO複合体(分子量=100,000)の細胞内移動で有効である為には、最低で6個の塩基性アミノ酸が存在しなければならないことが明瞭に読取れる(配列番号2、3、19〜21)。
【0201】
下記表7に、配列番号1と共役されたペプチドのH1299細胞内への浸透性に及ぼす配列番号1の影響を評価した結果を示す。
【0202】
ここで、
濃度a:1個のS−PO分子(1μg)に対して25ペプチド、
濃度b:1個のS−PO分子(10μg)に対して4ペプチド。
【0203】
【表7】
【0204】
表7より、配列番号1とヒトまたはネズミ抗DNA抗体に由来するペプチドベクターとの共役は、上記ベクターのトランスロケーション能をかなり高めることが分かる。
【0205】
図1は、濃度a(0.02nモルのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼに対する0.5nモルのビオチニル化ペプチド)において、37℃で一晩ビオチニル化された様々なペプチドによって輸送されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの内部化を示す棒グラフである。
【0206】
上記図1より明らかな様に、配列番号1と或る一定のベクター(配列番号6)との共役は配列番号7に到達するが、これは、上記ベクターの転移能が有意に上昇することを示している。しかしながら、配列番号1と同じ長さを有しており、且つ、アミノ酸組成が近似するペプチドと、上記と同じベクター(配列番号6)との共役は、配列番号12に到達するが、これは、当該ベクターのトランスロケーション能を殆ど上昇させない。上記配列番号6に対する同一の第二CDR3の共役は、配列番号14に到達するが、これは、配列番号1との共役ほど、高い増加が得られない。一般に配列番号1のヒト起源ベクター(配列番号10及び13)またはネズミ起源ベクター(配列番号5)への会合により、特に有効なベクターが得られる。
【0207】
図2は、濃度b(0.01nモルのS−POまたはA−POに対して0.25nモルのビオチニル化ペプチド)における、様々なビオチニル化ペプチド(37℃で2時間)によって輸送されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ(S−PO)及びアビジン−ペルオキシダーゼ(A−PO)の内部化を示す棒グラフである。
【0208】
図3は、濃度b(0.01nモルのS−POまたはA−POに対して0.25nモルのビオチニル化ペプチド)にて37℃2時間、上記と同じビオチニル化ペプチドによるS−POの内部化と、A−POの内部化との関係を示す棒グラフである。
【0209】
図2及び3により、上記ベクターによるS−PO及びA−POの転移を比較すると、転移される物質の性質は、ヒト起源のPLHを含むベクター(配列番号7、10、及び13)の場合に比べて、全部がネズミ起源であるベクター(配列番号14)のトランスロケーション能に重大な影響を及ぼすことを示唆している。
【0210】
図4は、37℃で2時間、4℃で2時間ビオチニル化された2つのペプチドによって輸送されたS−POの内部化の関係を示す棒グラフである。
【0211】
上記結果により、ヒト起源ベクター(配列番号10)のトランスロケーション能は、ネズミ起源ベクター(配列番号14)の場合に比べて、温度(細胞の活性代謝)に大きく依存することを示している。
【0212】
b)アビジン−ペルオキシダーゼのバイアスを防ぐことによってペプチドの浸透性をより直接的に評価する目的で、配列番号25〜48のペプチドの幾つかを、システインを介してペプチドのC−末端でペルオキシダーゼに共有結合させた。
【0213】
ペプチドとペルオキシダーゼとの共役は、以下の様に行なった。
【0214】
0.15MのNaCl、5mMのEDTAを含有するリン酸ナトリウム緩衝液100μl中マレイミド(Sigma)で活性化されたペルオキシダーゼ1mg中に、ペプチド1mgを添加する。実験室温度で2時間経過後、β−メルカプトエタノールを、1.5mMの最終濃度まで15分間添加する。共役されていないペプチドは、限外濾過膜(切断閾値=30,000ダルトン、Sartorius)上で遠心分離した後、0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4中で3回洗浄することにより除去する。
【0215】
これらの接合体とH1299細胞を、培養培地中ペプチド−ペルオキシダーゼの漸増濃度にて2時間培養した後、PBSで洗浄する。これらの細胞を溶解し、内部化されたペプチドの量を、ペプチド−ペルオキシダーゼを用いて作成された曲線を参照して、細胞溶解産物中でのペルオキシダーゼを定量することによって評価する。
【0216】
下記表8に、培養培地中の接合濃度に従って内部化されたペプチドの量(pg/103細胞)を示す。
【0217】
【表8】
【0218】
培養培地中のペプチド−ペルオキシダーゼ接合体の濃度が高くなればなるほど、内部化された量が多くなることが示唆される。
【0219】
細胞型による接合体の浸透性を比較する為、様々な系列の細胞を0.2μg/mlペプチド−ペルオキシダーゼ接合体と2時間培養させ、細胞溶解産物中のペルオキシダーゼ量を測定した。以下の表9及び表9の2に、測定結果をpg/103細胞で表わす。様々な細胞系列で内部化された各ペプチドの量は、一般的に倍しか違わない。
【0220】
立体配置DにおけるペプチドHBP3(配列番号26)及びHBP7(配列番号32)の内部化は、立体配置Lにおける相同性ペプチドのものと同程度の大きさを有している。裏表の位置にアミノ酸配列を有する、配列番号30のペプチド及び配列番号31の同族体の場合も同様である。
【0221】
【表9】
【0222】
【表9−2】
【0223】
4)細胞内へのペプチド−IgG接合体の浸透性評価
0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液1ml、pH7中のモノクローナルIgG抗体またはその断片F(ab’)22mgに、ジメチルスルホキシド10μl中のSMCC[4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−スクシンイミジルカルボキシレート]200μgを添加し、この溶液を、実験室温度で30分間培養する。過剰の反応体は、限外濾過膜[切断閾値=10,000ダルトン(Da)、Vivascience]上で遠心分離した後、0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7中で3回洗浄することによって除去する。
【0224】
次いでペプチドとの共役を、0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7中で、IgG1モルに対してペプチド6モルの比率にて実験室温度で3時間行なう。次に、共役されていない過剰のペプチドを、先行工程において記載した様に膜上で遠心分離して除去する。
【0225】
接合体の浸透性を顕微鏡で評価する為に、これらの細胞を培養培地中での漸減濃度(50〜6μg/ml)で、様々な抗体−ペプチド接合体の存在下に37℃で4時間培養する。
【0226】
培養終了後、これらの細胞をPBSで3回洗浄した後、エタノール中にて20℃で15分間固定する。IgG−ペプチド接合体の浸透性は、ペルオキシダーゼに共役されたマウスの抗IgG抗体と1時間培養させた後に評価する。次いで上記細胞をPBSで洗浄し、H2O2の存在下、ペルオキシダーゼ活性をジアミノベンジジンで定量する。
【0227】
内部化されたペプチド−IgG接合体の量を測定する為に、これらの細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらを遠心分離によって2回洗浄し、得られた沈殿物を、溶解緩衝液(トリス緩衝液、0.1M、pH8、0.5%Nonidet 40)200μl中に懸濁させる。細胞溶解産物中に存在するマウスIgGの量を、ペプチドに接合された同じモノクローナル抗体を用いて作成された標準曲線を参照して、マウス抗IgGヒツジ抗体を塗布したプレート上のELISAによって測定し、ペルオキシダーゼと共役されたマウス抗IgGヒツジ抗体接合体で定量する。
【0228】
これらの結果を表10に再編集する。この表は、ヒトH1299細胞内部へのネズミモノクローナル抗体またはこれらの断片F(ab’)2の浸透性を示している。ここで、
a:タンパク質p53の特異的ネズミモノクローナル抗体、及び
b:ラット−ラットハイブリドーマに由来するタンパク質p21の特異的ネズミモノクローナル抗体。
【0229】
【表10】
【0230】
この表から明らかな様に、配列番号1と会合されたヒト起源ベクターを使用することにより、ヒト細胞内での抗体を効果的に内部化させることが可能になる。同様に、ベクターが抗体全体にではなくF(ab’)2に接合されているときには、より多量の抗体が細胞内に転移されることにも注目すべきである。
【0231】
図5は、ヒトH1299細胞及びハムスターの卵巣CHO細胞上で様々なペプチドと共役されたネズミIgG1モノクローナル抗体の内部化(37℃で4時間;30μg/ml配置接合体)を示す棒グラフである。
【0232】
このグラフから明らかな様に、ヒト起源のベクター(配列番号10及び13)は、配列番号1と共役されたネズミ起源のベクター(配列番号7及び5)に比べ、ヒト細胞内部への物質の転移に対し、より効率的である。更にはヒト起源ベクター(配列番号10及び13)は、ハムスター細胞内部よりも、ヒト細胞内部への物質の転移に対し、より有効である。
【0233】
5)免疫蛍光法による組換えタンパク質の細胞内浸透性評価
