JPH1033186A - Ｔａｔ由来の輸送ポリペプチド - Google Patents

Ｔａｔ由来の輸送ポリペプチド

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JPH1033186A
JPH1033186A JP9096264A JP9626497A JPH1033186A JP H1033186 A JPH1033186 A JP H1033186A JP 9096264 A JP9096264 A JP 9096264A JP 9626497 A JP9626497 A JP 9626497A JP H1033186 A JPH1033186 A JP H1033186A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、細胞質または核の作用部位を有す
るタンパク質、核酸、および他の分子に関わる病気の治
療のための薬学的組成物を提供すること。 【解決手段】 カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端
輸送部分とからなる融合タンパク質または共有結合した
化学的複合体の、カーゴ部分の細胞内送達のための医薬
品の製造のための使用方法、およびそれらを薬学的に有
効な量で含むウイルス感染症を防止するための薬学的組
成物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願は、1992年8月21日
に出願した同時係属出願第07/934,375号の一部継続出願
である。
【０００２】本発明は、ポリペプチドおよび核酸のよう
な生物学的に活性なカーゴ分子の、細胞の細胞質および
核へのインビボおよびインビトロでの送達に関する。本
発明のカーゴ分子の細胞内送達は、１つ以上のHIV tat
タンパク質を含み、カーゴ分子に共有結合する新規の輸
送ポリペプチドの使用により達成される。本発明の輸送
ポリペプチドは、天然に存在するtatタンパク質のtat塩
基性領域(アミノ酸49-57)の存在、tatシステインに富む
領域(アミノ酸22-36)の不在、およびtatエクソン２コー
ド化カルボキシ末端ドメイン(アミノ酸73-86)の不在に
特徴がある。従来のtatタンパク質に見出されるシステ
インに富む領域の不在により、本発明の輸送ポリペプチ
ドは見せかけのトランス活性化(trans-activation)およ
びジスルフィド凝集の問題を解決する。また、本発明の
輸送ポリペプチドのサイズの減少により、カーゴ分子の
生物学的活性の妨害が最小となる。
【０００３】
【従来の技術】生物学的細胞は、一般的に、タンパク質
および核酸を含む高分子に対して不透過性である。いく
つかの小分子は、非常に低い割合で生細胞に進入する。
インビボで細胞内に高分子を送達する方法がないこと
が、細胞内の作用部位を有するおそらく多くのタンパク
質および核酸の、治療用、予防用、および診断用の使用
の障害となってきた。従って、組換えＤＮＡ技術を用い
て今日まで生成されたほとんどの治療用、予防用、およ
び診断用の候補は、細胞外環境中または標的細胞の表面
上で作用するポリペプチドである。
【０００４】種々の方法が、インビトロで細胞中に高分
子を送達するために開発された。このような方法のリス
トには、エレクトロポレーション、リポソームによる膜
融合、ＤＮＡをコートしたマイクロプロジェクタイル(m
icroprojectile)を用いる高速注入(bombardment)、リン
酸カルシウム−ＤＮＡ沈降とのインキュベーション、DE
AE−デキストラン仲介形質転換、改変ウイルス核酸の注
入、および単細胞への直接マイクロインジェクションが
含まれる。これらのインビトロの方法は、典型的には全
細胞群の一部分にのみ核酸分子を送達し、そしてこれら
は多くの細胞に傷害を与える傾向にある。インビボでの
細胞への高分子の実験的な送達は、リン酸カルシウム沈
降、およびリポソームを摩擦塗布(scrape loading)する
ことで達成された。しかし、これらの技術は、今日まで
インビボでの細胞送達への有用性に限界を示してきた。
さらに、インビトロでの細胞でさえ、このような方法
は、タンパク質の送達に対する有用性をかなり制限す
る。
【０００５】生物学的に活性なタンパク質の無傷細胞へ
のインビトロおよびインビボでの効果的な送達のための
一般的な方法が必要である。(L.A.Sternson, 「ポリペプ
チド送達に対する障害」,Ann. N.Y. Acad. Sci., 57, 19
-21頁(1987))。リポペプチドの化学的付加(P.Hoffmann
ら、「バクテリアのリポタンパク質および合成リポペプ
チドアナログによるヒトおよびマウス粘着細胞の刺激」,
Immunobiol., 177, 158-70頁(1988))、あるいは、ポリ
リシンまたはポリアルギニンのような塩基性ポリマー(W
-C.Chenら、「ポリ−L−リシンアルブミンおよび西洋ワ
サビペルオキシダーゼの複合体化：タンパク質の細胞取
り込みを増強する新規の方法」, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 75,1872-76頁(1978))は、高く信頼できること
あるいは一般的に有用であることを証明しなかった(後
述の実施例４参照)。葉酸が、輸送部分として用いられ
た(C.P.LeamonおよびLow, 「生細胞への高分子の送達：
葉酸レセプターのエンドサイトシスを活用する方法」,Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,5572-76頁(1991))。そ
の証拠は、葉酸複合体のインターナリゼーションについ
ては示されたが、細胞質送達については示されなかっ
た。インビボで高レベルの循環葉酸塩がある場合、この
系の有用性は十分に示されなかった。シュードモナス外
毒素もまた輸送部分として用いられた(T.I. Priorら、
「バルナーゼ(Barnase)トキシン：シュードモナス外毒素
Ａおよびバルナーゼを組合せた新規のキメラ毒素」,Cel
l, 64, 1017-23頁(1991))。しかし、この系の有効性お
よび一般適用性は公開された著述からは明らかではな
い。
【０００６】ヒト免疫不全ウイルスＩ型(「HIV」)のtatタ
ンパク質は、細胞へのカーゴタンパク質の送達について
の可能性を示す(PCT出願番号WO 91/09958で公開)。しか
し、全長のtatタンパク質の化学的特性のため、生物学
的に活性なカーゴの送達における有効な使用のための一
般適用法は、当該分野で教示されていない。
【０００７】tatは、特定のHIV遺伝子をトランス活性化
するHIVコード化タンパク質であり、ウイルス複製に必
須である。全長のHIV-1 tatタンパク質は86アミノ酸残
基を有する。HIV tat遺伝子は２つのエクソンを有す
る。tatアミノ酸1-72はエクソン１にコードされ、アミ
ノ酸73-86はエクソン２にコードされる。全長のtatタン
パク質は、２つのリシンおよび６つのアルギニンを含む
塩基性領域(アミノ酸49-57)、ならびに７つのシステイ
ン残基を含むシステインに富む領域(アミノ酸22-37)を
特徴とする。精製したtatタンパク質は、培養で増殖す
るヒト細胞により、周囲の培地から取り込まれる(A.D.
FrankelおよびC.O.Pabo,「ヒト免疫不全ウイルス由来のt
atタンパク質の細胞取り込み」, Cell, 55, 1189-93頁(1
988))。当該分野では、tatタンパク質のシステインに富
む領域(凝集および不溶性を引き起こす)が、tatタンパ
ク質の細胞取り込みに要求されるかどうかは知られてい
ない。
【０００８】PCT特許出願番号WO 91/09958(「'958出願」)
は、パピローマウイルスＥ2トランス活性化リプレッサ
ーのポリペプチドに遺伝子的に融合したHIV tatタンパ
ク質のアミノ酸1-67からなる異種タンパク質が、培養細
胞により取り込まれることを開示している。しかし、カ
ーゴポリペプチドの生物学的活性の保持(Ｅ2トランス活
性化の抑制)は、ここでは示されていない。
【０００９】'958出願に教示されるように、カーゴタン
パク質の細胞送達に用いる場合、tatタンパク質の使用
は実用上の困難さの可能性を含む。これらの実用上の困
難さは、tatタンパク質のシステインに富む領域に関わ
るタンパク質の凝集および不溶性を含む。さらに'958出
願では、カーゴタンパク質へのtatタンパク質の化学的
架橋の実施例は提供されていない。この化学的架橋は、
カーゴタンパク質へのtatの遺伝的融合が、tatタンパク
質、カーゴタンパク質、またはその両方の適切な折り畳
みを干渉する位置で重要であり得る。加えて'958出願と
FrankelおよびPabo(前出)との両方が、細胞毒性である
クロロキンと組み合わせるtat輸送タンパク質の使用を
教示している。従って、生細胞の細胞質および核への生
物学的に活性なカーゴ分子の安全で、有効な送達のため
の一般的に適用し得る手段についての必要性がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、細胞質また
は核の作用部位を有するタンパク質、核酸、および他の
分子に関わる病気の治療のための薬学的組成物を提供す
ることを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、(1)標的の細
胞または細胞核に本来進入し得ない、あるいは(2)有用
な割合で標的細胞に本来進入し得ない、生物学的に活性
な、tatではない、タンパク質、核酸、および他の分子
を、有効な細胞質および核に送達するための方法および
生成物を提供することにより、上記の問題を解決する。
本発明のカーゴ分子の細胞内送達は、HIV tatタンパク
質の１つ以上の部分を含み、そしてそのカーゴ分子に共
有結合している、新規の輸送タンパク質の使用により達
成される。さらに詳細には、本発明は、新規の輸送ポリ
ペプチド、これらの輸送ポリペプチドの作製方法、輸送
ポリペプチド−カーゴ複合体、輸送ポリペプチド−カー
ゴ複合体を含む薬学的組成物、予防用組成物、および診
断用組成物、および、tat関連輸送ポリペプチドを用い
る細胞へのカーゴの送達方法に関する。本発明はまた、
カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分とから
なる融合タンパク質または共有結合した化学的複合体
の、カーゴ部分の細胞内送達のための医薬品の製造のた
めの使用方法、およびそれらを薬学的に有効な量で含む
ウイルス感染症を防止するための薬学的組成物を提供す
る。
【００１２】本発明の輸送ポリペプチドは、tat塩基性
領域のアミノ酸配列(天然に存在するtatタンパク質のア
ミノ酸49-57)の存在；システインに富む領域のアミノ酸
配列(天然に存在するtatタンパク質のアミノ酸22-36)の
不在、およびtatエクソン２コード化カルボキシ末端ド
メイン(天然に存在するtatタンパク質のアミノ酸73-86)
の不在を特徴とする。このような輸送ポリペプチドの好
ましい実施態様は、tat37-72(配列番号:２)、tat37-58
(配列番号:３)、tat38-58GGC(配列番号:４)、tatCGG47-
58(配列番号:５)、tat47-58GGC(配列番号:６)、およびt
atΔcys(配列番号:７)である。輸送ポリペプチドがカー
ゴ部分に遺伝子的に融合する場合に、アミノ末端メチオ
ニンを加えなければならないが、スペーサーアミノ酸
(例えば、CysGlyGlyまたはGlyGlyCys)を加える必要はな
いことが当業者により知られている。従来のtatタンパ
ク質に存在するシステインに富む領域の不在により、本
発明の輸送タンパク質は、ジスルフィド凝集の問題を解
決する。このジスルフィド凝集は、カーゴの生物学的活
性の損失、輸送ポリペプチド−カーゴ複合体の不溶性、
またはその両方を生じ得る。また、本発明の輸送ポリペ
プチドのサイズの減少により、カーゴの生物学的活性の
妨害が都合よく最小となる。輸送ポリペプチドのサイズ
を減少するさらなる利点は、カーゴ分子当たり複数の輸
送ポリペプチドの結合に関わる、本発明の実施態様で、
取り込み効果を増強することである。
【００１３】本発明の輸送ポリペプチドは、化学的架橋
または遺伝的融合によりカーゴ分子に都合良く結合し得
る。本発明の好ましい実施態様に従って、輸送ポリペプ
チドおよびカーゴ分子は化学的架橋される。唯一の末端
システイン残基は、化学的架橋の好ましい手段である。
本発明の他の好ましい実施態様に従って、輸送部分のカ
ルボキシ末端はカーゴ部分のアミノ末端に遺伝子的に融
合される。本発明の特に好ましい実施態様は、JB106で
あり、これは、アミノ末端メチオニンに次いで、tat残
基47-58、次いでHPV−16 E2残基245-365からなる。
【００１４】多くの場合、本発明の新規の輸送ポリペプ
チドは、クロロキン関連の毒性を都合良く避ける。本発
明の１つの好ましい実施態様に従って、生きているヒト
または動物中に輸送ポリペプチド−カーゴ複合体を導入
した後、生物学的に活性なカーゴが種々の器官および組
織の細胞中に送達される。上記の特性により、本発明
は、細胞質または核の作用部位を有するタンパク質、核
酸、および他の分子に関わる生物学研究および病気の治
療に道を開く。
【００１５】本発明は、カルボキシ末端カーゴ部分とア
ミノ末端輸送部分とからなる融合タンパク質の、該カー
ゴ部分の細胞内送達のための医薬品の製造のための使用
方法を提供し、この融合タンパク質は、以下からなる群
から選択される： （１）(a)輸送部分が、(i) HIV tatタンパク質のアミノ
酸49-57の存在；(ii)HIV tatタンパク質のアミノ酸22-3
6の不在；および(iii) HIV tatタンパク質のアミノ酸73
-86の不在；で特徴付けられ、そして、(b)カーゴ部分が
輸送部分依存性の細胞内送達後に有意な生物学的活性を
維持する融合タンパク質； （２）カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分
とからなる融合タンパク質であって、該カーゴ部分が、
標的細胞に送達後に生物学的活性を維持するヒトパピロ
ーマウイルスＥ2リプレッサーからなり、そして該輸送
部分が、(a) HIVtatタンパク質のアミノ酸47-58(配列番
号:47)；(b) HIV tatタンパク質のアミノ酸47-72(配列
番号:48)；(c) HIV tatタンパク質のアミノ酸38-72(配
列番号:49)；および、(d) HIV tatタンパク質のアミノ
酸38-58(配列番号:50)；からなる群より選択される、融
合タンパク質； （３）融合タンパク質JB106(配列番号:38)； （４）融合タンパク質JB117(配列番号:59)； （５）融合タンパク質JB118(配列番号:60)； （６）融合タンパク質JB122(配列番号:63)； （７）カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分
とからなる融合タンパク質であって、該カーゴ部分が、
標的細胞に送達後に生物学的活性を維持するウシパピロ
ーマウイルスＥ2リプレッサーからなり、そして該輸送
部分が、(a) HIVtatタンパク質のアミノ酸47-62(配列番
号:52)；および(b) HIV tatタンパク質のアミノ酸38-62
(配列番号:53)；からなる群より選択される、融合タン
パク質； （８）融合タンパク質JB119(配列番号:61)； （９）融合タンパク質JB120(配列番号:62)；ならびに （10）カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分
とからなる融合タンパク質であって、該カーゴ部分がHS
V VP16タンパク質のアミノ酸43-412からなり、そして該
輸送部分がHIV tatタンパク質のアミノ酸47-58からな
る、融合タンパク質。
【００１６】好ましい実施態様では、上記（１）の融合
タンパク質において、上記カーゴ部分は、治療用分子、
予防用分子、および診断用分子からなる群より選択され
る。
【００１７】好ましい実施態様では、上記（２）の融合
タンパク質において、上記輸送部分の前にアミノ末端メ
チオニンがある。
【００１８】好ましい実施態様では、上記（１）または
（２）の融合タンパク質において、前記カーゴ部分はヒ
トパピローマウイルスＥ2タンパク質のアミノ酸245-365
(配列番号:51)からなる。
【００１９】好ましい実施態様では、上記（７）の融合
タンパク質において、前記輸送タンパク質の前にアミノ
末端メチオニンがある。
【００２０】好ましい実施態様では、上記（１）または
（７）の融合タンパク質において、前記カーゴ部分は、
ウシパピローマウイルスＥ2タンパク質のアミノ酸250-4
10(配列番号:56)からなるＥ2リプレッサーである。
【００２１】好ましい実施態様では、上記（10）の融合
タンパク質において、前記輸送部分の前にアミノ末端メ
チオニンがある。
【００２２】本発明はまた、輸送ポリペプチド部分とカ
ーゴ部分とからなる共有結合した化学的複合体の、この
カーゴ部分の細胞内送達のための医薬品の製造のための
使用方法を提供し、この化学的複合体は以下からなる群
から選択される： （１）(a)輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とからな
る共有結合した化学的複合体であって、該複合体の該輸
送ポリペプチド部分が、(i) HIV tatタンパク質のアミ
ノ酸49-57の存在；(ii) HIV tatタンパク質のアミノ酸2
2-36の不在；および(iii) HIV tatタンパク質のアミノ
酸73-86の不在；で特徴付けられ、そして、(b)該複合体
の該カーゴ部分が、輸送部分依存性の細胞内送達後に有
意な生物学的活性を維持する、化学的複合体； （２）輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とからなる共
有結合した化学的複合体であって、該輸送ポリペプチド
部分が、HIV tatタンパク質のアミノ酸37-72(配列番号:
２)からなり、そして該カーゴ部分が、(a)ヒトパピロー
マウイルスＥ2タンパク質のアミノ酸245-365(配列番号:
51)；および(b)ヒトパピローマウイルスＥ2タンパク質
のアミノ酸245-365(ここでアミノ酸300および309がシス
テインに置換している)(配列番号:55)からなる群より選
択される、化学的複合体；ならびに （３）輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とからなる共
有結合した化学的複合体であって、該輸送ポリペプチド
部分が、HIV tatタンパク質のアミノ酸37-72(配列番号:
２)からなり、そして該カーゴ部分が、(a)オリゴヌクレ
オチドNF2(配列番号:44)にアニールするオリゴヌクレオ
チドNF1(配列番号:43)、および(b)オリゴヌクレオチドN
F4(配列番号:46)にアニールするオリゴヌクレオチドNF3
(配列番号:45)からなる群より選択される、化学的複合
体。
【００２３】好ましい実施態様では、上記（１）の化学
的複合体において、前記輸送ポリペプチド部分は、HIV
tatタンパク質のアミノ酸37-72(配列番号:２)からな
る。
【００２４】好ましい実施態様では、上記（１）の化学
的複合体において、前記カーゴ部分は、(a)ヒトパピロ
ーマウイルスＥ2タンパク質のアミノ酸245-365(配列番
号:51)；および、(b)ヒトパピローマウイルスＥ2タンパ
ク質のアミノ酸245-365(ここでアミノ酸300および309は
システインに置換している)(配列番号:55)；からなる群
より選択される。
【００２５】本発明はまた、薬学的に有効な量の融合タ
ンパク質を含む、ウイルス感染症を防止するための薬学
的組成物を提供する。この融合タンパク質は上記の通り
である。
【００２６】本発明はまた、薬学的に有効な量の化学的
複合体を含む、ウイルス感染症を防止するための薬学的
組成物を提供する。この化学的複合体は上記の通りであ
る。
【００２７】
【発明の実施の形態】本明細書に記載の発明をさらに十
分理解し得るために、次に詳細な説明を記載する。
【００２８】本明細書中では、次の用語が用いられる： アミノ酸−−ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク
質のモノマー単位。20種のタンパク質アミノ酸(L−異性
体)は：アラニン(「Ala」または「A」)、アルギニン(「Arg」
または「R」)、アスパラギン(「Asn」または「N」)、アスパラ
ギン酸(「Asp」または「D」)、システイン(「Cys」または
「C」)、グルタミン(「Gln」または「Q」)、グルタミン酸(「Gl
u」または「E」)、グリシン(「Gly」または「G」)、ヒスチジン
(「His」または「H」)、イソロイシン(「Ile」または「I」)、ロ
イシン(「Leu」または「L」)、リシン(「Lys」または「K」)、メ
チオニン(「Met」または「M」)、フェニルアラニン(「Phe」ま
たは「F」)、プロリン(「Pro」または「P」)、セリン(「Ser」ま
たは「S」)、トレオニン(「Thr」または「T」)、トリプトファ
ン(「Trp」または「W」)、チロシン(「Tyr」または「Y」)、およ
びバリン(「Val」または「V」)である。本明細書で用いられ
る用語アミノ酸はまた、タンパク質アミノ酸のアナロ
グ、ならびに、タンパク質アミノ酸のD−異性体および
そのアナログを含む。
【００２９】カーゴ−−tatタンパク質またはそのフラ
グメントではない分子であって、(1)本来標的細胞に進
入し得ないか、または(2)本来標的細胞に有用な割合で
進入し得ない分子。(本出願中で用いられる「カーゴ」
は、本来のすなわち複合体化前の分子か、輸送ポリペプ
チド−カーゴ複合体のカーゴ部分のいずれかをいう。)
「カーゴ」の例は、ポリペプチド、核酸、および多糖のよ
うな小分子および高分子を含むが、それに限定されな
い。
【００３０】化学的架橋−−２つ以上の前もって形成さ
れた分子の共有結合。
【００３１】カーゴ複合体−−少なくとも１つの輸送ポ
リペプチド部分および少なくとも１つのカーゴ部分を含
む分子であって、輸送ポリペプチドとカーゴ分子との遺
伝的融合または化学的架橋のいずれかにより形成された
分子。
【００３２】遺伝的融合−−それぞれのタンパク質をコ
ードする隣接したＤＮＡ配列の遺伝子発現を通じて、２
つ以上のタンパク質のポリペプチド骨格を介するそれら
の共直線性の共有結合。
【００３３】高分子−−ペプチド、ポリペプチド、タン
パク質、または核酸のような分子。
【００３４】ポリペプチド−−そのサイズに関係なく、
