NO316761B1

NO316761B1 - tat-avledede transportpolypeptider

Info

Publication number: NO316761B1
Application number: NO19944273A
Authority: NO
Inventors: James G Barsoum; Stephen E Fawell; Blake R Pepinsky
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1992-08-21
Filing date: 1994-11-09
Publication date: 2004-05-03
Also published as: HK1012678A1; DE69321962D1; JPH07503617A; JPH1033186A; DE69321962T2; KR0153027B1; EP0656950B1; FI120495B; WO1994004686A1; JP2869396B2; CA2135642C; CA2135642A1; NZ255831A; EP2000536A2; EP0903408A2; AU5083293A; EP0656950A1; ES2123062T3; JP2702285B2; NO944273L

Description

TEKNISK OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører leveringen av biologisk aktive cargomolekyler, så som polypeptider og nukleinsyrer, til cytoplasma og cellekjerner in vitro og in vivo. Intracellulær levering av cargomolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse oppnås ved anvendelse av nye transportpolypeptider som inneholder én eller flere HIV-tat-proteindeler og som er kovalent bundet til cargomolekyler. Transportpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved nærværet av tat-baseområdet {aminosyrer 49-57), fraværet av det tat-cysteinrike område (aminosyrer 22-36) og fraværet av det tat-ekson-2-kodede karboksyendeområde (aminosyrer 73-86) av det naturlig forekommende tat-protein. Takket være fraværet av det cysteinrike område som finnes i de konvensjonelle tat-proteiner, løser transportpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse problemer med uønsket transaktivering og disulfidaggregasjon. Den minkede stør-relse av transportpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse minimerer dessuten forstyrrelser av cargomolekylenes biologiske aktivitet.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Biologiske celler er generelt ugjennomtrengelige for makromolekyler, deriblant proteiner og nukleinsyrer. Enkelte små molekyler trenger inn i levende celler med meget lav hastighet. Mangelen av måter for å levere makromolekyler til celler in vivo har vært en hindring til den terapeutiske, forebyggende og diagnostiske anvendelse av et potensielt stort antall proteiner og nukleinsyrer som har intracellulære virkningsområder. Følgelig er de fleste terapeutiske, forebyggende og diagnostiske midler i dag som anvender rekombinant DNA-teknologi, polypeptider som utfolder sin virkning i det ekstracellulære område eller på overflaten av målcellen.

Diverse fremgangsmåter er blitt utviklet for å levere makromolekyler inn i celler in vitro. Disse fremgangsmåter omfatter elektroforese, membranfusjon med liposomer, høy-hastighet sbombardering med DNA-belagte mikroprosjektiler, inkubasjon med kalsiumfosfat-DNA-feining, DEAE-dekstranme-diert transferese, infeksjon med modifiserte virusnuklein-syrer og direkte mikroinjeksjon inn i enkelte celler. Disse in vitro-fremgangsmåter leverer vanligvis nukleinsyremole-kylene kun til en brøkdel av den totale cellebestand, og de skader ofte store antall celler. Eksperimentell innføring av makromolekyler inn i celler in vivo er blitt gjennomført ved "scrape loading", kalsiumfosfatfeininger og liposomer. Imidlertid har disse teknikker til dato kun oppvist en begrenset effektivitet for in vivo levering til celler. I tillegg er slike fremgangsmåter selv med celler in vitro av meget begrenset effektivitet for levering av proteiner.

Det trenges generelle fremgangsmåter for effektiv levering av biologisk aktive proteiner i hele celler, in vitro og in vivo [L.A. Sternson, "Obstacles to Polypeptide Delivery", Ann. N. Y. Acad. Sei., 57, sider 19-21 (1987)]. Kjemisk ad-disjon av et lipopeptid [P. Hoffmann et al., "Stimulation of Human and Murine Adherent Cells by Bacterial Lipoprotein and Synthetic Lipopeptide Analogues", Immunobiol., 177, sider 158-170 (1988)] eller et basisk polymer så som polylysin eller polyarginin [W.-C. Chen et al., "Conjugation of Poly-L-Lysine Albumin and Horseradish Peroxidase: A Novel Method of Enhancing the Cellular Uptake of Proteins", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75, sider 1872-1876 (1978)] har ikke vist seg å være spesielt pålitelige eller generelt nyttige (jfr. eksempel 4 infra). Folinsyre er blitt anvendt som en transportenhet (CP. Leamon og Low, "Delivery of Macromole-cules into Living Cells: A Method That Exploits Folate Re-ceptor Endocytosis", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88, sider 5572-5576 (1991)]. Det ble presentert tegn for opptak av folinkonjugater, men ikke for cytoplasmalevering. Med hensyn til de høye nivåer av sirkulerende folin in vivo, er effektiviteten av denne fremgangsmåte ikke blitt troverdig demonstrert. PBeudomonas eksotoksin er også blitt anvendt som transportenhet [T.I. Prior et al., "Barnase Toxin: A New Cimeric Toxin Composed of Pseudomonas Exotoxin A and Barnase", Cell, 64, sider 1017-1023 (1991)]. Imidlertid gir de publiserte skrifter ingen klar idé om effektiviteten og den generelle anvendelighet av denne fremgangsmåte.

Tat-proteinet av human immunodefisiensvirus type 1 ("HIV") har demonstrert et potensiale for å levere cargoproteiner inn i celler (publisert PCT-søknad WO 91/09958). Med hensyn til de kjemiske egenskaper av tat-proteinet i sin fulle lengde, er det imidlertid ikke kjent noen generelt anvende-lige fremgangsmåter innen faget for en effektiv anvendelse av det ved levering av biologisk aktiv cargo.

Tat er et HIV-kodet protein som transaktiverer enkelte HIV-gener og er nødvendige for virusreplikasjonen. I sin fulle lengde har HIV-1-tat-proteinet 86 aminosyreresiduer. HIV-tat-genet har to eksoner. Tat-aminosyrer 1-72 er kodet i ekson 1, og aminosyrer 73-86 i ekson 2. I sin fulle lengde kjennetegnes tat-proteinet ved et basisk område som inneholder to lysiner og seks argininer (aminosyrer 4 9-57) og et cysteinrikt område som inneholder syv cysteinresiduer {aminosyrer 22-37) . Renset tat-protein tas opp fra det om-givende medium av humanceller i en voksende kultur [A.D. Frankel og CO. Pabo, "Cellular Uptake of the Tat Protein from Human Immunodeficiency Virus", Cell, 55, side 1189-1193 (1988)] . Det er ikke kjent innen faget om det cysteinrike område av tat-proteinet (hvilket område forårsaker aggregasjon og uløselighet) er påkrevd for cellens opptak av tat-proteinet.

PCT-patentsøknad WO 91/09958 {heretter nevnt '958-søknaden) frembringer at et heterologt protein bestående av aminosyrene 1-67 av et HIV-tat-protein genetisk fusjonert med et pap illomavirus-E2-1ransakt iverings-repressor-polypept id, tas opp av dyrkede celler. Imidlertid demonstreres ikke om cargopolypeptidets biologiske aktivitet (hemming av E2-

transaktivering) fortsatt består.

Anvendelsen av tat-proteinet ifølge '958-søknaden kan føre med seg praktiske vanskeligheter når det anvendes for cellulær levering av cargoproteiner. Disse praktiske vanskeligheter omfatter proteinaggregasjon og uløselighet forbundet med det cysteinrike område av tat-proteinet. Videre gir

■958-søknaden ingen eksempler på kjemiske tverrbindinger av tat-proteiner med cargoproteiner, hvilke kan være kritiske i situasjoner når den genetiske fusjon av tat til cargoproteinet hindrer tat-proteinets eller cargoproteinets, eller begges, riktige folding. Videre demonstrerer både '958-søk-naden og Frankel og Pabo ( supra) anvendelsen av tat-transportproteiner sammen med klorokin, hvilket er cytotoksisk. Det trenges derfor et generelt anvendbart middel for sikker og effektiv levering av biologisk aktive cargomolekyler inn i cytoplasma og kjernen av levende celler.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse løser ovennevnte problemer ved å frembringe produkter for effektiv levering til cytoplasma og cellekjerner av biologisk aktive ikke-tat-proteiner, nukleinsyrer og andre molekyler som (1) i seg ikke er i stand til å trenge inn i celler eller cellekjerner, eller (2) i seg ikke er i stand til å trenge inn i celler med en akseptabel hastighet. Intracellulær levering av cargomolekyler ifølge foreliggende oppfinnelse oppnås ved anvendelse av nye transportproteiner som omfatter én eller flere deler av HIV-tat-proteinet og som er kovalent bundet til cargomolekylet. Mer spesielt vedrører foreliggende oppfinnelse nye transportpolypeptider, fremgangsmåter for fremstilling av slike transportpolypeptider, transportpolypeptid-cargokon-jugager, farmasøytiske, forebyggende og diagnostiske sammensetninger inneholdende transportpolypeptid-cargokonjugater og fremgangsmåter for levering av cargo inn i celler ved hjelp av tat-beslektede transportpolypeptider. Transportpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved nærværet av tat-baseområdets aminosyresekvens (aminosyrer 49-57 av det naturlig forekommende tat-protein) ; fraværet av det tat-cysteinrike områdes aminosyresekvens (aminosyrer 22-36 av det naturlig forekommende tat-protein) og fraværet av tat-ekson-2-kodet karboksyendeområdet (aminosyrer 73-86 av det naturlig forekommende tat-protein) . Foretrukne utførelsesformer for slike transport-polypeptider er: tat37-72 (SEKV-ID Nr. 2), tat37-58 (SEKV-ID Nr. 3), tat38-58GGC (SEKV-ID Nr. 4), tatCGG47-58 (SEKV-ID Nr. 5), tat47-58GGC (SEKV-ID Nr. 6) og tatAcys (SEKV-ID Nr. 7). For personer med kunnskap innen faget vil det være åpenbart at når transportpolypeptidet genetisk fusjoneres med cargodelen, må det tilsettes et aminoendemetionin, men det trenger ikke tilsettes noen avstandsholdende aminosyrer (f.eks. CysGlyGly eller GlyGlyCys). Takket være fraværet av det cysteinrike område som finnes i konvensjonelle tat-proteiner, løser transportpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse problemer med disulfidaggregasjon, hvilken kan resultere i at cargoen mister sin biologiske aktivitet og/eller i at transportpolypeptid-cargokonjugatet blir ulø-selig. Den reduserte størrelse av transportpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse minimerer dessuten på fordelaktig måte forstyrrelser av cargoens biologiske aktivitet. En ytterligere fordel av transportpolypeptidets reduserte størrelse er en forbedret opptakseffektivitet i utfø-relsesformer av foreliggende forbindelse som innebærer fes-ting av flere transportpolypeptider til et cargomolekyl.

Transportpolypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan med fordel festes til cargomolekyler ved kjemisk tverrbinding eller ved genetisk fusjon. Ifølge foretrukne utførel-sesformer av foreliggende oppfinnelse, tverrforbindes transportpolypeptidet og cargomolekylet kjemisk. Et unikt endecysteinresiduum er det foretrukne middel for kjemisk tverrbinding. Ifølge andre foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse fusjoneres karboksyenden av transportdelen genetisk med aminoenden av cargodelen. En spesielt foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er JB106, hvilken består av et aminoendemetionin etterfulgt av tat-residuer 47-58, etterfulgt av HPV-16-E2-residuer 245-365.

I mange tilfeller unngår de nye transportpolypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse på fordelaktig måte toksisitet forbundet med klorokin. Ifølge en foretrukket utfø-relsesf orm av foreliggende oppfinnelse leveres en biologisk aktiv cargo inn i cellene av diverse organer og vev, etter tilføring av et transportpolypeptid-cargokonjugat til et levende menneske eller dyr. Takket være ovennevnte trekk, åpner foreliggende oppfinnelse veien for biologisk forskning og sykdomsbehandling under anvendelse av proteiner, nukleinsyrer og andre molekyler som utfolder sin virkning i cytoplasma eller cellekjernen.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 viser aminosyresekvensen av et HIV-1 tat-protein (SEKV-ID Nr. 1). Figur 2 oppsummerer resultatene av celleopptakseksperimenter med transportpolypeptid-Pseudomonas eksotoksin-ribosyl-eringsområdekonjugater (skyggede stolper: ukonjugert; dia-gonalt skraverte stolper: konjugert). Figur 3 oppsummerer resultater av celleopptakseksperimenter med transportpolypeptid-ribonukleasekonjugater (sluttede firkanter: ribonuklease-SMCC uten transportdel; sluttede sirkler: tat37-72-ribonuklease; sluttede trekanter: tat38-58GGC-ribonuklease; sluttede ruter: tatCGG38-58-ribonuklease; firkantet omriss: tatCGG47-58-ribonuklease). Figur 4 viser skjematisk konstruksjonen av plasmidet pAHE2. Figur 5 viser skjematisk konstruksjonen av plasmidet pET8cl23. Figur 6 viser skjematisk konstruksjonen av plasmidet pET8cl23CCSS. Figur 7 oppsummerer resultatene av celleopptakseksperimeter med transportpolypeptid-E2-repressor-konjugater (ruteom-riss: E2.123 tverrforbundet med tat37-72 uten klorokin; sluttede ruter: E2.123 tverrforbundet med tat37-72 med klorokin; sirkelomriss: E2.123CCSS tverrforbundet med tat37-72 uten klorokin; sluttede sirkler: E2.123CCSS tverrforbundet med tat3 7-72 med klorokin). Figur 8 viser skjematisk konstruksjonen av plasmidet pTATAcys. Figur 9 viser skjematisk konstruksjonen av plasmidet pFTE501. Figur 10 viser skjematisk konstruksjonen av plasmidet pTATAcys-249. Figur 11 viser skjematisk konstruksjonen av plasmidet pJB106. Figur 12 viser den komplette aminosyresekvens av protein JB106. Figur 13 oppsummerer resultatene av E2-hemmingstester med JB106 (firkanter), TxHE2CCSS (ruter) ogHE2.123 (sirkler). Testene ble utført i COS7-celler uten klorokin, som beskrevet i eksempel 14.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

For en full forståelse for oppfinnelsen beskrevet heri, følger en detaljert beskrivelse nedenfor.

I beskrivelsen anvendes følgende begreper:

Aminosyre: En monomer enhet av et peptid, et polypeptid eller protein. De tjue proteinaminosyrer (L-isomerer) er: alanin ("Ala" eller "A"), arginin ("Arg" eller "R"), aspa-ragin ("Asn" eller "N"), asparaginsyre ("Asp" eller "D") , cystein ("Cys" eller "C"), glutamin ("Gin" eller "Q"), glu-taminsyre ("Glu" eller "E"), glycin ("Gly" eller "G"), histidin ("His" eller "H"), isoleucin ("Ile" eller "I"), leucin ("Leu" eller "L"), lysin f"Lys" eller "K"), metionin ("Met" eller "M"), fenylalanin {"Phe" eller "F"), prolin ("Pro" eller "P"), serin ("Ser" eller "S"), threonin ("Thr" eller "T"), tryptofan ("Trp" eller "W"), tyrosin ("Tyr" eller "Y") og valin ("Val" eller "V"). Begrepet aminosyre, som anvendt heri, omfatter også analoger av proteinaminosyrene og D-isomerer av proteinaminosyrene og deres analoger .

Cargo: Et molekyl som ikke er et tat-protein eller et fragment derav og som enten (1) i seg ikke er i stand til å trenge inn i målceller, eller (2) i seg ikke er i stand til å trenge inn i målceller med en akseptabel hastighet.

("Cargo" som anvendt i foreliggende patentsøknad, vedrører enten et molekyl i seg, dvs. før konjugasjon, eller til cargodelen av et transportpolypeptid-cargokonjugat.) Eksempler på "cargo" omfatter, men er ikke begrenset til, små molekyler og makromolekyler, så som polypeptider, nukleinsyrer og polysakkarider.

Kjemisk tverrbinding: Kovalent binding av to eller flere forformulerte molekyler.

Cargokonjugat: Et molekyl bestående av minst én transportpolypeptiddel og minst én cargodel, dannet enten ved genetisk fusjon eller kjemisk tverrforbindelse av et transportpolypeptid og et cargomolekyl.

Genetisk fusjon: Kolineær, kovalent binding av to eller flere proteiner ved deres polypeptidstamme, ved genetisk ekspresjon av tilgrensende DNA-sekvenser som koder protei-nene .

Makromolekyl: Et molekyl, så som et peptid, polypeptid, protein eller en nukleinsyre.

Polypeptid: Enhver polymer hovedsaklig bestående av enhver av de 20 proteinaminosyrer (ovenfor), uansett størrelse. Selv om "protein" ofte anvendes under henvisning til relativt store polypeptider, og "peptid" ofte anvendes under henvisning til små polypeptider, overlapper og varierer anvendelsen av disse begreper innen faget. Begrepet "polypeptid" som anvendt heri, vedrører peptider, polypeptider og proteiner, hvis intet annet er angitt.

Reportergen: Et gen, hvis ekspresjon er avhengig av inntre-den av en aktuell cellulær hendelse, og hvis ekspresjon kan betraktes i en genetisk omdannet vertcelle.

Reporterplasmid: En plasmidvektor omfattende ett eller flere reportergener.

Lite molekyl: Ethvert molekyl som ikke er makromolekyler.

Avstandsholdende aminosyrer: En aminosyre (fortrinnsvis med en liten sidegren) plassert mellom en transportdel og et aminosyreresiduum anvendt for tverrbinding (f.eks, for å gi molekylfleksibilitet og å forhindre sterisk hindring).

Målcelle: En celle inn i hvilken et transportpolypeptid leverer en cargo. En "målcelle" kan være enhver celle, også menneskeceller, enten in vivo eller in vitro.

Transportdel eller transportpolypeptid: Et polypeptid som er i stand til å levere en kovalent forbundet cargo til en målcelle.

Foreliggende oppfinnelse er generelt anvendbar for terapeutisk, forebyggende eller diagnostisk intracellulær levering av små molekyler og makromolekyler, så som proteiner, nukleinsyrer og polysakkarider, som i seg ikke er istand til å trenge inn i målceller med en akseptabel hastighet. Det bør imidlertid påpekes at alternative utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til kliniske anvendelser. Foreliggende oppfinnelse kan med fordel utøves i medisinsk og biologisk forskning. I forskningsanvendelser av foreliggende oppfinnelse kan cargoen være et legemiddel eller et reportermolekyl. Transportpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes som laboratoriumreagen-ser innen forskningen, enten alene eller som en del av et transportpolypeptidkonjugasj onsutstyr.

Målcellene kan være in vivo-celler, dvs. celler som danner organer eller vev i levende dyr eller mennesker, eller mikroorganismer som finnes i levende dyr eller mennesker. Målcellene kan også være in vitro-celler, dvs. kultiverte dyreceller, menneskeceller eller mikroorganismer.

Det finnes et bredt spektrum ved valget av legemidler og reportermolekyler som skal anvendes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse. Faktorer som bør tas i betraktning når en velger reportermolekyler omfatter, men er ikke begrenset til, informasjonstypen som søkes, ikke-toksisitet, påvisningslettheten, kvantifiserbarheten av påvisningen samt tilgjengeligheten. Fagmenn er kjent med flere slike reportermolekyler.

Som vil bli tydelig fra eksemplene nedenfor, har vi anvendt enzymer, for hvilke det finnes kolorimetriske påvisnings-tester, som modellcargo for å bevise anvendeligheten og de nyttige trekk av transportpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse enzymcargoer muliggjør en følsom, bekvem visuell påvisning av cellenes opptak. Videre, siden den vi-suelle påvisning kun er mulig hvis cargoens enzymaktivitet

er bevart, muliggjør disse enzymer en følsom og pålitelig test for bibeholdningen av den biologiske aktivitet av car-

godelen i transportpolypeptid-cargokonjugater ifølge foreliggende oppfinnelse. En foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfatter pepperrotperoksydase ("HRP") som cargodelen av transportpolypeptid-cargokonjugatet. En spesielt foretrukket modellcargodel for utøvelse av foreliggende oppfinnelse er {3-galaktosidase.

