JPH07503617A - Ｔａｔ由来の輸送ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＴＡＴ由来の輸送ポリペプチド この出願は、１９９２年８月２１日に出願した同時係属出願第０７／９３４、３ ７５号の一部継続出願である。

発明の技術分野 本発明は、ポリペプチドおよび核酸のような生物学的に活性なカーゴ分子の、細 胞の細胞質および核へのインビボおよびインビトロでの送達に関する。本発明の カーゴ分子の細胞内送達は、１つ以上の旧ｖ　ｔａｔタンパク質を含み、カーゴ 分子に共有結合する新規の輸送ポリペプチドの使用により達成される。本発明の 輸送ポリペプチドは、天然に存在するｔａｔタンパク質のｔａｔ塩基性領域（ア ミノ酸４９−５７）の存在、ｔａｔシスティンに冨む領域（アミノ酸２２−３６ ）の不在、およびｔａｔエクソン２コード化カルボキシ末端ドメイン（アミノ酸 ７３−８６）の不在に特徴がある。従来のｔａｔタンパク質に見出されるシステ ィンに富む領域の不在により、本発明の輸送ポリペプチドは見せかけのトランス 活性化（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）およびジスルフィド凝集の問題を 解決する。また、本発明の輸送ポリペプチドのサイズの減少により、カーゴ分子 の生物学的活性の妨害が最小となる。

発明の背景 生物学的細胞は、一般的に、タンパク質および核酸を含む高分子に対して不透過 性である。いくつかの小分子は、非常に低い割合で生細胞に進入する。インビボ で細胞内に高分子を送達する方法がないことが、細胞内の作用部位を有するおそ らく多くのタンパク質および核酸の、治療用、予防用、および診断用の使用の障 害となってきた。従って、組換えＤＮＡ技術を用いて今日まで生成されたほとん どの治療用、予防用、および診断用の候補は、細胞外環境中または標的細胞の表 面上で作用するポリペプチドである。

種々の方法が、インビトロで細胞中に高分子を送達するために開発された。この ような方法のリストには、エレクトロポレーション、リポソームによる膜融合、 ＤＮＡをコートしたマイクロプロジェクタイル（ｏ＋１ｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉ ｌｅ）を用いる高速注入（ｂｏｆｆｌｂａｒｄのｅｎｔ）、リン酸カルシウム− ＤＮＡ沈降とのインキュベーション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介形質転換、改 変ウィルス核酸の注入、および単細胞への直接マイクロインジェクションが含ま れる。これらのインビトロの方法は、典型的には全細胞群の一部分にのみ核酸分 子を送達し、そしてこれらは多くの細胞に傷害を与える傾向にある。インビボで の細胞への高分子の実験的な送達は、リン酸カルシウム沈降、およびリポソーム を摩擦塗布（ｓｃｒａｐｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）することで達成された。しかし、 これらの技術は、今日までインビボでの細胞送達への有用性に限界を示してきた 。さらに、インビトロでの細胞でさえ、このような方法は、タンパク質の送達に 対する有用性をかなり制限する。

生物学的に活性なタンパク質の無傷細胞へのインビトロおよびインビボでの効果 的な送達のための一般的な方法が必要である。（Ｌ、Ａ、５ｔｅｒｎｓｏｎ、　 ｒポリペプチド送達に対する障害」。

＾ｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　５７．１９−２１頁（１９８７ ））。リポペプチドの化学的付加（Ｐ、　Ｉ（ｏｆｆｍａｎｎら、「バクテリア のりボタンバク質および合成リポペプチドアナログによるヒトおよびマウス粘着 細胞の刺激Ｊ、Ｉ＋ｎｍｕｎｏｂｉｏ１．．１７７、１５８−７０頁（１９８８ ））、あるいは、ポリリシンまたはポリアルギニンのような塩基性ポリマー　（ １−Ｃ，Ｃｈｅｎら、「ポリーＬ−リシンアルブミンおよび西洋ワサビペルオキ シダーゼの複合体化：タンパク質の細胞取り込みを増強する新規の方法Ｊ、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７５゜１８７２−７６ 頁（１９７８））は、高く信頼できることあるいは一般的に有用であることを証 明しなかった（後述の実施例４参照）。葉酸が、輸送部分として用いられた（Ｃ ，Ｐ、　Ｌｅａｎ＋ｏｎおよびＬｏｗ、　ｒ生細胞への高分子の送達：葉酸レセ プターのエンドサイトシスを活用する方法Ｊ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８８．５５７２−７６頁（１９９１））。その証拠は 、葉酸複合体のインターナリゼーションについては示されたが、細胞質送達につ いては示されなかった。インビボで高レベルの循環葉酸塩がある場合、この系の 有用性は十分に示されなかった。シュードモナス外毒素もまた輸送部分として用 いられた（Ｔ、１．　Ｐｒ１ｏｒら、「バルナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ）　）キシ ンニシュードモナス外毒素Ａおよびバルナーゼを組合せた新規のキメラ毒素Ｊ、 　Ｃｅ１ｌ、　６４．　１０１７−２３Ｍ　（１９９１））。しかし、この系の 有効性および一般適用性は公開された著述からは明らかではない。

ヒト免疫不全ウィルス複製（ｒＨＩＶＪ）のｔａｔタンパク質は、細胞へのカー ゴタンパク質の送達についての可能性を示す（ＰＣＴ出願番号７０９１１０９９ ５８で公開）。しかし、全長のｔａｔタンパク質の化学的特性のため、生物学的 に活性なカーゴの送達における有効な使用のための一般適用法は、当該分野で教 示されていない。

ｔａｔは、特定の旧Ｖ遺伝子をトランス活性化する旧Ｖコード化タンパク質であ り、ウィルス複製に必須である。全長の旧■−１ｔａｔタンパク質は８６アミノ 酸残基を有する。［（＋ｖｔａｔ遺伝子は２つのエクソンを有する。ｔａｔアミ ノ酸１−７２はエクソン１にコードされ、アミノ酸７３−８６はエクソン２にコ ードされる。全長のｔａｔタンパク質は、２つのりシンおよび６つのアルギニン を含む塩基性領域（アミノ酸４９−５７）、ならびに７つのシスティン残基を含 むシスティンに富む領域（アミノ酸２２−３７）を特徴とする。精製したｔａｔ タンパク質は、培養で増殖するヒト細胞により、周囲の培地から取り込まれる（ Ａ、Ｄ、　ＦｒａｎｋｅｌおよびＣ，０゜Ｐａｂｏ汀ヒト免疫不全ウィルス由来 のｔａｔタンパク質の細胞取り込み」、廁旦、　５５．　１１８９−９３頁（１ ９８８））。当該分野では、ｔａｔタンパク質のシスティンに富む領域（凝集お よび不溶性を引き起こす）が、ｔａｔタンパク質の細胞取り込みに要求されるか どうかは知られていない。

ＰＣＴ特許出願番号Ｗ０９１１０９９５８（ｒ’９５８出願」）ハ、パビローマ ウィルスＥ２トランス活性化リプレッサーのポリペプチドに遺伝子的に融合した 旧Ｖ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸１−６７からなる異種タンパク質が、培養細 胞により取り込まれることを開示している。しかし、カーゴポリペプチドの生物 学的活性の保持（Ｅ２トランス活性化の抑制）は、ここでは示されていない。

゛９５８出願に教示されるように、カーゴタンパク質の細胞送達に用いる場合、 ｔａｔタンパク質の使用は実用上の困難さの可能性を含む。これらの実用上の困 難さは、ｔａｔタンパク質のシスティンに冨む領域に関わるタンパク質の凝集お よび不溶性を含む。さらに゛９５８出願では、カーゴタンパク質へのｔａｔタン パク質の化学的架橋の実施例は提供されていない。この化学的架橋は、カーゴタ ンパク質へのｔａｔの遺伝的融合が、ｔａｔタンパク質、カーゴタンパク質、ま たはその両方の適切な折り畳みを干渉する位置で重要であり得る。加えて′９５ ８出願とＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ（前出）との両方が、細胞毒性であるク ロロキンと組み合わせるｔａｔ輸送タンパク質の使用を教示している。

従って、生細胞の細胞質および核への生物学的に活性なカーゴ分子の安全で、有 効な送達のための一般的に適用し得る手九吸曳１１ 本発明は、（１）標的の細胞または細胞核に本来進入し得ない、あるいは（２） 有用な割合で標的細胞に本来進入し得ない、生物学的に活性な、ｔａｔではない 、タンパク質、核酸、および他の分子を、有効な細胞質および核に送達するため の方法および生成物を提供することにより、上記の問題を解決する。本発明のカ ーゴ分子の細胞内送達は、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質の１つ以上の部分を含み、 そしてそのカーゴ分子に共有結合している、新規の輸送タンパク質の使用により 達成される。さらに詳細には、本発明は、新規の輸送ポリペプチド、これらの輸 送ポリペプチドの作製方法、輸送ポリペプチド−カーゴ複合体、輸送ポリペプチ ド−カーゴ複合体を含む薬学的組成物、予防用組成物、および診断用組成物、お よび、ｔａｔ関連輸送ポリペプチドを用いる細胞へのカーゴの送達方法に関する 。

本発明の輸送ポリペプチドは、ｔａｔ塩基性領域のアミノ酸配列（天然に存在す るｔａｔタンパク質のアミノ酸４９−５７）の存在；システィンに富む領域のア ミノ酸配列（天然に存在するｔａｔタンパク質のアミノ酸２２−３６）の不在、 およびｔａｔエクソン２コード化カルボキシ末端ドメイン（天然に存在するｔａ ｔタンパク質のアミノ酸７３−１１１６）の不在を特徴とする。このような輸送 ポリペプチドの好ましい実施態様は、ｔａｔ３７−７２（配列番号＝２）、ｔａ ｔ３７−５８（配列番号：３）、ｔａｔ３８−５８ＧＧＣ（配列番号：４）、ｔ ａｔＣＧＧ４７−５８（配列番号＝５）、ｔａｔ４７−５８ＧＧＣ（配列番号＝ ６）、およびｔａｔΔｃｙｓ（配列番号ニア）である。輸送ポリペプチドがカー ゴ部分に遺伝子的に融合する場合に、アミノ末端メチオニンを加えなければなら ないが、スペーサーアミノ酸（例えば、ＣｙｓＧｌｙＧｌｙまたはＧｌｙＧｌｙ Ｃｙｓ）を加える必要はないことが当業者により知られている。従来のｔａｔタ ンパク質に存在するシスティンに富む領域の不在により、本発明の輸送タンパク 質は、ジスルフィド凝集の問題を解決する。このジスルフィド凝集は、カーゴの 生物学的活性の損失、輸送ポリペプチド−カーゴ複合体の不溶性、またはその両 方を生じ得る。また、本発明の輸送ポリペプチドのサイズの減少により、カーゴ の生物学的活性の妨害が都合よく最小となる。輸送ポリペプチドのサイズを減少 するさらなる利点は、カーゴ分子当たり複数の輸送ポリペプチドの結合に関わる 、本発明の実施態様で、取り込み効果を増強することである。

本発明の輸送ポリペプチドは、化学的架橋または遺伝的融合によりカーゴ分子に 都合良く結合し得る。本発明の好ましい実施態様に従って、輸送ポリペプチドお よびカーゴ分子は化学的架橋される。唯一の末端システィン残基は、化学的架橋 の好ましい手段である。本発明の他の好ましい実施態様番ご従って、輸送部分の カルボキシ末端はカーゴ部分のアミノ末端に遺伝子的に融合される。本発明の特 に好まい）実施態様は、ＪＢ１０６であり、これは、アミノ末端メチオニンに次 いで、ｔａｔ残基４７−５８、次いでＨＰＶ−１６Ｅ２残基２４５−３６５から なる。

多くの場合、本発明の新規の輸送ポリペプチドは、クロロキン関連の毒性を都合 良く避ける。本発明の１つの好ましくＳ実施態様に従って、生きているヒトまた は動物中に輸送ポリペプチド−カーゴ複合体を導入した後、生物学的に活性なカ ーゴが種々の器官および組織の細胞中に送達される。上言己の特性により、本発 明は、細胞質または核の作用部位を有するタンパク質、核酸、および他の分子に 関わる生物学研究および病気の治療に道を開く。

図面の簡単な説明 図１は、ＨｒＶ−１ｔａｔタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。

図２は、輸送ポリペプチド−シュードモナス外毒素リボシル化ドメイン複合体を 用いた細胞取り込み実験の結果をまとめる（黒塗り、非複合体；斜線、複合体） 。

図３は、輸送ポリペプチド−リボヌクレアーゼ複合体を用いた細胞取り込み実験 の結果をまとめる（黒四角、輸送部分を含まないリボヌクレアーゼ−３ＭＣＣ； 黒丸、ｔａｔ３７−７２−リボヌクレアーゼ；黒三角、ｔａｔ３８−５８ＧＧＣ −リボヌクレアーゼ；黒菱形、ｔａｔＣＧＧ３８−５８−リボヌクレアーゼ−白 画角、ｔａｔＣＧＧ４７−５８−リボヌクレアーゼ）。

図４は、プラスミドｐＡＦＩＥ２の構築を模式的に示す。

図５は、プラスミドｐＥＴ８ｃ１２３の構築を模式的に示す。

図６は、プラスミドｐＥＴ８ｃ１２３ｃｃｓｓの構築を模式的に示す。

図７は、輸送ポリペプチドＥ２リプレッサー複合体を用いた細胞取り込み実験の 結果をまとめる（白菱形、ｔａｔ３７−７２に架橋したＥ２．１２３、クロロキ ンを含まない；黒菱形、ｔａｔ３７−７２に架橋したＥ２．１２３、クロロキン を含む；白丸、ｔａｔ３７−７２に架橋したＥ２．１２３ｃｃｓｓ、りｏロキン を含まない；黒丸、ｔａｔ３７−７２に架橋したＥ２．１２３ＣＣ３Ｓ、クロロ キンを含む）。

図８は、プラスミドｐＴＡＴΔｃｙｓの構築を模式的に示す。

図９は、プラスミドｐＦＴＥ５旧の構築を模式的に示す。

図１０は、プラスミドｐＴＡＴΔｃｙｓ−２４９の構築を模式的に示す。

図１１は、プラスミドｐＪＢ１０６の構築を模式的に示す。

図１２は、タンパク質ＪＢ１０６の完全なアミノ酸配列を示す。

図１３は、ＪＢ１０６（四角）、Ｔｘｌ（Ｅ２ＣＣＳＳ（菱形）、および）ＩＥ ２．１２３（丸）に関するＥ２抑制アッセイの結果をまとめる。このアッセイは 、実施例１４に記載したように、クロロキンを含まずに、ＣＯ３７細胞中で行っ た。

免監叫圧豊亙盈■ 本明細書に記載の発明をさらに十分理解し得るために、次に詳細な説明を記載す る。

本明細書中では、次の用語が用いられる二アミノ酸−一ペプチド、ポリペプチド 、またはタンパク質のモノマー単位。２０種のタンパク質アミノ酸（Ｌ−異性体 ）は：アラニン（「＾１ａＪまたは「Ａ」）、アルギニン（ｒＡｒｇＪまたは「 Ｒ」）、アスパラギン（「＾ｓｎＪまたは「Ｎ」）、アスパラギン酸（ｒＡｓｐ Ｊまたは「Ｄ」）、システィン（ｒｃｙｓＪまたは「Ｃ」）、グルタミン（ｒＧ ｌｎＪまたは「Ｑ」）、グルタミン酸（ｒＧｌｕＪまたは「Ｅ」）、グリシン（ ｒＧｌｙＪまたは「Ｇ」）、ヒスチジン（ｒＨｉｓＪまたは「Ｈ」）、イソロイ シン（ｒｌｌｅＪまたは「Ｉ」）、ロイシン（ｒＬｅｕＪまたは「Ｌ」）、リシ ン（ｒＬｙＳ」または「に」）、メチオニン（ｒＭｅｔＪまたは「Ｍ」）、フェ ニルアラニン（ｒＰｈｅＪまたは「Ｆ」）、プロリン（ｒＰｒｏＪまたは「Ｐ」 ）、セリン（ｒｓｅｒＪまたは「Ｓ」）、トレオニン（ｒＴｈｒ」または「Ｔ」 ）、トリプトファン（ｒＴｒｐＪまたは「Ｗ」）、チロシン（ｒＴｙｒＪまたは 「Ｙ」）、およびバリン（ｒＶａｌＪまたは「Ｖ」）である。本明細書で用いら れる用語アミノ酸はまた、タンパク質アミノ酸のアナログ、ならびに、タンパク 質アミノ酸のＤ−異性体およびそのアナログを含む。

カーゴー−ｔａｔタンパク質またはそのフラグメントではない分子であって、（ １）本来標的細胞に進入し得ないか、または（２）本来標的細胞に有用な割合で 進入し得ない分子。（本出願中で用いられる「カーゴ」は、本来のすなわち複合 体化前の分子か、輸送ポリペプチド−カーゴ複合体のカーゴ部分のいずれかをい う。）「カーゴ」の例は、ポリペプチド、核酸、および多糖のような小分子およ び高分子を含むが、それに限定されない。

化学的架橋−一２つ以上の前もって形成された分子の共有結合。

カーゴ複合体−一部なくとも１つの輸送ポリペプチド部分および少なくとも１つ のカーゴ部分を含む分子であって、輸送ポリペプチドとカーゴ分子との遺伝的融 合または化学的架橋のいずれかにより形成された分子。

遺伝的融合−一それぞれのタンパク質をコードする隣接したＤＮＡ配列の遺伝子 発現を通じて、２つ以上のタンパク質のポリペプチド骨格を介するそれらの共直 線性の共有結合。

高分子−一ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸のような分子。

ポリペプチド骨格そのサイズに関係なく、２０種のタンノくり質アミノ酸（上記 ）のいずれかから本質的になる任意のポリマー。「タンパク質」がしばしば比較 的大きなポリペプチド（こついて用いられ、「ペプチド」はしばしば小さいポリ ペブチ１二ついて用いられるが、当該分野におけるこれらの用語の使用は重複し 、そして多様である。本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、他に記 載のない限り、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をいう。

リポータ−遺伝子−一その発現が、目的の細胞の事象の発生に依存する遺伝子で あり、そしてその発現が遺伝的に形質転換された宿主細胞中で都合良く観察され 得る、遺伝子。

リポータ−プラスミドー−１つ以上のリポータ−遺伝子を含むプラスミドベクタ ー。

小分子−一高分子以外の分子。

スペーサーアミノ酸−一化学的架橋に用いられる輸送部分とアミノ酸残基との間 に含まれるアミノ酸（好ましくは／ｂ分子の側鎖を有する）（例えば、分子の柔 軟性を提供し、立体障害を避けるための）。

標的細胞−一カーゴが輸送ポリペプチドにより送達される細胞。「標的細胞」は 、インビボまたはインビトロの（為ずれ力）での、ヒト細胞を含む任意の細胞で あり得る。

輸送部分または輸送ポリペプチドーー共有結合したカーゴを標的細胞へ送達し得 るポリペプチド。

本発明は、一般的に治療用、予防用、または診断用の、タンパク質、核酸、およ び多糖のような、小分子および高分子（本来標的細胞に有用な割合で進入し得な い）の細胞内送達に適用可能である。しかし、本発明の他の実施態様は、臨床応 用に限定されないことが認められるべきである。本発明は、医学研究および生物 学研究に都合良く適用され得る。本発明の研究応用において、カーゴは薬物また はリポータ−分子であり得る。本発明の輸送ポリペプチドは、単独でまたは輸送 ポリペプチド複合体化キットの一部のとしてのいずれかで、研究機関用の試薬と して用いられ得る。

標的細胞は、インビボ細胞、すなわち生きている動物またはヒトの器官または組 織を構成する細胞であり得る。標的細胞はまた、インビトロ細胞、すなわち培養 した動物細胞、ヒト細胞、または微生物であり得る。

本発明の実施における使用のための薬物およびリポータ−分子の選択には広い自 由範囲がある。リポータ−分子の選択において考えられる要因は請求められる実 験の情報の型、非毒性、検出の利便性、検出の定量可能性、および入手可能性を 含むが、それに限定されない。多くのこのようなリポータ−分子は当業者に公知 である。

下記の実施例から認められるように、呈色アッセイに存在する酵素をモデルカー ゴとして用いて、本発明の輸送ポリペプチドの使用可能性、および有用な特性を 示した。これらの酵素カーゴは、感度、利便性、細胞取り込みの可視検出、を提 供する。さらに、カーゴの酵素活性が保持される場合にのみ可視的な解読が生じ るので、これらの酵素は、本発明の輸送ポリペプチド−カーゴ複合体中のカーゴ 部分の生物学的活性の保持に関する感度の高いおよび信頼できる試験を提供する 。本発明の好ましい実施態様は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｒＨＲＰＪ）を 輸送ポリペプチド−カーゴ複合体のカーゴ部分として含む。本発明の実施のため の特に好ましいモデルカーゴ部分はβ−ガラクトシダーゼである。

モデルカーゴタンパク質はまた、細胞内のそれらの作用部位によって選択され得 る。下記の実施例６および７に記載したように、シュードモナス外毒素（ｒＰＥ Ｊ）由来の＾ＤＰリボシル化ドノドメインび膵リボヌクレアーゼを用いて、本発 明の輸送ポリペプチドによる適切に折り畳まれたカーゴタンパク質の細胞質送達 を確認した。

全長のシュードモナス外毒素はそれ自身で細胞に進入し得、＾ＤＰリボシル化反 応によりリポソームを不活性化し、従って細胞を殺す。＾ＤＰリボシル化ドノド メインて知られているシュードモナス外毒素タンパク質の一部は細胞に進入し得 ないが、細胞と接触した場合、リポソームを不活性化する能力を維持する。従っ て、輸送ポリペプチド−ＰＥ　ＡＤＰリボシル化ドノドメイン複合体り誘発され た細胞の死は、輸送ポリペプチドによるカーゴの細胞質送達に関する試験となる 。

本発明者らは、リボヌクレアーゼを用いて本発明の輸送ポリペプチドによる適切 に折り畳まれたカーゴタンパク質の細胞質送達を確認した。ＲＮＡによる方法の タンパク質合成は、ＲＮＡを消化するりボヌクレアーゼに感度が高い。しかし、 リボヌクレアーゼはそれ自身で細胞に進入し得ない。従って、輸送ポリペプチド −リボヌクレアーゼ複合体によるタンパク質合成の阻害は、生物学的に活性なり ボヌクレアーゼの細胞内送達に関する試験となる。

もちろん、与えられたカーゴ分子の細胞質への送達に次いで、同カーゴ分子の核 へのさらなる送達が続き得る。核送達は細胞質のいくつかの部分を横断すること を必然的に含む。

パピローマウィルスＥ２リプレッサーのタンパク質は、本発明の輸送ポリペプチ ドにより標的細胞の核へ送達され得る高分子薬物の例である。パピローマウィル スＥ２タンパク質はホモダイマーとして通常存在するが、パピローマウィルスゲ ノムの転写および複製の両方を制御する。Ｅ２タンパク質のカルボキシ末端ドメ インは、ＤＮＡ結合活性および二量体化活性を含む。トランスフェクトされた哺 乳類細胞中の種々のＥ２アナログまたはＥ２カルボキシ末端フラグメントをコー ドするＤＮＡ配列の短い発現が、全長のＥ２タンパク質によるトランス活性化を 阻害する（Ｊ、　Ｂａｒｓｏｕｍら、「パピローマウィルスＥ２リプレッサーの 作用機構：　ＤＮＡ結合の不在における抑制Ｊ、　ＪＪｉｒｏｌ、。

６６、３９４１−３９４５頁（１９９２））。培養哺乳類細胞の成長培地に添加 したＥ２リプレッサーは細胞に進入しない。従って、Ｅ２リプレッサーは、これ らの細胞ではＥ２のトランス活性化を阻害しない。しかし、本発明の輸送ポリペ プチドのＥ２リプレッサーへの複合の結果、成長培地から生物学的活性を示す培 養細胞へのＥ２リプレッサーの移動が生じ、リポータ−遺伝子のＥ２依存性の発 現を抑制する。

インビトロおよびインビボで、−木端および二本鎖の核酸が細胞に進入する割合 は、本発明の輸送ポリペプチドを用いて都合良く増強され得る。実施例１１（下 記）に示すように、核酸へのポリペプチドの化学的架橋の方法は当該分野で周知 である。本発明の好ましい実施態様では、カーゴは一重鎖アンチセンス核酸であ る。アンチセンス核酸は、それらと相補的である配列の細胞の発現を阻害するの に有用である。本発明の他の実施態様において、カーゴは核酸結合タンパク質に 認識される結合部位を含む二本鎖の核酸である。このような核酸結合タンパク質 の例はウィルス性のトランスアクティベーターである。

天然に存在する旧ｖ−１ｔａｔタンパク質（図１）は、１６個のアミノ酸の内７ 個がシスティンである領域（アミノ酸２２−３７）を有する。これらのシスティ ン残基は、他のｔａｔタンパク質分子のシスティンに富む領域におけるシスティ ン残基、およびカーゴタンパク質または複合体のカーゴ部分におけるシスティン 残基とで、互いにジスルフィド結合を形成し得る。このようなジスルフィド結合 形成は、カーゴの生物学的な活性の損失を引き起こす。さらに、カーゴ部分にジ スルフィド結合の可能性がない場合でさえ（例えば、カーゴタンパク質がシステ ィン残基を持たない場合）、輸送ポリペプチド間のジスルフィド結合の形成が、 輸送ポリペプチド、輸送ポリペプチド−カーゴ複合体、またはその両方の凝集お よび不溶性を引き起こす。

ｔａｔシスティンに富む領域は、カーゴタンパク質の細胞送達に対する天然に存 在するｔａｔタンパク質の使用において、おそらく重大な問題の原因となる。

システィンに富む領域は、ｔａｔのインビトロでの二量体化に必要であり、そし て旧Ｖ　ＤＮＡ配列のトランス活性化に必要である。従って、ｔａｔシスティン に富む領域の除去は、ｔａｔの本来の活性（すなわち旧Ｖの転写および複製の誘 導）を除くのにさらに有利である。しかし、当該分野は、ｔａｔタンパク質のシ スティンに富む領域が細胞取り込みに要求されるかどうか教示していない。