20種のタンパク質アミノ酸(上記)のいずれかから本質的
になる任意のポリマー。「タンパク質」がしばしば比較的
大きなポリペプチドについて用いられ、「ペプチド」はし
ばしば小さいポリペプチドについて用いられるが、当該
分野におけるこれらの用語の使用は重複し、そして多様
である。本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」
は、他に記載のない限り、ペプチド、ポリペプチド、お
よびタンパク質をいう。
【００３５】リポーター遺伝子−−その発現が、目的の
細胞の事象の発生に依存する遺伝子であり、そしてその
発現が遺伝的に形質転換された宿主細胞中で都合良く観
察され得る、遺伝子。
【００３６】リポータープラスミド−−１つ以上のリポ
ーター遺伝子を含むプラスミドベクター。
【００３７】小分子−−高分子以外の分子。
【００３８】スペーサーアミノ酸−−化学的架橋に用い
られる輸送部分とアミノ酸残基との間に含まれるアミノ
酸(好ましくは小分子の側鎖を有する)(例えば、分子の
柔軟性を提供し、立体障害を避けるための)。
【００３９】標的細胞−−カーゴが輸送ポリペプチドに
より送達される細胞。「標的細胞」は、インビボまたはイ
ンビトロのいずれかでの、ヒト細胞を含む任意の細胞で
あり得る。
【００４０】輸送部分または輸送ポリペプチド−−共有
結合したカーゴを標的細胞へ送達し得るポリペプチド。
【００４１】本発明は、一般的に治療用、予防用、また
は診断用の、タンパク質、核酸、および多糖のような、
小分子および高分子(本来標的細胞に有用な割合で進入
し得ない)の細胞内送達に適用可能である。しかし、本
発明の他の実施態様は、臨床応用に限定されないことが
認められるべきである。本発明は、医学研究および生物
学研究に都合良く適用され得る。本発明の研究応用にお
いて、カーゴは薬物またはリポーター分子であり得る。
本発明の輸送ポリペプチドは、単独でまたは輸送ポリペ
プチド複合体化キットの一部のとしてのいずれかで、研
究機関用の試薬として用いられ得る。
【００４２】標的細胞は、インビボ細胞、すなわち生き
ている動物またはヒトの器官または組織を構成する細胞
であり得る。標的細胞はまた、インビトロ細胞、すなわ
ち培養した動物細胞、ヒト細胞、または微生物であり得
る。
【００４３】本発明の実施における使用のための薬物お
よびリポーター分子の選択には広い自由範囲がある。リ
ポーター分子の選択において考えられる要因は、求めら
れる実験の情報の型、非毒性、検出の利便性、検出の定
量可能性、および入手可能性を含むが、それに限定され
ない。多くのこのようなリポーター分子は当業者に公知
である。
【００４４】下記の実施例から認められるように、呈色
アッセイに存在する酵素をモデルカーゴとして用いて、
本発明の輸送ポリペプチドの使用可能性、および有用な
特性を示した。これらの酵素カーゴは、感度、利便性、
細胞取り込みの可視検出、を提供する。さらに、カーゴ
の酵素活性が保持される場合にのみ可視的な解読が生じ
るので、これらの酵素は、本発明の輸送ポリペプチド−
カーゴ複合体中のカーゴ部分の生物学的活性の保持に関
する感度の高いおよび信頼できる試験を提供する。本発
明の好ましい実施態様は、西洋ワサビペルオキシダーゼ
(「HRP」)を輸送ポリペプチド−カーゴ複合体のカーゴ部
分として含む。本発明の実施のための特に好ましいモデ
ルカーゴ部分はβ−ガラクトシダーゼである。
【００４５】モデルカーゴタンパク質はまた、細胞内の
それらの作用部位によって選択され得る。下記の実施例
６および７に記載したように、シュードモナス外毒素
(「PE」)由来のADPリボシル化ドメインおよび膵リボヌク
レアーゼを用いて、本発明の輸送ポリペプチドによる適
切に折り畳まれたカーゴタンパク質の細胞質送達を確認
した。
【００４６】全長のシュードモナス外毒素はそれ自身で
細胞に進入し得、ADPリボシル化反応によりリボソーム
を不活性化し、従って細胞を殺す。ADPリボシル化ドメ
インとして知られているシュードモナス外毒素タンパク
質の一部は細胞に進入し得ないが、細胞と接触した場
合、リボソームを不活性化する能力を維持する。従っ
て、輸送ポリペプチド−PE ADPリボシル化ドメイン複合
体により誘発された細胞の死は、輸送ポリペプチドによ
るカーゴの細胞質送達に関する試験となる。
【００４７】本発明者らは、リボヌクレアーゼを用いて
本発明の輸送ポリペプチドによる適切に折り畳まれたカ
ーゴタンパク質の細胞質送達を確認した。RNAによる方
法のタンパク質合成は、RNAを消化するリボヌクレアー
ゼに感度が高い。しかし、リボヌクレアーゼはそれ自身
で細胞に進入し得ない。従って、輸送ポリペプチド−リ
ボヌクレアーゼ複合体によるタンパク質合成の阻害は、
生物学的に活性なリボヌクレアーゼの細胞内送達に関す
る試験となる。
【００４８】もちろん、与えられたカーゴ分子の細胞質
への送達に次いで、同カーゴ分子の核へのさらなる送達
が続き得る。核送達は細胞質のいくつかの部分を横断す
ることを必然的に含む。
【００４９】パピローマウイルスＥ2リプレッサーのタ
ンパク質は、本発明の輸送ポリペプチドにより標的細胞
の核へ送達され得る高分子薬物の例である。パピローマ
ウイルスＥ2タンパク質はホモダイマーとして通常存在
するが、パピローマウイルスゲノムの転写および複製の
両方を制御する。Ｅ2タンパク質のカルボキシ末端ドメ
インは、DNA結合活性および二量体化活性を含む。トラ
ンスフェクトされた哺乳類細胞中の種々のＥ2アナログ
またはＥ2カルボキシ末端フラグメントをコードするDNA
配列の短い発現が、全長のＥ2タンパク質によるトラン
ス活性化を阻害する(J.Barsoumら、「パピローマウイル
スＥ2リプレッサーの作用機構：DNA結合の不在における
抑制」, J.Virol., 66, 3941-3945頁(1992))。培養哺乳
類細胞の成長培地に添加したＥ2リプレッサーは細胞に
進入しない。従って、Ｅ2リプレッサーは、これらの細
胞ではＥ2のトランス活性化を阻害しない。しかし、本
発明の輸送ポリペプチドのＥ2リプレッサーへの複合の
結果、成長培地から生物学的活性を示す培養細胞へのＥ
2リプレッサーの移動が生じ、リポーター遺伝子のＥ2依
存性の発現を抑制する。
【００５０】インビトロおよびインビボで、一本鎖およ
び二本鎖の核酸が細胞に進入する割合は、本発明の輸送
ポリペプチドを用いて都合良く増強され得る。実施例11
(下記)に示すように、核酸へのポリペプチドの化学的架
橋の方法は当該分野で周知である。本発明の好ましい実
施態様では、カーゴは一本鎖アンチセンス核酸である。
アンチセンス核酸は、それらと相補的である配列の細胞
の発現を阻害するのに有用である。本発明の他の実施態
様において、カーゴは核酸結合タンパク質に認識される
結合部位を含む二本鎖の核酸である。このような核酸結
合タンパク質の例はウイルス性のトランスアクティベー
ターである。
【００５１】天然に存在するHIV-1 tatタンパク質(図
１)は、16個のアミノ酸の内７個がシステインである領
域(アミノ酸22-37)を有する。これらのシステイン残基
は、他のtatタンパク質分子のシステインに富む領域に
おけるシステイン残基、およびカーゴタンパク質または
複合体のカーゴ部分におけるシステイン残基とで、互い
にジスルフィド結合を形成し得る。このようなジスルフ
ィド結合形成は、カーゴの生物学的な活性の損失を引き
起こす。さらに、カーゴ部分にジスルフィド結合の可能
性がない場合でさえ(例えば、カーゴタンパク質がシス
テイン残基を持たない場合)、輸送ポリペプチド間のジ
スルフィド結合の形成が、輸送ポリペプチド、輸送ポリ
ペプチド−カーゴ複合体、またはその両方の凝集および
不溶性を引き起こす。tatシステインに富む領域は、カ
ーゴタンパク質の細胞送達に対する天然に存在するtat
タンパク質の使用において、おそらく重大な問題の原因
となる。
【００５２】システインに富む領域は、tatのインビト
ロでの二量体化に必要であり、そしてHIV DNA配列のト
ランス活性化に必要である。従って、tatシステインに
富む領域の除去は、tatの本来の活性(すなわちHIVの転
写および複製の誘導)を除くのにさらに有利である。し
かし、当該分野は、tatタンパク質のシステインに富む
領域が細胞取り込みに要求されるかどうか教示していな
い。
【００５３】本発明は、この領域が本明細書中に記載さ
れた輸送タンパク質に存在しないため、tatシステイン
に富む領域に関連する問題が解決される実施態様を含
む。これらの実施態様において、輸送ポリペプチドまた
は輸送ポリペプチド−カーゴ分子複合体の細胞取り込み
は依然として起こる。本発明の好ましい実施態様の１つ
の群では、システインに富む領域の前のアミノ酸配列
が、システインに富む領域に続くアミノ酸配列に直接融
合される。このような輸送ポリペプチドはtatΔcysと呼
ばれ、一般式(tat1−21)−(tat38−n)を有し、ここでn
はカルボキシ末端残基の数、すなわち49-86である。好
ましくは、nは58-72である。下記の実施例から認められ
るように、tatタンパク質のシステインに富む領域の前
のアミノ酸配列が細胞取り込みに必要である。好ましい
輸送ポリペプチド(または輸送部分)は、tatタンパク質
のアミノ酸37-72からなり、そしてtat37-72(配列番号:
２)と呼ばれる。化学的架橋に有用であるので、輸送ポ
リペプチドのアミノ末端のtat残基37のシステインの保
持が好ましい。
【００５４】tatΔcysポリペプチド、tat37-72、および
本発明の他の実施態様の利点は、以下を含む： a)tatタンパク質の本来の活性、すなわちHIVの転写の誘
導が除かれる； b)輸送ポリペプチドのダイマーおよび高マルチマーが避
けられる； c)E.coli中でのtatΔcys遺伝的融合の発現レベルが改善
され得る； d)いくつかの輸送ポリペプチド複合体は、溶解度の増
加、および取扱いの容易さに優れていることを示す；そ
して、 e)いくつかの融合タンパク質は、カーゴ部分による活性
が、システインに富む領域を含む融合物に比較して増加
することを示す。
【００５５】多くの化学的架橋法が知られており、本発
明の輸送ポリペプチドのカーゴ高分子への複合体化にお
そらく適用可能である。多くの公知の化学的架橋法は非
特異的である(すなわち、輸送ポリペプチドまたはカー
ゴ高分子の任意の特定部位に結合するポイントに向けら
れない)。つまり、非特異的架橋剤の使用は、機能部位
または立体的にブロックされている活性部位に作用し
得、複合タンパク質を生物学的に不活性化する。
【００５６】本発明の実施において、結合特異性を増加
する好ましい試みは、架橋するポリペプチドの１つまた
は両方で１回のみまたは数回見出される官能基に直接化
学結合することである。例えば、多くのタンパク質の中
で唯一チオール基を含むタンパク質アミノ酸であるシス
テインはほんの数回生じる。また、例えば、ポリペプチ
ドがリシン残基を含まない場合、第一アミンに特異的な
架橋剤はそのポリペプチドのアミノ末端に選択的であ
る。結合特異性を増加するこの試みを首尾よく利用する
には、ポリペプチドがこの分子の生物学的活性を損失す
ることなく変化し得る、この分子の領域に適格な非常に
良い反応性残基を有することが必要である。
【００５７】下記の実施例に記載したように、架橋反応
におけるその関与が、生物学的活性を妨害しそうなポリ
ペプチド配列部分で起こる場合、システイン残基を置換
し得る。システイン残基を置換する場合、ポリペプチド
の折り畳みで生じる変化を最小にすることが一般的に望
ましい。ポリペプチドの折り畳みにおける変化は、置換
体がシステインと化学的におよび立体的に似ている場合
に最小になる。これらの理由で、セリンがシステインの
置換体として好ましい。下記の実施例に記載したよう
に、システイン残基は架橋の目的のためにポリペプチド
のアミノ酸配列に導入され得る。システイン残基が導入
される場合は、アミノ末端またはカルボキシ末端で、あ
るいはその近辺での導入が好ましい。このようなアミノ
酸配列の改変には、目的のポリペプチドが化学合成で生
成されるのかまたは組換えDNAの発現で生成されるのか
に関わらず、従来の方法が適用される。
【００５８】架橋剤は、ホモ二官能性(homobifunctiona
l、すなわち同じ反応を行う２つの官能基を有する)であ
り得る。好ましいホモ二官能性架橋剤は、ビスマレイミ
ドヘキサン(「BMH」)である。BMHは、緩和な条件(pH 6.5
−7.7)でスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する
２つのマレイミド官能基を含む。２つのマレイミド基は
炭化水素鎖でつながっている。従って、BMHはシステイ
ン残基を含有するポリペプチドの不可逆的な架橋に有用
である。
【００５９】架橋剤はまた、ヘテロ二官能性(heterobif
unctional)であり得る。ヘテロ二官能性架橋剤は２つの
異なる官能基、例えばアミン反応基およびチオール反応
基を有し、フリーのアミンおよびチオールをそれぞれ有
する２つのタンパク質を架橋する。ヘテロ二官能性架橋
剤の例は、スクシンイミジル4−(N−マレイミドメチル)
シクロヘキサン−1−カルボキシレート(「SMCC」)、m−マ
レイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル(「MBS」)、およびスクシンイミド 4−(p−マレイ
ミドフェニル)ブチレート(「SMPB」)、MBSの延長した鎖の
アナログである。これらの架橋剤のスクシンイミジル基
が第一アミンと反応し、チオール反応性マレイミドと反
応して、システイン残基のチオールと共有結合を形成す
る。
【００６０】架橋剤はしばしば水中では低い溶解度を有
する。スルホン酸基のような親水性部分を架橋剤に加え
て水への溶解度を改善し得る。スルホ−MBSおよびスル
ホ−SMCCは水溶性に改変された架橋剤の例である。
【００６１】多くの架橋剤は細胞内の条件下で本来切断
されない複合体を生じる。しかし、いくつかの架橋剤は
ジスルフィドのような共有結合を含み、それは細胞内の
条件下で切断可能である。例えば、ジチオビス(スクシ
ンイミジルプロピオネート)(「DSP」)、トラウト試薬(Tra
ut's reagent)、およびN−スクシンイミジル3−(2−ピ
リジルジチオ)プロピオネート(「SPDP」)は周知の切断可
能な架橋剤である。切断可能な架橋剤の使用で、標的細
胞への送達後、カーゴ部分を輸送ポリペプチドから分離
し得る。直接的なジスルフィド結合もまた有用であり得
る。
【００６２】n−γ−マレイミドブチリルオキシ−スク
シンイミドエステル(「GMBS」)、およびスルホ−GMBSのよ
うな、いくつかの新規の架橋剤は免疫原性が低い。本発
明のいくつかの実施態様において、このような低い免疫
原性は有利であり得る。
【００６３】上記に記載したものを含む多くの架橋剤は
市販で入手可能である。これらの使用のための詳細な指
示は市販者から容易に入手可能である。タンパク質の架
橋および複合体の調製における一般的な参考文献は、S.
S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cros
s−Linking, CRC Press(1991)である。
【００６４】化学的架橋はスペーサーアームの使用を含
み得る。スペーサーアームは、分子内柔軟性を提供する
かまたは複合部分間の分子内距離を調節し、それにより
生物学的活性の保持の助けになり得る。スペーサーアー
ムは、スペーサーアミノ酸を含むポリペプチド部分の形
態であり得る。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖S
PDP」(Pierce Chem. Co., Rockford, IL, カタログ番号2
1651 H)におけるように架橋剤の一部であり得る。
【００６５】本発明の薬学的組成物は、治療用、予防
用、または診断用であり得、そして種々の形態であり得
る。これらは、例えば、固体、半固体、および液体の投
与剤形(例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤または懸濁
剤、噴霧剤、リポソーム、坐剤、注入可能なおよび浸透
可能な溶液、ならびに持続性放出剤型)を含む。好まし
い形態は、意図する投与形態、および治療用、予防用、
または診断用の適用に依存する。本発明の輸送ポリペプ
チド−カーゴ分子複合体は、従来の投与経路(例えば、
経口、経皮、血管内、筋肉内、病巣内(intralesional)
または噴霧経路)により投与され得る。好ましくは、組
成物はまた当業者に公知の従来の薬学的に受容可能なキ
ャリアおよびアジュバントを含む。
【００６６】一般的に、本発明の薬学的組成物は、例え
ばαインターフェロンのような薬学的に重要なポリペプ
チドに用いられたのと類似の方法および組成物を用い
て、処方および投与され得る。従来の投与量は、含まれ
る特定のカーゴに依存して変化することが理解される。
【００６７】本発明の方法および組成物は、ヒトを含む
あらゆる生物に適用され得る。本発明の方法および組成
物はまた、動物およびヒトに子宮内で適用し得る。
【００６８】本発明の多くの薬学的な適用のために、カ
ーゴ分子が成長培地から培養細胞へよりむしろ、体液か
ら体の組織の細胞へ移動することが必要である。従っ
て、培養細胞を含む下記の実施例に加えて、本発明者ら
は、生きている動物への輸送ポリペプチド−カーゴタン
パク質複合体の静脈注射の後の、種々の哺乳類の器官お
よび組織の細胞へのモデルカーゴタンパク質の送達を証
明する実施例を提供した。これらのカーゴタンパク質
は、インビボでの細胞への送達後に生物学的活性を示し
た。
【００６９】次の実施例に記載したように、本明細書で
提供されたアミノ酸およびDNA配列情報を用いて、本発
明の輸送ポリペプチドを、化学合成または組換えDNA法
により生成し得る。公知のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドの化学合成または組換えDNA生成の方法は周知で
ある。ポリペプチドまたはDNAの合成のための自動化装
置は市販で入手可能である。宿主、クローニングベクタ
ー、DNA発現制御配列、およびオリゴヌクレオチドリン
カーもまた市販で入手可能である。
【００７０】周知の技術を用いて、当業者は本明細書中
に記載の好ましい輸送ポリペプチドのアミノ酸配列に、
小さい追加、削除、または置換を容易に行い得る。しか
し、このような変更は本発明の範囲内であると理解され
るべきである。
【００７１】さらに他のウイルス、例えばHIV−2(M.Guy
aderら、「ヒト免疫不全ウイルス２型のゲノムの構成お
よびトランス活性化」, Nature, 326, 662-669頁(198
7))、ウマ伝染性貧血ウイルス(R.Carrollら、「ウマ伝染
性貧血ウイルス/ヒト免疫不全ウイルス１型tat遺伝子キ
メラの発生によるレンチウイルスtat機能性ドメインの
同定」, J.Virol., 65, 3460-67頁(1991)、およびシミア
ン免疫不全ウイルス(L.Chakrabartiら、「マカク由来の
シミアン免疫不全ウイルスの配列およびその他のヒトお
よびシミアンレトロウイルスとの関係」,Nature, 328, 5
43-47頁(1987);S.K.Aryaら、「新規なヒトおよびシミア
ンHIV関連レトロウイルス保有機能トランスアクティベ
ーター(tat)遺伝子」Nature, 328, 548-550頁(1987))由
来のタンパク質が知られている。これらのtatタンパク
質由来であり、そしてtat塩基性領域の存在およびtatシ
ステインに富む領域の不在を特徴とするポリペプチド
が、本発明の範囲内にあることが理解されるべきであ
る。
【００７２】本明細書に記載の発明がさらに十分理解さ
れ得るために、次の実施例を記載する。これらの実施例
は単に例示の目的であり、いかようにも本発明を限定す
るように解釈されるべきではないことが理解されるべき
である。これらの実施例を通して、全ての分子クローニ
ング反応は、他に記載のない限り、J.Sambrookら、Mole
cular Cloning:A Laboratory Manual,第２版, Cold Spr
ing Harbor Laboratory(1989)の方法に従って行った。
【００７３】
【実施例】
＜実施例１；輸送ポリペプチドの生成および精製＞ （組換えDNA）プラスミドpTat72を、tat由来輸送ポリペ
プチドの細菌での生成および輸送ポリペプチド−カーゴ
タンパク質融合物をコードする遺伝子の構築のための開
始クローンとした。本発明者らは、Alan Frankel(The W
hitehead Institute for Biomedical Research, Cambri
dge, MA)からプラスミドpTat72(FrankelおよびPaboに記
載、前出)を得た。プラスミドpTat72は、HIV-1 tatのア
ミノ酸1位から72位をコードする合成遺伝子の挿入によ
り、F.W. Studierら(「クローニングした遺伝子の直接発
現へのT7 RNAポリメラーゼの使用」, Methods Enzymol.,
185, 60-90頁(1990))のpET-3a発現ベクターから得た。t
atコード領域は、E.coliコドン用法を使用し、イソプロ
ピルβ-D-チオガラクトピラノシド(「IPTG」)で誘導可能
なバクテリオファージT7ポリメラーゼプロモーターによ
り運ばれる。IPTG誘導後、tatタンパク質は総E.coliタ
ンパク質の５％を構成した。
【００７４】（細菌からのTat1-72の精製）tat1-72タン
パク質を発現するE.coliを、10容量の25mM Tris-HCl(pH
7.5)、1mM EDTA中に懸濁した。細胞をフレンチプレス
で溶解し、10,000×ｇで１時間遠心分離にかけ不溶性の
残渣を除いた。上清液をQ セファロースファーストフロ
ー(Pharmacia LKB, Piscataway, NJ)イオン交換カラム
(20ml樹脂/60ml溶解物)にのせた。tatタンパク質を沈殿
させる0.5M NaClで素通り画分を処理した。50.2ロータ
ー中35,000rpmで１時間遠心分離することで塩析したタ
ンパク質を集めた。6Mグアニジン−HClで沈殿を溶解
し、50.2ローター中35,000rpmで１時間遠心分離するこ
とにより清澄化した。清澄化した試料を、6M グアニジ
ン-HCl、50mM リン酸ナトリウム(pH 5.4)、10mMDTTで平
衡化したA.5アガロースゲル濾過カラムにのせた。次い
で、同緩衝液で試料を溶出した。tatタンパク質含有ゲ
ル濾過画分を、C4逆相HPLCカラムおよび0-75％のアセト
ニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸でグラディエントを
かけて溶出した。これらの手順を用いて、E.coli培養物
１リットル(推定で１リットル当り6gの細胞)当り約20mg
のtat1-72タンパク質を生成した。これは、全体の約50
％の回収率を示した。
【００７５】SDS-PAGE分析で、tat1-72ポリペプチドは1
0kDの１本のバンドに移動した。精製したtat1-72ポリペ
プチドは、取り込み/トランス活性化アッセイで活性で
あった。このポリペプチドをtat-反応性組織のプラスミ
ノーゲン活性化因子(「tPA」)リポーター遺伝子を含むヒ
ト肝癌細胞の培地に加えた。0.1mMクロロキンの存在下
で、精製tat1-72タンパク質(100ng/ml)は約150倍のtPA
発現を誘導した。
【００７６】（輸送ポリペプチドの化学合成）種々の輸
送ポリペプチドの化学合成のために、市販の自動化シス
テム(AppliedBiosystems 430A型合成機)を用いて、シス
テム製造者の推奨する手段に従った。HF処理によりブロ
ック基を除去し、従来の逆相HPLC法により合成ポリペプ
チドを単離した。全ての合成ポリペプチドの完全性はマ
ススペクトル分析により確認された。
【００７７】＜実施例２；β−ガラクトシダーゼ複合体
＞ （SMCCとの化学的架橋）β−ガラクトシダーゼのアセチ
ル化(システインスルフヒドリル基をブロックする)のた
めに、6.4mgの市販で入手したβ−ガラクトシダーゼ(Pi
erce Chem. Co.,カタログ番号 32101G)を、200μlの50m
Mのリン酸緩衝液(pH 7.5)に溶解した。この200μlのβ
−ガラクトシダーゼ溶液に、30mgのヨード酢酸を４mlの
50mMリン酸緩衝液(pH 7.5)に溶解することにより調製し
た、ヨード酢酸を10μl添加した。(引き続く実験におい
て、ヨードアセトアミドがヨード酢酸の好適な代替物で
あるがわかった。)この反応を、室温で60分間進行させ
た。次いで、反応混合物を小G-25(Parmacia LKB、Pisca
taway、NJ)ゲル濾過カラムにのせ、そしてボイドボリュ
ームを集めることにより、未反応のヨード酢酸からアセ
チル化β−ガラクトシダーゼを分離した。
【００７８】アセチル化β−ガラクトシダーゼのアミン
基のSMCC活性化に先立って、G-25カラムから集めた酵素
の２mlを、Centricon 10(Amicon、Danvers、MA)限外濾
過装置中で、0.3mlまで濃縮した。濃縮したアセチル化
β−ガラクトシダーゼに、15μlのジメチルホルムアミ
ド(「DMF」)中に溶解した19μgのスルホ−SMCC(Pierce Ch
em. Co.、カタログ番号 22322G)を添加した。反応を室
温で30分間進行させた。次いで、小G-25ゲル濾過カラム
を通過させることにより、β−ガラクトシダーゼ−SMCC
を、DMFおよび未反応のSMCCから分離した。
【００７９】輸送ポリペプチドのβ−ガラクトシダーゼ
への化学的架橋のために、β−ガラクトシダーゼ−SMCC
溶液を、200μlの50mMリン酸緩衝液(pH 7.5)に溶解し
た、100μgの輸送ポリペプチド(tat1-72、tat37-72、ta
t38-58GGC、tat37-58、tat47-58GGC、またはtatCGG47-5
8)と混合した。反応を室温で60分間進行させた。次い
で、反応混合物をS-200HRゲル濾過カラム上にのせ、そ
してボイドボリュームを集めることにより、輸送ポリペ
プチド−β−ガラクトシダーゼ複合体を単離した。
【００８０】このようにして得た輸送ポリペプチド−β
−ガラクトシダーゼ複合体は、ウサギ抗tatポリクロー
ナル抗体を用いて実施した従来のウェスタンブロットお
よびELISA分析で、tatに対してアッセイされたとき陽性
の結果を生じた。ウェスタンブロットおよびELISA分析
の一般的論議は、E. HarlowおよびD. Lane、Antibodie
s: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laborat
ory (1988)を参照のこと。スパロース(Superose) 6 (Ph
armacia LKB、Piscataway、NJ)を用いたゲル濾過分析
は、輸送ポリペプチド−β−ガラクトシダーゼ複合体
が、約540,000ダルトンの分子量を有することを示し
た。輸送ポリペプチド−β−ガラクトシダーゼ複合体の
比活性は、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド
(「ONPG」)を用いてアッセイしたとき、β−ガラクトシダ
ーゼ出発物質の比活性の52%であった。ONPGアッセイ手
法は、Sambrookら(前出)の16.66-16.67頁に詳細に記載
されている。
【００８１】（β−ガラクトシダーゼ複合体の細胞取り
込み）複合体を、100μMクロロキンの存在下または非存
在下で、HeLa細胞(ATCC番号CCL2)の培地に、20μg/mlで
添加した。細胞を、37℃/5.5% CO2で、4-18時間インキ
ュベートした。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水(「PB
S」)中の、2%ホルムアルデヒド、0.2%グルタルアルデヒ
ドを用いて4℃で5分間おいて固定化した。次いで、細胞
をPBS中で2 mM MgCl2で3回洗浄し、そしてそれらを37℃
でX-galを用いて染色した。X-galは、β−ガラクトシダ
ーゼによる切断に際し青色の生成物を生じる、無色のβ
−ガラクトシダーゼ基質(5-ブロモ-4-クロロ-3-インド
リル D-ガラクトシド)である。用いたX-gal染色溶液
は、5 mM フェリシアン化カリウム、5mM フェロシアン
化カリウム、および2 mM MgCl2を含むPBSの1mlあたり、
1 mgのX-gal(Bio-Rad、Richmond、CA、カタログ番号 17
0-3455)を含有した。
【００８２】染色した細胞を、400倍までの倍率で顕微
鏡検査した。このような顕微鏡検査は、核染色および細
胞質染色を示した。
【００８３】tat37-72−β−ガラクトシダーゼ複合体ま
たはtat1-72−β−ガラクトシダーゼ複合体を添加した
細胞は、暗青色に染色された。β−ガラクトシダーゼ活
性は、15分程度の展開時間後に観察され得た。比較のた
めに、β−ガラクトシダーゼ活性が、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子のトランスフェクションにより細胞内に導入
されたときは、少なくとも６時間の染色展開時間が、通
常、必要とされることに注目すべきである。クロロキン
処理細胞中で、核染色の強度は、よりわずかに大きかっ
たが、クロロキン非存在下で核染色が見られた。複合体
を形成していないβ−ガラクトシダーゼで処理されたコ
ントロール細胞は、検出可能な染色を示さなかった。
【００８４】（直接ジスルフィドによる切断可能な複
合）各β−ガラクトシダーゼテトラマーは、輸送ポリペ
プチドのシステイン残基への直接ジスルフィド結合に使
用され得る12のシステイン残基を有する。tat37-72のス
ルフヒドリルを還元および次いで保護するために、1.8
mg(411 nmole)のtat37-72を、1mlの、50mMリン酸ナトリ
ウム(pH 8.0)、150 mM NaCl、2mM EDTAに溶解し、そし
てこの溶液を、Reduce-Immカラム(Pierce Chem. Co.、R
ockford、IL)にかけた。室温で30分後、tat37-72を、カ
ラムから、同緩衝液の1 mlのアリコート(aliqouts)を用
いて、0.1mlの10mM 5,5'-ジチオ−ビス(2-ニトロ安息香
酸)(「DTNB」)を含むチューブに溶出した。還元tat37-72
ポリペプチドを3時間DTNBの存在下で静置した。次い
で、9 mlのセファデックスG-10カラム(Pharmacia LKB、
Piscataway、NJ)上のゲル濾過により、tat37-72-TNBか
ら未反応のDTNBを除去した。5mgのβ−ガラクトシダー
ゼを、0.5 mlの緩衝液に溶解し、そしてそれを、9 mlの
セファデックスG-25カラム(Pharmacia LKB、Piscatawa
y、NJ)上で脱塩し、3.8 mg β−ガラクトシダーゼ/ml緩
衝液を得た。脱塩したβ−ガラクトシダーゼ溶液の0.5
mlのアリコートを、0.25mlまたは0.5mlのtat37-72-TNB
調製液と混合し、そして室温で30分間おいて、直接ジス
ルフィド架橋反応を進行させた。9 mlのセファクリルS-
200カラム上のゲル濾過により、未反応のtat37-72-TNB
を、β−ガラクトシダーゼ複合体から除去した。架橋反
応の程度を、遊離したTNBに起因する412nmでの吸光度を
測定することにより間接的にモニターした。このように
して生成された直接ジスルフィド複合体を、細胞に取り
込ませた(データは示さず) (SPDPを用いた切断可能な複合）ヘテロ２官能性の架橋
試薬(「SPDP」)を用いた。この試薬は、切断可能なジスル
フィド結合を含み、以下の間に架橋を形成する：(1)β
−ガラクトシダーゼの第一アミン基、およびtat1-72(代
謝的に35Sで標識された)のシステインスルフヒドリル；
または(2)ローダミンで標識されたβ−ガラクトシダー
ゼの第一アミン基、およびtat37-72のアミノ末端システ
インスルフヒドリル。
【００８５】tat1-72複合体化のために、5mgのβ−ガラ
クトシダーゼを、0.5mlの、50mM リン酸ナトリウム(pH
7.5)、150mM NaCl、2 mM MgCl2中に溶解し、そして9ml
のセファデックスG-25カラム(Pharmacia LKB、Piscataw
ay、NJ)上でβ−ガラクトシダーゼを脱塩した。脱塩し
たβ−ガラクトシダーゼを、室温で２時間、88倍モル過
剰のヨードアセトアミドで処理し、フリーのスルフヒド
リル基をブロックした。未反応のヨードアセトアミドを
ゲル濾過により除去した後、ブロックされたβ−ガラク
トシダーゼを、10倍モル過剰のSPDPを用いて室温で処理
した。２時間後、限外濾過(Ultrafree 30、Millipore、
Bedford、MA)により緩衝液を交換した。次いで、４倍モ
ル過剰の標識されたtat1-72を添加し、そして架橋反応
を、一晩、室温で進行させた。未反応のtat1-72を、9 m
lのセファクリルS-200カラム上のゲル濾過により除去し
た。標識されたtat1-72の既知の比活性を用いると、β
−ガラクトシダーゼテトラマーあたり、1.1のtat1-72ポ
リペプチドが架橋されていると計算された。ONPGアッセ
イを用いて、複合β−ガラクトシダーゼはその酵素活性
の100%を保持することが分かった。細胞に取り込まれた
放射活性およびX-gal染色の測定を用いて、複合体が、
培養HeLa細胞に取り込まれたことを実証した。
【００８６】tat37-72複合体化のために、ヨードアセト
アミド処理(100:1ヨードアセトアミドモル過剰)の前
に、室温で１時間、ローダミンマレイミドの5:1のモル
比でβ−ガラクトシダーゼを標識したことを除いて、上
記段落中で記載の手順を用いた。架橋反応では、20:1の
SPDP比、および10:1のtat37-72比を用いた。この複合生
成物は、約５つのローダミン分子を有し(UV吸光度によ
る)、そしてβ−ガラクトシダーゼテトラマーあたり約
２個のtat37-72部分を有する(ゲル濾過による)と推定さ
れた。この手順からの複合体は、初期β−ガラクトシダ
ーゼ酵素活性の約35%を保持した。X-gal染色およびロー
ダミン蛍光を用いて、SPDP複合体が培養されたHeLa細胞
に取り込まれることを実証した。
【００８７】＜実施例３；β−ガラクトシダーゼ複合体
を用いた動物試験＞複合体の半減期測定および生体分布
分析のために、200 μgの、SMCC−β−ガラクトシダー
ゼ(コントロール)またはtat1-72−β−ガラクトシダー
ゼのいずれかを静脈(「IV」)注射により、Balb/cマウス(J
ackson Laboratories)の尾静脈に、クロロキンと共にま
たはなしで、注射した。30分までの間隔で血液試料を集
めた。30分後、動物を殺し、そして組織化学的分析のた
めに器官および組織を取り出した。
【００８８】ONPGアッセイにより血液試料中のβ−ガラ
クトシダーゼを測定した。ONPGアッセイ手順は、Sambro
okら(前出)の16.66-16.67頁に詳細に記載されている。
β−ガラクトシダーゼおよびtat1-72−β−ガラクトシ
ダーゼは、速やかに血流から浄化された。それらの半減
期は、3-6分と推定した。これらの実験的比較は、tat1-
72輸送ポリペプチドの複合体化は、血液からのβ−ガラ
クトシダーゼのクリアランス速度にほとんどまたは全く
影響しないことを示した。
【００８９】輸送ポリペプチド−β−ガラクトシダーゼ
複合体の細胞取り込みを検出するために、殺した動物
(前出)から、薄い凍結組織切片を調製し、実施例２(前
出)に記載されたように固定化を行い、そしてそれらを
標準X-gal染色法に供した。肝臓、脾臓および心臓が強
く染色された。肺および骨格筋はより弱く染色された。
脳、膵臓、および腎臓は、検出可能な染色を示さなかっ
た。高出力の顕微鏡検査により、組織への血液供給を取
り囲む内皮細胞であると思われる細胞、そして幾つかの
場合には、核の強い染色が示された。
【００９０】＜実施例４；β−ガラクトシダーゼ−ポリ
アルギニン複合体およびβ−ガラクトシダーゼ−ポリリ
シン複合体を用いる細胞取り込み試験＞本発明のtat由
来輸送ポリペプチドの有効性と塩基性アミノ酸単純ポリ
マーの有効性とを比較するために、市販で入手可能なポ
リアルギニン(Sigma Chem Co.、St. Louis、MO、カタロ
グ番号 P-4663)およびポリリシン(Sigma カタログ番号P
-2658)を、上記の実施例２に記載したように、β−ガラ
クトシダーゼに複合体化した。この複合体を、クロロキ
ンと共におよびなしで、HeLa細胞の培地に、1-30μg/ml
で添加した。複合体とのインキュベーションに続いて、
上記の実施例２に記載したように、細胞を固定化し、染
色し、そして顕微鏡検査した。
【００９１】ポリリシン−β−ガラクトシダーゼ複合体
では、低レベルの表面染色が得られたが、核染色は得ら
れなかった。ポリアルギニン−β−ガラクトシダーゼ複
合体では、強い全体の染色が得られたが、tat1-72−β
−ガラクトシダーゼ複合体およびtat37-72−β−ガラク
トシダーゼ複合体より弱い核染色を示した。ポリアルギ
ニン−β−ガラクトシダーゼ複合体の細胞表面結合と、
実際のインターナリゼーションを区別するために、固定
化および染色手順の前に、細胞をトリプシン(一種のプ
ロテアーゼ)で処理した。トリプシン処理は、ポリアル
ギニン−β−ガラクトシダーゼ処理細胞のX-gal染色の
大部分を除去し、よってポリアルギニン−β−ガラクト
シダーゼ複合体は、実際にインターナリゼーションして
いるよりはむしろ、細胞の外側表面に結合していたこと
が示された。対照的に、tat1-72または37-72−β−ガラ
クトシダーゼ複合体に曝された細胞は、トリプシン処理
にかかわらず染色され、よってβ−ガラクトシダーゼの
カーゴは、細胞の内側にあり、そしてトリプシン消化か
ら保護されたことが示された。複合体化していないβ−
ガラクトシダーゼで処理されたコントロール細胞は、検
出可能な染色を示さなかった。
【００９２】＜実施例５；西洋ワサビペルオキシダーゼ
複合体＞ （化学的架橋）tat1-72-HRP複合体およびtat37-72-HRP
複合体を生成するために、市販の入手可能なHRPのカッ
プリングキット(Immunopureマレイミド活性化HRP、Pier
ce Chem. Co.、カタログ番号 31498G)を用いた。キット
中で提供されるHRPは、フリーの-SH基に選択的に反応性
の形態にある。(システインは、20のタンパク質アミノ
酸のなかで、フリーの-SH基を有する唯一のアミノ酸で
ある。) tat1-72を含む輸送ポリペプチド−HRP複合体
実験では、上記の実施例１に記載したように、tat1-72
出発物質を、E.coli中で産生し、そしてそれをHPLCによ
り精製した。精製tat1-72(TFA/アセトニトリル中に溶解
した)の200μgを凍結乾燥し、そして100μlの100mM HEP
ES緩衝液(pH 7.5)、0.5mM EDTA中に再溶解した。50μl
のtat1-72溶液またはtat37-72溶液を、250mM トリエタ
ノールアミン(pH 8.2)中の50μlのImmunopure HRP(750
μgの酵素)に添加した。反応を室温で80分間進行させ
た。これらの条件下で、約70%のHRPが化学的にtat1-72
分子に結合した。結合反応の程度は、SDS-PAGE分析によ
りモニターした。
【００９３】（HRP複合体の細胞取り込み）複合体を、1
00μMのクロロキンの存在下または非存在下で、HeLa細
胞の培地に20μg/mlで添加した。細胞を、37℃/5.5%CO2
で、4-18時間インキュベートした。HRP染色を、4-クロ
ロ-1-ナフトール(Bio-Rad、Richmond、CA、カタログ番
号 170-6431)および過酸化水素HRP基質を用いて展開し
た。引き続く実験で、4-クロロ-1-ナフトールをジアミ
ノベンジジン(Sigma Chem. Co.、St. Louis、MO)に置き
換えた。
【００９４】輸送ポリペプチド−HRP複合体を添加した
細胞は、細胞結合HRP活性を呈示した。短時間複合体に
曝すことにより、小さな斑点状の染色パターンを得、こ
れは多分、エンドサイトーシス小胞(endocytic vesicl
e)中のHRPを反映している。より長くインキュベーショ
ンを行った後、核および細胞質染色の拡散を観察した。
複合体化していないHRPで処理されたコントロール細胞
は、検出可能な染色を示さなかった。
【００９５】＜実施例６；PE ADPリボシル化ドメイン複
合体＞E.coli中で、シュードモナス内毒素(「PE」)を、そ
の全長形態、およびそのＡＤＰリボシル化ドメインの形
態の両方で、クローニングし、そして発現させた。輸送
ポリペプチド−ＰＥ複合体を、遺伝的融合および化学的
架橋の両方で生成した。
【００９６】（プラスミド構築）プラスミドpTat70(Apa
I)を構築するため、BamH1およびEcoR1でpTat72を消化
し、そして以下の合成オリゴヌクレオチドからなる二本
鎖のリンカーを挿入することにより、tatオープンリー
ディングフレーム中に唯一のApaI部位を挿入した：
【００９７】
【化１】
【００９８】リンカーは、tatのC末端であるLysGlnStop
をGlyProStopと置換した。リンカーはまた、PE配列中の
天然に存在するApaI部位により、tat配列のPE ADPリボ
シル化ドメインコード配列とのフレームがあった、融合
に適した唯一のApaI部位を付加する。プラスミドpTat70
PE(配列番号：10)を構築するために、プラスミドCD4(18
1)-PE(392)から、PE ADPリボシル化ドメインをコードす
るApaI-EcoRIフラグメントを取り出した。プラスミドCD
4(181)-PE(392)の構築は、G.Winklerら(「CD4-シュード
モナス外毒素ハイブリッドタンパク質：構造設計および
細胞インターナリゼーションの特徴付けによる効力およ
び治療側面の調節」、AIDS Research and Human Retrovi
ruses、7、393−401頁 (1991))に記載されている。ApaI
-EcoRIフラグメントを、ApaIおよびEcoRIで消化したpTa
t70(ApaI)中に挿入した。
【００９９】プラスミドpTat8PE(配列番号：11)を構築
するために、pTat70PEから214塩基対のNdeI-ApaIフラグ
メントを取り出し、そしてそれを、NdeIおよびApaI付着
末端を有しtat残基1-4および67-70をコードしそして以
下の合成オリゴヌクレオチドからなる、二本鎖のリンカ
ーと置換した：
【０１００】
【化２】
【０１０１】（TAT8-PEの精製）pTat8-PE構築物の発現
は、tatタンパク質のアミノ酸1-4および67-70に融合し
たPE ADPリボシル化ドメインポリペプチドを生じた。pT
at8-PE発現産物(「tat8-PE」)を、以下に記載の化学的架
橋実験において、PE ADPリボシル化ドメイン部分(およ
び複合体化していないコントロール)として取り扱っ
た。８つのtatアミノ酸に対するコドンは、便宜上選択
されたクローニング手順からの人工構築物である。この
PE ADPリボシル化ドメインに融合した、８つのtatアミ
ノ酸は、輸送活性を有さなかった(図２)。
【０１０２】tat8-PEの精製のために、50 mMトリス−HC
l(pH 8.0)、2mM EDTAの20 ml中に、4.5gのpTat8-PE-形
質転換E.coliを懸濁した。フレンチプレスで細胞を溶解
し、そしてSA600ローター中で、10,000 rpmで１時間の
遠心分離により不溶性残渣を除去した。大部分のtat8-P
Eは上清液中にあった。この上清液を、３mlのQ-セファ
ロースファーストフロー(Pharmacia LKB、Piscataway、
NJ)イオン交換カラムにのせた。試料をのせた後、カラ
ムを50mMトリス−HCl(pH 8.0)、2 mM EDTAで洗浄した。
カラムの洗浄後、100mM、200mM、および400mMのNaClを
含む同一の緩衝液を用いて、ステップグラディエント溶
出を行った。tat8-PEは、200 mM NaClで溶出した。イオ
ン交換クロマトグラフィーに続いて、さらに、スーパー
デックス(superdex)75FPLCカラム(Pharmacia LKB、Pisc
ataway、NJ)上でのゲル濾過によりtat8-PEをさらに精製
した。ゲル濾過カラムを、50mM HEPES(pH 7.5)を用いて
平衡化した。次いで、試料を加え、平衡化緩衝液を用い
て0.34ml/分で溶出を行った。1.5分の画分を集め、そし
て-70℃でtat8-PE画分を貯蔵した。
【０１０３】（TAT8-PEの架橋）PE ADPリボシル化ドメ
インは、システイン残基を有さないので、輸送ポリペプ
チド−tat8-PE複合体化にスルホ−SMCC(Pierce Chem. C
o.、Rockford、IL カタログ番号22322 G)を用いた。複
合体化は、２工程反応手順で行った。第１番目の反応工
程では、tat8-PE(3mg/ml)を、10mM スルホ−SMCCを有す
る50mM HEPES(pH7.5)中、室温で40分間処理した。(スル
ホ−SMCCを、1M HEPES、pH 7.5中の100mMストック溶液
として反応液に添加した。) tat8-PE−スルホ−SMCC
を、未反応のスルホ−SMCCから、25 mM HEPES (pH 6.