Modellcargoproteiner kan også utvelges avhengig av deres virkningsområde innen cellen. Som beskrevet i eksempler 6 og 7 nedenfor, har vi anvendt ADP-ribosyleringsområdet fra Pseudomonas eksotoksin ("PE") og pankreasribonuklease for å bekrefte den cytoplasmiske levering av riktig foldede cargoproteiner ved transportpolypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse.

Pseudomonas eksotoksin i sin hele lengde er i seg i stand til å trenge seg inn i celler, hvor den inaktiverer ribosomer med hjelp av en ADP-ribosyleringsreaksjon og dermed dreper cellene. En del av Pseudomonas eksotoksinproteinet kjent som ADP-ribosyleringsområdet er ikke i stand til å trenge seg inn i celler, men den beholder evnen til å inak-tivere ribosomer hvis den bringes i kontakt med dem. Dermed er celledøden forårsaket av transportpolypeptid-PE-ADP-ri-bosyleringsområdekonjugater en test for levering til cytoplasma av cargo ved transportpolypeptidet.

Vi har også anvendt ribonuklease for å bekrefte leveringen til cytoplasma av et riktig foldet cargoprotein ved transportpolypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse. Protein-syntese, en RNA-avhengig prosess, er meget følsom for ribonuklease, hvilken bryter ned RNA. Ribonuklease er i seg imidlertid ikke i stand til å trenge inn i celler. Dermed er hemmingen av proteinsyntesen ved et transportpolypeptid-ribonukleasekonjugat en test for intracellulær levering av biologisk aktiv ribonuklease.

Leveringen av et gitt cargomolekyl til cytoplasma kan så klart følges av ytterligere levering av samme cargomolekyl til cellekjernen. Levering til cellekjernen krever nødven-digvis kryssing av en del av cytoplasma.

Papillomavirus E2-repressor-proteiner er eksempler på makromolekyllegemidler som kan leveres til målcellers kjerne ved transportpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Papillomavirus E2-protein, som normalt forekommer som en homodimer, regulerer både transkripsjonen og repli-kasjonen av papillomavirusgenomen. Karboksyendeområdet av E2-proteinet inneholder DNA-bindende og dimerisasjonsakti-viteter. Transient ekspresjon av DNA-sekvenser som koder diverse E2-analoger eller E2-karboksyendefragmenter i transfererte pattedyrceller hemmer transaktivering av E2-proteinet i sin hele lengde [J. Barsoum et al., "Mechanism of Action of the Papillomavirus E2 Repressor: Repression in the Absence of DNA Binding", J. Virol., 66, sider 3941-3945

(1992)]. E2-repressorer tilsatt til vekstmedium av kultiverte pattedyrceller trenger ikke inn i cellene og hemmer dermed ikke E2-transaktiveringen i disse celler. Imidlertid resulterer konjugasjon av transportpolypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse med E2-repressorer, i translokasjon av E2-repressorene fra vekstmediet inn i de kultiverte celler, hvor de oppviser biologisk aktivitet idet de hemmer E2-avhengig ekspresjon av et reportergen.

Hastigheten med hvilken enkeltkjedede og dobbeltkjedede nukleinsyrer trenger inn i celler, in vitro og in vivo, kan med fordel økes under anvendelse av transportpolypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse. Som vist i eksempel 11 (nedenfor), er fremgangsmåter for kjemisk tverrforbindelse av polypeptider til nukleinsyrer velkjent innen faget. I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse, er cargoen en enkeltkjedet motsatt rettet nukleinsyre. Motsatt rettede nukleinsyrer er nyttige for hemming av cellulær ekspresjon av sekvenser til hvilke de er komplementære. I en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er cargoen en dobbeltkjedet nukleinsyre omfattende en bindings-stilling som gjenkjennes av et nukleinsyrebindende protein. Et eksempel på et slikt nukleinsyrebindende protein er en viral transaktivator.

Naturlig forekommende HIV-1 tat-protein (figur 1) har et område (aminosyrer 22-37), hvor 7 av de 16 aminosyrer er cystein. Disse cysteinresiduser er i stand til å danne di-sulfidbindinger med hverandre, med cysteinresiduer i det cysteinrike område av andre tat-proteinmolekyler og med cysteinresiduer i et cargoprotein eller cargodelen av et konjugat. Slik disulfidbindingsdannelse kan forårsake at cargoen mister sin biologiske aktivitet. Videre, selv om det ikke finnes noe potensial for disulfidbinding til cargodelen (f.eks. når cargoproteinet ikke inneholder noen cysteinresiduer) , fører disulfidbindingsdannelse mellom transportpolypeptider til aggregasjon og uløselighet av transportpolypept idet, transportpolypept id-cargokonj ugatet eller begge. Det tat-cysteinrike område kan potensielt forårsake alvorlige problemer ved anvendelse av det naturlig forekommende tat-protein for levering inn i celler av cargomolekyler.

Det cysteinrike område er nødvendig for todeling av tat in vitro samt for transaktivering av DNA-sekvenser i HIV. Derfor har fjerningen av det tat-cysteinrike område den ytterligere fordel at den utelukker tafs naturlige aktivitet, dvs. bevirkning av HIV-transkripsjon og replikasjon. Imidlertid er det ikke kjent innen faget om det cysteinrike område av tat-proteinet er nødvendig for at tat-proteinet tas opp i cellene.

Foreliggende oppfinnelse omfatter utførelsesformer hvor problemene forbundet med det tat-cysteinrike område løses, siden dette område ikke er til stede i transportpolypeptidene som beskrives heri. I disse utførelsesformer forekommer fortsatt opptak av transportpolypeptidet eller transportpolypeptid- cargomoleky Ikon jugatet . I én gruppe av foretrukne utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse, fusjoneres sekvensen av aminosyrer som ligger foran det cysteinrike område, direkte til aminosyresekvensen som følger etter det cysteinrike område. Slike transportpolypeptider kalles tatAcys og har den generelle formel (tatl-21)-(tat38-n), hvor n er nummeret for karboksyenderesiduet, dvs. 49-86. Fortrinnsvis betyr n 58-72. Som vil bli klart fra eksemplene nedenfor, kreves aminosyresekvensen som ligger foran det cysteinrike område av tat-proteinet ikke for opptak i cellene. Et foretrukket transportpolypeptid {eller transportdel) består av aminosyrer 37-72 av tat-proteinet og kalles tat37-72 (SEKV-ID Nr. 2). Det foretrekkes å be-holde tat-residuum 37, et cystein, ved aminoenden av transportpolypeptidet, siden det er nyttig ved kjemisk tverrbinding.

Fordelene med tatAcys-polypeptider, tat3 7-72 og andre utfø-relsesf ormer av foreliggende oppfinnelse, omfatter følgen-de : a) Den naturlige aktivitet av tat-proteinet, dvs. bevirkning av HIV-transkripsjon og replikasjon, fjernes. b) Dimerer og høyere multimerer av transportpolypeptidet unngås. c) Ekspresjonsnivået for tatAcys genetiske fusjoner i E. coli kan forbedres. d) Enkelte transportpolypeptidkonjugater oppviser økt lø-selighet og lettere håndtering. e) Enkelte fusjonsproteiner oppviser økt aktivitet av cargodelen, sammenlignet med fusjoner inneholdende det cysteinrike område.

Et flertall fremgangsmåter for kjemisk tverrbinding er kjent og kan anvendes for å konjugere transportpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse til cargomakromoleky-ler. Flere kjente fremgangsmåter for kjemisk tverrbinding er ikke-spesifikke, dvs. de retter bindingsstedet ikke til noe spesielt sete på transportpolypeptidet eller cargomak-romolekylet. Som et resultat kan anvendelsen av ikkespesi-fikke tverrbindingsmidler angripe funksjonelle seter eller sterisk blokkere aktive seter og dermed gjøre de konjugerte proteiner biologisk inaktive.

En foretrukket fremgangsmåte for å øke bindingsspesifisite-ten ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse er direkte kjemisk binding til en funksjonell gruppe som kun finnes én gang eller enkelte ganger i ett eller begge polypeptider som skal tverrforbindes. I mange proteiner forekommer f.eks. cystein, som er den eneste proteinaminosyre som inneholder en tiolgruppe, kun noen få ganger. Videre, hvis et polypeptid f.eks. ikke inneholder noen lysinresiduer, vil et tverrbindende middel som er spesifikt for primære aminer være selektivt for aminoenden av dette polypeptid. For vel-lykket anvendelse av denne fremgangsmåte for å øke bin-dingsspesif isiteten, kreves det at polypeptidet oppviser de egnede sjeldne og reaktive residuer i områder av molekylet som kan forandres uten at man mister molekylets biologiske aktivitet.

Som vist i eksemplene nedenfor, kan cysteinresiduer erstattes når de forekommer i deler av en polypeptidsekvens hvor deres deltagelse i en tverrbindingsreaksjon sannsynligvis ville forstyrre den biologiske aktivitet. Når et cysteinresiduum erstattes, er det vanligvis ønskelig å minimere de resulterende forandringer i polypeptidets folding. Forandringer i polypeptidets folding minimeres når den erstat-tende forbindelse kjemisk og sterisk ligner cystein. Av disse grunner foretrekkes serin som en erstatter for cystein. Som demonstrert i eksemplene nedenfor kan et cysteinresiduum innføres i et polypeptids aminosyresekvens for tverrbindingsformål. Når et cysteinresiduum innføres, foretrekkes innføring ved eller nære amino- eller karboksyenden. Det er kjent konvensjonelle metoder for slike amino-syresekvensmodifikasjoner, enten det aktuelle polypeptid fremstilles ved kjemisk syntese eller ekspresjon av rekombinant DNA.

Tverrbindingsmidler kan være homobifunksjonelle, dvs. de har to funksjonelle grupper som gjennomgår samme reaksjon. Et foretrukket homobifunksjonelt tverrbindingsmiddel er bismaleimidoheksan ("BMH"). BMH inneholder to maleimido-funksjonelle grupper som reagerer spesifikt med sulfhydryl-holdige forbindelser under milde forhold (pH 6,5-7,7). De to maleimidogruppene er forbundet ved en hydrokarbonkjede. Derfor er BMH nyttig for irreversibel tverrbinding av polypeptider som inneholder cysteinresiduer.

Tverrbindingsmidler kan også være heterobifunksjonelie. He-tereobifunksjonelle tverrbindingsmidler har to forskjellige funksjonelle grupper, f.eks. en aminoreaktiv gruppe og en tiolreaktiv gruppe, som vil tverrforbinde to proteiner som har frie aminer hhv. tioler. Eksempler på heterobifunksjonelle tverrbindingsmidler er succinimidyl-4-(N-maleimidome-tyl)cykloheksan-l-karboksylat ("SMCC"), m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysukkinimidester ("MBS") og succinimid-4-{p-malei-midofenyl)butyrat ("SMPB"), en forlenget kjedeanalog av MBS. Succinimidylgruppen av disse tverrbindere reagerer med et primært amin, og det tiolreaktive maleimid danner en kovalent binding med tiolet av et cysteinresiduum.

Tverrbindingsmidler har ofte lav løselighet i vann. En hy-drofil del, så som en sulfonatgruppe, kan tilsettes til tverrbindingsmidlet for å forbedre dets vannløselighet. Sulfo-MBS og sulfo-SMCC er eksempler på tverrbindingsmidler som er modifisert for bedre vannløselighet.

Mange tverrbindingsmidler gir et konjugat som under cellulære forhold i alt vesentlig ikke er spaltbart. Imidlertid inneholder enkelte tverrbindingsmidler en kovalent binding, så som et disulfid, som kan spaltes under cellulære forhold. F.eks. er ditiobis(succinimidylpropionat) ("DSP"), Trauts reagens og N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat ("SPDP") velkjente spaltbare tverrbindere. Anvendelsen av spaltbare tverrbindingsmidler tillater cargodelen å spaltes fra transportpolypeptidet etter levering i målcellen. Direkte disulfidbinding kan også være nyttig.

Enkelte nye tverrbindingsmidler, så som n-y-maleimido-butyryloksysuccinimidester ("GMBS") og sulfo-GMBS, oppviser redusert immunogenisitet. I enkelte utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse kan en slik redusert immunogenisitet være av fordel.

Et flertall tverrbindingsmidler, deriblant de ovennevnte, er kommersielt tilgjengelige. Det kan erholdes detaljerte anvisninger for deres anvendelse fra de kommersielle leve-randører. En generell referanse for proteintverrbindings-og -konjugatfremstilling er S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross- Linking, CRC Press (1991).

Kjemisk tverrbinding kan omfatte anvendelsen av avstandsgivende armer. Avstandsgivende armer gir intramolekylær fleksibilitet eller justerer de intramolekylære avstander mellom konjugatdelene og kan dermed hjelpe å bevare den biologiske aktivitet. En avstandsgivende arm kan være i form av en polypeptiddel omfattende avstandholdende aminosyrer. Alternativt kan en avstandsgivende arm være en del av tverrbindingsmidlet, så som i "langkjedet SPDP" (Pierce Chem. Co-, Rockford, IL, kat. nr. 21651 H).

De farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan være for terapeutisk, forebyggende eller diagnostisk anvendelse, og kan anta diverse former. Disse omfatter f.eks. faste, halvfaste og flytende doserings-former, så som tabletter, piller, pulvere, væskeformede løsninger eller suspensjoner, aerosoler, liposomer, suppo-sitorier, injiserbare og infuserbare løsninger og former med varig frisettelse. Den foretrukne form er avhengig av den tiltenkte doseringsmåte og den terapeutiske, profy-laktiske eller diagnostiske anvendelse. Transportpolypeptid -cargomolekylkonjugatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres på konvensjonell måte, f.eks. parenteralt, subkutant, intravenøst, intramuskulært, intra-lesjonalt eller med aerosol. Sammensetningene omfatter også fortrinnsvis konvensjonelle farmasøytisk akseptable bærer-stoffer og adjuvanter kjent for fagmannen.

Generelt kan de farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse formuleres og administreres under anvendelse av fremgangsmåter og sammensetninger i likhet med dem anvendt for farmasøytisk viktige polypeptider, så som f.eks. alfaferon. Det vil være klart at de konvensjonelle doser vil variere avhengig av den spesielle cargo som anvendes.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilføres enhver organisme, også mennesker.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også tilføres dyr og mennesker in utero.

For flere farmasøytiske anvendelser av foreliggende oppfinnelse er det nødvendig at cargomolekylet omplasseres fra kroppsvæsker til celler av vev i kroppen, istedenfor fra et vekstmedium til kultiverte celler. Derfor har vi, i tillegg til eksempler nedenfor forbundet med kultiverte celler, gitt eksempler som beviser leveringen av modellcargoproteiner til celler av diverse organer og vev hos pattedyr, etter intravenøs injeksjon av trasportpolypeptid-cargo-proteinkonjugater til levende dyr. Disse cargoproteiner oppviser biologisk aktivitet etter levering til cellene in vivo.

Som demonstrert i de etterfølgende eksempler, kan transportpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse synteti-seres kjemisk eller fremstilles ved rekombinant DNA-fremgangsmåter under anvendelse av aminosyren og DNA-sekvens-informasjonen deri. Fremgangsmåter for kjemisk syntese eller rekombinant DNA-produksjon av polypeptider med kjent aminosyresekvens er velkjent. Automatisert utstyr for polypeptid- eller DNA-syntese er kommersielt tilgjengelig. Vertceller, klonevektorer, DNA-ekspresjonskontrollsekvenser og oligonukleotide bindere er også kommersielt tilgjengelige.

Under anvendelse av velkjente fremgangsmåter kan en fagmann lett gjøre mindre tilsetninger, utelatninger eller endrin-ger i de foretrukne transportpolypeptidaminosyresekvenser beskrevet heri. Det bør imidlertid forstås at slike modifi-kasjoner faller under foreliggende oppfinnelses ramme.

Videre er det kjent tat-proteiner fra andre vimser, så som HIV-2 [M. Guyader et al., "Genome Organization and Transactivation of the Human immunodeficiency Virus Type 2", Nature, 326, side 662-669 (1987)], infektiøs hesteanemi-virus [R. Carroll et al., "Identification of Lentivirus Tat Functional Domains Through Generation of Equine Infections Anemia Virus/Human Immunodeficiency Virus Type l tat Gene Chimeras", J. virol., 65, sider 3460-3467 (1991)] og ape-immunodefisiens-virus [L. Chakrabarti et al., "Sequence of Simian Immunodeficiency Virus from Macaque and Its Rela-tionship to Other Human and Simian Retroviruses", Nature, 328, side 543-547 (1987); S.K. Arya et al., "New Human and Simian HIV-Related Retroviruses Possess Functional Trans-activator (tat) Gene", Nature, 328, side 548-550 (1987)].

For en bedre forståelse av oppfinnelsen beskrevet heri, gis de følgende eksempler. Det er underforstått at disse eksempler kun skal illustrere oppfinnelsen og ikke skal begrense foreliggende oppfinnelse på noen måte. I disse eksempler ble alle molekylklonereaksjoner utført ifølge fremgangsmåter beskrevet i J. Sambrook et al., Molecular doning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), hvis intet annet er angitt.

EKSEMPEL 1

Fremstilling og rensing av transportpolypeptider Rekombinant DNA

Plasmidet pTat72 var utgangsklon for bakteriell fremstilling av tat-deriverte transportpolypeptider og fremstilling av gener som kodet transportpolypeptid-cargoprotein-fusjoner. Vi erholdt plasmid pTat72 {beskrevet i Frankel og Pabo, supra) fra Alan Frankel (The Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Plasmidet pTat72 ble erholdt fra pET-3a-ekspresjonsvektoren av F.W. Studier et al. ["Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes", Methods Enzymol., 185, sider 60-90 (1990)] ved tilsetning av et syntetisk gen som kodet aminosyrer 1 til 72 av HIV-l-tat. Tat-kodeområdet anvender E. coli-kodoner og drives av den bakteriofage T7-polymerasefremmer tilførbar med isopropyl-g-D-tiogalaktopyranosid ("IPTG"). Tat-proteinet omfattet 5% av det totale E. coli-protein etter IPTG-tilførsel.

Rensing av tatl- 72 fra bakteriene

Vi suspenderte E■ coli med tatl-72-proteinekspresjon i 10 volumdeler 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 itiM EDTA. Vi oppløs-te cellene i en fransk presse og fjernet det uløselige residuum ved sentrifugering ved 10.000 x g i 1 time. Vi ladet supernatanten på en Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) ionutbyttekolonne (20 ml resin/60 ml løsning). Vi behandlet den gjennomstrømmende fraksjon med 0,5 M NaCl, hvilket bevirket at tat-proteinet feltes. Vi samlet det saltfelte protein ved sentrifugering ved 35.000 rpm i en 50,2 rotor i 1 time. Vi oppløste den pelletiserte feining i 6 M guanidin-HCl og klarnet løsningen ved sentrifugering ved 35.000 rpm i en 50,2 rotor i 1 time. Vi ladet den klare prøve på en A.5 agarosegel filterkolonne som var ekvilibrert med 6 M guanidin-HCl, 50 mM natriumfosfat (pH 5,4) og 10 mM DTT, og eluerte deretter prøven med samme buffer. Vi ladet de tat-proteinholdige gel-filterfraksjoner på en C4-reversfase HPLC-kolonne og eluerte med en gradient på 0-75% acetonitril og 0,1% trifluoreddiksyre. Med denne fremgangsmåte fremstilte vi ca. 20 mg tatl-72-protein pr. liter E. coli-kultur (med 6 g celler pr. liter). Dette står for et utbytte på ca. 50%.

Etter SDS-PAGE-analyse, migrerte tatl-72-polypeptidet som en enkelt kjede på 10 kD. Det rensede tatl-72-polypeptid var aktivt i en opptaks/transaktiveringsprøve. Vi tilsatte polypeptidet til kulturmediet av hepatomaceller fra menneske inneholdende et tat-mottakelig vevplasminogenaktivator-("tPA"-) reportergen. I nærvær av 0,1 mM klorokin, bevirket det rensede tatl-72-protein (100 ng/ml) tPA-ekspresjon ca. 150-foldig.

