PT85777B - Processo para a producao de exotoxina de pseudomonas recombinantes - Google Patents

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Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE EXOTOXINA DE PSEUDOMONAS RECOMBINANTE
corpos no tratamento das infecções causadas pelas Pseudomonas. Além disso, a proteína codificada somente pelo domínio I pode ser administrada directamente aos pacientes para tratar as infecções causadas pelas Pseudomonas, uma vez que esse dominio vai bloquear a ligação das toxinas às células. Os clones contendo o dominio II e, partj_ cularmente, o clone pJH 12 podem ser fundidos com outras toxinas revelando uma actividade reduzida (tal como a cadeia A da ricina ou a proteína antiviral da phytolacca), a fim de aumentar a sua actividade destruidora das células sem aumentar a sua ligação não especifica às células.
As toxinas são agentes de destrin ção de células extremamente potentes, responsáveis por muitas doenças do homem. Por causa da sua elevada actividade, estes agentes têm sido ligados a anticorpos monoclonais a fim de se formamrem agentes citotôxicos (imunotoxinas) que se ligam às células pretendidas de modo especí fico. Estas imunotoxinas são, portanto, da maior utilidade na terapia do cancro.
A exotoxina A (PE) de Pseudomo nas é uma proteína monomérica (massa molecular 66 kd) extremamente activa, secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inibe a síntese de proteínas em células eucariotas me diante a inactivação do factor de elongamento 2 (EF-2) por meio da catálise da sua ribosilação de ADP (catali sando a transferência da fracção de ADP de NAD oxidado para EF-2).
Impõe-se que o processo de intoxição se desenvolve de acordo com os passos seguintes: Primeiro, a PE liga-se às células através de um receptor específico na superfície celular. Depois, o complexo PE-receptor é internaiizado na célula. Finalmente, a PE é transferida para o citosol, onde inibe enzimaticamente a síntese de proteínas. Crê-se que o processo de transferêii cia ocorre a partir de um compartimento ácido, uma vez que a intoxicação celular é evitada com bases fracas, tal como NH4 +, que elevam o valor do pH nas vesículas ácidas. Uma vez exposto a condições ácidas, o domínio hidrofôbico da PE entra na membrana, do que resulta a formação de um canal através do qual o domínio enzimâtico, sob forma expandida, passa ao citosol.
Imunotoxinas contendo PE são constituídas, fazendo primeiro a PE nativa reagir com imi_ notiolano. Esta reacção serve tanto para introduzir dois novos grupos sulfidrilo usados para ligar um anticorpo à toxina, como para inactivar a ligação da PE ao seu próprio receptor. Este modo de actuar baseia-se na inactivação química dos locais de ligação da PE, a fim de minimizar efeitos secundários não desejados devidos à ligação da PE a células com receptores de PE. Embora este modo de activar tenha um razoável na produção em cultura de tecidos e em murganhos com tumores de um reagente que destrói células de um modo específico, não foi até agora possível administrar mais de 2 ug de imunotoxina com PE a um murga_ nho de 20 g ou 1 mg a um macaco de 3 quilogramas ou 4 mg a um ser humano adulto, por causa dos efeitos tóxicos secundários da imunotoxina. E por isso desejável conseguir administra quantidades superiores de imunotoxinas, a fim de se obter uma maior destruição de células tumorais. 0 presente invento concretiza essa ambição, na medida em que propociona uma imunotoxina de elevada potência e baixa toxicidade. Além disso, e para ultrapassar a dependência atrás referida na inactivação química dos locais de ligação da PE, o presenta invento engloba técnicas de DNA recombinante para obter clones de gene completo da toxina (ou de segmentos dele) a fim de expressar a níveis elevados a molécula da toxina na sua totalidade (ou porções dela) contendo diferentes domínios funcionais, incluindo uma que carece do domínio referente à ligação ã célula. Ver o exemplo 1 para uma análise comparativa destes clones .
A estrutura tridimensional da PE foi determinada por meio de cristorlografia de raios X. Tal como se mostra na Figura 2, a molécula de PE contém três domínios estruturalmente distintos: o Domínio I contém os resíduos de aminoácidos 1 a 252 (Domínio Ia) e 365 a 404 (Domínio lb); o Domínio II contém os resíduos de aminoácidos 253 a 364; e o Domínio III contém os resíduos de aminoácidos 405-613.