本発明は、この領域が本明細書中に記載された輸送タンパク質に存在しないため 、ｔａｔシスティンに富む領域に関連する問題が解決される実施態様を含む。こ れらの実施態様において、輸送ポリペプチドまたは輸送ポリペプチド−カーゴ分 子複合体の細胞取り込みは依然として起こる。本発明の好ましい実施態様の１つ の群では、システィンに富む領域の前のアミノ酸配列が、システィンに富む領域 に続くアミノ酸配列に直接融合される。このような輸送ポリペプチドはｔａｔΔ ｃｙｓと呼ばれ、一般式（ｔａｔｌ　−２１）　−（ｔａｔ３８−　ｎ）を有し 、ここでｎはカルボキシ末端残基の数、すなわち４９−８６である。好ましくは 、ｎは５８−７２である。下記の実施例から認められるように、ｔａｔタンパク 質のシスティンに富む領域の前のアミノ酸配列が細胞取り込みに必要である。好 ましい輸送ポリペプチド（または輸送部分）は、ｔａｔタンパク質のアミノ酸３ ７−７２からなり、そしてｔａｔ３７−７２（配列番号＝２）と呼ばれる。化学 的架橋に有用であるので、輸送ポリペプチドのアミノ末端のｔａｔ残基３７のシ スティンの保持が好ましい。

ｔａｔΔｃｙｓポリペプチド、ｔａｔ３７−７２、および本発明の他の実施態様 の利点は、以下を含む： ａ）ｔａｔタンパク質の本来の活性、すなわち旧Ｖの転写の誘導が除かれる； ｂ）輸送ポリペプチドのダイマーおよび高マルチマーが避けられる； ｃ）Ｅ、ｃｏｌｉ中でのｔａｔΔｃｙｓ遺伝的融合の発現レベルが改善され得る ； ｄ）いくつかの輸送ポリペプチド複合体は、溶解度の増加、および取扱いの容易 さに優れていることを示す；そして、ｅ）いくつかの融合タンパク質は、カーゴ 部分による活性が、システィンに富む領域を含む融合物に比較して増加すること を示す。

多（の化学的架橋法が知られており、本発明の輸送ポリペプチドのカーゴ高分子 への複合体化におそらく適用可能である。多（の公知の化学的架橋法は非特異的 である（すなわち、輸送ポリペプチドまたはカーゴ高分子の任意の特定部位に結 合するポイントに向けられない）。つまり、非特異的架橋剤の使用は、機能部位 または立体的にプロ・ンクされて０る活性部特表千７−５０３６１７　（８） 位に作用し得、複合タンパク質を生物学的に不活性化する。

本発明の実施において、結合特異性を増加する好ましい試みは、架橋するポリペ プチドの１つまたは両方で１回のみまたは数回見出される官能基に直接化学結合 することである。

例えば、多くのタンパク質の中で唯一チオール基を含むタンパク質アミノ酸であ るシスティンはほんの数回生じる。また、例えば、ポリペプチドかりシン残基を 含まない場合、第一アミンに特異的な架橋剤はそのポリペプチドのアミノ末端に 選択的である。結合特異性を増加するこの試みを首尾よく利用するには、ポリペ プチドがこの分子の生物学的活性を損失することなく変化し得る、この分子の領 域に適格な非常に良い反応性残基を有することが必要である。

下記の実施例に記載したように、架橋反応におけるその関与が、生物学的活性を 妨害しそうなポリペプチド配列部分で起こる場合、システィン残基を置換し得る 。システィン残基を置換する場合、ポリペプチドの折り畳みで生じる変化を最小 にすることが一般的に望ましい。ポリペプチドの折り畳みにおける変化は、置換 体がシスティンと化学的におよび立体的に似ている場合に最小になる。これらの 理由で、セリンがシスティンの置換体として好ましい。下記の実施例に記載した ように、システィン残基は架橋の目的のためにポリペプチドのアミノ酸配列に導 入され得る。システィン残基が導入される場合は、アミン末端またはカルボキシ 末端で、あるいはその近辺での導入が好ましい。このようなアミノ酸配列の改変 には、目的のポリペプチドが化学合成で生成されるのかまたは組換えＤＮＡの発 現で生成されるのかに関わらず、従来の方法が適用される。

架橋剤は、ホモニ官能性（ｈｏｎ＋ｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａＬすなわち同じ反 応を行う２つの官能基を有する）であり得る。好ましいホモ二官能性架橋剤は、 ビスマレイミドヘキサン（ｒＢＭＨＪ）である。

ＢＭＨは、緩和な条件（ｐＨ６，５−７，７）でスルフヒドリル含有化合物と特 異的に反応する２つのマレイミド官能基を含む。２つのマレイミド基は炭化水素 鎖でつながっている。従って、ＢｌａＨはシスティン残基を含有するポリペプチ ドの不可逆的な架橋に有用である。

架橋剤はまた、ヘテロニ官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）であ り得る。ヘテロ三官能性架橋剤は２つの異なる官能基、例えばアミン反応基およ びチオール反応基を有し、フリーのアミンおよびチオールをそれぞれ有する２つ のタンパク質を架橋する。ヘテロ三官能性架橋剤の例は、スクシンイミジル４− （Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−■−カルポキシレー１−　（ｒｓｌ ｌｃｃＪ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ ル（ｒＭＢｓＪ）、およびスクシンイミド４−（＋）−マレイミドフェニル）ブ チレート（ｒＳＭＰＢＪ）、ＭＢＳの延長した鎖のアナログである。これらの架 橋剤のスクシンイミジル基が第一アミンと反応し、チオール反応性マレイミドと 反応して、システィン残基のチオールと共有結合を形成する。

架橋剤はしばしば水中では低い溶解度を有する。スルホン酸基のような親水性部 分を架橋剤に加えて水への溶解度を改善し得る。スルホ−ＭＢＳおよびスルホ− ３ＭＣＣは水溶性に改変された架橋剤の例である。

多くの架橋剤は細胞内の条件下で本来切断されない複合体を生じる。しかし、い くつかの架橋剤はジスルフィドのような共有結合を含み、それは細胞内の条件下 で切断可能である。

例えば、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（「ＤＳＰＪ）、トラ ウド試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ）、およびＮ−ｘクランイミジル３ −（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ｒＳＰＤＰＪ）は周知の切断可能な 架橋剤である。切断可能な架橋剤の使用で、標的細胞への送達後、カーゴ部分を 輸送ポリペプチドから分離し得る。直接的なジスルフィド結合もまた有用であり 得る。

ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシースクシンイミドエステル（ｒＧＭＢｓＪ） 、およびスルホ−ＧＭＢＳのような、い（つかの新規の架橋剤は免疫原性が低い 。本発明のいくつかの実施態様において、このような低い免疫原性は有利であり 得る。

上記に記載したものを含む多くの架橋剤は市販で入手可能である。これらの使用 のための詳細な指示は市販者から容易に入手可能である。タンパク質の架橋およ び複合体の調製における一般的な参考文献は、Ｓ、Ｓ、　ｌｏｎｇ、　Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎ’ｕ　ａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｒｏｓ ｓ−Ｌｉｎｋｉｎ　、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ（１９９１）である。

化学的架橋はスペーサーアームの使用を含み得る。スペーサーアームは、分子内 柔軟性を提供するかまたは複合部分間の分子内距離を調節し、それにより生物学 的活性の保持の助けになり得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸を含 むポリペプチド部分の形態であり得る。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖 ５ＰＤＰＪ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｉ＋、　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ 、カタログ番号２１６５１　Ｈ）におけるように架橋剤の一部であり得る。

本発明の薬学的組成物は、治療用、予防用、または診断用であり得、そして種々 の形態であり得る。これらは、例えば、固体、半固体、および液体の投与剤形（ 例えば、錠剤、火剤、散剤、液剤または懸濁剤、噴霧剤、リポソーム、坐剤、注 入可能なおよび浸透可能な溶液、ならびに持続性放出剤型）を含む。好ましい形 態は、意図する投与形態、および治療用、予防用、または診断用の適用に依存す る。本発明の輸送ポリペプチド−カーゴ分子複合体は、従来の投与経路（例えば 、経口、経皮、血管内、筋肉内、病巣内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ）または 噴霧経路）により投与され得る。好ましくは、組成物はまた当業者に公知の従来 の薬学的に受容可能なキャリアおよびアジュバントを含む。

一般的に、本発明の薬学的組成物は、例えばαインターフェロンのような薬学的 に重要なポリペプチドに用いられたのと類似の方法および組成物を用いて、処方 および投与され得る。従来の投与量は、含まれる特定のカーゴに依存して変化す ることが理解される。

本発明の方法および組成物は、ヒトを含むあらゆる生物に適用され得る。本発明 の方法および組成物はまた、動物およびヒトに子宮内で適用し得る。

本発明の多くの薬学的な適用のために、カーゴ分子が成長培地から培養細胞へよ りむしろ、体液から体の組織の細胞へ移動することが必要である。従って、培養 細胞を含む下記の実施例に加えて、本発明者らは、生きている動物への輸送ポリ ペプチド−カーゴタンパク質複合体の静脈注射の後の、種々の哺乳類の器官およ び組織の細胞へのモデルカーゴタンパク質の送達を証明する実施例を提供した。

これらのカーゴタンパク質は、インビボでの細胞への送達後に生物学的活性を示 した。

次の実施例に記載したように、本明細書で提供されたアミノ酸およびＤＮＡ配列 情報を用いて、本発明の輸送ポリペプチドを、化学合成または組換えＤＮＡ法に より生成し得る。公知のアミノ酸配列を有するポリペプチドの化学合成または組 換えＤＮＡ生成の方法は周知である。ポリペプチドまたはＤＮＡの合成のための 自動化装置は市販で入手可能である。宿主、クローニングベクター、ＤＮＡ発現 制御配列、およびオリゴヌクレオチドリンカーもまた市販で入手可能である。

周知の技術を用いて、当業者は本明細書中に記載の好ましい輸送ポリペプチドの アミノ酸配列に、小さい追加、削除、または置換を容易に行い得る。しかし、こ のような変更は本発明の範囲内であると理解されるべきである。

さらに他のウィルス、例えば旧Ｖ−２（Ｍ、Ｇｕｙａｄｅｒら、「ヒト免疫不全 ウィルス２型のゲノムの構成およびトランス活性化」。

Ｎａｔｕｒｅ、　３２６．６６２−６６９頁（１９８７））、ウマ伝染性貧血ウ ィルス（Ｒ，Ｃａｒｒｏｌｌら、「ウマ伝染性貧血ウィルス／ヒト免疫不全ウィ ルス１型工遺伝子キメラの発生によるレンチウィルスｔａｔ機能性ドメインノ同 定Ｊ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　６５．３４６０−６７頁（１９９１）、およびシ ミアン免疫不全ウィルス（１，、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、「マカク由来のシ ミアン免疫不全ウィルスの配列およびその他のヒトおよびシミアンレトロウィル スとの関係Ｊ、Ｎａｔｕｒｅ、　３２８．５４３−４７頁（１９８７）；Ｓ、　 Ｋ、Ａｒｙａら、「新規なヒトおよびシミアン旧Ｖ関連レトロウィルス保有機能 トランスアクティベーター（ｔａｔ）遺伝子ＪＮａｔｕｒｅ、　３２８．５４８ −５５０頁（１９８７乃由来のタンパク質が知られている。これらのｔａｔタン パク質由来であり、モしてｔａｔ塩基性領域の存在およびｔａｔシスティンに富 む領域の不在を特徴とするポリペプチドが、本発明の範囲内にあることが理解さ れるべきである。

本明細書に記載の発明がさらに十分理解され得るために、次の実施例を記載する 。これらの実施例は単に例示の目的であり、いかようにも本発明を限定するよう に解釈されるべきではないことが理解されるべきである。これらの実施例を通し て、全ての分子クローニング反応は、他に記載のない限り、Ｊ、　５ａＩｎｂｒ ｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａ ｎｕａｌ、第２版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ（１９８９）の方法に従って行った。

火ＪＪ引よ ”ポリペプチドの　お　び 紅且Ｌ１Ｂ プラスミドｐＴａｔ７２を、ｔａｔ由来輸送ポリペプチドの細菌での生成および 輸送ポリペプチド−カーゴタンパク質融合物をコードする遺伝子の構築のための 開始クローンとした。本発明者らは、＾ｔａｎ　Ｆｒａｎｋｅｌ（Ｔｈｅ　Ｗｈ ｉｔｅｈｅａｄ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ＾）からプラスミドｐＴａｔ７２（Ｆ ｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏに記載、前出）を得た。プラスミドｐＴａｔ７２は 、旧Ｖ−１ｔａｔのアミノ酸１位から７２位をコードする合成遺伝子の挿入によ り、Ｆ、ＩＦ、　５ｔｕｄｉｅｒら（［クローニングした遺伝子の直接発現への Ｔ７　ＲＮ＾ポリメラーゼの使用Ｊ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、。

１８５、６０−９０頁（１９９０））のｐＥＴ−３ｄ発現ベクターから得た。ｔ ａｔ＝＋−ド領域は、Ｅ、ｃｏｌｉコドン用法を使用し、イソプロピルβ−Ｄ− チオガラクトピラノシド（ｒｌＰＴＧＪ）で誘導可能なバクテリオファージエフ ポリメラーゼプロモーターにより運ばれる。ＩＰＴＧ誘導後、ｔａｔタンパク質 は総Ｅ、ｃｏｌｉタンパク質の５％を構成した。

ＵのＴａｔｌ−７２の ｔａｔｌ−７２タンパク質を発現するＥ、　ｃｏｌ　ｉを、ｌＯ容量の２５Ｉｏ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、ＩｎＭ　ＥＤＴ＾中に懸濁した。細胞を フレンチプレスで溶解し、１０，０００Ｘｇで１時間遠心分離にかけ不溶性の残 渣を除いた。上清液をＱセファロースファーストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　 ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）イオン交換カラム（２０＋ｎｌ樹脂 ／６０ｃｌ溶解物）にのせた。ｔａｔタンパク質を沈殿させる０、５３１　Ｎａ Ｃｔで素通り画分を処理した。５０．２ｏ−ター中３５．０ＯＯｒｐｆＩで１時 間遠心分離することで塩析したタンパク質を集めた。６Ｍグアニジン−ＨＣｌで 沈殿を溶解し、５０．２ｏ−ター中３５．００Ｏｒｌ）Ｉｌｌで１時間遠心分離 することにより清澄化した。清澄化した試料を、６１１グアニジン−１（Ｃ１， ５０１ｒ１Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ５，４）、１０ｏＭＤＴＴで平衡化した ＾、５アガロースゲル濾過カラムにのせた。次いで、同緩衝液で試料を溶出した 。ｔａｔタンパク質含有ゲル濾過画分を、Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムおよびローフ ５％のアセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸でグラディエンドをかけて溶 出した。

これらの手順を用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ培養物１リットル（推定で１リットル当り ６ｇの細胞）当り約２０ｎｇのｔａｔｌ−７２タンパク質を生成した。これは、 全体の約５０％の回収率を示した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、ｔａｔｌ−７２ポリペプチドは１ＯｋＤの１本のバン ドに移動した。精製したｔａｔｌ−７２ポリペプチドは、取り込み／トランス活 性化アッセイで活性であった。このポリペプチドをｔａｔ−反応性組織のプラス ミノーゲン活性化因子（ｒｔＰ八」）リポータ−遺伝子を含むヒト肝癌細胞の培 地に加えた。Ｏ，ｌ１Ｍクロロキンの存在下で、精製ｔａｔｌ−７２タンパク質 （１００ｎｇ／ｍｌ）は約１５０倍のｔＰ八へ現を誘導した。

・７．１ぺ　゛の　″′ 種々の輸送ポリペプチドの化学合成のために、市販の自動化システム（＾ｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３０Ａ型合成機）を用いて、システム製造者 の推奨する手段に従った。ＨＦ処理によりブロック基を除去し、従来の逆相）Ｉ ＰＬＣ法により合成ポリペプチドを単離した。全ての合成ポリペプチドの完全性 はマススペクトル分析により確認された。

火土■ニ ーガラ　トシダーゼ　ム ＳＭＣＣの＾。

β−ガラクトシダーゼのアセチル化（システィンスルフヒドリル基をブロックす る）のために、６．４Ｂの市販で入手したβ−ガラクトシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ 　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、、カタログ番号３２１０１Ｇ）を、２００μｍ０５０ｍ１ ！のリン酸緩衝液（ｐ）ｌ　７．５）に溶解した。この２００μｍのβ−ガラク トシダーゼ溶液に、３０Ｉｏｇのヨード酢酸を４＋ｎＬの５０ｆｆ１Ｍリン酸緩 衝液（ｐＨ７，５）に溶解することにより調製した、ヨード酢酸を１０μｍ添加 した。（引き続く実験において、ヨードアセトアミドがヨード酢酸の好適な代替 物であるがわかった。）この反応を、室温で６０分間進行させた。次いで、反応 混合物を小Ｇ−２５（Ｐａｒｆｆｌａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ 、　ＮＪ）ゲル濾過カラムにのせ、モしてボイドボリュームを集めることにより 、未反応のヨード酢酸からアセチル化β−ガラクトシダーゼを分離した。

アセチル化β−ガラクトシダーゼのアミン基のＳＭＣＣ活性化に先立って、Ｇ− ２５カラムから集めた酵素の２ａ＋１を、Ｃｅｎｔｒｉｃ。

ｎ　１０（Ａｍｉｃｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ）限外濾過装置中で、０． ３＋ｎｌまで濃縮した。濃縮したアセチル化β−ガラクトシダーゼに、１５μｍ のジメチルホルムアミド（ｒＤＭＦｊ）中に溶解した１９μｇのスルホ−ＳＭＣ Ｃ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、、カタログ番号２２３２２Ｇ）を添加し た。

反応を室温で３０分間進行させた。次いで、小Ｇ−２５ゲル濾過カラムを通過さ せることにより、β−ガラクトシダーゼ−ＳＭＣＣを、ＤＭＦおよび未反応のＳ ＭＣＣから分離した。

輸送ポリペプチドのβ−ガラクトシダーゼへの化学的架橋のために、β−ガラク トシダーゼ−３ｌａＣＣ溶液を、２００μｍの５０１リン酸緩衝液（ｐＨ７，５ ）に溶解した、１００μｇの輸送ポリペプチド（ｔａｔ１７２、ｔａｔ３７−７ ２、ｔａｔ３８−５８ＧＧＣ，ｔａｔ３７−５８、ｔａｔ４７−５８ＧＧＣ１ま たはｔａｔＣＧＧ４７−５８）と混合した。反応を室温で６０分間進行させた。

次いで、反応混合物をＳ−２００ＦＩＲゲル濾過カラム上にのせ、そしてボイド ボリュームを集めることにより、輸送ポリペプチド−β−ガラクトシダーゼ複合 体を単離した。

このようにして得た輸送ポリペプチド−β−ガラクトシダーゼ複合体は、ウサギ 抗ｔａｔポリクローナル抗体を用いて実施した従来のウェスタンプロットおよび ＥＬＩＳ＾分析で、ｔａｔに対してアッセイされたとき陽性の結果を生じた。ウ ェスタンプロットおよびＥＬＩＳ八分析へ一般的論議は、Ｅ、　Ｈａｒｌｏｗお よびＤ・Ｌａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａ ｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 （１９８Ｂ）を参照のこと。スパＯ−ス（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　６　（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）を用いたゲル濾過分析 は、輸送ポリペプチド−β−ガラクトシダーゼ複合体が、約５４０．０００ダル トンの分子量を有することを示した。輸送ポリペプチド−β−ガラクトシダーゼ 複合体の比活性は、０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｒＯＮ ＰＧＪ）を用いてアッセイしたとき、β−ガラクトシダーゼ出発物質の比活性の ５２％であった。０ＮＰＧアッセイ手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）の１６ ．６６−１６．６７頁に詳細に記載されている。

−ガー　シ　−ゼ　ム　の　”入 複合体を、１００μＭクロロキンの存在下または非存在下で、ＨｅＬａ細胞（Ａ ＴＣＣ番号ＣＣＬ２）の培地に、２０　μｇ／ａ＋１で添加した。細胞を、３７ ℃７５．５％、ＣＯｔで、４−１８時間インキュベートした。細胞を、リン酸緩 衝化生理食塩水（ｒＰＢＳＪ）中の、２％ホルムアルデヒド、０．２％グルタル アルデヒドを用いて４°Ｃで５分間おいて固定化した。次いで、細胞をＰＢＳ中 で’ｌ　ｍＭ　ＭｇＣｌ２で３回洗浄し、そしてそれらを３７℃でＸ−ｇａｌを 用いて染色した。Ｘ−ｇａｌは、β−ガラクトシダーゼによる切断に際し青色の 生成物を生じる、無色のβ−ガラクトシダーゼ基質（５−ブロモ−４−クロロ− ３−インドリルローガラクトシド）である。用いたＸ−ｇａｌ染色溶液は、５ｖ Ｍフェリシアン化カリウム、５　ｍＭフェロシアン化カリウム、および２　ｍＭ 　ＭｇＣ１ｚを含むＰＢＳのｌｎｌあたり、１　ｍｇのＸ−ｇａｌ（Ｂｉｏ−Ｒ ａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃ＾、カタログ番号１７０−３４５５）を含有し た。

染色した細胞を、４００倍までの倍率で顕微鏡検査した。このような顕微鏡検査 は、抜染色および細胞質染色を示した。

ｔａｔ３７−７２−β−ガラクトシダーゼ複合体またはｔａｔｌ−７２−β−ガ ラクトシダーゼ複合体を添加した細胞は、暗青色に染色された。β−ガラクトシ ダーゼ活性は、１５分程度の展開時間後に観察され得た。比較のために、β−ガ ラクトシダーゼ活性が、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のトランスフェクションに より細胞内に導入されたときは、少なくとも６時間の染色展開時間が、通常、必 要とされることに注目すべきである。

クロロキン処理細胞中で、核染色の強度は、よりわずかに大きかったが、クロロ キン非存在下で核染色が見られた。複合体を形成していないβ−ガラクトシダー ゼで処理されたコントロール細胞は、検出可能な染色を示さなかった。

ジスル　゛に　ｏｔ″　ム 各β−ガラクトシダーゼテトラマーは、輸送ポリペプチドのシスティン残基への 直接ジスルフィド結合に使用され得る１２のシスティン残基を有する。ｔａｔ３ ７−７２のスルフヒドリルを還元および次いで保護するために、１．８　ｉ＋ｇ （４１１ｎｌ０ｏｌｅ）のｔａｔ３７−７２を、ｌ＋ｎｌの、５０ｆｆｌｌ！リ ン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）、１５０１１Ｍ　Ｎａｃｌ、２ｎＭ　ＥＤＴ＾に 溶解し、そしてこの溶液を、Ｒｅｄｕｃｅ−１ｍｍカラム（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈ ｅＴｎ、　Ｃｏ−１Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）にかけた。室温で３０分後、ｔ ａｔ３７−７２を、カラムから、同緩衝液の１の１のアリコート（ａｌｉｑｏｕ ｔｓ）を用いて、Ｏ，１ｎｌのｌｏｍｌ［５，５°−ジチオ−ビス（２−ニトロ 安息香酸）（ｒＤＴＮＢＪ）を含むチューブに溶出した。還元ｔａｔ３７−７２ ポリペプチドを３時間ＤＴＮＢの存在下で静置した。次いで、９　ｒ＋ｌのセフ ァデックスＧ−１０カラム（Ｐｈａｒｉ＋ａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔａ ｗａｙ、　ＮＪ）上のゲル濾過により、ｔａｔ３７−７２−ＴＮＢから未反応の ＤＴＮＢを除去した。５＋ｎｇのβ−ガラクトシダーゼを、０．５ｃｌの緩衝液 に溶解し、そしてそれを、９　ｍｌのセファデックスＧ−２５カラム（Ｐｈａｒ ｆｆｌａｃｉａ　ＬＫＢＳＰｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）上で脱塩し、３．８ （１＄ｃβ−ガラクトシダーゼ／ｎｌ緩衝液を得た。脱塩したβ−ガラクトシダ ーゼ溶液の０．５１１１１のアリコートを、０．２５＋ｎｌまたは０．５ｏ１の ｔａｔ３７−７２−ＴＮＢｉｉ製液と混合し、そして室温で３０分間おいて、直 接ジスルフィド架橋反応を進行させた。９　ｉｎｌのセファクリルＳ−２００カ ラム上のゲル濾過により、未反応のｔａｔ３７−７２−ＴＮＢを、β−ガラクト シダーゼ複合体から除去した。架橋反応の程度を、遊離したＴＮＢに起因する４ １２ｒ＋ａ＋での吸光度を測定することにより間接的にモニターした。このよう にして生成された直接ジスルフィド複合体を、細胞に取り込ませた（データは示 さず）。

５ＰＤＰ　いた　口　ｔ゛　ム ヘテロ２官能性の架橋試薬（ｒＳＰＤＰＪ）を用いた。この試薬は、切断可能な ジスルフィド結合を含み、以下の間に架橋を形成する＝（１）β−ガラクトシダ ーゼの第一アミン基、およびｔａｔｌ−７２（代謝的に１１１Ｓで標識された） のシスティンスルフヒドリル；または（２）ローダミンで標識されたβ−ガラク トシダーゼの第一アミン基、およびｔａｔ３７−７２のアミノ末端システィンス ルフヒドリル。

ｔａｔｌ−７２複合体化のために、５ＩＩＩｇのβ−ガラクトシダーゼを、０、 ５ｎｌの、５０１！ＩＭ　リン酸ナトリウム（ｐＨ７，５）、１５０ＩＭ　Ｎａ Ｃ１，２ａｍ　ＭｇＣ１ｔ中に溶解し、そして９ａ＋１のセファデックスＧ−２ ５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）上 でβ−ガラクトシダーゼを脱塩した。脱塩したβ−ガラクトシダーゼを、室温で ２時間、８８倍モル過剰のヨードアセトアミドで処理し、フリーのスルフヒドリ ル基をブロックした。未反応のヨードアセトアミドをゲル濾過により除去した後 、ブロックされたβ−ガラクトシダーゼを、１０倍モル過剰の５ＰＤＰを用いて 室温で処理した。２時間後、限外濾過（［ｌ１ｔｒａｆｒｅｅ　３０、Ｍｉｌｌ ｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍ＾）により緩衝液を交換した。次いで、４ 倍モル過剰の標識されたｔａｔｌ−７２を添加し、そして架橋反応を、−晩、室 温で進行させた。未反応のｔａｔｌ−７２を、９ＩＩ１１のセファクリルＳ−２ ００カラム上のゲル濾過により除去した。標識されたｔａｔｌ−７２の既知の比 活性を用いると、β−ガラクトシダーゼテトラマーあたり、１．１のｔａｔｌ− ７２ポリペプチドが架橋されていると計算された。０ＮＰＧアツセイを用いて、 複合β−ガラクトシダーゼはその酵素活性の１００％を保持することが分かった 。細胞に取り込まれた放射活性およびＸ−ｇａｌ染色の測定を用いて、複合体が 、培養ＦｌｅＬａＨｅＬａ細胞まれたことを実証した。