Kjemisk syntese av transportpolypeptider

For kjemisk syntese av de diverse transportpolypeptider anvendte vi et kommersielt tilgjengelig automatisert system (Applied Biosystems Model 430A synthesizer) og fulgte systemleverandørens anbefalte fremgangsmåter. Vi fjernet blokkerende grupper ved HF-behandling og isolerte de syntetiske polypeptider ved konvensjonell reversfase HPLC-meto-de. Fullstendigheten av samtlige syntetiske polypeptider ble bekreftet ved massespektrometeranalyse.

EKSEMPEL 2

B- Galaktosidasekonj ugater

Kjemisk tverrbinding med SMCC

For acetylering av B-galaktosidase (for å blokkere cystein-sulfhydrylgrupper), oppløste vi 6,4 mg kommersielt erholdt B-galaktosidase (Pierce Chem. Co., kat. nr. 32101G) i 200 pl 50 mM fosfatbuffer (pH 7,5). Til de 200 ul p-galakto-sidaseløsning tilsatte vi 10 ul jodeddiksyre, fremstilt ved å oppløse 3 0 mg jodeddiksyre i 4 ml 50 mM fosfatbuffer (pH 7,5). (I etterfølgende eksperimenter fant vi at jodacetamid var å foretrekkes fremfor jodeddiksyre.) Vi lot reaksjonen forløpe i 60 minutter ved værelsestemperatur. Deretter separerte vi den acetylerte B-galaktosidase fra den ureagerte jodeddiksyre ved å lade reaksjonsblandingen (Pharmacia) på en liten G-25- (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) gelfilterkolonne og å samle nullvolumet.

Før SMCC-aktiveringen av aminogruppene av den acetylerte galaktosidase, konsentrerte vi 2 ml av enzymet samlet fra G-25-kolonnen til 0,3 ml i et Centricon 10 (Amicon, Dan-vers, MA) ultrafilterapparat. Til den konsentrerte acetylerte B-galaktosidase tilsatte vi 19 ug sulfo-SMCC (Pierce Chem. Co., kat. nr. 22322G) oppløst i 15 ul dimetylformamid ("DMF"). Vi lot reaksjonen løpe i 30 minutter ved værelsestemperatur. Vi separerte deretter B-galaktosidase-SMCCen fra DMF og ureagert SMCC ved passering over en liten G-25 gelfilterkolonne.

For kjemisk tverrbinding av transportpolypeptider til p-galaktosidase, blandet vi løsningen av S-galaktosidase-SMCC med 100 ug transportpolypeptid (tatl-72, tat37-72, tat38-58GGC, tat37-58, tat47-58GGC eller tatCGG47-58) oppløst i 200 pl 50 mM fosfatbuffer (pH 7,5). Vi lot reaksjonen løpe i 60 minutter ved værelsestemperatur. Vi isolerte deretter transportpolypeptid-p-galaktosidasekonjugatet ved å lade reaksjonsblandingen på en S-200HR gelfilterkolonne og å samle nullvolumet.

Det således erholdte transportpolypeptid-B-galaktosidase-konjugat gav positive resultater når det ble testet for tat i konvensjonelle Western blot- og ELISA-analyser utført med anti-tat-polyklone motstoffer i kanin. For en generell omtaling om Western blot- og ELISA-analyser, jfr. E. Harlow og D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Gelfilteranalyse med Superose 6 (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) viste at transportpolypeptid-p-galaktosidasekonjugatet hadde en molekylvekt på ca. 540.000 dalton. Den spesifikke aktivitet av transportpolypeptid-B-galaktosidasekonjugatet var 52% av den spesifikke aktivitet av p-galaktosidaseutgangsmaterialet når testet med o-nitrofenyl-p-D-galaktopyranosid ("ONPG"). ONPG-testmetoden beskrives i detalj på sider 16.66-16.67 i Sambrook et al. ( supra).

Cellulært opptak av p- galaktosidasekonjugater

Vi tilsatte konjugatene til mediet av HeLa-celler (ATCC nr. CCL2) i 20 ug/ml, i nærvær eller fravær av 100 uM klorokin. Vi inkuberte cellene i 4-18 timer ved 37°C/5,5% C03. Vi fikserte cellene med 2% formaldehyd og 0,2% glutaraldehyd i fosfatbuffersaltløsning ("PBS") i 5 minutter ved 4°C. Vi vasket deretter cellene tre ganger med 2 mM MgCL2 i PBS og merket dem med X-gal ved 37°C. X-gal er et f arveløst B-galaktosidasesubstrat {5-brom-4-klor-3-indolyl-D-galakto-sid) som gir et blått produkt etter spaltning med B-galaktosidase. Vår X-gal-markørløsning inneholdt 1 mg X-gal (Bio-Rad, Richmond, CA, kat. nr. 170-3455) pr. ml PBS inneholdende 5 mM kaliumferricyanid, 5 mM kaliumferrocyanid og 2 mM MgCl2-

Vi utsatte de merkede celler for mikroskopundersøkelse med forstørrelse opptil 400 X. Denne mikroskopundersøkelse åpenbarte farging av så vel cellekjernen som cytoplasma.

Cellene som var blitt tilsatt tat37-72-p-galaktosidase-konjugat eller tatl-72-B-galaktosidasekonjugat, var farget mørkt blå. p-Galaktosidaseaktiviteten ble synlig etter en såpass kort innvirkningstid som 15 minutter. Som sammenlig-ning bør det noteres at det normalt kreves en fargeutvik-lingstid på minst 6 timer hvis p-galaktosidaseaktiviteten introduseres til celler ved hjelp av overføring av S-galak-tosidasegenet. Fargingen av cellekjernen var synlig i fravær av klorokin, selv om fargeintensiteten var noe høyere i celler som var behandlet med klorokin. Kontrollceller behandlet med ukonjugert p-galaktosidase oppviste ingen synlig farging.

Spaltbar konjugasjon ved direkte disulfid

Hver S-galaktosidasetetramer har 12 cysteinresiduer som kan anvendes for direkte disulfidbinding til et transportpolypeptid- cysteinresiduum. For å redusere og deretter beskytte sulfhydrylet i tat37-72, oppløste vi 1,8 mg (411 nmol) tat37-72 i l ml 50 mM natriumfosfat (pH 8,0), 150 mM NaCl og 2 mM EDTA, og påførte løsningen på en Reduce-Imm-kolonne (Pierce Chem. Co., Rockford, IL). Etter 30 minutter ved værelsestemperatur eluerte vi tat37-72 fra kolonnen med 1 ml alikvoter av samme buffer, til rør inneholdende 0,1 ml 10 mM 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzosyre) ("DTNB"). Vi lot det reduserte tat37-72-polypeptid stå i nærvær av DTNB i 3 timer. Deretter fjernet vi ureagert DTNB fra tat37-72-TNB ved gelfiltrering på en 9 ml Sephadex G-10 kolonne (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Vi oppløste 5 mg p-galaktosidase i 0,5 ml buffer og avsaltet den på en 9 ml Sephadex G-25 kolonne (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) for å erholde 3,8 mg p-galaktosidase/ml buffer. Vi blandet 0,5 ml alikvoter avsaltet p-galaktosidaseløsning med 0,25 eller 0,5 ml tat37-72-TNB-preparat og lot den direkte disulfid-tverrbindingsreaksjon forløpe ved værelsestemperatur i 30 minutter. Vi fjernet det ureagerte tat37-72-TNB fra p-galaktosidasekonjugatet ved gelfiltrering på en 9 ml Sephacryl S-200 kolonne. Vi fulgte indirekte med omfanget for tverrbindingsreaksjonen ved å måle absorberingen ved 412 nm forårsaket av frigjort TNB. De således erholdte direkte disulfidkonjugater ble tatt opp i celler (data ikke vist).

Spaltbart konjugat med SPDP

Vi anvendte det heterobifunksjonelle tverrbindingsmiddel ("SPDP"), som inneholder en spaltbar disulfidbinding, for å danne en tverrbinding mellom-, (l) de primære aminogrupper av p-galaktosidase og cysteinsulfhydrylene i tatl-72 (meta-bolsk nevnt <35>S), eller (2) de primære aminogrupper i rhod-aminmerket p-galaktosidase og aminoende-cysteinsulfhydrylet av tat37-72.

For tatl-72-konjugasjonen oppløste vi 5 mg p-galaktosidase i 0,5 ml 50 mM natriumfosfat (pH 7,5), 150 mM NaCl og 2 mM MgCl2, og avsaltet p-galaktosidasen på en 9 ml Sephadex G-25 kolonne (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Vi behandlet den avsaltede p-galaktosidase med et 88 ganger molart overskudd av jodacetamid ved værelsestemperatur i 2 timer, for å blokkere frie sulfhydrylgrupper. Etter fjerning av det ureagerte jodacetamid ved gelfiltrering, behandlet vi den blokkerte p-galaktosidase med et 10 ganger molart overskudd av SPDP ved værelsestemperatur. Etter 2 timer byttet vi ut bufferen ved ultrafiltrering (Ultrafree 30, Millipore, Bedford, MA). Vi tilsatte deretter et 4-dobbelt molart overskudd av merket tatl-72 og lot tverrbindingsreaksjonen forløpe over natten ved værelsestemperatur. Vi fjernet det ureagerte tatl-72 ved gelfiltrering på en 9 ml Sephacryl S-200 kolonne. Under anvendelse av den kjente spesifikke aktivitet av merket tatl-72 beregnet vi at det var 1,1 tverrforbundne tatl-72-polypeptider pr. p-galaktosidasetetramer. Under anvendelse av ONPG-testen oppdaget vi at den konjugerte p-galaktosidase beholdt 100% av sin enzymaktivitet. Ved måling av celleinkorporert radioaktivitet og X-gal-farging, påviste vi opptaket av konjugatet i kultiverte HeLa-celler.

For tat37-72-konjugasjon gikk vi frem som beskrevet i forrige avsnitt, unntatt at vi merket p-galaktosidasen med et 5:l-forhold av rhodaminmaleimid ved værelsestemperatur i 1 time før jodacetamidbehandlingen (100:1 jodacetamid molart overskudd). I tverrbindingsreaksjonen anvendte vi et SPDP-forhold på 20:1 og et tat37-72-forhold på 10:1. Vi beregnet at det konjugerte produkt hadde ca. 5 rhodamin-molekyler (ifølge UV-absorbering) og ca. 2 tat3 7-72-deler (ifølge gelfiltrering) pr. p-galaktosidasetetramer. Konjugatet fra denne fremgangsmåte beholdt ca. 35% av en opprin-nelige p-galaktosidase-enzymaktivitet. Under anvendelse av X-gal-farging og rhodamin-fluorescens beviste vi at SPDP-konjugatet var blitt tatt opp i kultiverte HeLa-celler.

EKSEMPEL 3

Dyrestudier med p- galaktosidasekonjugater

For bestemmelse av konjugatets halveringstid og for en biofordelingsanalyse injiserte vi enten 200 ug SMCC-p-galaktosidase (kontrollforbindelse) eller tatl-72-B-galaktosidase intravenøst ("IV") i haleårene av Balb/c-mus (Jackson Laboratories), med og uten klorokin. Vi samlet blodprøver i intervaller i 30 minutter. Etter 30 minutter avlivet vi dyrene og fjernet organer og vev for en histo-kjemisk analyse.

Vi målte 6-galaktosidaseaktiviteten i blodprøver ved ONPG-test. ONPG-testprosedyren beskrives i detalj på sidene 16.66-16.67 i Sambrook et al. (supra). B-Galaktosidase og tatl-72-p-galaktosidase ble raskt renset fra blodstrømmen. Vi beregnet at deres halveringstid var 3-6 minutter. Disse eksperimentelle sammenligninger demonstrerte at bindingen til tatl-72-transportpolypeptidet har liten eller ingen innvirkning på rensningshastigheten av p-galaktosidase fra blodet.

For å påvise cellulært opptak av transportpolypeptid-p-galaktosidasekonjugater, fremstilte vi tynne frosne vev-seksjoner fra avlivede dyr (ovenfor), utførte fiksering som beskrevet i eksempel 2 (ovenfor) og utsatte dem for en standard X-gal-fargeprosedyre. Leveren, milten og hjertet ble farget intenst. Lungen og skjelettmuskulaturen var mindre intens farget. Hjernen, bukspyttkjertelen og nyrene viste ingen påvisbar farging. Høyeffekt mikroskopisk under-søkelse viste sterk cellulær farging, og i enkelte tilfeller sterk farging av cellekjernen, i noe som så ut til å være endoteliale celler som omligger blodtilførselen til vevene.

EKSEMPEL 4

Cellulære opptaksprøver med B- galaktosidase- polyarginin og P- <?alaktosidase- polylysinkonjugater

For å sammenligne effektiviteten av enkle basiske amino-syrepolymerer med effektiviteten av våre tat-deriverte transportpolypeptider, konjugerte vi kommersielt tilgjengelig polyarginin {Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, kat. nr. P-4663) og polylysin (Sigma kat. nr. P-2658) med B-galaktosidase, som beskrevet i eksempel 2 ovenfor. Vi tilsatte konjugatet til mediet av HeLa-celler i 1-3 0 ug/ml, med og uten klorokin. Etter inkubasjon med konjugatene fikserte vi, farget og undersøkte mikroskopisk cellene som beskrevet i eksempel 2 ovenfor.

Polylysin-B-galaktosidasekonjugatet gav lave nivåer av overflatefarging og ingen farging av cellekjernen. Polyarginin- 6-galaktosidasekonjugatet gav intens farging over hele cellen, men oppviste mindre farging av cellekjernen enn tatl-72-B-galaktosidase- og tat37-72-B-galaktosidase-konjugatene. For å atskille mellom celleoverflatebinding og virkelig opptak av polyarginin-B-galaktosidasekonjugatet, behandlet vi cellene med trypsin, en protease, før fiksering og farging. Trypsinbehandling hemmet størstedelen av X-gal-fargingen av celler behandlet med polyarginin-B-galaktosidase; et tegn på at polyarginin-B-galaktosidasekonjugatet var bundet til de ytre overflater av cellene, og ikke var tatt opp inn i cellene. I motsetning til dette farget cellene utsatt for tatl-72- eller tat37-72-B-galaktosidasekonjugater uansett trypsinbehandlingen; et tegn på at B-galaktosidasen befant seg inne i cellene og dermed var beskyttet for digerering ved trypsinet. Kontrollceller behandlet med ukonjugert p-galaktosidase oppviste ingen påvisbar farging.

EKSEMPEL 5

Pepperrotperoksydasekonj ugater

Kjemisk tverrbinding

Por å fremstille tatl-72-HRP- og tat37-72-HRP-konjugater anvendte vi kommersielt tilgjengelig HRP-bindingsutstyr {Immunopure maleimide activated HRP, Pierce Chem. Co., kat. nr. 31498G). HRP levert med utstyret er i en form som er selektivt reaktiv mot frie -SH-grupper. (Cystein er den eneste av de 20 proteinaminosyrer som har en fri -SH-gruppe). I et transportpolypeptid-HRP-konjugasjonseksperiment med tatl-72, fremstilte vi tatl-72-utgangsmaterialet i E. coli og renset ved HPLC, som beskrevet i eksempel 1 ovenfor. Vi frysetørket 200 ug renset tatl-72 (hvilket var oppløst i TFA/acetonitril) og gjenoppløste det i 100 pl 100 mM HEPES-buffer (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. Vi tilsatte 50 ul tat 1-72- eller tat37-72-løsning til 50 ul Immunopure HRP (750 ug enzym) i 250 mM trietanolamin (pH 8,2) . Vi lot reaksjonen forløpe i 80 minutter ved værelsestemperatur. Under disse forhold ble ca. 70% HRP kjemisk bundet til tatl-72-molekyler. Vi overvåket omfanget av bindingsreak-sjonen ved SDS-PAGE-analyse.

Cellulært opptak av HRP- konjugater

Vi tilsatte konjugatene til mediet av HeLa-celler i 20 pg/ml, i nærvær eller fravær av 100 uM klorokin. Vi inkuberte cellene i 4-18 timer ved 37°C/5,5% C02. Vi fremkalte HRP-fargingen under anvendelse av 4-klor-l-naftol (Bio-Rad, Richmond, CA, kat. nr. 170-6431) og hydrogenperoksyd-HRP-substrat. I etterfølgende eksperimenter anvendte vi di-aminobenzidin (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) istedenfor 4-klor-l-naftol.

Celler, til hvilke vi tilsatte transportpolypeptid-HRP-konjugater, oppviste celleassosiert HRP-aktivitet. Korte tidsperioder av utsettelse for konjugatet resulterte i fargemønstre som så punkterte ut, hvilket sannsynligvis reflekterte HRP i endocytiske vesikler. Etter lengre inku-basjoner observerte vi diffus farging av cellekjernen og cytoplasma. Kontrollceller behandlet med ukonjugert HRP oppviste ingen påvisbar farging.

EKSEMPEL 6

PE- ADP- Ribosy1eringsområdekonj ugater

Vi klonet og uttrykte i E. coli Pseudomonas eksotoksinet ("PE"), både i sin fulle lengde og i form av sitt ADP-ribosyleringsområde. Vi fremstilte transportpolypeptid-PE-konjugater både ved genetisk fusjon og ved kjemisk tverrbinding .

Konstruksjon av plasmid

For å fremstille plasmidet pTat70(ApaI) innsatte vi et unikt Apal-sete i den åpne leseramme for tat ved å spalte pTat72 med BamHl og EcoRl, og å innsette en dobbeltkjedet binder bestående av de følgende syntetiske oligonukleotider:

Binderen erstattet C-enden av tat, LysGlnStop, med GlyProStop. Binderen tilsatte dessuten et unikt Apal-sete egnet for fusjon i leseramme av tat-sekvensen med PE-ADP-ribosyleringsområde-kodesekvensene, med det naturlig forekommende Apal-sete i PE-sekvensen. For å konstruere plasmidet pTat70PE (SEKV-ID Nr. 10), fjernet vi et Apal-EcoRI-fragment, som kodet PE-ADP-ribosyleringsområdet, fra plasmidet CD4(181)-PE(392). Konstruksjonen av CD4(181)-PE(392) beskrives av G. Winkler et al. ["CD4- Pseudomonas Exotoxin Hybrid Proteins: Modulation of Potency and Therapeutic Window Through Structural Design and Characterization of Cell Internalization", AIDS Research and Human Retroviruses, 7, side 393-401 (1991)]. Vi satte inn Apal-EcoRI-fragmentet i pTat70(ApaI) som var spaltet med Apal og

EcoRI.

For å konstruere plasmidet pTatSPE {SEKV-ID Nr. 11), fjernet vi et 214-basepar Ndel-Apal-fragment fra pTat70PE og erstattet det med en dobbeltkjedet binder som hadde Ndel-og Apal-kohesive ender som kodet tat-residuer 1-4 og 67-70 og bestod av de følgende syntetiske oligonukleotider:

Rensing av TAT8- PE

Ekspresjon av pTat8-PE-konstruksjonen gav PE-ADP-ribosyle-ringsområdepolypeptidet fusjonert med aminosyrer 1-4 og 67-70 av tat-proteinet. pTat8-PE-ekspresjonsproduktet ("tat8-PE") tjente som PE-ADP-ribosyleringsområdedelen (og den ukonjugerte kontrollforbindelse) i de kjemiske tverrbin-dingseksperimenter beskrevet nedenfor. Kodoner for de 8 tat-aminosyrer var materialer fra en kloningsprosedyre utvalgt for bekvemmelighet. De 8 tat-aminosyrer som var fusjonert med PE-ADP-ribosyleringsområdet hadde ingen transportaktivitet (figur 2).

