JP2848489B2 - 組換えシュードモナスエクソトキシン：低副作用の活性イムノトキシンの構造 - Google Patents

組換えシュードモナスエクソトキシン：低副作用の活性イムノトキシンの構造

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 毒素は、ヒトの多くの病気の原因となる、きわめて強
力な細胞破壊をおこすものである。その強い活性のため
に、毒素は、標的細胞に特異的に結合する細胞傷害剤
（イムノトキシン）を作るためにモノクローナル抗体に
結合される。したがってこれらのイムノトキシンはガン
療法において、最も有益である。 シュードモナスエクソトキシンＡ（PE）はきわめて活
性が高い蛋白質モノマー（分子量66Kd）であり、緑膿菌
（Pseudomonas aeruginosa）によって分泌される。こ
の蛋白質モノマーは、ペプチド鎖延長因子２（EF−２）
のADPリボシル化を触媒（酸化型NAD+のADPリボース部分
のEF−２への転移を触媒）することにより、EF2の不活
化を通して真核細胞の蛋白合成を阻害するものである。 毒に侵される過程は次の様に考えられている。：ま
ず、PEが細胞表面の特異的受容体により結合する。次に
PE−受容体複合体が細胞内に吸収される。最終的に、PE
は、細胞質ゾルに移行し、そこで酵素的に蛋白合成を阻
害する。酸性液胞のPHを上昇するNH4 +の様な弱塩基によ
って、細胞の被毒が防がれているので、移行過程は酸性
区域から起こると考えられている。PEの疎水ドメインは
酸性状態に曝されることによって細胞膜内に入り込み、
酵素ドメインが伸長した状態で細胞質ゾルを通過する通
路を形成する。 米国特許第4,545,985号は、シュードモナストキシン
が抗体又は成長因子に化学的に結合できることを教示し
ている。しかし、これらの化学的に結合された毒素は好
ましくないレベルの毒性しか示さない。従って、一般に
これらの毒素に伴われる細胞の破壊を生じることなく、
ある特殊の細胞タイプを標的として高特異的に作用する
毒素が得られれば有益なことであろう。 PEを含むイムノトキシンは、天然のPEとイミノチオラ
ン（iminothiolane）との第１の反応で製造される。こ
の反応は、抗体を毒素に結合するのに役立つ２つの新し
いスルフヒドリル基をもたらすと共に、その結果PEがそ
の固有の受容体に結合するのを不活化する。この考え方
はPE受容体を持った細胞にPEが結合するために生ずる好
ましくない副作用を最少限に抑制するため、PE結合部位
を化学的に不活化することにもとづいている。この考え
は、組織細胞培養液内の特異細胞破壊や腫瘍接種マウス
においてはかなり旨い考えだが、イムノトキシンの毒性
副作用のために、20グラムのマウスに対しては２μｇ、
3Kgのモンキーに対しては1mg、成人に対しては4mg以上
投与することができない。従って、腫瘍細胞のより大き
な破滅を為し遂げるために、より大量のイムノトキシン
を投与できることが望まれる。本発明は、高い効能と低
い毒性を持ったイムノトキシンを提供することにより、
この目的を達成するものである。さらに、上記PE結合部
位の化学的不活化についての考えを克服するために、本
発明ではDNA組換えの技術を用いた。即ち、異なった機
能のドメインを含んだり、細胞結合ドメインを持ってい
ない毒素分子の全長（又は、その部分）が高度に発現さ
れるように、DNA組換えのテクニックを用いて完全な毒
素遺伝子（又はその断片）のクローニングを行なった。
これらのクローンの比較実験を例１に示した。 PEの３次構造は、Ｘ線結晶学により決定された。第２
図に示すように、PE分子は、３つの構造的に異なるドメ
インを有している。ドメインＩはアミノ酸残基を１〜25
2（ドメインI a）、365〜404（ドメインI b）含んでい
る；ドメインIIはアミノ酸残基を253〜364含んでいる；
ドメインIIIはアミノ酸残基を405〜613有している。 PE分子の種々の部分を発現するプラスミドが作製され
ている。このプラスミドはPE分子の異なった構造のドメ