0)、25mM NaClで平衡化したP6DGカラム(Bio-Rad、Richm
ond、CA)上のゲル濾過により分離した。第２番目の反応
工程で、tat8−PE−スルホ−SMCC(1.5mg/ml 100mM HEPE
S (pH 7.5)、1mM EDTA)を、精製tat37-72(600μM最終濃
度)と、室温で１時間反応させた。架橋反応を停止する
ために、システインを添加した。架橋反応生成物を、SD
S-PAGEにより分析した。約90%のtat8-PEが、これらの条
件下で、tat37-72輸送ポリペプチドに架橋した。複合生
成物の約半分が、１つの輸送ポリペプチド部分を有し、
そして約半分が、２つの輸送ポリペプチド部分を有し
た。
【０１０４】（PE ADP リボシル化の無細胞アッセイ）P
Eリボシル化ドメインは、輸送ポリペプチドへの複合体
化後、その生物学的活性(すなわち、破壊的なリボソー
ム改変)を保持したことを確かめるために、輸送ポリペ
プチド−PE ADPリボシル化複合体のインビトロ(すなわ
ち、無細胞)翻訳に対する効果を試験した。各インビト
ロ翻訳実験のために、新鮮な翻訳調合液(cocktail)を調
合し、そしてそれを氷上で保存した。インビトロ翻訳調
合液は、200μlウサギ網状赤血球溶解液(Promega、Madi
son、WI)、2μl 10mM ZnCl2(必要に応じて)、メチオニ
ンを除く20のタンパク質アミノ酸混合物の4μl、および
20μl35S-メチオニンを含んでいた。9μlの翻訳調合液
に、１〜1000 ngの輸送ポリペプチド−PE複合体(好適に
は１μlの容量で)またはコントロールを添加し、そして
この混合液を、30℃で60分間プレインキュベートした。
次いで、0.5μlのBMVRNAを各試料に添加し、そして、30
℃でさらに60分間インキュベートした。試料あたり50%
グリセロールの５μlを添加した後、試料を-70℃で貯蔵
した。SDS-PAGE法により、インビトロ翻訳反応生成物を
分析した。SDSゲル上の各レーンあたり、2μlの各翻訳
反応混合物(適切な容量のSDS-PAGE試料緩衝液を添加し
て)をのせた。電気泳動後、フルオログラフィーによ
り、35Sを含むインビトロ翻訳生成物を可視化した。
【０１０５】上記段落中に記載した手法を用いて、tat1
-70輸送ポリペプチドに遺伝子的に融合されたPE ADPリ
ボシル化ドメインは、生物学的活性を有さない、すなわ
ち、インビトロ翻訳を阻害しないことが分かった。これ
に対し、同一の手順を用いて、tat37-72輸送ポリペプチ
ドに化学的に架橋されたPE ADPリボシル化ドメインは、
完全な生物学的活性を保持した、すなわち、複合体化し
ていないPE ADPリボシル化ドメインコントロール同様
に、インビトロ翻訳活性を阻害したことが分かった(図
２)。
【０１０６】（PE ADP リボシル化の細胞毒性アッセ
イ）tat37-72-PE ADPリボシル化ドメイン複合体に関わ
るさらなる試験において、複合体を、100μMクロロキン
の存在下または非存在下で、培養HeLa細胞に添加した。
次いで、細胞抽出物中のトリクロロ酢酸(「TCA」)沈澱性
の放射活性により示されるように、インビボタンパク質
合成を測定することにより細胞毒性をアッセイした。
【０１０７】この細胞毒性アッセイは以下のように行っ
た。HeLa細胞層を破壊し、細胞を遠心分離し、そしてそ
れらを培養液に2.5 x 104/mlの密度で再懸濁した。24ウ
ェルプレートを用いるときウェルあたり0.5 mlの懸濁液
を、または48ウェルプレートを用いるときウェルあたり
0.25 mlの懸濁液を用いた。細胞を沈降させるために少
なくとも４時間放置した後、100 μlのPBS中に溶解し
た、複合体または複合体化していないコントロールをウ
ェルに添加した。これら細胞を、複合体またはコントロ
ールの存在下で、37℃、60分インキュベートし、次い
で、各細胞に0.5 mlの新鮮培地を添加し、そしてさらに
5-24時間細胞をインキュベートした。このインキュベー
ションに続いて、各ウェルから培地を除去し、そして約
0.5 mlのPBSで１回細胞を洗浄した。次いで、１μCiの3
5S-メチオニン(Amersham、インビボ細胞標識グレードS
J.1015)を、ウェルあたり100μlあたり添加し、これら
細胞を２時間インキュベートした。２時間後、放射活性
培地を除去し、そして細胞を３回冷5%TCAを用いて、そ
して次いで１回PBSを用いて洗浄した。100μlの0.5 M N
aOHを各ウェルに添加し、そして少なくとも45分間、細
胞溶解そしてタンパク質溶解が起こるように放置した。
次いで、50μlの1 M HClを各ウェルに添加し、そして各
ウェルの全内容物を、放射活性の液体シンチレーション
測定のためにシンチレーション液に移した。
【０１０８】クロロキンの非存在下では、輸送ポリペプ
チド−PE ADPリボシル化ドメイン複合体を用いた処理に
応じて(複合体化していないPE ADPリボシル化ドメイン
を用いた処理に応じてではなく)細胞タンパク質合成
の、明瞭な投与量依存性の阻害があった。これらの結果
は図２に要約される(黒塗り、非複合体；斜線、複合
体)。tat37-72に複合体化されたとき、PE ADPリボシル
化ドメインは、tat1-72に複合体化したときより3〜10倍
効果的に輸送されるようであった。さらに、輸送ポリペ
プチドtat38-58GGC、tat37-58、tat47-58GGC、およびta
tCGG-47-58もまた、PE ADPリボシル化ドメインに複合体
化した。これら複合体のすべては、生物学的に活性なPE
ADPリボシル化ドメインの細胞取り込みの結果をもたら
した(データ示さず)。
【０１０９】＜実施例７；リボヌクレアーゼ複合体＞ （化学的架橋）7.2mgのウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ、T
ype12A(Sigma Chem. Co.、St. Louis、MO、カタログ番
号 R5500)を、200μl PBS(pH 7.5)中に溶解した。この
リボヌクレアーゼ溶液に、1.4 mgのスルホ−SMCC(Pierc
e Chem. Co.、Rockford、IL、カタログ番号22322H)を添
加した。ボルテックスで撹拌した後、反応を室温で１時
間進行させた。未反応のSMCCを、リボヌクレアーゼ−SM
CCから、反応混合液を9mlのP6DGカラム(Bio-Rad、Richm
ond、CA)を通過させ、そして0.5ml画分を集めることに
より除去した。ボイドボリュームのピーク画分(リボヌ
クレアーゼ−SMCC複合体を含む)を、280nmでのUV吸光度
をモニターすることにより同定した。プールしたリボヌ
クレアーゼ−SMCC含有画分を５つの等量のアリコートに
分けた。４つのリボヌクレアーゼ−SMCCアリコートの各
々に、以下のtat残基に相当する化学合成輸送ポリペプ
チドを添加した：37-72(「37-72」)；38-58、プラス、カ
ルボキシ末端のGGC(「38-58GGC」)；37-58(「CGG37-58」)；
または47-58、プラス、アミノ末端(「CGG47-58」)のCGG。
輸送ポリペプチドリボヌクレアーゼ複合体化反応を、室
温で２時間、そして次いで４℃で一晩進行させた。10-2
0%グラディエントゲル上のSDS-PAGEにより反応生成物を
分析した。架橋効率は、輸送ポリペプチドtat38-58GG
C、tat37-58、およびtatCGG47-58に対しては約60%、そ
してtat37-72に対しては40%であった。改変種の中で
は、72%が１つの、そして25%が２つの輸送ポリペプチド
置換体を含んでいた。
【０１１０】（Tat37-72-リボヌクレアーゼ複合体の細
胞取り込み）細胞を、10%のドナー子ウシ血清およびペ
ニシリウム/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ
の改変イーグル培地において、組織培養インキュベータ
ー中、37℃で維持した。細胞の取り込みアッセイのため
に、24ウェルプレート中に105細胞をプレートし、それ
らを一晩培養させた。これらの細胞をダルベッコのPBS
で洗浄し、そして80μMクロロキンを含む300μlのPBS中
に溶解したリボヌクレアーゼ複合体を、0、10、20、4
0、および80μg/ml濃度で添加した。37℃で1.25時間の
インキュベーションの後、750μlの成長培地を添加し、
そしてさらに細胞試料を一晩インキュベートした。一晩
のインキュベーションの後、細胞をPBSを用いて１回洗
浄し、そしてそれらを35Sメチオニン(1μCi/ウェル)を
含む、メチオニンなしの最小必須培地(Flow Labs)(250
μl/ウェル)中で１時間インキュベートした。放射活性
メチオニンを用いた１時間のインキュベーションの後、
この培地を除去し、そして細胞を３回、5%TCA(1 ml/ウ
ェル/洗浄)で洗浄した。次いで、ウェルあたり250μlの
0.5M NaOHを添加した。室温で１時間後、各ウェルの内
容物の200μlをシンチレーションバイアルにピペットで
移し、100μlの1M HClおよび4mlのシンチレーション液
を添加した。各バイアルの内容物を完全に混合した後、
液体シンチレーションカウンティングにより、各試料中
の放射活性を測定した。
【０１１１】細胞取り込みの結果を図３に要約する(黒
四角、輸送部分を含まないリボヌクレアーゼ−SMCC；黒
丸、tat37-72−リボヌクレアーゼ；黒三角、tat38-58GG
C−リボヌクレアーゼ；黒菱形、tatCGG38-58−リボヌク
レアーゼ；白四角、tatCGG47-58−リボヌクレアーゼ)。
輸送ポリペプチドtat38-58GGCは、tat37-72と同様に、
またはわずかに良好に機能した。輸送ポリペプチドtatC
GG47-58は減少した活性を有した(データ示さず)。この
ポリペプチドが減少した取り込み活性を有したか否か、
またはリボヌクレアーゼへの塩基性領域の近接が酵素活
性を妨害したか否かは不明である。
【０１１２】カチオン交換クロマトグラフィー(BioCA
D、perfusion chromatography system, PerSeptive Bio
systems)を用いて、１つまたは２つの輸送ポリペプチド
部分を有するリボヌクレアーゼ複合体を精製した。
【０１１３】＜実施例８；タンパク質キナーゼＡインヒ
ビター複合体＞ （化学的架橋）タンパク質キナーゼＡインヒビター(「PK
AI」)ペプチド(アミノ酸20個)をBachemCalifornia(Torre
nce, CA)から購入した。PKAIの輸送ポリペプチドへの化
学的架橋のために、スルホ-MBS(10mMで)またはスルホ-S
MPB(15mMで)のいずれかを使用した。これらの架橋試薬
はいずれも、チオール基および一級アミン基に対してヘ
テロ二官能性である。PKAIにはリシン残基およびシステ
イン残基がないので、スルホ-MBSおよびスルホ-SMPBは
いずれも、選択的にPKAIのアミノ末端への架橋を標的に
する。PKAIを２mg/mlの濃度で、50mMのHEPES(pH 7.5)、
25mMのNaClと共に、室温で50分間、これらの架橋試薬の
いずれかと反応させた。スルホ-MBS反応混合物は、スル
ホ-MBSを10mM、およびDMFを20％含有していた。スルホ-
SMPB反応混合物は、スルホ-SMPBを15mM、およびジメチ
ルスルホキシド(「DMSO」)を20％含有していた。このPKAI
−架橋剤付加物を、Ｃ4カラムを用いる逆相HPLCによっ
て精製した。0.1％のトリフルオロ酢酸を含有するアセ
トニトリルの20〜75％の勾配を用いて、Ｃ4カラムから
試料を溶出させた。凍結乾燥によって付加物からアセト
ニトリルおよびトリフルオロ酢酸を除去し、そしてこの
付加物を25mMのHEPES(pH 6.0)、25mMのNaClに再溶解し
た。tat1-72またはtat37-72を添加し、そして１ＭのHEP
ES(pH 7.5)を添加して100mMにすることによって、反応
混合物のpHを7.5に調整した。その後、架橋反応を室温
で60分間進行させた。
【０１１４】輸送ポリペプチド：PKAI比を変えることに
よって、架橋の程度を調節した。SDS-PAGEによって架橋
反応生成物を分析した。tat37-72を用いたときは、単一
の新たな電気泳動バンドが架橋反応で生成した。この結
果は、１分子のtat37-72が、１分子のPKAIに付加するこ
とと一致した。tat1-72を用いたときは、６個の新たな
生成物が架橋反応で生成した。この結果は、tat1-72に
複数のシステイン残基が存在する結果として、tat1-72
ポリペプチド１個あたりに複数のPKAI分子が付加するこ
とと一致する。PKAIをモルで大過剰に架橋反応に添加し
たとき、tat1-72の１個につき５個または６個のPKAI部
分を有する複合体だけを得た。
【０１１５】（PKAI活性についてのインビトロリン酸化
アッセイ）PKAIの生物学的活性の保持について、スルホ
-MBSによって架橋した複合体を試験するために、インビ
トロのリン酸アッセイを用いた。このアッセイでは、ヒ
ストンＶを、PKAI(またはPKAI複合体)の存在または非存
在下の、タンパク質キナーゼＡによるリン酸化の基質と
して供した。次いで、SDS-PAGEを用いて、リン酸化の程
度におけるPKAIに依存する差異をモニターした。それぞ
れの反応において、PKAIまたはPKAI複合体の量を変え
て、タンパク質キナーゼＡ(Sigma)の触媒サブユニット
５単位と、37℃で30分間インキュベートした。アッセイ
反応混合物は、24mMの酢酸ナトリウム(pH 6.0)、25mMの
MgCl2、100mMのDTT、50μCiの［γー32Ｐ］ATP、および
２μgのヒストンＶを全反応容積40μl中に含有してい
た。このアッセイを用いて、tat1-72またはtat37-72に
複合体化体化したPKAIは、非結合PKAIと同様に、リン酸
化を阻害することを見出した(データは示さない)。
【０１１６】（細胞アッセイ）PKAIおよび輸送ポリペプ
チド−PKAI複合体の細胞取り込みを試験するために、cA
MP応答性発現制御配列の制御下にあるクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ(「CAT」)リポーター遺
伝子を含有する培養細胞を用いた。このようにCAT活性
を測定することによってタンパク質キナーゼＡの活性を
間接的に定量した。このアッセイは、J.R.Groveらによ
って詳細に説明されている(「組換えタンパク質キナーゼ
インヒビターを用いた、予備結合(Probind)cAMP関連遺
伝子発現」、Molecular Aspects of Cellular Regulatio
n, Vol.6, P.CohenおよびJ.G.Folkes編、Elsevier Scie
ntific, Amsterdam, pp.173-95 (1991))。
【０１１７】このアッセイを用いて、PKAIまたは輸送ポ
リペプチド−PKAI複合体の全てに活性がないことを見出
した。この結果は、PKAI部分が、細胞中に入る際、急速
に分解を受けているかもしれないということを示唆し
た。
【０１１８】（PKAIとTat37-72−β−ガラクトシダーゼ
との架橋）本発明者らは、以前に、tat37-72−β−ガラ
クトシダーゼの細胞取り込みがクロロキンに依存性がな
いことを見出した(上記実施例２)。それ故に、急速分解
に対してPKAIを保護することができるように、PKAIをta
t37-72−β−ガラクトシダーゼに架橋した。
【０１１９】β−ガラクトシダーゼを、室温で30分間、
20mMのDTT(還元剤)で処理し、そしてMES緩衝液(pH ５)
中のG50カラムでのゲル濾過によってDTTを除去した。還
元したβ−ガラクトシダーゼをSMPB活性化したPKAI(上
記)とpH 6.5で60分間反応させた。残存するフリーのス
ルフヒドリル基をブロックするために、Ｎ−エチルマレ
イミドまたはヨードアセトアミドを添加した。SDS-PAGE
分析は、β−ガラクトシダーゼの少なくとも95％が結合
したことを示した。結合したβ−ガラクトシダーゼ生成
物の約90％が、サブユニットあたり１個のPKAIを含有
し、そして約10％が２個のPKAIを含有していた。PKAI−
β−ガラクトシダーゼ複合体を10倍モル過剰のスルホ−
SMCCで処理した。次に、このPKAI−β−ガラクトシダー
ゼ−SMCCをtat1-72と反応させた。SDS-PAGE分析によっ
て、PKAI−β−ガラクトシダーゼ：tat1-72の比は、
１：0.5であるように思われた。最終生成物約100μgを
生成した。沈殿の問題のために、溶液中の最終生成物の
濃度は、100μg/mlに制限された。
【０１２０】＜実施例９；E2リプレッサー複合体＞輸送
ポリペプチド−E2リプレッサー複合体の細胞取り込みお
よびE2リプレッサー活性を試験するために、E2依存性の
リポータープラスミドおよびE2発現プラスミドを、SV40
で形質変換されたアフリカミドリザル(African green m
onkey)腎臓(「COS7」)細胞に、同時にトランスフェクトし
た。次に、トランスフェクトした細胞を、輸送ポリペプ
チド−E2リプレッサー複合体(遺伝子融合または化学的
架橋によって作製した)、または適切なコントロールに
曝した。以下に記載の抑制アッセイは、本質的にBarsou
mらによって説明されている(前出)。
【０１２１】（抑制アッセイ細胞）COS7細胞をアメリカ
ンタイプカルチャーコレクション、Rockville, MD(ATCC
番号CRL 1651)から得た。このCOS7細胞を、10％の胎仔
ウシ血清(JRH Biosciences,Lenexa, KS)および４mMグル
タミン(「成長培地」)を含むダルベッコの改変イーグル培
地(GIBCO, Grand Island, NY)で増殖させた。細胞のイ
ンキュベーション条件は、37℃でCO25.5％であった。
【０１２２】（抑制アッセイプラスミド）E2依存性リポ
ータープラスミド、すなわちpXB332hGHは、切形SV40初
期プロモーター(３個の上流E2結合部位を有する)によっ
て作動する、ヒト成長ホルモンリポーター遺伝子を含有
していた。このhGHリポータープラスミド、すなわちpXB
332hGHをBarsoumらの記載(前出)に記載のように構築し
た。
【０１２３】完全長のHPV E2遺伝子の発現のために、プ
ラスミドpAHE2(図４)を構築した。プラスミドpAHE2は、
上流のSV40エンハンサーによって増強されたアデノウィ
ルス主要後期プロモーターに作動可能に連結されたHPV
株16からのE2遺伝子を有する。プラスミドpHPV16(pBR32
2中にクローン化された完全長のHPV16ゲノム)からHPV E
2遺伝子を単離した。この遺伝子は、M.Durstら、「子宮
頚癌から得た乳頭腫ウィルスDNAおよび種々の地理的領
域から得た癌生体検査試料におけるその罹患率」、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、80、pp.3812〜15(1983)に、Tt
h111I−AseIフラグメントとして記載されている。HPV16
ゲノムにおいて、Tth111Iはヌクレオチド2711で切断
し、そしてAseIはヌクレオチド3929で切断する。DNAポ
リメラーゼＩクレノウ反応で、Tth111I−AseIフラグメ
ントの末端を平滑化し、そしてBamHIリンカー(New Engl
and Biolabs、カタログ番号1021)を連結した。このリン
カーを有するフラグメントをBamHI切断プラスミドpBG33
1に挿入して、プラスミドpAHE2を作製した。
【０１２４】プラスミドpBG331は、SV40ポリアデニル化
シグナルの下流のBamHI部位がないこと以外は、pBG312
(R.L.Cate ら、「ミューラー(Mullerian)阻害物質のため
の、ウシおよびヒト遺伝子の単離、ならびに動物細胞で
のヒト遺伝子の発現」、Cell,45,685〜98頁(1986))と同
じで、プロモーターとSV40イントロンとの間のBamHI部
位が唯一になる。pBG312をBamHIで部分的に消化し、線
状化したプラスミドをゲル精製し、DNAポリメラーゼＩ
クレノウ処理によって平滑末端を形成し、自己連結さ
せ、そして所望の、BamHI部位が欠失したプラスミドを
スクリーニングすることによって、所望でないBamHI部
位を除去した。
【０１２５】（E2リプレッサータンパク質の細菌による
産生）E2リプレッサータンパク質の一つ、E2.123は、ア
ミノ末端に付加したMetValを有するHPV16 E2のカルボキ
シ末端の121個のアミノ酸からなっていた。また、E2.12
3CCSSと呼ばれる、E2.123の変異体を用いた。E2.123
は、HPV16 E2のアミノ酸位置251、281、300、および309
にシステイン残基を有する。E2.123CCSSでは、位置300
および309でシステイン残基をセリンに変え、そして位
置299でリシン残基をアルギニンに変えた。位置300およ
び309のシステイン残基を置換し、その結果、システイ
ン依存性の化学的架橋がE2リプレッサーのアミノ末端部
分では起こるが、E2の最小のDNA結合／二量体化ドメイ
ンでは起こらない。最小のDNA結合ドメインでの架橋
は、リプレッサーの生物学的活性を妨害する可能性があ
ると考えた。
【０１２６】プラスミドpET8c-123(図５；配列番号:14)
の構築のために、プラスミドpHPV16をテンプレートとし
て用いて、標準的なポリメラーゼ連鎖反応(「PCR])手法
によって必要なDNAフラグメントを生成した。(PCR手法
の一般的な議論については、Sambrookら、上述の14章を
参照。自動化されたPCR装置および化学物質が市販され
ている。) EA52(374個の塩基対のE2-123フラグメント
の5'末端のためのPCRオリゴヌクレオチドプライマー)の
ヌクレオチド配列は、配列表の配列番号:15に記載して
いる。EA54(E2-123フラグメントの3'末端のために用い
られるPCRオリゴヌクレオチドプライマー)のヌクレオチ
ド配列は、配列表の配列番号:16に記載している。このP
CR産物をNcoIおよびBamHIを用いて消化し、そして得ら
れたフラグメントを、NcoI／BamHIで消化した発現プラ
スミドpET8c(Studierら、前出)にクローン化して、プラ
スミドpET8c-123を作製した。
【０１２７】異なる5'オリゴヌクレオチドPCRプライマ
ーを用いた、同様の手順を用いることによって、HPV16
E2のカルボキシ末端の83個のアミノ酸に対するコドンに
直ちにつながる、メチオニンコドンおよびアラニンコド
ンを含む、260個の塩基対のフラグメント(「E2-85」)を得
た。EA57(すなわちE2-85を生成するためのPCR5'プライ
マー)のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号:34に記
載している。
【０１２８】E2.123CCSSの細菌による産生のための、プ
ラスミドpET8c-123CCSS(図６；配列番号:17)を構築する
ために、PCR手法によって、882 bp PstI-EagI DNAフラ
グメントを合成した。PCRテンプレートは、pET8c-123で
あった。PCRプライマーの一つ(374.140と呼ぶ)は以下の
ように３個のアミノ酸の変化の全てをコードした：
【０１２９】
【化３】
【０１３０】もう一つのPCRプライマー374.18は、以下
の配列を有していた：
【０１３１】
【化４】
【０１３２】このPCR反応生成物をPstIプラスEagIを用
いて消化し、そして882 bpフラグメントを標準手法で単
離した。最終工程は、３切片(3-piece)結合でのpET8c-1
23CCSSの生成であり、図６に示されるように、pET8c-12
3から得られた3424 bp EcoRI-EagIフラグメントと、882
bp PCRフラグメントおよび674-bp PstI-EcoRI pET8c-1
23フラグメントとを結合した。DNA配列分析によって構
築を確認した。E2.123およびE2.123CCSSタンパク質の産
生のために、Studierによる記載(前出)に記載されたよ
うに、E.coliのBL21(DE3)pLysS株で、プラスミドpET8c-
123およびpET8c-123CCSSを発現させた。
【０１３３】（E2リプレッサータンパク質の精製）3.6g
の凍結したpET8c-123−形質転換E.coli細胞を解凍し、
そしてこれらの細胞を、25mMのトリス−HCl(pH 7.5)、
0.5mMのEDTA、2.5mMのDTT、およびプロテアーゼインヒ
ビター(１mMのPMSF、３mMのベンズアミジン、50μg/ml
のペプスタチンＡ、10μg/mlのアプロチニン)を含む35m
lに懸濁した。10,000psiでフレンチプレスを２回通過さ
せることによって、これらの細胞を溶解した。SA600ロ
ータを用いて、12,000rpmで１時間、溶解物を遠心分離
した。E2.123タンパク質は、上清液の中に存在した。こ
の上清液に、MES緩衝液(pH ６)を25mMまで、MES緩衝液
(pH ５)を10mMまで、そしてNaClを125mMまで添加した。
次に、この上清液を、２mlのＳセファロースファースト
フローカラムに６ml/時間で付与した。カラムに付与し
た後、カラムを50mMのトリス−HCl(pH 7.5)と１mMのDTT
とを用いて洗浄した。その後、50mMのトリス−HCl(pH
7.5)、１mMのDTT中の200mM、300mM、400mM、500mM、700
mM、および1000mMのNaClを用いた、ステップグラディエ
ント溶出(２ml/ステップ)を行った。E2.123リプレッサ
ータンパク質は、500mMおよび700mMのNaCl画分中に溶出
された。SDS-PAGE分析によって、E2.123リプレッサーの
純度は９５％を超えていることが示された。
【０１３４】３．０ｇの凍結したpET8c-123CCSS−形質
転換E.coli細胞を解凍し、そしてこれらの細胞をpET8c-
123−形質転換細胞に対して用いたのと同じ緩衝液(上
記)30mlに懸濁した。細胞溶解、不溶性の細胞残渣の除
去、ならびにMES緩衝液およびNaClの添加もまた、E2-12
3の精製について記載されたように行った。E2.123CCSS
のための精製手順は、MES緩衝液およびNaClの添加の後
は異なった。なぜなら、手順のこの時点で、沈殿がE2.1
23CCSSと共に生成したからである。この沈殿を遠心分離
によって除去し、そして沈殿と上清液はいずれも実質的
なE2リプレッサー活性を有することを見出した。それ故
に、これらを両方とも精製工程にかけた。上清液を２ml
のＳセファロースファーストフローカラム(Pharmacia L
KB,Piscataway,NJ)に６ml/時間で付与した。カラムに付
与した後、このカラムを50mMのトリス−HCl(pH 7.5)、
１mMのDTTを用いて洗浄した。カラムの洗浄後、50mMの
トリス−HCl(pH 7.5)、１mMのDTT中の300mM、400mM、50
0mM、700mM、および1000mMのNaClを用いて、ステップグ
ラディエント溶出(２ml/ステップ)を行った。E2.123CCS
Sタンパク質は、700mMのNaClで溶出した。SDS-PAGE分析
によって、この純度は95％を超えていることが示され
た。E2.123CCSSの沈殿を、25mMのトリス−HCl(pH 7.