For rensing av tat8-PE, suspenderte vi 4,5 g pTat8-PE-transferert E. coli i 20 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 2 mM EDTA. Vi oppløste cellene i en fransk presse og fjernet det uløselige residuum ved sentrifugering ved 10.000 rpm i 1 time i en SA600-rotor. Størsteparten av tat8-PE befant seg i supernatanten. Vi satte supernatanten på en 3 ml Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) ionutbyttekolonne. Etter tilføring av prøven vasket vi kolonnen med 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 2 mM EDTA. Etter vasking av kolonnen utførte vi trinnvis gradienteluering under anvendelse av samme buffer med 100, 200 og 400 mM NaCl. Tat 8-PE ble eluert med 200 mM NaCl. Etter ionutbyttekromatografi renset vi tat8-PE ytterligere ved gelfiltrering på en Superdex 75 FPLC-kolonne (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Vi ekvilibrerte gelfilterkolonnen med 50 mM HEPES (pH 7,5). Vi ladet deretter prøven og utførte eluering med ekvili-breringsbufferen ved 0,34 ml/min. Vi samlet fraksjoner i 1,5 minutters intervaller og lagret tat8-PE-fraksjonene ved -70°C.

Tverrbinding av tat8- PE

Siden PE-ADP-ribosyleringsområdet ikke har noen cysteinresiduer, anvendte vi sulfo-SMCC (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, kat. nr. 22322G) for transportpolypeptid-tat8-PE-konjugasjon. Vi utførte konjugasjonen i en reaksjonsprose-dyre i to trinn. I det første reaksjonstrinn behandlet vi tat8-PE (3 mg/ml), i 50 mM HEPES {pH 7,5), med 10 mM sulfo-SMCC ved værelsestemperatur i 40 minutter. (Sulfo-SMCC ble tilsatt til reaksjonsblandingen som en 100 mM utgangsløs-ning i 1 M HEPES, pH 7,5.) Vi separerte tat8-PE-sulfo-SMCOen fra den ureagerte sulfo-SMCC ved gelf iltrering på en P6DG-kolonne (Bio-Rad, Richmond, CA) ekvilibrert med 25 mM HEPES (pH 6,0) og 25 mM NaCl. I det andre reaksjonstrinn lot vi tat8-PE-sulfo-SMCCen (1,5 mg/ml 100 mM HEPES (pH 7,5) og 1 mM EDTA) reagere med renset tat37-72 (600 uM slutlig konsentrasjon) ved værelsestemperatur i 1 time. For å stoppe tverrbindingsreaksjonen tilsatte vi cystein. Vi analyserte produktene av tverrbindingen ved SDS-PAGE. Ca. 90% av tat8-PE var blitt tverrbundet til tat37-72-transportpolypeptidet under disse forhold. Ca. halvparten av det konjugerte produkt hadde én transportpolypeptiddel, og den andre halvpart hadde to transportpolypeptiddeler.

Cellefri assay av PE- ADP- ribosylering

For å bekrefte at PE-ribosyleringsområdet beholdt sin biologiske aktivitet (dvs. ødeleggende ribosommodifikasjon) etter konjugasjon med transportpolypeptider, testet vi virkningen av transportpolypeptid-PE-ADP-ribosylerings-konjugater på in vitro (dvs. cellefri) translasjon. For hvert in vitro-translasjoneksperiment laget vi en fersk translasjonblanding og holdt den på is. In vitro-transla-sjonsblandingen inneholdt 200 ul kanin-retikulocyttløsning (Promega, Madison, WI) , 2 ul 10 mM (ZnCl2 (valgfritt) , 4 ul blanding av de 20 proteinaminosyrer unntatt metionin og 20 pl 35S-metionin. Til 9 pl translasjonsblanding tilsatte vi fra 1 til 1000 ng transportpolypeptid-PE-konjugat (fortrinnsvis i et volum på 1 pl) eller kontrollforbindelse, og forinkuberte blandingen i 60 minutter ved 30°C. Vi tilsatte deretter 0,5 ul BMV RNA til hver prøve og inkuberte i ytterligere 60 minutter ved 30°C. Vi lagret prøvene ved -70°C etter tilsetning av 5 pl 50% glyserolt pr. prøve. Vi analyserte in vitro-translasjonsreaksjonsproduktene ved SDS-PAGE-teknikker. Vi ladet 2 pl av hver translasjonsreak-sjonsblanding (plus et egnet volum SDS-PAGE prøvebuffer) pr. bane på SDS-gelene. Etter elektroforese visualiserte vi de <35>S-holdige in vitro-translasjonsprodukter ved fluoro-grafi.

Under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i forrige avsnitt, oppdaget vi at PE-ADP-ribosyleringsområdet som var genetisk fusjonert med tatl-70-transportpolypeptidet, ikke hadde noen biologisk aktivitet, dvs. den hemmet ikke in vitro-translasjon. Under anvendelse av samme fremgangsmåte fant vi i motsetning til dette, at PE-ADP-ribosyleringsområdet som var kjemisk tverrforbundet med tat37-72-transportpolypeptidet, hadde beholdt sin fulle biologiske aktivitet, dvs. den hemmet in vitro-translasjon like godt som de ikke-konjugerte PE-ADP-ribosyleringsområde-kontrollforbindelser (figur 2).

Cytotoksisitetsassay av PE- ADP- ribosylering

I en ytterligere test med tat37-72-PE-ADP-ribosyleringsområdekonjugatet, tilsatte vi det til kultiverte HeLa-celler i nærvær eller fravær av 100 uM klorokin. Vi testet deretter cytotoksisiteten ved å måle in vivo-proteinsyntesen, som påvist av trikloreddiksyre- ("TCA") fellbar radioaktivitet i celleekstrakter.

Vi utførte cytotoksisitetsassayet som følger: Vi fjernet HeLa-cellesjikt, sentrifugerte cellene og resuspenderte dem i en tetthet på 2,5 x 10<4>/ml medium. Vi anvendte 0,5 ml suspensjon/brønn under anvendelse av 24 brønnplater, eller 0,25 ml suspensjon/brønn under anvendelse av 48 brønn-plater. Vi tilsatte konjugater eller ukonjugerte kontrollforbindelser, oppløst i 100 pl PBS, til brønnene etter at cellene hadde fått stå i minst 4 timer. Vi inkuberte cellene i nærvær av konjugatene eller kontrollforbindelsene i 60 minutter ved 37°C og tilsatte deretter 0,5 ml ferskt medium til hver celle og inkuberte cellene i ytterligere 5-24 timer. Etter denne inkubasjon fjernet vi mediet fra hver brønn og vasket cellene én gang med ca. 0,5 ml PBS. Vi tilsatte deretter l uCi <35>S-metionin (Amersham) pr. 100 pl pr. brønn in vivo (cellemerkingsgrad SJ.1015) og inkuberte cellene i 2 timer. Etter to timer fjernet vi det radioaktive medium og vasket cellene 3 ganger med kald 5% TCA og deretter én gang med TBS. Vi tilsatte 100 pl 0,5 M NaOH til hver brønn og lot celle- og proteinoppløsning forløpe i minst 45 minutter. Vi tilsatte deretter 50 pl 1 M HC1 til hver brønn og overførte hele innholdet av hver brønn til scintillasjonsvæske for flytende scintillasjonsmåling av radioaktiviteten.

I fravær av klorokin var det en klar doseringsavhengig hemming av celleproteinsyntese i respons til behandling med transportpolypeptid-EP-ADP-ribosyleringsområdekonjugatet, men ikke i respons til behandling med ukonjugert PE-ADP-ribosyleringsområde. Resultatene oppsummeres på figur 2. Når konjugert med tat37-72, virket PE-ADP-ribosyleringsområdet å være transportert 3 til 10 ganger mer effektivt enn når de var konjugert med tatl-72. Vi konjugerte dessuten transportpolypeptidene tat38-58GGC, tat37-58, tat47-58GGC og tatCGG47-58 til PE-ADP-ribosyleringsområdet. Alle disse konjugatene resulterte i cellulært opptak av biologisk aktivt PE-ADP-ribosyleringsområde (data ikke vist).

EKSEMPEL 7

Ribonukleasekonjugater

Kjemisk tverrbinding

Vi oppløste 7,2 mg bovin pankreatisk ribonuklease A, type 12A (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, kat. nr. R5500) i 200 pl PBS (pH 7,5). Til ribonukleaseløsningen tilsatte vi 1,4 mg sulfo-SMCC {Pierce Chem. Co., Rockford, IL, kat. nr. 22322H). Etter virvelomrøring lot vi omsetningen forløpe ved værelsestemperatur i 1 time. Vi fjernet ureagert SMCC fra ribonuklease-SMCC ved å passere reaksjonsblandingen over en 9 ml P6DG-kolonne (Bio-Rad, Richmond, CA) og samle 0,5 ml fraksjoner. Vi identifiserte nullvolum-toppfrak-sjoner (inneholdende ribonuklease-SMCC-konjugatet) ved å overvåke UV-absorberingen ved 280 nm. Vi oppdelte de samle-de ribonuklease-SMCC-holdige fraksjoner i 5 like alikvoter. Til hver av 4 ribonuklease-SMCC-alikvoter tilsatte vi et kjemisk syntetisert transportpolypeptid tilsvarende tat-residuer: 37-72 ("37-72"); 38-58 plus GGC ved karboksyenden ("38-58GGC"); 37-58 ("CGG37-58") eller 47-58 pluss CGG ved aminoenden ("CGG47-58"). Vi lot transportpolypeptid-ribo-nukleasekonjugasjonsreaksjonene forløpe i 2 timer ved værelsestemperatur og deretter over natten ved 4°C. Vi analyserte reaksjonsproduktene ved SDS-PAGE på en 10-20% gradientgel. Tverrbindingseffektiviteten var ca. 60% for transportpolypeptider tat38-58GGC, tat37-58 og tatCGG47-58, og 40% for tat37-72. Av de modifiserte arter inneholdt 72% én og 25% to transportpolypeptidsubstitusjoner.

Cellulært opptak av tat37- 72- ribonukleasekonjugater

Vi holdt celler ved 37°C i en vevkul tur inkubator i Dul-becco<*>s Modified Eagle Medium suppleraentert med 10% donor calf serum og penicillin/streptomycin. For måling av det cellulære opptak, plasserte vi IO<5> celler i en 24-brønn-plate og kultiverte dem over natten. Vi vasket cellene med Dulbecco's PBS og tilsatte ribonukleasekonjugatet oppløst i 300 pl PBS inneholdende 80 pM klorokin, i konsentrasjoner på 0, 10, 20, 40 og 80 ug/ml. Etter inkubasjon i 1,25 time ved 3 7°C, tilsatte vi 750 pl vekstmedium og inkuberte celleprøvene over natten. Etter inkubasjonen over natten, vasket vi cellene én gang med PBS og inkuberte dem i 1 time i Minimal Essential Medium uten metionin (Flow Labs) (250 pl/brønn) inneholdende <35>S-metionin (1 pCi/brønn). Etter inkubasjon i 1 time med radioaktivt metionin, fjernet vi mediet og vasket cellene tre ganger med 5% TCA (l ml/brønn/vasking). Vi tilsatte deretter 250 pl 0,5 M NaOH pr. brønn. Etter l time ved værelsestemperatur, pipetterte vi 200 pl av innholdet av hver brønn i en seintillasjons-ampulle og tilsatte 100 pl 1 M HC1 og 4 ml scintillasjonsvæske. Etter grundig blanding av innholdet i hver ampulle, målte vi radioaktiviteten i hver prøve ved væskescintilla-sjonsmåling.

Resultatene av cellulært opptak er oppsummert på figur 3. Transportpolypeptidet tat38-58GGC virket like godt som, eller noe bedre enn, tat37-72. Transportpolypeptidet tatCGG47-58 oppviste redusert aktivitet (data ikke vist). Vi vet ikke om dette polypeptid har en redusert opptaks-aktivitet, eller om nærheten av det basiske område til ribonukleasen forstyrret enzymaktiviteten.

Vi har anvendt kationutbyttekromatografi (BioCAD perfusion chromatography system, PerSeptive Biosystems) for å rense ribonukleasekonjugater med én eller to transportpolypeptiddeler.

EKSEMPEL 8

Proteinkinase A- hemmende konjugater

Kjemisk tverrbinding

Vi skaffet proteinkinase A-inhibitor- ("PKAI") peptidet (20 aminosyrer) fra Bachem California (Torrence, CA). For kjemisk tverrbinding av PKAI til transportpolypeptider anvendte vi enten sulfo-MBS (ved 10 mM) eller sulfo-SMPB (ved 15 mM). Begge disse tverrbindingsmidler er hetero-bif unksjonelle for tiolgrupper og primære aminogrupper. Siden PKAI mangler lysin- og cysteinresiduer, søker både sulfo-MBS og sulfo-SMPB selektivt tverrbinding til aminoenden av PKAI. Vi omsatte PKAI i en konsentrasjon på 2 mg/ml, i nærvær av 50 mM HEPES (pH 7,5) og 25 mM NaCl ved værelsestemperatur i 50 minutter, med enten tverrbindingsmiddel. Sulfo-MBS-reaksjonsblandingen inneholdt 10 mM sulfo-MBS og 20% DMF. Sulfo-SMPB-reaksjonsblandingen inneholdt 15 mM sulfo-SMPB og 20% dimetylsulfoksyd ("DMSO"). Vi renset PKAI-tverrbindingsadduktene ved reversfase HPLC under anvendelse av en C4-kolonne. Vi eluerte prøvene fra C4-kolonnen i en 20-75% acetonitrilgradient inneholdende 0,1% trifluoreddiksyre. Vi fjernet acetonitrilet og tri-fluoreddiksyren fra adduktene ved frysetørking og gjen-oppløste dem i 25 mM HEPES (pH 6,0) og 25 mM NaCl. Vi tilsatte tatl-72 eller tat37-72 og justerte pH for reaksjonsblandingen til 7,5 ved å tilsette IM HEPES (pH 7,5) til 100 mM. Vi lot deretter kryssbindingsreaksjonen forløpe ved værelsestemperatur i 60 minutter.

Vi regulerte tverrbindingsomfanget ved å forandre transportpolypeptid: PKAI-forholdet. Vi analyserte tverrbin-dingsreaksjonsproduktene ved SDS-PAGE. Med tat37-72 dannet det seg et enkelt nytt elektroforetisk bånd under tverrbindingsreaksjonene. Dette resultat var i samsvar med addisjo-nen av et enkelt tat37-72-molekyl til et enkelt PKAI-molekyl. Med tatl-72 dannedes det seks nye produkter under tverrbindingsreaksjonene. Dette resultat er i samsvar med tilsetningen av flere PKAI-molekyler pr. tatl-72-polypeptid, som et resultat av et flertall forekommende cysteinresiduer i tatl-72. Når vi tilsatte PKAI til tverrbindings-reaksjonsblandingen i et stort molart overflod, erholdt vi kun konjugater inneholdende 5 eller 6 PKAI-deler pr. tatl-72 .

In vitro- fosforyleringsassay av PKAI- aktivitet

For å teste sulfo-MBS-tverrforbundne konjugaters bibehol-delse av PKAI's biologiske aktivitet, anvendte vi en in vitro-fosforyleringsassay. I denne assay tjente histon V som substratet for fosforylering ved proteinkinase A i nærvær eller fravær av PKAI (eller et PKAI-konjugat). Vi anvendte deretter SDS-PAGE for å overvåke de PKAI-avhengite differanser i omfanget for fosforyleringen. I hver omsetning inkuberte vi 5 enheter av den katalytiske subenhet av proteinkinase A (Sigma) med varierende mengder PKAI eller PKAI-konjugat ved 37°C i 30 minutter. Assayreaksjonsblan-dingen inneholdt 24 mM natriumacetat (pH 6,0), 25 mM MgCl2, 100 mM DTT, 50 pCi [y-<32>P]ATP og 2 pg histon V, i en total reaksjonsvolum på 40 pl. Under anvendelse av denne assay oppdaget vi at PKAI konjugert med tatl-72 eller tat37-72 hemmet fosforyleringen like godt som ukonjugert PKAI (data ikke vist).

Cellulær assay

For å teste det cellulære opptak av PKAI og transportpolypeptid- PKAI -konj ugater, anvendte vi kultiverte celler inneholdende et kloramfenikolacetyltransferase- ("CAT") reportergen, under kontroll med en cAMP-følsom ekspresjons-kontrollsekvens. Vi kvantifiserte dermed proteinkinase A-aktiviteten indirekte ved å måle CAT-aktiviteten. Denne assay er blitt beskrevet i detalj av J.R. Grove et al.

["Probind cAMP-Related Gene Expression with a Recombinant Protein Kinase Inhibitor", Molecular Aspects of Cellular Regulation, Vol. 6, P. Cohen og J.G. Folkes, utg., Elsevier Scientific, Amsterdam, side 173-195 (1991)J.

Under anvendelse av denne assay fant vi ingen aktivitet av PKAI eller noen av transportpolypeptid-PKAI-konjugatene. Dette resultat åpnet for formodningen at PKAI-delen muli-gens undergikk en rask nedbrytning etter inntrenging i cellene.

Kryssbinding av PKAI til tat37- 72- p- galaktosidase

Vi hadde tidligere funnet at det cellulære opptak av tat37-72-p-galaktosidase var uavhengig av klorokin (eksempel 2 ovenfor). Derfor tverrforbandt vi PKAI med tat37-72-B-galaktosidase for å hvis mulig beskytte PKAI mot rask nedbrytning.

Vi behandlet p-galaktosidase med 20 mM DTT (et reduksjons-middel) ved værelsestemperatur i 30 minutter og fjernet deretter DTT ved gelfiltrering på en G50-kolonne i MES-buffer (pH 5). Vi lot den reduserte p-galaktosidase reagere med det SMPB-aktiverte PKAI (ovenfor) ved pH 6,5 i 60 minutter. For å blokkere gjenblivende frie sulfhydrylgrupper tilsatte vi N-etylmaleimid eller jodacetamid. SDS-PAGE-analyse viste at minst 95% av p-galaktosidasen var blitt konjugert. Ca. 90% av det konjugerte p-galaktosidase-produkt inneholdt én PKAI-del pr. subenhet, og ca. 10% inneholdt 2 PKAI-deler. Vi behandlet PKAl-p-galaktosidasekonjugatet med et 10-foldig molart overflod sulfo-SMCC. Vi omsatte deretter PKAI-p-galaktosidase-SMCC med tatl-72. Ifølge SDS-PAGE-analysen virket PKAI-p-galaktosidase:tatl-72 -forholdet å være 1:0,5. Vi har fremstilt ca. 100 pg av sluttproduktet. Grunnet felningsproblemer har konsentrasjo-nen av sluttproduktet i løsninger vært begrenset til 100 pg/ml.

EKSEMPEL 9

E2- repressor- konjugater

For å teste det cellulære opptak og E2-repressoraktiviteten av transportpolypeptid-E2-repressor-konjugater, overførte vi samtidig et E2-avhengig reporterplasmid og et E2-ekspresjonsplasmid til SV40-transformerte afrikansk grønn apenyre ("COS7")-celler. Deretter utsatte vi de overførte celler for transportpolypeptid-E2-repressor-konjugater (fremstilt ved genetisk fusjon eller kjemisk tverrbinding) eller for egnede kontrollforbindelser. Hemmingstesten, beskrevet nedenfor, var i alt vesentlig som beskrevet av Barsoum et al. ( supra) .

Repressorassayceller

Vi erholdt C0S7-cellene fra the American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC Nr. CRL 1651). Vi formerte COS7-cellene i Dulbecco's modified Eagle's medium (GIBCO, Grand Island, NY) med 10% føtalt bovint serum (JRH Bio-sciences, Lenexa, KS) og 4 mM glutamin {"vekstmedium"). Celleinkubasjonsforholdene var 5,5% C02 ved 37°C.

Represj onsassayplasmider

Vårt E2-avhengige reporterplasmid, pXB332hGH, inneholdt et humant veksthormon-reportergen drevet av en avkortet SV40-tidlig promoter med 3 oppstrøms E2-bindingseter. Vi konstruerte hGH-reporterplasmidet, pXB332hGH, som beskrevet av Barsoum et al. ( supra).