インを種々の作用活性に関係付けることを可能にし、お
よび（１）分子のどの部分が細胞認識（結合）に寄与し
ているか、（構造ドメインＩ、アミノ酸１−252）；
（２）どの部分が酵素活性に必要であるか（ADPリボシ
ル化活性、ドメインIIIをドメインI bの部分に加えたも
の）（アミノ酸385−613）；（３）どの部分が細胞膜を
通ってトランスロケーションするのに寄与するか（ドメ
インII）を決定することを可能とする。 構造ドメインI aが細胞認識に関係していることは、
次の事実から明らかである。すなわち、ドメインI aを
含まず、ドメインII、ドメインI b及びドメインIIIを含
むプラスミドにより生産された蛋白はそれ自身による細
胞傷害性を有さず、無傷の毒素の細胞傷害性に対する拮
抗阻害を示さないのに対して、ドメインI aをコード
し、かつ他のドメインをコードしないプラスミドは感受
性細胞のPE細胞傷害性をブロックした。構造ドメインII
の最初の半分を欠失して導入したプラスミドから得られ
たPEは、ブロック活性とADPリボシル化活性の両方を示
す。しかし、これらの分子は細胞傷害活性をすべて失っ
ていた。構造ドメインIIIのみをコードするプラスミド
は大量の蛋白を生産するが、この蛋白は防御的酵素活性
（ADPリボシル化）を失っていた。しかし、構造ドメイ
ンIIIの全部と構造ドメインI bに近接したアミノ酸とを
コードするプラスミドは、大量の蛋白を発現し、かつそ
のADPリボシル化活性が高い。 PEの３次構造に基づき、PEの異なった部分が発現され
るようにプラスミドが作られる。異なった構造を発現し
ている細胞の蛋白パターンはSDSゲル電気泳動により分
析され、組換え毒素のADPリボシル化活性が測定され
た。これらのプラスミド（例１に記載）のうち、アミノ
酸253−613（構造ドメインI b、II、とIII）を含むプラ
スミドpJH8とドメインI bからのアミノ酸を含むプラス
ミドpJH17とは、ヒト細胞に対する低い毒性を有するに
もかかわらず高い酵素活性を保持した大量の修飾PEをコ
ードすることができる。 以上のプラスミドパターンを総合すると、構造ドメイ
ンI aは受容体結合ドメインであること、構造ドメインI
Iの前半部分は、宿主細胞内含物の液胞から細胞質ゾル
への毒素の移行に必要な部分であること、並びに構造ド
メインIIIはそれのみでは十分なADPリボシル化活性を発
現しないことが示される。 動物にPEを投与すれば、PE特有の肝臓障害により死に
至る。同様にPEから作られるイムノトキシンは肝臓に障
害を与えるので、PEから作られる大量のイムノトキシン
を投与した場合は、肝臓毒性中毒により死に至る。第３
表に示される実験は、構造ドメインI aが細胞結合に寄
与すること、並びに構造ドメインI aが欠失したPE分子
は天然のPEよりもマウスに対して毒性が少ないことを示
している。この結論は例４のデーターによっても裏付け
られ、そこでは修飾PEのマウスに対する毒性が天然のPE
の200分の一以下であることが示されている。例５は、p
JH8から作られた蛋白を精製してヒトのトランスフェリ
ン受容体に対する抗体に結合させると、天然のPEを含む
抗毒素とほぼ同じ程度の活性を示し、かつ標的細胞以外
の細胞（マウス）に対する毒性は100分の一ほどに少な
いイムノトキシンが得られることを示している。 したがって本発明を言替えれば、構造ドメインI aを
欠失したPE分子は、肝臓中毒性の少ない、副作用の少な
い効果的なイムノトキシンであるということである。 図面の説明 第１図は、PEの異なったドメインの発現に使用される
本発明のプラスミドの構築を示している。 第２図は、本発明の一部分として製造される異なった
サイズのPE分子の簡略マップである。 第３図は、ヒトKB細胞での蛋白合成に対するPE45−HB
21とPE−HB21の影響を示している。PE45はプラスミドpJ
H8によりコードされるドメインＩを欠失した毒素蛋白で
ある。細胞は適当なイムノトキシンとともに24時間イン
キュベートされ、3H−ロイシンとともに１時間インキュ
ベートされた。蛋白内への3H−ロイシンの取込みを測定
