NO180270B - Fremgangsmåte til fremstilling av modifisert rekombinant Pseudomonas eksotoksin som et aktivt immunotoksin med små bivirkninger, ekspresjonsplasmid og vertscelle brukt i fremgangsmåten - Google Patents

Fremgangsmåte til fremstilling av modifisert rekombinant Pseudomonas eksotoksin som et aktivt immunotoksin med små bivirkninger, ekspresjonsplasmid og vertscelle brukt i fremgangsmåten Download PDF

Info

Publication number
NO180270B
NO180270B NO882269A NO882269A NO180270B NO 180270 B NO180270 B NO 180270B NO 882269 A NO882269 A NO 882269A NO 882269 A NO882269 A NO 882269A NO 180270 B NO180270 B NO 180270B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
exotoxin
stated
expression plasmid
codes
dna sequence
Prior art date
Application number
NO882269A
Other languages
English (en)
Other versions
NO180270C (no
NO882269D0 (no
NO882269L (no
Inventor
Ira H Pastan
David J Fitzgerald
Sankar Adhya
Original Assignee
Ira H Pastan
David J Fitzgerald
Dassler Kg Adi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ira H Pastan, David J Fitzgerald, Dassler Kg Adi filed Critical Ira H Pastan
Publication of NO882269D0 publication Critical patent/NO882269D0/no
Publication of NO882269L publication Critical patent/NO882269L/no
Publication of NO180270B publication Critical patent/NO180270B/no
Publication of NO180270C publication Critical patent/NO180270C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Oppfinnelsen angår fremgangsmåte til fremstilling av et modifisert Pseudomonas eksotoksin sammenføyd til en målsøkende bærer, ekspresjonsplasmid og vertscelle benyttet i fremgangsmåten .
Toksiner er meget kraftige celledrepende midler som forårsaker en rekke sykdommer hos mennesker. På grunn av deres høye aktivitet er disse midler blitt festet til monoklonale antistoffer for å danne cytotoksiske midler (immunotoksiner)
som spesifikt binder til målceller. Disse immunotoksiner er derfor meget nyttige i kreftbehandling.
Pseudomonas eksotoksin A (PE) er et meget aktivt monomert protein (molekylvekt 66 kD), som utskilles av Pseudomonas aeruainosa, som hindrer proteinsyntese i eukaryote celler gjennom inaktiveringen av forlengelsesfaktor-2 (EF-2) ved katalyse av dets ADP-ribosylering (katalyse av overføringen av ADP-ribosylmolekyldelen av oksidert NAD på EF-2).
Intoksikasjonsprosessen antas å foregå ved de følgende trinn: Først binder PE til celler gjennom en spesifikk reseptor på celleoverflaten. Deretter blir PE-reseptorkomplekset inter-nalisert inn i cellen. Til slutt blir PE overført til cytosolen hvor det enzymatisk hindrer proteinsyntese. Over-føringsprosessen antas å finne sted fra et surt område, da cellulær intoksikasjon hindres av svake baser såsom NH4+,
som øker pH-verdien i sure vesikler. Ved utsettelse for sure betingelser kommer det hydrofobe domene av PE inn i membranen, hvilket fører til dannelsen av en kanal gjennom hvilken enzymdomenet i forlenget form passerer inn i cytosolen.
US-PS 4 545 985 viser at Pseudomonas toksin kan kobles kjemisk til et antistoff eller vekstfaktor. Disse kjemisk koblede toksiner er imidlertid vist å ha uønskede giftighetsnivåer. Det ville derfor være nyttig å ha toksiner som er sterkt mål-rettede for spesifikke celletyper uten den generaliserte celledreping som normalt er forbundet med disse toksiner. PE-holdige immunotoksiner konstrueres ved at nativt PE først omsettes med iminotiolan. Denne reaksjon tjener både til å introdusere to nye sulfhydrylgrupper som benyttes til kobling av et antistoff til toksinet og til å inaktivere bindingen av PE til dens egen reseptor. Denne fremgangsmåte avhenger av den kjemiske inaktivering av PE-bindingsseter for å bringe til et minimum uønskede bivirkninger som skyldes bindingen av PE til celler med PE-reseptorer. Skjønt denne fremgangsmåte har vært forholdsvis vellykket når det gjelder å produsere en spesiell celledrepende reagens i vevskultur og i tumor-bærende mus, har det ikke vært mulig å gi mer enn 2 \ iq PE-immunotoksin til en 2 0 g's mus eller 1 mg til en 3 kg's ape eller 4 mg til et voksent menneske på grunn av de giftige bivirkninger av immunotoksinet. Det er derfor ønskelig å kunne gi større mengder immunotoksiner for oppnåelse av større dreping av tumorceller. Det er derfor hensikten med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte til å fremstille immunotoksiner som ikke utviser ovennevnte ulemper.
Den foreliggende oppfinnelse oppfyller denne hensikt ved at den skaffer et immunotoksin med høy virkning og lav giftighet. Videre, for å overvinne den ovenfor angitte avhengighet av kjemisk inaktivering av PE-bindingssetene innlemmer den foreliggende oppfinnelse rekombinant-DNA-teknikker for å klone det fullstendige toksingen (eller segmenter av det)
for å uttrykke på høye nivåer den fulle lengde av toksin-molekylet (eller partier av det) som inneholder forskjellige funksjonelle domener, innbefattet et som mangler celle-bindingsdomene. Se eksempel 1 for en sammenligningsunder-søkelse av disse kloner.
Den foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte til fremstilling av (1) et modifisert Pseudomonas eksotoksin som omfatter minst ADP-ribosyleringsaktivitet og eventuelt translokasjonsaktiviteten er definert som evnen til å translokere gjennom en cellemembran og hvor det modifiserte endotoksin mangler et funksjonelt domen Ia og eventuelt domene II i det native eksotoksin, (2) et målsøkende bærer-toksinkonjugat som består av det nevnte eksotoksin sammenføyd til en målsøkende bærer, særlig immunotoksin som omfatter eksotoksinet sammenføyd med et antistoff, kjennetegnet ved å: (a) transfektere en egnet vertscelle med et ekspresjonsplasmid som inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte eksotoksin eller nevnte målsøkende bærertoksinkonjugat og dyrking av vertscellen under betingelser slik at det modifiserte Pseudomonas eksotoksin eller det målsøkende bærer-toksinkonjugat blir fremstilt; eller (b) å konjugere nevnte modifiserte eksotoksin med målsøkende bærer for å fremstille nevnte målsøkende bærer-toksinkonjugat, særlig immunotoksin.
Den tredimensjonale struktur av PE er blitt bestemt ved røntgenkrystallografi. Som vist på fig. 2, inneholder PE-molekylet tre strukturelt forskjellige domener: Domene I inneholder aminosyrerester 1-252 (Domene Ia) og 365-404 (Domene Ib); domene II inneholder aminosyrerester 253-364
og domene III inneholder aminosyrerester 405-613.
Plasmider er blitt konstruert som uttrykker forskjellige partier av PE-molekylet, hvilket gir evnen til å korrelere forskjellige strukturelle domener med forskjellige funksjonelle aktiviteter og å bestemme (1) hvilke partier av molekylet er ansvarlige for cellegjenkjennelse (binding), (strukturelt domene I, aminosyre 1-252) ; (2) hvilket parti er nødvendig for enzymatisk aktivitet (ADP-ribosyleringsaktivitet, domene III pluss et parti av domene Ib) (aminosyre 385-613); (3) hvilket parti er ansvarlig for translokasjon gjennom cellemembranen (domene II). Beviset for at strukturelt domene Ia er involvert i cellegjenkjennelse er at proteiner fremstilt ved plasmider uten domene Ia, men inneholdende domene II, Ib og III, ikke i seg selv er cytotoksiske og ikke oppviser konkurrerende hindring av cytotoksisitet i intakte toksiner, mens et plasmid som koder for domene Ia, men mangler andre domener, blokkerte PE-cytotoksisitet i følsomme celler. PE fra plasmider med en delesjon av den første halvdel av strukturelt domene II oppviser både PE-blokkerende aktivitet og ADP-ribosyleringsaktivitet, men disse molekyler tapte all celledrepende aktivitet. Plasmider som koder for bare strukturelt domene III, produserer store mengder av proteinet, men mangler påvisbar enzymatisk aktivitet (ADP-ribosylering). Plasmider som koder for hele det strukturelle domene III pluss tilgrensende aminosyrer fra strukturelt domene Ib, uttrykker imidlertid store mengder av proteinet, og deres ADP-ribosyleringsaktivitet er høy.