For ekspresjon av et HPV-E2-gen i hele sin lengde, konstruerte vi plasmidet pAHE2 {figur 4). Plasmidet pAHE2 inneholder E2-genet fra HPV-kjede 16, operativt bundet til adeno-virus sen hovedpromoter uthevet med SV40-forsterkeren, oppstrøms for promoteren. Vi isolerte HPV E2-genet fra plasmidet pHPV16 (HPV16-genomet i full lengde klonet til pBR322) beskrevet av M. Durst et al., "A Papillomavirus DNA from Cervical Carcinoma and Its Prevalence in Cancer Biopsy Samples from Different Geographic Regions", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80, sider 3812-3815 (1983), som et Tthllll-Asel-fragment. Tthllll spalter nukleotidet 2711, og Asel spalter nukleotidet 3929 i HPVl6-genomet. Vi avstumpet endene av Tthllll-Asel-fragmentet i en DNA-polymerase-I-Klenowreaksjon, og ligerte BamHI-binderne (New England Biolabs, kat. nr. 1021). Vi innsatte dette bindingsbærende fragment i BamHI-spaltet plasmid pBG331 for å danne plasmidet pAHE2.

Plasmidet pBG331 er det samme som pBG312 [R.L. Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells", Cell, 45, sider 685-698 (1986)], unntatt at den mangler BamHI-setet nedstrøms fra SV40-polyadenyler-ingssignalet. Dette gjør BamHI-setet mellom promoteren og SV40-intronet unikt. Vi fjernet det uønskede BamHI-sete ved delvis BamHI-spalting av pBG312, gelrensing av det line-ariserte plasmid, stumpet endedannelse ved DNA-polymerase-I-Klenowbehandling, selvligering og utvelgelse av de ønskede plasmider med fjernet BamHI-sete.

Bakteriell fremstilling av E2- repressorrproteiner

Et av våre E2-repressorrproteiner, E2.123, bestod av karb-oksyterminale 121-aminosyrer av HPV16 E2 med MetVal tilsatt ved aminoenden. Vi anvendte også en variant av E2.123 kalt E2.123CCSS. E2.123 har cysteinresiduer i HPV16-E2-amino-syreposisjoner 251, 281, 300 og 309. I E2.123CCSS er cysteinresiduene i posisjoner 300 og 309 forandret til serin, og lysinresiduet i posisjon 299 er forandret til arginin. Vi byttet ut cysteinresiduene i posisjoner 300 og 309, slik at cysteinavhengig kjemisk tverrbinding kunne finne sted i aminoendedelen av E2-repressoren, men ikke i E2-minimal-DNA-bindings/dimerisasjonsområdet. Vi anså at tverrbindingen i det minimale DNA-bindende område sannsynligvis ville forstyrre repressorens biologiske aktivitet.

For konstruksjon av plasmidet pET8c-123 (figur 5; SEKV-ID Nr. 14), fremstilte vi de nødvendige DNA-fragmenter ved standard polymerasekjedereaksjons- ("PCR") teknikker, med plasmidet pHPV16 som templat. (For en generell oversikt over PCR-teknikker, jfr. kapittel 14 i Sambrook et al., supra. Automatisert PCR-utstyr og -kjemikalier er kommersielt tilgjengelige.) Nukleotidsekvensen av EA52, PCR-oligonukleotid-primeren for 5'-enden av 374-basepar E2-123-fragmentet, er oppført i sekvenslisten under SEKV-ID Nr. 15. Nukleotidsekvensen for EA54, PCR-oligonukleotidprimeren anvendt for 3'-enden av E2-l23-fragmentet, er oppført i sekvenslisten under SEKV-ID Nr. 16. Vi spaltet PCR-produktene med Ncol og BamHI og klonet det resulterende fragment til ncoI/BamHI-spaltet ekspresjonsplasmid pETBc (Studier et al., supra), for å danne plasmidet pET8c-l23.

Ved å anvende samme fremgangsmåte med en forskjellig 5'-oligonukleotid-PCR-primer, erholdt vi et 260-baseparfragment ("E2-85") inneholdende et metioninkodon og et alaninkodon direkte etterfulgt av kodoner for de karboksy-terminale 83- aminosyrer av HPV16E2. Nukleotidsekvensen for EA57, PCR-5<1->primeren for å fremstille E2-85, er oppført i sekvenslisten under SEKV-ID Nr. 34.

Por å konstruere plasmidet pET8c-123CCSS (figur 6; SEKV-ID Nr. 17), for bakteriell fremstilling av E2.123CCSS, syntetiserte vi et 882-basepar-PstI-EagI-DNA-fragment ved PCR-teknikker. PCR-templatet var pET8c-123. En av PCR-primer-ene, kalt 374.140, kodet alle tre aminosyreendringer:

CGACACTGCA GTATACAATG TAGAATGCTT TTTAAATCTA TATCTTAAAG

ATCTTAAAG (SEKV-ID Nr. 18). Den andre PCR-primer, 374.18, hadde følgende sekvens: GCGTCGGCCG CCATGCCGGC GATAAT (SEKV-ID Nr. 19). Vi spaltet PCR-reaksjonsproduktene med Pstl plus Eagl og isolerte 882-basepar-fragmentet ved standard-metoder. Det sluttlige trinn var fremstilling av pET8c-123CCSS i en 3-delt ligering, forbindende et 3424-basepar-EcoRI-Eagl-fragment fra pET8c-l23 med 882-basepar-PCR-fragmentet og et 674-basepar-PstI-EcoRI pET8C-123-fragment, som vist på figur 6. Vi verifiserte konstruksjonen ved DNA-sekvensanalyse. For fremstilling av E2.123- og E2.123CCSS-proteiner, uttrykte vi plasmidene pET8c-l23 og pET8c-123-CCSS i E. coli-kjeden BL21(DE3)pLysS, som beskrevet av Studier (supra).

Rensing av E2- repressor- proteiner

Vi tinte 3,6 g frosne pET8c-123-transformerte E. coli-celler og suspenderte dem i 35 ml 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA, 2,5 mM DTT plus proteasehemmere {1 mM PMSP, 3 mM benzamidin, 50 pg/ml pepstatin A, 10 pg/ml aprotinin). Vi oppløste cellene ved to passasjer gjennom en fransk presse ved 10.000 psi. Vi sentrifugerte løsningen ved 12.000 rpm i en SA600-rotor i 1 time. E2.123-Proteinet var i supernatanten. Til supernatanten tilsatte vi MES-buffer (pH 6) opptil 25 mM, MES-buffer (pH 5) opptil 10 mM og NaCl opptil 125 mM. Vi påførte deretter supernatanten på en 2 ml Sepharose Fast Flow kolonne ved 6 ml/time. Etter påsetting vasket vi kolonnen med 50 mM Tris-HCl {pH 7,5) og 1 mM DTT. Vi utførte deretter trinnvis gradienteluering (2 ml/trinn) med 200, 300, 400, 500, 700 og 1000 mM NaCl i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM DTT. E2.123-repressor-proteinet ble eluert i fraksjonene med 500 og 700 mM NaCl. SDS-PAGE-Analyse viste at renheten av E2.123-repressoren var over 95%.

Vi tinte 3,0 g frossen pET8c-123CCSS-transformert E. coli og suspenderte cellene i 30 ml av samme buffer som anvendt for pET8c-123-transformerte celler (ovenfor). Oppløsning, fjerning av uløselig celleavfall og tilsetning av MES-buffer og NaCl ble også gjennomført som beskrevet for rensingen av E2-123. Rensingsprosedyren for E2.123CCSS ble forandret etter tilsetning av MES-bufferen og NaCl, siden det dannedes en feining med E2.123CCSS ved dette punkt av fremgangsmåten. Vi fjernet feiningen ved sentrifugering og oppdaget at både den og supernatanten inneholdt vesentlig E2-repressoraktivitet. Derfor utsatte vi begge for rense-trinn. Vi påførte supernatanten på en 2 ml S Sepharose Fast Flow kolonne (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) ved 6 ml/time. Etter tilføring vasket vi kolonnen med 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM DTT. Etter vasking av kolonnen utførte vi trinnvis graderingseluering (2 ml/trinn) under anvendelse av 300, 400, 500, 700 og 1000 mM NaCl i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM DTT. E2.123CCSS-Proteinet eluerte med 700 mM NaCl. SDS-PAGE-Analyse viste at dets renhet var over 95%. Vi oppløste E2.l23CCSS-feiningen i 7,5 ml 25 mM Tris-HCl

(pH 7,5), 125 mM NaCl, 1 mM DTT og 0,5 mM EDTA. Vi satte de oppløste materialer på en 2 ml S Sepharose Fast Flow kolonne og vasket kolonnen som beskrevet for E2.123 og ikke felt E2.123CCSS. Vi utførte trinnvis gradienteluering (2 ml/trinn) under anvendelse av 300, 500, 700 og 1000 mM NaCl. E2-repressoren eluerte i 500-700 mM NaCl-fraksjonene. SDS-PAGE-analyse viste at dens renhet var over 98%. Direkte etter rensing av E2.123- og E2.123CCSS-proteinene, tilsatte vi glyserolt til en endelig konsentrasjon på 15% (vol./vol) og lagret hurtigfrosset ("flash-frozen") (flytende N2) alikvoter ved -70°C. Vi kvantifiserte de rensede E2-re-pressorproteiner ved UV-absorbering ved 280 nm under anvendelse av en optisk koeffisient på 1,8 ved 1 mg/ml.

Kjemisk tverrbinding

Vi utførte kjemisk syntese av transportpolypeptidet bestående av tat-aminosyrer 37-72, som beskrevet i eksempel 1. Vi oppløste polypeptidet (5 mg/ml) i 10 mM MES-buffer (pH 5,0), 50 mM NaCl og 0,5 mM EDTA (optisk koeffisient på 0,2 ved 1 mg/ml). Til transportpolypeptidløsningen tilsatte vi en bismalimidoheksan- ("BMH") (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, kat. nr. 22319G) råstoffløsning (6,25 mg/ml DMF) til en endelig konsentrasjon på 1,25 mg/ml og HEPES-buffer-råstoffløsning (1 M) med pH 7,5 til en endelig konsentrasjon på 100 mM. Vi lot BMH reagere med proteinet i 30 minutter ved værelsestemperatur. Vi separerte deretter protein-BMH fra ureagert BMH ved gelfiltrering på en G-10 kolonne ekvilibrert i 10 mM MES (pH 5), 50 mM NaCl og 0,5 mM EDTA. Vi lagret alikvoter av transportpolypeptid-BMH-konjugatet ved -70°C.

For tverrbinding av transportpolypeptid-BMH-konjugatet til E2-repressoren, fjernet vi E2-repressorproteinet fra sin lagringsbuffer. Vi oppløste E2-repressorproteinet med tre volumdeler 25 mM MES (pH 6,0) og 0,5 mM EDTA og tilsatte den porsjonsvis på en S Sepharose Fast Flow (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) med 5 mg protein pr. ml harpiks. Etter å ha helt materialet av proteinholdig resin på en kolonne, vasket vi kolonnen med 25 mM MES (pH 6,0), 0,5 mM EDTA og 250 mM NaCl. Vi eluerte deretter det bundne E2-repressor-protein fra kolonnen med samme buffer inneholdende 800 mM NaCl. Vi fortynnet det E2-repressorholdige elueringsmiddel til l mg/ml med 25 mM MES (pH 6,0) og 0,5 mM EDTA. Fra tverrbindingsprøvestudier utført med hver batch E2-re-pressorprotein og BMH-aktivert transportpolypeptid, fastslo vi at behandling av 1 mg E2-repressorprotein med 0,6 mg BMH-aktivert transportpolypeptid gir den ønskede innlemming av l transportmolekyl pr. E2-repressor-homodimer. Vanligvis blandet vi 2 ml E2-repressor (1 mg/ml) med 300 pl tat37-72-BMH (4 mg/ml) og 200 pl 1 M HEPES (pH 7,5). Vi lot tverrbindingsreaksjonen forløpe i 30 minutter ved værelsestemperatur. Vi stoppet tverrbindingsreaksjonen ved tilsetning av 2-merkaptoetanol til en endelig konsentrasjon på 14 mM. Vi bestemte omfanget for tverrbinding ved SDS-PAGE-analyse. Vi lagret alikvoter av tat37-72-E2-repressorkonjugat ved -70°C, Vi anvendte identiske fremgangsmåter for å kjemisk sammenbinde tat37-72-transportpolypeptidet med HPVE2.123-repressor-proteinet og HPVE2-CCSS-repressor-proteinet.

Cellulært opptak av E2- repressorkonjugater

For våre E2-repressorassays brukte vi transient ekspresjon av plasmider ført inn i COS7-celler. Vår E2-repressorassay-prosedyre lignet den som beskrevet av Barsoum et al. (supra) . Vi overførte 4 x IO<6> COS7-celler (ca. 50% sammenfly-tende ved høstingstidspunktet) ved elektroforese, i to separate overføringer ("EPl" og "EP2"). I overføring EP1 anvendte vi 20 pg pXB332hGH (reporterplasmid) plus 380 pg ultralydbehandlet laksespermie-bærer-DNA (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). I overføring EP2 anvendte vi 20 pg pXB33-2hGH plus 30 pg pAHE2 (E2-transaktivator) og 350 pg laksespermie-bærer-DNA. Vi utførte elektroforeser med en Bio-Rad Gene Pulser ved 270 volt og 960 pFD, med en pulseringstid på ca. 11 msek. Etter elektroforesene sådde vi cellene i 6-brønn-skåler med 2 x IO<5> celler pr. brønn. Fem timer etter elektroforesene sugde vi bort vekstmediet, renset cellene med vekstmedium og tilsatte 1,5 ml ferskt vekstmedium til hver brønn. Ved dette tidspunkt tilsatte vi klorokin ("CQ") til en slutlig konsentrasjon på 80 pM (eller en bestemmel-sesvæske til kontrollcellene). Deretter tilsatte vi tat37-72 tverrforbundet med E2.123 ("TxHE2<n>) eller tat37-72 tverrforbundet med E2.123CCSS ("TxHe2CCSS"). Den endelige konsentrasjon av disse transportpolypeptid-cargokonjugater var 6, 20 eller 60 pg/ml cellevekstmedium (tabell I).

Etter inkubasjon i 18 timer fjernet vi mediet, renset cellene med ferskt medium og tilsatte 1,5 ml ferskt medium inneholdende de samme konsentrasjoner klorokin og transportpolypeptid- cargokonjugater som i foregående 18 timers inkubasjon. Denne mediumutveksling ble gjort for å fjerne all hGH som eventuelt var til stede før repressoren trengte inn i cellene. 24 timer etter mediumutvekslingen høstet vi cellene og utførte celletelling for å sjekke levedyktig-heten. Vi testet deretter etter hGH på ufortynnede vekst-mediumprøver ifølge fremgangsmåten til Seldon, beskrevet i Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associ-ates, New York, sider 9.7.1-9.7.2 (1987) under anvendelse av Allegro Human Growth Hormone transient genekspresjons-systemutstyr (Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA). Vi subtraherte assaybakgrunnen (dvs. assaykomponenter tilsatt ikkekondisjonert medium) fra hGH cpm, for alle prøver. Vi utførte separate beregninger av repressor-prosenttallet for en gitt proteinbehandling, avhengig av om det var klorokin til stede ("(+)CQ") eller ikke ("(-)CQ") i proteinopptakstesten. Vi beregnet repressor-prosenttallet ifølge følgende formel:

hvor

BKG= hGH cpm i overføringene av reporteren alene (f.eks.

EPl.l for (-)CQ og EP1.2 for ( + )CQ);

ACT= hGH cpm i overføringene av reporter plus transaktivator, men til hvilken intet repressorkonjugat ble

tilsatt (f.eks. EP2.1 for (-)CQ og EP2.8 for ( + )CQ); REP= hGH cpm i overføringene av reporter plus transaktivator, til hvilken det ble tilsatt et repressorkonjugat (f.eks. EP2.2-2.7 for (-)CQ og EP2.9-2.14 for

( + )CQ) -

Data fra et representativ E2-hemmingsassay vises i tabell II. Tabell I identifiserer de diverse prøver representert i tabell II. Figur 7 avbilder grafisk resultatene presentert i tabell II.

TABELL II

Transportpolypeptidet tat37-72 tverrforbundet med E2-repressor {E2.123 eller E2.123CCSS) resulterte i en doseavhengig hemming av E2-avhengig genekspresjon i de kultiverte pattedyrceller (tabell II; figur 7). Vi har gjentatt dette eksperiment fire ganger, med lignende resultater. Virkningen var E2-spesifikk, dvs. andre tat37-72-konjugater hadde ingen virkning på E2-induksjonen av pXB332hGH (data ikke vist). Dessuten hadde tat37-72xHE2-konjugatene ingen virkning på hGH-ekspresjonsnivået av en reporter, i hvilken ekspresjonen av hGH-genet ble drevet av en grunnleggende promoter som ikke reagerte på E2. E2-repressoren med CCSS-mutasjon hemmet til en høyere grad enn repressoren med den naturlig forekommende aminosyresekvens. Dette var å vente, siden tverrbinding av transportpolypeptidet til enten av de siste cysteiner i den naturlig forekommende repressor sannsynligvis ville redusere eller forhindre repressorens aktivitet. Klorokin var ikke nødvendig for repressorens aktivitet. Imidlertid øket klorokin hemmingen i alle tester. Disse resultater oppsummeres i tabell II og figur 7.

EKSEMPEL 10

tatAcys- konj ugater

Fremstilling av tatAcys

For bakteriell fremstilling av et transportpolypeptid bestående av tat-aminosyrer 1-21 direkte fusjonert med tat-aminosyrer 38-72, fremstilte vi ekspresjonsplasmidet pTATAcys (figur 8; SEKV-ID Nr. 20). For å fremstille plasmidet pTATAcys, anvendte vi konvensjonelle PCR-teknikker, med plasmidet pTAT72 som PCR-templat. En av de oligonukleotide primere anvendt for PCR var 374.18 (SEKV-ID Nr. 19), hvilken dekker Eagl-setet oppstrøms for tat-kodesekvensen.

(Vi anvendte også oligonukleotid 374.18 i konstruksjonen av plasmidet pET8c-l23CCSS. Jfr. eksempel 9). Den andre oligonukleotide primer for PCR, 374.28, dekker Eagl-setet innen tat-kodesekvensen og mangler de tat-DNA-sekvenskodende aminosyrer 22-37. Den nukleotide sekvens for 3 74.2 8 er:

TTTACGGCCG TAAGAGATAC CTAGGGCTTT GGTGATGAAC GCGGT (SEKV-ID

Nr. 21). Vi spaltet PCR-produktene med Eagl og isolerte det resulterende 762-baseparfragment. Vi innsatte dette Eagl-fragment i 4 057-baseparvektoren fremstilt ved Eagl-spaltning av pTAT72. Vi verifiserte konstruksjonen ved DNA-sekvensanalyse og ekspresjonerte tatAcys-polypeptidet ved fremgangsmåten til Studier et al. { supra). SDS-PAGE-Analyse viste at tatAcys-polypeptidet hadde riktig størrelse.

For rensing av tatAcys-proteinet tinte vi 4,5 g pTATAcys-transformerte E. coli-celler, resuspenderte cellene i 35 ml 20 mM MES (pH 6,2) og 0,5 mM EDTA. Vi oppløste cellene ved to gjennomganger gjennom en fransk presse ved 10.000 psi. Vi fjernet uløselig residuum ved sentrifugering ved 10.000 rpm i en SA600-rotor i l time. Vi påførte supernatanten på en 5 ml S Sepharose Fast Flow kolonne ved 15 ml/time. Vi vasket kolonnen med 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 0,3 mM DTT. Vi utførte deretter trinnvis gradienteluering (2 ml/trinn) med samme buffer, inneholdende 300, 400, 500, 700 og 950 mM NaCl. TatAcys-proteinet eluerte i fraksjonen med 950 mM NaCl.

Vi konjugerte et tatAcys-transportpolypeptid med rhodaminisotiocyanat og testet det ved å direkte teste for cellulært opptak. Resultatene var positive (lignet resultatene for lignende eksperimenter med tatl-72).