ｔａｔ３７−７２複合体化のために、ヨードアセトアミド処理（１００：ｌヨー ドアセトアミドモル過剰）の前に、室温で１時間、ローダミンマレイミドの５＝ １のモル比でβ−ガラクトシダーゼを標識したことを除いて、上記段落中で記載 の手順を用いた。架橋反応では、２０：ｌの５ＰＤＰ比、およびｌ０＝１のｔａ ｔ３７−７２比を用いた。この複合生成物は、約５つのローダミン分子を有しく ［ＩＶ吸光度による）、そしてβ−ガラクトシダーゼテトラマーあたり約２個の ｔａｔ３７−７２部分を有する（ゲル濾過による）と推定された。この手順から の複合体は、初期β−ガラクトシダーゼ酵素活性の約３５％を保持した。Ｘ−ｇ ａｌ染色およびローダミン蛍光を用いて、５ＰＤＰ複合体が培養されたＨｅＬａ 細胞に取り込まれることを実証した。

Ｋ五孤ニ ーガラ　シ　−ゼ　ム　いた 複合体の半減期測定および生体分布分析のために、２００μｇの、ＳＭＣＣ−β −ガラクトシダーゼ（コントロール）またはｔａｔｌ−７２−β−ガラクトシダ ーゼのいずれかを静脈（ｒｒＶＪ）注射により、Ｂａ１ｂ／ｃｖウス（Ｊａｃｋ ｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の尾静脈に、クロロキンと共にまたはなし で、注射した。３０分までの間隔で血液試料を集めた。３０分後、動物を殺し、 そして組織化学的分析のために器官および組織を取り出した。

０ＮＰＧアツセイにより血液試料中のβ−ガラクトシダーゼを測定した。０ＮＰ Ｇアツセイ手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）の１６．６６−１６、６７頁に 詳細に記載されている。β−ガラクトシダーゼおよびｔａｔｌ−７２−β−ガラ クトシダーゼは、速やかに血流から浄化された。それらの半減期は、３−６分と 推定した。これらの実験的比較は、ｔａｔｌ−７２輸送ポリペプチドの複合体化 は、血液からのβ−ガラクトシダーゼのクリアランス速度にほとんどまたは全く 影響しないことを示した。

輸送ポリペプチド−β−ガラクトシダーゼ複合体の細胞取り込みを検出するため に、殺した動物（前出）から、薄い凍結組織切片を調製し、実施例２（前出）に 記載されたように固定化を行い、そしてそれらを標準Ｘ−ｇａｌ染色法に供した 。肝臓、膵臓および心臓が強く染色された。肺および骨格筋はより弱く染色され た。脳、膵臓、および腎臓は、検出可能な染色を示さなかった。高出力の顕微鏡 検査により、組織への血液供給を取り囲む内皮細胞であると思われる細胞、そし て幾つかの場合には、核の強い染色が示された。

大ＪＬ医」− 一ガー　シ　−ゼーポＩ　ル　ニン　ム　゛　−ガー　シ　−ゼーポ＋１シン　 ム　い　・験 本発明のｔａｔ由来輸送ポリペプチドの有効性と塩基性アミノ酸単純ポリマーの 有効性とを比較するために、市販で入手可能なポリアルギニン（Ｓｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍ　Ｃｏ、、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，カタログ番号Ｐ−４６６３）お よびポリリシン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ−２６５８）を、上記の実施例２に 記載したように、β−ガラクトシダーゼに複合体化した。この複合体を、クロロ キンと共におよびなしで、ＨｅＬａ細胞の培地に、■−３０μｇ／ｎｌで添加し た。複合体とのインキュベーションに続いて、上記の実施例２に記載したように 、細胞を固定化し、染色し、そして顕微鏡検査した。

ポリリシン−β−ガラクトシダーゼ複合体では、低レベルの表面染色が得られた が、核染色は得られなかった。ポリアルギニン−β−ガラクトシダーゼ複合体で は、強い全体の染色が得られたが、ｔａｔｌ−７２−β−ガラクトシダーゼ複合 体およびｔａｔ３７−７２−β−ガラクトシダーゼ複合体より弱い核染色を示し た。ポリアルギニン−β−ガラクトシダーゼ複合体の細胞表面結合と、実際のイ ンターナリゼーションを区別するために、固定化および染色手順の前に、細胞を トリプシン（一種のプロテアーゼ）で処理した。トリプシン処理は、ポリアルギ ニン−β−ガラクトシダーゼ処理細胞のＸ−ｇａｌ染色の大部分を除去し、よっ てポリアルギニン−β−ガラクトシダーゼ複合体は、実際にインターナリゼーシ ョンしているよりはむしろ、細胞の外側表面に結合していたことが示された。対 照的に、ｔａｔｌ−７２または３７−７２−β−ガラクトシダーゼ複合体に曝さ れた細胞は、トリプシン処理にかかわらず染色され、よってβ−ガラクトシダー ゼのカーゴは、細胞の内側にあり、そしてトリプシン消化から保護されたことが 示された。複合体化していないβ−ガラクトシダーゼで処理されたコントロール 細胞は、検出可能な染色を示さなかった。

Ｋ１１ °ワサビペルオ　シ　−ゼ　ム 化生皿ｌ且 ｔａｔｌ−７２−ＨＲＰ複合体およびｔａｔ３７−７２−ＨＲＰ複合体を生成す るために、市販の入手可能なＨＲＰのカップリングキット（１＋ｎｍｕｎｏｐｕ ｒｅ？レイミド活性化）ＩＲＰ％Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｆｆｌ、　Ｃｏ、、カタ ログ番号３１４９８Ｇ）を用いた。キット中で提供されるＨＲＰは、フリーの一 ８Ｈ基に選択的に反応性の形態にある。（システィンは、２０のタンパク質アミ ノ酸のなかで、フリーの一３Ｈ基を有する唯一のアミノ酸である。）　ｔａｔｌ −７２を含む輸送ポリペプチド−１’ｌＲＰ複合体実験では、上記の実施例１に 記載したように、ｔａｔｌ−７２出発物質を、Ｅ、ｃｏｌｉ中で産生じ、そして それをＨＰＬＣにより精製した。精製ｔａｔ　ｌ−７２（ＴＦ＾／アセトニトリ ル中に溶解した）の２００μｇを凍結乾燥し、そして１００μｍの１００＋ｎＭ 　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）、０．５ｎＭ　ＥＤＴＡ中に再溶解した。５ ０μｍのｔａｔｌ−７２溶液またはｔａｔ３７−７２溶液を、２５０ｍＭ　）リ エタノールアミン（ｐＨ８，２）中の５０μｍのＩｎｎｕｎｏｐｕｒｅ　ＨＲＰ （７５０ｔｔ　ｇの酵素）に添加した。反応を室温で８０分間進行させた。これ らの条件下で、約７０％のＨＲＰが化学的にｔａｔｌ−７２分子に結合した。結 合反応の程度は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりモニターした。

ＨＲＰ　ム　の　゛入 複合体を、１００μＭのクロロキンの存在下または非存在下で、ＨｅＬａ細胞の 培地に２０μｇ／ｍｌで添加した。細胞を、３７℃７５．５％Ｃ０２で、４−１ ８時間インキュベートした。ＨＲＰ染色を、４−クロロ−１−ナフトール（Ｂｉ ｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｆｆｌｏｎｄ、　ＣＡ、カタログ番号１７０−６４３１ ）および過酸化水素）ＩＲＰ基質を用いて展開した。引き続く実験で、４−クロ ロ−１−ナフトールをジアミノベンジジン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍ、　Ｃｏ、、Ｓ ｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）に置き換えた。

輸送ポリペプチド−１１ＲＰ複合体を添加した細胞は、細胞結合ＨＲＰ活性を呈 示した。短時間複合体に曝すことにより、小さな斑点状の染色パターンを得、こ れは多分、エンドサイト−シス小胞（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ　ｖｅｓｉｃｌｅ）中 のＨＲＰを反映している。より長くインキュベーションを行った後、核および細 胞質染色の拡散を観察した。複合体化していないＨＲＰで処理されたコントロー ル細胞は、検出可能な染色を示さなかった。

尖ｍ ＰＥ　ＡＤＰリボシルヒトメイン　ム Ｅ、ｃｏｌｉ中で、シュードモナス内毒素（ｒＰＥＪ）を、その全長形態、およ びそのＡＤＰリボシル化ドノドメイン態の両方で、クローニングし、そして発現 させた。輸送ポリペプチド−ＰＥ複合体を、遺伝的融合および化学的架橋の両方 で生成した。

ヱｉム主上１１ プラスミドｐＴａｔ７０（Ａｐａｌ）を構築するため、Ｂａｆｆ１Ｈ１およびＥ ｃ。

Ｒ１でｐＴａｔ７２を消化し、そして以下の合成オリゴヌクレオチドからなる二 本鎖のリンカ−を挿入することにより、ｔａｔオープンリーディングフレーム中 に唯一の＾ｐａ１部位を挿入した二番号：９）。

リンカ−は、ｔａｔのＣ末端であるＬｙｓＧ　１ｎｓｔｏｐをＧｌｙＰｒｏＳｔ ｏｐと置換した。リンカ−はまた、ＰＥ配列中の天然に存在する＾ｐａ１部位に より、ｔａｔ配列のＰＥ　ＡＤＰリボシル化ドノドメインコード配列フレームが あった、融合に適した唯一の＾ｐａ１部位を付加する。プラスミドｐＴａｔ７０ ＰＥ（配列番号：１０）を構築するために、プラスミドＣＤ４（１８１）−ＰＥ （３９２）から、ＰＥ　ＡＤＰリボシル化ドノドメインードする＾ｐａｌ−Ｅｃ ｏＲＩフラグメントを取り出した。プラスミドＣＤ４（１８１）−ＰＥ（３９２ ）の構築は、Ｇ、　ｆｉｎｋｌｅｒら（ｒＣＤ４−シュードモナス外毒素ハイブ リッドタンパク質：構造設計および細胞インターナリゼーションの特徴付けによ る効力および治療側面の調節」、＾ＩＤｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍ ａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、　７．３９３−４０１頁（１９９１））に記 載されている。＾ｐａｌ−ＥｃｏＲＩ７ラグメントを、ＡｐａｌおよびＥｃｏＲ Ｉで消化したｐＴａｔ７０（Ａｐａｌ）中に挿入した。

プラスミドｐＴａｔ８ＰＥ（配列番号＝１１）を構築するために、ｐＴａｔ７０ ＰＥから２１４塩基対のＮｄｅ　Ｉ−＾ｐａ＋フラグメントを取り出し、そして それを、Ｎｄｅ＋および＾ｐａｌ付着末端を有しｔａｔ残基１−４および６７− ７０をコードしそして以下の合成オリゴヌクレオチドからなる、二本鎖のリンカ −と置換した： ハエト」４口り製 ｐＴａｔ８−ＰＥ構築物の発現は、ｔａｔタンパク質のアミノ酸ト４および６７ −７０に融合したＰＥ　ＡＤＰリボシル化ドノドメインポリペプチドじた。ｐＴ ａｔ８−ＰＥ発現産物（ｒｔａｔ８−ＰＥＪ）を、以下に記載の化学的架橋実験 において、ＰＥ　Ａ叶すボシル化ドメイン部分（および複合体化していないコン トロール）として取り扱った。８つのｔａｔアミノ酸に対するコドンは、便宜上 選択されたクローニング手順からの人工構築物である。このＰＥ　ＡＤＰリボシ ル化ドノドメイン合した、８つのｔａｔアミノ酸は、輸送活性を有さなかった（ 図２）。

ｔａｔ８−ＰＥの精製のために、５０ｒｎＭトリスー　ＨＣＩ（ｐＨａ、　Ｏ） 、２ｍ１ｉＥＤＴ＾の２０　ｆｆ１ｌ中に、４．５ｇのｐＴａｔ８−ＰＥ−形質 転換Ｅ、ｃｏｌｉを懸濁した。フレンチプレスで細胞を溶解し、そしてＳ＾６０ ０ローター中で、１０．００Ｏｒｐｍで１時間の遠心分離により不溶性残渣を除 去した。大部分のｔａｔ８−ＰＥは上清液中にあった。この上清液を、３＋ｎｌ のＱ−セファ０−スフアーストフｏ　−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｐｉ ｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）イオン交換カラムにのせた。試料をのせた後、カラ ムを５０ｎｌｉ　）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、２　ｍＭ　ＥＤＴＡで洗浄し た。

カラムの洗浄後、１１００ｏ、　２００ａ＋Ｍ、および４００＋ｎＭのＮａＣ１ を含む同一の緩衝液を用いて、ステップグラディエント溶出を行つた。

ｔａｔ８−ＰＥは、２００　ｍＭ　ＮａＣ１で溶出した。イオン交換クロマトグ ラフィーに続いて、さらに、スーパーデックス（ｓｕｐｅｒｄｅｘ）７５ＦＰＬ Ｃカラム（Ｐｈａｒｉ＋ａｃｉａ　ＬＫＢ、　ＰｉｓｃａｔａｖａｙＳＮＪ）上 でのゲル濾過によりｔａｔ８−ＰＥをさらに精製した。ゲル濾過カラムを、５０ ＪＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，５）を用いて平衡化した。次いで、試料を加え、平衡化 緩衝液を用いて０．３４ｍ１／分で溶出を行った。１．５分の画分を集め、そし て−７０℃でｔａｔ８−ＰＥ画分を貯蔵した。

ｎ遷」１匹束碧 ＰＥ　ＡＤＰリボシル化ドノドメインシスティン残基を有さないので、輸送ポリ ペプチド−ｔａｔ８−ＰＥ複合体化にスルホ−３ＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅ ｒｌ、　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬカタログ番号２２３２２　Ｇ）を用 いた。複合体化は、２工程反応手順で行った。第１番目の反応工程では、ｔａｔ ８−ＰＥ（釦ｇ／ｉｌ）を、ｌｏｎＭスルホ−８ＩＩＣＣを有する５０ｎｌｌ　 １（ＥＰＥＳ（ｐＨ７，５）中、室温で４０分間処理した。（スルホ−Ｓ！ＩＣ Ｃヲ、１ソ旺ＰＥ５Ｓｐ）ｌ　７．５中（７）１００ＩＭストック溶液として反 応液に添加した。）　ｔａｔ８−ＰＥ−スルホ−３ＭＣＣを、未反応のスルホ− ８ＭＣＣから、２５　ｆｉ＋Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ６，０）、２５ｍＭ　Ｎａ Ｃ１で平衡化したＰＧＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｎｏｎｄ、　Ｃ ＾）上のゲル濾過により分離した。第２番目の反応工程で、ｔａｔ８−　ＰＥ− スルホ−３ＩＩＣＣ（１゜５＋ｎｇ／ｍｌ　１ｏＯｎ＋Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ ７，５）、ｌｄ　ＥＤＴＡ）を、精製ｔａｔ３７−７２（６００ＩＭ最終濃度） と、室温で１時間反応させた。架橋反応を停止するために、システィンを添加し た。架橋反応生成物を、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。約９０％のｔａｔ８ −ＰＥが、これらの条件下で、ｔａｔ３７−７２輸送ポリペプチドに架橋した。

複合生成物の約半分が、１つの輸送ポリペプチド部分を有し、そして約半分が、 ２つの輸送ポリペプチド部分を有した。

ＰＥＡＤＰｌ、：シル　の　・セ ＰＥリボシル化ドメインは、輸送ポリペプチドへの複合体化後、その生物学的活 性（すなわち、破壊的なリポソーム改変）を保持したことを確かめるために、輸 送ポリペプチド−ＰＥ八へＰリボシル化複合体のインビトロ（すなわち、無細胞 ）翻訳に対する効果を試験した。各インビトロ翻訳実験のために、新鮮な翻訳調 合液（ｃｏｃｋｔａｉｌ）を調合し、そしてそれを氷上で保存した。インビトロ 翻訳調合液は、２００μｌウサギ網状赤血球溶解液（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄ ｉｓｏｎＳｌｌ）、２μｌ　１Ｏｉ１１　ＺｎＣ１＊（必要に応じて）、メチオ ニンを除り２０のタンパク質アミノ酸混合物の４μｍ、および２０μｍ８″Ｓ− メチオニンを含んでいた。９μｌの翻訳調合液に、１〜１０００　ｎｇの輸送ポ リペプチド−ＰＥ複合体（好適にはｌμｌの容量で）またはコントロールを添加 し、そしてこの混合液を、３０°Ｃで６０分間プレイシキュベートした。次いで 、０．５μｌのＢＭＶ　ＲＮＡを各試料に添加し、そして、３０℃でさらに６０ 分間インキュベートした。試料あたり５０％グリセロールの５μｍを添加した後 、試料を一７０℃で貯蔵した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ法により、インビトロ翻訳反応 生成物を分析した。ＳＤＳゲル上の各レーンあたり、２μｍの各翻訳反応混合物 （適切な容量の５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加して）をのせた。電気泳動後 、フルオログラフィーにより、１８Ｓを含むインビトロ翻訳生成物を可視化した 。

上記段落中に記載した手法を用いて、ｔａｔ１７０輸送ポリペプチドに遺伝子的 に融合されたＰＥ　ＡＤＰリボシル化ドノドメイン生物学的活性を有さない、す なわち、インビトロ翻訳を阻害しないことが分かった。これに対し、同一の手順 を用いて、ｔａｔ３７−７２輸送ポリペプチドに化学的に架橋されたＰＥ　ＡＤ Ｐリボシル化ドノドメイン完全な生物学的活性を保持した、すなわち、複合体化 していないＰＥ　ＡＤＰリボシル化ドノドメインコントロール同様インビトロ翻 訳活性を阻害したことが分かった（図２）。

ＰＥ　ＡＤＰ　Ｉボシル　の　１　・・セｔａｔ３７−７２−ＰＥ　ＡＤＰリボ シル化ドノドメイン複合体わるさらなる試験において、複合体を、１００μ菖ク ロロキンの存在下または非存在下で、培養ＦＩｅＬａ細胞に添加した。次いで、 細胞抽出物中のトリクロロ酢酸（ｒＴｃＡＪ）沈澱性の放射活性により示される ように、インビボタンパク質合成を測定することにより細胞毒性をアッセイした 。

この細胞毒性アッセイは以下のように行った。ｔｌｅＬａ細胞層を破壊し、細胞 を遠心分離し、そしてそれらを培養液に２．５ｘ　ｌｏ’／ｌｌｌ＋１の密度で 再懸濁した。２４ウエルプレートを用いるときウェルあたり０．５ｎ＋１の懸濁 液を、または４８ウエルプレートを用いるときウェルあたり０．２５ｍ１の懸濁 液を用いた。細胞を沈降させるために少なくとも４時間放置した後、１００μｌ のＰＢＳ中に溶解した、複合体または複合体化していないコントロールをウェル に添加した。これら細胞を、複合体またはコントロールの存在下で、３７°０１ ６０分インキュベートし、次いで、各細胞に０．５＋ｎｌの新鮮培地を添加し、 そしてさらに５−２４時間細胞をインキュベートした。このインキュベーション に続いて、各ウェルから培地を除去し、そして約０．５ｍｌのＰＢＳで１回細胞 を洗浄した。次いで、ｌμＣｉのＳ″Ｓ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ１イン ビボ細胞標識グレードＳＪ、　１０１５）を、ウェルあたり１００μｌあたり添 加し、これら細胞を２時間インキュベートした。

２時間後、放射活性培地を除去し、そして細胞を３回踏５％ＴＣＡを用いて、そ して次いで１回ＰＢＳを用いて洗浄した。１００μｍの０．５　Ｍ　ＮａＯＨを 各ウェルに添加し、そして少なくとも４５分間、細胞溶解そしてタンパク質溶解 が起こるように放置した。次いで、５０μｍのｌ　Ｍ　Ｉ（Ｃ１を各ウェルに添 加し、そして各ウェルの全内容物を、放射活性の液体シンチレーション測定のた めにシンチレーション液に移した。

クロロキンの非存在下では、輸送ポリペプチド−ＰＥ　ＡＤＰリボシル化ドノド メイン複合体いた処理に応じて（複合体化していないＰＥ　ＡＤＰリボシル化ド ノドメインいた処理に応じてではなく）細胞タンパク質合成の、明瞭な投与量依 存性の阻害があった。これらの結果は図２に要約される。ｔａｔ３７−７２に複 合体化されたとき、ＰＥ八へＰリボシル化ドメインは、ｔａｔｌ−７２に複合体 化したときより３〜ｌＯ倍効果的に輸送されるようであった。

さらに、輸送ポリペプチドｔａｔ３Ｂ−５８ＧＧＣ，ｔａｔ３７−５８、ｔａｔ ４７−５８ＧＧＣ，およびｔａｔＣＧＧ−４７−５８もまた、ＰＥ　ＡＤＰリボ シル化ドノドメイン合体化した。これら複合体のすべては、生物学的に活性なＰ Ｅ　ＡＤＰリボシル化ドノドメイン胞取り込みの結果をもたらした（データ示さ ず）。

火嵐勇ユ リボヌ　レアーゼ　ム 化坐五呈」 ７、２ｆｆ１ｇのウシ膵臓リボヌクレアーゼＡＳＴｙｐｅ１２Ａ（Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ、カタログ番号Ｒ５５００） を、２００μＩＰＢＳ（ｐｉ（７，５）中に溶解した。このリボヌクレアーゼ溶 液に、１゜４　ｍｇ、のスルホ−３ＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、 、ＲｏｃｋｆｏｒｄＳＩＬ、カタログ番号２２３２２８）を添加した。ポルテッ クスで撹拌した後、反応を室温で１時間進行させた。未反応のＳ肛Ｃを、リボヌ クレアーゼ−３ＭＣＣから、反応混合液を９＋ｎｌのＰＢＤＧカラム（Ｂｉｏ− Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃ＾）を通過させ、そして０．５ｍ１画分を集め ることにより除去した。ボイドボリュームのピーク画分（リボヌクレアーゼ−３ ＭＣＣ複合体を含む）を、２８０ｎｆｆｌでのＵＶ吸光度をモニターすることに より同定した。プールしたりボヌクレアーゼーＳＭＣＣ含有画分を５つの等量の アリコートに分けた。４つのりボヌクレアーゼー３ＭＣＣアリコートの各々に、 以下のｔａｔ残基に相当する化学合成輸送ポリペプチドを添加した：　３７−７ ２（ｒ３７−７２」）、　３Ｂ−５８、プラス、カルボキシ末端のＧＧＣ（ｒ３ ８−５８ＧＧＣＪ）　；　３７−５８（ｒＣＧＧ３７−５８Ｊ）　；または４７ −５８、プラス、アミノ末端（ｒＣＧＧ４７−５８」）のＣＧＧ０輸送ポリペプ チドリボヌクレアーゼ複合体化反応を、室温で２時間、そして次いで４°Ｃで一 晩進行させた。ｌｏ−２０％グラディエンドゲル上の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより反 応生成物を分析した。架橋効率は、輸送ポリペプチドｔａｔ３Ｂ−５８ＧＧＣ， ｔａｔ３７−５８、およびｔａｔＣＧＧ４７−５８に対しては約６０％、そして ｔａｔ３７−７２に対しては４０％であった。改変種の中では、７２％が１つの 、そして２５％が２つの輸送ポリペプチド置換体を含んでいた。

Ｔａｔ３７−７２−　’ボヌ　し　−ゼ　ム　の　゛入細胞を、１０％のドナー 子ウシ血清およびペニシリウム／ストレプトマイシンを補充したダルベツコの改 変イーグル培地において、組織培養インキュベーター中、３７°Ｃで維持した。

細胞の取り込みア、ツセイのために、２４ウエルプレート中に１０６細胞をプレ ートし、それらを−晩培養させた。これらの細胞をダルベツコのＰＢＳで洗浄し 、そして８０μ輩クロロキンを含む３００μｌのＰＢＳ中に溶解したりポヌクレ アーゼ複合体を、０．１Ｏ１２０，４０、および８０μｇ＃ｎｌ濃度で添加した 。３７°Ｃで１．２５時間のインキュベーションの後、７５０μｍの成長培地を 添加し、そしてさらに細胞試料を一晩インキユベートした。−晩のインキュベー ションの後、細胞をＰＢＳを用いて１回洗浄し、そしてそれらを３１１Ｓメチオ ニン（１μＣｉ／ウエル）を含む、メチオニンなしの最小必須培地（Ｆｌｏｗ　 ＬａｂｓＸ２５０μｌ／ウェル）中で１時間インキュベートした。放射活性メチ オニンを用いた１時間のインキュベーションの後、この培地を除去し、そして細 胞を３回、５％ＴＣＡ（ｌ　ｍｌ／ウェル／洗浄）で洗浄した。次いで、ウェル あたり２５０μｍの０．５Ｍ　ＮａＯＨを添加した。室温で１時間後、各ウェル の内容物の２００μｍをシンチレーションバイアルにピペットで移し、１００μ ｍのＩＭ　ＨＣＩおよび４ａ＋１のシンチレーション液を添加した。各バイアル の内容物を完全に混合した後、液体シンチレーションカウンティングにより、各 試料中の放射活性を測定した。

細胞取り込みの結果を図３に要約する。輸送ポリペプチドｔａｔ３Ｂ−５８ＧＣ ，Ｃは、ｔａｔ３７−７２と同様に、またはわずかに良好に機能した。輸送ポリ ペプチドｔａｔＣＧＧ４７−５８は減少した活性を有した（データ示さず）。こ のポリペプチドが減少した取り込み活性を有したか否か、またはりボヌクレアー ゼへの塩基性領域の近接が酵素活性を妨害したか否かは不明である。

カチオン交換クロマトグラフィ（ＢｉｏＣＡＤ、　ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｃｈｒ ｏｗ＋ａｔｏｇｒａｐｈｙ　５ｙｓｔｅａ＋、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｗ＋ｓ）を用いて、１つまたは２つの輸送ポリペプチド部分を有するリ ボヌクレアーゼ複合体を精製した。

良直五ｌ ンバ　ナーゼΔインヒビ　−　ヘ勝 化茎庭呈１ タンパク質キナーゼＡインヒビター（ｒＰＫＡｌ」）ペプチド（アミノ酸２０個 ）をＢａｃｈｅｍ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ（Ｔｏｒｒｅｎｃｅ、　ＣＡ）から購 入した。