Basert på den tredimensjonale struktur av PE er plasmider blitt konstruert som uttrykker forskjellige partier av PE. Proteinmønsteret av cellene som uttrykker de forskjellige konstruksjoner, ble analysert ved SDS-gelelektroforese, og ADP-ribosyleringsaktiviteten av de rekombinante toksiner
ble målt. Av disse plasmider (beskrevet i eksempel 1) er plasmid pJH8 som inneholder aminosyrer 253-613 (Domener Ib, II og III) og plasmid pJH17 som inneholder aminosyrer (fra Domene Ib), i stand til å kode store mengder modifisert PE som oppviser lav giftighet for menneskelige celler, men forblir enzymatisk meget aktive.
Sett under ett antyder plasmidmønstrene at strukturelt domene Ia er et reseptorbindende domene, at den første halvdel av strukturelt domene II er nødvendig for translokasjon av toksinet fra en vertscelles endocytiske vesikel til cytosolen, og at strukturelt domene III alene ikke er tilstrek-kelig til å uttrykke full ADP-ribosyleringsaktivitet.
Når det gis til dyr, bevirker PE karakteristisk død på grunn av leversvikt. Immunotoksiner fremstilt med PE angriper også leveren, og når det gis i store mengder, bevirker de død på grunn av leverforgiftning. Eksperimentene vist i tabell III antyder at Domene Ia er ansvarlig for cellebinding og antyder at et PE-molekyl hvor domene Ia er deletert, er mindre giftig for mus enn nativt PE. Dataene vist i eksempel 4 understøtter denne konklusjon, hvilket tyder på at modifisert PE er minst 200-ganger mindre giftig for mus enn nativt PE. Eksempel 5 viser at når proteinet fremstilt ved pJH8 renses og kobles til et antistoff til den humane transferrin-reseptor, blir der dannet et immunotoksin som er tilnærmet like aktivt som et immunotoksin som inneholder nativt PE,
men som er 100-ganger mindre giftig på ikke-målceller (museceller).
En side ved den foreliggende oppfinnelse er derfor fremstilling av PE-molekyler med en delesjon av Domene Ia som er virksomme immunotoksiner med nedsatte bivirkninger innbefattet forminsket levergiftighet.
BESKRIVELSE AV FIGURENE
Fig. 1 viser konstruksjonen av plasmidene ifølge oppfinnelsen, som benyttes til ekspresjon av forskjellige domener av PE. Fig. 2 er et forenklet kart over PE-molekyler med forskjellig størrelse, fremstilt som en del av den foreliggende oppfinnelse. Fig. 3 viser virkningen av PE45~HB21 og PE-HB21 på proteinsyntese i humane KB-celler. PE45er det toksinprotein som mangler Domene I kodet for ved plasmid pJH8. Celler ble inkubert i 24 h med det riktige immunotoksin og deretter
3 3
inkubert med H-leucin i 1 h. Innlemmelse av ( H)-leucin i protein ble målt. I panel 3B ble Swiss 3T3-celler inkubert i 24 h med enten nativt Pseudomonas
toksin (PE), nativt Pseudomonas toksin koblet til HB21,
PE„C alene eller PE,,. koblet til HB21. Celler ble utsatt
45 45
for disse midler i 24 h og deretter ble proteinsyntesen målt i 1 h som angitt ovenfor.
NÆRMERE BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
I den foretrukne utførelsesform angår oppfinnelsen fremstil-lingen av en modifisert form av pseudomonas eksotoksin (PE) hvor modifikasjonen fører til et aktivt immunotoksin. Det modifiserte toksin og immunotoksinet fremstilt fra det har sterkt redusert ikke-spesifikk toksisitet overfor menneske-og museceller i vevskultur og med sterkt nedsatt giftighet for mus in vivo.
Genomisk DNA fås ved fullstendig fordøyelse av en stamme av Pseudomonas aeru<g>inosa med EcoRI og Pstl. Skjønt en hvilken som helst stamme av P. aeruginosa er egnet til bruk i oppfinnelsen, er den foretrukne stamme PA103, en stamme som produserer en stor mengde aktivt toksin. DNA-fragmenter i størrelsesorden 2,6-2,9 kb isoleres fra det genomiske DNA-bibliotek og ligeres med et 2,7 kb DNA-fragment fra plasmid pUC13 kuttet med EcoRI og Pstl. Plasmid pUC13 er tilgjengelig i handelen fra Boehringer Mannheim. En egnet vert, fortrinnsvis en E. coli-stamme, blir deretter transformert med de ligerte produkter (den foretrukne stamme av E. coli er HB101, tilgjengelig i handelen fra Bethesda Research Laboratories). Det 2,7 kb DNA-fragment som fås fra ptoxETA, et plasmid som inneholder det PE-strukturelle gen, benyttes som en probe, og plasmid-DNA fra forskjellige positive kolonier ble fremstilt og karakterisert ved Southern blotting. De forskjellige størrelser av rekombinant-PE blir deretter uttrykt i en egnet vert. En vert som bærer det bakteriofage T7 RNA-poly-merasegen i lysogenisk og induserbar form [BL21(DE3)], foretrekkes og er tilgjengelig fra Dr. F. W. Studier ved Brookhaven National Laboratories.
Også foretrukket er plasmider som bærer den bakteriofage sene T7-promotor og AMP<r> og Shine-Dalgarno-boks - pAR2156, også tilgjengelig fra Dr. Studier.
Som vist i eksemplene er de foretrukne plasmider pJH8 og pJH17. pJH8 inneholder et DNA-fragment på 5,1 kb og kan uttrykke Domener II, Ib og III av PE. Dette plasmid frem-stilles ved delvis kapping av plasmid pJH4 med Aval. Det lineariserte DNA-fragment blir deretter fullstendig kappet med Hindlll for oppnåelse av et 5,1 kb DNA-fragment som har Aval- og Hindlll-seter på sine ender. Dette fragment blir deretter inkubert med Sl-nuklease for å fjerne dets kohesive ender, fulgt av ligatisering med T4-ligase for dannelse av plasmid pJH8.
Plasmid pJH17 inneholder et DNA-fragment på 4,8 kb og kan uttrykke Domene III med de tilgrensende 20 aminosyrer av PE. Dette plasmid produseres ved fullstendig kapping av plasmid pJH4 med Hindlll og Apal. Det 4,8 kb DNA-fragment blir deretter isolert og inkubert med Klenow DNA-polymerase I og dNTP for å fylle opp de kohesive ender, fulgt av ligasjon med T4-ligase.
Ekspresjon av rekombinante toksiner i BL21 (DE3)
BL21(DE3) inneholdende plasmider for ekspresjon av forskjellige størrelser av PE dyrkes i LB-næringsvæske med 50 /xg ampicillin/ml ved 37°C. Når absorbans ved 650 nm når 0,3, blir IPTG (isopropyl-beta-D-tiogalatopyranosid) satt til kulturen ved en endelig konsentrasjon på 1 mM. Celler høstes 90 min senere og analyseres for mengden av rekombinante toksiner ved SDS-PAGE, immunoblotting, ADP-ribosylering og celledrepende forsøk.