TATAcys- 249 genetisk fusjon

For bakteriell ekspresjon av tatAcys-transportpolypeptidet som er genetisk fusjonert med aminoenden av det naturlig forekommende E2-repressorprotein (dvs. karboksyende-249-aminosyrer av BPV-1 E2), konstruerte vi plasmidet pTATAcys-249 som følger. Vi konstruerte plasmidet pFTESOl (figur 9) fra plasmidene pTAT72 (Frankel og Pabo, supra) og pXB314 (Barsoum et al., supra). Fra plasmidet pXB314 isolerte vi NcoI-Spel-DNA-fragmentet som koder 249-aminosyre-BPV-1-E2-repressoren. (Ncol spalter ved nukleotid 296 og Spel spalter ved nukleotid 1118 av pXB314.) Vi avstumpet endene av dette fragment ved DNA-polymerase-I-Klenow-behandling og tilsatte en kommersielt tilgjengelig BglII-binder (New England Biolabs, kat. nr. 1090). Vi innsatte dette binderbærende fragment til det BamHI-spaltede (komplett spaltning) plasmid pTAT72. I pTAT72 finnes det et BamHI-spaltningssete innen tat-kodeområdet, nære dens 3'-ende, og det andre BamHI-spaltningssete ligger noe nedstrøms fra tat-genet. Bglll-Binderen bandt seg ved tat- og E2-kodesekven-sene i leseramme for å kode en fusjon av de første 62 aminosyrer av tat-proteinet, etterfulgt av et serinresiduum og de siste 249 aminosyrer av BPV-1-E2-proteinet. Vi kalte dette bakterielle ekspresjonsplasmid pFTESOl (figur 9). For å konstruere pTATAcys-249 (figur 10; SEKV-ID Nr. 22), innsatte vi 762-basepar-Eagl-fragmentet fra plasmidet pTATAcys, som inneholder partiet av tat inneholdende cyste-infjerningen, til 4812-basepar-Eagl-fragmentet av plasmidet pFTESOl.

Rensing av tatAcys- 249

Vi tinte 5 g E. coli uttrykkende tatAcys-249 og suspenderte cellene i 40 ml 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT plus proteasehemmmere (1,25 mM PMSF, 3 mM benzamidin, 50 pg/ml pepstatin A, 50 pg/ml aprotinin, 4 pg/ml E64). vi oppløste cellene ved to passasjer gjennom en fransk pressecelle ved 10.000 psi. Vi fjernet uløselig residuum fra løsningen ved sentrifugering ved 12.000 rpm i en SA600-rotor i l time. Vi renset tatAcys-249 fra den løslige fraksjon. Supernatanten ble satt på en 2 ml S Sehparose Fast Flow kolonne (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) i en strømningshastighet på 6 ml/h. Kolonnen ble vasket med 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM NaCl, 0,5 mM EDTA og 1 mM DTT og behandlet med støt-eluering med salt i samme buffer, inneholdende 100, 200, 300, 400, 500, 600 og 800 mM NaCl. Vi samlet TatAcys-249 i 600-800 mM saltfraksjonene. Vi samlet toppfraksjonene, tilsatte glyserol til 15% og lagret alikvotene ved -70°C.

Immunofluorescensassay

For å analysere cellulært opptak av tatAcys-E2-repressor-fusjonsproteinet anvendte vi indirekte immunofluorescens-teknikker. Vi sådde HeLa-celler på dekkglass i 6-brønners vevskulturskåler til 50% konfluens. Etter inkubasjon over natten tilsatte vi tatAcys-E2-repressor-fusjonproteinet (1 pg/ml slutlig konsentrasjon) og klorokin (0,1 mM sluttlig konsentrasjon). Etter seks timer fjernet vi det fusjonsprotein/klorokinholdige vekstmedium og vasket cellene to ganger med PBS. Vi fikserte de vaskede celler i 3,5% formaldehyd ved værelsestemperatur. Vi permeabiliserte de fikserte celler med 0,2% Triton X-100/2% bovint serum-albumin ("BSA") i PBS inneholdende IM MgCl2/0,l mM CaCl2

("PBS+") i 5 minutter ved værelsestemperatur. For å blokkere de permeabiliserte celler behandlet vi dem med PBS inneholdende 2% BSA i 1 time ved 4°C.

Vi inkuberte dekkglassene med 20 pl primær antistoffløsning i hver brønn, i en fortynning til 1:100 i PBS+ inneholdende 2% BSA i l time ved 4°C. Det primære antistoff var enten et polyklonalt antistoff av kanin mot BPV-i-E2-repressoren

(generert ved å injisere de rensede karboksyende-85-aminosyrer av E2) eller et polyklonalt antistoff av kanin mot tat (generert ved å injisere de aminoende-72-aminosyrer av tat-proteinet). Vi tilsatte et sekundært antistoff i en fortynning til 1:100 i 0,2% Tween-20/2% BSA i PBS+ i 30 minutter ved 4°C.

Det sekundære antistoff var et rhodaminkonjugert gjete-anti-kanin IgG (Cappel nr. 2212-0081). Etter inkubasjon av cellene med det sekundære antistoff, vasket vi cellene med 0,2% Tween-20/2% BSA i PBS+ og preparerte dekkglassene med 90% glyserol, 25 mM natriumfosfat (pH 7,2) og 150 mM NaCl. Vi undersøkte cellene med et fluorescensmikroskop utstyrt med et rhodaminfilter.

Cellulært opptak av tatAcys- fusjoner

Vi målte et signifikant cellulært opptak av tatAcys-E2-repressor-fusjonsproteinet, under anvendelse av enten tat-antistoffet eller E2-antistoffet. I kontrollceller utsatt for det ukonjugerte tat-protein målte vi intracellulær fluorescens under anvendelse av tat-antistoffet, men ikke med E2-antistoffet. I kontrollceller utsatt for en blanding av den ukonjugerte E2-repressor og tat-protein eller tatAcys, målte vi fluorescens under anvendelse av tat-antistoffet, men ikke med E2-antistoffet. Dette bekreftet at tat formidler opptak av E2-repressoren kun når den er bundet til tat-proteinet. Liksom med ukonjugert tat-protein, målte vi tatAcys-E2-repressor-fusjonprotein i hele cellen, men det var konsentrert i de intracellulære vesikler. Disse resultater viser at et tat-derivert polypeptid som helt mangler cysteinresiduer, kan bære et heterologt protein (dvs. transportpolypeptid-cargoprotein genetisk fusjon) inn i dyreceller.

I en fremgangsmåte lignende den som beskrevet ovenfor, fremstilte vi en genetisk fusjon av tatAcys til de C-terminale 123-aminosyrene av HPV-E2. Når tilsatt til vekstmediet, oppviste dette fusjonspolypeptid hemming av E2-avhengig genekspresjon i C0S7-celler (data ikke vist).

EKSEMPEL 11

Motsatt rettede oligodeoksynukleotidkonjugater

Under anvendelse av en automatisert DNA/RNA-syntetisator (Applied Biosystems modell 394), syntetiserte vi DNA-fos-for t iona tanaloger (med en lengde på 4-18 nukleotider), hver inneholdende en fri aminogruppe i 5'-enden. Aminogruppen ble innlemmet i oligonukleotidene under anvendelse av kommersielt modifiserte nukleotider (aminolink 2, Applied Biosystems). 01igonukleotidene tilsvarte likerettede og motsatt rettede kjeder fra områder av veksthormonet i menneske og CAT-messenger-RNA.

For hver tverrbindingsreaksjon oppløste vi 200 pg oligonukleotid i 100 pl 25 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,0). Vi tilsatte deretter 10 pl 50 mM utgangsløsning av sulfo-SMCC, og lot reaksjonen forløpe ved værelsestemperatur i 1 time. Vi fjernet ureagert sulfo-SMCC ved gelfiltrering av reaksjonsblandingen på en P6DG-kolonne (Bio-Rad) i 25 mM HEPES (pH 6,0). Vi tørket oligonukleotid-sulfo-SMCC-adduktet under vakuum. Utbyttet av oligonukleotider i denne fremgangsmåte varierte fra 58 til 95%. For omsetning med et transportpolypeptid, gjenoppløste vi hvert oligonukleotid-sulfo-SMCC-addukt i 50 pl 0,5 mM EDTA, overførte løsningen

. til et prøverør inneholdende 50 pg frysetørket transportpolypeptid og lot reaksjonen forløpe ved værelsestemperatur

i 2 timer. Vi analyserte reaksjonsproduktene ved SDS-PAGE.

EKSEMPEL 12

Ant i stof fkonjugater

Antitubulinkonjugat 1

Vi ervervet kommersiell IgGl-mAb-antitubulin fra mus (Amersham) og renset vekk bukvæske ved konvensjonelle metoder under anvendelse av protein A. Vi merket det rensede antistoff med rhodaminisotiocyanat, med 1,2 mol rhodamin/mol antistoff. Når vi utsatte fikserte, permeabiliserte HeLa-celler for det merkede antistoff, oppviste mikroskopanalysen sterkt flekkede mikrotubuler. Selv om rhodaminmerkingen var tilstrekkelig, økte vi antistoff-signalet med antimus FITC.

I en i alt vesentlig lignende fremgangsmåte som beskrevet under eksempel 2 (ovenfor), lot vi 250 pg av antistoffet reagere med et 10:1 molart overskudd av sulfo-SMCC. Vi tilsatte deretter 48 pg (<35>S-merket) tatl-72. Det molare forhold av tatl-71antitstoff var 2,7:1. Ifølge innlemming av radioaktivitet ble tatl-72 kryssbundet med antistoffet i et forhold på 0,6:1.

For analyse av opptaket av tatl-72-antistoffkonjugatet, tilsatte vi konjugatet til mediet (10 pg/ml) i hvilket celler dyrket på dekkglass badet. Vi observerte en punkt-mønstret fluorescens i cellene. Punktmønsteret oppviste den vesikulære plassering av konjugatet, og det var derfor uvisst om konjugatet var blitt levert til cytoplasma.

For å demonstrere immunoreaktiviteten av det konjugerte antistoff, testet vi dens evne til å binde tubulin. Vi koblet renset tubulin til cyanogenbrominaktivert Sepharose 4B (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). Vi påførte prøver av det radioaktive konjugat til tubulinkolonnen (og til en Sepharose 4B kontrollkolonne) og målte mengden av bundet konjugat. Det ble bundet mer radioaktivitet til affini-tet smatr i sen enn til kontrollkolonnen, hvilket tydet på tubulinbindende aktivitet.

Antitubulinkonjugat 2

I et separat kryssbindingseksperiment ervervet vi rotte-monoklonalt antitubulinantistoff IgG2a (Serotec) og renset vekk bukvæske ved konvensjonelle metoder under anvendelse av protein G. Vi eluerte antistoffet med Caps buffer (pH 10) . Det rensede antistoff fikk positivt utslag i en tubu-linbindingstest. Vi lot tatl-72 reagere med rhodaminisotiocyanat i et molart forhold på 1:1. Reaksjonsproduktet oppviste et A555/A2ao-forhold på 0,63, hvilket var tegn på en substitusjon på ca. 0,75 mol farge pr. mol tatl-72. Etter fjerning av den ureagerte farge fra tatl-72-rhodaminet ved G-25-gelfiltrering (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ), gjen-vant vi kun 52 pg av de 150 pg tatl-72 vi anvendte i reaksjonen.

Vi sparte en alikvot av tatl-72-rhodaminet for anvendelse (som kontrollforbindelse) i cellulære opptakseksperimenter og tilsatte resten til 0,4 mg antistoff som var omsatt med SMCC (20:1). Reaksjonsblandingen inneholdt et tatl-72:antistoff -f orhold på ca. 1:1 istedenfor de planlagte 5:1. (I et etterfølgende eksperiment viste seg 5:l-forholdet ikke å være tilfredsstillende, idet det gav en feining). Vi lot kryssbindingsreaksjonen forløpe over natten ved 4°C. Vi tilsatte deretter en molart overflod av cystein for å blokkere de gjenblivende maleimidogrupper for dermed å stoppe kryssbindingsreaksjonen. Vi sentrifugerte reaksjonsblandingene for å fjerne hver mulig feining.

Vi utførte elektroforese under anvendelse av en 4-20% polyakrylamido gradientgel for å analysere supernatanten under reduserende og ikke-reduserende forhold. Vi analyserte dessuten kulene ved denne fremgangsmåte. I supernatant-ene fra antistoff-tatl-72- (uten rhodamin) konjugasjons-eksperimenter, observerte vi meget lite materiale på 4-20% gelen. I supernatanter fra antistoff-tat 1-72-rhodaminkonjli-gas jonseksperimenter observerte vi imidlertid relativt tunge kjeder overfor antistoffet, for den reduserte prøve. Antistoffet virket å være konjugert med tatl-72 i et forhold på ca. 1:1.

I eksperimenter med cellulært opptak utført med konjugat 2 (fremgangsmåte som beskrevet for konjugat 1), erholdt vi lignende resultater som med konjugat 1. Når vi visualiserte konjugatet ved rhodaminfluorescens eller ved fluorescein forbundet med et andre antistoff, observerte vi konjugatet i vesikler.

EKSEMPEL 13

Ytterligere tat- E2- konjugater

Kjemisk kryssbundne tat- E2- konjugater

Vi kryssbandt kjemisk transportpolypeptidet tat37-72 med fire forskjellige repressorformer av E2. De fire E2-re-pressorenheter anvendt i disse eksperimenter var karboksyende 103-residuer (dvs. 308-410) av BPV-l ("E2.103"); karboksyende 249-residuer (dvs. 162-410) av BPV-1 ("E2.249-") ; karboksyende 121-residuer (dvs. 245-365) av HPV-16 ("HE2") og karboksyende 121-residuer av HPV-16, hvor cysteinresiduene i posisjoner 300 og 309 var byttet ut mot serin, og lysinresiduet i posisjon 299 var byttet ut mot arginin ("HE2CCSS"). Den rekombinante fremstilling og rensing av HE2 og HE2CCSS, etterfulgt av kjemisk kryssbinding av HE2 og HE2CCSS til tat37-72 for å danne TxHE2 hhv. TxHE2CCSS, beskrives i eksempel 9 (ovenfor). For den kjemiske kryssbinding av E2.103 og E2.249 til tat37-72 (for å gi konjugatene kalt TxE2.103 hhv. TxE2.249), fulgte vi samme fremgangsmåte som for å fremstille TxHE2 og TxHE2CCSS (eksempel 9, ovenfor).

Vi uttrykte proteinet E2.103 i E. coli fra plasmidet pET-

E2.103. Vi erholdt pET-E2.103 ved en PCR-klonefremgangsmåte analog med den som ble anvendt for å fremstille pET8c-123, beskrevet i eksempel 9 (ovenfor) og på figur 5. Liksom ved fremstillingen av pET8c-123, ligerte vi et PCR-fremstilt Ncol-BamHI-E2-fragment i Ncol-BamHI-spaltet pET8c. Vårt PCR-templat for E2-fragmentet var plasmidet pC0-E2 [Hawley-Nelson et al., EMBO J., vol. 7, sider 525-531 (1988); USA-patent nr. 5.219.990]. De oligonukleotide primerer anvendt for å fremstille E2-fragmentet fra pCO-E2 var EA21 (SEKV-ID Nr. 36) og EA22 (SEKV-ID Nr. 37). Primer EA21 innførte et Ncol-sete som tilsatte et metioninkodon etterfulgt av et alaninkodon 5' i det naboliggende kodeområde for de karb-oksyterminale 101-residuer av BPV-1-E2.

Vi uttrykte proteinet E2.249 i E. coli fra plasmidet pET8c-249. Vi fremstilte pET8c-249 ved å innsette 1362-basepar-NcoI-BamHI-fragmentet fra plasmidet pXB314 (figur 9) i Ncol-BamHI-spaltet pET8c (figur 5).

TatAcys- BPV- E2- Genetiske f us j oner

I tillegg til TatAcys-249, testet vi flere andre TatAcys-BPV-l-E2-repressor-fusjoner. Plasmidet pTatAcys-105 kodet for tat-residuer 1-21 og 38-67, etterfulgt av karboksyende 105-residuene av BPV-1. Plasmidet pTatAcys-161 kodet for tat-residuer 1-21 og 38-62, etterfulgt av de karboksy-terminale 161-residuene av BPV-l. Vi konstruerte plasmidene pTatAcys-105 og pTatAcys-161 fra mellomproduktplasmidene pFTE103 hhv. pFTE403.

Vi fremstilte pFTEl03 og pFTE403 (samt pFTESOl) ved å ligere forskjellige innskudd i BamHI-spaltet (fullstendig spaltning) vektor pTat72.

For å erholde innsetningsfragmentene for pFTE103, isolerte vi et 929-basepar Plel-BamHI-fragment fra pXB314 og ligerte det med en dobbeltkjedet binder bestående av syntetisk oligonukleotid FTE.3 (SEKV-ID Nr. 23) og syntetisk oligonukleotid FTE.4 (SEKV-ID Nr. 24). Binderen kodet tat-residuer 61-67 og hadde en BamHI-overheng i 5'-enden og en Plel-overheng i 3'-enden. Vi ligerte det binderbærende fragment fra pXB3314 i BamHI-spaltet pTat72 for å erholde pFTEl03. For å erholde innsetningsfragmentet for pFTE403, spaltet vi pXB314 med Ncol og Spel, genererte buttede ender ved Klenow-behandling og ligerte en Bglll-linker bestående av GAAGATCTTC (New England Biolabs, Beverly, MA, Kat. Nr. 1090) (SEKV-ID Nr. 35) duplisert med seg selv. Vi renset det resulterende 822-baseparfragment ved elektroforese og ligerte det deretter i en BamHI-spaltet pTat72-vektor for å erholde pFTE4 03.

For å fjerne tat-residuer 22-37, derved erholdende pTatAcys-105 fra pFTE103 og pTatAcys-161 fra pFTE4 03, anvendte vi samme fremgangsmåte (beskrevet ovenfor) som for å erholde plasmidet pTatAcys-249 fra pFTESOl.

Tat Acys- HPV- E2- Geneti ske fus j oner

Vi konstruerte plasmidene pTatAcys-HE2.85 og pTatAcys-HE2.121 for å innkode et fusjonsprotein bestående av tatAcys-transportdelen (tat-residuer 1-21, 38-72) etterfulgt av karboksyende 85- hhv. 121-residuene av HPV-16.

Våre utgangsplasmider i konstruksjonen av pTatAcys-HE2.85 og pTatAcys-EI2.121 var pET8c-85 hhv. pET8c-123 (begge beskrevet ovenfor). Vi spaltet pET8c-85 og pET8c-123 med Bglll og Ncol, og isolerte det store fragment i hvert tilfelle (4769-basepar fra pET8c-85 eller 4880-basepar fra pET8c-123) for anvendelse som en vektor. I begge vektorer begynner E2-kodeområdet ved Ncol-setet. Inn i begge vektorer satte vi inn 220-basepar-BglII-AatII-fragmentet fra plasmidet pTatAcys samt et syntetisk fragment. 5'-Enden av Bglll-Aatll-fragmentet ligger oppstrøms fra T7-promoteren og koder de første 40 residuer av tatAcys (dvs. residuer 1-21, 38-56) . Det syntetiske fragment bestående av parede oligonukleotider 374.67 (SEKV-ID Nr. 25) og 374.68 (SEKV-ID Nr. 26) kodet tat-residuer 57-72, med en Aatll-overheng i

5'-enden og en Ncol-overheng i 3'-enden.

JB- Serier av genetiske fusjoner

Plasmidet pJB106 koder et fusjonsprotein (figur 12) (SEKV-ID Nr. 38), i hvilket et aminoende-metioninresiuum følges av tat-residuer 47-58 og deretter HPV-16-E2-residuer 245-365. For å erholde pJB106, utførte vi en 3-veis-ligering, skjematisk avbildet på figur 11. Vi genererte et 4602-baseparvektorfragment ved å spalte plasmidet pET8c med Ncol og BamHI. Et innskudd var et 359-basepar-MspI-BamHI-fragment fra pET8c-123, innkodende HPV-16-E2-residuer 248-365. Det andre innskudd var et syntetisk fragment bestående av det pardannede oligonukleotide par, 374.185 (SEKV-ID Nr. 27) og 374.186 (SEKV-ID Nr. 28). Det syntetiske fragment kodet aminoendemetioninet og tat-residuer 47-58 plus HPV16-residuer 245-247 (dvs. ProAspThr). Det syntetiske fragment hadde et Ncol-overheng i 5'-enden og et Mspl-overheng i den 3'-enden.