5)、125mMのNaCl、１mMのDTT、および0.5mMのEDTAを含
む7.5mlに溶解した。溶解した物質を２mlのＳセファロ
ースファーストフローカラムにのせ、そしてE2.123およ
び沈殿しなかったE2.123CCSSについて記載したようにカ
ラムを洗浄した。300mM、500mM、700mM、および1000mM
のNaClを用いて、ステップグラディエント溶出(２ml/ス
テップ)を行った。E2リプレッサーは、500〜700mMのNaC
l画分で溶出した。SDS-PAGE分析によって、その純度は9
8％を超えていることが示された。E2.123およびE2.123C
CSSタンパク質の精製後直ちに、グリセロールを最終濃
度15％(v/v)まで添加し、そして瞬間凍結(液体窒素)ア
リコートを−70℃で保存した。１mg/mlでの吸光係数1.8
を用いて、280nmにおけるＵＶ吸収によって、精製E2リ
プレッサーを定量した。
【０１３５】（化学的架橋）実施例１の記載の通りに、
tatアミノ酸37-72からなる輸送ポリペプチドの化学合成
を行った。ポリペプチド(５mg/ml)を、10mMのMES緩衝液
(pH 5.0)、50mMのNaCl、0.5mMのEDTA(吸光係数は１ml/m
lで0.2)に溶解した。この輸送ポリペプチド溶液に、ビ
スマレイミドヘキサン(「BMH」)(Pierce Chemical Co., R
ockford, IL、カタログ番号22319G)ストック溶液(6.25m
g/ml DMF)を最終濃度1.25mg/mlになるように、そしてpH
7.5のHEPES緩衝液ストック溶液(１Ｍ)を最終濃度100mM
になるように加えた。室温で30分間、このBMHをタンパ
ク質と反応させた。次に、10mMのMES(pH ５)、50mMのNa
Cl、0.5mMのEDTAで平衡化したG-10カラム上でゲル濾過
することによって、タンパク質−BMHを未反応のBMHから
分離した。輸送ポリペプチド−BMH複合体のアリコート
を−70℃で保存した。
【０１３６】輸送ポリペプチド−BMH複合体のE2リプレ
ッサーへの架橋のために、E2リプレッサータンパク質を
その保存緩衝液から取り出した。このE2リプレッサータ
ンパク質を、25mMのMES(pH6.0)、0.5mMのEDTAの３容量
で希釈し、そして樹脂１mlあたりタンパク質５mgで、Ｓ
セファロースファーストフロー(Pharmacia LKB,Piscata
way, NJ)にバッチ式でロードした。タンパク質をロード
した樹脂のスラリーをカラムに注いだ後、このカラムを
25mMのMES(pH 6.0)、0.5mMのEDTA、250mMのNaClで洗浄
した。次に、800mMのNaClを含有する同じ緩衝液を用い
て、結合したE2リプレッサータンパク質をカラムから溶
出した。E2リプレッサーを含有する溶出液を、25mMのME
S(pH 6.0)、0.5mMのEDTAを用いて、１mg/mlまで希釈し
た。E2リプレッサータンパク質およびBMH活性化輸送ポ
リペプチドを有するバッチのそれぞれを用いて行った、
試験的な架橋の研究から、１mgのE2リプレッサータンパ
ク質を0.6mgのBMH活性化輸送ポリペプチドで処理するこ
とで、E2リプレッサーホモダイマー１個あたり輸送分子
１個の所望の組み込みを生ずることを確認した。代表的
には、２mlのE2リプレッサー(１mg/ml)を、300μlのtat
37-72−BMH(４mg/ml)および200μlの１ＭのHEPES(pH 7.
5)と混合した。この架橋反応を、室温で30分間進行させ
た。２−メルカプトエタノールを最終濃度14mMまで添加
することによって、架橋反応を停止させた。SDS-PAGE分
析によって、架橋の程度を測定した。tat37-72−E2リプ
レッサー複合体のアリコートを−70℃で保存した。同一
の手順を用いて、tat37-72輸送ポリペプチドをHPVE2 12
3リプレッサータンパク質およびHPVE2 CCSSリプレッサ
ータンパク質に架橋した。
【０１３７】（E2リプレッサー複合体の細胞取り込み）
E2抑制アッセイには、COS7細胞にトランスフェクトした
プラスミドの一過性発現を用いた。E2抑制アッセイの手
順は、Barsoumらの記載の手順(前出)と同様であった。
２つの別々のトランスフェクション(「EP1」および「EP2」)
において、エレクトロポレーション(electroporation)
によって４×106個のCOS7細胞(採収時で約50％集密度)
をトランスフェクトした。トランスフェクションEP1で
は、20μgのpXB332hGH(リポータープラスミド)プラス38
0μgの超音波処理したサケ精子キャリアDNA(Pharmacia
LKB, Piscataway, NJ)を用いた。トランスフェクション
EP2では、20μgのpXB332hGHプラス30μgのpAHE2(E2トラ
ンスアクティベーター)および350μgのサケ精子キャリ
アDNAを用いた。Bio-Rad Gene Pulserを用いて、270ボ
ルト、960μFDで、約11ミリ秒のパルス時間で、エレク
トロポレーションを行った。エレクトロポレーションに
続いて、６ウェルの皿(6-well dish)に、ウェル１個当
たり２×105個の細胞を接種した。エレクトロポレーシ
ョン後５時間で、成長培地を吸引し、細胞を成長培地と
共に洗浄し、そして1.5mlの新鮮な成長培地をそれぞれ
のウェルに加えた。この時点で、クロロキン(「CQ」)を最
終濃度80μMまで添加した(または、ブランク溶液をコン
トロールに添加した)。次に、tat37-72架橋したE2.123
(「TxHE2」)またはtat37-72架橋したE2.123CCSS(「TxHE2CC
SS」)を添加した。これらの輸送ポリペプチド−カーゴ複
合体の最終濃度は、細胞成長培地で６、20または60μg/
mlであった(表Ｉ)。
【０１３８】
【表１】
【０１３９】18時間インキュベーションした後、培地を
除去し、そして先行する18時間のインキュベーションの
場合と同じ濃度のクロロキンおよび輸送ポリペプチド−
カーゴ複合体を含有する、新鮮培地を1.5ml添加した。
この培地変換は、リプレッサーが細胞内に入る前に存在
し得る任意のhGHを除去するためであった。培地変換後2
4時間で、細胞を採収し、そして生存度を調べるために
細胞計数を行った。次に、成長培地の希釈していない試
料上で、Seldonの方法(Protocols in Molecular Biolog
y, Green Publishing Associates, New York, pp. 9.7.
1-9.7.2 (1987)に記載)に従って、Allegro Human Growt
h Hormone一過性遺伝子発現システムキット(Nichols In
stitute, San Juan Capistrano, CA)を用いて、hGHにつ
いてアッセイした。全ての試料について、アッセイバッ
クグラウンド(すなわち、添加された非調整培地にある
アッセイ成分)をhGH cpmから引き算した。タンパク質取
り込み試験において、クロロキンが存在する(「(+)CQ」)
か、または欠如している(「(-)CQ」)かによって、与えら
れたタンパク質処理について別々の抑制率計算を行っ
た。抑制率を以下の式に従って計算した：
【０１４０】
【数１】
【０１４１】ここで：BKG＝リポーターのみのトランス
フェクションにおけるhGH cpm(例えば、(-)CQに対するE
P1.1および(+)CQに対するEP1.2)； ACT＝リポーターおよびトランスアクティベーターのト
ランスフェクションにおけるhGH cpmであり、これに
は、リプレッサー複合体は添加されなかった(例えば、
(-)CQに対するEP2.1および(+)CQに対するEP2.8)； REP＝リポーターおよびトランスアクティベーターのト
ランスフェクションにおけるhGH cpmであり、これに
は、リプレッサー複合体が添加された(例えば、(-)CQに
対するEP2.2〜2.7および(+)CQに対するEP2.9〜2.14)。
【０１４２】代表的なE2抑制アッセイのデータを、表II
に示す。表Iによって、表IIに挙げられた種々の試料が
同定される。図７は、表IIに示した結果を図式的に描い
ている(白菱形、tat37-72に架橋したE2.123、クロロキ
ンを含まない；黒菱形、tat37-72に架橋したE2.123、ク
ロロキンを含む；白丸、tat37-72に架橋したE2.123CCS
S、クロロキンを含まない；黒丸、tat37-72に架橋したE
2.123CCSS、クロロキンを含む)。
【０１４３】
【表２】
【０１４４】E2リプレッサー(E2.123またはE2.123CCSS)
のいずれかに架橋した輸送ポリペプチドtat37-72は、培
養した哺乳動物細胞で、E2依存性の遺伝子発現を、投与
量に依存して阻害した(表II；図７)。この実験を４回繰
り返して同様の結果を得た。この効果は、他のtat37-72
複合体は、pXB332hGHのE2誘導に効果がない(データは示
さず)という点で、E2に特異的である。また、tat37-72x
HE2複合体は、リポーターのhGH発現レベルに効果がな
く、ここでは、hGH遺伝子の発現は、E2には応答しない
構成性プロモーターによって駆動された。CCSS突然変異
を有するE2リプレッサーは、野生型アミノ酸配列を有す
るリプレッサーよりも、より大きな程度で抑制した。こ
れは期待されたとおりであった。なぜなら、輸送ポリペ
プチドの野生型リプレッサーの最後の２個のシステイン
のいずれかへの架橋によって、リプレッサー活性が低下
したり、または奪われてしまう可能性があるからであ
る。クロロキンは、抑制活性のためには不要であった。
しかし、クロロキンは、全ての試験において抑制を増強
した。これらの結果を、表IIおよび図７に要約する。
【０１４５】＜実施例10；TATΔCYS複合体＞ （TatΔcysの産生）tatアミノ酸38-72に直接に融合した
tatアミノ酸1-21からなる輸送ポリペプチドの細菌によ
る産生のために、発現プラスミドpTATΔcysを構築した
(図８；配列番号：20)。プラスミドpTATΔcysを構築す
るために、従来のPCR技術を、PCRテンプレートとしての
プラスミドpTAT72と共に用いた。PCRに用いたオリゴヌ
クレオチドプライマーの１つは、374.18(配列番号：19)
であり、これはtatコード配列の上流のEagI部位をカバ
ーしている。(本発明者らはまた、プラスミドpET8c-123
CCSSの構築にオリゴヌクレオチド374.18を用いた。実施
例９を参照のこと。)他方のPCRのオリゴヌクレオチドプ
ライマーの374.28は、tatコード配列内のEagI部位をカ
バーしており、そしてアミノ酸22-37をコードするtat D
NA配列の欠失を有する。374.28のヌクレオチド配列は以
下である： TTTACGGCCG TAAGAGATAC CTAGGGCTTT GGTGATGAAC GCGGT
(配列番号：21)。PCR産物をEagIで消化し、生じる762塩
基対フラグメントを単離した。EagIフラグメントをpTAT
72のEagI切断により生成した4057塩基対ベクターに挿入
した。DNA配列分析により構築を確認し、Studierら(前
出)の方法によりtatΔcysポリペプチドを発現させた。S
DS-PAGE分析により、tatΔcysポリペプチドが正確な大
きさであることが示された。
【０１４６】tatΔcysタンパク質の精製のために、4.5
ｇのpTATΔcys形質転換E.coli細胞を融解し、35mlの20m
M MES(pH 6.2)、0.5mM EDTA中にこの細胞を再懸濁し
た。この細胞をフレンチプレスにより10,000psiで２回
通過により溶解した。SA600ロータにおいて、10,000rpm
で１時間遠心分離することにより、不溶性の残渣を除去
した。この上清を15ml／時で5ml Sセファロースファー
ストフローカラムにかけた。50mM トリス-HCl(pH 7.
5)、0.3mM DTTでカラムを洗浄した。次いで、300mM、40
0mM、500mM、700mM、および950mMのNaClを含む同じ緩衝
液でステップグラディエント溶出(2ml／ステップ)を行
った。tatΔcysタンパク質は950mM NaCl画分中に溶出し
た。
【０１４７】tatΔcys輸送ポリペプチドをローダミンイ
ソチオシアネートに複合し、それを細胞取り込みに対し
て直接アッセイすることにより試験した。結果は陽性で
あった(tat1-72での関連実験での結果に類似する)。
【０１４８】（TATΔcys-249遺伝的融合）天然E2リプレ
ッサータンパク質のアミノ末端に遺伝子的に融合したta
tΔcys輸送ポリペプチド(すなわち、BPV-1 E2のカルボ
キシ末端の249アミノ酸)の細菌による発現のために、プ
ラスミドpTATΔcys-249を以下のように構築した。プラ
スミドpTAT72(FrankelおよびPabo、前出)およびpXB314
(Barsoumら、前出)からプラスミドpFTE501(図９)を構築
した。プラスミドpXB314から、249アミノ酸のBPV-1E2リ
プレッサーをコードするNcoI-SpeI DNAフラグメントを
単離した。(NcoIはヌクレオチド296位で切断し、そして
SpeIはpXB314のヌクレオチド1118位で切断する。)この
フラグメントの末端をDNAポリメラーゼIクレノウ処理に
より平滑化し、市販により入手可能なBglIIリンカー(Ne
w England Biolabs, カタログ番号1090)を加えた。この
リンカーを有するフラグメントをBamHI切断(完全消化)
プラスミドpTAT72に挿入した。pTAT72では、BamHI切断
部位がtatコード領域内でその３’末端近くに存在し、
第二のBamHI切断部位はtat遺伝子のわずかに下流に存在
する。BglIIリンカーは、フレームが合って、tatおよび
E2コード配列を連結し、これらはセリン残基に続くtat
タンパク質の最初の62アミノ酸およびBPV-1 E2タンパク
質の最後の249アミノ酸の融合物をコードする。本発明
者らはこの細菌発現プラスミドをpFTE501と称した(図
９)。プラスミドpTATΔcys-249(図10；配列番号：22)を
構築するために、プラスミドpTAT cys由来の762塩基対
のEagIフラグメント(これはシステインの欠失を含むtat
の部分を含む)をプラスミドpFTE501の4812塩基対EagIフ
ラグメントに挿入した。
【０１４９】（tatΔcys-249の精製）tatΔcys-249を発
現する５ｇのE.coliを融解し、プロテアーゼインヒビタ
ー(1.25mM PMSF、3mM ベンズアミジン、50μg／mlペプ
スタチンＡ、50μg／mlアプロチニン、４μg/ml E64)を
加えた、40mlの25mM トリスHCl(pH 7.5)、25mM NaCl、
0.5mM EDTA、５mM DTT、中にこの細胞を再懸濁した。こ
の細胞を10,000psiでフレンチプレスのセルを２回通過
させることにより溶解した。SA600ロータにおいて、12,
000rpmで１時間遠心分離をかけることにより、不溶性の
残渣を除去した。可溶画分からtatΔcys-249を精製し
た。この上清を２ml Sセファロースファーストフローカ
ラム(Pharmacia LKB, Piscataway, NJ)に流速６ml／時
で加えた。カラムを、25mM トリスHCl(pH 7.5)、25mM N
aCl、0.5mM EDTA、１mM DTTで洗浄し、100mM、200mM、3
00mM、400mM、500mM、600mM、および800mMのNaClを含む
同じ緩衝液で連続的な塩濃度ステップで処理した。Tat
Δcys-249を600−800mM塩画分で回収した。このピーク
画分をプールし、グリセロールを15％まで加え、アリコ
ートを-70℃で貯蔵した。
【０１５０】（免疫蛍光アッセイ）tatΔcys-E2リプレ
ッサー融合タンパク質の細胞取り込みを分析するため
に、間接免疫蛍光法を用いた。HeLa細胞を６ウエル組織
培養皿中でカバーガラス上に50％集密で植え付けた。一
晩インキュベートした後、tatΔcys-E2リプレッサー融
合タンパク質(１μg/ml最終濃度)およびクロロキン(0.1
mM最終濃度)を加えた。６時間後、融合タンパク質／ク
ロロキン含有成長培地を除去し、細胞をPBSで２回洗浄
した。洗浄した細胞を室温で3.5％ホルムアルデヒド中
に固定化した。固定化した細胞を、１mM MgCl2／0.1mM
CaCl2を含有するPBS(「PBS+」)中で0.2％Triton X-100／
２％ウシ血清アルブミン(「BSA」)で室温で５分間透過処
理した。透過処理した細胞をブロックするために、２％
BSAを含有するPBSで、これら細胞を４℃で１時間処理し
た。
【０１５１】このカバーガラスを、各ウエル中で20μl
の一次抗体溶液と共に４℃で１時間、２％BSAを含有す
るPBS+の1:100希釈でインキュベートした。一次抗体
は、BPV-1 E2リプレッサーに対するウサギポリクローナ
ル抗体(E2の精製カルボキシ末端85アミノ酸を注射する
ことにより生成される)、またはtatに対するウサギポリ
クローナル抗体(tatタンパク質の精製アミノ末端72アミ
ノ酸を注射することにより生成される)のいずれかであ
った。PBS+中の0.2％ Tween-20／２％ BSA中で、1:100
希釈で４℃で30分間、二次抗体を加えた。
【０１５２】二次抗体は、ローダミン複合ヤギ抗ウサギ
IgG(Cappel no.2212-0081)であった。細胞を二次抗体と
インキュベートさせた後、この細胞をPBS+中0.2％ Twee
n-20／２％ BSAで洗浄し、90％グリセロール、25mMリン
酸ナトリウム(pH 7.2)、150mM NaCl中でカバーガラスを
乗せた。ローダミンフィルターを有する蛍光顕微鏡で細
胞を試験した。
【０１５３】（TatΔcys融合の細胞取り込み）tatΔcys
-E2リプレッサー融合タンパク質の顕著な細胞取り込み
を、tat抗体またはE2抗体のいずれかを用いて観察し
た。複合体化していないtatタンパク質にさらしたコン
トロール細胞では、tat抗体による細胞内蛍光を観察し
たが、E2抗体では観察されなかった。複合体化していな
いE2リプレッサーとtatタンパク質またはtatΔcysとの
混合物にさらしたコントロール細胞では、tat抗体によ
る蛍光を観察したが、E2抗体では観察されなかった。こ
れにより、tatは、tatタンパク質に複合体化したときに
のみE2リプレッサーの取り込みを仲介することが証明さ
れた。複合体化していないtatタンパク質と同様に、細
胞全体にtatΔcys-E2リプレッサー融合タンパク質を観
察したが、これは細胞内小胞中に密集していた。これら
の結果は、完全にシステイン残基を欠失しているtat由
来ポリペプチドが、動物細胞中に異種タンパク質(すな
わち、輸送ポリペプチド−カーゴタンパク質の遺伝的融
合)を運搬し得ることを示す。
【０１５４】上記と同様の手順で、tatΔcysとHPV E2の
Ｃ末端123アミノ酸との遺伝的融合物を作製した。成長
培地に加えたとき、この融合ポリペプチドは、COS7細胞
においてE2依存性遺伝子発現の抑制を示した(データは
示さず)。
【０１５５】＜実施例11；アンチセンスオリゴデオキシ
ヌクレオチド複合体＞自動化DNA／RNAシンセサイザー(A
pplied Biosystemsモデル394)を用いて、DNAホスホロチ
オネートアナログ(長さ4-18ヌクレオチド)を合成した。
このアナログはそれぞれ５’末端にフリーアミノ基を含
む。このアミン基は市販の修飾ヌクレオチド(アミノリ
ンク２、Applied Biosystems)を用いて、オリゴヌクレ
オチドに結合した。このオリゴヌクレオチドは、ヒト成
長ホルモンおよびCATメッセンジャーRNAの領域に由来の
センス鎖およびアンチセンス鎖に相当した。
【０１５６】各架橋反応のために、200μgのオリゴヌク
レオチドを100μlの25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.