した。パネル3Bにおいて、Swiss3T3細胞は天然シュード
モナストキシン（PE）、HB21に結合した天然シュードモ
ナストキシン、またはPE45のみ若しくはHB21と結合した
PE45のいずれかと24時間インキュベートされた。細胞を
これらの薬剤に24時間さらし、上記の方法で蛋白合成を
測定した。 発明の詳細な開示 好ましい実施例において、；本発明は、修飾により活
性イムノトキシンとなる修飾シュードモナスエクソトキ
シン（PE）を製造することである。それから作られた修
飾毒素とそのイムノトキシンは組織細胞培養液内のヒト
とマウスの細胞に対する非特異的毒性が著しく減少し、
マウスの生体内細胞においても、毒性が大きく減少して
いる。 ゲノムDNAは緑膿菌の菌株をEcoR IとPst Iで完全に消
化して得られる。緑膿菌のどの菌株でも本発明の使用に
適しているが、大量の活性毒素を生産するPA103が最適
菌株である。長さ2.6〜2.9kbのDNA断片がゲノムDNAライ
ブラリーから分離される。この断片は、EcoR IとPst I
でpUC13プラスミドを切って得られる長さ2.7kbのDNA断
片に連結される。pUC13プラスミドはBoehringerMannhei
mより入手可能である。適した宿主は、好ましくは大腸
菌（E.coli）で、上記の組換えプラスミドで形質転換さ
れる（好ましい大腸菌の菌株は、HB101でこれはBethesd
aResearchLaboratoriesから入手可能である）。 ptoxETAすなわちPE構造遺伝子を含むプラスミドから
得られた長さ2.7kbのDNA断片をプローブとして用い、い
くつかの陽性コロニーからプラスミドDNAが調整され、
ザザーンブロット法により同定される。次いで、異なっ
た大きさの修飾PEが好適な宿主中で発現される。溶菌性
でかつ［BL21（DE3）］から誘導され得るバクテリオフ
ァージT7RNAポリメラーゼ遺伝子を有する宿主が、好ま
しく、この宿主はBrookhaven National Laboratories
のF.W.Studier博士から入手可能である。同様にF.W.Stu
dier博士から入手可能である、バクテリオファージ後期
T7プロモーター（lateT7promoter）とAMP′とShine−Da
lgarno box−−pAR2156を持ったプラスミドが好まし
い。例に示すように、好ましいプラスミドは、pJH8とpJ
H17である。pJH8は5.1kbのDNA断片で、PEのドメインI
I、I b、IIIを発現可能である。このプラスミドは、プ
ラスミドpJH4をAva Iで部分的に切って製造される。線
状に作られたDNA断片は、Ava IとHind IIIの認識サイト
をもった5.1kbの断片を得るために、Hind IIIで完全に
切られる。 この断片はその付着端を取り除くために、S1ヌクレア
ーゼを加えてインキュベートし、次にプラスミドpJH8を
作るために、T4リガーゼを加えて連結した。 プラスミドpJH17は4.8kbのDNA断片を含み、PEの隣り
合った20のアミノ酸と共にドメインIIIを発現可能であ
る。このプラスミドは、プラスミドpJH4をApa IとHind
IIIで完全に切って作られる。そして、4.8kbのDNA断片
は分離され、付着端を埋めるためにKlenow DNA ポリ
メラーゼＩ及びdNTPと共にインキュベートされ、続いて
T4リガーゼで連結される。 BL21（DE3）中における組換え毒素の発現 異なったサイズのPEを発現するプラズミドを含むBL21
（DE3）は37℃の50μg Ampicillin/ml含むLB培地で培養
される。波長650nmで吸光度が0.3に達した時に、IPTG
（isopropyl beta−Ｄ−thio−galatopyranoside）を
濃度1mMになるように培養液に加える。90分後細胞に回
収し、組換え毒素の量を、SDS−PAGE、免疫ブロット
法、ADPリボシル化、細胞傷害実験により分析した。 SDS−PAGE、免疫ブロット法 細胞沈澱はLaemmli緩衝液で溶解される。試料を0.1％
SDS、10％アクリルアミドのスラブゲルに掛ける前に５