Vi erholdt plasmider pJB117 (SEKV-ID Nr. 59), pJB118 (SEKV-ID Nr. 60), pJB119 (SEKV-ID Nr. 61), pJB120 (SEKV-ID Nr. 62) OG pJBl22 (SEKV-ID Nr. 63) ved PCR-delesjonskloning på en lignende måte som anvendt for pTatAcys (beskrevet ovenfor og på figur 8). Vi konstruerte plasmider pJB117 og pJB118 ved å fjerne segmenter fra pTatAcys-HE2.121. Vi konstruerte plasmidene pJB119 og pJB120 ved å fjerne segmenter fra pTatAcys-161. I alle fire kloninger anvendte vi PCR-primer 374.122 (SEKV-ID Nr. 29) for å dekke Hindlll-setet nedstrøms fra tat-E2-kodeområdet. I hvert tilfelle dekket den andre primer Ndel-setet i begynnelsen av tatAcys-kodesekvensen og fjernet kodoner for residuer ved begynnelsen av tatAcys (dvs. residuer 2-21 og 38-46 for pJB117 og pJB119; og residuer 2-21 for pJB118 og pJB120) . For fjerning av residuer 2-21, anvendte vi primer 3 79.11 (SEKV-ID Nr. 30). For fjerning av residuer 2-21 og 38-46, anvendte vi primer 379.12 (SEKV-ID Nr. 31). Etter PCR-reaksjonen spaltet vi PCR-produktene med Ndel og Hindlll. Vi klonet deretter de resulterende restriksjonsfragmenter til vektor pTatAcys-HE2.121, hvilken tidligere var blitt spaltet med Ndel plus Hindlll for å gi et 4057-basepar-reseptorfragment. Dermed konstruerte vi ekspresjons-plasmider som kodet fusjonsproteiner bestående av aminosyreresiduer som følger: JB117 = Tat47-72-HPV16-E2-245-365;

JB118 = Tat38-72-HPV16-E2-245-365;

JB119 = Tat47-62-BPVl-E2-250-410 og

JB120 = Tat38-62-BPVl-E2-250-410.

Vi konstruerte pJB122 som kodet tat-residuer 38-58 etterfulgt av HPV16-E2-residuer 245-365 {dvs. E2-karboksyende 121-aminosyrer), ved å fjerne tat-residuer 59-72 fra pJBllB-kodoner. Vi utførte denne fjerning ved PCR under anvendelse av primer 374.13 (SEKV-ID Nr. 32), hvilken dekker Aatll-setet innen tat-kodeområdet, og primer 374.14 (SEKV-ID Nr. 33), hvilken dekker Aatll-setet noe nedstrøms fra det unike Hindlll-sete nedstrøms for Tat-E2-genet. Vi spaltet PCR-produktet med Aatll og isolerte det resulterende restriksjonsfragment. I det endelige pJB122-konstruk-sjonstrinn, innsatte vi det isolerte Aatll-fragment i den Aatll-spaltede vektor pJB118.

Det bør bemerkes at i alle fem av våre pJB-konstruksjoner beskrevet ovenfor, gikk et metioninkodon forut for tat-kodesekvensen, for initiering av translasjon.

Rensing av tat- E2- fusjonsproteiner

I alle tilfeller brukte vi E. coli for å uttrykke våre tat-E2-genetiske fusjoner. Vår generelle fremgangsmåte for tat-E2-proteinrensing omfattet følgende første trinn: Pellete-ring av cellene; resuspendering av dem i 8-10 volumer oppløsningsbuffer (25 mM Tris (pH 7,5), 25 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA) inneholdende proteaseinhibitorer - generelt 1 mM PMSF, 4 pg/ml E64, 50 pg/ml aprotinin, 50 pg/ml pepstatin A og 3 mM benzamidin); oppløsning av cellene i en fransk presse (2 passeringer ved 12.000 psi) og sentrifugering av løsningene ved 10.000-12.000 x g i 1 time (unntatt FTE-proteiner) ved 4°C. Ytterligere trinn anvendt for rensing av spesielle tat-E2-fusjonsproteiner beskrives nedenfor.

E2. 103 og E2. 249: Etter sentrifugering av løsningen ladet vi supernatanten på en Fast S Sepharose kolonne og eluerte E2.103- hhv. E2.249-proteinet med 1 M NaCl. Vi renset deretter E2.103 hhv. E2.249 ytterligere ved kromatografi på en P60 gelfilterkolonne ekvilibrert med 100 mM HEPES (pH 7,5), 0,1 mM EDTA og 1 mM DTT.

FTE103: Etter sentrifugering av løsningen ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4°C, samlet vi FTE103-proteinet (hvilket feltes) ved resuspendering av kulen i 6 M urea og tilsetning av fast guanidin-HCl til en slutlig konsentrasjon på 7 M. Etter sentrifugering av suspensjonen renset vi FTE103-proteinet fra supernatanten ved kromatografi på en A.5M gelfilterkolonne i 6 M guanidin, 50 mM natriumfosfat (pH 5,4) og 10 mM DTT. Vi samlet de FTE103-holdige fraksjoner fra gelfilterkolonnen, alt ettersom et bånd oppstod som hadde en observert molekylvekt på 19 kDa på Coomassiemer-kede SDS-polyakrylamideletroforesegeler.

FTE403: Vår rengjøringsmetode for FTE403 var ialt vesentlig lik den for FTE103, utenom at FTE403 migrerte på gelfilterkolonnen med en observert molekylvekt på 25 kDa.

FTE501: Etter sentrifugering av løsningen ved 10.000 x g i 30 minutter, resuspenderte vi pelleten i 6 M urea, tilsatte fast guanidin-HCl til en slutlig konsentrasjon på 6 M og DTT til en konsentrasjon på 10 mM. Etter 30 minutter ved 37°C gjorde vi løsningen klar ved sentrifugering ved 10.000 x g i 30 minutter. Vi satte deretter prøven på en A.5 agarosegelfilterkolonne i 6 M guanidin-HCl, 50 mM natriumfosfat (pH 5,4) og 10 mM DTT og samlet de FTE501-holdige fraksjoner fra gelfilterkolonnen, alt ettersom et bånd oppstod med en observert molekylvekt på 40 kDA på Coo-massiemerkede SDS-polyakrylamideletroforesegeler. Vi satte gelfilter-renset FTE501 på en C16-reversfase HPLC-kolonne og eluerte med en gradient av 0-75% acetonitril i 0,1% trifluoreddiksyre. Vi samlet FET501-proteinet i en enkel topp med en observert molekylvekt på 4 0 kDa.

TatAcys- 105: Etter sentrifugering av løsningen, satte vi supernatanten på en Q-Sepharose-kolonne ekvilibrert med 25 mM Tris (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. Vi satte deretter det gjennomstrømmede fra Q-Sepharosekolonnen på en S-Sepharose-kolonne ekvilibrert med 25 mM MES (pH 6,0), etter å ha justert det gjennomstrømmede fra Q-Sepharosekolonnen til ca. pH 6,0 ved tilsetning av MES {pH 6,0) til en slutlig konsentrasjon på 30 mM. Vi samlet tatAcys-105-proteinet fra S-Sepharosekolonnen ved anvendelse av sekvensielle NaCl-konsentrasjonstrinn i 25 mM MES (pH 6,0). TatAcys-105 eluerte i bufferen med pH 6,0 med 800-1000 mM NaCl.

TatAcys- 161: Etter sentrifugering av løsningen, satte vi supernatanten på en S-Sepharosekolonne ekvilibrert med 25 mM Tris (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. Vi samlet tatAcys-161 fra S-Sepharosekolonnen ved anvendelse av en NaCl trinnvis gradient i 25 mM Tris (pH 7,5). TatAcys-161 eluerte i bufferen med pH 7,5 med 500-700 mM NaCl.

TatAcys- 249: Etter sentrifugering av løsningen, satte vi supernatanten på en Q-Sepharosekolonne ekvilibrert med 25 mM Tris (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. Vi samlet tatAcys-249 fra S-Sepharosekolonnen ved anvendelse av en NaCl trinnvis gradient i 25 mM Tris (pH 7,5). TatAcys-249 eluerte i gradienttrinnporsjonen med 600-800 mM NaCl.

TatAcys- HE2. 85 og tatAcys- HE2. 121: Etter sentrifugering av løsningen, satte vi supernatanten på en Q-Sepharosekolonne. Vi satte det gjennomstrømmede materiale på en S-Sepharose-kolonne. Vi samlet tatAcys-HE2.85 hhv. tatAcys-HE2.121 fra S-Sepharosekolonnen ved anvendelse av en NaCl trinnvis

gradient. Begge proteiner eluerte med 1 M NaCl.

HPV- E2 og HPV- E2CCSS: Jfr. eksempel 9 (ovenfor).

JB106: Etter sentrifugering av løsningen og samling av supernatanten, tilsatte vi NaCl til 300 mM. Vi satte supernatanten med tilsatt NaCl på en S-Sepharosekolonne ekvilibrert med 25 mM HEPES (pH 7,5). Vi behandlet kolonnen med sekvensielle saltkonsentrasjonstrinn i 25 mM HEPES (pH 7,5), 1,5 mM EDTA og 1 mM DTT. Vi eluerte JB106-proteinet fra S-Sepharosekolonnen med 1 M NaCl.

JB117: Etter sentrifugering av løsningen og samling av

supernatanten, tilsatte vi NaCl til 3 00 mM. Grunnet feining av JB117 ved 300 mM NaCl, fortynnet vi JB117-supernatanten til 100 mM NaCl og batch-tilsatte proteinet på S-Sepharosekolonnen. Vi eluerte JB117 fra S-Sepharosekolonnen med 1 M NaCl i 25 mM Tris (pH 7,5) og 0,3 mM DTT.

JB118: Etter sentrifugering av løsningen og samling av supernatanten, tilsatte vi NaCl til 300 mM. Vi satte supernatanten med tilsatt NaCl på en S-Sepharosekolonne ekvilibrert med 25 mM Tris (pH 7,5). Vi eluerte JB118-proteinet fra S-Sepharosekolonnen med 1 M NaCl i 25 mM Tris (pH 7,5) og 0,3 mM DTT.

JB119, JB120, JB121 og JB122: Etter sentrifugering av løsningen og samling av supernatanten, tilsatte vi NaCl til 150 mM for JB119 hhv. JB121, og 2 00 mM for JB12 0 hhv. JB122. Vi satte supernatanten med tilsatt NaCl på en S-Sepharosekolonne ekvilibrert med 25 mM Tris (pH 7,5). Vi eluerte proteinet JB119, JB120, JB121 hhv. JB122 fra S-Sepharosekolonnen med 1 M NaCl i 25 mM Tris (pH 7,5) og 0,3 mM DTT.

EKSEMPEL 14

E2- Hemmingsassayer - ytterligere konjugater

Vi testet våre tat-E2-fusjonsproteiner for hemming av transkripsjonen aktivering av papillomavirus-E2-proteinet i sin fulle lengde ("hemming"). Vi målte E2-hemmingen med et transient kco-transfeksjonsassay i C0S7-celler. C0S7-cellene anvendt i denne test ble holdt i kultur kun i korte tidsrom. Vi tinte COS7-cellerie ved at passasje 13 og anvendte dem kun t.o.m. passasje 25. Lange formeringsperioder førte til lave nivåer av E2-translasjonsaktivering og senket hemmingen og reproduserbarheten. Vår hemmingsassay og fremgangsmåte for beregning av hemmingsaktiviteten beskrives i eksempel 9 (ovenfor). For konjugatene TxE2.l03, TXE22.249, FTE103, FTE202, FTE403 og FTE501, substituerte vi HPV-l6-E2-transaktivatoren med en lik mengde BPV-1-E2-transaktivator. Følgelig transfiserte vi med BPV-l-E2-ekspresjonsplasmidet pXB323, hvilket beskrives i detalj i US-Patent nr. 5.219.990, istedenfor med HPV-16-E2-ekspresjonsplasmidet pAHE2.

Det genetiske fusjonsprotein JB106 har gjennomgående vært vårt sterkeste tat-E2-repressor-konjugat. Data fra en hemmingsassay som sammenligner JB106 og TxHE2CCSS vises i tabell III. Figur 13 avbilder grafisk resultatene presentert i tabell III.

I tillegg til JB106, har flere andre tat-E2-repressorkonjugater gitt vesentlig hemming. Som vist i tabell IV, oppviste TxHE2, TXHE2CCSS, JB117, JB118, JB119, JB12 0 og JB122 hemmingsnivåer i ++-området.

Tabell IV oppsummerer våre tat-E2-repressor-assay-resultater. Selv om vi testet alle våre tat-E2-repressorkonjugater i lignende tester, ble konjugatene ikke alle testet samtidig i samme assay. Følgelig har vi uttrykt nivået for hemmingsaktiviteten semi-kvantitativt, som +++, ++» +# +/- eller -, hvor +++ betyr sterk hemming og - betyr ingen påvisbar hemming. Figur 13 illustrerer repressjons-aktivitets-vurderingssystemet anvendt i tabell IV. JB106 eksemplifiserer +++-aktivitetsnivået. TxHE2CCSS eksemplifiserer ++-aktivitetsnivået. Den negative kontrollforbindelse HE2.123 eksemplifiserer --aktivitetsnivået. +-aktivitetsnivået ligger mellom aktiviteten målt for TxHE2CCSS og HE2.123. De to konjugater, hvis aktivitet vises som +/-, hadde svak (men påvisbar) aktivitet i enkelte assayer og ingen påvisbar aktivitet i andre assayer.

FTE103, FTE4 03, FTE208 og FTE501, de fire konjugater med tat-aminoendeområdet (dvs. residuer 1-21) og det cysteinrike område (dvs. residuer 22-37), hadde overhodet ingen hemming. Siden vi ved indirekte immunofluorescens har vist at FTE501 trenger inn i cellene, synes vi det er sannsynlig at E2-repressor-aktiviteten gikk tapt i FTE-serien som et resultat av bindingen til tat-transportpolypeptidet. Våre data viser at fraværet av det cysteinrike område i tat-delen generelt øket E2-repressor-aktiviteten. I tillegg synes fraværet av det cysteinrike område i tat-E2-konjugater å øke proteinproduksjonsnivået i E. coli og å øke proteinløseligheten, uten tap av inntrenging i cellene. Fjerning av aminoendeområdet av tat økte også E2-repressor-aktiviteten. Fusjonsproteinet JB106, med kun tat-residuer 47-58, var den sterkeste av våre tat-E2-repressor-konjugater. Imidlertid resulterer fraværet av det tat-cysteinrike område ikke alltid i bibeholdningen av E2-repressor-aktiviteten i konjugatet. F.eks. var det kjemiske konjugat TxE2.249 uløselig og toksisk mot cellene. Dermed kan binding av selv en cysteinfri del av tat føre til ikke-funksjonelle E2-repressorkonjugater.

EKSEMPEL 15

Spaltbare E2- konjugater

Kjemisk konjugasjon av tat-deler til E2-protein resulterte i en minst 20-foldig reduksjon i bindingen av E2-proteinet til E2-bindingsetene på DNA (data ikke vist). Derfor utfør-te vi eksperimenter for å vurdere spaltbar tverrbinding mellom tat-transportdelen og E2-repressordelen. Vi testet diverse spaltbare tverrbindingsmetoder.

I én eksperimentserie, aktiverte vi cysteinsulfhydrylgrup-pene i HPV-E2-CCSS-proteinet med aldritiol i 100 mM HEPES (pH 7,5) og 500 mM NaCl. Vi isolerte den aktiverte E2-repressor ved gelfilterkromatografi og behandlet den med tat37-72. Vi oppnådde kun en lav kryssbindingseffektivitet pga. rask E2-CCSS-dimerdannelse etter behandling med aldritiol. For å unngå dette problem plasserte vi E2-CCSS i 8 M urea ved værelsestemperatur, og behandlet det med aldritiol ved 23°C i 60 minutter under denatureringsforhold. Vi gjenfoldet deretter E2CCSS-adtritioladduktet, isolerte det ved gelfilterkromatografi og lot det reagere med tat37-72. Denne fremgangsmåte gav ypperlig kryssbinding. Vi kryssbandt dessuten E2CSSS og E2CCSC til tat37-72 under anvendelse av en modifisert ureafremgangsmåte, anvendende S-Sepharosekromatografi istedenfor gelfiltrering for å isole-re E2-aldritioladduktene. Denne modifikasjon økte utbyttet i addukter og resulterte i kryssbinding av ca. 90% av E2-utgangsmaterialet anvendt i omsetningen.

De spaltbare tat-E2-konjugater oppviste aktivitet i hemmingsassayet. Imidlertid var inhibitoraktiviteten av de spaltbare konjugater noe lavere enn aktiviteten til lig-nenede konjugater som var irreversibelt kryssforbundne. Den noe lavere aktivitet av de spaltbare konjugater kan være en refleksjon av proteinenes halveringstid i cellene. Tat er relativt stabil i celler. E2-Proteiner har generelt en kort halveringstid i celler. Dermed kan irreversibel kryssbinding av en tat-del til en E2-del stabilisere E2-delen.

EKSEMPEL 16

Herpes simpleks virus- inhibitor- konjugat

Herpes simpleks virus ("HSV") koder en avskriftaktivator, VP16, hvilken induserer ekspresjon av de nestliggende første HSV-gener. Friedman et al. har fremstilt en HSV-VP16-inhibitor ved å slette karboksyende-transaktiverings-området av VP16 ["Expression of a Truncated Viral Trans-Activator Selectively Impedes Lytic Infection by Its Cog-nate Virus", Nature, 335, sider 452-454 {1988)1. Vi har fremstilt en HSV-2-VP16-inhibitor på lignende måte.

For å teste det cellulære opptak og VP16-inhibitor-aktiviteten av transportpolypeptid-VP16-inhibitor-konjugater, transfiserte vi simultant et VP16-avhengig reporterplasmid og et VP16-inhibitor-plasmid inn i C0S7-celler. Deretter utsatte vi de transfiserte celler for et transportpolypeptid-VP16-inhibitor-konjugat eller for en egnet kontrollforbindelse. Hemmingsassayet, beskrevet nedenfor, var analog med E2-inhibitor-assayet beskrevet ovenfor i eksempel 9.

VP16- Hemmingsassayplasmider

Vår reporterkonstruksjon for VP16-hemmingsassayet var plasmidet pl75kCAT, erholdt fra G. Hayward [jfr. P. 0'Hare og G.S. Hayward, "Expression of Recombinant Genes Contai-ning Herpes Simplex Virus Delayed-Early and Immediate-Early Regulatory Regions and Trans Activation by Herpes Virus Infection", J. Virol., 52, sider 522-531 (1984)]. Plasmidet pl75kCAT inneholder HSV-l-IE175-promoteren som driver et CAT-reportergen.

Vår HSV-2-transaktivatorkonstruksjon for VP16-hemmingsassayet var plasmidet pXB324, hvilket inneholdt det naturlig forekommende HSV-2-VP16-gen under kontroll av kylling-p-aktin-promoteren. Vi konstruerte pXB324 ved å innsette i pXBlOO [P. Han et al., "Transactivation of Heterologous Promoters by HIV-1 Tat", Nuc. Acids Res., 19, sider 7225-7229 (1991)] mellom Xhol-setet og BamHI-setet, et 280-baseparfragment inneholdende kylling-0-aktin-promoteren og et 2318-basepar-BamHI-EcoRl-fragment fra plasmidet pCA5 (0'Hare og Hayward, supra) som kodet hele det naturlig forekommende HSV-2-VP16-protein.