SDS- PAGE og immunoblottincr
Cellepellets løses opp i Laemmli-buffer. Prøver kokes i
5 min før påføring på en 0,1% SDS, 10% akrylamid-gelplate. For immunoblotting blir prøver etter elektroforese overført til et nitrocellulosepapir, fulgt av reaksjon med antistoff til PE, deretter et nytt antistoff (geit-antikanin) og farging. Antistoffet for PE fås ved hyperimmunisering av kaniner med glutaraldehyd (0,2%) omsatt PE (250 \ iq PE pr. injeksjon). En IgG-fraksjon ble fremstilt for immunoblotting.
Undersøkelse av ADP- ribosyleringsaktivitet
Kjente fremgangsmåter benyttes til undersøkelse av ADP-ribosyleringsaktivitet. Kort fortalt blir retikulocytt-preparater fra kanin eller hvetekim-ekstrakter anriket med forlengelsesfaktor-2 (EF-2) benyttet som en kilde til EF-2. Analyseprøver (500 ul samlet volum) inneholder ca. 10 pmol av EF-2, 37 pmol av <14>C-NAD (0,06 ^Ci), 0,25-1,25 fig av pE og buffer (40 mM
DTT, 1 mM EDTA og 50 mM Tris, pH 8,1). Aktiviteten måles
som pmol av NAD overført til EF-2 i løpet av 3 0 min. En standardkurve for kjente konsentrasjoner av PE opprettes og benyttes til bestemmelse av aktiviteten av PE i ekstrakter fra E. coli. Etter inkubasjon i 30 min ved 37°C blir 0,5 ml 12% TCA satt til hver prøveblanding. Prøveblandingene blir deretter satt i et isbad i 15 min, fulgt av sentrifugering ved 4°C, 3000 x g i 10 min. Pelleten vaskes med 1 ml 6% TCA og sentrifugeres som angitt ovenfor. Pelleten måles deretter for <14>C-radioaktivitet i en væske-scintillasjonsteller som indeksen for ADP-ribosyleringsaktivitet.
Cellecvtotoksisitets- forsok
Forsøk for cytotoksisk aktivitet for det modifiserte PE utføres i NIH 3T3-cellekulturer og humane KB-celler. NIH 3T3-celler eller KB-celler podes 24 h før cytotoksisitets-forsøket i en 24-brønns vevskulturplate ved en tetthet på 2 x 10 celler pr. brønn. Etter inkubasjon i 48 timer med forskjellige konsentrasjoner av PE eller proteinekstrakter isolert fra BL21(DE3) med plasmider som uttrykker forskjellige størrelser av PE, blir monolagene farget med metylenblått for påvisning av de overlevende celler. Resultatene er vist i tabell 1.
Inhibision av proteinsyntese
Målinger av inhibisjonen av proteinsyntese ved PE eller PE med ekstrakter fra B121(DE3)/pJH8 utføres i Swiss 3T3-celle-kulturer. Swiss 3T3-celler podes en dag før undersøkelse i 24-brønns vevskulturplater med en tetthet på IO<5> celler pr. brønn. Cellene vaskes en gang ved at mediet erstattes med DMEM og 0,2% BSA før tilsetning av PE (100<*> ng/ml) eller PE (100 ng/ml) med ekstrakter som inneholdt et overskudd av forskjellige størrelser av PE (tabell 2). Etter 15 min ved 37°C blir mediet så fjernet og erstattet med nytt DMEM og 0,2% BSA. Fire timer senere blir hastigheten for proteinsyntese målt ved tilsetning av [ H]-leucin til mediet (til en endelig konsentrasjon på 2-4 /xCi/ml) i 1 h.
I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir det strukturelle domene til Pseudomonas eksotoksin-genet innsatt i en T7-ekspresjonsvektor nedstrøms for ribosom-bindingssetet og dets ledsagende ATG-initieringskodon (som vist på fig. 1), som beskrevet ovenfor. For å produsere rekombinante proteiner blir celler dyrket ved 37°C til Ag5() = 0,3. IPTG blir deretter tilsatt ved 1 mM for å indusere T7 RNA-polymerase og inkuberes i 2 h. En serie plasmider produseres som vist i eksempel 1. Deretter blir en klon konstruert som koder for et PE-molekyl uten en ledersekvens (pJH4) og i hvilken et metionin anbringes grensende opp til alaninet ved aminoterminusen av den prosesserte form av nativt PE (tabell 1). Det protein som produseres med pJH4, betegnes Met-PE. Store mengder Met-PE produseres ved induksjon med IPTG, hvilket representerer 20% av det samlede celleprotein. ADP-ribosyleringsaktivitet svarende til 0,1 mg nativt PE blir funnet i supernatanten,
og 0,2 mg i pelleten pr. mg samlet celleprotein. PE-molekylet som produseres ved pJH4, avviker fra native PE-molekyler
ved nærværet av én ekstra metioninrest ved amino-terminusen.
pJH8 fremstilt fra pJH4, som angitt ovenfor, uttrykker et protein hvor mesteparten av Domene Ia er slettet (bibeholder kun det tilsatte metionin og tre aminosyrer ved amino-terminusen) . Immunoblotting viser at dette protein er 45 kD, og det uttrykkes ved en konsentrasjon på tilnærmet 0,04 mg/mg celleprotein. Høy ADP-ribosyleringsaktivitet oppvises når urea og DTT ekskluderes fra reaksjonsblandingen. I motsetning til nativt PE (hvor tilsetningen av urea og DTT aktiverer ADP-ribosyleringsaktivitet) gir tilsetningen av urea og DTT til pJH8 redusert ADP-ribosyleringsaktivitet (med ca. 3 0%).
Fordi ADP-ribosyleringsaktiviteten av PE ligger i karboksyl-enden av molekylet, ble plasmid pJH17, konstruert fra pJH4 (som angitt ovenfor), produsert. Dette plasmid inneholder Domene III og 20 aminosyrer fra Domene Ib. Ekstrakter fra dette plasmid inneholder høye nivåer av ADP-ribosyleringsaktivitet - ekvivalent med 0,06 mg PE (tabell 1). Ved immunoblotting ble et 31 kD protein påvist, som foreligger i en konsentrasjon på 0,03 mg/mg celleprotein.
Ingen av de plasmider som produseres ved den ovenfor angitte fremgangsmåte (og som er beskrevet i eksemplene), med unn-tagelse av pJHl, pJH2 og pJH4, oppviser betydelig celledrepende evne, skjønt mange av disse oppviser høy enzymatisk aktivitet (tabell 1). Disse plasmider er vist å hindre inhi-bisjon av proteinsyntese eller celledreping ved nativt PE ved at cellene utsettes i 15 min for nativt PE ved 0,1 ixg/ml i nærvær av 3-5 ixg/ml forskjellige modifiserte toksiner. Dataene i tabell III viser at plasmider som uttrykker enten Domene Ia alene eller Domene I, halvparten av Domene II og Domene III hindrer PE i å inhibere proteinsyntese.
Giftighet for dvr
Mus som mottar nativt PE, bukker under på grunn av lever-ødeleggelse. Den dødelige dose for en 20 gs mus er 0,1-0,2 jug. Dataene i tabell IV viser at PE med en delesjon av Domene
Ia oppviser betydelig forminsket giftighet i mus. Mus ble injisert I.P. med enten nativt PE eller manglende Domene Ia. Alle mus som mottok 1,0 /xg nativt PE og halvparten av
de som mottok 0,2 ug PE, var døde etter 40 h. To av tre mus som mottok 50 /xg av PE Ia, døde, og alle som mottok 20 ug av PE Ia, overlevde, og alle mus som mottok 5 /xg PE Ia, overlevde. Således er PE Ia mer enn 100 ganger mindre giftig på vektbasis enn nativt PE.