ヒーラ細胞を、各々滅菌ラメラが入っている24ウエルプレート中に、0.5×104細胞の濃度で植付ける。24時間後、これらの細胞上に50μg/ml組換えタンパク質を配置する。6時間後または18時間後、これらの細胞をPBS(リン酸塩緩衝塩水)中で2回洗浄し、外気温度で10分間、PBS中4%PFA(パラホルムアルデヒド)溶液で固定するか、またはトリプシンで解離させ、ラメラ上で再び18時間培養した後、固定する。PBS中で3回洗浄した後、これらの細胞を、周囲温度で5分間、PBS中0.25%トリトンX−100溶液で透過性を付与する。PSB中で5分間の洗浄を3回行なった後、これらの細胞を、PBS−0.1%BSA(ウシ血清アルブミン)で1/50倍に希釈した抗RGS.His(Qiagen)モノクローナル抗体と、湿室にて周囲温度で1時間培養する。PBS中で10分間洗浄する工程を3回行なった後、上記ラメラを、PBS−0.1%BSAで1/200倍に希釈したFITC接合抗マウスIgGヤギ抗血清と、湿室下、周囲温度で30分間培養する。これらの細胞を、PBS中で10分間洗浄する操作を2回行なった後、スライド用調製液(Sigma製スライド作製培地)を用いて、ラメラをブレード上に取り付ける。上記細胞を、共焦顕微鏡(Leica)下で観察する。
【0234】
ヒーラ細胞を、His6−Zebra−PAV1組変えタンパク質と18時間培養し、固定するか(図17A)または解離し、固定前に18時間再び培養する(図17B)。18時間培養した細胞を共焦顕微鏡で観察すると、これらの表面に大きな蛍光を示すことが明らかになった。この実験では、細胞内蛍光は全く検出されない様であるが、DAP1またはHOECHSTによる核の対比染色を行なえば、このことが確認されるであろう。低い割合のタンパク質が内部化されることも考えられない訳ではない。更には、組換えタンパク質を細胞表面に送る為には、ペプチドPAV1ユニット(motif)のみで充分である様に思われる。これらの細胞を解離した後、蛍光は、様々なサイズのエンドソーム小胞中に限定される。His6−Zebra−PAV1組変えタンパク質が内部化されるが、これは、Zebraタンパク質のnlsドメインにもかかわらず、核である様には思われない。
【0235】
ヒーラ細胞を、His6−ZebraΔnls−PAV1組変えタンパク質と6時間または18時間培養し、18時間後固定するか(図18A及び18B)または解離し、固定前に18時間再び培養する(図18C)。6時間経過後、直ちに核蛍光が観察されるが、これは18時間目で顕著になる。矢印で示される核ゾーンは、より大きな蛍光を示す。解離細胞の場合、より顕著な蛍光は、核小体の周りに限定される。His6−Zebra−PAV1組変えタンパク質とは異なり、nlsドメインのないHis6−ZebraΔnls−PAV1組変えタンパク質は、核局在を有している。PAV1配列は、このタンパク質を核に送る様に思われる。
【0236】
対照ヒーラ細胞(タンパク質を含まない)またはHis6−Zebra及びHis6−ZebraΔnls組変えタンパク質と培養されたヒーラ細胞では、蛍光は観察されなかった。
【0237】
6)in vitroにおける、ペプチドと接合されたリボヌクレアーゼA(RNase A)の細胞毒性活性評価。
【0238】
5mgのウシRNase Aを、0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液1ml、pH7中に溶解する。
【0239】
1mgのSMCCを、50μlのジメチルスルホキシド(最終溶液20mg/ml)中に溶解する。
【0240】
RNase Aの活性化は、200μlのRNase A溶液中のSMCC溶液12.5μlを添加して行なう(モル比=1分子のRNase Aに対してSMCC10分子)。
【0241】
反応を、実験室温度で30分間行なう。
【0242】
過剰の反応体は、限外濾過膜(切断閾値=5,000 Da、Vivascience)上で遠心分離した後、0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄することによって除去する。
【0243】
次いでペプチドとの共役を、0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7中、ペプチド:RNase Aを6:1のモル比にて、周囲温度で3時間行なう。
【0244】
共役されていない過剰のペプチドを、先行工程で記載した様に遠心分離して除去する。
【0245】
RNase Aに共役されたペプチドの量は、アクリルアミド15%含有SDS−ポリアクリルアミドゲル上で共役させた後、得られたバンドの分子量を測定することによって評価する。
【0246】
図6に、RNase A単独(バンド1)、及び配列番号10と共役されたRNase Aの電気泳動法による結果を対比して示す。この図には2つの共役試験が示されている(バンド2及び3)。
【0247】
図7に、同様に実施した電気泳動法の結果を示す。これにより、RNase A単独(バンド5)の泳動、及び配列番号14単独(バンド6)の泳動、RNase Aと、配列番号14(2つの試験:バンド1及び2)と、配列番号5(バンド3)と、配列番号10(バンド4)との共役生成物の泳動を比較することができる。
【0248】
ヒト起源のベクター(配列番号10、15、及び16)と共役されたRNase Aを、天然RNase Aと比較することによって、培養中のHH9細胞に対する細胞毒性活性を試験した。
【0249】
a)in vitroにおける、HH9細胞に対するRNaseの細胞毒性活性評価
前日に、上記細胞を、1ウエル当たり103細胞の割合で、96ウエルプレート中に植付ける。
【0250】
翌日、上澄み液を採取し、RNase A−ベクターまたは天然RNase Aの連続希釈液を含む100μlの培地に替えて、72時間培養を続ける。
【0251】
次いで上記ウエルに、培養培地中1mg/mlのMTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムの臭化物)溶液50μlを添加し、4時間培養する。
【0252】
上澄み液を除去し、これらのウエルにジメチルスルホキシド100μlを加える。結晶を溶解した後、550nmにおける染色を読取る。
【0253】
試験試料の希釈液を含む細胞ウエルで得られた平均光学密度、及び培地しか含まないウエルの光学密度の結果を、パーセンテージで算出する。これらの結果を図8にグラフ化して示す。
【0254】
図8より明らかな様に、天然RNase Aは、細胞毒性活性が全く見られない。RNase Aの濃度33〜100μg/ml、即ち、2〜7×10-7Mのモル濃度間で、50%の平均細胞毒性が得られた。
【0255】
b)in vitroにおける、ヒーラ細胞に対するペプチド−RNase A接合体の細胞毒性活性評価
多様な細胞系列について、様々なペプチド−RNase接合体を試験した。これらの結果をIC50で示すが、これは、72時間培養後に細胞増殖を50%阻害させるペプチド−RNase接合体の濃度に相当する。
【0256】
表11に、得られた結果を要約する。全ての接合体で異なる細胞毒性活性が見られ、これらの幾つかは細胞毒性力を殆ど有していない様に思われる。
【0257】
【表11】
【0258】
7)in vivoにおける、無胸腺(ヌード)マウスに移植されたヒト腫瘍に対する、ペプチドと接合されたRNase Aの細胞毒性活性評価
a)プロトコール1
生後6週間のメスのヌードマウスの左わき腹に、50μl容積下、3×106HH9細胞を皮下注射した。移植後17日目に腫瘍を測定し、マウスを下記3つのグループに分ける。グループ1(7匹のマウス):50μlのPBS中配列番号10/RNase Aの共役体100μgを注射する;グループ2(7匹のマウス):100μlのPBS中50μgの天然RNase Aを注射する;グループ3(6匹のマウス):50μlのPBSを注射する。これらの注射を、同一条件下で1週間に3回続ける。各群における腫瘍を測定し、その容積を、式V=4/3π×L2l(L>1)(ここで、Lは腫瘍の最大直径であり、lは腫瘍の最小直径である)に従って計算する。
【0259】
これらの結果を、図9にグラフ化して示す。
【0260】
上記図より明らかな様に、配列番号10と共役されたRNase Aにより、腫瘍容積の増加は33日目から著しく抑制されている。
【0261】
細胞毒性は、ある幾つかの腫瘍細胞の方が、他の腫瘍細胞よりも大きい様に思われる。
【0262】
b)プロトコール2
ヌードマウスに、上記の様にHH9腫瘍細胞を皮下移植した。移植後9日目に、上記マウスに、腫瘍周辺注射として、100μgのRNase、または65μgのペプチド(HBP3)2、または65μgのペプチド(HBP3)2+100μgのRNase、または100μgのペプチド(HBP3)2−RNase接合体またはHBP6−RNase接合体を1週間に2回投与した。26日目にマウスを屠殺し、上記腫瘍の重量を計測した。
【0263】
表12に、ペプチド−RNase接合体で処置したHH9腫瘍の増殖阻害率を示す。処置マウスの腫瘍の増殖阻害率は、NaCl投与マウスの腫瘍の平均重量に対する比で算出する。
【0264】
【表12】
【0265】
これら3つのペプチド−RNase接合体は、腫瘍の増殖を同程度に阻害するのに対し、単独またはRNaseを添加したペプチドでは、殆ど効果が見られない。
【0266】
8)in vitroにおける、ペプチドを用いたルシフェラーゼのプラスミドでの細胞トランスフェクション
a)CHO細胞のトランスフェクション
使用プラスミドは、ヒトサイトメガロウイルスのプロモーターの制御下にルシフェラーゼの遺伝子を有するPCMV−LUC(6.4kb)である。
【0267】
プラスミド−ペプチド複合体を、0.15MのNaCl 50μl中にプラスミド3μg及び3.3nモルの配列番号22及び23を15分間添加して調製する。これらの複合体は、二番目のコピーとして(en triplicata)調製される。
【0268】
CHO細胞を、6%の胎児ウシ血清を含む完全アルファMEM培地中で培養し、試験前日に、24ウエルプレートの1ウエル当たり5×104細胞を植付ける。次いで上記ウエルから培地を取除き、プラスミド−ペプチド複合体(37℃で5時間、0.5mlの完全培地中3μgのプラスミド及び3.3nモルのペプチド)を加える。次に、この培地を完全培地に取替え、18〜20時間培養を続行する。次いで、上記細胞をPBSで3回洗浄した後、1%トリトンX−100及び2mMのDTTを含む溶解緩衝液(Promega)100μlで溶解する。
【0269】