ＰＫＡＩの輸送ポリペプチドへの化学的架橋のために、スルホ−菖ＢＳ（１ｈ＋ Ｍで）またはスルホ−ＳＭＰＢ（１５ｍＭで）のいずれかを使用した。

これらの架橋試薬はいずれも、チオール基および一級アミン基に対してヘテロニ 官能性である。ＰＫＡＩにはりシン残基およびシスティン残基がないので、スル ホ−輩ＢＳおよびスルホ−ＳＭＰＢはいずれも、選択的にＰＫＡＩのアミノ末端 への架橋を標的にする。ＰＫＡ１を２　ｍｇ／ｍｌの濃度で、５０ｎＭのＨＥＰ ＥＳ（ｐＨ７，５）、２５１ＭのＮａＣ１と共に、室温で５０分間、これらの架 橋試薬のいずれかと反応させた。スルホ−１！ＢＳ反応混合物は、スルホ−ＭＢ Ｓを１ｈ＋Ｍ、およびＤＭＦを２０％含有していた。スルホ−ＳＭＰＢ反応混合 物は、スルホ−ＳＭＰＢを１５＋ｎｌｌ、およびジメチルスルホキシド（ｒＤＭ ｓＯＪ）を２０％含有していた。このＰＫＡＩ−架橋剤付加物を、Ｃ４カラムを 用いる逆相［（ＰＬＣによって精製した。０．１％のトリフルオロ酢酸を含有す るアセトニトリルの２０〜７５％の勾配を用いて、０４カラムから試料を溶出さ せた。凍結乾燥によって付加物からアセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸を除 去し、そしてこの付加物を２５ｃ＋ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６，０）、２５ｍ１ｌ のＮａＣ１に再溶解した。ｔａｔｌ−７２またはｔａｔ３７−７２を添加し、そ してＩＭのＢＥＰＥＳ（ｐＨ７，５）を添加して１００ｍＭにすることによって 、反応混合物のｐｉ（を７．５に調整した。その後、架橋反応を室温で６０分間 進行させた。

輸送ポリペプチド二ＰＫへ■比を変えることによって、架橋の程度を調節した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥによって架橋反応生成物を分析した。ｔａｔ３７−７２を用い たときは、単一の新たな電気泳動バンドが架橋反応で生成した。この結果は、１ 分子のｔａｔ３７−７２が、１分子のＰＫＡ　Ｉに付加することと一致した。ｔ ａｔｌ−７２を用いたときは、６個の新たな生成物が架橋反応で生成した。この 結果は、ｔａｔｌ−７２に複数のシスティン残基が存在する結果として、ｔａｔ ｌ−７２ポリペプチド１個あたりに複数のＰＫＡＩ分子が付加することと一致す る。ＰＫＡＩをモルで大過剰に架橋反応に添加したとき、ｔａｔｌ−７２の１個 につき５個または６個のＰＫＡ　１部分を有する複合体だけを得た。

ＰＫＡＩ　こついてのインビ　ロｌン　・・セＰＫＡ　Ｉの生物学的活性の保持 について、スルホ−ＭＢＳによって架橋した複合体を試験するために、インビト ロのリン酸ア・ンセイを用いた。このアッセイでは、ヒストンＶを、ＰＫＡＩ（ またはＰＫＡＩ複合体）の存在または非存在下の、タンパク質キナーゼへによる リン酸化の基質として供した。次いで、５Ｏ８−ＰＡＧＥを用いて、リン酸化の 程度におけるＰＫＡＩに依存する差異をモニターした。それぞれの反応において 、ＰＫＡ　ＩまたはＰＫＡＩ複合体の墓を変えて、タンパク質キナーゼへ（Ｓｉ ｇｍａ）の触媒サブユニット５単位と、３７°Ｃで３０分間インキュベートした 。ア・ンセイ反応混合物は、２４１１ＩＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）、２ ５＋＋＋ＭＩ７）ＭｇＣ１５，１１００ＩのＤＴＴ、５０μＣｉの［γ−３２ｐ コＡＴＰ、および２μｇのヒストン■を全反応容積４０μｍ中に含有していた。

このアッセイを用いて、ｔａｔｌ−７２またはｔａｔ３７−７２に複合体化体イ ヒしたＰＫＡＩは、非結合ＰＫＡ　Ｉと同様に、リン酸化を阻害することを見出 した（データは示さない）。

綴１０二り土ヱー ＰＫＡＩおよび輸送ポリペプチド−ＰＫＡ　Ｉ複合体の細胞取り込みを試験する ために、ｃＡＭＰ応答性発現制御配列の制御下にあるクロラムフェニコールアセ チルトランスフェラーゼ（ｒｃＡＴＪ）リポータ−遺伝子を含有する培養細胞を 用いた。このようにＣＡＴ活性を測定することによってタンパク質キナーゼＡの 活性を間接的に定量した。このアッセイは、Ｊ、　Ｒ，Ｇｒｏｖｅらによって詳 細に説明されている（「組換えタンパク質キナーゼインヒビターを用いた、予備 結合（Ｐｒｏｂｉｎｄ）ｃＡＭＰ関連遺伝子発現」、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ａｓ 　ｅａｔｓ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｒｅ　ｕｌａｔｉｏｎ　Ｖｏｌ、６．　 Ｐ、ＣｏｈｅｎおよびＪ、Ｇ、Ｆｏｌｋｅｓ！５Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ、　Ａａ＋５ｔｅｒｄａＩｎ、　ｐｐ、１７３−９５　（１９９１乃 。

このアッセイを用いて、ＰＫＡＩまたは輸送ポリペプチド−ＰＫ＾■複合体の全 てに活性がないことを見出した。この結果は、ＰＫＡ　１部分が、細胞中に入る 際、急速に分解を受けているかもしれないということを示唆した。

ＰＫＡＩ　Ｔａｔ３７−７２−　−−−　シ　−ゼ　の本発明者らは、以前に、 ｔａｔ３７−７２−β−ガラクトシダーゼの細胞取り込みがクロロキンに依存性 がないことを見出した（上記実施例２）。それ故に、急速分解に対してＰＫＡＩ を保護することができるように、ＰＫＡＩをｔａｔ３７−７２−β−ガラクトシ ダーゼに架橋した。

β−ガラクトシダーゼを、室温で３０分間、２０ｆｆｉｌｉのＤＴＴ（還元剤） で処理し、そしてＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）中のＧ５０カラムでのゲル濾過によっ てＤＴＴを除去した。還元したβ−ガラクトシダーゼをＳＭＰＢ活性化したＰＫ ＡＩ（上記）とｐＨ６，５で６０分間反応させた。

残存するフリーのスルフヒドリル基をブロックするために、Ｎ−エチルマレイミ ドまたはヨードアセトアミドを添加した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、β−ガラクトシダーゼの少なくとも９５％が結合した ことを示した。結合したβ−ガラクトシダーゼ生成物の約９０％が、サブユニッ トあたり１個のＰＫＡＩを含有し、そして約ｌＯ％が２個のＰＫＡＩを含有して いた。ＰＫＡ　Ｉ−β−ガラクトシダーゼ複合体を１０倍モル過剰のスルホ−３ ＭＣＣで処理した。

次に、このＰＫＡＩ−β−ガラクトシダーゼ−３ＭＣＣをｔａｔｌ−７２と反応 させた。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、ＰＫＡＩ−β−ガラクトシダーゼ：　 ｔａｔｌ−７２の比は、１：０．５であるように思われた。最終生成物的１００ μｇを生成した。沈殿の問題のために、溶液中の最終生成物の濃度は、１００μ ｇ／ｎｌに制限された。

去ＪＬ医Ｊ− Ｅｅｌプレーサ−ム 輸送ポリペプチド−Ｅ２リプレッサー複合体の細胞取り込みおよびＥ２リプレッ サー活性を試験するために、Ｅ２依存性のリポータ−プラスミドおよびＥ２発現 プラスミドを、ＳＶ４０で形質変換されたアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ 　ｇｒｅｅｎ　ｉ′１ｏｎｋｅｙ）腎臓（ｒｃＯ３７Ｊ）細胞に、同時にトラン スフェクトした。次に、トランスフェクトした細胞を、輸送ポリペプチド−Ｅ２ リプレ・ノサー複合体（遺伝子融合または化学的架橋によって作製した）、また は適切なコントロールに曝した。以下に記載の抑制アッセイは、本質的にＢａｒ ｓｏｕｆｆｌらによって説明されて（する（前出）。

・・セイ　己 ＣＯ３７細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒ。

ｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ　１６５１）から得た。このＣＯ ３７細胞を、１０％の胎仔ウシ血清（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｌｅｎ ｅｘａ、　ＫＳ）および４ｍＭグルタミン（「成長培地」）を含むダルベツコの 改変イーグル培地（ＧｒＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）で増殖さ せた。細胞のインキュベーション条件は、３７℃でＣ０ｙ５．５％であった。

・・セ　−スミ′ Ｅ２依存性リポータ−プラスミド、すなわちｐＸＢ３３２ｈＧＨは、切形ＳＶ４ ０初期プロモーター（３個の上流Ｅ２結合部位を有する）によって作動する、ヒ ト成長ホルモンリポータ−遺伝子を含有していた。このｈＧ［ｌリポータ−プラ スミド、すなわちｐＸＢ３３２ｈＧＦＩをＢａｒｓｏｕＩｏらの記載（前出）に 記載のように構築した。

完全長のＨＰＶ　Ｅ２遺伝子の発現のために、プラスミドｐＡｔｌＥ２（図４） を構築した。プラスミドｐＡＨＥ２は、上流のＳＶ４０エンハンサ−によって増 強されたアデノウィルス主要後期プロモーターに作動可能に連結されたＲＰＶ株 １６からのＥ２遺伝子を有する。

プラスミドｐＨＰＶ１Ｂ（ｐＢＲ３２２中にクローン化された完全長のＢＰＶ１ ６ゲノム）からＦＩＰＶ　Ｅ２遺伝子を単離した。この遺伝子は、Ｍ、Ｄｕｒｓ ｔら、「子宮頚癌から得た乳頭腫ウィルスＤＮＡおよび種々の地理的領域から得 た癌生体検査試料におけるその罹患率」、？ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ、８０、ｐｐ、　３８１２〜１５（１９８３）に、Ｔｔｈｌｌｌｌ 　−Ａｓｅｌフラグメントとして記載されている。ＨＰｖ１６ゲノムにおいて、 Ｔｔｈｌｌｌｌはヌクレオチド２７１１で切断し、そしてＡｓｅｌはヌクレオチ ド３９２９で切断する。Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩクレノウ反応で、Ｔｔｈｌｌ ｌｌ−＾ｓｅｌフラグメントの末端を平滑化し、そしてＢａｍ旧リンカ−（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号１０２１）を連結した。こ のリンカ−を有するフラグメントをＢａｍＨＩ切断プラスミドｐＢＧ３３１に挿 入して、プラスミドｐＡＨＥ２を作製した。

プラスミドｐＢＧ３３１は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの下流のＢａｍ旧 部位がないこと以外は、ｐＢＧ３１２（Ｒ，Ｌ、　Ｃａｔｅら、［ミュータ−（ １［ｕｌｌｅｒｉａｎ）阻害物質のための、ウシおよびヒト遺伝子の単離、なら びに動物細胞でのヒト遺伝子の発現」、Ｃｅ１ｌ、４５゜６８５−９８頁（１９ ８６））とｒｉｆｌ　シテ、プロモーターと５ｖ４０イントロンとの間のＢａｍ 旧部位が唯一になる。ｐＢＧ３１２をＢａｎ旧で部分的に消化し、線状化したプ ラスミドをゲル精製し、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ処理によって平滑末端を 形成し、自己連結させ、そして所望の、Ｂａｆｆ１旧部位が欠失したプラスミド をスクリーニングすることによって、所望でないＢａｍ旧部位を除去した。

Ｅ２１　し、・サー　ンパ　の、こ Ｅ２リプレッサータンパク質の一つ、Ｅ２．１２３は、アミン末端に付加したＭ ｅｔＶａｌを有するＨＰＶ１６　Ｅ２のカルボキシ末端の１２１個のアミノ酸か らなっていた。また、Ｅ２．１２３ＣＣ５Ｓと呼ばれる、Ｅ２．１２３ノ変異体 を用イタ。Ｅ２．１２３ハ、Ｈｐｖｔ６Ｅ２１７）　７　ミ／酸位置２５１．２ ８１．３００、および３０９にシスティン残基を有する。Ｅ２゜１２３ｃｃｓｓ では、位置３００および３０９でシスティン残基をセリンに変え、そして位置２ ９９でリシン残基をアルギニンに変えた。位置３００および３０９のシスティン 残基を置換し、その結果、シス−ティン依存性の化学的架橋がＥ２リプレッサー のアミノ末端部分では起こるが、Ｅ２の最小のＤＮＡ結合／二量体化ドメインで は起こらない。最小のＤＮＡ結合ドメインでの架橋は、リプレッサーの生物学的 活性を妨害する可能性があると考えた。

プラスミドｐＥＴ８ｃｍ１２３（図５ｌ配列番号：１４）の構築のために、プラ スミドｐ）ＩＰＶ１６をテンプレートとして用いて、標準的なポリメラーゼ連鎖 反応（ｒＰＣＲ］）手法によって必要なりＮＡフラグメントを生成した。（ＰＣ Ｒ手法の一般的な議論については、５ａｎｂｒｏｏｋら、上述の１４章を参照。

自動化されたＰＣＲ装置および化学物質が市販されている。）Ｅ＾５２（３７４ 個の塩基対のＥ２−１２３フラグメントの５°末端のためのＰＣＲオリゴヌクレ オチドプライマー）のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号＝１５に記載して いる。

Ｅ＾５４（Ｅ２−１２３７ラグメントの３′末端のために用いられるＰＣＲオリ ゴヌクレオチドプライマー）のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号：１６に 記載している。このＰＣＲ産物をＮｃｏ　ＩおよびＢａｍ旧を用いて消化し、そ して得られたフラグメントを、Ｎｃｏｌ／Ｂａｍ旧で消化した発現プラスミドｐ ＥＴ８ｃ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、前出）にクローン化して、プラスミドｐＥＴ８ｃ ｍ１２３を作製した。

異なる５′オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いた、同様の手順を用いる ことによって、ＨＰＶ１６　Ｅ２のカルボキシ末端の８３ｇのアミノ酸に対する コドンに直ちにつながる、メチオニンコドンおよびアラニンコドンを含む、２５ ０個の塩基対のフラグメント（ｒＥ２−８５Ｊ）を得た。Ｅ＾５７（すなわちＣ ２−８５を生成するためのＰＣＲ５’プライマー）のヌクレオチド配列は、配列 表の配列番号＝３４に記載している。

Ｃ２，＋２３ＣＣ３Ｓの細菌による産生のための、プラスミドｐＥＴ８ｃｍ１２ ３ＣＣ３Ｓ（図６；配列番号：１７）を構築するために、ＰＣＲ手法によッテ、 ８８２　ｂｐ　Ｐｓｔｌ−Ｅａｇｌ　ＤＮ＾フラグメントを合成した。ＰＣＲテ ンプレートは、ｐＥＴ８ｃｍ　１２３であった。ＰＣＲプライマーの一つ（３７ ４、１４０と呼ぶ）は以下のように３個のアミノ酸の変化の全てをＡＴＣＴＴＡ ＭＧ　（配列番号　＝１８）もう一つのＰＣＲプライマー３７４．１８は、以下 の配列を有していたこのＰＣＲ反応生成物をＰｓｔｌプラスＥａｇｌを用いて消 化し、そして８８２　ｂｐフラグメントを標準手法で単離した。最終工程は、３ 切片（３−ｐｉｅｃｅ）結合でのｐＥＴ８ｃｍ１２３ｃｃｓｓの生成であり、図 ６に示されるように、ｐＥＴ８ｃｍ　１２３から得られた３４２４　ｂｐ　Ｅｃ ｏＲＩ−Ｅａｇ■フラグメントと、８８２　ｂｐ　ＰＣＲフラグメントおよび６ ７４−ｂｐ　Ｐｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ　ｐＥτ８ｃｍ１２３７ラグメントとを結合 ゛した。Ｉ）ＮＡ配列分析によって構築を確認した。Ｃ２，１２３およびＣ２， １２３ｃｃｓｓタンノくり質の産生のために、５ｔｕｄｉｅｒによる記載（前出 ）に記載されたように、Ｅ、ｃｏｌｉのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株で、プ ラスミドｐＥＴ８ｃｍ　１２３およびｐＥＴ８ｃｍ１２３ｃｃｓｓを発現させた 。

Ｃ２１し・・サー　ンパ　の ３．６ｇの凍結したｐＥＴ８ｃｍ１２３−形質転換Ｅ、ｃｏｌｉ細胞を解凍゛し 、そしテコれらの細胞を、２５！ＩＭ（７）　）　！Ｊ　スー［ＩＣ１（ｐｔｌ 　７．５）、０．５ＩＩＭのＥＤＴＡ、　２．５ｍＭのＤＴＴ、およびプロテア ーゼインヒビター（１ａ＋ソのＰＭＳＦ、３ｍＭのベンズアミジン、５０ｇｇ／ １１の、ペプスタチン八、ＩＯμｇ／ｆｆ１１ノアブロチニン）を含む３５ａ＋ ｌｌ：懸濁した。１０．０００ｐｓｉでフレンチプレスを２回通過させることに よって、これらの細胞を溶解した。Ｓへ６００ロータを用いて、１２．００Ｏｒ ｐｍで１時間、溶解物を遠心分離した。Ｃ２，１２３タンパク質は、上滑液の中 に存在した。この上清液に、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）を２５ｏＭまで、旺Ｓ緩衝 液（ｐＨ５）を１０＋ｎｌｌまで、そしてＮａＣ１を１２５ｏＭまで添加した。

次に、この上清液を、２ｍＭのＳセファロースファーストフローカラムに６　ｍ ｌ／時間で付与した。カラムに付与した後、カラムを５０ｆｆ１Ｍのトリス−Ｈ ＣＩ（ｐＨ７，５）と１＋＋＋ＭのＤＴＴとを用いて洗浄した。その後、５０ａ ＋Ｍのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、ＩＩｏＭのＤＴＴ中の２００Ｉｌ＋Ｍ、 　３００ｍＭ、　４００＋ｏＭ、　５００ａ＋Ｍ、　７００ｎＭ、　オよび１０ ００１０００ＥＩ　ＮａＣ１を用いた、ステップグラディエント溶出（２ｍｌ／ ステップ）を行っ・り。Ｃ２，１２３１Ｊプレツサータンハク質は、５００Ｉｏ Ｍオヨヒ７ｏｏＩＩＩＭノＮａＣ１画分中に溶出された。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 によって、Ｃ２，１２３リプレーノサーの純度は９５％を超えていることが示さ れた。

３．０ｇの凍結したｐＥＴ８ｃｍ　１２３ＣＣ３Ｓ−形質転換Ｅ、ｃｏｌｉ細胞 を解凍し、そしてこれらの細胞をｐＥＴ８ｃｍ１２３−形質転換細胞に対して用 いたのと同じ緩衝液（上記）３０ｉ１に懸濁した。細胞溶解、不溶性の細胞残渣 の除去、ならびにＭＥＳ緩衝液およびＮａＣ１の添加もまた、Ｃ２−１２３の精 製について記載されたように行った。Ｃ２゜１２３ＣＣ３Ｓのための精製手順は 、ＭＥＳ緩衝液およびＮａＣ１の添加の後は異なった。なぜなら、手順のこの時 点で、沈殿がＣ２，１２３ｃｃｓｓと共に生成したからである。この沈殿を遠心 分離によって除去し、そして沈殿と上清液はいずれも実質的なＣ２リプレッサー 活性を有することを見出した。それ故に、これらを両方とも精製工程にかけた。

上清液を２ｍＭのＳセファロ−スフアースドアｏ−カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 　ＬＫＢ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）に６ｆｆｌｌ／時間で付与した。カ ラムに付与した後、このカラムを５０ａ＋誠のトリス−）ＩＣＩ（ｐ［１７，５ ）、ｌｆｆ１ＭのＤＴＴを用いて洗浄した。カラムの洗浄後、５０ａ＋Ｍのトリ ス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１ｍＭのＤＴＴ中の３００ａ＋Ｍ、　４００ａ＋Ｍ 、５００＋ｎＭ、　７００＋ｎＭ、および１０００ｎ＋ＭのＮａＣ１を用いて、 ステップグラディエント溶出（２ｍｌ／ステップ）を行った。Ｃ２゜１２３ＣＣ ３Ｓタンパク質は、７００ｍＭのＮａＣ１で溶出した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に よって、この純度は９５％を超えていることが示された。

Ｃ２，１２３ＣＣ３Ｓノ沈Ｒを、２５ａ＋Ｍ（７）　ト’Ｊ　ス−ＨＣＩ（ｐＨ ７，５）、１２５＋ｎ＆ｈ７）ＮａＣ１，１ｍＭのＤＴＴ、および０．５ｆｆ１ ＭのＥＤＴＡを含む７．５ｍＭに溶解した。

溶解した物質を２ｔ＋ｌのＳセファロースファーストフローカラムにのせ、そし てＣ２，１２３および沈殿しなかったＣ２．１２３ｃｃｓｓについて記載したよ うにカラムを洗浄した。３ＱＯｍＭ、　５ＱＯａ＋１１．７００ＩＩＩＭ、およ び１１０００ｆｆ１のＮａＣ１を用いて、ステップグラディエント溶出（２ａｌ ｌ／ステップ）を行った。Ｃ２リプレッサーは、５００〜７００ｍＭのＮａＣ１ 画分で溶出した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、その純度は９８％を超えてい ることが示された。Ｃ２，１２３およびＣ２，１２３ｃｃＳＳタンパク質の精製 後直ちに、グリセロールを最終濃度１５％（ｖ／ｖ）まで添加し、そして瞬間凍 結（液体窒素）アリコートを一７０℃で保存した。１１１ｇ／ｍｌでの吸光係数 り、Ｓを用いて、２８０ｎｗ＋におけるＵＶ吸収によって、精製Ｃ２リプレッサ ーを定量した。

皮ヱ皿ｌ１ 実施例１の記載の通りに、ｔａｔアミノ酸３７−７２からなる輸送ポリペプチド の化学合成を行った。ポリペプチド（５ｍｇ／ｃｌ）を、１ＯＩＩＩｌｌＩのＭ ＥＳ！ｌｉ衝液（ｐＨ５，０）、５０ａ＋ＭのＮａＣ１，０，５ｍＭのＥＤＴＡ （吸光係数はＩＩＩ＋１／ｍｌで０．２）に溶解した。この輸送ポリペプチド溶 液に、ビスマレイミドヘキサン（ｒＢＭＨＪ）（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｆｌｉｃ ａｌ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、カタログ番号２２３１９Ｇ）ストッ ク溶液（６，２５ａ＋ｇ／ｆｌｌ　ＤＭＦ）を最終濃度１．２５＋ｎｇ／ｎｌに なるように、そしてｐＨ７，５のＨＥＰＥＳＩＩｉ衝液ストック溶液液ストック 溶液濃度１００＋ｏＭになるように加えた。室温で３０分間、このＢＭｔｌをタ ンパク質と反応させた。次に、１０ｍＭの１ｌＥｓ（ｐＨ５）、５０１ＭのＮａ Ｃ１，０，５ｉＭのＥＤＴＡで平衡化したＧ−１ｏカラム上でゲル濾過すること によって、タンパク質−ＢＭ［（を未反応のＢＭＨから分離した。輸送ポリペプ チド−８Ｍ［（複合体のアリコートを一７０℃で保存した。

輸送ポリペプチド−Ｂｉｌｌ（複合体のＣ２リプレッサーへの架橋のために、Ｅ ２リプレッサータンパク質をその保存緩衝液から取り出した。このＥ２リプレッ サータンパク質を、２５１ＭのＭＥＳ（ｐＨ６，０）、０．５１１ＭのＥＤＴＡ の３容量で希釈し、そして樹脂１ｏ１あたりタンパク質５ｍｇで、Ｓセファロー スファーストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　 ＮＪ）にバッチ式でロードした。タンパク質をロードした樹脂のスラリーをカラ ムに注いだ後、このカラムを２５ｎｋｌのＭＥＳ（ｐＨ６，０）、０．５ａ＋Ｍ のＥＤＴＡ、　２５０ａ＋ｉｌのＮａＣ１で洗浄した。次に、８００１ＭのＮａ Ｃ１を含有する同じ緩衝液を用いて、結合したＥ２リプレッサータンパク質をカ ラムから溶出した。

Ｅ２リプレッサーを含有する溶出液を、２５ＩＭのＭＥＳ（ｐＨ６，０）、０゜ ５ｎＭのＥＤＴＡを用いて、ｌＩ［１ｇ／ＩＩＩ■まで希釈した。Ｅ２リプレッ サータンパク質およびＢＭＨ活性化輸送ポリペプチドを有するバッチのそれぞれ を用いて行った、試験的な架橋の研究から、１ａ＋ｇのＥ２リプレッサータンパ ク質を０．６ＨのＢＭＥＩ活性化輸送ポリペプチドで処理することで、Ｅ２リプ レッサーホモダイマー１個あたり輸送分子１個の所望の組み込みを生ずることを 確認した。代表的には、２ｎｌのＥ２リプレッサー（１ｆｆ１ｇ＃＋１）を、３ ００μｍのｔａｔ３７−７２−　ｔｌＭＦｌ（４ｆｆ１ｇ／ｎｌ）および２００ μｍのＩＭのＨＥＰＥＳＣｐＨ７，５）と混合した。この架橋反応を、室温で３ ０分間進行させた。

２−メルカプトエタノールを最終濃度１４＋＋＋Ｍまで添加することによって、 架橋反応を停止させた。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、架橋の程度を測定した 。ｔａｔ３７−７２−　Ｅ２リプレッサー複合体のアリコートを一７０°Ｃで保 存した。同一の手順を用いて、ｔａｔ３７−７２輸送ポリペプチドを１ｌＰＶＥ ２１２３リプレツサータンパク質および１（ＰＶＥ２　ＣＣ３Ｓリプレッサータ ンパク質に架橋した。

Ｅ２１　し・・サー　Δ　の　′ Ｅ２抑制アッセイには、ＣＯ３７細胞にトランスフェクトしたプラスミドの一過 性発現を用いた。Ｅ２抑制アッセイの手順は、Ｂａｒｓｏｕａ＋らの記載の手順 （前出）と同様であった。２つの別々のトランスフェクション（ｒＥＰＩＪおよ びｒＥＰ２Ｊ）において、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔ ｉｏｎ）によって４　Ｘ　１０’個のＣ０８７細胞（採収時で約５０％集密度） をトランスフェクトした。トランスフェクションＥＰｌでは、２０　ｔｔ　ｇノ ｐＸＢ３３２ｈＧＨ（＋）ポータープラスミド）プラス３８０μｇの超音波処理 したサケ精子キャリアＤＮＡ（ＰｈａｒＩｎａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔ ａｗａｙ、　ＮＪ）を用いた。トランスフェクションＥＰ２では、２０μｇのｐ ＸＢ３３２ｈＧＥＩプラス３０μｇのｐＡＨＥ２（Ｅ２トランスアクティベータ ー）および３ｓｅｒｇのサケ精子キャリアＤＮＡを用いた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｇ ｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒを用いて、２７０ボルト、９６０μＦＤで、約１１ミリ秒 のパルス時間で、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションに 続いて、６ウエルの皿（６−ｗｅｌｌ　ｄｉｓｈ）に、ウェル１個当たり２　Ｘ 　１０’個の細胞を接種した。エレクトロポレーション後５時間で、成長培地を 吸引し、細胞を成長培地と共に洗浄し、そして１．５ｎｌの新鮮な成長培地をそ れぞれのウェルに加えた。この時点で、クロロキン（ｒＣＱＪ）を最終濃度８０ μＭまで添加した（または、ブランク溶液をコントロールに添加した）。次に、 ｔａｔ３７−７２架橋したＥ２、１２３（ｒＴｘＨＥ２Ｊ）またはｔａｔ３７− ７２架橋したＥ２．１２３ｃｃｓｓ（ｒＴｘ［ＩＥ２ｃＣ３ＳＪ）を添加した。