Construiram-se plasmídeos que expressam várias porções da molécula de PE, proporcionando a possibilidade de relacionar diferentes domínios estruturais com diversas actividades funcionais e de deter minar (1) quais as porções da molécula responsáveis pelo reconhecimento celular (ligação), (Domínio estrutural I, aminoácidos 1-252); (2) qual a porção necessária para a actividade enzimática (actividade de Domínio III e uma porção do Domínio -613); (3) qual a porção responsável através o domínio estrutural Ia celular é que proteínas produzidos por plasmídeos sem o Domínio Ia mas contendo ribosilação de ADP, Ib) (aminoácidos 385pela
II). A prova de que no translocação da membrana celular (Domínio está envolvido reconhecimento os Domínios
II
Ib e em si mesmas citotóxicas nem revelam competir na inibição da citoxicidade de toxinas intactas, enquanto que um plamídeo que codifica o Domínio Ia, mas não outros domínios, bloqueia a citotoxicidade a PE de células sensíveis. PE obtida a partir de plasmídeos com a deleção da primeira metade do Domínio estrutural II exibe tanto uma activida de bloquedora da PE como uma actividade de ribosilação de
ADP, mas estas moléculas perderam toda a capacidade de destruir células. Os plasmídeos que codificam apenas o Domínio estrutural III produzem grandes quantidades da proteína, mas não é detectável actividade enzimática (vilosilação de ADP). Contudo, os plasmídeos que codificam a totalidade do Domínio estrutural III e ainda aminoácidos adjacentes do Domínio estrutural Ib expressam graii des quantidades da proteína e a sua actividade de ribosilação de ADP é elevada.
Com base na estrutura tridimensio nal da PE, foram construídos plasmídeos que expressam diferentes porções da PE. A composição proteica das células expressando as diferentes construções foi analisada por meio de electroforese de gel de SDS e a actividade de ribosilação de ADP das toxinas recombinantes foi medida.
De entre estes plasmideos (descritos no Exemplo 1), o plasmldeo pjh8, contendo os aminoácidos 253 a 613 (Domínios Ib, II, e III) e o plasmídeo pjh17, contendo os aminoácidos 385 a 613 (Domínio III, mais vinte aminoácidos adjacentes do Domínio Ib), são capazes de codificar grandes porções da PE modificada exibindo uma baixa toxicidade relativamente às células humanas, mas permanecei! do muito activas enzimaticamente.
Tomadas em conjunto, as composições dos plasmideos indicam que o Domínio estrutural Ia é um domínio de ligação ao receptor, que a primeira metade do Domínio estrutural II é necessária para a translo cação de uma vesícula endocética da célula hospedeira para o citosol, e que o Domínio estrutural III não é por si só suficiente para exprimir a totalidade da actividade de ribosilação de ADP.
Quando administrada a animais, a PE causa de modo característico a sua morte, devida a insuficiência hepática. As imunotoxinas preparadas com PE também atacam o figado e, quando administradas em grandes quantidades, causam a morte devido à toxidade em relação ao figado. As expreriências apresentadas no Quadro III indicam que o Domínio Ia é responsável pela ligação à célula e indicam que uma molécula de PE da qual o Domínio Ia foi eliminado, é menos tóxica para os murganhos que a PE nativa. Os dados apresentados no Exemplo 4 vêm apoiar esta conclusão, indicando que a PE modificada é pelo menos 200 vezes menos tóxica para os murganhos que a PE nativa. 0 Exemplo 5 revela que quando a proteína obtida a partir de pjh8 é purificada e ligada a um anticorpo para o receptor de transfenina humano, ê criada uma imunotoxina que é, aproximadamente, tão activa como uma imunotoxina contendo a PE nativa, mas é 100 vezes menos tóxica em células que não são pretendidas (células de murganho):
Por conseguinte, constitui um aspecto deste invento, o facto de moléculas de PE de que se eliminou o Domínio Ia serem imunotoxinas eficazes com efeitos secundários reduzidos, incluindo uma toxicidade em relação ao fígado diminuída.