分間煮沸した。免疫ブロット法を行なうために、電気泳
動後の試料をニトロセルロースフィルターに移し、次に
PEに対する抗体と反応させ、その後第２の抗体（抗ウサ
ギ−ヤギ）と反応させ、染色する。PEに対する抗体は、
PEと反応させた（PE250μｇずつの接種）グルタルアル
デヒド（0.2％）で高度に免疫したウサギから得られ
る。免疫ブロット法のために、IgG分画が調製される。 ADPリボシル化活性検定 従来法によりADPリボシル化活性検定を行なった。簡
単に言えば、ウサギ網状赤血球調製液または、ペプチド
鎖延長因子２（EF−２）を富化した小麦胚芽エキスをEF
−２源として用いた。検定液（全500μ）は約10pmole
のEF−２と、37pmoleの14C−NAD（0.06uCi）と、0.25〜
1.25μｇのpEと、緩衝液（40mM DDT、1mM EDTA、50mM
Tris、pH8.1）とを含んでいる。活性は30分間にEF−
２に転移したNADのpmole数として測定される。既知濃度
のPEの標準曲線は確定されており、大腸菌抽出エキスの
PE活性を決定するためにこの標準曲線が使用される。37
℃で30分間インキュベートした後、0.5ml、12％TCAが各
定量用混合液に加えられる。定量用混合液はその後15分
間氷浴され、続いて４℃、3000xgで10分間遠心分離し
た。沈澱を1ml 6％のTCAで洗浄し、同様に遠心分離し
た。その後液体シンチレーションカウンターで沈澱の14
C放射能を測定することによりADPリボシル化活性の指標
とした。 細胞傷害性テスト 修飾PEの細胞傷害活性のテストはNIH 3T3細胞株とヒ
トKB細胞を用いて行なわれる。NIH 3T3細胞又はヒトKB
細胞は、細胞傷害活性テスト前に、24区画の組織培養プ
レートで１区画２×104細胞密度で24時間静置される。P
Eの異なった濃度液または、異なったサイズのPEを発現
するプラスミドを持ったBL21（DE3）から分離された蛋
白抽出液と48時間インキュベートし、生残った細胞を見
付けるために、その単層をメチレンブルーで染色した。
その結果を第１表に示した。 蛋白合成の阻害 PEによる、あるいはB121（DE3）/pJH8から得た抽出物
とPEによる蛋白合成阻害の検定は、Swiss3T3細胞株にお
いて行なわれる。Swiss3T3細胞は、定量１日前に24区画
の組織培養プレートで１区画105細胞密度で培養器に植
え込まれる。細胞は、PE（100ng/ml）または大きさの異
なるPE（第２表）を過剰に含む抽出液を有したPE（100n
g/ml）を加える前に、培養液をDMEMと0.2％のBSAと取替
える事により一度洗浄された。 37℃で15分経過後、培地は除かれ、代わりに新鮮なDM
EMと0.2％のBSAが入れられる。４時間後、培地に１時間
［3H］ロイシン（最終濃度２−4uCi/ml）を加えて蛋白
合成割合が測定される。 本発明の好ましい実施例において、上記したようにシ
ュードモナスエクソトキシン遺伝子の構造ドメインはT7
発現ベクターのリボゾーム結合領域の下流に組入れら
れ、それはATG開始コドンを伴っている（第１図参
照）。できた組換え蛋白産生の細胞を37℃でA650＝0.3
まで成長させた。T7RNAポリメラーゼを誘導するために1
mMのIPTGが加えられ、２時間インキュベートされた。例
１に示すように、一連のプラスミドが製造される。 次に、プロセッシングされた天然PE（第１表）におけ
るアミノ末端のアラニンに接近してメチオニンが配列し
ており、リーダー配列のないPE分子をコードするクロー
ン（pJH4）を構成した。pJH4により製造された蛋白をMe
t−PEと表わす。全細胞蛋白の20％を占める大量のMet−
PEがIPTGによる誘導により製造される。天然PEの0.1mg
に相当するADPリボシル化活性がその上清に認められ
た。また全細胞蛋白の1mg当り0.2mgの天然PEに相当する
ADPリボシル化活性がその沈澱に認められた。pJH4によ
り製造されたPE分子はアミノ末端に１つの余分のメチオ