Genfusioner ved bruk av rekombinant modifisert Pseudomonas eksotoksin
Genet for modifisert PE ifølge oppfinnelsen som nærmere bestemt inneholdes i pJH8, ble sammensmeltet med DNA-sekvenser som koder for den humane alfa-transformerende vekstfaktor (a-TGF) eller humant interleukin-2 (IL-2). Se eksempel 7 og 8 for detaljer for disse genfusjoner. Modifisert PE er egnet til bruk i fusjoner med et hvilket som helst peptidhormon, vekstfaktor eller annet polypeptid-cellegjenkjennelsesprotein for hvilket en spesifikk reseptor foreligger på celler.
Noen eksempler innbefatter: insulin, glukagon, endorfiner, veksthormon, melanocytt-stimulerende hormon, transferrin, bombesin, lipoprotein med lav tetthet, luteiniserende hormon og asialoglykoproteiner.
Eksempler
Eksempel 1
Som vist i tabell l ble fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen brukt til å konstruere en rekke plasmider inneholdende fusjoner av de forskjellige størrelser av PE-strukturelt gen og den T7 sene promotor. pJH2 inneholder det intakte PE-strukturelle gen med et segment som koder for en modifisert ledersekvens foran. pJH4 inneholder det intakte PE-strukturelle gen med tilføyelsen av et metioninkodon ved amino-terminusen. pJH7 inneholder det gen som koder for strukturelt Domene III av PE (aminosyre 405-613). pJH8 inneholder det
gen som koder for strukturelt Domene II, Ib og III av PE (aminosyre 253-613). pJH13 koder for PE med en utslettelse
av den første halvpart av strukturelt domene II som omfatter aminosyrer 253-307. pJH14 koder for strukturelt domene Ia av PE (aminosyrer 1-252). pJH17 koder for strukturelt domene III med en ytterligere tilgrensende sekvens på 2 0 aminosyrer fra Domene Ib (aminosyrer 385-613) .
pJHl ble konstruert ved delvis kapping av det native PE
(pE 0) med BamHI, og den lineære form av DNA ble eluert og fullstendig kappet med EcoRI. Det 2,0 kb DNA-fragment som ble oppnådd fra pE 0 som har BamHI og EcoRI ved de to ender, ble deretter innsatt i pAR 2156 som var blitt fullstendig kappet med BamHI og EcoRI.
pJH2 ble konstruert ved delvis kapping av pJHl med BamHI.
Den lineære form av DNA ble isolert og fullstendig kappet
med Ndel. Det 610 kb DNA-fragment ble spart, for å konstruere pJH2 ved at det ble ligert med syntetisk oligonukleotid-dupleks.
pJH4 ble konstruert ved delvis kapping av pJH2 med Taql. Det lineariserte DNA (610 kb) ble isolert og fullstendig
kappet med Ndel. Det storste DNA-fragment (5,9 kb) ble sepa-rert og ligert med syntetisk oligonukleotid-dupleks.
pJH7 ble konstruert ved delvis kapping av pJH4 med Aatll. Det lineariserte DNA-fragment (5,9 kb) ble deretter fullstendig kappet med Hindlll. Det 4,7 kb DNA-fragment som har Aatll- og Hindlll-seter ved sine ender etter separasjon,
ble inkubert med Sl-nuklease for å fjerne de kohesive ender, fulgt av ligasjon med T4-ligase.
pJH8 ble konstruert som beskrevet i den nærmere beskrivelse.
pJH13 ble konstruert ved delvis kapping av pJH4 med Aval. Det lineariserte DNA-fragment ble deretter fullstendig kappet med EcoRI. Det 4,7 kb DNA som har Aval og EcoRI kappet ved begge ender, ble inkubert med Sl for å fjerne kohesive ender (DNA-fragment 1). pJH4 ble delvis kappet med Sali. Det lineariserte DNA-fragment ble deretter fullstendig kappet med EcoRI. Det 1,0 kb DNA-fragment som har Sali- og EcoRI-seter ved endene, ble inkubert med Klenow DNA-polymerase I og dNTP for å fylle de kohesive ender (DNA-fragment 2). DNA-fragment 1 (4,7 kb) og DNA-fragment 2 (1,0 kb) ble ligert ved 4°C over natten.
pJH14 ble konstruert ved delvis kapping av pJH4 med Aval. Det lineariserte DNA-fragment ble deretter fullstendig kappet med EcoRI. 4,7 kb DNA som har Aval- og EcoRI-seter ved sine ender, ble inkubert med Sl for å fjerne den kohesive ende, fulgt av ligasjon med T4-ligase.
pJH17 ble konstruert som beskrevet i den nærmere beskrivelse.
Eksempel 2
Mengden og aktiviteten av de rekombinante toksiner (produsert ved plasmidene beskrevet i eksempel 1) ble målt ved SDS-PAGE, ADP-ribosylering og celledrepende evne. Resultatene
er vist i tabell 1.
Eksempel 3
Eksperimentene ble utført for å undersøke egenskapene av
den rekombinante giftighet ifølge oppfinnelsen. Resultatene er vist i tabell 2.
Eksempel 4
Virkningen av forskjellige delesjoner på celleproteinsyntese ble bestemt, i nærvær og fravær av nativt PE. Resultatene er vist i tabell 3. Strukturelt Domene Ia (pJH14) og strukturelt Domene I, halvparten av II og III (pJH13) ble ekstra-hert fra pelleten av de lydbehandlede celler med 8M urea.
10 /il av hvert ekstrakt svarende til 3-5 /xg rekombinante proteiner ble brukt i hver undersøkelse. Strukturelt II, Ib og III (pJH8) forelå i supernatanten av de sonikerte BL21(DE3)/pJH8-celler. 10 /il av ekstrakt svarende til 2 /xg rekombinant toksin ble benyttet. Cellene ble behandlet som angitt i tabell 3 i 15 min med og uten nativt PE ved 0,1 /xg/ml fulgt av 1 ml DMEM-vasking, inkubert i 4 h i DMEM og 0,2%
BSA og deretter inkubert med <3>H-leucin i 1 h.
Eksempel 5
Som vist i tabell 4 ble dosen som forårsaker død hos mus bestemt ved injisering av Balb/c-mus I.P. med forskjellige mengder av PE eller PE Ia inneholdt i 1,0 ml sterilt saline og 10 mg/ml sterilt humanalbumin. Dyrene ble overvåket daglig i to uker. Alle dødsfall fant sted ved 48 h.
Eksempel 6
Som vist på fig. 3 dreper et immunotoksin bestående av det
45 kD-protein fremstilt ved pJH8 konjugert ved et disulfid bundet til et antistoff til den humane transferrin-reseptor (PE45~HB2l) humane celler som uttrykker transferrin-reseptoren (ID5Q 3 ng/ml). Det har liten eller ingen virkning på museceller som ikke uttrykker den humane transferrin-reseptor ved 1000 ng/ml, mens nativt PE konjugert ved et sulfid bundet til HB21 dreper ikke-spesifikt museceller ved en ID50 på 29 ng/ml. Dataene på fig. 3 viser at den ikke-spesifikke giftighet av PE45~HB21 er 100 ganger mindre enn PE-HB21.
Molekylvekten av PE45 ble senere bestemt på nytt. Molekylvekten ble da funnet å være 40 000.
Eksempel 7
Konstruksjon av alfa- transformerende vekstfaktor- PE- fusionsgen
PJH8 ble behandlet med Tth 1111 og SphI for å konstruere et mindre plasmid pVC8 som har færre Avall-seter. pVC8 ble delvis kappet med Avall og ligatisert til et syntetisk oligonukleotid (30 bp) som inneholder et STuI-sete, et Tth 1111-sete og et stoppkodon for å danne pVC31. pVC31 ble kappet med Tth 1111 og fylt opp med et Klenow-fragment, et fragment av DNA-polymerase og ligatisert til en klon med butt ende som inneholdt alfa-TGF-genet (pVC 33). Alfa-TGF-DNA, p-hTGF-10-925 [Derynck et al. Cell. 38:287-297 (1984)] ble kappet med EcoRI og Bgll for å gi et 322 bp-fragment som ble isolert og kappet med Fnu 4HI og behandlet med T4-polymerase for å gi et 152 bp-fragment som i sin tur ble ligatisert til pVC31 for å danne PE-alfa-TGF-fusjonsgenet. Når det uttrykkes i E. coli B121, produserer dette plasmid et protein som reagerer med antistoffer for alfa-TGF og for PE og har en molekylvekt på 51 000.