これらの輸送ポリペプチド−カーゴ複合体の最終濃度は、細胞成長培地で６．２ ０または６０μｇ／ａ＋１であつ試料の同定 ＥＰｌ、２　８０　０ ＥＰ２．１４　８０　６０　ＴｘＨＥ２ＣＣ５Ｓ１８時間インキュベーションし た後、培地を除去し、そして先行する１８時間のインキュベーションの場合と同 じ濃度のクロロキンおよび輸送ポリペプチド−カーゴ複合体を含有する、新鮮培 地を１．５ｍｌ添加した。この培地斐換は、リプレッサーが細胞内に入る前に存 在し得る任意のｈＧＨを除去するためであった。培地皮換後２４時間で、細胞を 採収し、そして生存度を調べるために細胞計数を行った。次に、成長培地の希釈 していない試料上で、５ｅｌｄｏｎの方法（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ３４．　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ ｏｃｉａｔｅｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、９．７．１９．７．２　（１９８７ ）に記載）に従って、Ａｌｌｅｇｒｏ　ｆ（ｕｍａｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｆ ｆｌｏｎｅ−過性遺伝子発現システムキット（Ｎｉｃｈｏｌｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ ｔｅ、　Ｓａｎ　Ｊｕａｎ　Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ、　ＣＡ）を用いて、ｈＧＨ についてアッセイした。全ての試料について、アッセイバックグラウンド（すな わち、添加された非調整培地にあるアッセイ成分）をｈＧＩ（ｃｐＩＩ＋から引 き算した。タンパク質取り込み試験において、クロロキンが存在する（ｒ（＋） ＣＱＪ）か、または欠如している（ｒ（−）ＣＱＪ）かによって、与えられたタ ンパク質処理について別々の抑制率計算を行った。抑制率を以下の式に従って計 算した：ここで：　ＢＫＧ＝リポータ−のみのトランスフェクションにおけるｈ ＧＨｃｐｍ（例えば、（−）ＣＱに対するＥＰｌ、　１および０）ＣＱに対する ＥＰｌ、　２）　； ＾ＣＴ＝リポーターおよびトランスアクティベーターのトランスフェクションに おけるｈＧＨｃｐｍであり、これには、リプレッサー複合体は添加されなかった （例えば、（−）ＣＱに対するＥＰ２．１および（÷）ＣＱに対するＥＰ２．８ ）　；ＲＥＰ＝リポータ−およびトランスアクティベーターのトランスフェクシ ョンにおけるｈＧＨｃｐｆｆｌであり、これには、リプレッサー複合体が添加さ れた（例えば、（−）ＣＱに対するＥＰ２．２〜２．７および０）ＣＱに対する ＥＰ２．９〜２．１４）。

代表的なＥ２抑制アッセイのデータを、表１１に示す。表Ｉによって、表■１に 挙げられた種々の試料が同定される。図７は、表Ｈに示した結果を図式的に描い ている。

以二巴■「二」ニー ＥＰ２．１　１５，１６１　１５，０１１　１１，２０３　−−ＥＰ２．８　１ ５，１２０　１４，９７０　９７１９　、　−−Ｅ２リプレッサー（Ｅ２．１２ ３またはＥ２．１２３ｃｃｓｓ）のいずれかに架橋した輸送ポリペプチドｔａｔ ３７−７２は、培養した哺乳動物細胞で、Ｅ２依存性の遺伝子発現を、投与量に 依存して阻害した（表１１、図７）。この実験を４回繰り返して同様の結果を得 た。この効果は、他のｔａｔ３７−７２複合体は、ｐＸＢ３３２ｈＧＨのＥ２誘 導に効果かない（データは示さず）という点で、Ｅ２に特異的である。また、ｔ ａｔ３７−７２ｘ）ｌＥ２複合体は、リポータ−のｈＧＨ発現レベルに効果がな く、ここでは、ｈＧＨ遺伝子の発現は、Ｅ２には応答しない構成性プロモーター によって駆動された。ｃｃｓｓ突然変異を有するＥ２リプレッサーは、野生型ア ミノ酸配列を有するリプレッサーよりも、より大きな程度で抑制した。これは期 待されたとおりであった。なぜなら、輸送ポリペプチドの野生型リプレッサーの 最後の２個のシスティンのいずれかへの架橋によって、リプレッサー活性が低下 したり、または奪われてしまう可能性があるからである。クロロキンは、抑制活 性のためには不要であった。しかし、クロロキンは、全ての試験において抑制を 増強した。これらの結果を、表口および図７に要約する。

ｔａｔアミノ酸３８−７２に直接に融合したｔａｔアミノ酸１−２１からなる輸 送ポリペプチドの細菌による産生のために、発現プラスミドｐＴＡＴΔｃｙｓを 構築した（図８；配列番号＝２０）。プラスミドｐＴＡＴΔｃｙｓを構築するた めに、従来のＰＣＲ技術を、ＰＣＲテンプレートとしてのプラスミドｐＴＡＴ７ ２と共に用いた。ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドプライマーの１つは、３７ ４．１８（配列番号二１９）であり、これはｔａｔコード配列の上流のＥａｇ　 １部位をカバーしている。（本発明者らはまた、プラスミドｐＥＴ８ｃｍ　１２ ３ｃｃｓｓの構築にオリゴヌクレオチド３７４．１８を用いた。実施例９を参照 のこと。）他方のＰＣＲのオリゴヌクレオチドプライマーの３７４．２８は、ｔ ａｔコード配列内のＥａｇ１部位をカバーしており、そしてアミノ酸２２−３７ をコードするｔａｔ　ＤＮＡ配列の欠失を有する。３７４゜２８のヌクレオチド 配列は以下である：ＴＴＴＡＣＧＧＣＣＧ　ＴＡＡＧＡＧＡＴＡＣＣＴＡＧＧＧ ＣＴＴＴ　ＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＧＣＧＧＴ（配列番号・２１）。ＰＣＲ産物を Ｅａｇｌで消化し、生じる７６２塩基対フラグメントを単離した。Ｅａｇｌフラ グメントをｐＴＡＴ７２のＥａｇｌ切断により生成した４０５７塩基対ベクター に挿入した。ＤＮＡ配列分析により構築を確認し、５ｔｕｄｉｅｒら（前出）の 方法によりｔａｔΔｃｙｓポリペプチドを発現させた。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に より、ｔａｔΔａｙｓポリペプチドが正確な大きさであることが示された。

ｔａｔΔｃｙｓタンパク質の精製のために、４．５ｇのｐＴＡＴΔｃｙｓ形質転 換Ｅ、ｃｏ１ｉ細胞を融解し、３５＋ｎｌの２０＋ｎＭ　ＭＥＳ（ｐＨ６，２） 、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ中にこの細胞を再懸濁した。この細胞をフレンチプレス により１０．０００ｐｓｉで２回通過により溶解した。Ｓへ６００ロータにおい て、１０．０００ｒｐｆｆｌで１時間遠心分離することにより、不溶性の残渣を 除去した。、この上清を１５＋ｎｌ／時で５ｍｌ　Ｓセファロースファーストフ ローカラムにかけた。５０ｏ＋Ｍ　トリス−ＦＩＣＩ（ｐＨ７゜５）、０．釦Ｍ 　ＤＴＴでカラムを洗浄した。次いで、３００ｍＭ、　４００ＩＭ。

５００ｏＭ、　７００ｍＭ、および９５０＋ｎＭの％ａＣ１を含む同じ緩衝液で ステップグラディエント溶出（２ｍｌ／ステップ）を行った。ｔａｔΔｃｙｓタ ンパク質は９５０＋ｎＭ　ＮａＣ１画分中に溶出した。

ｔａｔΔｃｙｓ輸送ポリペプチドをローダミンイソチオシアネートに複合し、そ れを細胞取り込みに対して直接アッセイすることにより試験した。結果は陽性で あった（ｔａｔｌ−７２での関連実験での結果に類似する）。

ＴＡＴΔｃ　５−２４９’　−Ｉｆ’ム天然Ｅ２リプレッサータンパク質のアミ ノ末端に遺伝子的に融合したｔａｔΔｃｙｓ輸送ポリペプチド（すなわち、ＢＰ Ｖ−Ｉ　Ｅ２のカルボキシ末端の２４９アミノ酸）の細菌による発現のために、 プラスミドｐＴＡＴΔ、ｃｙｓ−２４９を以下のように構築した。プラスミドｐ ＴＡＴ７２（ＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ、前出）およびｐＸＢ３１４（Ｂａ ｒｓｏｕｉら、前出）からプラスミドｐＦＴＥ５０１（図９）を構築した。プラ スミドｐＸＢ３１４カラ、２４９７　ミ／酸＋７）ＢＰＶ−Ｉ　Ｅ２１Ｊプレッ サーヲコードするＮｃｏｌ−３ｐｅＩ　ＤＮＡフラグメントを単離した。（Ｎｃ ｏｌはヌクレオチド２９６位で切断し、そして５ｐｅｌはｐＸＢ３１４のヌクレ オチド１，１１８位で切断する。）このフラグメントの末端をＤＮＡポリメラー ゼＩクレノウ処理により平滑化し、市販により入手可能なりｇｌ　１１リンカ− （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号１０９０）を加えた 。

このリンカ−を有するフラグメントをＢａａ＋旧切断（完全消化）プラスミドｐ ＴＡＴ７２に挿入した。ｐＴＡＴ７２では、Ｂａｍ旧切断部位がｔａｔコード領 域内でその３′末端近くに存在し、第二のＢａ１Ｈｒ切断部位はｔａｔ遺伝子の わずかに下流に存在する。８ｇｌｌｌリンカ−は、フレームが合って、ｔａｔお よびＥ２コード配列を連結し、これらはセリン残基に続（ｔａｔタンパク質の最 初の６２アミノ酸およびＢＰＶ−Ｉ　Ｅ２タンパク質の最後の２４９アミノ酸の 融合物をコードする。本発明者らはこの細菌発現プラスミドをｐＦＴＥ５０１と 称した（図９）。プラスミドｐＴＡＴΔｃｙｓ−２４９Ｃ図１Ｏ：配列番号：２ ２）を構築するために、プラスミドｐＴＡＴ　ｃｙｓ由来の７６２塩基対のＥａ ｇｌフラグメント（これはシスティンの欠失を含むｔａｔの部分を含む）をプラ スミドｐＦＴＥ５０１の４８１２塩基対Ｅａｇｌフラグメントに挿入した。

ｔａｔΔｃｓ−２９の ｔａｔΔｃｙｓ−２４９を発現する５ｇのＥ、ｃｏｌｉを融解し、プロテアーゼ インヒビター（１，２５ｆｆ１Ｍ　ＰＭＳＦ、　３ｍＭベンズアミジン、５０μ ｇ／の１ペプスタチンＡ、５０μｇ／のｌアプロチニン、４μｇ／ｎｌ　Ｅ６４ ）を加えた、４０ノ１の２５ｍＭ　トリスＨＣＩ（ｐＨ７，５）、２５ｍＭ　Ｎ ａＣ１，０，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５　ＩＩＩＭ　ＤＴＴ、中にこの細胞を再懸 濁した。この細胞を１０．０００ｐｓｉでフレンチプレスのセルを２回通過させ ることにより溶解した。５Ａ６００ロータにおいて、１２．００Ｏｒｐａ＋で１ 時間遠心分離をかけることにより、不溶性の残渣を除去した。可溶画分からｔａ ｔΔａｙｓ−２４９を精製した。この上清を２ｍ１Ｓセフア０−スフアーストフ ローカラム（Ｐｈａｒｒｎａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ ）に流速６の１ｘ時で加えた。カラムを、２５ＩｎＭトリスＨＣ１（ｐＨ７，５ ）、２５ｍ１ｌ　ＮａＣ１，０，５＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ、１　ｆｆＩＷ　ＤＴＴで 洗浄し、ｉ。

ＯＩＩＩＭ、　２００ｎＭ、　３００ｎＪ　４００ＩＭ、５００ｍＭ、　６００ ＋ｎＭ、および８００ｎＭのＮａｃｌを含む同じ緩衝液で連続的な塩濃度ステッ プで処理した。

ＴａｔΔｃｙｓ−２４９を６００−８００ａ＋Ｍ塩画分で回収した。このピーク 画分をプールし、グリセロールを１５％まで加え、アリコートを一７０℃で貯蔵 した。

灸交ｉ土ヱユ土イ ｔａｔΔｃｙＳ−Ｅ２リプレッサー融合タンパク質の細胞取り込みを分析するた めに、間接免疫蛍光法を用いた。ＨｅＬａ細胞を６ウ工ル組織培養皿中でカバー ガラス上に５０％集密で植え付けた。

−晩インキユベートした後、ｔａｔΔｃｙｓ−Ｅ２リプレッサー融合タンパク質 （１μｇ／ｆｆ１ｌ最終濃度）およびクロロキン（０，１１１Ｍ最終濃度）を加 えた。６時間後、融合タンパク質／クロロキン含有成長培地を除去し、細胞をＰ ＢＳで２回洗浄した。洗浄した細胞を室温で３．５％ホルムアルデヒド中に固定 化した。固定化した細胞を、１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２／　Ｏ，１ｍＭ　ＣａＣ１ｘ を含有するＰＢＳ（ｒＰＢｓ＋Ｊ）中で０．２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００／　 ２％ウシ血清アルブミンＣｒＢｓ＾」）で室温で５分間透過処理した。透過処理 した細胞をブロックするために、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで、これら細胞を ４℃で１時間処理した。

このカバーガラスを、各ウェル中で２０μｍの一次抗体溶液と共に４°Ｃで１時 間、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ＋のｔ：ｔｏｏ希釈でインキュベートした。− 次抗体は、ＢＰＶ−Ｉ　Ｅ２リプレッサーに対するウサギポリクローナル抗体（ Ｅ２の精製カルボキシ末端８５アミノ酸を注射することにより生成される）、ま たはｔａｔに対するウサギポリクローナル抗体（ｔａｔタンパク質の精製アミノ 末端７２アミノ酸を注射することにより生成される）のいずれかであった。ＰＢ Ｓｆ中の０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０／　２％ＢＳＡ中で、ｉ　：　ｔｏｏ希釈で ４℃で３０分間、二次抗体を加えた。

二次抗体は、ローダミン複合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ　ｎｏ。

２２１２−００８１）であった。細胞を二次抗体とインキュベートさせた後、こ の細胞をＰＢＳ＋中０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０／　２％ＢＳＡで洗浄し、９０％ グリセロール、２５ｆｆ１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ）Ｉ　７．２）、１５０ｍＭ ＮａＣ１中でカバーガラスを乗せた。ローダミンフィルターを有する蛍光顕微鏡 で細胞を試験した。

ＴａｔΔｃｓ　ムの、胞 ｔａｔΔｃｙｓ−Ｅ２リプレッサー融合タンパク質の顕著な細胞取り込みを、ｔ ａｔ抗体またはＥ２抗体のいずれかを用いて観察した。

複合体化していないｔａｔタンパク質にさらしたコントロール細胞では、ｔａｔ 抗体による細胞内蛍光を観察したが、Ｅ２抗体では観察されなかった。複合体化 していないＥ２リプレッサーとｔａｔタンパク質またはｔａｔΔｃｙｓとの混合 物にさらしたコントロール細胞では、ｔａｔ抗体による蛍光を観察したが、Ｅ２ 抗体では観察されなかった。これにより、ｔａｔは、ｔａｔタンパク質に複合体 化したときにのみＥ２リプレッサーの取り込みを仲介することが証明された。複 合体化していないｔａｔタンパク質と同様に、細胞全体にｔａｔΔｃｙｓ−Ｅ２ リプレッサー融合タンパク質を観察したが、これは細胞内小胞中に密集していた 。これらの結果は、完全にシスティン残基を欠失しているｔａｔ由来ポリペプチ ドが、動物細胞中に異種タンパク質（すなわち、輸送ポリペプチド−カーゴタン パク質の遺伝的融合）を運搬し得ることを示す。

上記と同様の手順で、ｔａｔΔｃｙｓとＲＰＶ　Ｅ２のＣ末端１２３アミノ酸と の遺伝的融合物を作製した。成長培地に加えたとき、この融合ポリペプチドは、 Ｃ０８７細胞においてＥ２依存性遺伝子発現の抑制を示した（データは示さず） 。

Ｋ直匠旦 アンチセンス第１ゴデオ　シ　レオチ゛　ム自動化ＤＮＡ／　ＲＮＡシンセサイ ザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３９４）を用いて、ＤＮＡ ホスホロチオネートアナログ（長さ４−１８ヌクレオチド）を合成した。このア ナログはそれぞれ５°末端にフリーアミノ基を含む。このアミン基は市販の修飾 ヌクレオチド（アミノリンク２、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｉ＋ｓ）を 用いて、オリゴヌクレオチドに結合した。このオリゴヌクレオチドは、ヒト成長 ホルモンおよびＣＡＴメツセンジャーＲＮＡの領域に由来のセンス鎖およびアン チセンス鎖に相当した。

各架橋反応のために、２００μｇのオリゴヌクレオチドを１００μｍの２５ｎ＋ Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）中に溶解した。次いで、１０μｍのス ルホ−３ＭＣＣの５０ｍＭストック溶液を加え、反応を室温で１時間進行させた 。２５％Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐｉ（６，０）中のＰＢＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ）での反応混合物のゲル濾過により未反応のスルホ−３ＭＣＣを除去した。オリ ゴヌクレオチド−スルホ−３ＭＣＣ付加物を減圧下で乾燥した。この手順におけ るオリゴヌクレオチドの回収率は、５８〜９５％の範囲であった。輸送ポリペプ チドとの反応のために、各オリゴヌクレオチド−スルホ−３ＭＣＣ付加物を５０ μｍの０．５＋ｎＭ　ＥＤＴＡ中に再溶解し、この溶液を５０μｇの凍結乾燥し た輸送ポリペプチドを含有する試験管に移し、そして反応を室温で２時間進行さ せた。反応産物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

夾ｉｆＬ浮 仄μ」［［体 一″クンム　１ 市販のマウスＩｇＧ１　ａ＋Ａｂ抗チューブリン（ＡＩＩＩｅｒｓｈａｍ）を得 て、プロティンＡを用いて従来法により腹水からそれを精製した。

精製抗体をローダミンイソチオシアネートで、１．２モルローダミン１モル＾ｂ で標識した。固定化し透過処理したＨｅＬａ細胞を標識抗体にさらすと、顕微鏡 検査により鮮やかに染色された微小管が明らかになった。ローダミン標識で十分 であるが、抗マウスＦＩＴＣで抗体シグナルを増強した。

本質的に実施例２に記載された手順（前出）で、２５０μｇの抗体をスルホ−Ｓ ＭＣＣのｌｏ：１モル過剰と反応させた。次いで、４８μｇの（”Ｓ−標識）ｔ ａｔｌ−７２を加えた。ｔａｔｌ−７２：　Ａｂのモル比は２゜７：１であった 。放射活性の取り込みによると、ｔａｔｌ−７２は、抗体に０．６：ｌの比で架 橋した。

ｔａｔｌ−７２−＾ｂ複合体の取り込みの分析のために、複合体をカバーガラス 上で増殖した細胞を浸している培養液（１０μｇ／ｍｌ）に加えた。細胞におい て蛍光の斑点パターンを観察した。斑点パターンは、複合体の小胞体への局在化 を示し、従って細胞質送達に関しては決定的ではない。

複合抗体の免疫反応性を示すために、この抗体がチューブリンに結合する能力を 試験した。精製チューブリンを臭化シアン−活性化セファロース４Ｂ（Ｓｉｇｎ ＋ａ　Ｃｈｅ＋ｎ、　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ）に結合させた。放射活性複合体の試料をチューブリンカラム（およびセフ ァロース４Ｂコントロールカラム）にかけ、結合した複合体の量を測定した。コ ントロールカラムよりもアフィニティーマトリックスに対してより大きい放射活 性が結合し、チューブリン結合活性を示した。

−１ンム　２ 別の架橋実験において、抗チューブリンラットモノクローナル抗体１ｇＧ２ａ（ Ｓｅｒｏｔｅｃ）を得、プロティンＧを用いて従来法により腹水からそれを精製 した。この抗体をＣａｐｓ緩衝液（ｐＨ１０）で溶出した。精製抗体は、チュー ブリン結合アッセイで陽性であった。ｔａｔｌ−７２をローダミンイソチオシア ネートとｌ：ｌのモル比で反応させた。反応産物は、０．６３のＡ　ａ＊＊／　 Ａ　ｘａｏ比を示し、ｔａｔｌ−７２１モルに対し色素的０．７５モルの置換を 示した。未反応の色素をｔａｔｌ−７２−ローダミンからＧ−２５ゲル濾過（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）により分離した 際、反応において１５０μｇのｔａｔｌ−７２から５２μｇのみを回収した。

ｔａｔｌ−７２−ローダミンのアリコートを、細胞取り込み実験での使用（コン トロールとしての）のために保存し、残りをＳＭＣＣ（２０：１）と反応させた ０、　４ｍｇの抗体に加えた。反応混合物は、意図された５：ｌではなく約１＝ １の比のｔａｔｌ−７２：Ａｂを含んでいた。

（続く実験では、５：ｌの比は沈殿を生じ、満足しない結果となることがわかっ た。）架橋反応を４°Ｃで一晩進行させた。次いで、モル過剰のシスティンを加 え、残存するマレイミド基を−ブロックし、このようにして架橋反応を停止させ た。反応混合物を遠心分離し、存在する沈殿物をすべて取り除いた。

４−２０％ポリアクリルアミドグラディエントゲルを用いて電気泳動を行い、還 元条件下および非還元条件下で上清液を分析した。また、この手順により沈殿ペ レットを分析した。抗体−ｔａｔｌ−７２（ローダミンなし）からの上溝液では 、４−２０％ゲルではほんのわずかしか物質は観察されなかった。しかし、抗体 −ｔａｔｌ−７２−〇−ダミン複合体実験からの上清液では、還元試料について 、抗体よりも相対的に大きな分子員のバンドを観察した。抗体は、ｔａｔｌ−７ ２に約ｌ：ｌの比で複合体化したと思われた。

複合体２で行った細胞取り込み実験（複合体１に関して上述した手順）では、複 合体ｌで得た結果と同様の結果を得た。複合体をローダミン蛍光または二次抗体 に結合したフルオレセインにより可視化したとき、小胞体内で複合体が観察され た。

（以下余白） 実ｍユ 輸送ポリペプチドｔａｔ３７−７２を、Ｅ２の４つの異なるリプレッサー型に化 学的に架橋した。これらの実験に用いた４つのＥ２リプレッサ一部分ハ、ＢＰＶ −１（ｒＥ２．１０３Ｊ）ノカルボキシ末端１０３残基（すなわち、３０８−４ １０）　；　ＢＰＶ−１（ｒＥ２．２４９Ｊ）（７）　カルボキシ末端２４９残 基（すナワち、１６２−４１０）　；　ＲＰＶ−１６（ｒＨＥ２Ｊ）（７）カル ボキシ末端１２１残基（すナワち、２４５−３６５）　；　オヨびＲＰＶ−１６ ノカルボキシ末端１２１残基であり、ここでは、３００位および３０９位でシス ティン残基をセリンに変えており、そして２９９位でリシン残基をアルギニンニ 変えた（ｒＨＥ２ｃｃｓｓＪ）。ＥＩＥ２オよびＩ（Ｅ２ＣＣ３Ｓ（７）組換元 産生および精製、ソノ後＋７）　ＥＩＥ２およびＨＥ２ＣＣ３ｓノｔａｔ３７− ７２へ（Ｄ架橋により、それぞれＴｘＨＥ２およびＴｘＨＥ２ＣＣ３Ｓの形成を 実施例９に記載している（上記）。ｔａｔ３７−７２へＥ２．１０３およびＥ２ ．２４９を化学的に架橋（ＴｘＥ２．１０３およびＴｘＥ２．２４９と名付けた 複合体を生ずる）するために、ＴｘＨＥ２およびＴｘＨＥ２ＣＣ３Ｓを作製する ために用いた同じ方法を用いた（実施例９、前出）。

Ｅ、　ｃｏｌｉ中でプラスミドｐＥＴ−Ｅ２．１０３からタンパク質Ｅ２．１０ ３を発現させた。実施例９（上記）および図５に記載した、ｐＥＴ８ｃｍ１２３ を生成するのに用いた手順と類似のＰＣＲクローニング手順により、ｐＥＴ−Ｅ ２．１０３を得た。ｐＥＴ８ｃｍ１２３の構築におけるように、ＰＣＲで生成し たＮｃｏｌ−Ｂａ＋ｎＨＩ　Ｅ２７ラグメントをＮｃｏｌ−Ｂａｔ旧で切断した ｐＥＴ８ｃに連結した。Ｅ２フラグメントに対するＰＣＲ鋳型は、プラスミドｐ ｃｏ−Ｅ２であった（）ｌａｖｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら、ＥＭＢＯＪ、、７巻、 ５２５−３１頁（１９８８）　；米国特許第５．２１９．９９０号）。ｐｃｏ− Ｅ２かうＥ２７ラグメントを生成するのに用いたオリゴヌクレオチドプライマー は、ＥＡ２１（配列番号：３６）、およびＥ＾２２（配列番号：３７）であった 。プライマーＥ＾２１は、ＢＰＹ−Ｉ　Ｅ２のカルボキシ末端１０１残基に対す るコード領域の５゛側に隣接するアラニンコドンが続くメチオニンコドンを付加 するＮｃｏ１部位を導入した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ中でプラスミドｐＥＴ８ｃｍ２４９からタンパク質Ｅ２．２４９ を発現させた。プラスミドｐＸＢ３１４（図９）の１３６２ｂｐのＮｃｏｌ−Ｂ ａＩＩＩＨＩフラグメントをＮｃｏｌ−Ｂａｉ旧で切断したｐＥＴ８ｃ（図５） に挿入することにより、ｐＥＴ８ｃｍ２４９を構築した。