ニン残基がある点で天然のPE分子とは異なる。 上述したようにpJH4により製造されたpJH8は、ドメイ
ンI aのほとんどを欠失した蛋白（添加メチオニンとア
ミノ末端の３つのアミノ酸のみをアミノ末端に保持して
いる）を発現する。 免疫ブロット法により、この蛋白は45kbで、ほぼ0.04
mg/mg細胞蛋白の濃度であることが分かった。その反応
混合液から尿素とDTTを除くと、高いADPリボシル化活性
を示す。天然PE（尿素とDTTを加えると、高いADPリボシ
ル化活性を示す）とは対照的に、pJH8に尿素とDTTを加
えると、ADPリボシル化活性は低下する（約30％）。 PEのADPリボシル化活性は分子のカルボキシル末端に
よるものであるので、pJH4から構成される（上記の様
に）プラスミドpJH17が生産される。このプラスミド
は、ドメインIIIとドメインI bの20アミノ酸を含む。こ
のプラスミドからの抽出物は、0.06mgPE（第１表）に相
当する高いADPリボシル化活性を含んでいる。免疫ブロ
ット法により、31kdの蛋白が検出された。この蛋白は、
濃度0.03mg/mg細胞蛋白の濃度で存在する。 上記の（および後期の例で説明する）方法で製造され
たプラスミドは、pJH1、pJH2、pJH4を除いて、いずれも
顕著な細胞破壊能を示さない。しかし、これらの多くは
高い酵素活性を示す（第１表）。これらのプラスミド
は、細胞を種々の修飾された毒素３−５μg/mlの存在下
で0.1μg/mlの天然PEに15分間さらすことによって、蛋
白合成の阻害または天然PEによる細胞破壊を防止するこ
とが示される。第３表のデーターにより、ドメインI a
のみ、若しくはドメインＩ、ドメインIIの半分及びドメ
インIIIのいずれかを発現しているプラスミドは、PEの
蛋白合成阻害を妨げることがわかる。 動物毒性 天然PEを投与されたマウスは肝臓傷害による死亡す
る。20グラムのマウスでは0.1〜0.2μｇが致死量とな
る。第４表は、ドメインI aを欠失しているPEはマウス
に対する毒性を著しく減じるものであることを示してい
る。マウスの腹腔内に、天然PEまたはドメインI aを欠
如している天然PEを注射した。天然PE1.0μｇを投与さ
れたすべてのマウスと、0.2μｇのPEを投与された1/2の
マウスが40時間で死んだ。PE I a50μｇを投与された３
匹のマウスの内２匹が死んだ。PE I a20μｇを投与され
たすべてのマウスは生存した。PE I aを５μｇを投与さ
れたすべてのマウスも生存した。従って、PE I aは天然
PEより体重当りの毒性が100分の１より少なかった。 修飾されたシュードモナスエクソトキシンの組換え体を
利用した遺伝子融合 本発明の修飾PEのためのPEの遺伝子のうち、特にpJH8
に含まれる遺伝子を、ヒトα形質転換成長因子（ａ−TG
F）又はヒトインタ−ロイキン２（IL−２）をコードし
ているDNA配列と融合した。例７と８にこれらの遺伝子
融合の詳細を示した。ペプチドホルモン、成長因子、ま
たはその特異的受容体が細胞表面に存在する他のいかな
るポリペプチド細胞認識蛋白との融合においても、修飾
されたPEの使用は適している。いくつかの実施例はイン
シュリン、グルカゴン、エンドルフィン、成長ホルモ
ン、メラニン細胞刺激ホルモン、トランスフェリン、ボ
ンベシン、低密度のリポ蛋白、黄体形成ホルモン（lute
inizing nor more）、アシアログリコ蛋白を含んでい
る。 例 例１ 第１表に示すように、本発明のプロセスは、異なった
サイズのPE構造遺伝子とT7後期ブロモーターの融合を含
んでいくつかのプラスミドを構成するために用いられ
た。pJH2は、修飾リーダー配列をコードする断片を前方
に有する、無傷のPE構造遺伝子を含んでいる。pJH4は、
アミノ末端にメチオニンコドンを付加した無傷のPE構造
遺伝子を含んでいる。pJH7は、PEの構造ドメインIII
（アミノ酸405−613）をコードする遺伝子を含んでい
る。pJH8は、PEの構造ドメインII、I b及びIII（アミノ
酸253−613）をコードする遺伝子を含んでいる。pJH13
は、アミノ酸253−307を含む構造ドメインIIの最初の半