Eksempel 8
Konstruksjon av IL- 2- PE- fus~ ionsqen
pVC8 ble kappet med Avall ved posisjon 1190, 3,6 kb-fragmentet ble isolert, dets enkelttrådede ender fylt med Klenow-enzym og defosforylert for å produsere fragment I. Klon PST-5 [Gallo et al., PNAS. 81:2543-2547 (1984)] ble kappet med Pstl for å gi et 1 kD-fragment av IL-2 som deretter ble kappet med Bsp 1286 ved posisjon 105 og 669 og behandlet med T4-polymerase for å fylle opp endene. 564 bp-fragmentet ble ligert til fragment I for å danne pHL-1 og transfor-
mert inn i BL21-ekspresjonsceller. Ved induksjon ble et 60 kD-protein produsert som reagerer med antistoffer for IL-2 og for PE og inneholder ADP-ribosyleringsaktivitet.
Deponeringserklæring
De følgende plasmider er blitt deponert i the American Type Culture Collection i Rockville, Maryland under de respektive ATCC-nummer før innlevering av søknaden, og ved utstedelse av søknaden som patent vil de opprettholdes i en periode av tretti (30) år fra deponeringsdatoen eller fem (5) år etter den siste forespørsel etter slike deponeringer eller for patentets effektive levetid, hva som måtte være lengst. Deponeringene skal erstattes dersom kulturene muterer eller blir ikke-levedyktige i løpet av deponeringsperioden.

Claims (19)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av (1) et modifisert Pseudomonas eksotoksin som omfatter minst ADP-ribosyleringsaktivitet og eventuelt translokasjonsaktivitet, hvor translokasjonsaktiviteten er definert som evnen til å translokere gjennom en cellemembran og hvor det modifiserte endotoksin mangler et funksjonelt domene Ia og eventuelt domene II i det native eksotoksin, (2) et målsøkende bærertoksinkonjugat som består av det nevnte eksotoksin sammenføyd til en målsøkende bærer, særlig immuntoksin som omfatter eksotoksinet sammenføyd med et antistoff, karakterisert ved å: (a) transfektere en egnet vertscelle med et ekspresjonsplasmid som inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte eksotoksin eller nevnte målsøkende bærertoksinkonjugat og dyrking av vertscellen under betingelser slik at det modifiserte Pseudomonas eksotoksin eller det målsøkende bærertoksinkonjugat blir fremstilt; eller (b) å konjugere nevnte modifiserte eksotoksin med målsøkende bærer for å fremstille nevnte målsøkende bærer-toksinkonjugat, særlig immunotoksin.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det modifiserte Pseudomonas eksotoksin mangler minst én del av domene II i det native eksotoksin.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det modifiserte Pseudomonas eksotoksin omfatter translokasjonsaktivitet, hvor det modifiserte eksotoksinet inkluderer minst én del av domene II i det native eksotoksin.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det modifiserte Pseudomonas eksotoksin omfatter både ADP-ribosyleringsaktivitet og translokasjonsaktivitet hvor det modifiserte eksotoksin mangler et funksjonelt domene Ia og inkluderer minst en del av domenene Ib, II og III av det native eksotoksin.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den målsøkende bærer som anvendes blir selektert fra gruppen som består av et antigen, et antistoff, en vekstfaktor, et hormon, et lymfokin, et polypeptid cellegjenkjennelsesprotein, et serumprotein, et endorfin, og asialoglykoprotein, insulin, glukagon, luteiniserende hormon, fibroblastfaktor, nervevekstfaktor, melanocyttstimulerende hormon, bombesin og et lektin, fortrinnsvis interleukin-2 alfatransformerende vekstfaktor og et peptidhormon.
6. Ekspresjonsplasmid, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for ethvert av proteinene som angitt i krav 1-4, og som er i stand til å uttrykke nevnte DNA-sekvens.
7. Ekspresjonsplasmid i henhold til krav 6, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for eksotoksinet til pJH12.
8. Ekspresjonsplasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for et konjugat av interleukin-2 og det modifiserte eksotoksin fremstilt i henhold til krav 1.
9. Ekspresjonsplasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for et konjugat av alfatransformerende vekstfaktor og det modifiserte eksotoksin fremstilt som angitt i krav 1.
10. Ekspresjonsplasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for eksotoksinet til plasmidet pJH8.
11. Ekspresjonsplasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for eksotoksinet til plasmidet pJH14.
12. Ekspresjonsplasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for eksotoksinet til plasmid pJH17.
13. Ekspresjonsplasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for eksotoksinet til plasmid pJH13.
14. Ekspresjonsplasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for eksotoksinet til plasmid pJHIO.
15. Ekspresjonsplasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for eksotoksinet til plasmid pJH9.
16. Ekspresjonsplasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for eksotoksinet til plasmid pJH7.
17. Ekspresjonsplasmid som angitt i krav 6, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens som koder for proteinet som angitt i krav 4.
18. Vertscelle, karakterisert ved at den inneholder ekspre-sjonsplasmidet angitt i kravene 6-17 som omfatter DNA som koder for enhver av proteinene fremstilt i henhold til krav 1-4 og som er i stand til å uttrykke det gitte gen.
19. Vertscelle som angitt i krav 18, karakterisert ved at den innholder ekspresjons-plasmidet som omfatter DNA som koder for proteinet fremstilt som angitt i krav 4 og som er i stand til å uttrykke det gitte gen.
NO882269A 1986-09-24 1988-05-24 Fremgangsmåte til fremstilling av modifisert rekombinant Pseudomonas eksotoksin som et aktivt immunotoksin med små bivirkninger, ekspresjonsplasmid og vertscelle brukt i fremgangsmåten NO180270C (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/911,227 US4892827A (en) 1986-09-24 1986-09-24 Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
PCT/US1987/002373 WO1988002401A1 (en) 1986-09-24 1987-09-22 Recombinant pseudomanas exotoxin: construction of an active immunotoxin with low side effects

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO882269D0 NO882269D0 (no) 1988-05-24
NO882269L NO882269L (no) 1988-05-24
NO180270B true NO180270B (no) 1996-12-09
NO180270C NO180270C (no) 1997-03-19

Family

ID=25429936

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO882269A NO180270C (no) 1986-09-24 1988-05-24 Fremgangsmåte til fremstilling av modifisert rekombinant Pseudomonas eksotoksin som et aktivt immunotoksin med små bivirkninger, ekspresjonsplasmid og vertscelle brukt i fremgangsmåten

Country Status (19)

Country Link
US (2) US4892827A (no)
EP (2) EP0261671B1 (no)
JP (3) JP2848489B2 (no)
KR (1) KR970001563B1 (no)
AT (2) ATE311442T1 (no)
AU (1) AU618722B2 (no)
CA (1) CA1336691C (no)
DE (2) DE3789587T2 (no)
DK (2) DK173301B1 (no)
ES (2) ES2253734T3 (no)
FI (1) FI105271B (no)
IE (1) IE66223B1 (no)
IL (2) IL105160A (no)
NO (1) NO180270C (no)
NZ (1) NZ221923A (no)
PT (1) PT85777B (no)
SG (1) SG96159A1 (no)
WO (1) WO1988002401A1 (no)
ZA (1) ZA877153B (no)

Families Citing this family (153)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6022950A (en) * 1984-06-07 2000-02-08 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5668255A (en) * 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5169939A (en) * 1985-05-21 1992-12-08 Massachusetts Institute Of Technology & Pres. & Fellows Of Harvard College Chimeric antibodies
US6051405A (en) * 1986-09-24 2000-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Constructs encoding recombinant antibody-toxin fusion proteins
US4892827A (en) * 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
WO1989010971A1 (en) * 1988-05-09 1989-11-16 The United States Of America, As Represented By Th Vector for secretion of proteins directly into periplasm or culture medium
US5206353A (en) * 1988-07-23 1993-04-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services CD-4/cytotoxic gene fusions
US5135736A (en) * 1988-08-15 1992-08-04 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5169933A (en) * 1988-08-15 1992-12-08 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
US5149782A (en) * 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
ZA898139B (en) * 1988-11-17 1990-08-29 Hoffmann La Roche Recombinant interleukin-2 hybrid proteins
ES2085329T3 (es) * 1989-02-17 1996-06-01 Merck & Co Inc Agente anticanceroso proteico.