次に、Promegaルシフェリンキットを用いてルシフェラーゼを測定する為に、細胞溶解産物を15μl採取し、当該細胞溶解産物中のタンパク質量をブラドフォードテストによって計算する為に、更に15μl採取する。ルシフェラーゼの相対単位(RLU)を、タンパク質mgとの関係で表す。
【0270】
これらの結果を下記表13に示す。
【0271】
【表13】
【0272】
これらの結果より、プラスミドと上記ベクターのうちの一つとを複合させることによって、ルシフェラーゼの発現が可能であること、及びこの発現は、アポリポタンパク質のPLHの配列番号22への添加によって6倍増加する(配列番号23)ことが分かる。
【0273】
b)3T3細胞のトランスフェクション
−技術:Qiagenにより供給されたプラスミドpCMVLUC(ルシフェラーゼの遺伝子を有する)を、取扱説明書に従って使用する。前日に3T3細胞を、完全培養培地中の24ウエルプレート(8×104細胞/ウエル)中に植付ける。
【0274】
ペプチドとプラスミドを、0.15MのNaCl 50μl中1.6nモル/μgの比率にて、実験室温度で20分間複合させる。次いでこれらの細胞を洗浄し、ペプチド−プラスミド複合体を、0.5mlの完全培地中の細胞に添加する。37℃で5時間培養した後、反応培地を除去し、細胞中に完全培地を1ml添加する。24時間培養した後、これらの細胞をPBSで3回洗浄し、1%のトリトンX−100及び2mMのDTTを含む溶解緩衝液(Promega)100μlで15分間溶解する。遠心分離した後、細胞溶解産物についてルシフェラーゼ試験を行なう。上記細胞溶解産物中に含まれるタンパク質の量を、ブラドフォードテスト(Bio−Rad)によって測定し、ウシの腫瘍マグロブリンを用いて作成された曲線に従って計算する。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェリン(Promega)を含むルシフェラーゼの反応体100μlを添加した細胞溶解産物15μlで評価する。ルシフェラーゼの相対単位(RLU)を、ルミノメーター(Berthold Systems)で測定し、タンパク質mgとの関係で表す。
【0275】
−結果:下記表14に、トランスフェクションされた細胞で表されるルシフェラーゼの量を示す。
【0276】
【表14】
【0277】
プラスミドと複合させたペプチドにより、細胞内部への転移、及びルシフェラーゼ遺伝子の発現が可能になる。ルシフェラーゼの量(RLU/mgタンパク質)で表わされるトランスフェクション効率は、使用するペプチドによって様々である。ペプチド配列番号42及びペプチド配列番号40は、ペプチド配列番号41に比べ、夫々、5.5倍及び2.6倍の高値が得られる。
【0278】
9)ペプチドと共役された輸送体を用いた物質の浸透性評価
以下、本発明による輸送体について記載するが、下記表15に、輸送体及びこれらが強い親和性を示す物質の幾つかの例を示す。
【0279】
【表15】
【0280】
上記表において、「ペプチド」の総称は、「本発明によるアミノ酸配列」を意味する。
【0281】
タンパク質Aは、分子量42,000 Daを有するStapHyloccocus aureusから単離されたタンパク質である。このタンパク質の特徴的性質は、IgGのFc部分に対する親和性が大きいことである。この特性により、上記タンパク質は、抗体の活性部位と相互作用すること無く、2〜4個のIgG分子を固定することができる。タンパク質Aは、ヒト、ウサギ、ラットのIgG、及びマウスの幾つかのIgGに対して有用である。
【0282】
タンパク質Gは本来、連鎖球菌の細菌株CまたはDの細胞壁より単離される30,000〜35,000 Daのタンパク質である。SIGMA社より商品化されているタンパク質Gは、IgGの2つの固定ドメインを含む17,000 Daの組換えタンパク質である。タンパク質Aと同様、タンパク質Gは、IgGのFc画分に対する親和性が高く、特に、ウシ、マウス、及びヒツジのIgG用として用いられる。
【0283】
F(ab’)2は抗体に由来する。例えばヒツジの免疫血清から得られるマウスの抗IgGヒツジIgGを使用することができる。これらを、アフィニティークロマトグラフィーで精製する。上記クロマトグラフィーにおいて、固相は、ポリアクリルアミド−アガロース上に固定されたマウスIgGで構成されている。抗原−抗体反応によるマウスの抗IgGヒツジIgGの特異的固定は、免疫吸収体による精製によって可能になる。この抗原−抗体結合は、pHを酸性にすると解離する。タンパク質分解酵素によってIgGの消化を調節することにより、様々な抗体断片を得ることができる。ペプシンを用いると、縮小サイズ(分子量=92,000 Da)の二価のF(ab’)2断片、及び小さいポリペプチドに完全に消化されたFc断片が得られる。Fc断片のサプレッションによって抗体のサイズを小さくすることができ、ペプチドとの共役を簡略化することができる。ペプチド−抗IgG F(ab’)2輸送体を調製することにより、非常に多様なマウスIgGを多量に内部化することが可能である。
【0284】
抗ペルオキシダーゼIgGは、マウスの腹水から単離されるIgG1イソタイプのモノクローナル抗体である。これは、タンパク質G(GammaBind Plus SepHarose:PHarmacia)に対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。この抗体は、ペルオキシダーゼに対して、同様にペルオキシダーゼを含むあらゆる分子に対して、高い親和性を有している。ペルオキシダーゼ(PO)は、分子量44,000 Daを有するクロダイコンから抽出される酵素であり、数多くの分子と非常に会合し易い。ペプチド−抗PO IgG輸送体を調製することによって、PO及びPOを含む全ての物質を、これらの細胞内で内部化することが可能となる。
【0285】
Canavalia ensiformisより抽出されるコンカナバリンは、タンパク質末端α−D−マンノシル及びα−D−グルコシル基に対して親和性を有するレクチンである。この様な特性により、数多くの糖タンパク質と反応することができる。ペプチド−コンカナバリン輸送体を調製することによって、多くの糖タンパク質または解糖された分子を、これらの細胞内で内部化することが可能となる。
【0286】
Streptomyces avidiniiから抽出された60,000 Daの分子であるストレプトアビジン、及び卵白より抽出されるアビジンは共に、ビオチンに対する4つの認識部位を有している。これらの小さい分子への親和定数は非常に高く(KD=10-13M)、これにより、ビオチンを含むあらゆる物質と相互作用することができる。ペプチド−ストレプトアビジンまたはペプチド−アビジン輸送体を調製することにより、ビオチン及びビオチンを含むあらゆる分子を、これらの細胞内で内部化することが可能となる。
【0287】
以下に詳述する実施例は、この様な輸送体の調製及び使用を実証するものである。
【0288】
a)抗RNase、ペプチド−F(ab’)2輸送体によって輸送された細胞内へのウシリボヌクレアーゼA(RNase A)の浸透性評価
タンパク質分解酵素、即ちペプシンによる抗RNase IgGの消化を調節することにより、F(ab’)2断片を得ることができる。酢酸ナトリウム溶液pH4.5中、2%ペプシンによる消化を行なえば、抗体の活性部位を改変させることなく、IgGのFc断片のフラグメント化が可能になる。
【0289】
0.1Mリン酸カリウム緩衝液1ml、pH7.4中の抗RNase F(ab’)2抗体2mgを、ジメチルスルホキシド11μl中のSMCC[4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−スクシンイミジルカルボキシレート]110μgに添加する。この溶液を、実験室温度で45分間培養する。過剰の反応体は、限外濾過膜(切断閾値=10,000 Da、Vivascience)上で遠心分離した後、0.5MのNaCl及び5mMのEDTAを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7中で3回洗浄して除去する。
【0290】
次いでペプチドとの共役を、0.5MのNaCl及び5mMのEDTAを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7中、1モルのF(ab’)2に対して6モルのペプチドの比率にて、実験室温度で3時間行なう。次に、共役されていない過剰のペプチドを、先行工程の様に限外濾過膜上で遠心分離することによって完全に除去する。
【0291】
これらの輸送体[ペプチド−抗RNase F(ab’)2]を、完全培養培地中のリボヌクレアーゼに添加し、この溶液を実験室温度で1時間培養する。上記反応のモル比は、2RNase/1F(ab’)2である。
【0292】
RNase Aの浸透性を顕微鏡で評価する為に、これらの細胞を、培養培地中でRNase Aの漸減濃度(100〜6μg/ml)で希釈した複合体[ペプチド−抗RNase F(ab’)2]−RNase Aの存在下に、37℃で4時間培養する。
【0293】
培養終了後、これらの細胞をPBSで3回洗浄した後、絶対エタノール中にて20℃で15分固定する。RNaseの浸透性を、ペルオキシダーゼに共役された抗RNase抗体と1時間培養させることによって評価する。次いでこれらの細胞をPBSで洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を、H2O2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【0294】
内部化されたRNase Aの量を測定する為に、これらの細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらをPBSによる遠心分離によって2回洗浄した後、沈殿物を、溶解緩衝液(トリス緩衝液、0.1M、pH8、0.5%Nonidet 40)220μl中に懸濁させる。細胞溶解産物中に存在するRNase Aの量を、抗RNase Aウサギ抗体で感作したプレート上のELISAによって測定し、RNaseを用いて作成された標準曲線を参照して、ペルオキシダーゼに共役された抗RNase Aウサギ抗体接合体で定量する。
【0295】