分を欠失したPEをコードしている。pJH14はPEの構造ド
メインI a（アミノ酸１−252）をコードしている。pJH1
7は、構造ドメインI bから20のアミノ酸の付加近接配列
を有した、構造ドメインIIIをコードしている（アミノ
酸385−613）。 pJH1は天然PE（pE0）をBamH Iで部分的に切断し、そ
して、直鎖状のDNAを溶出させ、EcoR Iで完全に切って
構成された。pE0から誘導された2.0kbのDNA断片は、２
つの末端にBamH IとEcoR Iのサイトを持ち、BamH IとEc
oR Iで完全に切られたpAR2156に挿入された。 pJH2はpJH1をBamH Iで部分的に切断することによって
構成された。直鎖状のDNAが分離され、Nde Iで完全に切
られた。610kbのDNA断片は下記の合成オリゴヌクレオチ
ド二重鎖と連結してpJH2を構成するために保存された。 pJH4はpJH2をTaq Iで部分的に切断することによって
構成された。直鎖状のDNA（610kb）が分離され、Nde I
で完全に切られた。最も大きいDNA断片（5.9kb）が分離
され、下記の合成オルゴヌクレオチド二重鎖と連結され
た。 pJH7はpJH4をAat IIで部分的に切断することによって
構成された。直鎖状のDNA（5.9kb）が分離され、Hind I
IIで完全に切られた。分離後Aat IIとHind IIIのサイト
を持った4.7kbのDNA断片を、付着蛋白を除くためにS1核
酸分解酵素を加えてインキベートし、続いてT4リガーゼ
で連結した。 pJH8は発明の詳細は開示に記載した様にして構成され
る。 pJH13はpJH4をAva Iで部分的に切断することによって
構成された。直鎖状のDNAが分離され、EcoR Iで完全に
切られた。両端にAva IとEcoR Iの切断末端を持った4.7
kbのDNA断片を、付着端を除くためにS1を加えてインキ
ベートした（DNA断片１）。pJH4をSal Iで部分的に切断
した。次いで、直鎖状になったDNA断片をEcoR Iで完全
に切断した。末端にSal IとEcoR Iのサイトを持った1.0
kbのDNA断片を、KlenowDNAポリメラーゼＩ及びdNTPと共
にインキュベートし、付着端を埋めた（DNA断片２）。D
NA断片１（4.7kb）とDNA断片２（1.0kb）を一昼夜４℃
で連結した。 pJH14はpJH4をAva Iで部分的に切断して構成された。
直鎖状のDNAがEcoR Iで完全に切られた。末端にAva Iと
EcoR Iのサイトを持った4.7kbのDNA断片を、付着端を埋
めるためにS1加えてインキュベートし、続いてT4リガー
ゼで連結した。 pJH17は発明の詳細な説明に記載した様にして構成さ
れる。 例２ 組換え毒素（実施例１で述べたプラスミドにより製造
された）の量と活性がSDS−PAGE、ADPリボシル化と細胞
破壊活性により測定された。結果を第１表にまとめた。 例３ 本発明の組換え毒素の特性を試すために、実験をし
た。結果を第２表にまとめた。 例４ 天然PEの存在あるいは非存在下で、種々の欠失の細胞
蛋白合成への影響を決定した。結果を第３表に示した。
構造ドメインI a（pJH14）及び構造ドメインＩと構造ド
メインIIの半分及びIII（pJH13）とを、音波処理した細
胞の沈澱から8M尿素で抽出した。組換え蛋白３−５μｇ
に匹敵するそれぞれの抽出液10μを検定に用いた。構
造ドメインII、I b、III（pJH8）を音波処理したBL21
（DE3）/pJH8細胞の上澄に存在した。組換え毒素２μｇ
に匹敵する抽出液10μを使用した。第３表に示すよう
に、細胞は0.1μg/mlの天然PEの存在あるいは非存在下
で15分間処理され、その後1mlのDMEMで洗われ、DMEMと
0.2％のBSA中で４時間インキュベートし、次いで3H−ロ
イシンと共に１時間インキュベートした。 例５ 第４表に示すように、Balb/cマウスに、殺菌済みの生
理食塩水1.0ml及び殺菌済みのヒトアルブミン10mg/ml中
に含まれている種々の量のPEまたはPE I aを腹腔内注射