0)中に溶解した。次いで、10μlのスルホ-SMCCの50mMス
トック溶液を加え、反応を室温で１時間進行させた。25
mM HEPES(pH 6.0)中のP6DGカラム(Bio-Rad)での反応混
合物のゲル濾過により未反応のスルホ-SMCCを除去し
た。オリゴヌクレオチド-スルホ-SMCC付加物を減圧下で
乾燥した。この手順におけるオリゴヌクレオチドの回収
率は、58〜95％の範囲であった。輸送ポリペプチドとの
反応のために、各オリゴヌクレオチド-スルホ-SMCC付加
物を50μlの0.5mM EDTA中に再溶解し、この溶液を50μg
の凍結乾燥した輸送ポリペプチドを含有する試験管に移
し、そして反応を室温で２時間進行させた。反応産物を
SDS-PAGEにより分析した。
【０１５７】＜実施例12；抗体複合体＞ （抗チューブリン複合体１）市販のマウスIgG1 mAb抗チ
ューブリン(Amersham)を得て、プロテインＡを用いて従
来法により腹水からそれを精製した。精製抗体をローダ
ミンイソチオシアネートで、1.2モル ローダミン／モル
Abで標識した。固定化し透過処理したHeLa細胞を標識抗
体にさらすと、顕微鏡検査により鮮やかに染色された微
小管が明らかになった。ローダミン標識で十分である
が、抗マウスFITCで抗体シグナルを増強した。
【０１５８】本質的に実施例２に記載された手順(前出)
で、250μgの抗体をスルホ-SMCCの10:1モル過剰と反応
させた。次いで、48μgの(35Ｓ-標識)tat1-72を加え
た。tat1-72：Abのモル比は2.7:1であった。放射活性の
取り込みによると、tat1-72は、抗体に0.6:1の比で架橋
した。
【０１５９】tat1-72-Ab複合体の取り込みの分析のため
に、複合体をカバーガラス上で増殖した細胞を浸してい
る培養液(10μg/ml)に加えた。細胞において蛍光の斑点
パターンを観察した。斑点パターンは、複合体の小胞体
への局在化を示し、従って細胞質送達に関しては決定的
ではない。
【０１６０】複合抗体の免疫反応性を示すために、この
抗体がチューブリンに結合する能力を試験した。精製チ
ューブリンを臭化シアン-活性化セファロース4B(Sigma
Chem. Co., St. Louis, MO)に結合させた。放射活性複
合体の試料をチューブリンカラム(およびセファロース4
Bコントロールカラム)にかけ、結合した複合体の量を測
定した。コントロールカラムよりもアフィニティーマト
リックスに対してより大きい放射活性が結合し、チュー
ブリン結合活性を示した。
【０１６１】（抗チューブリン複合体２）別の架橋実験
において、抗チューブリンラットモノクローナル抗体Ig
G2a(Serotec)を得、プロテインＧを用いて従来法により
腹水からそれを精製した。この抗体をCaps緩衝液(pH 1
0)で溶出した。精製抗体は、チューブリン結合アッセイ
で陽性であった。tat1-72をローダミンイソチオシアネ
ートと1:1のモル比で反応させた。反応産物は、0.63の
Ａ555／Ａ280比を示し、tat1-72 １モルに対し色素約0.
75モルの置換を示した。未反応の色素をtat1-72-ローダ
ミンからG-25ゲル濾過(Pharmacia LKB, Piscataway, N
J)により分離した際、反応において150μgのtat1-72か
ら52μgのみを回収した。
【０１６２】tat1-72-ローダミンのアリコートを、細胞
取り込み実験での使用(コントロールとしての)のために
保存し、残りをSMCC(20:1)と反応させた0.4mgの抗体に
加えた。反応混合物は、意図された5:1ではなく約1:1の
比のtat1-72:Abを含んでいた。(続く実験では、5:1の比
は沈殿を生じ、満足しない結果となることがわかっ
た。)架橋反応を４℃で一晩進行させた。次いで、モル
過剰のシステインを加え、残存するマレイミド基をブロ
ックし、このようにして架橋反応を停止させた。反応混
合物を遠心分離し、存在する沈殿物をすべて取り除い
た。
【０１６３】4-20％ポリアクリルアミドグラディエント
ゲルを用いて電気泳動を行い、還元条件下および非還元
条件下で上清液を分析した。また、この手順により沈殿
ペレットを分析した。抗体-tat1-72(ローダミンなし)か
らの上清液では、4-20％ゲルではほんのわずかしか物質
は観察されなかった。しかし、抗体-tat1-72-ローダミ
ン複合体実験からの上清液では、還元試料について、抗
体よりも相対的に大きな分子量のバンドを観察した。抗
体は、tat1-72に約1:1の比で複合体化したと思われた。
【０１６４】複合体２で行った細胞取り込み実験(複合
体１に関して上述した手順)では、複合体１で得た結果
と同様の結果を得た。複合体をローダミン蛍光または二
次抗体に結合したフルオレセインにより可視化したと
き、小胞体内で複合体が観察された。
【０１６５】＜実施例13；付加的Tat-E2複合体＞ （化学的に架橋したTat-E2複合体）輸送ポリペプチドta
t37-72を、E2の４つの異なるリプレッサー型に化学的に
架橋した。これらの実験に用いた４つのE2リプレッサー
部分は、BPV-1(「E2.103」)のカルボキシ末端103残基(す
なわち、308-410)；BPV-1(「E2.249」)のカルボキシ末端2
49残基(すなわち、162-410)；HPV-16(「HE2」)のカルボキ
シ末端121残基(すなわち、245-365)；およびHPV-16のカ
ルボキシ末端121残基であり、ここでは、300位および30
9位でシステイン残基をセリンに変えており、そして299
位でリシン残基をアルギニンに変えた(「HE2CCSS」)。HE2
およびHE2CCSSの組換え産生および精製、その後のHE2お
よびHE2CCSSのtat37-72への架橋により、それぞれTxHE2
およびTxHE2CCSSの形成を実施例９に記載している(上
記)。tat37-72へE2.103およびE2.249を化学的に架橋(Tx
E2.103およびTxE2.249と名付けた複合体を生ずる)する
ために、TxHE2およびTxHE2CCSSを作製するために用いた
同じ方法を用いた(実施例９、前出)。
【０１６６】E. coli中でプラスミドpET-E2.103からタ
ンパク質E2.103を発現させた。実施例９(上記)および図
５に記載した、pET8c-123を生成するのに用いた手順と
類似のPCRクローニング手順により、pET-E2.103を得
た。pET8c-123の構築におけるように、PCRで生成したNc
oI-BamHI E2フラグメントをNcoI-BamHIで切断したpET8c
に連結した。E2フラグメントに対するPCR鋳型は、プラ
スミドpCO-E2であった(Hawley-Nelsonら、EMBO J.、7
巻、525-31頁(1988)；米国特許第5,219,990号)。pCO-E2
からE2フラグメントを生成するのに用いたオリゴヌクレ
オチドプライマーは、EA21(配列番号：36)、およびEA22
(配列番号：37)であった。プライマーEA21は、BPV-1 E2
のカルボキシ末端101残基に対するコード領域の５'側に
隣接するアラニンコドンが続くメチオニンコドンを付加
するNcoI部位を導入した。
【０１６７】E. coli中でプラスミドpET8c-249からタン
パク質E2.249を発現させた。プラスミドpXB314(図９)の
1362bpのNcoI-BamHIフラグメントをNcoI-BamHIで切断し
たpET8c(図５)に挿入することにより、pET8c-249を構築
した。
【０１６８】（TATΔcys-BPV E2遺伝的融合）TATΔcys-
249に加えて、幾つかの他のTATΔcys-BPV-1 E2リプレッ
サー融合体を試験した。プラスミドpTATΔcys-105は、t
at残基1-21および38-67、その後ろにBPV-1のカルボキシ
末端105残基をコードしていた。プラスミドpTATΔcys-1
61は、tat残基1-21および38-62、その後ろにBPV-1のカ
ルボキシ末端161残基をコードしていた。プラスミドpTA
TΔcys-105およびpTATΔcys-161を、中間体プラスミド
のpFTE103およびpFTE403からそれぞれ構築した。
【０１６９】pFTE103およびpFTE403(およびpFTE501)
を、BamHIで切断した(完全消化)ベクターpTAT72に異な
る挿入物を連結することにより生成した。
【０１７０】pFTE103への挿入フラグメントを得るため
に、pXB314から929塩基対のPleI-BamHIフラグメントを
単離し、そしてそれを合成オリゴヌクレオチドFTE.3(配
列番号：23)および合成オリゴヌクレオチドFTE.4(配列
番号：24)からなる二本鎖リンカーに連結した。このリ
ンカーは、tat残基61-67をコードしており、そして５'
末端でBamHI突出部、および３'末端でPleI突出部を有し
た。pXB3314由来のリンカーを有するフラグメントをBam
HIで切断したpTAT72に連結し、pFTE103を得た。pFTE403
への挿入フラグメントを得るために、pXB314をNcoIおよ
びSpeIで消化し、クレノウ処理し平滑末端を生成し、そ
してそれ自身で二重らせんであるGAAGATCTTC(New Engla
nd Biolabs, Beverly, MA,カタログ番号No. 1090)(配列
番号：35)からなるBglIIリンカーを連結した。得られた
822-塩基対フラグメントを電気泳動により精製し、次い
で、それをBamHIで切断したpTAT72ベクターに連結してp
FTE403を得た。
【０１７１】tat残基22-37を欠失するために、それによ
ってpFTE103からプラスミドpTATΔcys-105を、およびpF
TE403からpTATΔcys-161を得、pFTE501からプラスミドp
TATΔcys-249を得るために用いた同一の方法(上に記載)
を用いた。
【０１７２】（TATΔcys-HPV E2遺伝的融合）tatΔcys
輸送部分(tat残基1-21、38-72)に続くHPV-16のカルボキ
シ末端85残基または121残基からなる融合タンパク質を
コードする、プラスミドpTATΔcys-HE2.85およびpTATΔ
cys-HE2.121をそれぞれ構築した。
【０１７３】pTATΔcys-HE2.85およびpTATΔcys-HE2.12
1の構築における出発プラスミドは、それぞれpET8c-85
およびpET8c-123であった(両者とも上に記載)。pET8c-8
5およびpET8c-123をBglIIおよびNcoIで消化し、そし
て、それぞれの場合に、ベクターとして用いるために大
きなフラグメント(pET8c-85から4769塩基対またはpET8c
-123から4880塩基対)を単離した。両方のベクターと
も、NcoI部位からE2コード領域が始まる。両方のベクタ
ーに、プラスミドpTATΔcys由来の220bpのBglII-AatII
フラグメントおよび合成フラグメントを挿入した。BglI
I-AatIIフラグメントの５'末端は、T7プロモーターの上
流であり、そしてtatΔcysの最初の40残基(すなわち、
残基1-21、38-56)をコードする。アニールしたオリゴヌ
クレオチド374.67(配列番号：25)および374.68(配列番
号：26)からなる合成フラグメントは、tat残基57-72を
コードし、５'末端にAatII突出部、および３'末端にNco
I突出部を有する。
【０１７４】（遺伝的融合のJBシリーズ）プラスミドpJ
B106は、融合タンパク質をコードし(図12)(配列番号：3
8)、そこではアミノ末端メチオニン残基の後にtat残基4
7-58、次いで、HPV-16 E2残基245-365が続く。pJB106を
得るために、図11に図式で表現したように、３つの断片
の連結を行った。プラスミドpET8cをNcoIおよびBamHIで
消化することにより、4602塩基対ベクターフラグメント
を生成した。１つの挿入物は、pET8c-123由来の359塩基
対のMspI-BamHIフラグメントであり、HPV-16 E2残基248
-365をコードしていた。他の挿入物は、アニールしたオ
リゴヌクレオチド対の374.185(配列番号：27)および37
4.186(配列番号：28)からなる合成フラグメントであっ
た。合成フラグメントは、アミノ末端メチオニンおよび
tat残基47-58、プラスHPV16残基245-247(すなわち、Pro
AspThr)をコードした。合成フラグメントは、５'末端で
NcoI突出部および３'末端でMspI突出部を有した。
【０１７５】pTATΔcysに用いた方法と類似の方法(上記
および図８に記載)でPCR欠失クローニングにより、プラ
スミドpJB117(配列番号：59)、pJB118(配列番号：60)、
pJB119(配列番号：61)、pJB120(配列番号：62)、および
pJB122(配列番号：63)を得た。pTATΔcys-HE2.121のセ
グメントを欠失することにより、プラスミドpJB117およ
びpJB118を構築した。pTATΔcys-161のセグメントを欠
失することにより、プラスミドpJB119およびpJB120を構
築した。４つのクローニングすべてにおいて、PCRプラ
イマー374.122(配列番号：29)を用いて、tat-E2コード
領域下流のHindIII部位をカバーした。それぞれの場合
において、別のプライマーがtatΔcysコード配列の開始
部のNdeI部位がtatΔcysのはじめの残基に対する欠失コ
ドン(すなわち、pJB117およびpJB119に対する残基2-21
および38-46；およびpJB118およびpJB120に対する残基2
-21)にまたがった。残基2-21の欠失には、プライマー37
9.11(配列番号：30)を用いた。残基2-21および38-46の
欠失には、プライマー379.12(配列番号：31)を用いた。
PCR反応に続き、PCR産物をNdeIおよびHindIIIで消化し
た。次いで、得られた制限酵素切断フラグメントをベク
ターpTATΔcys-HE2.121にクローニングした。このベク
ターは、前もってNdeIプラスHindIIIで切断して、4057
塩基対のレセプターフラグメントとして生成していた。
このように、以下のアミノ酸残基からなる融合タンパク
質をコードする発現プラスミドを構築した： JB117＝Tat47-72-HPV16 E2 245-365； JB118＝Tat38-72-HPV16 E2 245-365； JB119＝Tat47-62-BPV1 E2 250-410；および JB120＝Tat38-62-BPV1 E2 250-410。
【０１７６】tat残基59-72に対するコドンをpJB118から
欠失することにより、tat残基38-58に続くHPV16 E2残基
245-365(すなわち、E2カルボキシ末端121アミノ酸)をコ
ードするpJB122を構築した。プライマー374.13(配列番
号：32)を用いてPCRによりこの欠失を行った。このプラ
イマーは、tatコード領域内のAatII部位をカバーし、そ
してプライマー374.14(配列番号：33)は、Tat-E2遺伝子
下流の唯一のHindIII部位の少し下流のAatII部位をカバ
ーする。PCR産物をAatIIで消化し、そして得られた制限
酵素切断断片フラグメントを単離した。pJB122構築最終
工程において、単離したAatIIフラグメントをAatIIで消
化したベクターpJB118に挿入した。
【０１７７】上記の５つのpJB構築物すべてにおいて、t
atコード配列は、翻訳開始のためのメチオニンコドンが
先行していることに注目すべきである。
【０１７８】（Tat-E2融合タンパク質の精製）全ての場
合において、E. coliを用いてtat-E2遺伝子融合物を発
現させた。tat-E2タンパク質精製のための一般的な手順
は、以下の初期工程を包含する：細胞のペレット化；プ
ロテアーゼインヒビター −− 一般的に１mM PMSF、４
μg/mlE64、50μg/ml アプロチニン、50μg/ml ペプス
タチン(pepstatin)Ａ、および３mM ベンズアミジン(ben
zamidine)を含む8-10容量の溶菌緩衝液(25mM トリス(pH
7.5)、25mM NaCl、１mM DTT、0.5mM EDTA)に細胞を再懸
濁；フレンチプレス(12,000psiの２回通過)で細胞を溶
解；および溶解液を10,000-12,000×ｇで４℃で１時間
遠心分離する(FTEタンパク質を除く)。特にtat-E2融合
タンパク質の精製において、さらに行った工程を以下に
記載する。
【０１７９】E2.103およびE2.249 −− 溶解液の遠心分
離の後、ファーストSセファロースカラムに上清をロー
ドし、そして１ＭのNaClでE2.103またはE2.249タンパク
質を溶出した。次いで、100mM HEPES(pH 7.5)、0.1mM E
DTAおよび１mM DTTで平衡化したP60ゲル濾過カラムでの
クロマトグラフィーにより、E2.103およびE2.249をさら
に精製した。
【０１８０】FTE103 −− 溶解液を10,000×ｇで４℃で
10分間遠心分離した後、ペレットを6M 尿素に再懸濁
し、そして固体のグアニジン-HClを最終濃度が7Mになる
ように添加することにより、FTE103タンパク質(沈殿し
た)を回収した。懸濁液を遠心分離した後、6M グアニジ
ン、50mM リン酸ナトリウム(pH 5.4)、10mM DTT中でA.5
Mゲル濾過カラムでのクロマトグラフィーにより、上清
からFTE103を精製した。クーマジー染色したSDSポリア
クリルアミド電気泳動ゲル上で、19kDaの見かけの分子
量を有するバンドの出現に従って、ゲル濾過カラムから
FTE103含有画分を集めた。
【０１８１】FTE403 −− FTE403の精製手順は、25kDa
の見かけ分子量を有するFTE403がゲル濾過カラム上を移
動した以外は、FTE103に対する手順と本質的に同じであ
る。
【０１８２】FTE501 −− 溶解液を10,000×ｇで30分間
遠心分離した後、ペレットを6M 尿素に再懸濁し、固体
のグアニジン-HClを最終濃度が6Mになるように添加し、
そしてDTTを濃度が10mMになるように添加した。37℃で3
0分後、10,000×ｇで30分間の遠心分離により、溶液を
清澄にした。次いで、6M グアニジン-HCl、50mM リン酸
ナトリウム(pH 5.4)、10mM DTT中でA.5Mアガロースゲル
濾過カラムに試料をロードし、そしてクーマジー染色し
たSDSポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で、40kDaの見
かけの分子量を有するバンドの出現に従って、ゲル濾過
カラムからFTE501含有画分を集めた。ゲル濾過精製した
FTE501を、Ｃ18逆相HPLCカラムにロードし、そして0.1
％のトリフルオロ酢酸中の0-75％のアセトニトリルのグ
ラディエントで溶出した。40kDaの見かけの分子量を有
するFTE501タンパク質を、単一ピーク中に集めた。
【０１８３】TatΔcys-105 −− 溶解液の遠心分離の
後、上清を25mM トリス(pH 7.5)、0.5mM EDTAで平衡化
したＱ-セファロースカラムにロードした。Ｑ-セファロ
ースカラムの通過液を、MES(pH 6.0)を最終濃度が30mM
になるように添加して約pH 6.0に調節した後、Ｑ-セフ
ァロースカラム通過液を、25mM MES(pH 6.0)で平衡化し
たＳ-セファロースカラムにロードした。25mM MES(pH
6.0)中の連続的なNaCl濃度ステップの適用により、Ｓ-
セファロースカラムからtatΔcys-105を回収した。Tat
Δcys-105は、800-1000mM NaClでpH 6.0の緩衝液中に溶
出した。
【０１８４】TatΔcys-161 −− 溶解液の遠心分離の
後、上清を25mM トリス(pH 7.5)、0.5mM EDTAで平衡化
したＳ-セファロースカラムにロードした。25mM トリス
(pH 7.5)中のNaCl濃度ステップグラディエントの適用に
より、Ｓ-セファロースカラムからtatΔcys-161を回収
した。TatΔcys-161は、500-700mM NaClでpH 7.5の緩衝
液中に溶出した。
【０１８５】TatΔcys-249 −− 溶解液の遠心分離の
後、上清を25mM トリス(pH 7.5)、0.5mM EDTAで平衡化
したＱ-セファロースカラムにロードした。25mM トリス
(pH 7.5)中のNaClステップグラディエントの適用によ
り、Ｓ-セファロースカラムからtatΔcys-249を回収し
た。TatΔcys-249は、NaClステップグラディエントの60
0-800mMの部分に溶出した。
【０１８６】TatΔcys-HE2.85およびTatΔcys-HE2.121
−− 溶解液の遠心分離の後、上清をＱ-セファロースカ
ラムにロードした。通過液をＳ-セファロースカラムに
ロードした。NaClステップグラディエントの適用によ
り、Ｓ-セファロースカラムからtatΔcys-HE2.85または
tatΔcys-HE2.121を回収した。両タンパク質は、１M Na
Clで溶出した。
【０１８７】HPV E2およびHPV E2CCSS −− 実施例９参
照(上記)。
【０１８８】JB106 −− 溶解液の遠心分離、および上
清の回収後、NaClを300mMまで添加した。25mM HEPES(pH
7.5)で平衡化したＳ-セファロースカラムに、NaClを添
加した上清をロードした。25mM HEPES(pH 7.5)、1.5mM
EDTA、１mM DTT中の連続的な塩濃度ステップでカラムを
処理した。JB106タンパク質を、１MNaClでＳ-セファロ
ースカラムから溶出した。
【０１８９】JB117 −− 溶解液の遠心分離、および上
清の回収後、NaClを300mMまで添加した。JB117が300mM
NaClで沈殿するので、JB117上清を100mM NaClまで希釈
し、そしてＳ-セファロースカラムにタンパク質をバッ
チ式でロードした。JB117を、25mM トリス(pH 7.5)、0.