表16に再編集する結果は、抗RNase F(ab’)2輸送体によるRNase Aの内部化及びヒーラ細胞の内部でペプチドに共有結合的に共役されたRNaseの内部化を示している。
【0296】
【表16】
【0297】
b)細胞内への、マウスの抗IgG、ペプチド−F(ab’)2輸送体によって輸送されたマウス(IgG)のIgGの浸透性評価
マウスのペプチド−抗IgG F(ab’)2輸送体は、前述した手段に従って調製することができる。
【0298】
これらの輸送体[ペプチド−抗IgG F(ab’)2]を、0.5MのNaCl緩衝液中のマウスIgGに添加する。この溶液を実験室温度で1時間培養する。上記反応のモル比は、1F(ab’)2/l IgGである。1時間培養した後、形成された複合体を完全培養培地中に希釈する。
【0299】
IgGの浸透性を顕微鏡で評価する為に、これらの細胞を、完全培養培地中のIgGの漸減濃度(100〜6μg/ml)に希釈された複合体[ペプチド−抗IgG F(ab’)2]−IgGの存在下に、37℃で4時間培養する。
【0300】
培養終了後、これらの細胞をPBSで3回洗浄し、次いで絶対エタノール中にて20℃で15分固定させる。IgGの浸透性は、ペルオキシダーゼに共役された抗IgG抗体と1時間培養させた後に評価する。次いでこれらの細胞をPBSで洗浄し、ペルオキシダーゼの活性を、H2O2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【0301】
内部化されたIgGの量を測定する為に、これらの細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらをPBSで遠心分離して2回洗浄した後、沈殿物を、溶解緩衝液(トリス緩衝液、0.1M、pH8、0.5%Nonidet 40)220μl中に懸濁させる。細胞溶解産物中に存在するIgGの量を、抗IgGヒツジ抗体で感作したプレート上のELISAによって測定し、IgGを用いて作成された標準曲線を参照して、ペルオキシダーゼに共役された抗IgGヒツジ抗体接合体で定量する。ペルオキシダーゼ活性を、オルトジアニシジン及びH2O2で定量する。
【0302】
同じ輸送体[ペプチド−抗IgG F(ab’)2]は、細胞内部において非常に多様なマウスIgGを輸送することができる。
【0303】
表17に再編集された結果は、同じ輸送体[ペプチド−抗IgG F(ab’)2]を介して、ヒーラ細胞の内部における、マウスまたは場合によってはラットの様々なIgGの内部化を示している。
【0304】
【表17】
【0305】
c)ペプチド−抗PO IgG輸送体によって輸送されたペルオキシダーゼ(PO)またはペルオキシダーゼを含む分子の、細胞内への浸透性評価
0.1Mリン酸カリウム緩衝液1ml、pH7.4中のペルオキシダーゼまたはこれらの断片F(ab’)2の特異的モノクローナルIgG抗体2mgを、ジメチルスルホキシド11μl中のSMCC[4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−スクシンイミジルカルボキシレート]110μgに添加する。この溶液を、実験室温度で45分間培養する。過剰の反応体は、限外濾過膜(切断閾値=10,000ダルトン(Da)、Vivascience)上で遠心分離した後、0.5MのNaCl及び5mMのEDTAを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7中で3回洗浄することによって除去する。
【0306】
次いでペプチドとの共役を、0.5MのNaCl及び5mMのEDTAを含む10Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7中、IgGを1モルまたはF(ab’)2を1モルに対してペプチドを6モルの比率にて、実験室温度で3時間行なう。次いで共役されていない過剰のペプチドを、先行工程に記載した様に限外濾過膜上で遠心分離することによって完全に除去する。
【0307】
これらの輸送体[ペプチド−抗PO IgG]を、0.5MのNaCl緩衝液中、ペルオキシダーゼまたはビオチニル化ペルオキシダーゼに添加する。この溶液を、実験室温度で1時間培養する。上記反応のモル比は、2PO/1 IgGまたはF(ab’)2である。
【0308】
POまたはPOを含む分子の浸透性を顕微鏡で評価する為に、上記細胞を、培養培地中のPOまたはPOを含む分子の漸減濃度(100〜6μg/ml)にて複合体[ペプチド−抗PO IgG]−POの存在下、37℃で4時間培養する。
【0309】
培養終了後、これらの細胞をPBSで3回洗浄した後、絶対エタノール中にて20℃で15分固定させる。次いで上記細胞をPBSで洗浄し、POまたはPOを含む分子の浸透性をペルオキシダーゼ活性で評価し、H2O2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【0310】
内部化されたPOの量を測定する為に、上記細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらをPBSで遠心分離することによって2回洗浄し、得られた沈殿物を、溶解緩衝液(トリス緩衝液、0.1M、pH8、0.5%Nonidet 40)220μl中に懸濁させる。細胞溶解産物中に存在するPOの量を、抗ペルオキシダーゼマウス抗体で感作したプレート上のELISAによって測定し、POの標準曲線を参照して、オルトジアニシジン及びH2O2で定量する。
【0311】
表18に再編集した結果は、輸送体[ペプチド−抗PO IgGF]を介した、ヒーラ細胞の内部におけるPO及びビオチニル化POの内部化を示している。
【0312】
【表18】
【0313】
d)ペプチド−タンパク質A輸送体によって輸送されたIgGの、細胞内への浸透性評価
1.0Mリン酸ナトリウム緩衝液0.5ml、pH7中のタンパク質A1gを、ジメチルスルホキシド12μl中のSMCC[4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−スクシンイミジルカルボキシレート]120μgに添加する。この溶液を、実験室温度で45分間培養する。過剰の反応体を、限外濾過膜(切断閾値=10,000 Da、Vivascience)上で遠心分離した後、0.15MのNaClを含む0.1mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7中で3回洗浄することによって除去する。
【0314】
次いでペプチドとの共役を、0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7中、タンパク質Aを1モルに対してペプチドを6モルの比率にて、実験室温度で3時間行なう。次いで共役されていない過剰のペプチドを、先行工程において記載した様に限外濾過膜上で遠心分離することによって完全に除去する。
【0315】
これらの輸送体[ペプチド−タンパク質A]を、0.15M NaCl緩衝液中のIgGに添加する。この溶液を、実験室温度で20分間培養する。上記反応のモル比は、2IgG/1タンパク質Aである。
【0316】
IgGの浸透性を顕微鏡で評価する為に、上記細胞を、培養培地中のIgGの漸減濃度(100〜6μg/ml)で希釈された複合体[ペプチド−タンパク質A]−IgGの存在下に37℃で4時間培養する。
【0317】
培養終了後、これらの細胞をPBSで3回洗浄した後、絶対エタノール中にて20℃で15分固定する。IgGの浸透性は、POに共役された抗IgG抗体若しくはPO単独と1時間培養した後における、抗PO IgGを評価することによって行なう。この工程は、POに接合されたIgGの内部化に当たっては必要でない(例えばウサギIgG−PO)。次いで上記細胞をPBSで洗浄し、ペルオキシダーゼの活性を、H2O2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【0318】
内部化されたIgGの量を測定する為に、上記細胞をトリプシン化し、微小管に移し替えて計数する。これらをPBSで遠心分離して2回洗浄した後、沈殿物を溶解緩衝液(トリス緩衝液、0.1M、pH8、0.5%Nonidet 40)220μl中に懸濁させる。細胞溶解産物中に存在するIgGの量を、抗IgG抗体で感作したプレート上のELISAによって測定し、IgGを用いて作成された標準曲線を参照して、ペルオキシダーゼと共役された抗IgG抗体接合体で定量する。POの活性を、オルトジアニシジン及びH2O2で定量する。表19に再編成された結果は、輸送体[ペプチド−タンパク質A]を介した、ヒーラ細胞の内部における様々なIgGの内部化を示している。
【0319】
【表19】
【0320】
10)結腸腫瘍細胞内への抗CEA抗体の輸送
a)抗CEA Ac 35A7、並びに配列番号10、配列番号30、及び配列番号35(これらは夫々、1047、HBP7、及びHBP10とも呼ばれる)のペプチドを用い、実験を行なった。
【0321】
ペプチド1047を、35A7及びHerceptin(登録商標)と共役させた。ELISAにより接合体の抗体活性をチェック(controle)した後、37℃及び4℃における出発抗体との比較免疫蛍光法によって内部化を調べた。ヒト結腸腫瘍CEA+のLS174T細胞上で、35A7−1047接合体は、1時間15分経過後直ちに内部化されるのに対し、35A7は5時間まで内部化が全く見られない。Herceptin(登録商標)−1047接合体では、ヒト卵巣腫瘍ErbB2+のSKOv3細胞上で、Herceptin(登録商標)を用いたときの内部化に近似する迅速な内部化が見られる。125Iによる放射標識を行なうと、これらの接合体は、セファロース上に固定化されたAg上の出発Acに近い免疫反応性を示す。ゲル濾過による分析を行なったところ、集塊は存在しなかった。
【0322】
b)ペプチド1047、HBP7、及びHBP10の比較。この比較は、Ac 35A7についてのみ行なった。
【0323】
−in vitro試験