Tat- VP16- inhibitor- fusj onsprotein

Vi fremstilte i bakterier fusjonsproteinet tat-VP16R.GF (SEKV-ID Nr. 58), bestående av aminosyrer 47-58 av HIV-tat-proteinet etterfulgt av aminosyrer 43-412 av HSV-VP16-proteinet. For bakteriell fremstilling av et tat-VPl6-inhibitor-fusjonsprotein, fremstilte vi plasmidet pET/tat-VP16R.GF i en 3-delt ligering. Det første fragment var vektoren pED-3d {beskrevet ovenfor under det alternative navn "pET-8c") spaltet med Ncol og Bglll {ca. 4.600 basepar). Det andre fragment bestod av de syntetiske oligonukleotider 374.219 (SEKV-ID Nr. 39) og 374.220 (SEKV-ID Nr. 40), koblet sammen for å danne et dobbeltkjedet DNA-molekyl. 5'-Enden av det syntetiske fragment hadde en Ncol-struktur inneholdende et ATG-translasjons-startkodon. Etter startkodonet fulgte kodoner for tat-residuer 47-58. Direkte etter tat-kodoner i leseramme fulgte kodoner for VP16-residuer 43-47. 3<1->Enden av det syntetiske fragment var en avstumpet ende for ligering med det tredje fragment, et 1134-basepar-PVuII-Bglll-fragment fra pXB324R4, inneholdende kodoner 48-412 av HSV-2-VP16. Vi erholdt pXB324R4 fra pXB324 (beskrevet ovenfor). Plasmidet pXB324R2 var et mellomprodukt under fremstillingen av pXB324R4.

Vi konstruerte pXB324R2 ved å innsette i pXBlOO et 1342-basepar-BamHI-Aatll-fragment fra pXB324, som kodet de N-terminale 419-aminosyrene av HSV-2-VP16. For å gi et endekodon i leseramme, anvendte vi et 73-basepar-AatII-EcoRl-fragment fra pSV2-CAT [CM. Gorman et al., Molecular & Cellular Biology, 2, sider 1044-1051 (1982)]. Dermed kodet pXB324R2 de første 419 aminosyrer av HSV-2-VP16 og ytterligere syv ikke-VP16-aminosyrer før endekodonet. For å fremstille pXB324R4, utførte vi en 3-veis-ligering omfattende et 5145-basepar-MluI-EcoRI-fragment fra pXB324R2 og to innsetningsfragmenter. Én insetning var et 115-basepar-MluI-NspI-fragment fra pXB324R2 som kodet de første 198 residuer av VP16. Det andre insetningsfragment var et dobbeltkjedet syntetisk DNA-molekyl bestående av de syntetiske oligonukleotider 374.32 (SEKV-ID Nr. 41) og 374.33 (SEKV-ID Nr. 42). Når de er sammenkoblet, dannet disse oligonukleotider en 5<1->Nspl klebrig ende og en 3'-EcoRI klebrig ende. Dette syntetiske fragment kodet VP16-residuer 399-412, etterfulgt av et endekodon. Dermed var pXB324R4 forskjellig fra pXB324R2 idet det manglet kodoner for VP16-aminosyrer 413-419 og de syv tillegsaminosyrer før ende-

kodonet.

Rensing av tat- VP16R. GF- fusjonsproteinet

Vi uttrykte vår genetiske konstruksjon for tat-VP16R.GF i E. Coli. Vi høstet de transformerte E. coli ved sentrifugering; resuspenderte cellene i 8-10 volumdeler oppløsnings-buffer (25 mM Tris (pH 7,5), 25 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 4 pg/ml E64, 50 pg/ml aprotinin, 50 pg/ml pepstatin A og 3 mM benzamidin); oppløste cellene i en fransk presse (2 passasjer ved 12.000 psi) og sentrifugerte løsningen ved 10.000 til 12.000 x g i 1 time ved 4°C. Etter sentrifugering av løsningen, ladet vi supernatanten på en Fast Q-Sepharosekolonne ekvilibrert med 25 mM Tris (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. Vi satte permeatet fra Q-Sepharosen på en Fast S-Sepharosekolonne ekvilibrert i 25 mM MES (pH 6,0), 0,1 mM EDTA og 2 mM DTT. Vi samlet tat-VP16-fusjonsproteinet fra S-Sepharosekolonnen ved sekvensielle NaCl-konsentrasjonstrinn i 25 mM MES (pH 6,0), 0,1 mM EDTA og 2 mM DTT. Tat-VP16-fusjonsproteinet eluerte i fraksjonene med 600-1000 mM NaCl.

VP16- Inhibitorassay

Vi sådde HeLa-celler i 24-brønn kulturplater med IO<5> celler/brønn. Den følgende dag transfiserte vi cellene under anvendelse av DEAE-dekstranmetoden, som beskrevet av B.R. Cullen, "Use of Eukaryotic Expression Technology in the Functional Analysis of Cloned Genes", Meth. Enzymol., vol. 152, side 684 (1987). Vi felte DNA'et for transfeksjonene og gjenoppløste det, i en konsentrasjon på ca. 100 pg/ml, i 100 mM NaCl og 10 mM Tris (pH 7,5). For hver transfeksjon, bestod DNA-DEAE-blandingen av: 200 ng pl75kCAT (+/- 1 ng pXB324) eller 200 ng pSV-CAT (kontrollforbindelse), 1 mg/ml DEAE-dekstran og PBS, til et endelig volum på 100 pl. Vi utsatte cellene for denne blanding i 15-20 minutter ved 37°C, under tilfeldig rotering av kulturplatene. Vi tilsatte deretter 1 ml ferskt DC-medium (DMEM + 10% serum) med 80 uM klorokin til hver brønn. Etter inkubasjon av brønnene ved 37<Q>C i 2,5 timer, sugde vi opp mediet fra hver brønn og byttet det ut mot fersk DC inneholdende 10% DMSO. Etter 2,5 minutt ved værelsestemperatur, sugde vi opp det DMSO-holdige medium og byttet det ut mot fersk DC inneholdende 0, 10 eller 50 pg/ml renset tat-VP16.GF. Den følgende dag byttet vi ut mediet i hver brønn mot ferskt medium av samme sammensetning. 24 timer senere løste vi opp HeLa-cellene med 0,65% NP-40 (vaskemiddel) i 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA og 150 mM NaCl. Vi målte proteinkonsentrasjonen i hvert ektrakt for prøvenormalisering i prøven.

Ved en tat-VP16.GF-konsentrasjon på 50 pg/ml, forstyrret cellulær toksisitet testen. Ved en konsentrasjon på 10 pg/ml, gav tat-VP16.GF-fusjonsproteinet en nesten fullstendig hemming av VP16-avhengig CAT-ekpresjon uten synlig celledød, og ca. 30% hemming av ikke-VP16-avhengig CAT-ekspresjon i kontrollceller. Dermed observerte vi en spesifikk hemming av VP16-avhengig transaktivering, i tillegg til en mindre sterk ikke-spesifikk hemming.

EKSEMPEL 17

Transportpolypept id- DNA- konj ugater

Translasjonsaktivering ved en DNA-bindende translasjons-faktor kan hemmes ved å innføre i cellene DNA som har bindingsetet for den aktuelle trqnslasjonsfaktor. Trans-lasjonsfaktoren blir bundet til det innførte DNA og er utilgjengelig for å binde seg ved promotersetet hvor den vanligvis virker. Denne strategi er blitt anvendt for å hemme translasjonsaktivering av NF-kB [Bielinska et al., "Regulation of Gene Expression with Double-Stranded Phos-phorothioate Oligonucleotides", Science, vol. 250, sider 997-1000 (1990)]. Bielinska et al. observerte doseavhengig hemming når det ble tilsatt dobbeltkjedet DNA til celle-kulturmediet. Vi konjugerte transportpolypeptidet tat37-72 med det dobbeltkjedede DNA-molekyl for å bestemme om en slik konjugasjon ville forbedre hemmingen ved å øke det cellulære opptak av DNA.

Vi ervervet fire på bestilling syntetiserte 39-mer fosfor-tioatoligonukleotider kalt NF1, NF2, NF3 og NF4 med nukleo-tidsekvensene (SEKV-ID Nr. 43), (SEKV-ID Nr. 44), (SEKV-ID Nr. 45) hhv. (SEKV-ID Nr. 46). NF1 og NF2 danner en dupleks tilsvarende det naturlig forekommende NF-xB-bindingssete. NF3 og NF4 danner en dupleks tilsvarende et forandret NF-KB-bindingssete.

Vi oppløste NF1 hhv. NF3 i vann, i en konsentrasjon på ca. 4 mg/ml. Vi plasserte deretter 800 <p>g NF1 hhv. NF3 separat i 400 pl 50 mM trietanolamin (pH 8,2), 50 mM NaCl og 10 Mm Trauts reagens. Vi lot reaksjonen forløpe i 50 minutter ved værelsestemperatur. Vi stoppet reaksjonen ved gelfiltrering på en P6DG-kolonne (BioRad, Richmond, CA) ekvilibrert med 50 mM HEPES (pH 6,0) og 50 mM NaCl for å fjerne overflødig Trauts reagens. Vi overvåket absorberingen ved 260 nm for å identifisere de oligonukleotidholdige fraksjoner. Vårt utbytte av oligonukleotidene var ca. 75%. Vi sammenkoblet deretter Traut-modifisert NF1 med NF2 (0,55 mg/ml slutlig konsentrasjon) og sammenkoblet Traut-modifisert NF3 med NF4 (0,50 mg/ml slutlig konsentrasjon). Deretter lot vi 0,4 mg av hvert Traut-modifisert DNA reagere med 0,6 mg tat37-72-BMH {fremstilt som beskrevet i eksempel 9 ovenfor), i 1 ml 100 mM HEPES (pH 7,5), i 60 minutter ved værelsestemperatur. Vi overvåket omfanget for kryssbinding ved poly-akrylamidgelelektroforese etterfulgt av etidiumbromfarging av gelen. Generelt observerte vi at ca. 50% av DNA ble modifisert under disse forhold.

Disse dobbeltkjedede DNA-molekyler ble testet, ialt vesentlig ifølge fremgangsmåten til Bielinska et al. { supra), med og uten tat-binding, for hemming av NF-kB-translasjonsaktivering. Tat-binding forbedret signifikant transakti-veringen av NF-kB.

Rekombinante DNA-sekvenser fremstilt ved fremgangsmåtene beskrevet heri, eksemplifiseres av en kultur deponert hos the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Escherichia coli-kulturen identifisert som pJB106 ble deponert den 28. juli 1993 og fikk ATCC-tilgangsnummeret 69368.

Mens vi har beskrevet et antall utførelsesformer for foreliggende oppfinnelse, er det tydlig at våre grunnleggende konstruksjoner kan endres til andre utførelsesformer som anvender fremgangsmåtene og produktene ifølge foreliggende oppfinnelse. Derfor er det underforstått at rammen for foreliggende oppfinnelse defineres ved de vedlagte krav, og ikke ved de spesielle utførelsesformer som er blitt presentert som eksempler.

Claims

1. Fusjonsprotein omfattende en karboksyterminal cargoenhet og en aminoterminal transportenhet, karakterisert ved at a) transportenheten kjennetegnes ved: i) nærværet av aminosyrer 49-57 av HIV-tat-proteinet; ii) fråværet av aminosyrer 22-36 av HIV-tat-proteinet og iii) fraværet av aminosyrer 73-86 av HIV-tat-proteinet, og b) cargoenheten bibeholder en signifikant biologisk aktivitet etter transportenhet-avhengig intracellulær levering.

2. Fusjonsprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at cargoenheten utvelges fra gruppen bestående av terapeutiske molekyler, forebyggende molekyler og diagnostiske molekyler.

3. Fusjonsprotein ifølge krav 1 eller 2 omfattende en karboksyterminal cargoenhet og en aminoterminal transportenhet, karakterisert ved at cargoenheten består av en papillomavirus-E2-inhibitor fra menneske som beholder sin biologiske aktivitet etter levering til en målcelle, og transportenheten er utvalgt fra gruppen bestående av: a) aminosyrer 47-58 av HIV-tat-proteinet (SEKV-ID Nr. 47); b) aminosyrer 47-72 av HIV-tat-proteinet (SEKV-ID Nr. 48); c) aminosyrer 38-72 av HIV-tat-proteinet (SEKV-ID Nr. 49) og d) aminosyrer 38-58 av HIV-tat-proteinet (SEKV-ID Nr. 50).

4. Fusjonsprotein ifølge krav 3, karakterisert ved at transportenheten følger etter et aminoterminalt metionin.

5. Fusjonsprotein ifølge et av kravene 1 til 4, karakterisert ved at cargoenheten består av aminosyrer 245-365 av papillomavirus-E2-proteinet i menneske {SEKV-ID Nr. 51).

6. Fusjonsprotein ifølge krav l, karakterisert ved at det er JB106 (SEKV-ID Nr. 38).

7. Fusjonsprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at det er JB117 (SEKV-ID Nr. 59).

8. Fusjonsprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at det er JB118 (SEKV-ID Nr. 60).

9. Fusjonsprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at det er JB122 (SEKV-ID Nr. 63).

10. Fusjonsprotein ifølge krav 1-9 omfattende en karboksyterminal cargoenhet og en aminoterminal transportenhet, karakterisert ved at cargoenheten består av en bovin papillomavirus-E2-inhibitor som beholder sin biologiske aktivitet etter levering til en målcelle, og transportenheten utvelges fra en gruppe bestående av. a) aminosyrer 47-62 av HIV-tat-proteinet (SEKV-ID Nr. 52) og b) aminosyrer 38-62 av HIV-tat-proteinet (SEKV-ID Nr. 53).

11. Fusjonsprotein ifølge krav 10, karakterisert ved at transportenheten følger etter et aminoterminalt metionin.

12. Fusjonsprotein ifølge et av kravene 1, 2, 10 eller 11, karakterisert ved at cargoenheten er en E2-inhibitor bestående av aminosyrer 250-410 av det bovine papillomavirus-E2-protein (SEKV-ID Nr. 56).

13. Fusjonsprotein ifølge krav 12, karakterisert ved at det er JB119 (SEKV-ID Nr. 61).

14. Fusjonsprotein ifølge krav 12, karakterisert ved at det er JB120 (SEKV-ID Nr. 62).

15. Fusjonsprotein ifølge krav 1 bestående av en karboksyterminal cargoenhet og en aminoterminal transportenhet, karakterisert ved at cargoenheten består av aminosyrer 43-412 av HSV-VP16-proteinet, og transportenheten består av aminosyrer 47-58 av HIV-tat-proteinet.

16. Fusjonsprotein ifølge krav 15, karakterisert ved at transportenheten følger etter et aminoterminalt metionin.

17. Et kovalent bundet kjemisk konjugat bestående av en transportpolypeptidenhet og en cargoenhet, karakterisert ved at a) transportpolypeptidenheten av konjugatet kjennetegnes ved: i) nærværet av aminosyrer 49-57 av HIV-tat-proteinet; ii) fraværet av aminosyrer 22-36 av HIV-tat-proteinet og iii) fraværet av aminosyrer 73-86 av HIV-tat-proteinet, og b) cargodelen av konjugatet beholder signifikant biologisk aktivitet etter transportenhet-avhengig intracellulær levering.

18. Kovalent bundet kjemisk konjugat ifølge krav 17, karakterisert ved at transportpolypeptidenheten består av aminosyrer 37-72 av HIV-tat-proteinet (SEKV-ID Nr. 2).

19. Kovalent bundet kjemisk konjugat ifølge krav 18, karakterisert ved at cargoenheten er utvalgt fra gruppen bestående av: a) aminosyrer 245-365 av papillomavirus-B2-proteinet i menneske (SEKV-ID Nr. 51) og b) aminosyrer 245-365 av papillomavirus-E2-proteinet i menneske, hvor aminosyrene 300 og 309 er blitt omdannet til cystein (SEKV-ID Nr. 55).

20. Kovalent bundet kjemisk konjugat ifølge krav 17 bestående av en transportenhet og en cargoenhet, karakterisert ved at transportpolypeptidet består av aminosyrer 37-72 av HIV-tat-proteinet (SEKV-ID Nr. 2), og cargoenheten er utvalgt fra gruppen bestående av: a) aminosyrer 245-365 av papillomavirus-E2-proteinet i menneske (SEKV-ID Nr. 51) og b) aminosyrer 245-365 av papillomavirus-E2-proteinet i menneske, hvor aminosyrene 300 og 309 er blitt omdannet til cystein (SEKV-ID Nr. 55).

21. Kovalent bundet kjemisk konjugat ifølge krav 15 bestående av en transportpolypeptidenhet og en cargoenhet, karakterisert ved at transportpolypeptidenheten består av aminosyrer 37-72 av HIV-tat-proteinet (SEKV-ID Nr. 2) og cargoenheten er et dobbeltkjedet DNA utvalgt fra gruppen bestående av: a) oligonukleotid NF1 (SEKV-ID Nr. 43} sammenkoblet til oligonukleotid NF2 (SEKV-ID Nr. 44) og b) oligonukleotid NF3 (SEKV-ID Nr. 45) sammenkoblet til oligonukleotid NF4 (SEKV-ID Nr. 46).

22. Anvendelse av et fusjonsprotein ifølge et av kravene 1 til 16 ved fremstilling av et farmasøytisk preparat som er egnet for intracellulær levering av cargo.

23. Anvendelse av et kovalent bundet kjemisk konjugat ifølge et av kravene 17 til 21 ved fremstilling av et farmasøytisk preparat som er egnet for intracellulær levering av cargo.

24. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den inneholder en farmasøytisk virksom mengde av et fusjonsprotein ifølge et av kravene 1 til 14.

25. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den inneholder en farmasøytisk virksom mengde av et fusjonsprotein ifølge krav 19 eller 20.

26. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den inneholder en farmasøytisk virksom mengde av et kovalent bundet kjemisk konjugat ifølge et av kravene 15 til 18 eller 21.

2 7. DNA-molekyl, karakterisert ved at det inneholder en nukleotidsekvens som koder et fusjonsprotein utvalgt fra gruppen bestående av: a) JB106 (SEKV-ID Nr. 38), b) JB117 (SEKV-ID Nr. 59), c) JB118 (SEKV-ID Nr. 60), d) JB119 (SEKV-ID Nr. 61), e) JB120 (SEKV-ID Nr. 62) og f) JB122 (SEKV-ID Nr. 63).

28. DNA-molekyl, karakterisert ved at det inneholder en nukleotidsekvens som koder fusjonsproteinet tat-VP16R.GF (SEKV-ID Nr. 58).

29. DNA-molekyl ifølge krav 27, karakterisert ved at nukleotidsekvensen som koder fusjonsproteinet er operativt bundet til ekspre-sj onskontrollsekvenser.

30. DNA-molekyl ifølge krav 28, karakterisert ved at nukleotidsekvensen som koder fusjonsproteinet er operativt bundet til ekspre-sj onskontrollsekvenser.

31. Unicellulær vertsorganisme, karakterisert ved at den er transformert med et DNA-molekyl ifølge krav 29.

32. Unicellulær vertsorganisme, karakterisert ved at den er transformert med et DNA-molekyl ifølge krav 30.

33. Fremgangsmåte ved fremstilling av et fusjonsprotein ifølge krav l og som er utvalgt fra gruppen bestående av: a) JB106 (SEKV-ID Nr. 38), b) JB117 (SEKV-ID Nr. 59), c) JB118 (SEKV-ID Nr. 60), d) JB119 (SEKV-ID Nr. 61), e) JB120 (SEKV-ID Nr. 62) og f) JB122 (SEKV-ID Nr. 63), karakterisert ved at man a) dyrker en transformert unicellulær vertsorganisme ifølge krav 31, og b) samler fusjonsproteinet fra kulturen.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33 ved fremstilling av et fusjonsprotein bestående av aminosyrer 47-58 av HIV-tat-proteinet etterfulgt av aminosyrer 43-412 av HSV-VP16-proteinet, karakterisert ved at man: a) dyrker en transformert unicellulær værtsorgnisme ifølge krav 32, og b) samler fusjonsproteinet fra kulturen.