US6406697B1 (en) * 1989-02-23 2002-06-18 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5621078A (en) * 1989-03-22 1997-04-15 Merck & Co., Inc. Modified pseudomonas exotoxin PE40
NZ232900A (en) * 1989-03-22 1993-08-26 Merck & Co Inc Pseudomonas exotoxin a, pe 40 domain derivatives
EP0469065B1 (en) * 1989-04-21 1996-05-29 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Recombinant antibody-toxin fusion protein
US6207798B1 (en) 1989-08-03 2001-03-27 Merck & Co., Inc. Modified PE40 toxin fusion proteins
US5672683A (en) * 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
US6329508B1 (en) 1989-09-07 2001-12-11 Alkermes, Inc. Transferrin receptor reactive chimeric antibodies
US5527527A (en) * 1989-09-07 1996-06-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
US5977307A (en) * 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
CA2071946A1 (en) * 1989-12-21 1991-06-22 Ira H. Pastan Toxin for construction of immunotoxins
US5458878A (en) * 1990-01-02 1995-10-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services P. exotoxin fusio proteins have COOHG220101al alterations which increase cytotoxicity
EP0509056A4 (en) * 1990-01-02 1993-02-17 Us Health Target-specific, cytotoxic, recombinant pseudomonas exotoxin
US5110912A (en) * 1990-03-02 1992-05-05 Seragen, Inc. Purification of il-2-containing hybrid compounds
DE69131449T2 (de) * 1990-05-11 1999-11-25 Us Health Verbesserte exotoxine aus pseudomonas mit geringer toxität bei tieren und hoher zelltötender aktivität
IL98528A0 (en) * 1990-06-21 1992-07-15 Merck & Co Inc Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells
US5241053A (en) * 1990-09-05 1993-08-31 Takeda Chemical Industries, Ltd. Fused proteins comprising glycoprotein gD of HSV-1 and LTB
US6099842A (en) * 1990-12-03 2000-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant immunotoxin composed of a single chain antibody reacting with the human transferrin receptor and diptheria toxin
US5571894A (en) * 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
FR2672616B1 (fr) * 1991-02-08 1994-09-23 Roussel Uclaf Sequences nucleotidiques codant pour des regions variables de chaines alpha des recepteurs de lymphocytes t humains, segments peptidiques correspondants et les applications diagnostiques et therapeutiques.
AU660660B2 (en) * 1991-02-08 1995-07-06 Roussel-Uclaf Nucleotide sequences coding for alpha chain variable regions in human lymphocyte receptors and applications thereof
IE920447A1 (en) * 1991-02-12 1992-08-12 Roussel Uclaf NUCLEOTIDE SEQUENCES CODING FOR ß-CHAIN VARIABLE REGIONS OF¹HUMAN T-LYMPHOCYTE RECEPTORS, CORRESPONDING PEPTIDE SEGMENTS¹AND DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS
US5328984A (en) * 1991-03-04 1994-07-12 The United States As Represented By The Department Of Health & Human Services Recombinant chimeric proteins deliverable across cellular membranes into cytosol of target cells
US5223604A (en) * 1991-06-25 1993-06-29 S.P.I. Synthetic Peptides Incorporated Pseudomonas exoenzyme s peptide composition and method
US5939531A (en) * 1991-07-15 1999-08-17 Novartis Corp. Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
CA2081952A1 (en) * 1991-11-08 1993-05-09 John J. Donnelly Recombinant dna sequences and plasmids for cellular immunity vaccines from bacterial toxin-antigen conjugates, and methods of their use
CA2136724A1 (en) * 1992-06-18 1993-12-23 Ira H. Pastan Recombinant pseudomonas exotoxin with increased activity
GB9326174D0 (en) * 1993-12-22 1994-02-23 Biocine Sclavo Mucosal adjuvant
US6015555A (en) * 1995-05-19 2000-01-18 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
DE69629580D1 (de) * 1995-10-13 2003-09-25 Us Gov Health & Human Serv Immunotoxin enthaltend ein disulfid-stabilisiertes antikörperfragment
WO1997031948A1 (en) 1996-03-01 1997-09-04 Novartis Ag Peptide immunogens for vaccination against and treatment of allergy
EP0941334B1 (en) 1996-11-06 2004-06-02 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Protease-activatable pseudomonas exotoxin a-like proproteins
US6818222B1 (en) 1997-03-21 2004-11-16 Chiron Corporation Detoxified mutants of bacterial ADP-ribosylating toxins as parenteral adjuvants
US20020004113A1 (en) * 1997-06-26 2002-01-10 Weder Donald E. Decorative cover for flower pot or floral grouping formed of polymeric materials having a texture or appearance simulating the texture or appearance of paper
US20030198772A1 (en) * 1997-06-26 2003-10-23 Weder Donald E. Polymeric materials having a texture or appearance simulating the texture or appearance of paper
US20030054012A1 (en) * 2000-05-12 2003-03-20 Fitzgerald David J. Pseudomonas exotoxin a-like chimeric immunogens for eliciting a secretory iga-mediated immune response
US7314632B1 (en) * 1997-07-11 2008-01-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin A-like chimeric immunogens
JP2001510683A (ja) * 1997-07-11 2001-08-07 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ リプリゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素Ａ様キメラ免疫原
US6077676A (en) * 1997-12-18 2000-06-20 Spectral Diagnostics, Inc. Single-chain polypeptides comprising troponin I and troponin C
AU2004201055B2 (en) * 1998-04-24 2007-08-23 The Regents Of The University Of California Internalizing ErbB2 antibodies
US6794128B2 (en) 1998-04-24 2004-09-21 The Regents Of The University Of California Methods of selecting internalizing antibodies
US7244826B1 (en) * 1998-04-24 2007-07-17 The Regents Of The University Of California Internalizing ERB2 antibodies
US20020142000A1 (en) * 1999-01-15 2002-10-03 Digan Mary Ellen Anti-CD3 immunotoxins and therapeutic uses therefor
US20030143233A1 (en) * 1999-06-07 2003-07-31 Neorx Corporation Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
US20030103948A1 (en) * 1999-06-07 2003-06-05 Neorx Corporation Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
US7144991B2 (en) 1999-06-07 2006-12-05 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
US6838553B1 (en) * 1999-10-05 2005-01-04 Academia Sinica Peptide repeat immunogens
US7078486B2 (en) * 1999-12-10 2006-07-18 Spectral Diagnostics, Inc. Single-chain polypeptides comprising troponin I and troponin C
AU2001255688A1 (en) * 2000-04-25 2001-11-07 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Identification and uses of a hyaluronan receptor
US20050287638A1 (en) * 2000-04-25 2005-12-29 Weigel Paul H Hyaluronan receptor for endocytosis, variants thereof, and methods of making and using same
CA2432731A1 (en) * 2000-12-21 2002-08-08 The Government Of The United States Of America A chimeric protein comprising non-toxic pseudomonas exotoxin a and type iv pilin sequences
CA2445627A1 (en) * 2001-04-25 2002-10-31 Paul H. Weigel Methods of using a hyaluronan receptor
CA2461351C (en) 2001-09-26 2014-08-05 Ira H. Pastan Mutated anti-cd22 antibodies with increased affinity to cd22-expressing leukemia cells
EP1448237A1 (en) * 2001-11-09 2004-08-25 Neopharm, Inc. Selective treatment of il-13 expressing tumors
WO2004087758A2 (en) * 2003-03-26 2004-10-14 Neopharm, Inc. Il 13 receptor alpha 2 antibody and methods of use
PT2382990E (pt) 2003-04-30 2014-12-29 Univ Zuerich Método para tratamento do cancro usando uma imunotoxina
CA2547165C (en) * 2003-11-25 2014-07-08 Ira H. Pastan Mutated anti-cd22 antibodies and immunoconjugates
US7999077B2 (en) * 2004-09-30 2011-08-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services IRTA2 antibodies and methods of use
CA2583226A1 (en) 2004-10-04 2006-04-20 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for immunizing against pseudomonas infection