LS174T細胞上における様々な接合体(35A7−1047、35A7−HBP7、及び35A7−HBP10)の内部化に関する動力学的研究によれば、1047及びHBP10を用いた場合に比べ、ペプチドHBP7を用いた場合の方が、より大きい内部化が認められる。これら2つのペプチドは、匹敵し得る結果が得られる。SKOv3細胞、CEA−上では、1047及びHBP7は、LS174T上で得られたものに匹敵し得る程度の内部化を誘発するのに対し、HBP10は、その半分の内部化しか得られない。
【0324】
−in vivo試験
LS174T腫瘍を有するヌードマウスを用い、125Iで標識した3つの接合体35A7−1047、35A7−HBP7、及び35A7−HBP10を、標識した35A7と比較して調べた。131I−35A7では、注射後6時間で、1グラム当たりに注射された用量(%ID/g)の約13%の腫瘍の取込み(captation)が認められた。この取り込みは、注射後24時間で20〜25%ID/gに達する。接合体125I−35A7−1047は131I−35A7に比べ、やや迅速な除去が認められ、腫瘍の取り込みは僅かに減少した(24時間において18.6対21.2%ID/g)。接合体125I−35A7−HBP7では、6時間経過後直ちに、肝臓の大きな取り込みが認められた。これは、迅速な除去と、腫瘍の取り込みの低下を招くものである(24時間において8.5%ID/g)。接合体125I−35A7−HBP10は、天然抗体のものと非常に近似する生物分布を有しており、これら3つの接合体に比べ、良好な腫瘍の取り込みが認められる。
【0325】
c)ペプチド1047による内部化の誘発作用は、特に35A7上において顕著に見られる。Acは、内部化しないAgであるCEAに逆行して進行する。この作用は、AgのErbB2への固定後に迅速に内部化するHerceptin(登録商標)上では、あまり顕著に認められない。
【0326】
1047、HBP7、及びHBP10を用いて行なわれたin vitro試験により、これら3つのペプチドは、35A7の内部化を誘発することが示される。HBP7は、最も活性が強い様に思われるが、HBP10は、抗体の特異性を最もよく維持しているペプチドであると考えられる(CEA+細胞に対する顕著な作用、CEA−細胞に対する抑制効果)。in vivo実験でも、in vitroでの結果が実証された。
【0327】
d)添付の図11〜16は、上記結果を例証するものである。
【0328】
−ペプチド:
・1047:2420 Da⇒抗ACE及び抗erbB2 Acに対して、
・HBP7:1827 Da⇒抗ACE Ac単独に対して、
・HBP10:1696 Da⇒抗ACE Ac単独に対して。
【0329】
−共役:
調整(mise au point)後、1つの共役について(抗体の集塊形成を阻止することにより)決定された条件は、18 SMCC/Ig及び12pept/Ig−SMCCである。
【0330】
−培養中の細胞に対する内部化試験:
図11A及びBは、テスト1を表わしている。即ち、A375細胞(ACE−)及び5F12細胞(ACE+)に対して、1ウエル当たり40,000細胞(24ウエルのボックス)。天然抗体(Ac):35A7対接合体Ac:37A7−1047との培養、37℃で4時間。洗浄、固定、第二Ac−ペルオキシダーゼとの培養、OPD暴露、490nmでの読取り。抗体の濃度(μg/ml)によるDO。
【0331】
・図12に、ヨウ素125で標識された抗体を用いたテスト1の結果を示す。
【0332】
・図13A及びBは、テスト2を表わしている。即ち、A375細胞(erbB2−)及びSKOV3(erbB2+)に対して、1ウエル当たり40,000細胞(24ウエルのボックス)。天然抗体(Ac):Herceptine対接合体AcHER−1047との培養、37℃で4時間。洗浄、固定、第二Ac−ペルオキシダーゼとの培養、PD暴露、490nmでの読取り。
【0333】
・図14A及びBは、テスト3を表わしている。即ち、抗体の濃度を減少させ、培養時間を1時間または4時間に変更した。
【0334】
・図15A〜Fは、テスト4を表わしている。即ち、プロトコールは同じであるが、SKOV3(ACE−)及びLS174T(ACE+)細胞に対して3つのペプチド(1047−HBP7−HBP10)を比較する。
【0335】
図16A〜Fは、in vivo試験を示している。即ち、ヨウ素125で放射性標識された抗体35A7−1047、35A7−HBP7、35A7−HBP10対35A7−ヨウ素131の分布;スイスマウスnu/nu LS174Tで移植されたもの(ヒト結腸腫瘍、CEA+);1マウス当たり5μgのAc−pept*と5μgの天然Acを同時にi.v.注射;注射後6時間/24時間の解剖、組織1グラム当たりの注入量をパーセンテージで表示した結果。黒棒:接合Ac−125I;白棒:天然Ac−131I。
【0336】
11)ペプチド−IgG誘導体を用いた粒子の輸送
以下の実施例で使用するベクターは、配列番号10(1047)のペプチドと共役されたマウスのモノクローナル抗体(IgG1)である。モノクローナル抗体への上記ペプチドの共役は、上述した様に実施した。
【0337】
a)蛍光球:ペプチドIgG−微小球複合体の調製:
マウス抗IgG抗体(Estapor、Merk Eurolab)を表面に有する、70〜900nmの蛍光ポリスチレンの微小球を、0.15MのNaClで1/100倍に希釈する。この調製物4μlを、ペプチド配列番号2に接合されたマウスのモノクローナルIgG 10μgを含む50μl容積中に添加し、実験室温度で30分間培養した後、放置する。この反応培地を、前日に18時間かけて植付けられたH1299細胞(5×104細胞/ウエル)上に配置する。
【0338】
これらの細胞を洗浄し、蛍光顕微鏡で観察する。ペプチド−IgG−蛍光球複合体と共に培養された細胞は、球のサイズにかかわらず、強い標識が認められるのに対し、対照群(ペプチド−IgGを含まない蛍光球、または正常なIgGを用いたもの)は陰性である。
【0339】
−コロイド金:ペプチド−IgG−コロイド金複合体の調製
製造業者による使用説明書に従って、10nmコロイド金の球(British Biocell International)を、コロイド金溶液1mlに対してIgG750μgの割合で、ペプチド1047に予め接合されているマウスのモノクローナルIgGに複合させる。細胞内への上記複合体の浸透性を評価する為、懸濁液の沈殿物を、培養培地で半分に希釈する。
【0340】
c)電子顕微鏡によるペプチド−IgG−蛍光球複合体及びペプチド−IgG−コロイド金複合体の内部化の評価
接合工程後、これらの調製物を、前述した様に前日から培養したH1299細胞上に配置する。IgG−蛍光球複合体については18時間培養した後、またはIgG−コロイド金複合体については4時間培養した後、これらの細胞をPBSで3回洗浄し、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液中の1.6%グルタルアルデヒド溶液にて1時間固定した後、電子顕微鏡検査をする為、常法に従って処理する。
【0341】
d)結果:70nmのペプチド−IgG−微小球複合体(図19)及びペプチド−IgG−コロイド金複合体(図20)は、小胞中及び細胞質の小胞体中において、並びにゴルジ部の周囲において認められた。
【0342】
12)ドキソルビシンの輸送
ドキソルビシン等のアントラシクリンは、ヒト腫瘍の治療に最も有効な薬剤の一つである。これらの細胞内への導入方法は、未だ解決されていない。唯一判明していることは、これらが細胞核に迅速に輸送されるということである。これらは生体内全体に広く拡散して毒性をもたらすと考えられ、その為に大量投与が困難になり、治療の限界を招くものと思われる。
【0343】
本発明者らは、ペプチドHBPへのドキソルビシンの共役によって、上記薬剤薬品の毒性を低減しつつ、ヒト腫瘍の増殖阻害能を改善するかどうかを明らかにしたいと考えた。
【0344】
a)ドキソルビシンへのペプチドの共役
アミノ基が保護されているドキソルビシンを、カルボジイミドの存在下に4−マレイミド酪酸で処理する。これにより、ドキソルビシンのヒドロキシルとマレイミド酪酸のカルボキシルとの間がエステル結合する。この様にしてドキソルビシン中に導入されたマレイミド基は、ペプチドのC−末端またはN−末端に存在するシステインと反応する。
【0345】
一般的手法に従って、以下の接合体を調製した。
【0346】
即ち、1047−ドキソルビシン;HBP1−ドキソルビシン;HBP3−ドキソルビシン;HBP6−ドキソルビシン;HBP7−ドキソルビシン;HBP10−ドキソルビシン;HBP13−ドキソルビシン。
【0347】
b)in vitroにおける、ペプチドと接合されたドキソルビシンの生物活性の評価
ペプチド−ドキソルビシン接合体の生物活性を評価する為に、培養中の腫瘍細胞の増殖阻害率を測定する。
【0348】
前日に上記細胞を、1ウエル当たり103細胞の割合で、96ウエルプレート中に植付ける。翌日、上澄み液を採取し、ペプチド−ドキソルビシンまたは天然ドキソルビシンの連続希釈液(10-6M−10-8M)を含む培地100μlに替え、48時間培養を続行する。
【0349】
次いで上記ウエルに、培養培地中1mg/mlでMTT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム)50μlを添加し、4時間培養する。上澄み液を除去し、上記ウエルにジメチルスルホキシド100μlを添加する。結晶を溶解した後、550nmでの染色を読取る。
【0350】
これらの結果を、被験試料の希釈液を含む細胞ウエルで得られた平均光学密度、及び培地しか受け入れていないウエルの光学密度のパーセンテージで算出する。下記表20に、細胞増殖の50%阻害率を生じるモル濃度で示した結果を示す。
【0351】
【表20】
【0352】
in vitroにおける、ペプチド−ドキソルビシン接合体への細胞の感受性は、天然ドキソルビシンのものと同程度である様に思われる。ドキソルビシンに抵抗性のある系統(K562R及びMCF7R)は、より高濃度のドキソルビシンを必要とする。
【0353】
c)in vivoにおける、ペプチド−ドキソルビシン接合体の抗腫瘍活性の評価