ＴＡＴΔｃ　５−ＢＰＶ　Ｅ２’−、ムＴＡＴΔｃｙｓ−２４９に加えて、幾つ かの他のＴＡＴΔｃｙｓ−ＢＰＶ−Ｉ　Ｅ２リプレッサー融合体を試験した。プ ラスミドｐＴＡＴΔｃｙｓ−１０５は、ｔａｔ残基１−２１および３８−６７、 その後ろにＢＰＶ−１のカルボキシ末端ｔＯＳ残基をコードしていた。プラスミ ドｐＴＡＴΔｃｙｓ−１６１は、ｔａｔ残基１−２１および３Ｂ−６２、その後 ろにＢＰＶ−１のカルボキシ末端１６１残基をコードしていた。プラスミドｐＴ ＡＴΔｃｙｓ−１０５およびｐＴＡＴΔｃｙｓ−１６１を、中間体プラスミドの ｐＦＴＥ１０３およびｐＦＴＥ４０３からそれぞれ構築した。

ｐＦＴＥ１０３およびｐＦＴＥ４０３（およびｐＦＴＥ５０１）を、Ｂａｎ旧で 切断した（完全消化）ベクターｐＴＡＴ７２に異なる挿入物を連結することによ り生成した。

ｐＦＴＥ１０３への挿入フラグメントを得るために、ｐＸＢ３１４から９２９塩 基対のＰｌｅｌ−Ｂａｍ旧フラグメントを単離し、そしてそれを合成オリゴヌク レオチドＦＴＥ、　３（配列番号＝２３）および合成オリゴヌクレオチドＦＴＥ 、４（配列番号：２４）からなる二本鎖リンカ−に連結した。このリンカ−は、 ｔａｔ残基６１−６７をコードしており、そして５′末端でＢａ１１１旧突出部 、および３′末端でＰｌｅｌ突出部を有した。ｐＸＢ３３１４由来のリンカ−を 有するフラグメントをＢａｆｆ１旧で切断しりｐＴＡＴ７２１：連結し、ｐＦＴ Ｅ１０３を得た。ｐＦＴＥ４ｏ３への挿入フラグメントを得るために、ｐＸＢ３ １４をＮｃｏｌおよび５ｐｅｌで消化し、フレノウ処理し平滑末端を生成し、そ してそれ自身で二重らせんであるＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ＾、カタログ番号Ｎｏ、１０９０ ）（配列番号＝３５）からなるＢｇｉｒｌリンカ−を連結した。得られた８２２ −塩基対フラグメントを電気泳動により精製し、次いで、それをＢａｍ旧で切断 したｐＴＡＴ７２ベクターに連結してｐＦＴＥ４０３を得た。

ｔａｔ残基２２−３７を欠失するために、それによってｐＦＴＥ１０３からプラ スミドｐＴＡＴΔｃｙｓ−１０５を、およびｐＦＴＥ４０３からｐＴＡＴΔｃｙ ｓ−１６１を得、ｐＦＴＥ５０１からプラスミドｐＴＡＴΔｃｙｓ−２４９を得 るために用いた同一の方法（上に記載）を用いた。

ＴＡＴΔｃｓ−ＨＰｖＥ２°−、ム ｔａｔΔＣＹＳ輸送部分（ｔａｔ残基１−２１．３８−７２）に続＜　ＨＰＶ− １６のカルボキシ末端８５残基または１２１残基からなる融合タンパク質をコー ドする、プラスミドｐＴＡＴΔｃｙｓ−ＨＥ２．８５およびｐＴＡＴΔｃｙｓ− ＩＦ２．１２１をそれぞれ構築した。

ｐＴＡＴΔｃｙｓ−）ＩＦ５．８５およびｐ　Ｔ　Ａ　ＴΔｃｙｓ−ＦＩＥ２． １２１の構築における出発プラスミドは、それぞれｐＥＴ８ｃｍ８５およびｐＥ Ｔ８ｃｍ１２３であった（両者とも上に記載）。ｐＥＴ８ｃｍ８５およびｐＥＴ ８ｃｍ１２３をＢｇｌ［ＩおよびＮｃｏｌで消化し、そして、それぞれの場合に 、ベクターとして用いるために大きなフラグメント（ｐＥＴ８ｃｍ８５がら４７ ６９塩基対またはｐＥＴ８ｃｍ１２３から４８８０塩基対）を単離した。両方の ベクターとも、Ｎｃｏ１部位からＥ２コード領域が始まる。両方のベクターに、 プラスミドｐＴＡＴΔｃｙｓ由来の２２０ｂｐのＢｇｌｌｌ−Ａａｔｌ　１フラ グメントおよび合成フラグメントを挿入した。ＢｇＬＩｉ＾ａｔｌｌフラグメン トの５′末端は、Ｔ７プロモーターの上流であり、そしてｔａｔΔｃｙｓの最初 の４０残基（すなわち、残基１−２Ｌ　３８−５６）をコードする。アニールし たオリゴヌクレオチド３７４．６７（配列番号：２５）および３７４．６８（配 列番号＝２６）からなる合成フラグメントは、ｔａｔ残基５７−７２をコードし 、５°末端に＾ａｔ１１突出部、および３゛末端にＮｅｏ　Ｉ突出部を有する。

−・　ムのＪＢシＶ−ズ プラスミドｐＪＢ１０６は、融合タンパク質をコードしく図１２）（配列番号： ３８）、そこではアミノ末端メチオニン残基の後にｔａｔ残基４７−５８、次イ テ、Ｉ（Ｐｖ−１６Ｅ２残基２４５−３６５カ続く。ｐＪＢ１０６を得るために 、図１１に図式で表現したように、３つの断片の連結を行った。プラスミドｐＥ Ｔ８ｃをＮｃｏ　＋およびＢａｌ１′ｌ旧で消化することにより、４６０２塩基 対ベクターフラグメントを生成した。

１つの挿入物は、ｐＥＴ８ｃｍ１２３由来の３５９塩基対のＭｓｐｌ−Ｂａａ＋ 旧フラグメントであり、ＨＰＶ−１６Ｅ２残基２４８−３６５をコードしていた 。

他の挿入物は、アニールしたオリゴヌクレオチド対の３７４．１８５（配列番号 、２７）および３７４．１８６（配列番号＝２８）からなる合成フラグメントで あった。合成フラグメントは、アミノ末端メチオニンおよびｔａｔ残基４７−５ ８、プラスＨＰＶ１６残基２４５−２４７（すなわち、ＰｒｏＡｓｐＴｈｒ）を コードした。合成フラグメントは、５°末端でＮｅｏ　Ｉ突出部および３°末端 でＭｓｐｌ突出部を有した。

ｐＴＡＴΔｃｙｓに用いた方法と類似の方法（上記および図８に記載）でＰＣＲ 欠失クローニングにより、プラスミドｐＪＢｌ１７（配列番号＝５９）、ｐＪ８ １１８（配列番号二６０）、ｐＪＢ１１９（配列番号二６１）、ｐＪＢ１２０（ 配列番号：６２）、およびｐＪＢ１２２（配列番号：６３）を得た。

ｐＴＡＴΔｃｙｓ−ＩＦ２．１２１のセグメントを欠失することにより、プラス ミドｐＪＢ１１７およびｐＪＢ１１８を構築した。ｐＴＡＴΔｃｙｓ−１６１の セグメントを欠失することにより、プラスミドｐＪＢ１１９およびｐＪＢ１２０ を構築した。４つのクローニングすべてにおいて、ＰＣＲプライ７−３７４．１ ２２（配列番号＝２９）を用いて、ｔａｔ−Ｅ２コード領域下流のＢｉｎｄｌｌ ［部位をカバーした。それぞれの場合において、別のプライマーがｔａｔΔｃｙ ｓコード配列の開始部のＮｄｅ　１部位がｔａｔΔｃｙｓのはじめの残基に対す る欠失コドン（すなわち、ｐＪＢｌ１７およびｐＪＢ１１９に対する残基２−２ １および３８−４６　、およびｐＪＢｌ１８およびｐＪＢ１２０に対する残基２ −２１）にまたがった。残基２−２１の欠失には、プライマー３７９．１１（配 列番号：３０）を用いた。残基２−２１および３８−４６の欠失には、プライマ ー３７９．１２（配列番号：３１）を用いた。ＰＣＲ反応に続き、ＰＣＲ産物を Ｎｄｅ　［およびＨｉｎｄｌｌｌで消化した。次いで、得られた制限酵素切断フ ラグメントをベクターｐＴＡＴΔｃｙｓ−ＨＥ２．１２１にクローニングした。

このベクターは、前もってＮｄｅ　ＩプラスＦｌｉｎｄｌｌ［で切断して、４０ ５７塩基対のレセプターフラグメントとして生成していた。このように、以下の アミノ酸残基からなる融合タンパク質をコードする発現プラスミドを構築した： ＪＢ１１７＝Ｔａｔ４７−７２−）ＢＰＶＩ６　Ｅ２２４５−３６５　；ＪＢ１ １８＝Ｔａｔ３８−７２−ＢＰＶＩ６　Ｅ２２４５−３６５　；ＪＢｌ１９＝Ｔ ａｔ４７−６２−ＢＰＶＩ　Ｅ２２５０−４１０　；およびＪＢ１２０＝Ｔａｔ ３８−６２−ＢＰＶＩ　Ｅ２２５０−４１０゜ｔａｔ残基５’１−７２に対する コドンをｐＪＢＬ１８から欠失することにより、ｔａｔ残基３８−５８に統（Ｂ ＰＶＩ６　Ｅ２残基２４５−３６５（すなわち、Ｅ２カルボキシ末端１２１アミ ノ酸）をコードするｐＪＢ１２２を構築した。プライマー３７４．１３（配列番 号：３２）を用いてＰＣＲにより二の欠失を行った。このプライマーは、ｔａｔ コード領域内のＡａｔ１１部位をカバーし、そしてプライマー３７４．１４（配 列番号＝３３）は、Ｔａｔ−Ｅ２遺伝子下流の唯一のＨｉｎｄｌ１１部位の少し 下流の＾ａｔ１１部位をカバーする。ＰＣＲ産物をＡａｔｌｌで消化し、そして 得られた制限酵素切断断片フラグメントを単離した。ｐＪＢ１２２構築最終工程 において、単離したＡａｔロフラグメントをＡａｔｌｌで消化したベクターｐＪ Ｂ１１８に挿入した。

上記の５つのｐＪＢ構築物すべてにおいて、ｔａｔコード配列１、翻訳開始のた めのメチオニンコドンが先行して（すること１二注目すべきである。

Ｔａｔ−Ｅ２　ム　ンパ　の　１ 全ての場合において、Ｅ、　ｃｏｌｉを用いてｔａｔ−Ｅ２遺伝子融合物を発現 させた。ｔａｔ−Ｅ２タンパク質精製のための一般的な手順は、以下の初期工程 を包含する：細胞のペレット化；プロテアーゼインヒビターーー一般的に１　ｔ ｎＷ　ＰＭＳＦ、　４μｇ／幻Ｉ　Ｅ６４．５０　μｇ／ｍｌアプロチニン、５ ０　μｇ／ｎｌペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）Ａ、および３％Ｍベンズア ミジン（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ）を含む８−１Ｏ容量の溶菌緩衝液（２５＋ｎ Ｍ　トリス（ｐｉ（７，５）、２５ｍＭ　ＮａＣ１、ＩｎＭ　ＤＴＴ、０．５ａ ＋Ｍ　ＥＤＴＡ）に細胞を再懸濁；フレンチプレス（１２，０００ｐｓｉの２回 通過）で細胞を溶解：および溶解液を１０．０００−１２．０００Ｘｇで４°Ｃ で１時間遠心分離する（ＦＴＥタンパク質を除く）。

特にｔａｔ−Ｅ２２全タンパク質の精製において、さらに行った工程を以下に記 載する。

Ｅ２．１０３お　びＥ２．２４９−一溶解液の遠心分離の後、ファーストＳセフ ァ０−ス力ラムに上清をロードし、そしてＩＭのＮａＣ１でＥ２．１０３または Ｅ２−２４９タンパク質を溶出した。次いで、１００ａ＋Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７，５）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡおよびｌ　ｍＭ　ＤＴＴで平衡化したＰ６０ゲ ル濾過カラムでのクロマトグラフィーにより、Ｅ２．１０３およびＥ２．２４９ をさらに精製した。

ＦＴＥ１０３−一溶解液を１０．０００ｘ　ｇで４℃で１０分間遠心分離した後 、ペレットを６Ｍ尿素に再懸濁し、そして固体のグアニジン−ＨＣｌを最終濃度 が７Ｍになるように添加することにより、ＦＴε１０３タンパク質（沈殿した） を回収した。懸濁液を遠心分離した後、６ソグアニシン、５０ｆｆ１Ｍ　リン酸 ナトリウム（ｐＨ５，４）、１０＋＋＋Ｉｌｌ　ＤＴＴ中でＡ、　５Ｍゲル濾過 カラムでのクロマトグラフィーにより、上ｔｌｌからＦＴＥ１０３を精製した。

クーマジー染色したＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で、ｌ　９ｋＤａ の見かけの分子量を有するバンドの出現に従って、ゲル濾過カラムからＦＴＥ１ ０３含有画分を集めた。

ＦＴＥ４０３−−　ＦＴＥ４０３の精製手順は、２５ｋＤａの見かけ分子量を有 するＦＴＥ４０３がゲル濾過カラム上を移動した以外は、ＦＴＥ１０３に対する 手順と本質的に同じである。

ＦＴＥ５０１−一溶解液を１０，０ＯＯｘ　ｇで３０分間遠心分離した後、ベレ ットを６Ｍ尿素に再懸濁し、固体のグアニジン−ＨＣｌを最終濃度が６Ｍになる ように添加し、モしてＤＴＴを濃度がｌ　Ｏａ＋Ｍになるように添加した。３７ °Ｃで３０分後、１０，０００ｘ　ｇで３０分間の遠心分離により、溶液を清澄 にした。次いで、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５ｈ＋Ｍ　リン酸ナトリウム（ｐＨ ５，４）、１０１Ｍ　ＤＴＴ中で＾、５Ｍアガロースゲル濾過カラムに試料をロ ードし、そしてクーマジー染色したＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で 、４０ｋＤａの見かけの分子量を有するバンドの出現に従って、ゲル濾過カラム からＦＴＥ５０１含有画分を集めた。ゲル濾過精製したＦＴＥ５０１を、Ｃ＋ｓ 逆相１（ＰＬＣカラムにロードし、そして０．１％のトリフルオロ酢酸中の０− ７５％のア七ト二トリルのグラディエンドで溶出した。４０ｋＤａの見かけの分 子量を有するＦＴＥ５０１タンパク質を、単一ピーク中に集めた。

ｋＱ匹巨」並−一溶解液の遠心分離の後、上清を２５＋ｎＭ　トリス（ｐＨ７， ５）、０．５ｄ　ＥＤＴＡで平衡化したＱ−セファロースカラムにロードした。

Ｑ−セファロースカラムの通過液を、ｌ！ＥＳＣｐＨ６，０）を最終濃度が３０ ａ＋Ｍになるように添加して約ｐＨ６，０に調節した後、Ｑ−セファロースカラ ム通過液を、２５ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ６゜０）で平衡化したＳ−セファロースカ ラムにロードした。２５ａ＋ＭＭＥＳ（ｐＨ６，０）中の連続的なＮａＣ１濃度 ステップの適用により、Ｓ−セファロースカラムからｔａｔΔｃｙｓ−１０５を 回収した。ＴａｔΔｃｙｓ−１０５は、８００−１０００ｆｆ１Ｍ　ＮａＣ１で ｐＨ６，０の緩衝液中に溶出した。

ＴａｔΔｃｓ−１６１，−一溶解液の遠心分離の後、上清を２５ａ＋Ｍ　）リス （ｐＨ７，５）、０．５Ｉｌ１Ｍ　ＥＤＴＡで平衡化したＳ−セファロースカラ ムにロードした。２５＋ｎＭ　Ｉ−リス（ｐＨ７，５）中のＮａＣ１濃度ステッ プグラディエントの適用により、Ｓ−セファロースカラムからｔａｔΔｃｙｓ− １６１を回収した。ＴａｔΔｃｙｓ−１６１は、５００−７００１ｒ１Ｍ　Ｎａ Ｃ１でｐＨ７，５の緩衝液中に溶出した。

Ｔａｔ６匹Ｌ４甘　−一溶解液の遠心分離の後、上清を２５ａ＋Ｍトリス（ｐＨ ７，５）、０．５＋ｎＭ　ＥＤＴＡで平衡化したＱ−セファロースカラムにロー ドした。２５ｆｆ１Ｍトリス（ｐＨ７，５）中のＮａＣ１ステツプグラデイエン トの適用により、Ｓ−セファロースカラムからｔａｔΔｃｙｓ−２４９を回収し た。ＴａｔΔｃｙｓ−２４９は、ＮａＣ１ステツプグラデイエントの６００−８ ００ａ＋Ｍの部分に溶出した。

ＴａｔΔｃｓ−ＨＥ２．８５お　びＴａｔΔｃＳ−Ｉ（Ｅ２．１２１−一溶解液 の遠心分離の後、上清をＱ−セファロースカラムにロードした。通過液をＳ−セ ファロースカラムにロードした。ＮａＣ１ステップグラディエントの適用により 、Ｓ−セファロースカラムからｔａｔΔｃｙｓ−）ＩＦ５．８５またはｔａｔΔ ｃｙｓ−ＩＦ２．１２１を回収した。両タンパク質は、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１で溶出 した。

）ＩＰＶ　Ｅ２オ　び）ＩＰＶ　Ｅ２ＣＣ３Ｓ　−一実施例９参照（上記）。

朋」−一溶解液の遠心分離、および上清の回収後、ＮａＣ１を３００ｍＭ１Ｍま で添加した。２５ＩｎＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐ）１７．５）で平衡化したＳ−セファ ロースカラムに、ＮａＣ１を添加した上溝をロードした。

２５ｆｆｉＩＩＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，５）、１．５＋ｏＭ　ＥＤＴＡ、　ｌ　ｍ Ｍ　ＤＴＴ中の連続的な塩濃度ステップでカラムを処理した。ＪＢ１０６タンパ ク質を、１舗ＮａＣ１でＳ−セファロースカラムから溶出した。

旦上ローー溶解液の遠心分離、および上清の回収後、ＮａＣ１を３００ｉ＋Ｍま で添加した。ＪＢ１１７が３００１１ＩＭ　ＮａＣ１で沈殿するので、ＪＢｌ１ ７上清を１００ｉ＋Ｍ　ＮａＣ１まで希釈し、そしテＳ−セファ　ｏ　−Ｘカラ ムにタンパク質をバッチ式でロードした。ＪＢ１１７を、２５怒菖　トリス（ｐ Ｈ７，５）、０．３ｆｆｉｌｌｌＤＴＴ中のＩ　Ｍ　ＮａＣ１でＳ−セファロー スカラムから溶出した。

挫上■−−溶解液の遠心分離、および上清の回収後、ＮａＣ１を３００１Ｍまで 添加した。２５＋ｎＭ　ｌ−リフ！、ＣｐＨ７，５）で平衡化したＳ−セファロ ースカラムに、ＮａＣ１を添加した上清をロードした。

ＪＢ１１８タンパク質は、２５ｍＭ　ｌ−リス（ｐＨ７，５）、０．３ｄ　ＤＴ Ｔ中の１Ｍ　ＮａＣ１でＳ−セファロースカラムから溶出した。

旭１１９ユ肛観、痰ｕＫ」−μａ町皿−−溶解液の遠心分離、および上溝の回収 後、ＮａＣ１をＪＢ１１９およびＪＢ１２１に対しては１５０ｍＭまで、そして ＪＢ１２０およびＪＢ１２２に対しては２００ＩＩＩＭまで添加した。２５ＩＩ ＩＭトリス（ｐＨ７，５）で平衡化したＳ−セファロースカラムに、ＮａＣ１を 添加した上清をロードした。ＪＢｌ１９、ＪＢＩ２０、ＪＢＬ２１、およびＪＢ １２２は、２５１トリス（ｐＨ７，５）、０．３ｄＤＴＴ中の１　’４　ＮａＣ １でＳ−セファロースカラムから溶出した。

Ｋ１叢土Ｉ Ｅ２　ｊアーセイー・　的　ム ｔ、ｔ−Ｅ２融合タンパク質を、全長の乳頭腫ウィルスＥ２タンノくり質により 、転写活性化の阻害（「抑制」）に対して試験した。

ＣＯ３７細胞中での一時的な共トランスフェクションアッセイで、Ｅ２抑制を測 定した。本アッセイにおいて使用したＣＯ３７細胞は、はんの短い期間だけ培養 で維持した。ＣＯ３７細胞を１３継代で馴化Ｃｔｈａｗ比、そして２５継代まで だけそれらの細胞を使用した。

長い期間増殖させると、Ｅ２の転写活性化の低レベル化を招き、そして抑制およ び再現性が減少した。抑制アッセイおよび抑制活性の計算方法は、実施例９（上 記）に記載しである。複合体ＴｘＥ２．１０３、ＴｘＥ２２．２４９、ＦＴＥ１ ０３、ＦＴＥ２０２、ＦＴＥ４０３、およびＦＴＥ５０１について、ＢＰＶ−１ ６Ｅ２　トランスアクティベーターに、等量のＢＰＶ−Ｌ　Ｅ２）ランスアクテ ィベーターを置換した。従って、ＢＰ’／−１６Ｅ２発現プラスミドｐＡＨＥ２ でトランスフェクションする代わりに、ＢＰＶ−Ｉ　Ｅ２発現プラスミドｐＸＢ ３２３でトランスフェクトした。これは米国特許第５．２１９．９９０号に全て 記載されて（する。

遺伝的融合タンパク質ＪＢ１０６は、首尾一貫して最も強力なｔａｔ−Ｅ２リプ レッサー複合体であった。ＪＢ１０６とＴｘＨＥ２ＣＣ８Ｓとを比較した抑制ア ッセイのデータを表ＩＩ＋に示す。図１３は、表ＩＩ＋にある結果をグラフで表 している。

ＪＢ１０６１こ加えて、幾つかの他のｔａｔ−Ｅ２リプレ・ソサー複合体力（、 顕著な抑制を生じた。表Ｈ’に示したように、ＴｘＨＥ２、ＴｘＨＥ２ＣＣ５Ｓ 、　ＪＢ１１７、ＪＢ１１８、ＪＢ１１９、ＪＢ１２０、およびＪＢ１２２は、 ＋＋の範囲の抑制レベルを示した。

（以下余白） 】二＝ユ 会　Ｂｋｑｄ−１５８ｃｐ！１１、 表ＩＶは、ｔａｔ−Ｅ２リプレッサーアッセイの結果を要約している。同様のア ッセイでｔａｔ−Ｅ２リプレッサー複合体全部を試験したが、同じアッセイで複 合体を全て同時には試験しなかった。従って、抑制活性のレベルを半定員的に、 ＋＋＋、＋＋、＋、＋／−１または−として表した。＋＋＋は強い抑制、−は検 出可能な抑制がないことを示す。図１３は、表ＩＶで用いた抑制活性評価システ ムを図示している。ＪＢ１０６は、＋＋十活性レベルの例である。ＴｘＨＥ２Ｃ Ｃ３Ｓは、＋十活性レベルの例である。

負のコントロールであるＨＥ２．１２３は、−活性レベルの例である。

＋活性レベルは、ＴｘＨＥ２ＣＣＳＳとＨＥ２．１２３との間で観測される活性 の中間である。活性が＋／−と表示される２つの複合体は、幾つかのアッセイで は弱い（が検出可能な）活性を有し、他のアッセイでは検出可能な活性がない。

（以下余白） 遣＝匡 ム乙二Ｌ！　ｎ！塁員　ｍ菟　注五と二土ＴＸ！２．１０コ　コアー７２　８Ｐ Ｖ−１３０８−４ＬＯ＋ＴｘΣ２．２４９　コアー７２　ＢＰＶ−１１６２−４ １０ＴｘＨΣ２　コアー７２　ＨＰＶ−１６２４５−３６５＋＋ＴｘＨΣ２ＣＣ ５Ｓ　３フーフ２　ＨＰＶ−１６２４５−３６５→Ｆ丁］：１０３　１−６フ　 ＢＰＶ−１：１０６−４１０　−Ｆτに２０８　１−６２　ＢＰＶ−１３１１− ４１０−ＦＴＥ４０コ　１−６２　ＢＰＶ（２５０−４１０−ＦＴＥ５０１　１ −６２　ＢＰＶ−１１６２−４１０−、ＴＢＩＬＯ６４７−５８ＲＰＶ−１６２ ４５−３６５←→ＪＥｌｉ）　４７−７２　ＲＰＶ−１６２４５−３６５→Ｊ’ Ｂ１１Ｂ　３Ｂ−７２）ｔＰＶ−１６２４５−３６５＋＋、ｒＢｌ１９　４７− ６２　ＢＰＶ−１２５０−４４０＋＋：ｒＢ１２０　コ８−６２　ＢＰＶ−１２ ５０−４１０＋＋Ｊｍ２２　３ｇ−５８ＨＰＶ−１６２４５−３６５＋＋アミノ 末端領域（すなわち、残基１−２１）およびシスティンに富む領域（すなわち、 残基２２−３７）を有する４つの複合体ＦＴＥＩＯ３、ＦＴＥ４０３、ＦＴＥ２ ０８、およびＦＴＥ５０１は、完全に抑制欠失である。

間接的な免疫蛍光法によりＦＴＥ５旧が細胞に入ることを示したので、Ｅ２リプ レッサー活性は、一連のＦＴＥにおいてはｔａｔ輸送ポリペプチドに結合した結 果として失われたようであると考えられている。データは、ｔａｔ部分のシステ ィンに富む領域が無ければ、一般的にＥ２リプレッサー活性が増加することを示 す。さらに、ｔａｔ−Ｅ２複合体中にシスティンに富む領域が無ければ、標的細 胞への輸送の損失もなく、Ｅ、　ｃｏｌｉ中でのタンパク質産生レベルが増加す るようであり、そしてタンパク質の溶解性が増加した。ｔａｔのアミノ末端領域 の欠失はまた、Ｅ２リプレッサー活性を増加させた。ｔａｔ残基４７−５８のみ 有する融合タンパク質ＪＢ１０６は、最も強力なｔａｔ−Ｅ２リプレッサー複合 体であった。しかし、システィンに富む領域の不在により、複合体にＥ２リプレ ッサー活性が常に保存されているわけではない。

例えば、化学的複合体ＴｘＥ２．２４９は、不溶性であり、そして細胞に対して 毒性である。このように、たとえｔａｔのシスティンの無い部分の結合でさえ、 非機能的なＥ２リプレッサー複合体となり得る。