3mM DTT中の１M NaClでＳ-セファロースカラムから溶出
した。
【０１９０】JB118 −− 溶解液の遠心分離、および上
清の回収後、NaClを300mMまで添加した。25mM トリス(p
H 7.5)で平衡化したＳ-セファロースカラムに、NaClを
添加した上清をロードした。JB118タンパク質は、25mM
トリス(pH 7.5)、0.3mM DTT中の１M NaClでＳ-セファロ
ースカラムから溶出した。
【０１９１】JB119、JB120、JB121、およびJB122 −−
溶解液の遠心分離、および上清の回収後、NaClをJB119
およびJB121に対しては150mMまで、そしてJB120およびJ
B122に対しては200mMまで添加した。25mM トリス(pH 7.
5)で平衡化したＳ-セファロースカラムに、NaClを添加
した上清をロードした。JB119、JB120、JB121、およびJ
B122は、25mM トリス(pH 7.5)、0.3mM DTT中の１M NaCl
でＳ-セファロースカラムから溶出した。
【０１９２】＜実施例14；E2抑制アッセイ−付加的複合
体＞tat-E2融合タンパク質を、全長の乳頭腫ウイルスE2
タンパク質により、転写活性化の阻害(「抑制」)に対して
試験した。COS7細胞中での一時的な共トランスフェクシ
ョンアッセイで、E2抑制を測定した。本アッセイにおい
て使用したCOS7細胞は、ほんの短い期間だけ培養で維持
した。COS7細胞を13継代で馴化(thaw)し、そして25継代
までだけそれらの細胞を使用した。長い期間増殖させる
と、E2の転写活性化の低レベル化を招き、そして抑制お
よび再現性が減少した。抑制アッセイおよび抑制活性の
計算方法は、実施例９(上記)に記載してある。複合体Tx
E2.103、TxE22.249、FTE103、FTE202、FTE403、およびF
TE501について、HPV-16 E2トランスアクティベーター
に、等量のBPV-1 E2トランスアクティベーターを置換し
た。従って、HPV-16 E2発現プラスミドpAHE2でトランス
フェクションする代わりに、BPV-1 E2発現プラスミドpX
B323でトランスフェクトした。これは米国特許第5,219,
990号に全て記載されている。
【０１９３】遺伝的融合タンパク質JB106は、首尾一貫
して最も強力なtat-E2リプレッサー複合体であった。JB
106とTxHE2CCSSとを比較した抑制アッセイのデータを表
IIIに示す。図13は、表IIIにある結果をグラフで表して
いる(JB106(四角)、TxHE2CCSS(菱形)、およびHE2.123
(丸))。
【０１９４】JB106に加えて、幾つかの他のtat-E2リプ
レッサー複合体が、顕著な抑制を生じた。表IVに示した
ように、TxHE2、TxHE2CCSS、JB117、JB118、JB119、JB1
20、およびJB122は、＋＋の範囲の抑制レベルを示し
た。
【０１９５】
【表３】
【０１９６】表IVは、tat-E2リプレッサーアッセイの結
果を要約している。同様のアッセイでtat-E2リプレッサ
ー複合体全部を試験したが、同じアッセイで複合体を全
て同時には試験しなかった。従って、抑制活性のレベル
を半定量的に、＋＋＋、＋＋、＋、＋/−、または−と
して表した。＋＋＋は強い抑制、−は検出可能な抑制が
ないことを示す。図13は、表IVで用いた抑制活性評価シ
ステムを図示している。JB106は、＋＋＋活性レベルの
例である。TxHE2CCSSは、＋＋活性レベルの例である。
負のコントロールであるHE2.123は、−活性レベルの例
である。＋活性レベルは、TxHE2CCSSとHE2.123との間で
観測される活性の中間である。活性が＋/−と表示され
る２つの複合体は、幾つかのアッセイでは弱い(が検出
可能な)活性を有し、他のアッセイでは検出可能な活性
がない。
【０１９７】
【表４】
【０１９８】アミノ末端領域(すなわち、残基1-21)およ
びシステインに富む領域(すなわち、残基22-37)を有す
る４つの複合体FTE103、FTE403、FTE208、およびFTE501
は、完全に抑制欠失である。間接的な免疫蛍光法により
FTE501が細胞に入ることを示したので、E2リプレッサー
活性は、一連のFTEにおいてはtat輸送ポリペプチドに結
合した結果として失われたようであると考えられてい
る。データは、tat部分のシステインに富む領域が無け
れば、一般的にE2リプレッサー活性が増加することを示
す。さらに、tat-E2複合体中にシステインに富む領域が
無ければ、標的細胞への輸送の損失もなく、E. coli中
でのタンパク質産生レベルが増加するようであり、そし
てタンパク質の溶解性が増加した。tatのアミノ末端領
域の欠失はまた、E2リプレッサー活性を増加させた。ta
t残基47-58のみ有する融合タンパク質JB106は、最も強
力なtat-E2リプレッサー複合体であった。しかし、シス
テインに富む領域の不在により、複合体にE2リプレッサ
ー活性が常に保存されているわけではない。例えば、化
学的複合体TxE2.249は、不溶性であり、そして細胞に対
して毒性である。このように、たとえtatのシステイン
の無い部分の結合でさえ、非機能的なE2リプレッサー複
合体となり得る。
【０１９９】＜実施例15；切断可能なE2複合体＞E2タン
パク質へのtat部分の化学的結合は、DNA上のE2結合部位
へのE2タンパク質の結合が少なくとも20倍減少した(デ
ータは示さず)。従って、実験を行って、tat輸送部分と
E2リプレッサー部分との間の切断可能な架橋を評価し
た。種々の切断可能な架橋方法を試験した。
【０２００】一連の実験において、HPV E2-CCSSタンパ
ク質のシステインスルフヒドリル基を、100mM HEPES(pH
7.5)、500mM NaCl中のアルドリチオール(aldrithiol)
で活性化した。ゲル濾過クロマトグラフィーにより活性
化E2リプレッサーを単離し、そしてそれをtat37-72で処
理した。アルドリチオールで処理すると、急速にE2-CCS
S二量体が形成するので、低い架橋効率であった。この
問題をさけるために、E2-CCSSを室温で８Mの尿素に入れ
て、そして変性条件下で23℃で60分間、アルドリチオー
ルで処理した。次いで、E2CCSS-アルドリチオール付加
物を再生し、それをゲル濾過クロマトグラフィーにより
単離し、次いで、tat37-72と反応させた。この手順で優
れて架橋を得た。尿素方法の改変法を用いて、E2CSSSお
よびE2CCSCもまたtat37-72に架橋した。ここでは、ゲル
濾過の代わりにＳ-セファロースクロマトグラフィーを
用いて、E2-アルドリチオール付加物を単離した。この
改変により、付加物の回収率が増加し、そして反応に用
いたE2出発物質の約90％が架橋した。
【０２０１】切断可能なtat-E2複合体は、抑制アッセイ
において活性を示した。しかし、切断可能な複合体の抑
制活性は、不可逆的に架橋した類似の複合体の抑制活性
よりわずかに低かった。切断可能な複合体のわずかに低
い活性は、細胞中でのタンパク質の半減期の反映であり
得る。Tatは細胞中で比較的安定である。E2タンパク質
は、一般的に細胞中では半減期は短い。従って、tat部
分とE2部分との間の不可逆的架橋は、E2部分を安定化し
得る。
【０２０２】＜実施例16；単純疱疹ウイルスリプレッサ
ー複合体＞単純疱疹ウイルス(「HSV」)は、急速な初期HSV
遺伝子の発現を誘導する転写アクティベーターのVP16を
コードする。Friedmanらは、VP16のカルボキシ末端転写
活性化ドメインを欠失することにより、HSV VP16リプレ
ッサーを生成した(「先欠のウイルストランスアクティベ
ーターの発現は、その同系のウイルスによる溶菌感染を
選択的に妨害する」、Nature, 335, 452-54頁(1988))。
類似の方法でHSV-2 VP16リプレッサーを生成した。
【０２０３】輸送ポリペプチド-VP16リプレッサー複合
体の、細胞取り込みおよびVP16リプレッサー活性を試験
するために、VP16依存性リポータープラスミドおよびVP
16リプレッサープラスミドを、COS7細胞に同時にトラン
スフェクトした。次いで、トランスフェクトした細胞
を、輸送ポリペプチド-VP16リプレッサー複合体または
適切なコントロールにさらした。以下に記載の抑制アッ
セイは、実施例９において上記のE2抑制アッセイと類似
であった。
【０２０４】（VP16抑制アッセイプラスミド）VP16抑制
アッセイのためのリポーター構築物は、プラスミドp175
kCATであり、これはG. Haywardから入手した(P. O'Hare
およびG. S. Haywardの「単純疱疹ウイルス遅滞型初期お
よび急速型初期調節領域を包含する組換え遺伝子の発現
および疱疹ウイルス感染によるトランス活性化」、J. Vi
rol., 52, 522-31頁(1984)参照)。プラスミドp175kCAT
は、CATリポーター遺伝子を作動させるHSV-1 IE175プロ
モーターを含む。
【０２０５】VP16抑制アッセイのためのHSV-2トランス
アクティベーター構築物は、プラスミドpXB324であり、
これはニワトリβ-アクチンプロモーターのコントロー
ル下で、野生型HSV-2 VP16遺伝子を含有していた。pXB1
00(P. Hanら、「HIV-1 Tatによる異種プロモーターのト
ランス活性化」、Nuc. Acids Res., 19, 7225-29頁(199
1))のXhoI部位とBamHI部位との間に、ニワトリβ-アク
チンプロモーターを含む280塩基対フラグメント、およ
び野生型HSV-2 VP16タンパク質全体をコードするプラス
ミドpCA5(O'HareおよびHayward, 前出)由来の2318塩基
対のBamHI-EcoRIフラグメントを挿入してpXB324を構築
した。
【０２０６】（Tat-VP16リプレッサー融合タンパク質）
細菌中で、HIV tatタンパク質のアミノ酸47-58とそれに
続くHSV VP16タンパク質のアミノ酸43-412からなる融合
タンパク質tat-VP16R.GF(配列番号：58)を産生した。ta
t-VP16リプレッサー融合タンパク質を細菌で産生するた
めに、３つの断片を連結してプラスミドpET/tat-VP16R.
GFを構築した。第１番目のフラグメントは、NcoIおよび
BglIIで消化したベクターpET-3d(別の名称「pET-8c」上
記)であった(約4600塩基対)。第２番目のフラグメント
は、アニールして二本鎖DNA分子の形態になった合成オ
リゴヌクレオチド374.219(配列番号：39)および374.220
(配列番号：40)からなる。合成フラグメントの５'末端
は、ATG翻訳開始コドンを含むNcoI突出部を有した。開
始コドンに続いて、tat残基47-58に対するコドンが存在
した。tatコドンのすぐ次は、フレーム(読み取り枠)が
合ったVP16残基43-47に対するコドンであった。合成フ
ラグメントの３'末端は、HSV-2 VP16のコドン48-412を
含む、pXB324R4由来の1134塩基対のPvuII-BglIIフラグ
メントである第３番目のフラグメントと連結するための
平滑末端であった。pXB324からpXB324R4を誘導した(上
記)。プラスミドpXB324R2は、pXB324R4の構築における
場合の中間体であった。
【０２０７】pXB100に、HSV-2 VP16のＮ末端の419アミ
ノ酸をコードするpXB324由来の1342塩基対のBamHI-AatI
Iフラグメントを挿入してpXB324R2を構築した。フレー
ムのあった停止コドンを提供するために、pSV2-CAT由来
の73塩基対AatII-EcoRIフラグメントを用いた(C. M. Go
rmanら、Molecular & Cellular Biology, 2, 1044-51頁
(1982))。従って、pXB324R2は、HSV-2 VP16の最初の419
アミノ酸および停止コドンに先行するVP16でないさらに
７つのアミノ酸をコードした。pXB324R4を構築するため
に、pXB324R2由来の5145塩基対のMluI-EcoRIフラグメン
ト、および２つの挿入フラグメントを含有する３つの断
片の連結を行った。１つの挿入物は、VP16の最初の198
残基をコードするpXB324R2由来の115塩基対のMluI-NspI
フラグメントであった。第２番目の挿入フラグメント
は、合成オリゴヌクレオチド374.32(配列番号：41)およ
び374.33(配列番号：42)からなる二本鎖合成DNA分子で
あった。アニールしたとき、これらのオリゴヌクレオチ
ドは、５'NspI付着末端および３'EcoRI付着末端を形成
した。この合成フラグメントは、終止コドンが続くVP16
残基399-412をコードしていた。このように、プラスミ
ドpXB324R4は、VP16アミノ酸413-419に対するコドン、
および停止コドンに先行する７つの外部からのアミノ酸
を欠くことにより、pXB324R2と異なった。
【０２０８】（tat-VP16R.GF融合タンパク質の精製）ta
t-VP16R.GFに対する遺伝子構築物を、E. coli中で発現
させた。遠心分離により形質転換させたE. coliを集
め；細胞を8-10容量の溶菌緩衝液(25mM トリス(pH 7.
5)、25mM NaCl、１mM DTT、0.5mM EDTA、１mM PMSF、４
μg/ml Ｅ64、50μg/mlアプロチニン、50μg/ml ペプス
タチンＡ、および３mM ベンズアミジン)に再懸濁し；フ
レンチプレス中で細胞を溶菌し(12,000psiで２回通
過)；そして、溶解液を10,000〜12,000×ｇで４℃で１
時間、遠心分離した。溶解液を遠心分離した後、25mM
トリス(pH 7.5)、0.5mM EDTAで平衡化したファーストＱ
-セファロースカラムに上清をロードした。Ｑ-セファロ
ース通過液を、25mM MES(pH 6.0)、0.1mM EDTA、2mM DTT
で平衡化したファーストＳ-セファロースカラムにロー
ドした。tat-VP16融合タンパク質を、Ｓ-セファロース
カラムから、25mM MES(pH 6.0)、0.1mM EDTA、2mM DTT
中のNaClの連続的な濃度ステップを用いて回収した。ta
t-VP16融合タンパク質は、600-1000mM NaCl画分中に溶
出した。
【０２０９】（VP16抑制アッセイ）HeLa細胞を、１ウェ
ル当たり105細胞で、24ウェル培養プレートに接種し
た。翌日、DEAE-デキストラン法(B. R. Cullen、「クロ
ーン化した遺伝子の機能的分析における真核生物発現技
術の使用」、Meth Enzymol., 152巻、684頁(1987)に記
載)を用いて、細胞をトランスフェクトした。DNAをトラ
ンスフェクションのために沈殿させ、そしてそれを100m
M NaCl、10mM トリス(pH 7.5)中に約100μg/mlの濃度で
再溶解した。各トランスフェクション用のDNA-DEAE混合
液は以下からなる：最終体積100μlに対して、200ng p1
75kCAT(＋/−１ng pXB324)または200ng pSV-CAT(コント
ロール)、１mg/ml DEAE-デキストラン、およびPBS。細
胞をこの混合液に37℃で15-20分間、培養プレートをと
きどき揺らしながらさらした。次いで、１mlの新鮮DC培
地(DMEM＋10％ 血清)を80μM クロロキンとともに各ウ
ェルに添加した。細胞を37℃で2.5時間インキュベート
した後、各ウェルから培地を吸引し、そしてそれを10％
DMSOを含有する新鮮DCで置き替えた。室温で2.5分後、
DMSO含有培地を吸引し、そしてそれを０、10、または50
μg/mlの精製tat-VP16.GFを含有する新鮮DCで置き替え
た。翌日、各ウェル中の培地を同じ組成の新鮮培地で置
き替えた。24時間後、HeLa細胞を10mM トリス(pH 8.