ヌードマウスのわき腹に、3×106HH9細胞を皮下注射し、細胞移植後19日目に腫瘍を測定する。1群当たり6匹、合計4群のマウスに、NaCl、若しくは天然ドキソルビシン、若しくは1047−ドキソルビシン接合体、またはHBP1−ドキソルビシンを、ドキソルビシン30μlまたはこれらの接合体当量の割合で2週間毎に、腫瘍周辺に注射する。腫瘍を測定し、その容積を計算する。60日目、全部で120μgのドキソルビシンまたは上記当量の注射後、腫瘍の増殖は夫々、1047−ドキソルビシン接合体では77%、HBP1−ドキソルビシン接合体では84%、ドキソルビシン単独では79%が阻害される。これらの結果により、上記接合体は、in vivoでは天然ドキソルビシンと少なくとも同程度に有効に作用することが証明される。
【0354】
d)in vivoにおける、ペプチド−ドキソルビシン接合体の毒性評価
ドキソルビシンまたはドキソルビシン−ペプチドを静脈内注射することにより、様々な調製物の毒性を比較することができる。この評価は、マウスの体重減少を調べることによって行なわれる(1群当たり5匹のマウス)。下記二つの実験を行なった。
【0355】
実験1:3日間隔でマウスに200μgずつ注射し、全部でドキソルビシン600μgまたはペプチド−ドキソルビシン当量を投与した。最終投与の翌日にマウスの体重を計測する。
【0356】
実験2:これらのマウスに、1週間間隔でドキソルビシン200μgまたはペプチド−ドキソルビシン当量を2回注射し、全部で400μgを投与した。最終投与の翌日に体重を計測する。
【0357】
下記表21に、ドキソルビシンまたはペプチド−ドキソルビシン接合体で処理されたマウスの体重減少率を示す。平均体重減少率は、NaClを投与したマウスの平均体重に対する比率で計算する。
【0358】
【表21】
【0359】
600μgの投与用量では、天然ドキソルビシン投与マウスは、体重の31%が減少するのに対し、ペプチド−ドキソルビシン投与マウスは、体重の18〜8%しか減少しない。400μgの投与用量では、天然ドキソルビシン投与マウスは、15%の体重減少が見られるのに対し、ペプチド−ドキソルビシン接合体を用いた場合は、有意な減少は認められない。
【0360】
13)ユビキチンの輸送
ユビキチンは、進化中に高度に保持された76アミノ酸からなる分子量8,500ダルトンのポリペプチドであり、全ての真核生物の生体内に存在している。細胞内ユビキチンは、様々な細胞機能、例えばユビキチンとの連結反応後におけるタンパク質の分解、細胞サイクルの進行、NF−κB転写因子の活性化の調節に関与している。細胞外ユビキチンは、アポトーシスの誘発により、造血株細胞の増殖を阻害するという特性を有している。
【0361】
a)ペプチドへのユビキチンの共役
0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液0.3ml、pH7中のユビキチン1mgに、ジメチルスルホキシド39μl中のSMCC(4−N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−スクシンイミジルカルボキシレート)390μgを添加し、この溶液を、実験室温度で30分間培養する。過剰の反応体は、限外濾過膜(切断閾値=5,000ダルトン、Sartorius)上で遠心分離した後、0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH7中で3回洗浄することによって除去する。次いでペプチドとの共役を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液1ml、pH7中、ユビキチン1モルに対してペプチド5モルの比率にて実験室温度で行なう。次いで共役されていない過剰のペプチドを、先行工程の様にこれらの膜上で遠心分離することによって除去する。
【0362】
b)ペプチド−ユビキチン接合体の浸透性評価
ペプチド−ユビキチン接合体の浸透性評価は、N−末端側にビオチンを有するペプチドによって調製された接合体を用いて実施する。
【0363】
前日に、HT29細胞を24ウエルプレートに植付ける(5×104/ウエル)。
【0364】
様々な(ビオチニル化)ペプチド−ユビキチン接合体を、培養培地中漸減濃度で(100〜25μg/ml)37℃で4時間添加する。培養終了後、これらの細胞をPBSで3回洗浄した後、エタノール中にて20℃で15分固定する。ペプチド−ビオチン−ユビキチン接合体の浸透性を、ペルオキシダーゼに共役されたアビジンと60分間培養した後に評価する。ペルオキシダーゼの活性を、H2O2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【0365】
培養培地中における接合体の濃度に応じた浸透性を、十字印で表示された染色の強度によって顕微鏡で評価する。下記表22に、細胞内へのペプチド−ユビキチン接合体の浸透性を示す。
【0366】
【表22】
【0367】
c)ペプチド−ユビキチン接合体の生物活性評価
細胞の増殖をMTT試験によって測定する。Daudi細胞(3×104細胞/ウエル)を、漸減濃度(200〜12.5μg/ml)の天然ユビキチンが添加されているか、またはペプチドに接合されている、完全RPMI培養培地中で、96ウエルプレート中にて37℃で48時間培養し、更に培養を48時間続行する。
【0368】
次いでこれらのウエルに、培養培地中1mg/mlでMTT(臭化3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム)50μlを加え、4時間培養する。
【0369】
上澄み液を除去し、これらのウエルに、ジメチルスルホキシド100μlを添加する。結晶を溶解した後、550nmでの染色を読取る。
【0370】
表23に、ペプチド−ユビキチン接合体によるDaudi細胞の増殖阻害率を示す。表23に、被験試料の希釈液を含む細胞のウエルで得られた平均光学密度、及び培地しか受け入れていないウエルの光学密度のパーセンテージを算出した結果を示す。これらは、細胞増殖の50%阻害率が認められる濃度として表されている。
【0371】
【表23】
【0372】
天然ユビキチンは、Daudi細胞の増殖を阻害しない。ペプチドHBP10を用いて調製された接合体は殆ど阻害しないのに対し、ペプチドHBP7を用いて調製された接合体は効率的であり、50μg/mlで更に35%の阻害が認められる。ペプチド1047を用いて調製された接合体の阻害値は、中間的な値が得られる。
【0373】
14)チトクロムcの輸送
チトクロムcは、脂質−ミトコンドリアタンパク質複合体を構成するヘムタンパク質であり、植物及び哺乳動物の細胞酸化において生死に関与する役割を担っている。これは、システイン残基と結合したヘム基を有する104アミノ酸(分子量13,000ダルトン)のポリペプチド鎖のみから形成されている。サイトゾル中ミトコンドリアのチトクロムcを塩析すると、カスパーゼの活性化による細胞のアポトーシスが認められた。
【0374】
a)ペプチドへのチトクロムcの共役
0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液930μl、pH7中のチトクロムc4mgに、ジメチルスルホキシド54μl中のSMCC[4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−スクシンイミジルカルボキシレート]540μgを添加し、この溶液を、実験室温度で30分間インキュベーションする。過剰の反応体は、限外濾過膜(切断閾値=10,000ダルトン、Sartorius)上で遠心分離した後、0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7中で3回洗浄することによって除去する。
【0375】
次いでペプチドとの共役を、0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液1ml、pH7中で、チトクロムcを1モルに対してペプチドを10モルの比率にて、実験室温度で3時間実施する。次に、共役されていない過剰のペプチドを、先行工程の様に遠心分離/濾過することによって除去する。
【0376】
b)細胞内へのペプチド−チトクロムc接合体の浸透性評価
ペプチド−チトクロムc接合体の浸透性評価は、N−末端側にビオチンを有するペプチドで調製された接合体を用いて行なう。
【0377】
H1299細胞を、様々な(ビオチニル化)ペプチド−チトクロムc接合体の存在下、培養培地中の漸減濃度(100〜25μg/ml)にて37℃で4時間培養する。培養終了後、上記細胞をPBSで3回洗浄した後、エタノール中にて−20℃で15分間固定する。ペプチド−ビオチン−チトクロムc接合体の浸透性を、ペルオキシダーゼに共役されたアビジンと60分間インキュベーションした後に評価する。次いで上記細胞をPBSで洗浄し、ペルオキシダーゼの活性を、H2O2の存在下にジアミノベンジジンで定量する。
【0378】
培養培地中の接合体濃度に応じた浸透性を、十字印で表示した染色の強度により、顕微鏡下で評価する。下記表24に、細胞内へのペプチド−チトクロムc接合体の浸透性を示す。
【0379】
【表24】
【0380】
上記表より、天然チトクロムcは細胞内に浸透しないが、1047−チトクロムc接合体は25μg/mlまで効率的に浸透することが認められる。
【0381】
c)in vitroにおける、ペプチド−チトクロムc接合体の生物活性の評価
H1299またはHT29細胞(3×104細胞/ウエル)を、漸減濃度(200〜3μg/ml)の天然チトクロムcが添加されているか、またはペプチドに接合されている、完全RPMI培養培地中にて、96ウエルプレート中、37℃で48時間培養し、培養を更に48時間続行する。
【0382】
次いでこれらのウエルに、培養培地中1mg/mlでMTT(臭化3−、(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム)50μlを加え、4時間培養する。
【0383】
上澄み液を除去し、これらのウエルに、ジメチルスルホキシド100μlを添加する。結晶を溶解した後、550nmでの染色を読取る。
【0384】