尖ＪＬＪ引上」− 口　なＥ２　Δ Ｅ２タンパク質へのｔａｔ部分の化学的結合は、ＤＮＡ上のＥ２結合部位へのＥ ２タンパク質の結合が少なくとも２０倍減少した（データは示さず）。従って、 実験を行って、ｔａｔ輸送部分とＥ２１Ｊプレッサ一部分との間の切断可能な架 橋を評価した。種々の切断可能な架橋方法を試験した。

一連の実験において、ＨＰＶ　Ｅ２−ＣＣ５Ｓタンパク質のシスティンスルフヒ ドリル基を、１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐ）Ｉ　７．５）、５００ＩＩＩＭ　Ｎ ａＣ１中のアルトリチオール（ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ）で活性化した。ゲル濾過 クロマトグラフィーにより活性化Ｅ２リプレッサーを単離し、そしてそれをｔａ ｔ３７−７２で処理した。アルトリチオールで処理すると、急速にＥ２−ＣＣ３ Ｓ二量体が形成するので、低い架橋効率であった。この問題をさけるために、Ｅ ２−ＣＣ３Ｓを室温で８Ｍの尿素に入れて、そして変性条件下で２３℃で６０分 間、アルトリチオールで処理した。次いで、Ｅ２ＣＣ３Ｓ−アルトリチオール付 加物を再生し、それをゲル濾過クロマトグラフィーにより単離し、次いで、ｔａ ｔ３７−７２と反応させた。この手順で優れて架橋を得た。尿素方法の改変法を 用いて、Ｅ２Ｃ３ＳＳおよびＥ２ＣＣ３Ｃもまたｔａｔ３７−７２に架橋した。

ここでは、ゲル濾過の代わりにＳ−セファロースクロマトグラフィーを用いて、 Ｅ２−アルトリチオール付加物を単離した。この改変により、付加物の回収率が 増加し、そして反応に用いたＥ２出発物質の約９０％が架橋した。

切断可能なｔａｔ−Ｅ２複合体は、抑制アッセイにおいて活性を示した。しかし 、切断可能な複合体の抑制活性は、不可逆的に架橋した類似の複合体の抑制活性 よりわずかに低かった。

切断可能な複合体のわずかに低い活性は、細胞中でのタンパり質の半減期の反映 であり得る。Ｔａｔは細胞中で比較的安定である。Ｅ２タンパク質は、一般的に 細胞中では半減期は短い。

従って、ｔａｔ部分と８２部分との間の不可逆的架橋は、８２部分を安定化し得 る。

犬立拠上１ 純　ウィルス１プレーサ−ム 単純庖疹ウィルス（ｒＨ８ＶＪ）は、急速な初期Ｈ３Ｖ遺伝子の発現を誘導する 転写アクティベーターのＶＰ１６をコードする。Ｆｒ１ｅｄｃａｎらは、ＶＰＩ ６のカルボキシ末端転写活性化ドメインを欠失することにより、ＨＳＶ　ＶＰ１ ６リプレツサーを生成した（「先太のウィルストランスアクティベーターの発現 は、その同系のウィルスによる溶菌感染を選択的に妨害する」、Ｎａｔｕｒｅ、 　３３５゜４５２−５４頁（１９８８））。類似の方法テＨ８Ｖ−２ＶＰ１６１ Ｊプレツサーを生成した。

輸送ポリペプチド−ＶＰ１６リプレツサー複合体の、細胞取り込みおよびＶＰ１ ６リプレツサー活性を試験するために、ＶＰ１６依存性リポータ−プラスミドお よびＶＰ１６リプレツサープラスミドを、ＣＯ３７細胞に同時にトランスフェク トした。次いで、トランスフェクトした細胞を、輸送ポリペプチド−ＶＰ１６リ ブレツサー複合体または適切なコントロールにさらした。以下に一記載の抑制ア ッセイは、実施例９において上記のＥ２抑制アッセイと類似であった。

ＶＰ１６　−セイプースミ゛ ＶＰ１６抑制アッセイのためのリポータ−構築物は、プラスミドｐ１７５ｋｃＡ Ｔであり、これはＧ、　Ｗａｙｗａｒｄから入手した（Ｐ、０°Ｈａｒｅおよび Ｇ、　Ｓ、　）ｌａｙｗａｒｄの「単純庖疹ウィルス遅滞型初期および急速型初 期調部領域を包含する組換え遺伝子の発現および庖疹ウィルス感染によるトラン ス活性化」、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　５２゜５２２−３１頁（１９８４）参照） 。プラスミド１）１７５ｋｃＡＴは、ＣＡＴリポータ−遺伝子を作動させるＨＳ Ｖ−１１Ｅ１７５プロモーターを含む。

ＶＰ１６抑制アッセイのためのＨＳＶ−２１−ランスアクティベーター構築物は 、プラスミドｐＸＢ３２４であり、これはニワトリβ−アクチンプロモーターの コントロール下で、野生型Ｈ３Ｖ−２ＶＰ１６遺伝子を含有していた。ｐＸＢｌ ｏｏ（Ｐ、　Ｈａｎら、ｒＨＩＶ−Ｉ　Ｔａｔによる異種プロモーターのトラン ス活性化」、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１９゜７２２５−２９頁（１ ９９１））のＸｈｏ１部位とＢａｍ旧部位との間に、ニワトリβ−アクチンプロ モーターを含む２８０塩基対フラグメント、および野生型１（ＳＶ−２ＶＰ１６ タンパク質全体をコードするプラスミドｐＣ＾５（０’ＨａｒｅおよびＨａｙｗ ａｒｄ、前出）由来の２３１８塩基対のＢａ１ｔ１旧−ＥｃｏＲ［フラグメント を挿入してｐＸＢ３２４を構築した。

Ｔａｔ−ＶＰ１６　’　レー　−Δ　ンパ細菌中で、ｔｌｌＶ　ｔａｔタンパク 質のアミノ酸４７−５８とそれに続＜　ＨＳＶ　ＶＰ１６タンパク質のアミノ酸 ４３−４１２からなる融合タンパク質ｔａｔ−ＶＰ１６Ｒ，にＦ（配列番号：５ ８）を産生じた。ｔａｔ−ＶＰ１６リプレツサー融合タ融合タンパ線質で産生ず るために、３つの断片を連結してプラスミドｐＥＴ／１ａｔ−ｖＰ１６Ｒ，ＧＦ を構築した。第１番目のフラグメントは、ＮｃｏｌおよびＢｇｌｌ＋で消化した ベクターｐＥＴ−３ｄ（別の名称ｒｐＥＴ−８ｃＪ上記）であった（約４６００ 塩基対）。第２番目のフラグメントは、アニールして二本鎖ＤＮＡ分子の形態に なった合成オリゴヌクレオチド３７４．２１９（配列番号：３９）および３７４ ．２２０（配列番号＝４０）からなる。合成フラグメントの５゜末端は、＾ＴＧ 翻訳開始コドンを含むＮｃｏ＋突出部を有した。開始コドンに続いて、ｔａｔ残 基４７−５８に対するコドンが存在した。

ｔａｔコドンのすぐ次は、フレーム（読み取り枠）が合ったＶＰ１６残基４３− ４７に対するコドンであった。合成フラグメントの３°末端は、ＨＳＶ−２ＶＰ １６ノ：］トン４Ｂ−４１２’ｉ−含む、ｐＸＢ３２４Ｒ４由来（７）ｌ１３４ 塩基対のＰｖｕ　Ｉ　Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｉ　＋フラグメントである第３番目のフラ グメントと連結するための平滑末端であった。ｐＸＢ３２４からｐＸＢ３２４Ｒ ４を誘導した（上記）。プラスミドｐＸＢ３２４Ｒ２は、ｐＸＢ３２４Ｒ４の構 築における場合の中間体であった。

ｐＸＢｌｏｏｌ：、ＨＳＶ−２ＶＰ１６（７）　Ｎ　末端（７）４１９７　ミ／ 酸をコードするｐＸＢ３２４由来の１３４２塩基対のＢａの旧−＾ａｔｌｌフラ グメントを挿入してｐＸＢ３２４Ｒ２を構築した。フレームのあった停止コドン を提供するために、ｐｓＶ２−ＣＡＴ由来の７３塩基対Ａａｔｌｌ−ＥｃｏＲＩ フラグメントを用いた（Ｃ，Ｍ、　Ｇｏｒｍａｎら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　＆　 Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ。

Ｍ、２．　１０４４−５１頁（１９８２））。従ッテ、ｐＸＢ３２４Ｒ２ハ、Ｆ ＩＳＶ−２ＶＰ１６の最初の４１９アミノ酸および停止コドンに先行するＶＰ１ ６でないさらに７つのアミノ酸をコードした。ｐＸＢ３２４Ｒ４を構築するため に、ｐＸＢ３２４Ｒ２由来の５１４５塩基対のＭｌｕｌ−ＥｃｏＲＩ７ラグメン ト、および２つの挿入フラグメントを含有する３つの断片の連結を行った。１つ の挿入物は、ＶＰ１６の最初の１９８残基をコードするｐＸＢ３２４Ｒ２由来の １１５塩基対のＭｌｕｌ−Ｎｓｐ１７ラグメントであった。第２番目の挿入フラ グメントは、合成オリゴヌクレオチド３７４．３２（配列番号：４１）および３ ７４．３３（配列番号：４２）からなる二本鎖合成りＮＡ分子であった。アニー ルしたとき、これらのオリゴヌクレオチドは、５　’、Ｎ５ｐｌ付着末端および ３’ＥｃｏＲＩ付着末端を形成した。この合成フラグメントは、終止コドンが続 （ＶＰ１６残基３９９−４１２をコードしていた。このように、プラスミＦ　ｐ ＸＢ３２４Ｒ４ハ、ＶＰ１６７　ミ／酸４１３−４１９ｉ：対すルコドン、およ び停止コドンに先行する７つの外部からのアミノ酸を欠くことにより、ｐＸＢ３ ２４Ｒ２と異なった。

ｔａｔ−ＶＰ１６Ｒ，ＧＦ　ム　ンパ　の　１ｔａｔ−ＶＰ１６Ｒ，ＣＦに対す る遺伝子構築物を、Ｅ、　ｃｏｌｉ中で発現させた。遠心分離により形質転換さ せたＥ、　ｃｏｌｉを集め；細胞を８−ＩＯ容量の溶菌緩衝液（２５ｎＭ　）リ ス（ｐｔｌ　７．５）、２５＋ｎＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＤＴＴ、　０．５１ｎ ＭＥＤＴ＾、１　ｎＭ　ＰＭＳＦ、　４　μｇ／ｍｌ　Ｅ６４．５０　ｕ　ｇ／ ｉｌアプロチニン、５０μｇ／ｎｌペプスタチンＡ、および３＋ｎＭベンズアミ ジン）に再懸濁し；フレンチプレス中で細胞を溶菌しく１２．０００ｐｓｉで２ 回通過）；そして、溶解液を１０．０００〜１２．０００　ｘｇで４℃で１時間 、遠心分離した。溶解液を遠心分離した後、２５ｆｆＩＭトリス（ｐロア、５） 、０．５ｍＭ　ＥＤＴ＾で平衡化したファーストローセファロースカラムに上清 をロードした。Ｑ−セファロース通過液ヲ、２５０１１１１１１１ＥＳ（＋）Ｉ （６，０）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２ａ＋１１　ＤＴＴテ平衡化したファー ストＳ−セファロースカラムにロードした。ｔａｔ４Ｐ１６融合タンパク質を、 Ｓ−セファロースカラムから、２５１１１１　ＭＥＳ（ｐＨ６，０）、０．１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ、　２ＩＭ　ＤＴＴ中のＮａＣ１の連続的な濃度ステップを用いて 回収した。ｔａｔ−ＶＰ１６融合タンパク質は、６００−１０００Ｊ　ＮａＣ１ 画分中に溶出した。

ｖＰ６　・・セ ＨｅＬａ細胞を、ｌウェル当たり１０６細胞で、２４ウエル培養プレートに接種 した。翌日、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｂ、　Ｒ，Ｃｕ１ｌｅｎ、「クローン 化した遺伝子の機能的分析における真核生物発現技術の使用」、Ｍｅｔｈ　Ｅｎ ｚ　ｎ＋ｏ１．、　１５２巻、６８４頁（１９８７）に記載）を用いて、細胞を トランスフェクトした。ＤＮＡをトランスフェクションのために沈殿させ、そし てそれをｌｏＯｍＭ　ＮａＣ１、ｌｏｎＭ　）リス（ｐｆｌ　７．５）中に約１ ００μｇ／ｌｌ１ｌの濃度で再溶解した。各トランスフェクション用のＤＮＡ− ＤＥＡＥ混合液は以下からなる：最終体積１００μｍに対して、２００ｎｇ　ｐ １７５ｋｃＡＴ（＋　／　−１ｎｇ　ｐＸＢ３２４）または２００ｎｇ　ｐｓｉ −ＣＡＴ（］ントロール）、１　ｍｇ／＋ｏｌ　ＤＥＡＥ−デキストラン、およ びＰＢＳ０細胞をこの混合液に３７℃で１５−２０分間、培養プレートをときど き揺らしながらさらした。次いで、１ａ＋１の新鮮ＤＣ培地（ＤＭＥＭ＋　１０ ％血清）を８０ｄＭクロロキンとともに各ウェルに添加した。細胞を３７°Ｃで ２．５時間インキュベートした後、各ウェルから培地を吸引し、そしてそれをｌ Ｏ％ＤＭＳＯを含有する新鮮ＤＣで置き替えた。室温で２．５分後、ＤＭＳＯ含 有培地を吸引し、そしてそれをＯｌ【０、または５０　ｕ　ｇ／ｆｌｌの精製ｔ ａｔ−ＶＰ１６．　ＣＦを含有する新鮮ＤＣで置き替えた。翌日、各ウェル中の 培地を同じ組成の新鮮培地で置き替えた。２４時間後、ＨｅＬａ細胞をｌ１０ｆ ｆ１トリス（ｐＨ８，０）、１ａ＋ＭＥＤＴ＾、１５０ｍＭ　ＮａＣ１中の０． ６５％ＮＰ−４０（界面活性剤）で溶解した。アッセイにおいて試料の標準化の ために、各抽出物中のタンパク質濃度を測定した。

ｔａｔ−ＶＰ１６．　ＣＦの濃度が５０　ｕ　ｇ＃１１の場合、細胞毒性がアッ セイを妨害した。１０ｄｇ／ｎｌの濃度では、ｔａｔ−ＶＰＬ６．　ＧＦ融合タ ンパク質は、ｖｐｔａ−依存性のＣＡＴ発現をほとんど完全に抑制した。ここで は、観察し得る細胞の死滅はなく、そしてコントロール中ではＶＰ１６−依存性 でないＣＡＴ発現が約３０％抑制された。このように、より少ない量の非特異的 抑制に加えて、ｖｐｔｓ依存性のトランス活性化の特異的な抑制を観測した。

火１■引上ｊ− °ポ１ペプ　ドーＤＮ＾　ム ＤＮＡ結合性転写因子による転写活性化は、その転写因子に対する結合部位を有 するＤＮＡを細胞中に導入することにより阻害し得る。転写因子は導入されたＤ ＮＡに結合するようになり、そして正常に機能するプロモータ一部位で結合しな い。この戦略は、ＮＦ−１ｃＢによる転写活性化を阻害するのに用いた（Ｂｉｅ ｌｉｎｓｋａら、「二本鎖ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いる遺伝 子発現調節」、５ｃｉｅｎｃｅ、　２５０巻、９９７−１０００頁（１９９０乃 。

Ｂｉｅｌｉｎｓｋａらは、二本鎖ＤＮＡを細胞培養培地に入れた場合、投与量に 依存する阻害を観測した。輸送ポリペプチドｔａｔ３７−７２を、二本鎖ＤＮＡ 分子に結合し、このような複合体が、ＤＮＡの細胞取り込みを増加することによ り阻害を増強し得るが否がを測定した。

ＮＦＬ、　ＮＦ２、ＮＦ３およびＮＦ４と命名した、それぞれヌクレオチド配列 （配列番号・４３）、（配列番号：４４）、（配列番号、４５）および（配列番 号：４６）を有する、４つの注文合成された３９７−のホスホロチオエートオリ ゴヌクレオチドを購入した。ＮＦＩおよびＮＦ２は、野生型ＮＦ−にＢ結合部位 に相当する二重らせんを形成した。ＮＦ３およびＮＦ４は、変異型ＮＦ−にＢ結 合部位に相当する二重らせんを形成した。

ＮＦＩおよびＮＦ３を、約４１１１ｇ／Ｉｎｌの濃度で水に溶解した。次いで８ ００μｇのＮＦＩおよびＮＦ３を別々に、４００μｌの５０ｆｆ１Ｍトリエタノ ールアミン（ｐＨ８，２）、５０ＩＩ＋Ｍ　ＮａＣ１，１０ｄ　Ｔｒａｕｔ試薬 に入れた。室温で５０分間反応を進行させた。５０ａ＋Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６ ，０）、５００１Ｍ　Ｎａｃｌで平衡化したＰＧＤＧカラム（ＢｉｏＲａｄ、　 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）上のゲル濾過により反応を停止して、過剰のＴｒａ ｕｔ試薬を除去した。２６０ｎｒｒＩの吸収をモニターして、オリゴヌクレオチ ドを含有する画分を同定した。オリゴヌクレオチドの回収率は、約７５％であっ た。次いで、Ｔｒａｕｔ修＃ＮＦ１とＮＦ２とをアニールしく最終濃度０．５５ ｍｇ／ｆｆ１ｌ　）、そしてＴｒａｕｔ修飾ＮＦ３とＮＦ４とをアニールした（ 最終濃度０．５０ｍｇ／ｍｌ）。最終的に、室温で６０分間、ｌｌｌ１１の１１ ００ＯＨＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，５）中で、０．４ａ＋ｇの各Ｔｒａｕｔ修飾ＤＮ Ａを０．６＋ｎｇのｔａｔ３７−７２−ＢＭＷ（上記の実施例９に記載のように 調製した）と反応させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動、その後のゲルのエ チジウムプロミド染色により、架橋反応の進行をモニターした。一般に、これら の条件下で、約５０％のＤＮＡが修飾されたことを観察した。

これらの二本鎖ＤＮＡ分子を、本質的にＢｉｅｌｉｎｓｋａら（前出）の方法に 従って、ｔａｔ結合がある場合および無い場合についてＮＦ−にＢ転写活性化の 阻害を試験した。Ｔａｔ結合は、ＮＦ−にＢにより著しく転写活性化を増強した 。

本明細書中に記載した方法により調製される組換えＤＮＡ配列は、アメリカンタ イプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄにおいて寄託されたカルチャーにより例示される。

ｐＪＢ１０６とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ１ｉカルチャーは、１９９３年７ 月２８日に寄託され、モしてＡＴＣＣ受諾番号６９３６８が与えられた。

本発明の多くの実施態様を記載したが、発明者らの基本的な構築物は改変され得 、本発明の方法および産生物を利用する他の実施態様を提供し得ることは明らか である。従って、本発明の範囲は実施例により提供された特定の実施態様により 規定されるのではなく添付の請求項により規定されるべきであることが理解され 得る。

（以下余白） （ｉｉ）発明の名称：　ＴＡＴ由来輸送ポリペプチド（ｉｉｉ）配列数：６３ （２）配列番号、ｌの情報・ （ｌり配列のＮ類：タンパク質 （ｖｉ）起Ｂ、： （ｘｌ）配列：配列番号＝１＝ （２）配列番号＝２の情報： （１１）配列の種類：ペプチド （ｘｌ）配列：配列番号：２： コ５ （２）配列番号：３の情報： （１１）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号：３゜ −・（２）配列番号＝４の情報＝ （１１）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列、配列番号：４・ （２）配列番号：５の情報： （１１）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列・配列番号＝５＝ （２）配列番号・６の情報。

（１１）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号＝６＝ （２）配列番号ニアの情報： （１１）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号ゴ： （２）配列番号二８の情報： （１１）配列の種類、ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号：８： Ｑ＆Ｔｌ工Ｃ猷講Ｃαス０シ心Ｃπ六ゴＣにテα７ＡＧαｍＡＡ０　３９（２） 配列番号：９の情報・ （ｉｉ）配列の種＠　：　ＤＭＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列・配列番号・９： 鮎ｉで＝Ｎ−弱＝国Ａａ−ＡＧＭＡｅＯＴＧＣｆｆ口工　３９−　（２）配列番 号：ｌＯの情報： （１１）配列の種ｆＲ：　ＤＭＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号、ｌＯ： ＣλＴＧＧＧＧＧｋＴ　ＣｋＴＧτ＾ＡＣＴＣＧＣＣτテＧＡ丁ＣＧ　ＴＴＧＧ ＧＡＡＣＣＧ　ＧＡｑＣＴＧＡＡ’Ｎ　入ＡＧＣＣＡＴＡＣb７２０ ＾ＡＡｅＭ　（Ｃ’ｍＡＣＡＣＣＡ　ＱＪＬＴＩＩ；Ｃ１：丁ＱＣＡｃｅ＾ＡＴ ＣＧＣλ　＾Ｃ入ｊ！τｉＧＣＧＩＪＭ（：’ＦＡＴ？　７W０ ＣＴＩ：ＣＣτＧテ丁ＣＡＴＣＣＧＣにτＣＣＡＣＣＴＣＧ丁丁Ｇ＾　丁子Ｔ〒 ＣτＣＣＡＧ　入ＡσＣＣττへＡＴＯテｃＴｃｃｃｒτＣQ４００ πＡＴＡＩす、ＧＣＧ（、ＧｅＣＡＴ’ＣＴＴｈ　ＡＧＧＧＣＧＧＴＴｒ　丁Ｔ ＴＣＩ：’ｒｌ：ＴＴ’Ｔ　ＱＣτ（ＪＣＴＴＧＡ　ＴＧＣb丁ＣＩ：ＧテＧ　 ２４６０ ＡτＡＴＡＣＡＴＡＴ　ｃｃＡＡｃｅｃａτＣＧｋＣＣＣＧＣＱＴＣＴＧＧＡＡ ＣＣＡＴＧ　ＧＡＡＡ（：＾ｃｃｅｃ　ｃｃｃτａｃｅ＾Ｇb４Ｘ４０ （２）配列番号＝１１の情報： （１１）配列の種類＝ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号、１１ τＣＡＡＴＡＡτ＾Ｔ　ＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡ＾ＧＡＧτ＾ＴＩＪＧτＡＴｒＣ ＡＡＣＡＴ　ＴＴＣＣＣＴＯＴＩＪ　ＣＣＣＴｒＡＴＴＣＣQ４０ ｃフ１ｌ−ｒｒｒＣｃｃ　ａｅａｒｒｒｒｃｃｃ　テ！ｉ　テａｙコＵＣＣＣ＾ 　Ｃ＾＾ＡＣＫ＋ｃＴＧＧ　↑Ｇ＾＾＾Ｇ丁＾＾＾　コｏＯＣＴ’ｌ”！ＴＣＣ Ｔ’ｌＪ　Ｃｅ！’Ｔ’ｉｒ丁ＧＣ丁Ｃ＾ＣＡ丁ＣｆｆＣτテ　τＣＣτＧＣＧ ＴＴｋ　ＴＣＣＣＣＴＧ＾ｒｒ　ｅｒａfｒｃａ＾ＴＡＡ　１９２０ ＷＡｆｆＡＣｅ　０２　ＧＡＩＩ；ＣｒＧＡ丁ＡＣＣＥ（ＹＣＯＣｅＣ＋：　Ａ （ｉｔ：ＣＧＡＡＣｅＡ　ＣＣＧｋＧＣＤＣｋＧ　１９８０ＧＴＣＧＣＩＩ：Ｃ ＴＣＣ入ＣＣＣ入＾＾ＧＣＧ　ＧτＣＣＴＣＣＣＣＧ　入＾＾ＡＴ（：ＡＣＣＣ ＡＧＡＧＣＣＣτＱＣＣｔ：Ｇ（：Ａｃ煤FＴＧτ　３６００ （：ＣＴＡ８Ｔ？　Ｇ（２ＴｌｆｆＡＴＭＡ　ＧＭＧｈＣ＾ＧτＣＡ丁Ａ＾Ｃ丁 ａＣＧＣｃａｘｅｃ＾τ入Ｇ〒　ｃａ丁Ｇｃｃｅｃｃｃ　３U６０ （２）配列番号　１２の情報・ （ｉｉ）配列の種類＝ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号、１２゜ τＡ冗隷絋鉱Ｃ！＝τゴａ℃冗π項カ＝２９（２）配列番号：１３の情報： （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号：１３゜ Ｃ１：ＡＣＪＵ＾ＧＡＡ　＾ＣＧＡＣｃＧＧｆｆｌ　ＣＣＡ　２コ（２）配列番 号：１４の情報： （ｉｉ）配列の種類　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列・配列番号　１４： πｃｃｃｃｃｐａｃ　ＴＴｘｃＴＴｃｒｃＡｃＡＡｃｃｘｒｃｃａ　ｈａｃＡｃ ｃｃｙｃ　ｃｘＧｃｒｙｃｃｃ　σπ買πｃｐ、　６６０Ｃ＾＾ＣＡＴＧＧＧＧ 　Ｇ＾τＣ入τＧτＡＡ　ｅｒｃＯｃｃττＣ＾　テロ；ＴＴＧＧＧ＾＾　ｃｅ ｃａ＾ＧＣＴＧｋ　＾ＴＯ入ＡＧＱＩi丁　フ２０ ＣＧＡＡＡＣＣＯＣＣＧ＾ＧＧＣＡＧＣＴＧ　ＣＧＧＴｋＡＡＧＣＴ　ＣＡＴＣ ＡＣ；ＣＣ；ＴＧ　ＧＴｃｃτＧ入入ＧＣ五人ＡＴＴＣＡＣ`ＣＡ　２コ４゜ （２）配列番号＝１５の情報 （ｉｉ）配列の種類・ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列、配列番号　Ｉ５゜ （２）配列番号　１６の情報 （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号・ｌ６ ｃＧＧＧＧＡＴｃｃ？　ＣＡＴＡＴＡＧＡＣＡ　ＴＭＡＴＣＣ２フ（２）配列番 号：１７の情報・ （１１）配列の種類　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列　配列番号　１７： 入＾Ａτ入ＧＡＣ＾Ｇ　λｘｃ’ｒｃ＾ＧＡ　丁ｋＧＧ丁ａｃｅτＣＡＣ丁Ｇｋ ττ入ＡＧＣ入ＴＴｇＴ入＾Ｃ〒ａｒｃ＾Ｇ入ＣＣＡ入入　P０８０ ｒＡＡＴＡｃＡ　ＧＡＭ？ＡＧＧＴＣＴ’ＴＣＣＡＣＡ（：Ｇ（：　ＴＡＧＣＣ ＡＧＣＡＧ　ｃｘｒｃＣＴＧＣＯ＾　τａＣ＾Ｇ＾〒ｅｏｌF　２７００ Ｇ入入ＣＡＴＡ＾’ｒＧ　σ１ＧＣＡＣＧＣＣＧ　ＣＴＧＡＣＴτＣＣＧ　ＣＣ ττＴＣＣ＾Ｇ入　ｅｒｒｒ＾ＣＧ八＾＾　Ｃ＾へｃｅ＾＾OＣＣ２７６０ ｃＣＡＴＴｔＡｘｅ＾　ＧＧ＾（Ｊ丁五人τＧ　τ＾＾＾ＡＣ＾丁入Ａ　入ＫＧ τＧＣ入へ丁τ　Ｇττ八ＣへＣτＴＡＣ＾丁＾ＴＧＡτ＾f　４３８０ 丁ＨＡＡＴＣＡＣＡＡ　ｅＯＴｔ：入Ｃ（ＪＡＹ　τｊゴ℃丁ＣτＣＡ　ＪＷＴ ｒんり五丁＾Ｃαリリ講＾ＣτＡτｒＡｃＮｎ℃τＣ４４４O （２）配列番号＝１８の情報 （１１）配列の種類＝ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号、１８： Ｃ！２ＡＣＡＣＴＯＣＡ　１ｉＡＴＡｃＡＡＴＧ　ＴＡＧＡＡＴＣＣＴＴ　ＴＴ ＴＭＡＴＣ’Ｌ’Ａ　ＴＡＷＡＡＡＧ　ＡＴＣＴτ＾ＭＧ　T９ （２）配列番号＋１９の情報。