Descrição das Figuras
A Figura 1 mostra a construção dos plasmídeos do presente invento usados para a expressão dos diferentes domínios da PE.
A Figura 2 é um mapa simplificado das moléculas de PE de diferentes tamanhos produzidas no âmbito do presente invento.
A Figura 3 mostra o efeito de
PE45-HB21 e PE-HB21 na síntese de proteínas em células KB humanas.
é a toxina a que falta o Domínio I codifi cado pelo plasmídeo pjh8. As células foram incubadas du rante 24 horas com a imunotoxina apropriada e depois inc^j
O badas com H-leucina durante 1 hora. A incorporação de ( H)-leucenina na proteína foi medida. Na Figura 3B, célu las swiss 3T3 foram incubadas durante 24 horas, ou com toxina de Pseudomonas nativa (PE), ou toxina de Pseudomonas nativa ligada a HB21, ou ΡΕ^5 isoladamente ou PE45 ligada a HB21. As células foram expostas a estes agentes durante 24 horas e depois a síntese de proteínas foi med^ da durante 1 hora, tal como atrás se referiu.
Apresentação Específica do Invento
Na execução preferida, o presente invento consiste na produção de uma forma modificada de Exotoxina de Pseudomonas (PE), caracterizado por essa modificação resultar numa imunotoxina activa. A toxj_ na modificada e a imunotoxina feita a partir dela apresen tam uma toxidade não específica em relação a células humanas e de murganho em cultura de tecidos acentuadamente reduzida, e uma toxicidade em relação a murganhos in vivo grandemente reduzida.
DNA genómico é obtido mediante digestão completa de uma estirpe de Pseudomonas aeruginosa com EcoRI e PstI. Embora qualquer estirpe de P. aeruginosa seja adequada para utilização neste invento, a estirpe preferida é a PA103, uma estirpe que produz uma grande quantidade de toxina activa. Fragmentos de DNA com dimensões entre 2,6 e 2,9 Kb são isolados do conjunto do DNA genómico e ligados a um fragmento de DNA de 2,7 Kb do plasmldeo pUC13, cortado com EcoRI e PstI. 0 plasmídeo pUC13 é comercializado por Boehringer, Mannheim. Um hospedeiro adequado, de preferência uma estirpe de E. coli é depois transformada com os produtos ligados (a estirpe de E, coli preferida é a HB1O1, que é comercializada por Bethesda Research Laboratories). 0 fragmento de DNA de
2,7 Kb derivado de ptoxETA, um plasmídeo que contém o gene estrutural da PE, é usado como sonda e DNA de plasmídeos de várias colónias positivas foram preparadas e caracterizados pela técnica de Southern blotting. Os diferentes tamanhos de PE recombinante foram depois expressos num hospedeiro adequado, Prefere-se um hospedeiro que possua o gene da RNA polimerase do bacteriífago T7 numa forma lisogénica e induzível /T3L21 (DE3L7, que pode ser obtido do Dr. F. W. Studier nos Brookhaven National Laboratories. São também preferidos os plasmídeos que possuem promotor tardio do bacteriõfago T7 e AMPr e Shine-Dalgarno box--pAR2156, que também podem ser obtidos do Dr. Studier.
Tal como se mostra nos Exemplos, os plasmídeos preferidos são o pjH8 e o pJH17. pJH8 contém um fragmento de DNA de 5,1 Kb e pode expressar os Domínios II, Ib e III da PE. Este plasmídeo é produzido mediante corte parcial do plamídeo pJH4 com Ava I. 0 fragmento de DNA linearizado ê depois completamente cortado com HindIII a fim de se obter um fragmento de DNA de 5,1 Kb possuindo locais Aval e HindIII nas extremidades. Este fragmento é depois incubado com S1 nuclease para remoção das suas extremidades coesivas, seguindo-se ligação com ligase de T4 a fim de dar origem ao plasmídeo pJH8.
plasmídeo pJH17 contém um fragmento de DNA de 4,8 Kb e pode expressar o Domínio III com os 20 aminoâcidos adjacentes da PE. Este plasmídeo é produzido cortando completamente o plasmídeo pJH4 com HindIII e Apal. 0 fragmento de DNA de 4,8 kb é depois isolado e incubado com Klenow DNA polimerase I e dNTP para preencher extremidades coesivas, seguindo-se ligação com ligase de T4.