これらの結果を、被験試料の希釈液を含む細胞のウエルで得られた平均光学密度、及び培地しか受け入れていないウエルの光学密度のパーセンテージとして算出する。表25に、ペプチド−ユビキチン接合体による細胞の増殖阻害率を示す。
【0385】
【表25】
【0386】
上記表は、2種類の細胞に対するペプチド−チトクロムc接合体の効率を示している。天然チトクロムcは増殖を阻害しない。50μg/mlにおいて、HT29細胞に対して最も効率的なペプチドは、ペプチド1047であり、ペプチドHBP3及びHBP6は、中間的な値を生じるのに対し、ペプチドHBP)は、当該濃度では殆ど活性が認められない。
【0387】
15)本発明のペプチドを用いた抗腫瘍及び抗炎症性物質の輸送
a)アスピリン誘導体の輸送
治療薬として長年使用されているアスピリン等の鎮痛薬は、アスピリンを長期間、定期的に服用している男性及び女性に対し、例えば結腸腫瘍の抑制作用といった他の作用を発揮することが明らかになった。動物では、様々な腫瘍に対する抗腫瘍作用が証明された。これは、酵素プロスタグランジンHシンテターゼ及びシクロオキシゲナーゼを阻害して、プロスタグランジンの産生を部分的に阻害する作用に基づくものと考えられる。
【0388】
配列番号30のペプチドに接合されたアスピリンの2つの誘導体、即ち、N−末端におけるサリシリル−HBP6誘導体(ペプチド配列番号47)、及びC−末端におけるHBP6−サリシリル誘導体(配列番号48)について、HT29腫瘍細胞の増殖阻害能力を、天然ペプチドと対比させて調べた。
【0389】
HT29細胞(3×104細胞/ウエル)を、漸減濃度(200〜3μg/ml)のアスピリンまたはペプチド−サリシリル接合体が添加されている、完全DMEM培養培地中、96ウエルプレート中にて37℃で48時間培養し、培養を更に48時間続行する。
【0390】
次いでこれらのウエルに、培養培地中1mg/mlでMTT(臭化3−、(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム)50μlを添加し、4時間培養する。
【0391】
上澄み液を除去し、これらのウエルに、ジメチルスルホキシド100μlを添加する。結晶を溶解した後、550nmでの染色を読取る。
【0392】
HT29細胞の増殖阻害率を表26に示す。これらの結果を、被験試料の希釈液を含む細胞ウエル中で得られた平均光学密度、及び培地しか受け入れていないウエルの光学密度のパーセンテージとして算出する。
【0393】
【表26】
【0394】
サリチル酸にペプチドを添加すると、アスピリンによる細胞の増殖阻害能が増強される。
【0395】
b)フタル酸誘導体の輸送
N−フタルイミドグルタルイミド(タリドミド)は、例えば奇形を誘発する作用、単核細胞によるTNF−αの産生低下、血管形成の抑制等、多様な特性を示す分子である。奇形誘発作用は、グルタルイミド残基と関係があり、一方、血管形成作用は、フタロイル基と関係があることが証明された。その為、本発明者らは、N−末端にグリシルフタロイルを添加したペプチド配列番号26(HBP3)2から誘導されたペプチド配列番号46を調製した。培地しか受け入れていないウエル、フタロイル−HBP3の活性を試験する為に用いた手段は、アスピリンにおいて記載した技術と同じである。
【0396】
表27に示すHT29細胞の増殖阻害率(%)の結果は、被験試料の希釈液を含む細胞のウエルで得られた平均光学密度、及び培地しか受け入れていないウエルの平均光学密度のパーセンテージとして算出したものである。
【0397】
【表27】
【0398】
フタロイル誘導体は、HT29細胞の増殖を阻害すると考えられる。
【0399】
16)本発明のペプチドを用いた抗菌物質の活性増加
a)リゾチーム
リゾチームは、ヒト多核リンパ球の顆粒の主要な成分の一つである。分泌の際にも同様に認められるが、これはムラミニダーゼである。リゾチームは、グラム陽性菌の表面にあるペプチドグリカンを修飾して溶解し、菌を死滅させる。リゾチームは細菌の外部膜に浸透し難いので、ペプチドへのリゾチームの共役は、浸透性を補助する役割を有している。
【0400】
−リゾチームへのペプチドの共役
0.15MのNaClを含む1.0Mリン酸ナトリウム緩衝液2.7ml、pH7中のリゾチーム8mgに、ジメチルスルホキシド186ml中のSMCC(4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−スクシンイミジルカルボキシレート)1.8mgを添加し、この溶液を、実験室温度で30分間インキュベーションする。過剰の反応体は、限外濾過膜(切断閾値=5,000ダルトン、Sartorius)上で遠心分離した後、0.15MのNaClを含む0.1mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7中で3回洗浄することによって除去する。
【0401】
次いでペプチドとの共役は、0.15MのNaClを含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液1ml、pH7中で、リゾチーム1モルに対してペプチド5モルの比率にて、実験室温度で3時間実施する。次に、共役されていない過剰のペプチドを、先行工程に記載した様に膜上で遠心分離することによって除去する。
【0402】
−ペプチドに共役されたリゾチームの活性評価
グラム陽性菌株Escherichia coli(ATCC25922)を、Luria−Bertani(LB)培地中で半対数相になるまで培養する。上記菌を遠心分離して収集し、5×105cfu/ml(コロニー形成単位/ml)の濃度で1%バクト−ペプトン培地中に再懸濁する。リゾチームまたはペプチド−リゾチーム接合体を、半分ずつ(demi en demi)希釈し(バクト−ペプトン培地中256〜0.5μg/ml)、50μlを96ウエルプレート中に分配する。次いで各ウエルに、菌希釈液50μlを添加する。37℃で16時間インキュベーションした後、各ウエルの10μlを、LB培地の寒天ボックス上に広げる。37℃で18時間インキュベーションした後、増殖の75%を阻害するリゾチームまたはリゾチーム−ペプチドの濃度を最小殺菌濃度(MBC)として決定する。
【0403】
−結果
表28に、E.coliの増殖阻害率を示す(MBCμg/ml)。
【0404】
【表28】
【0405】
ペプチド−リゾチーム接合体は、天然リゾチームの抗菌活性に比べ、抗菌活性に優れている。
【0406】
b)抗菌ペプチド
数年前より、抗菌活性及び抗真菌活性を有する短いペプチドについて、その構造−メカニズムに対する関心が高まっている。動物界及び植物界に多く存在する様々な配列の天然ペプチドは、非常に多様な微生物に対し、同等の作用を有している。
【0407】
一般に抗菌ペプチドは、両親媒性ドメイン内部で同等数の極性残基及び非極性残基を有しており、中性pH域では全体として正の電荷のペプチドを生じるのに充分な塩基性残基を有している。
【0408】
更に本発明のペプチドは、ヘパリンに対する親和性が高い、主として塩基性ペプチドであるが、以下の実施例により、これらのうちの幾つかは、真核生物細胞に対して毒性のない濃度で、in vitroにおいて抗菌活性を有することが証明された。
【0409】
−カチオン性ペプチドの抗菌性評価
グラム陽性菌株:Enterococcus faecalis(ATCC29212)、及びStaphylococcus aureus(ATCC25923)、及びグラム陰性菌株:Escherichia coli(ATCC25922)、Pseudomonas aeruginosa(ATCC27853)、及びSalmonella typHimurium(臨床分離物)、Salmonella typhiTy2(WHO)。これらの菌を、37℃で一晩中撹拌しながら培養した後、Luria−Bertani(LB)新鮮培地中で1:50の希釈になるまで更に2時間、再培養する。菌濃度が106cfu/mlとなる様に調整し、その50μlをLB培地中に半分ずつ(256〜0.5μg/ml)に希釈した等容積のペプチドと共に96ウエルプレート中に分配する。37℃で16時間培養した後、菌の増殖が完全に阻止される(濁度が全くない)最小濃度である最小阻害濃度(MIC)を決定する。最小抗菌濃度を決定する為に、各ウエルの10μlをLB培地の寒天ボックス上に広げる。37℃で18時間インキュベーションした後、生存細菌の0.01%しか存続させないペプチドの濃度である最小抗菌濃度(MBC)を決定する。
【0410】
−結果
これらの結果を、MBCのペプチド濃度(μM)として示す。
【0411】
【表29】
【0412】
上記表の結果より、ペプチド(HBP1)3は抗菌活性を有するのに対し、ペプチド(HBP1)2及びHBP13は抗菌活性を有しないことが分かる。しかしながら、ペプチドHBP13(配列番号38)がペプチド配列番号24と共役されると、その活性が係数50〜100だけ増加する(ペプチド配列番号45)。この結果は、ペプチド配列番号24が、それ自体は抗菌活性を有していないペプチド配列番号30(HBP7)と共役されたときも同様に見られる。
【0413】
上記表における全てのペプチドの最小抗菌濃度(MBC)は、MICと同等であるか、または希釈液によって異なる(MBC=2×MIC)。これらのペプチドは全て、グラム陽性菌に対して活性を示さない。
【0414】
参考文献
【0415】
【表30】
【0416】
【表31】
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、濃度a(0.02nモルのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼに対する0.5nモルのビオチニル化ペプチド)において、37℃で一晩ビオチニル化された様々なペプチドによって輸送されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの内部化を示す棒グラフである。
【図2】 図2は、濃度b(0.01nモルのS−POまたはA−POに対して0.25nモルのビオチニル化ペプチド)における、様々なビオチニル化ペプチド(37℃で2時間)によって輸送されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ(S−PO)及びアビジン−ペルオキシダーゼ(A−PO)の内部化を示す棒グラフである。