0)、１mM EDTA、150mM NaCl中の0.65％ NP-40(界面活性
剤)で溶解した。アッセイにおいて試料の標準化のため
に、各抽出物中のタンパク質濃度を測定した。
【０２１０】tat-VP16.GFの濃度が50μg/mlの場合、細
胞毒性がアッセイを妨害した。10μg/mlの濃度では、ta
t-VP16.GF融合タンパク質は、VP16-依存性のCAT発現を
ほとんど完全に抑制した。ここでは、観察し得る細胞の
死滅はなく、そしてコントロール中ではVP16-依存性で
ないCAT発現が約30％抑制された。このように、より少
ない量の非特異的抑制に加えて、VP16依存性のトランス
活性化の特異的な抑制を観測した。
【０２１１】＜実施例17；輸送ポリペプチド−DNA複合
体＞DNA結合性転写因子による転写活性化は、その転写
因子に対する結合部位を有するDNAを細胞中に導入する
ことにより阻害し得る。転写因子は導入されたDNAに結
合するようになり、そして正常に機能するプロモーター
部位で結合しない。この戦略は、NF-κBによる転写活性
化を阻害するのに用いた(Bielinskaら、「二本鎖ホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチドを用いる遺伝子発現調
節」、Science,250巻、997-1000頁(1990))。Bielinskaら
は、二本鎖DNAを細胞培養培地に入れた場合、投与量に
依存する阻害を観測した。輸送ポリペプチドtat37-72
を、二本鎖DNA分子に結合し、このような複合体が、DNA
の細胞取り込みを増加することにより阻害を増強し得る
か否かを測定した。
【０２１２】NF1、NF2、NF3およびNF4と命名した、それ
ぞれヌクレオチド配列(配列番号：43)、(配列番号：4
4)、(配列番号：45)および(配列番号：46)を有する、４
つの注文合成された39マーのホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドを購入した。NF1およびNF2は、野生型NF-
κB結合部位に相当する二重らせんを形成した。NF3およ
びNF4は、変異型NF-κB結合部位に相当する二重らせん
を形成した。
【０２１３】NF1およびNF3を、約４mg/mlの濃度で水に
溶解した。次いで800μgのNF1およびNF3を別々に、400
μlの50mM トリエタノールアミン(pH 8.2)、50mM NaC
l、10mMTraut試薬に入れた。室温で50分間反応を進行さ
せた。50mM HEPES(pH 6.0)、50mM NaClで平衡化したP6D
Gカラム(BioRad, Richmond, CA)上のゲル濾過により反
応を停止して、過剰のTraut試薬を除去した。260nmの吸
収をモニターして、オリゴヌクレオチドを含有する画分
を同定した。オリゴヌクレオチドの回収率は、約75％で
あった。次いで、Traut修飾NF1とNF2とをアニールし(最
終濃度0.55mg/ml)、そしてTraut修飾NF3とNF4とをアニ
ールした(最終濃度0.50mg/ml)。最終的に、室温で60分
間、１mlの100mM HEPES(pH 7.5)中で、0.4mgの各Traut
修飾DNAを0.6mgのtat37-72-BMH(上記の実施例９に記載
のように調製した)と反応させた。ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動、その後のゲルのエチジウムブロミド染色
により、架橋反応の進行をモニターした。一般に、これ
らの条件下で、約50％のDNAが修飾されたことを観察し
た。
【０２１４】これらの二本鎖DNA分子を、本質的にBieli
nskaら(前出)の方法に従って、tat結合がある場合およ
び無い場合についてNF-κB転写活性化の阻害を試験し
た。Tat結合は、NF-κBにより著しく転写活性化を増強
した。
【０２１５】本明細書中に記載した方法により調製され
る組換えDNA配列は、アメリカンタイプカルチャーコレ
クション、Rockville,Marylandにおいて寄託されたカル
チャーにより例示される。pJB106とEscherichia coliカ
ルチャーは、1993年７月28日に寄託され、そしてATCC受
託番号69368が与えられた。
【０２１６】本発明の多くの実施態様を記載したが、発
明者らの基本的な構築物は改変され得、本発明の方法お
よび産生物を利用する他の実施態様を提供し得ることは
明らかである。従って、本発明の範囲は実施例により提
供された特定の実施態様により規定されるのではなく上
述の特許請求の範囲により規定されるべきであることが
理解され得る。
【０２１７】
【発明の効果】本発明により、細胞質または核の作用部
位を有するタンパク質、核酸、および他の分子に関わる
病気の治療のための薬学的組成物が提供される。
【０２１８】
【配列表】
【０２１９】
【配列番号：１】 配列の長さ：86アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 免疫不全ウイルス 株名：１型 配列
【０２２０】
【表５】
【０２２１】
【配列番号：２】 配列の長さ：36アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０２２２】
【表６】
【０２２３】
【配列番号：３】 配列の長さ：22アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０２２４】
【表７】
【０２２５】
【配列番号：４】 配列の長さ：24アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０２２６】
【表８】
【０２２７】
【配列番号：５】 配列の長さ：15アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：配列番号：5：
【０２２８】
【表９】
【０２２９】
【配列番号：６】 配列の長さ：15アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０２３０】
【表１０】
【０２３１】
【配列番号：７】 配列の長さ：56アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０２３２】
【表１１】
【０２３３】
【配列番号：８】 配列の長さ：39塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２３４】
【表１２】
【０２３５】
【配列番号：９】 配列の長さ：39塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２３６】
【表１３】
【０２３７】
【配列番号：１０】 配列の長さ：5098塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２３８】
【表１４】
【０２３９】
【表１５】
【０２４０】
【表１６】
【０２４１】
【表１７】
【０２４２】
【配列番号：１１】 配列の長さ：4910塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２４３】
【表１８】
【０２４４】
【表１９】
【０２４５】
【表２０】
【０２４６】
【表２１】
【０２４７】
【配列番号：１２】 配列の長さ：29塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム） 配列
【０２４８】
【表２２】
【０２４９】
【配列番号：１３】 配列の長さ：２３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２５０】
【表２３】
【０２５１】
【配列番号：１４】 配列の長さ：4977塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２５２】
【表２４】
【０２５３】
【表２５】
【０２５４】
【表２６】
【０２５５】
【表２７】
【０２５６】
【配列番号：１５】 配列の長さ：27塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２５７】
【表２８】
【０２５８】
【配列番号：１６】 配列の長さ：27塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２５９】
【表２９】
【０２６０】
【配列番号：１７】 配列の長さ：4977塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２６１】
【表３０】
【０２６２】
【表３１】
【０２６３】
【表３２】
【０２６４】
【表３３】
【０２６５】
【配列番号：１８】 配列の長さ：59塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２６６】
【表３４】
【０２６７】
【配列番号：１９】 配列の長さ：26塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２６８】
【表３５】
【０２６９】
【配列番号：２０】 配列の長さ：4819塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２７０】
【表３６】
【０２７１】
【表３７】
【０２７２】
【表３８】
【０２７３】
【表３９】
【０２７４】
【配列番号：２１】 配列の長さ：45塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２７５】
【表４０】
【０２７６】
【配列番号：２２】 配列の長さ：5574塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：環状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２７７】
【表４１】
【０２７８】
【表４２】
【０２７９】
【表４３】
【０２８０】
【表４４】
【０２８１】
【配列番号：２３】 配列の長さ：20塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) ハイポセティカル配列：NO 配列
【０２８２】
【表４５】
【０２８３】
【配列番号：２４】 配列の長さ：17塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２８４】
【表４６】
【０２８５】
【配列番号：２５】 配列の長さ：50塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム） 配列
【０２８６】
【表４７】
【０２８７】
【配列番号：２６】 配列の長さ：５８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２８８】
【表４８】
【０２８９】
【配列番号：２７】 配列の長さ：48塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２９０】
【表４９】
【０２９１】
【配列番号：２８】 配列の長さ：46塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２９２】
【表５０】
【０２９３】
【配列番号：２９】 配列の長さ：26塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２９４】
【表５１】
【０２９５】
【配列番号：３０】 配列の長さ：52塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２９６】
【表５２】
【０２９７】
【配列番号：３１】 配列の長さ：51塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０２９８】
【表５３】
【０２９９】
【配列番号：３２】 配列の長さ：52塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３００】
【表５４】
【０３０１】
【配列番号：３３】 配列の長さ：30塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３０２】
【表５５】
【０３０３】
【配列番号：３４】 配列の長さ：26塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３０４】
【表５６】
【０３０５】
【配列番号：３５】 配列の長さ：10塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３０６】
【表５７】
【０３０７】
【配列番号：３６】 配列の長さ：27塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３０８】
【表５８】
【０３０９】
【配列番号：３７】 配列の長さ：27塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３１０】
【表５９】
【０３１１】
【配列番号：３８】 配列の長さ：134アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３１２】
【表６０】
【０３１３】
【表６１】
【０３１４】
【配列番号：３９】 配列の長さ：55塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３１５】
【表６２】
【０３１６】
【配列番号：４０】 配列の長さ：51塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３１７】
【表６３】
【０３１８】
【配列番号：４１】 配列の長さ：46塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３１９】
【表６４】
【０３２０】
【配列番号：４２】 配列の長さ：54塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３２１】
【表６５】
【０３２２】
【配列番号：４３】 配列の長さ：39塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３２３】
【表６６】
【０３２４】
【配列番号：４４】 配列の長さ：39塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３２５】
【表６７】
【０３２６】
【配列番号：４５】 配列の長さ：39塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３２７】
【表６８】
【０３２８】
【配列番号：４６】 配列の長さ：39塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA(ゲノム) 配列
【０３２９】
【表６９】
【０３３０】
【配列番号：４７】 配列の長さ：12アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０３３１】
【表７０】
【０３３２】
【配列番号：４８】 配列の長さ：26アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０３３３】
【表７１】
【０３３４】
【配列番号：４９】 配列の長さ：35アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０３３５】
【表７２】
【０３３６】
【配列番号：５０】 配列の長さ：21アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０３３７】
【表７３】
【０３３８】
【配列番号：５１】 配列の長さ：121アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３３９】
【表７４】
【０３４０】
【配列番号：５２】 配列の長さ：15アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０３４１】
【表７５】
【０３４２】
【配列番号：５３】 配列の長さ：25アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
【０３４３】
【表７６】
【０３４４】
【配列番号：５４】 配列の長さ：85アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３４５】
【表７７】
【０３４６】
【表７８】
【０３４７】
【配列番号：５５】 配列の長さ：121アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３４８】
【表７９】
【０３４９】
【配列番号：５６】 配列の長さ：161アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３５０】
【表８０】
【０３５１】
【配列番号：５７】 配列の長さ：249アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３５２】
【表８１】
【０３５３】
【表８２】
【０３５４】
【配列番号：５８】 配列の長さ：385アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３５５】
【表８３】
【０３５６】
【表８４】
【０３５７】
【表８５】
【０３５８】
【配列番号：５９】 配列の長さ：148アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３５９】
【表８６】
【０３６０】
【表８７】
【０３６１】
【配列番号：６０】 配列の長さ：157アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３６２】
【表８８】
【０３６３】
【表８９】
【０３６４】
【配列番号：６１】 配列の長さ：177アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３６５】
【表９０】
【０３６６】
【表９１】
【０３６７】
【配列番号：６２】 配列の長さ：187アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３６８】
【表９２】
【０３６９】
【表９３】
【０３７０】
【配列番号：６３】 配列の長さ：143アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【０３７１】
【表９４】
【０３７２】
【表９５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 HIV-1 tatタンパク質のアミノ酸配列(配列番
号:１)を示す図である。
【図２】 輸送ポリペプチド−シュードモナス外毒素リ
ボシル化ドメイン複合体を用いた細胞取り込み実験の結
果をグラフである。
【図３】 輸送ポリペプチド−リボヌクレアーゼ複合体
を用いた細胞取り込み実験の結果を示すグラフである。
【図４】 プラスミドpAHE2の構築を模式的に示す図で
ある。
【図５】 プラスミドpET8c123の構築を模式的に示す図
である。
【図６】 プラスミドpET8c123CCSSの構築を模式的に示
す図である。
【図７】 輸送ポリペプチドＥ2リプレッサー複合体を
用いた細胞取り込み実験の結果を示すグラフである。
【図８】 プラスミドpTATΔcysの構築を模式的に示す
図である。
【図９】 プラスミドpFTE501の構築を模式的に示す図
である。
【図１０】 プラスミドpTATΔcys-249の構築を模式的
に示す図である。
【図１１】 プラスミドpJB106の構築を模式的に示す図
である。
【図１２】 タンパク質JB106の完全なアミノ酸配列を
示す図である。
【図１３】 JB106、TxHE2CCSS、およびHE2.123に関す
るＥ2抑制アッセイの結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 スティーブン イー． ファウエル アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01890，ウィンチェスター，ワン ブラッ ク ホース テラス（番地なし) (72)発明者 アール． ブレイク ペピンスキー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02174，アーリントン，フォルマス ロー ド 30

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端
    輸送部分とからなる融合タンパク質の、該カーゴ部分の
    細胞内送達のための医薬品の製造のための使用方法であ
    って、該融合タンパク質が以下からなる群から選択され
    る、使用方法： （１）(a)輸送部分が、(i) HIV tatタンパク質のアミノ
    酸49-57の存在；(ii)HIV tatタンパク質のアミノ酸22-3
    6の不在；および(iii) HIV tatタンパク質のアミノ酸73
    -86の不在；で特徴付けられ、そして、(b)カーゴ部分が
    輸送部分依存性の細胞内送達後に有意な生物学的活性を
    維持する融合タンパク質； （２）カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分
    とからなる融合タンパク質であって、該カーゴ部分が、
    標的細胞に送達後に生物学的活性を維持するヒトパピロ
    ーマウイルスＥ2リプレッサーからなり、そして該輸送
    部分が、(a) HIVtatタンパク質のアミノ酸47-58(配列番
    号:47)；(b) HIV tatタンパク質のアミノ酸47-72(配列
    番号:48)；(c) HIV tatタンパク質のアミノ酸38-72(配
    列番号:49)；および、(d) HIV tatタンパク質のアミノ
    酸38-58(配列番号:50)；からなる群より選択される、融
    合タンパク質； （３）融合タンパク質JB106(配列番号:38)； （４）融合タンパク質JB117(配列番号:59)； （５）融合タンパク質JB118(配列番号:60)； （６）融合タンパク質JB122(配列番号:63)； （７）カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分
    とからなる融合タンパク質であって、該カーゴ部分が、
    標的細胞に送達後に生物学的活性を維持するウシパピロ
    ーマウイルスＥ2リプレッサーからなり、そして該輸送
    部分が、(a) HIVtatタンパク質のアミノ酸47-62(配列番
    号:52)；および(b) HIV tatタンパク質のアミノ酸38-62
    (配列番号:53)；からなる群より選択される、融合タン
    パク質； （８）融合タンパク質JB119(配列番号:61)； （９）融合タンパク質JB120(配列番号:62)；ならびに （10）カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分
    とからなる融合タンパク質であって、該カーゴ部分がHS
    V VP16タンパク質のアミノ酸43-412からなり、そして該
    輸送部分がHIV tatタンパク質のアミノ酸47-58からな
    る、融合タンパク質。
  2. 【請求項２】 前記（１）の融合タンパク質において、
    前記カーゴ部分が、治療用分子、予防用分子、および診
    断用分子からなる群より選択される、請求項１に記載の
    使用方法。
  3. 【請求項３】 前記（２）の融合タンパク質において、
    前記輸送部分の前にアミノ末端メチオニンがある、請求
    項１に記載の使用方法。
  4. 【請求項４】 前記（１）または（２）の融合タンパク
    質において、前記カーゴ部分がヒトパピローマウイルス
    Ｅ2タンパク質のアミノ酸245-365(配列番号:51)からな
    る、請求項１から３のいずれかに記載の使用方法。
  5. 【請求項５】 前記（７）の融合タンパク質において、
    前記輸送タンパク質の前にアミノ末端メチオニンがあ
    る、請求項１に記載の使用方法。
  6. 【請求項６】 前記（１）または（７）の融合タンパク
    質において、前記カーゴ部分が、ウシパピローマウイル
    スＥ2タンパク質のアミノ酸250-410(配列番号:56)から
    なるＥ2リプレッサーである、請求項１、２、または５
    に記載の使用方法。
  7. 【請求項７】 前記（10）の融合タンパク質において、
    前記輸送部分の前にアミノ末端メチオニンがある、請求
    項１に記載の使用方法。
  8. 【請求項８】 輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とか
    らなる共有結合した化学的複合体の、該カーゴ部分の細
    胞内送達のための医薬品の製造のための使用方法であっ
    て、該化学的複合体が以下からなる群から選択される、
    使用方法： （１）(a)輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とからな
    る共有結合した化学的複合体であって、該複合体の該輸
    送ポリペプチド部分が、(i) HIV tatタンパク質のアミ
    ノ酸49-57の存在；(ii) HIV tatタンパク質のアミノ酸2
    2-36の不在；および(iii) HIV tatタンパク質のアミノ
    酸73-86の不在；で特徴付けられ、そして、(b)該複合体
    の該カーゴ部分が、輸送部分依存性の細胞内送達後に有
    意な生物学的活性を維持する、化学的複合体； （２）輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とからなる共
    有結合した化学的複合体であって、該輸送ポリペプチド
    部分が、HIV tatタンパク質のアミノ酸37-72(配列番号:
    ２)からなり、そして該カーゴ部分が、(a)ヒトパピロー
    マウイルスＥ2タンパク質のアミノ酸245-365(配列番号:
    51)；および(b)ヒトパピローマウイルスＥ2タンパク質
    のアミノ酸245-365(ここでアミノ酸300および309がシス
    テインに置換している)(配列番号:55)からなる群より選
    択される、化学的複合体；ならびに （３）輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とからなる共
    有結合した化学的複合体であって、該輸送ポリペプチド
    部分が、HIV tatタンパク質のアミノ酸37-72(配列番号:
    ２)からなり、そして該カーゴ部分が、(a)オリゴヌクレ
    オチドNF2(配列番号:44)にアニールするオリゴヌクレオ
    チドNF1(配列番号:43)、および(b)オリゴヌクレオチドN
    F4(配列番号:46)にアニールするオリゴヌクレオチドNF3
    (配列番号:45)からなる群より選択される、化学的複合
    体。
  9. 【請求項９】 前記（１）の化学的複合体において、前
    記輸送ポリペプチド部分が、HIV tatタンパク質のアミ
    ノ酸37-72(配列番号:２)からなる、請求項８に記載の使
    用方法。
  10. 【請求項１０】 前記（１）の化学的複合体において、
    前記カーゴ部分が、(a)ヒトパピローマウイルスＥ2タン
    パク質のアミノ酸245-365(配列番号:51)；および、(b)
    ヒトパピローマウイルスＥ2タンパク質のアミノ酸245-3
    65(ここでアミノ酸300および309はシステインに置換し
    ている)(配列番号:55)；からなる群より選択される、請
    求項９に記載の使用方法。
  11. 【請求項１１】 薬学的に有効な量の融合タンパク質を
    含む、ウイルス感染症を防止するための薬学的組成物で
    あって、該融合タンパク質は以下からなる群から選択さ
    れる、薬学的組成物： （１）(a)輸送部分が、(i) HIV tatタンパク質のアミノ
    酸49-57の存在；(ii)HIV tatタンパク質のアミノ酸22-3
    6の不在；および(iii) HIV tatタンパク質のアミノ酸73
    -86の不在；で特徴付けられ、そして、(b)カーゴ部分が
    輸送部分依存性の細胞内送達後に有意な生物学的活性を
    維持する融合タンパク質； （２）カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分
    とからなる融合タンパク質であって、該カーゴ部分が、
    標的細胞に送達後に生物学的活性を維持するヒトパピロ
    ーマウイルスＥ2リプレッサーからなり、そして該輸送
    部分が、(a) HIVtatタンパク質のアミノ酸47-58(配列番
    号:47)；(b) HIV tatタンパク質のアミノ酸47-72(配列
    番号:48)；(c) HIV tatタンパク質のアミノ酸38-72(配
    列番号:49)；および、(d) HIV tatタンパク質のアミノ
    酸38-58(配列番号:50)；からなる群より選択される、融
    合タンパク質； （３）融合タンパク質JB106(配列番号:38)； （４）融合タンパク質JB117(配列番号:59)； （５）融合タンパク質JB118(配列番号:60)； （６）融合タンパク質JB122(配列番号:63)； （７）カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分
    とからなる融合タンパク質であって、該カーゴ部分が、
    標的細胞に送達後に生物学的活性を維持するウシパピロ
    ーマウイルスＥ2リプレッサーからなり、そして該輸送
    部分が、(a) HIVtatタンパク質のアミノ酸47-62(配列番
    号:52)；および(b) HIV tatタンパク質のアミノ酸38-62
    (配列番号:53)；からなる群より選択される、融合タン
    パク質； （８）融合タンパク質JB119(配列番号:61)；ならびに （９）融合タンパク質JB120(配列番号:62)。
  12. 【請求項１２】 前記（１）の融合タンパク質におい
    て、前記カーゴ部分が、治療用分子、予防用分子、およ
    び診断用分子からなる群より選択される、請求項１１に
    記載の薬学的組成物。
  13. 【請求項１３】 前記（２）の融合タンパク質におい
    て、前記輸送部分の前にアミノ末端メチオニンがある、
    請求項１１に記載の薬学的組成物。
  14. 【請求項１４】 前記（１）または（２）の融合タンパ
    ク質において、前記カーゴ部分がヒトパピローマウイル
    スＥ2タンパク質のアミノ酸245-365(配列番号:51)から
    なる、請求項１１から１３のいずれかに記載の薬学的組
    成物。
  15. 【請求項１５】 前記（７）の融合タンパク質におい
    て、前記輸送タンパク質の前にアミノ末端メチオニンが
    ある、請求項１１に記載の薬学的組成物。
  16. 【請求項１６】 前記（１）または（７）の融合タンパ
    ク質において、前記カーゴ部分が、ウシパピローマウイ
    ルスＥ2タンパク質のアミノ酸250-410(配列番号:56)か
    らなるＥ2リプレッサーである、請求項１１、１２、ま
    たは１５に記載の薬学的組成物。
  17. 【請求項１７】 薬学的に有効な量の融合タンパク質を
    含む、ウイルス感染症を防止するための薬学的組成物で
    あって、該融合タンパク質は以下である、薬学的組成
    物：カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸送部分と
    からなる融合タンパク質であって、該カーゴ部分がHSV
    VP16タンパク質のアミノ酸43-412からなり、そして該輸
    送部分がHIV tatタンパク質のアミノ酸47-58からなる、
    融合タンパク質。
  18. 【請求項１８】 前記融合タンパク質において、前記輸
    送部分の前にアミノ末端メチオニンがある、請求項１７
    に記載の薬学的組成物。
  19. 【請求項１９】 薬学的に有効な量の化学的複合体を含
    む、ウイルス感染症を防止するための薬学的組成物であ
    って、該化学的複合体は、以下からなる群から選択され
    る、薬学的組成物： （１）(a)輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とからな
    る共有結合した化学的複合体であって、該複合体の該輸
    送ポリペプチド部分が、(i) HIV tatタンパク質のアミ
    ノ酸49-57の存在；(ii) HIV tatタンパク質のアミノ酸2
    2-36の不在；および(iii) HIV tatタンパク質のアミノ
    酸73-86の不在；で特徴付けられ、そして、(b)該複合体
    の該カーゴ部分が、輸送部分依存性の細胞内送達後に有
    意な生物学的活性を維持する、化学的複合体； （２）輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とからなる共
    有結合した化学的複合体であって、該輸送ポリペプチド
    部分が、HIV tatタンパク質のアミノ酸37-72(配列番号:
    ２)からなり、そして該カーゴ部分が、(a)ヒトパピロー
    マウイルスＥ2タンパク質のアミノ酸245-365(配列番号:
    51)；および(b)ヒトパピローマウイルスＥ2タンパク質
    のアミノ酸245-365(ここでアミノ酸300および309がシス
    テインに置換している)(配列番号:55)からなる群より選
    択される、化学的複合体；ならびに （３）輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とからなる共
    有結合した化学的複合体であって、該輸送ポリペプチド
    部分が、HIV tatタンパク質のアミノ酸37-72(配列番号:
    ２)からなり、そして該カーゴ部分が、(a)オリゴヌクレ
    オチドNF2(配列番号:44)にアニールするオリゴヌクレオ
    チドNF1(配列番号:43)、および(b)オリゴヌクレオチドN
    F4(配列番号:46)にアニールするオリゴヌクレオチドNF3
    (配列番号:45)からなる群より選択される、化学的複合
    体。
  20. 【請求項２０】 前記（１）の化学的複合体において、
    前記輸送ポリペプチド部分が、HIV tatタンパク質のア
    ミノ酸37-72(配列番号:２)からなる、請求項１９に記載
    の薬学的組成物。
  21. 【請求項２１】 前記（１）の化学的複合体において、
    前記カーゴ部分が、(a)ヒトパピローマウイルスＥ2タン
    パク質のアミノ酸245-365(配列番号:51)；および、(b)
    ヒトパピローマウイルスＥ2タンパク質のアミノ酸245-3
    65(ここでアミノ酸300および309はシステインに置換し
    ている)(配列番号:55)；からなる群より選択される、請
    求項２０に記載の薬学的組成物。
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