することにより、マウスにおける致死量が決定された。
動物は２週間に亘って毎日観察された。すべての死は48
時間で起こった。 例６ 第３図に示すように、pJH8をジスルフィド結合によっ
てヒトトランスフェリン受容体に対する抗体（PE45−HB
21）に結合することによって生産された45kDの蛋白より
なるイムノトキシンは、トランスフェリン受容体（ID50
3ng/ml）を発現したヒト細胞を破壊する。上記のイムノ
トキシンはヒトトランスフェリン受容体を発現していな
いマウス細胞に対しては1000ng/mlでもほとんどあるい
は全く影響がない。これに反して、ジスルフィド結合に
よってHB21に結合された天然PEは、29ng/mlのID50で非
特異的にマウス細胞を破壊する。第３図のデーターは、
PE45−HB21の非特異的毒性がPE−HB21の100分の１ほど
少ないことを示している。 続いて、PE45の分子量が再び測定された。分子量は4
0,000であることが分かった。 例７ α形質転換成長因子PE融合遺伝子の構成 Ava IIサイトをほとんど持っていない小さいプラスミ
ドpVC8を構成するために、pJH8をTrh1111とSph Iで処理
した。pVC31を作製するためにpVC8をAva IIで部分的に
切断し、STu Iサイト、Tth1111サイト及び停止コドンを
含む合成オリゴヌクレオチド（30bp）に連結した。pVC3
1をTth1111で切断し、DNAポリメラーゼ断片であるKleno
w断片を用いて満たし、α−TGF遺伝子（pVC33）を含む
ブラント末端クローンに連結した。α−TGF遺伝子、ｐ
−hTGF−10−925［Derynck etal、細胞、38:287−297
（1984）］をEcoR IとBgl Iで切って322bp断片を得、分
離し、Fnu 4HIで切り、T4ポリメラーゼで処理して152bp
断片を得、次いでPE−αTGF融合遺伝子を製造するため
にこの断片をpVC31に連結した。大腸菌内で発現させる
と、このプラスミドは、α−TGFに対する抗体およびPE
と反応する分子量51,000の蛋白を生産した。 例８ IL−２−PE融合遺伝子の構成 Ava IIによってpVC8を1190の位置で、切断し、3.6断
片を分離し、その一本鎖末端をKlenow酵素を用いて埋
め、脱リン化して断片Ｉを得た。IL−２の1kDの断片を
得るために、クローンPST−５［Galloら、PNAS、（81:2
543−2547（1984）］をPst Iで切断してIL−２の1kD断
片を得、次いで該断片を105と669の位置でBap1286で切
り、T4ポリメラーゼで処理して末端を埋めた。564bp断
片を断片Ｉに連結してpHL−１を製造し、BL21発現細胞
に形質転換した。誘導により、IL−２とPEに対する抗体
に反応し、かつADPリボシル化活性を有する60kDの蛋白
が生産された。 寄託の表示 以下のプラスミドは、Rockville、MarylandのAmerica
n Type Culture Collectionに、それぞれATCC番号を
付してこの出願前に寄託されている。また、この出願が
特許されたときには、寄託の日もしくは最後の寄託申請
から５年後の日から30年または特許存続期間のうちの最
も長い期間だけは維持される。もし、寄託の間に株が突
然変更したり、生育不能になったりした場合は取替えら
れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (73)特許権者 999999999 アドヒヤ，サンカー アメリカ合衆国 メリーランド州 20878 ガイザーズバーグ，キングス・ グラント・ストリート 14400 (72)発明者 パスタン，イラ・エツチ アメリカ合衆国 メリーランド州 20854 ポトマツク，ビオール・マウン テイン・ロード 11710 (72)発明者 フイツツゲラルド，ダビツド・ジエイ アメリカ合衆国 メリーランド州 20902 シルバー・スプリング，ラツ ド・ストリート 1731 (72)発明者 アドヒヤ，サンカー アメリカ合衆国 メリーランド州 20878 ガイザーズバーグ，キングス・ グラント・ストリート 14400 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．