【図3】 図3は、濃度b(0.01nモルのS−POまたはA−POに対して0.25nモルのビオチニル化ペプチド)にて37℃で2時間における、ビオチニル化ペプチドによるS−POの内部化と、A−POの内部化との関係を示す棒グラフである。
【図4】 図4は、37℃で2時間、4℃で2時間ビオチニル化された2つのペプチドによって輸送されたS−POの内部化の関係を示す棒グラフである。
【図5】 図5は、ヒトH1299細胞及びハムスターの卵巣CHO細胞上で様々なペプチドと共役されたネズミIgG1モノクローナル抗体の内部化(37℃で4時間;30μg/ml配置接合体)を示す棒グラフである。
【図6】 図6は、RNase A単独(バンド1)及び配列番号10と共役されたRNase Aの電気泳動法による結果を示す。この図には2つの共役試験が示されている(バンド2及び3)。
【図7】 図7は、電気泳動法による結果を示す。
【図8】 試験試料の希釈液を含む細胞ウエルにおいて得られた平均光学密度、及び培地しか含まないウエルの光学密度を、パーセンテージで算出する。これらの結果を図8にグラフ化して示す。
【図9】 生後6週間のメスのヌードマウスの左わき腹に、50μl容積下、3×106HH9細胞を皮下注射した。移植後17日目に腫瘍を測定し、マウスを下記3つのグループに分ける。グループ1(7匹のマウス):50μlのPBS中配列番号10/RNase Aの共役体100μgを注射する;グループ2(7匹のマウス):100μlのPBS中50μgの天然RNase Aを注射する;グループ3(6匹のマウス):50μlのPBSを注射する。これらの注射は、同一条件下で1週間に3回続行する。各群における腫瘍を測定し、その容積を、式V=4/3π×L2l(L>1)(ここで、Lは腫瘍の大きい直径に対応し、lは腫瘍の小さい直径に対応する)に従って計算する。これらの結果を、図9にグラフ化して示す。
【図10】 図10は、本発明のペプチド配列を含む組換えタンパク質の発現が可能なベクターの調製法を示す。
【図11】 図11A及びBは、テスト1を表わしている。即ち、A375細胞(ACE−)及び5F12細胞(ACE+)に対して、1ウエル当たり40,000細胞(24ウエルのボックス)。天然抗体(Ac):35A7対接合体Ac:37A7−1047との培養、37℃で4時間。洗浄、固定、第二Ac−ペルオキシダーゼとの培養、OPD暴露、490nmでの読取り。抗体の濃度(μg/ml)によるDO。
【図12】 図12は、ヨウ素125で標識された抗体を用いたテスト1の結果を示す。
【図13】 図13A及びBは、テスト2を表わしている。即ち、A375細胞(erbB2−)及びSKOV3(erbB2+)に対して、1ウエル当たり40,000細胞(24ウエルのボックス)。天然抗体(Ac):Herceptine対接合体AcHER−1047との培養、37℃で4時間。洗浄、固定、第二Ac−ペルオキシダーゼとの培養、PD暴露、490nmでの読取り。
【図14】 図14A及びBは、テスト3を表わしている。即ち、抗体の濃度を減少させ、培養時間を1時間または4時間に変更した。
【図15】 図15A〜Fは、テスト4を表わしている。即ち、プロトコールは同じであるが、SKOV3(ACE−)及びLS174T(ACE+)細胞に対して3つのペプチド(1047−HBP7−HBP10)を比較する。
【図16】 図16A〜Fは、in vivo試験を示している。即ち、ヨウ素125で放射性標識された抗体35A7−1047、35A7−HBP7、35A7−HBP10対35A7−ヨウ素131の分布;スイスマウスnu/nu LS174Tで移植されたもの(ヒト結腸腫瘍、CEA+);1マウス当たり5μgのAc−pept*と5μgの天然Acを同時にi.v.注射;注射後6時間/24時間の解剖、組織1グラム当たりの注入量をパーセンテージで表示した結果。黒棒:接合Ac−125I;白棒:天然Ac−131I。
【図17】 ヒーラ細胞を、His6−Zebra−PAV1組変えタンパク質と18時間培養し、固定するか(図17A)または解離し、固定前に18時間再び培養する(図17B)。
【図18】 ヒーラ細胞を、His6−ZebraΔnls−PAV1組変えタンパク質と6時間または18時間培養し、18時間後固定するか(図18A及び18B)または解離し、固定前に18時間再び培養する(図18C)。
【図19】 電子顕微鏡によるペプチド−IgG−微小球複合体。
【図20】 電子顕微鏡によるペプチド−IgG−コロイド金複合体。
【配列表】
Claims (24)
- 細胞質内及び/又は細胞核内への対象物質の侵入を促進する能力を備えたペプチドであって、in vivoでアミノグリカンと反応し得ることを特徴とするペプチドにおいて、
配列番号:2;配列番号:3;配列番号:19;配列番号:20;配列番号:21;配列番号:26;配列番号:30;配列番号:36;配列番号:38及び配列番号:39からなる群から選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ペプチド。 - 細胞質内及び/又は細胞核内への対象物質の侵入を促進する能力を備えたペプチドであって、アミノグリカンと反応することができ、ヒト由来のタンパク質より生じることを特徴とするペプチドにおいて、
配列番号:2;配列番号:3;配列番号:19;配列番号:20;配列番号:21;配列番号:26;配列番号:30;配列番号:36;配列番号:38及び配列番号:39からなる群から選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ペプチド。 - 前記対象物質を細胞内に運搬することを意図した組成物を調製する為の、請求項1または2に記載のペプチドの使用。
- アミノグリカンと反応する少なくとも一つのアミノ酸配列により構成されることを特徴とするin vivoにおける細胞質内及び/又は細胞核内への運搬ベクターにおいて、
前記アミノ酸配列が、配列番号:2;配列番号:3;配列番号:19;配列番号:20;配列番号:21;配列番号:26;配列番号:30;配列番号:36;配列番号:38及び配列番号:39からなる群から選択されるアミノ酸配列であることを特徴とする、運搬ベクター。 - アミノグリカンと反応し、ヒトタンパク質に由来する少なくとも一つのアミノ酸配列により構成されることを特徴とする細胞質内及び/又は細胞核内運搬ベクターにおいて、
前記アミノ酸配列が、配列番号:2;配列番号:3;配列番号:19;配列番号:20;配列番号:21;配列番号:26;配列番号:30;配列番号:36;配列番号:38及び配列番号:39からなる群から選択されるアミノ酸配列であることを特徴とする、運搬ベクター。 - 前記アミノ酸配列は、自然に又は人為的に細胞及び/又は該細胞の核に組込まれ得る少なくとも一つの対象物質に結合していることを特徴とする請求項4又は5に記載のベクター。
- 前記対象物質はアミノ酸配列のN末端又はC末端に結合していることを特徴とする請求項6に記載のベクター。
- 前記結合は化学結合であることを特徴とする請求項6または7に記載のベクター。
- 前記結合は、4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボン酸スクシニミジル(SMCC)系のホモ官能性架橋試薬又はヘテロ官能性架橋試薬を介して行われることを特徴とする請求項6〜8のいずれかに記載のベクター。
- 前記結合は、遺伝子工学によって行われることを特徴とする請求項6または7に記載のベクター。
- 前記対象物質は、核酸、タンパク質、医薬、抗原、抗体を含む群から選択されることを特徴とする請求項6〜10のいずれかに記載のベクター。
- in vitroで細胞をトランスフェクションし得ることを特徴とする請求項6〜11のいずれかに記載のベクター。
- 前記対象物質に対して強い親和性を有する少なくとも一つの天然固定分子を介して、少なくとも一つの対象物質に結合すること、並びに
前記固定分子は、タンパク質A、タンパク質G、抗IgG F(ab’) 2 断片、抗ペルオキシダーゼIgG,抗RNase F(ab’) 2 、コンカナバリンA、ストレプトアビジン及びアビジンのなかから選択されることを特徴とする請求項6〜12のいずれかに記載のベクター。 - 前記固定分子は、多数の対象物質に対して親和性を有することを特徴とする請求項13に記載のベクター。
- 請求項1又は2に記載のペプチドを含むことを特徴とする真核細胞。
- 請求項4〜14のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とする真核細胞。
- 請求項4〜14のいずれかに記載のベクターによってトランスフェクションされた真核細胞。
- 下記工程:
a)前記対象物質を、請求項1〜3のいずれかに記載のペプチド又は請求項4〜14のいずれかに記載のベクターに結合させる工程、及び
b)前記細胞の能動代謝を可能にする培養温度において、該結合産物と細胞を培養する工程
を包含することを特徴とするin vitroで細胞内に対象物質を運搬する方法。 - 前記工程b)の培養を25℃〜39℃の温度で行なうことを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 前記工程b)の培養を37℃で行なうことを特徴とする請求項18又は19に記載の方法。
- 請求項4〜14のいずれかに記載のベクター又は請求項15〜17のいずれかに記載の細胞を有効成分として含有することを特徴とする生物学的、医薬用、化粧品用、農産物用、診断用又は追跡用組成物。
- 生物学的、医薬用、化粧品用、農産物用、診断用又は追跡用組成物を製剤化及び調製する為の、請求項21に記載の組成物の使用。
- 請求項4〜14のいずれかに記載のベクター及び請求項15〜17のいずれかに記載の細胞からなる群より選択される少なくとも1つを含むことを特徴とする診断薬。
- 1又はそれ以上の容器中に、あらかじめ定められた量の請求項21に記載の組成物を含むことを特徴とする診断キット。
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