KR20070073863A (ko) * 2004-10-04 2007-07-10 트리니티 바이오시스템스, 인크. 거대분자의 무침 전달을 위한 방법 및 조성물
CA2591992A1 (en) 2004-12-22 2006-06-29 The Salk Institute For Biological Studies Compositions and methods for producing recombinant proteins
US7964200B2 (en) 2005-05-18 2011-06-21 Children's Hospital & Research Center At Oakland Methods and compositions for immunizing against Chlamydia infection
EP2332970B1 (en) 2005-07-29 2015-12-23 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of Health and Human Services Mutated pseudomonas exotoxins with reduced antigenicity
US7666991B2 (en) * 2005-12-05 2010-02-23 Trinity Biosystems, Inc. Compositions for needleless delivery of antibodies
EP1971367A4 (en) * 2005-12-05 2010-04-07 Trinity Biosystems Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR THE NEEDLESS DELIVERY OF BINDING PARTNERS
EP2010205A2 (en) 2006-03-16 2009-01-07 Trinity Biosystems, Inc. Methods for increasing the size of animals using needleless delivery constructs
EP1878744A1 (en) * 2006-07-13 2008-01-16 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Epitope-tag for surface-expressed T-cell receptor proteins, uses thereof and method of selecting host cells expressing them
US20090092660A1 (en) * 2006-08-09 2009-04-09 Trinity Biosystems, Inc. Methods and compositions for needleless delivery of particles
JP2010534061A (ja) * 2007-07-20 2010-11-04 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 組換えコレラ菌外毒素
WO2009032954A1 (en) * 2007-09-04 2009-03-12 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Deletions in domain ii of pseudomonas exotoxin a that reduce non-specific toxicity
EP2853267B1 (en) * 2007-09-21 2016-12-07 The Regents of the University of California Targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
WO2010045495A2 (en) 2008-10-16 2010-04-22 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Fully human antibodies to high molecular weight-melanoma associated antigen and uses thereof
WO2011031441A1 (en) 2009-08-28 2011-03-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Therapy with a chimeric molecule and a pro-apoptotic agent
US8936792B2 (en) 2009-09-11 2015-01-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin a with reduced immunogenicity
WO2011100455A1 (en) 2010-02-12 2011-08-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Inhibition of antibody responses to foreign proteins
EP2553102B1 (en) 2010-03-30 2015-12-09 Pfenex Inc. High level expression of recombinant toxin proteins
JP2013538042A (ja) 2010-06-16 2013-10-10 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション エンドプラスミンに対する抗体およびその使用
JP6061853B2 (ja) 2010-07-30 2017-01-18 メディミューン，エルエルシー 活性ポリペプチドまたは免疫複合体の精製方法
US11246915B2 (en) 2010-09-15 2022-02-15 Applied Molecular Transport Inc. Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo
US20120171120A1 (en) * 2010-11-30 2012-07-05 Genentech, Inc. Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor
EP3070104B1 (en) 2011-04-19 2017-12-27 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Human monoclonal antibodies specific for glypican-3 and use thereof
EP2718308B1 (en) 2011-06-09 2017-05-17 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Pseudomonas exotoxin a with less immunogenic t cell and/or b cell epitopes
US8932586B2 (en) 2011-09-06 2015-01-13 Intrexon Corporation Modified forms of Pseudomonas exotoxin A
WO2013039916A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 The United States Of America, Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Compositions for and methods of treatment and enhanced detection of non-pituitary tumors
ES2656505T3 (es) 2011-09-16 2018-02-27 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Exotoxina A de Pseudomonas con epítopos de linfocitos B menos inmunogénicos
ES2654160T3 (es) 2011-10-04 2018-02-12 Igem Therapeutics Limited Anticuerpos de IgE anti-HMW-MAA
US9169304B2 (en) 2012-05-01 2015-10-27 Pfenex Inc. Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein
US9409994B2 (en) 2012-06-01 2016-08-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High-affinity monoclonal antibodies to glypican-3 and use thereof
US9409992B2 (en) 2012-08-21 2016-08-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin domain-specific monoclonal antibodies and use thereof
WO2014052064A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Mesothelin antibodies and methods for eliciting potent antitumor activity
WO2014089354A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 The Regents Of The University Of California Cd138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
WO2014093240A1 (en) 2012-12-10 2014-06-19 The General Hospital Corporation Bivalent il-2 fusion toxins
US9920124B2 (en) 2012-12-20 2018-03-20 Medimmune, Llc Methods of producing immunoconjugates
US9790282B2 (en) 2013-03-25 2017-10-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
WO2014194100A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 The Regents Of The University Of California Anti-cspg4 fusions with interferon for the treatment of malignancy
EP3038641B1 (en) 2013-10-06 2019-04-17 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Modified pseudomonas exotoxin a
ES2960807T3 (es) 2013-10-11 2024-03-06 Us Health Anticuerpos contra TEM8 y su uso
US20160280798A1 (en) 2013-11-06 2016-09-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Service Alk antibodies, conjugates, and chimeric antigen receptors, and their use
CA2930587A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors to control hiv infection
EP3102245B1 (en) 2014-02-05 2021-09-08 Molecular Templates, Inc. Methods of screening, selecting, and identifying cytotoxic recombinant polypeptides based on an interim diminution of ribotoxicity
RU2723178C2 (ru) 2014-05-07 2020-06-09 ЭППЛАЙД МОЛЕКЬЮЛАР ТРАНСПОРТ ЭлЭлСи Слитые молекулы, происходящие от Cholix-токсина, для пероральной доставки биологически активных нагрузок
EP3473271B1 (en) 2014-07-31 2022-07-20 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Human monoclonal antibodies against epha4 and their use
WO2016044383A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-cd276 antibodies (b7h3)
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
US11046959B2 (en) 2015-03-30 2021-06-29 The Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education On Behalf Of The University Of Nevada, Las Vegas Compositions comprising TALENs and methods of treating HIV
US20180161429A1 (en) 2015-06-26 2018-06-14 Beth Israel Deaconess Medical Center Inc. Cancer therapy targeting tetraspanin 33 (tspan33) in myeloid derived suppressor cells
CA3000591A1 (en) 2015-10-13 2017-04-20 Sanofi Pasteur Immunogenic compositions against s. aureus
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
US10925969B2 (en) 2015-11-13 2021-02-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Service Anti-BCMA polypeptides and proteins
WO2017196847A1 (en) 2016-05-10 2017-11-16 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Variable new antigen receptor (vnar) antibodies and antibody conjugates targeting tumor and viral antigens
WO2017214182A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 The United States Of America. As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Fully human antibody targeting pdi for cancer immunotherapy
EP3494135A1 (en) 2016-08-02 2019-06-12 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Monoclonal antibodies targeting glypican-2 (gpc2) and use thereof