81，ｐ．2645− 2649（1984) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．83，ｐ．1320− 1324（1986) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/31 C12P 21/02 C07K 14/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 １．ADPリボシル化活性および細胞膜を通してトランス
    ロケーションする能力を具備した、修飾されたシュード
    モナスエクソトキシンであって、前記修飾されたエクソ
    トキシンが、修飾されていないシュードモナスエクソト
    キシンと比較して、in vitroでヒト若しくは動物細胞に
    対してより低い毒性で、かつin vivoで投与された場合
    に肝臓に対してより低い毒性である修飾された毒素とな
    るのに十分な、天然の毒素の受容体結合ドメインI aの
    修飾を具備するもの。 ２．ターゲッティングキャリアーに融合され、ターゲッ
    ティングされた細胞膜上の受容体若しくは抗原に結合す
    る複合体を形成した請求の範囲第１項に記載の修飾され
    たエクソトキシン。 ３．請求の範囲第２項に記載の複合体であって、前記タ
    ーゲッティングキャリアーが、抗体、ホルモン、成長因
    子、サイトカイン、および他の細胞認識蛋白質よりなる
    群から選択されるもの。 ４．請求の範囲第３項に記載の複合体であって、前記タ
    ーゲッティングキャリアーが抗体であるもの。 ５．請求の範囲第３項に記載の複合体であって、前記成
    長因子がTFG−αであるもの。 ６．請求の範囲第３項に記載の複合体であって、前記サ
    イトカインがインターロイキン−２であるもの。 ７．請求の範囲第４項に記載の複合体であって、前記抗
    体が抗トランスフェリン受容体抗体であるもの。 ８．ADPリボシル化活性および細胞膜を通してトランス
    ロケーションする能力を具備した、修飾されたシュード
    モナスエクソトキシンであって、前記修飾されたエクソ
    トキシンが、修飾されていないシュードモナスエクソト
    キシンと比較して、in vitroでヒト若しくは動物細胞に
    対してより低い毒性で、かつin vivoで投与された場合
    に肝臓に対してより低い毒性である修飾された毒素とな
    るのに十分な、天然の毒素の受容体結合ドメインI aの
    修飾を具備するものを、ターゲッティングされた細胞膜
    上の受容体若しくは抗原に結合するようにターゲッティ
    ングキャリアーに融合した複合体、および薬学的に許容
    しうる担体を含有する組成物。 ９．ADPリボシル化活性および細胞膜を通してトランス
    ロケーションする能力を具備した、修飾されたシュード
    モナスエクソトキシンであって、前記修飾されたエクソ
    トキシンが、修飾されていないシュードモナスエクソト
    キシンと比較して、in vitroでヒト若しくは動物細胞に
    対してより低い毒性で、かつin vivoで投与された場合
    に肝臓に対してより低い毒性である修飾された毒素とな
    るのに十分な、天然の毒素の受容体結合ドメインI aの
    修飾を具備するものを、ターゲッティングされた細胞膜
    上の受容体若しくは抗原に結合するようにターゲッティ
    ングキャリアーに融合した複合体、および薬学的に許容
    しうる担体を含有する組成物の細胞毒性量を、死亡させ
    られる標的細胞に接触することを具備したターゲッティ
    ングされた細胞毒性を達成するための方法。
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