（ｉｉ）配列の種類　（＋ｊｌＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列；配列番号・１９・ Ｇαテαｔα工　ＣＣ入πＣＣＧＧＣＧＡτ＾＾τ　２６（２）配列番号、２０ の情報。

（ｉ）配列の特色。

（ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号＝２０： 丁Ｃ五人ＧＡ（：ＣＴＡ　ＣＣＭＣＴＣτττ　τ丁ＣＣＧｋｋＧＧＴ　ＡＡＣ ＴＧＧＣＴ’ＴＣＡＧｃＡＧｋＧＣＡＣＡにＡＴＡＣＣＡＭ@１３１１０ Ｔ入ＣテＣ？ｅｃｉＴ　ｅ？ＡＧｉＧＴＡＧＣＣ１；ＴｋＧＴτＡＧＧ　ＣＣＡ ＣＣＡＣττＣ＾＾Ｃ＾＾Ｃ？ＣＴＧ　ＴＡＣＣＡＣｅｌ：bＣ１４４０ ＧＧτ丁ＴＧＣＧＣＡ　ＴＭＪＣＸＣＴＴＣτＣＣＧＣＡｋＧ八Ａ　ＴＴＣへＴ τｃｃｃτ　Ｃ（ＪＡＴτＣＴＴＧ　ＧＡＧτＣＸ；ＴＧｋ`　コ０６０ τ℃ＸズｍＡｌ：Ｃｏ　＾ＧＧ丁ＧＣ：ＣＸｄＸ：　ＧＧＣＴ丁ＣＣＡＴテ　Ｃ ＾ＧＧＴｃＧ入ｃａ　入入ｃｃｅｃｃｃｒ　ｃｃｘπＣ八ｌFｃへ　３１ス。

（２）配列番号：２１の情ｆｌ： （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号、２１： 丁τ丁ＡＣＧＯＣＣＯＴＡＡＧＡＯＡＴＡＣＣＴＡＧＧＣ；ＣＴ！’Ｔ　ＧＧＴ Ｉ：ＡＴＧＡ＾ｃ　ａｃｃａ丁　４Ｓ（２）配列番号：２２の情報： （１１）配列の種類・ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号・２２ πα＋ＣＣＡＡＣＴＴＡＣＴｒＣ？ＣＡ　ＣＡＡＣＸ；ＡＴＣＧＧ　Ｊ’ＧＣ； ＡＣＣＧｋＭ；　ＧＭ：ＣＴＭＣ（に　ＣＴＴＴ’ＴＴ’ＴbＣＡ　６６０ ＣＡＡＣＡＴＧＧＧＧ　Ｇ＾τＣ＾πτ＾＾　Ｃτｃｃｃｃ’ｒ丁ＧＡ　丁ＣＯ τ丁ＧＧＯ入Ａ　ＣＣＥＧＡＣＣτＧ＾　＾π入五人ｃｅ八■@）２０ α議ＡＡＣＧＣＧＣ０１００口（ＯＣＴＧ　ＣＧＧτＶ講ＣＣＴ　ＣＡＴＣｋＧ ＣＧＴＧ　ＧＴＣＧＴＧｋＡＧＣＧＡＴＴＣＡＣＡＧＡ　２R４０ ＴσＷｅ　丁子Ｃ入丁ｃｃｃｃａ　丁ｅＣ＾ＣＣτＣＣτ　丁ＧＡＣ丁ＴτＣ丁 ＣＣ入Ｇ＾へａｃｅ丁テ　λ＾τＣτＣＴＧＧＣ２４０口ｃｃｃｃｃｃ＾ＣＧ＾ 　πｃｃ丁ＣＣＧＧＣＧ丁λＧへ〇〇λ７ｃｃ八Ｇ入τＣτＣＣＡ　τｃｃＣｃ ｃａ入ＡＡ　ττ入＾丁八へ〇ＡＣ４O２０ ＴＣＡＣＴ＆ＴＡＧＧ　ＧｋＧｋＣＣＡｃＡＡ　！τＴＣＣＣＴ　ＣＴＭＡＡ＾ ＴＡ八　丁子τ丁０ｆｆｉ丁＾ＡＣｒτ丁入＾ＨＡ＾ｌｉｔ@４０８０ （２）配列番号・２３の情報： （１）配列の特色： （１１）配列の種類、ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号＝３０： ｍｍ＾＾　ＧＧ＾Ｇ＾τＡＴ入ＣｋＴｋテロ！ｆｆｌ入〒　ｅＡｅｃλ＾ＡＯＣ ＣＣ？＾ＧＧｉＡＴｃτ　ｃ丁（２）配列番号：３１の情報： （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号、３１： ＡＣ’！ＴＴＡＡＧＡＡ　にＧＡＯＡＴＡＴＡＣＡ？ＡＴＩ：？ＡＣＣＣＣＣＧ ＴｋｆｉＡＭＡ　ＣＧＴ（ＷＣＡＩ：ＣＧ（２）配列番号・３２の情報： （１１）配列の種類　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列・配列番号：３２： ＡＡｃｃＴＣＩ：ＴＣＡ　ＧｅＧＡｅＧ？Ｃ１：τＣＣＡＣＣＡＧｋＣｋ　Ｃ（ ＸｅＬａ）講Ｃ（：ＣＣＴＩ：ＣＣＡＣＡ（：ＣＡＣ（２）配列番号：３３の情 Ｎ： （ｉｉ）配列の種類、ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列　配列番号、３３： 工Ｎよとπｃｃｘｃｅ’ｒ−απαＮ−緑絋Ｃ（２）配列番号：３４の鉱報 （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列、配列番号・３４： （：？ＣＱＩＪ？ｌＪＣＴＡＩ：ＣＭＣＡＣ〒　ＡＣＡＣＣＣ（２）配列番号： ３５の情報 （１１）配列の種類二ＤＮ＾（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号　３５： Ｇλ＾ＧＡ？＋＝７℃ （２）配列番号、３６の情報： （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号・３６゜ ローｍｍＣＡπＧＴＩ：ＡＣ？　ＣＴＣＣＣＭ（２）配列番号、３７の情報： （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号、３７ ｍｃＡＡＴＷ　ＡＴ’Ｃα講ＴｅＡＧ　Ｎｃπム（２）配列番号　３８の情報： （１１）配列の種類　タンパク質 （ｘｉ）配列：配列番号、３８： Ｂａｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ工ｉｓ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｐｈｓ＾ａｎ　ｓａ ｒ　Ｓｉｒ　ＨＬｍ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＸＬｔａＡｓｒ＋　Ｃ’ｙｍ　 Ａｓｎ　Ｓｅｙ：　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｅ　Ｐｒｏ　エｌ＠　Ｖａｌ　ＨＬｍ 　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｌｌ　Ｃ１ｙ　Ａｍｐ@＾１ｍ ５ｏ　５５　６０ ； Ａｍｐ　Ｇｉｎ　Ｐｈ＠Ｌ＊ｕ　Ｓｅｙ　Ｇｉｎ　ＶａＬ　Ｌｙｅ　ＸＬ・Ｐｒ ｏ　Ｌｙｓ↑ｈｒ　！ｌ＠　Ｔｈｅ　Ｖａｌ　ｍａｒ１１５　１２０　Ｌ２Ｓ （２）配列番号・３９の情報： （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列、配列番号：３９・ ０ＬＴＯ′ＴＡｃＩＡＣＣＧＴＡＡＡＡＪＩＪＣ（Ｙ（ＣＴＣＡＧＣＧ　ＡＣＣ ＴｅＧτＣＣＣＣＴＯＡＣ？ＣＡＧＧ　ＣｃＣ＾Ｇ　５５（２）配列番号：４０ の情報： （ｉｆ）配列の種類＝ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号：４０： ＣｒＧＧＧＣＣＴＧＡ　ＣＴＣＡＧＣＩ４ＡＣＧＡＯｆｆＣＣＯＴ（ｉ　Ａ（！ ｌ；ＡＱ：’！’！ＴＴ　ｆｆＡｃＧＣｃｃσテＡ　５１（２）配列番号　４１ の情報・ （１１）配列の種類・ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号＝４１＝ ＴＣロチ−↑π＝−πＧＧτＣＡ　ｃｃｃｃｃ−α℃工ＣＣ℃τＣコαゴ紡Ｇ　 ４６（２）配列番号　４２の情報： （１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）配列、配列番号・４２゜ ＡＡＴ？ｃ′ｒＴＡＧＯＴＧＧＡＣＡＧＧＣＧ　ＧＣＸｉＣＧＧＯＣＩ：、ＣＴ ＧＮＪＪ−αｔλ艶関ｕα請儲π（２）配列番号：４３の情報： （１１）配列の種類、ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号：４３： ＧＧＧＧＡＣＴＴｉ’ＣＣ０ＣＴＣＧＧＧＡＣττ丁ＣＣＡＣＧＧＧ　ＧＯ＾Ｃ ｒＴτＣＣ（２）配列番号＝４４の情報： （ｉｉ）配列の種類・ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号＝４４： ＧＧλ＾＾ＧＴＣＣＣＣ１！〒ＧＣ入＾ＡＧ　丁ｅＣＣＣ＾ｃｃｃａ　＾＾＾Ｇ 丁ＣＣ：ｅＣ（２）配列番号：４５の情報・ （ｉｉ）配列の種類＝ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列、配列番号：４５゜ Ｇ〒ｆ：Ｘ入Ｃテテ〒Ｃｅｌ：Ｃ１ＧｉＣＴＡｅ　’！？ｒＣｅＡＣｅＧＴ　Ｃ ！ＡＣ’！”Ｌ’ＴＣＣ（２）配列番号・４６の情報・ （１１）配列の種類・ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号、４６゜ ＧＣ九Ｍ−τｋＱＡＣＣＧτＧＧ＾＾ＡＱ　τλＧ＾Ｃ＾Ｇαを入り４τＡＧ＾ Ｃ（２）配列番号、４７の情報： （１１）配列の種類：ペプチド （ｘｌ）配列、配列番号：４７゜ （２）配列番号、４８の情報： （１１）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号＝４８゜ ？ｙｒ　Ｃ１ｙ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　１１９　Ａｒ９　Ｇｉｎ　Ａｒ９　 ｘｒｇ　Ｍｑ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＧＬＩユ５１０ （２）配列番号：４９の情＄１１： （１１）配列の種類：ペプチド （ｘｌ）配列：配列番号＝４９・ （２）配列番号：５０の情報・ （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｌ）配列：配列番号　５０： （２）配列番号・５１の情報： （ｉｉ）配列の種類二タンパク質 （ｘｌ）配列：配列番号：５１・ （２）配列番号：５２の情報二 （１１）配列の種類・ペプチド （ｘｌ）配列：配列番号：５２゜ （２）配列番号：５３の情報。

（ｉｉ）配列の種類　ペプチド （ｘｉ）配列：配列番号・５３： Ｐｈ＠ＸＬａτ’ｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　ＸＬ＊　Ｓａｒ　Ｔ ｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｙ露Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＡｒｇＩ　Ｓ　ユ０　１５ （２）配列番号゛５４の情報： （ｉｉ）配列の種ｇＩｌ：タンパク質 （ｘｌ）配列：配列番号＝５４： Ｇ１ｎＰｈ＠ＬＪｕｓａｔ＋ＬｎＶａＬＬｙｓ）Ｌ＠ＰｒｏＬｙ纏？Ｍ！ｉｓ丁 ）ＨｚＶＪＬＩｓｉｒ〒ｈｒ６５　フ０　フＳ　８０ Ｇｌｙ　ｔｈｅ　Ｍ＠ｔ　Ｓ＠ｔ　Ｉｌ＠（２）配列番号：５５の情報： （１１）配列の種類：タンパク質 （ｘｌ）配列、配列番号、５５： （２）配列番号：５６の情報・ （ｉｆ）配列の種類、タンパク質 （ｘｌ）配列：配列番号、５６： （２）配列番号　５７の情報 （ｉ）配列の特色 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｌ）配列　配列番号：５７： Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＣＴａ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｓ　ｋｇ　ＶａｌＬｙｅ　Ｌｙ ｅ　ｋｓｎ　ｉｌｌ＠　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　？ｙｒ１ｇ０　１８５　１９ ０ （２）配列番号　５８の情報・ （１１）配列の種類　タンパク質 （ｘｌ）配列：配列番号・５８゜ 工１・　入ｓｐ　Ｘｉｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　入ｓｐ　Ｖａｌ　 Ａｌａ　Ｐｈｓ　Ｐｒｏ　２Ｍ　ＩＪＩＪ　Ｐｒｏ　Ａｌａｚｏｏ　１０５　１ １０ ＶａＬ　＾１ｍ　テｈｒ　ｓａｒ　（Ｌｕ　Ｇｌｙ　ｌＬｕ　Ｓ＠ｒ　Ｖ龜１　 ｈａｔ　入ｒｇ　ＧＬｕ　１１膳　＾１息テＦ　Ｓｉｒコ２Ｓ　ココｏ　３コＳ ｈｘ ａｓ （２）配列番号、５９の情報 （ｉｉ）配列の種類　タンパク質 （ｘｌ）配列：配列番号：５９・ しＩＬｙｓ　Ｏｙｓ　ＩＪ％１社ｇ　Ｔｙｒ　）ｇｇ　Ｐｈｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｍ 　Ｈｌｓ　ＣＹＩＩテｈｒ　Ｌｅｕ　？ｙｒチーＩｓ　ｉｌｏ　９１！ ｔｈ＠ｍｅ　Ｓｉｒ　Ｈｌｓ （２）配列番号・６０の情報： （１１）配列の種類・タンパク質 （Ｘｌ）配列：配列番号：６０： Ｐｈｓ　Ｌｙｓ　Ｉ、ｙｓ　ＩＬＬｍ　Ｃｙｓ　Ｔｈｅ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　ＴＭ 　ｋＬｍ　Ｖａｌ　１ｉａｒ　！Ｉｎｃ　Ｔｈｘ　？ｒｐ釦P Ｗｏ０　１０５　１１０ Ｌａｕ　ＸＬｍ　Ｉｓｒ　Ｏ１ｙ丁ｈｔ　ＪｕＪＬ　ＪＩＪｎ　ＧｌｎＶａｌ　 Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　ｉ’ｈａｅ　ｋＩＶａｎｚｏｏ　１ｏｓ　工 １０ （ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　丁’ｈｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　入ｒ９　Ａｒｇ 　Ｔｈｒ　Ｔｈｅ　Ａｇｎ　Ｍｐ　Ｇｌｙ　ＰＭ　ｕｓａｓ　９０　９５ Ｐｂ＠　Ｊｖｗｎ　ｊａｒ　５＠ｒ　Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　＾ｒ９　工Ｌｅ 　Ａｊｌ’ｌ　Ｃｙｓ　Ｍｎ　Ｓａｔ　ｕｎ　ＴＭ　τｈｒＳｏ　５ｓ　６０ ＦＩＧ、　Ｉ Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　 Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙｌ　５　１５ Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　 Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＣｙｓＳｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａ ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐ ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ｖａ ｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　５ｅｒＦＩＧ 、　２ ８０゜ タンパク質　（ｕｇ／ｍｌ） ＦＩＧ、　１２ ＭＥＴ　ＴＹＲＧＬＹ　ＡＲＧ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＡＲＧ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　Ａ ＲＧ　ＡＲＧＡＲＧ　ＰＲＯＰＲＯＡＳＰ　ＴＨＲＧＬＹ　ＡＳＮ　ＰＲＯＣＹ Ｓ　ＨＩＳ　ＴＨＲＴＨＲＩＬＥ　ＬＥＵ　ＴＨＲＡＬＡ　ＰＨＥ　ＡＳＮ　Ｓ ＥＲＳＥＲＨＩＳ　ＬＹＳ　ＧＬＹ　ＡＲＧＩＬＥ　ＡＳＮ　ＣＹＳ　’ＡＳＮ 　ＳＥＲＡＳＮ　ＴＨＲＴＨＲＰＲＯＩＬＥ　ＶＡＬ　Ｈ１ｓＬＥＵ　ＬＹＳ　 ＧＬＹ　ＡＳＰ　ＡＬＡ　ＡＳＮ　ＴＨＲＬＥＵ　ＬＹＳ　ＣＹＳ　ＬＥＵ　Ａ ＲＧＶＡＬ　ＳＥＲＳＥＲＴＨＲＴＲＰ　ＨＩＳ　ＴＲＰ　ＴＨＲＧＬＹ　ＨＩ Ｓ　ＡＳＮ　ＶＡＬＭ日−ＳＥＲＩＬＥ ＦＩＧ、　１３ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｚ　９２８２−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） ８３１４−４Ｃ （８１）指定間　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ、　 ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ。

ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＥＤ （７２）発明者　ペピンスキー、アール、ブレイクアメリカ合衆国　マサチュー セッツ ０２１７４　、アーリントン、フォルマス　ロード　３０

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分とからなる融合タンパク質 であって、 （ａ）輸送分が： （ｉ）ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸４９−５７の存在；（ｉｉ）ＨＩＶ 　ｔａｔタンパク質のアミノ酸２２−３６の不在；および、（ｉｉｉ）ＨＩＶ　 ｔａｔタンパク質のアミノ酸７３−８６の不在；で特徴付けられ、そして、 （ｂ）カーゴ部分が輸送部分依存性の細胞内送達後に有意な生物学的活性を維持 する、融合タンパク質。
2. ２．請求項１に記載の融合タンパク質であって、前記カーゴ部分が、治療用分子 、予防用分子、および診断用分子からなる群より選択される、融合タンパク質。
3. ３．カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分とからなる融合タンパク質 であって、該カーゴ部分が、標的細胞に送達後に生物学的活性を維持するヒトパ ピローマウイルスＥ２リプレッサーからなり、そして該輸送部分が：（ａ）ＨＩ Ｖ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸４７−５８（配列番号：４７）；（ｂ）ＨＩＶ 　ｔａｔタンパク質のアミノ酸４７−７２（配列番号：４８）；（ｃ）ＨＩＶ　 ｔａｔタンパク質のアミノ酸３８−７２（配列番号：４９）；および、 （ｄ）ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸３８−５８（配列番号：５０）；か らなる群より選択される、融合タンパク質。
4. ４．請求項３に記載の融合タンパク質であって、前記輸送部分の前にアミノ末端 メチオニンがある、融合タンパク質。
5. ５．請求項１から４のいずれかに記載の融合タンパク質であって、前記カーゴ部 分がヒトパピローマウイルスＥ２タンパク質のアミノ酸２４５−３６５（配列番 号：５１）からなる、融合タンパク質。
6. ６．融合タンパク質ＪＢ１０６（配列番号：３８）。
7. ７．融合タンパク質ＪＢ１１７（配列番号：５９）。
8. ８．融合タンパク質ＪＢ１１８（配列番号：６０）。
9. ９．融合タンパク質ＪＢ１２２（配列番号：６３）。
10. １０．カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分とからなる融合タンパク 質であって、該カーゴ部分が、標的細胞に送達後に生物学的活性を維持するウシ パピローマウイルスＥ２リプレッサーからなり、そして該輸送部分が：（ａ）Ｈ ＩＶ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸４７−６２（配列番号：５２）；および、 （ｂ）ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸３８−６２（配列番号：５３）；か らなる群より選択される、融合タンパク質。
11. １１．請求項１０に記載の融合タンパク質であらて、前記輸送タンパク質の前に アミノ末端メチオニンがある、融合タンパク質。
12. １２．請求項１、２、１０、または１１のいずれかに記載の融合タンパク質であ って、前記カーゴ部分が、ウシパピローマウイルスＥ２タンパク質のアミノ酸２ ５０−４１０（配列番号：５６）からなるＥ２リプレッサーである、融合タンパ ク質。
13. １３．融合タンパク質ＪＢ１１９（配列番号：６１）。
14. １４．融合タンパク質ＪＢ１２０（配列番号：６２）。
15. １５．輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とからなる共有結合した化学的複合体 であって： （ａ）複合体の輸送ポリペプチド部分が：（ｉ）ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質のア ミノ酸４９−５７の存在；（ｉｉ）ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸２２− ３６の不在；および、（ｉｉｉ）ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸７３−８ ６の不在；で特徴付けられ、そして、 （ｂ）複合体のカーゴ部分が、輸送部分依存性の細胞内送達後に有意な生物学的 活性を維持する、融合タンパク質。
16. １６．請求項１５に記載の共有結合した化学的複合体であって、前記輸送ポリペ プチド部分が、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸３７−７２（配列番号：２ ）からなる、化学的複合体。
17. １７．請求項１６に記載の共有結合した化学的複合体であって、前記カーゴ部分 が： （ａ）ヒトパピローマウイルスＥ２タンパク質のアミノ酸２４５−３６５（配列 番号：５１）；および、 （ｂ）ヒトパピローマウイルスＥ２タンパク質のアミノ酸２４５−３６５（ここ でアミノ酸３００および３０９はシステインに置換している）（配列番号：５５ ）、 からなる群より選択される、化学的複合体。
18. １８．輸送部分とカーゴ部分とからなる共有結合した化学的複合体であって、前 記輸送ポリペプチドが、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸３７−７２（配列 番号：２）からなり、そして該カーゴ部分が： （ａ）ヒトパピローマウイルスＥ２タンパク質のアミノ酸２４５−３６５（配列 番号：５１）；および、 （ｂ）ヒトパピローマウイルスＥ２タンパク質のアミノ酸２４５−３６５（ここ でアミノ酸３００および３０９がシステインに置換している）（配列番号：５５ ）、からなる群より選択される、化学的複合体。
19. １９．カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分とからなる融合タンパク 質であって、該カーゴ部分がＨＳＶ　ＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４３−４１ ２からなり、そして該輸送部分がＨＩＶ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸４７−５ ８からなる、融合タンパク質。
20. ２０．請求項１９に記載の融合タンパク質であって、前記輸送部分の前にアミノ 末端メチオニンがある、融合タンパク質。
21. ２１．輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とからなる共有結合した化学的複合体 であって、該輸送ポリペプチド部分が、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸３ ７−７２（配列番号：２）からなり、そして該カーゴ部分が： （ａ）オリゴヌクレオチドＮＦ２（配列番号：４４）にアニールするオリゴヌク レオチドＮＦＩ（配列番号：４３）、および、（ｂ）オリゴヌクレオチドＮＦ４ （配列番号：４６）にアニールするオリゴヌクレオチドＮＦ３（配列番号：４５ ）、からなる群より選択される、化学的複合体。
22. ２２．請求項１から１４、１９、または２０のいずれかに記載の融合タンパク質 の前記カーゴの細胞内送達のための使用。
23. ２３．請求項１５から１７、または２１のいずれかに記載の共有結合した化学的 複合体の前記カーゴの細胞内送達のための使用。
24. ２４．薬学的に有効な量の請求項１から１４のいずれかに記載の融合タンパク質 を含む薬学的組成物。
25. ２５．薬学的に有効な量の請求項１９または２０のいずれかに記載の融合タンパ ク質を含む薬学的組成物。
26. ２６．薬学的に有効な量の請求項１５から１８、または２１のいずれかに記載の 共有結合した化学的複合体を含む薬学的組成物。
27. ２７．次の： （ａ）ＪＢ１０６（配列番号：３８）、（ｂ）ＪＢ１１７（配列番号：５９）、 （ｃ）ＪＢ１１８（配列番号：６０）、（ｄ）ＪＢ１１９（配列番号：６１）、 （ｅ）ＪＢ１２０（配列番号：６２）、および、（ｆ）ＪＢ１２２（配列番号： ６３）、からなる群より選択される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配 列を含む、ＤＮＡ分子。
28. ２８．融合タンパク質ｔａｔ−ＶＰ１６Ｒ．ＧＦ（配列番号：５８）をコードす るヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
29. ２９．請求項２７に記載のＤＮＡ分子であって、前記融合タンパク質をコードす るヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結している、ＤＮＡ分子。
30. ３０．請求項２８に記載のＤＮＡ分子であって、前記融合タンパク質をコードす るヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結している、ＤＮＡ分子。
31. ３１．請求項２９に記載のＤＮＡ分子で形質転換した単細胞性宿主。
32. ３２．請求項３０に記載のＤＮＡ分子で形質転換した単細胞性宿主。
33. ３３．次の、 （ａ）ＪＢ１０６（配列番号：３８）、（ｂ）ＪＢ１１７（配列番号：５９）、 （ｃ）ＪＢ１１８（配列番号：６０）、（ｄ）ＪＢ１１９（配列番号：６１）、 （ｅ）ＪＢ１２０（配列番号：６２）、および、（ｆ）ＪＢ１２２（配列番号： ６３）、からなる群より選択される融合タンパク質を生成する方法であって、 該方法が以下の工程： （ａ）請求項３１に記載の形質転換した単細胞性宿主を培養する工程；および、 （ｂ）該培養から融合タンパク質を回収する工程、を包含する、方法。
34. ３４．ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質のアミノ酸４７−５８に続くＨＳＶ　ＶＰ１６ タンパク質のアミノ酸４３−４１２からなる融合タンパク質を生成する方法であ って、 該方法が以下の工程： （ａ）請求項３２に記載の形質転換した単細胞性宿主を培養する工程；および、 （ｂ）該培養から融合タンパク質を回収する工程、を包含する、方法。