CA3045902A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies specific for flt3 and uses thereof
US11390683B2 (en) 2017-05-18 2022-07-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin polypeptides and proteins
AU2018268970A1 (en) 2017-05-19 2019-10-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibody targeting tnfr2 for cancer immunotherapy
WO2019005208A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services ANTIBODIES TO HUMAN MESOTHELIN AND USES IN ANTICANCER THERAPY
CA3066953A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Lentigen Technology, Inc. Human monoclonal antibodies specific for cd33 and methods of their use
WO2019051204A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services SYNERGISTIC COMBINATION OF IL4, INTERFERON GAMMA AND INTERFERON ALPHA RECEPTOR AGENTS FOR USE IN THE TREATMENT OF OVARIAN CANCER
US11795235B2 (en) 2017-09-18 2023-10-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunotoxins with albumin binding domain
US11198722B2 (en) 2017-10-06 2021-12-14 University Of Utah Research Foundation Immune tolerant elastin-like peptide tetramer guided nanoparticles and methods of use
SG11202009925PA (en) 2018-03-08 2020-11-27 Applied Molecular Transport Inc Toxin-derived delivery constructs for oral delivery
EP3820903A1 (en) 2018-07-12 2021-05-19 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Affinity matured cd22-specific monoclonal antibody and uses thereof
WO2020033430A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-2 and uses thereof
KR102353086B1 (ko) * 2018-09-07 2022-01-20 아주대학교산학협력단 신규 면역독소 제조방법
EA202191280A1 (ru) 2018-11-07 2021-12-27 Эпплайд Молекьюлар Транспорт Инк. Конструкции для доставки для трансцитоза и связанные способы
WO2020096695A1 (en) 2018-11-07 2020-05-14 Applied Molecular Transport Inc. Cholix-derived carriers for oral delivery of heterologous payload
CN113490510A (zh) 2019-01-08 2021-10-08 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 用于治疗实体瘤的靶向间皮素的跨物种单结构域抗体
AU2020212534A1 (en) 2019-01-22 2021-07-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High affinity monoclonal antibodies targeting glypican-1 and methods of use
EP3927731A4 (en) 2019-02-19 2022-12-28 The Regents of the University of Colorado, a body corporate BISPECIFIC IMMUNOTOXINS FOR TARGETING HUMAN CD25S-CCR4+ TUMORS AND REGULATORY T-CELLS
CN114269783B (zh) 2019-07-02 2024-03-26 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 结合egfrviii的单克隆抗体及其应用
BR112022002962A2 (pt) 2019-08-16 2022-07-05 Applied Molecular Transport Inc Composições, formulações e produção e purificação de interleucina
EP4031250A1 (en) 2019-10-22 2022-07-27 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services High affinity nanobodies targeting b7h3 (cd276) for treating multiple solid tumors
WO2021097289A1 (en) 2019-11-15 2021-05-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pegylated recombinant immunotoxins
WO2021173674A1 (en) 2020-02-26 2021-09-02 A2 Biotherapeutics, Inc. Polypeptides targeting mage-a3 peptide-mhc complexes and methods of use thereof
WO2022093745A1 (en) 2020-10-26 2022-05-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof
TW202231663A (zh) 2020-12-22 2022-08-16 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 抗ｉｌ－４ｒ抗體或其抗原結合片段的複合物及醫藥用途
US20240218055A1 (en) 2021-04-29 2024-07-04 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lassa virus-specific nanobodies and methods of their use
EP4352099A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Cross species single domain antibodies targeting pd-l1 for treating solid tumors
WO2023076881A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting the s2 subunit of sars-cov-2 spike protein
CA3240254A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
WO2024050399A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Single domain antibodies targeting hpv e6/e7 oncogenic peptide/mhc complexes
WO2024104584A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 University Of Cape Town Deimmunized pseudomonas exotoxin a

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4470924A (en) * 1981-12-30 1984-09-11 Iglewski Barbara M Nontoxic, immunologically crossreactive toxin A protein from Pseudomonas aeruginosa
DE3369466D1 (en) * 1982-05-12 1987-03-05 Harvard College Fused genes encoding hybrid proteins, cloning vectors containing them and the use thereof
US4545985A (en) * 1984-01-26 1985-10-08 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins
US4894443A (en) * 1984-02-08 1990-01-16 Cetus Corporation Toxin conjugates
NZ212312A (en) * 1984-06-07 1988-09-29 John Richard Murphy Hybrid protein comprising fragments of diphtheria toxin and part of cell-specific ligand; and fused gene therefor
US4892827A (en) * 1986-09-24 1990-01-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects
US4867962A (en) * 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
EP0261671A3 (en) 1988-08-10
IL83971A (en) 1994-06-24
IE66223B1 (en) 1995-12-13
DK276488A (da) 1988-05-20
AU8021187A (en) 1988-04-21
DE3789587T2 (de) 1994-07-28
ZA877153B (en) 1989-08-30
ATE311442T1 (de) 2005-12-15
FI891321A0 (fi) 1989-03-21
JPH02502063A (ja) 1990-07-12
NO180270C (no) 1997-03-19
KR970001563B1 (ko) 1997-02-11
PT85777A (en) 1987-10-01
ATE104153T1 (de) 1994-04-15
EP0261671B1 (en) 1994-04-13
IE872553L (en) 1988-03-24
EP0583794A1 (en) 1994-02-23
DE3752387T2 (de) 2006-06-08
IL105160A (en) 1997-07-13
FI891321A (fi) 1989-03-21
WO1988002401A1 (en) 1988-04-07
CA1336691C (en) 1995-08-15
FI105271B (fi) 2000-07-14
EP0261671A2 (en) 1988-03-30
IL83971A0 (en) 1988-02-29
IE950321L (en) 1988-03-24
PT85777B (pt) 1990-07-31
DK173560B1 (da) 2001-03-12
JP3053087B2 (ja) 2000-06-19
DK199901377A (da) 1999-09-28
AU618722B2 (en) 1992-01-09
SG96159A1 (en) 2003-05-23
NO882269D0 (no) 1988-05-24
NO882269L (no) 1988-05-24
US5696237A (en) 1997-12-09
US4892827A (en) 1990-01-09
DE3789587D1 (de) 1994-05-19
DK276488D0 (da) 1988-05-20
ES2074042T3 (es) 1995-09-01
DE3752387D1 (de) 2006-01-05
JP2848489B2 (ja) 1999-01-20
JPH10136988A (ja) 1998-05-26
EP0583794B1 (en) 2005-11-30
KR890700162A (ko) 1989-03-10
ES2253734T3 (es) 2006-06-01
JP2960697B2 (ja) 1999-10-12
JPH11253181A (ja) 1999-09-21
NZ221923A (en) 1991-12-23
DK173301B1 (da) 2000-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO180270B (no) Fremgangsmåte til fremstilling av modifisert rekombinant Pseudomonas eksotoksin som et aktivt immunotoksin med små bivirkninger, ekspresjonsplasmid og vertscelle brukt i fremgangsmåten
AU660616B2 (en) Target-specific, cytotoxic, recombinant pseudomonas exotoxin
Batra et al. Single-chain immunotoxins directed at the human transferrin receptor containing Pseudomonas exotoxin A or diphtheria toxin: anti-TFR (Fv)-PE40 and DT388-anti-TFR (Fv)
Chaudhary et al. Pseudomonas exotoxin contains a specific sequence at the carboxyl terminus that is required for cytotoxicity.
US5906820A (en) Epidermal growth factor receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis
Hwang et al. Functional domains of Pseudomonas exotoxin identified by deletion analysis of the gene expressed in E. coli
EP0646175B1 (en) Recombinant pseudomonas exotoxin with increased activity
US7585942B2 (en) Diphtheria toxin variant
Debinski et al. An immunotoxin with increased activity and homogeneity produced by reducing the number of lysine residues in recombinant Pseudomonas exotoxin
EP0509056A1 (en) Target-specific, cytotoxic, recombinant pseudomonas exotoxin
IE84490B1 (en) Recombinant pseudomonas exotoxin: construction of an active immunotoxin with low side effects