Expressão de Toxinas Recombinantes em BL21(DEg)
BL21(DEg) contendo plasmídeos para a expressão de diferentes porções de PE ê cultivada num caldo LB com 50 mg de Ampici1ina/ml a 37eC. Quando a absorção a 650 nm atinge o valor 0,3, adiciona-se IPTG (isopropil beta-D-tio-galactopiranosida) à cultura de modo a obter-se uma concentração final de 1 mM. Faz-se a colheita das células 90 minutos mais tarde e analisa-se relativamente à quantidade de toxinas recombinantes por
meio das técnicas de SDS-PAGE,immunoblotting, riboxilação de ADP e experiências de destruição de células.
SDS-PAGE e immunoblotting
Sedimentos de células são dissolvidas em solução tampão Laemmil. Amostras são fervidas durante 5 minutos antes de serem aplicadas sobre uma placa de gel, 0,1% de SDS, 10% de acrilamida. Para a técnica de immunoblotting, as amostras são transferidas depois da electroforese para um papel de mitrocelulose, seguindo-se a reacção com anticorpo relativamente a PE, depois com um segundo anticorpo (goat anti-rabbit) e aplicação de um corante. 0 anticorpo relativamente a PE é obtido mediante hiperimunização de coelhos com PE que se fez reagir com 0,2% de glutaraldeído (0,2%) (250 ug de PE por injecção). Uma fracçao IgG foi preparada para a técnica de immunoblotting.
Ensaio da Actividade de Ribosilação de ADP
São utilizados procedimentos conhecidos para o ensaio de actividade de ribosilação de ADP. Brevemente, preparações de reticulócito de coelho ou extractos de gérmen de trigo enriquecidos com o factor de elongamento 2 (EF-2) são usados como fonte de EF-2. Os ensaios (500 ml volume total) contêm cerca de 10 pmole de EF-2, 37 pmole de 14C-NAD (0,06 u Ci), 0,25 a 1,25 ug de PE e solução tampão (40 mM DTT, 1mM EDTA, e 50 mM Tris, pH 8,1). A actividade é medida em termos de pmoles de NAD transferidas para EF-2 em 30 minutos. Uma curva de calibração de concentrações de PE é estabelecida e usada para determinar a actividade da PE em extractos de _E. col i.
Após incubacão durante 30 minutos a 37eC, 0,5 ml de TCA a 12% são adicionados a cada mistura de ensaio. As misturas de ensaio são depois colocados num banho de gelo durante 15 minutos, seguindo-se centrifugação a 49C, 3,000 xg durante 10 minutos. 0 sedimento é lavado com 1 ml de TCA a 6% e centrifugado tal como atrás se referiu. Fazem-se depois medições no sedimento relativamente à radio14 actividade de C num aparelho de contagem de cintilações em liquido, como indicador da actividade de ribosilação de ADP.
Teste da Citotoxicidade nas células
Testes da actividade citotóxica da PE modificada são realizados em culturas de células NIH 3T3 e em células KB humanas. Células NIH 3T3 ou KB são cultivadas durante 24 horas antes da realização do teste de citotoxidade numa placa de cultura de tecidos de 24 orifícios a uma densidade de 2x10^ células por orifício. Após incubação durante 48 horas com várias concentra ções de PE ou extractos de proteína isolados a partir de BL21 (DEg) com plasmídeos que expressam diferentes porções da PE, as monocamadas são coradas com azul de metileno para detecção das células sobreviventes. Os resultados estão indicados no Quadro 1.
Inibição da Síntese de Proteínas
Ensaios para a inibição da síntese de proteínas por PE ou PE com extractos de BL21(DEg)/pJH8 são realizados em culturas de células Swiss 3T3. As células Swiss 3T3 são cultivadas um dia antes do ensaio em placas de cultura de tecidos de 24 orifícios a
uma densidade de 10 células por orifício. As células são lavadas uma vez mediante a substituição do meio por DMEM e BSA a 0,2% antes de se adicionar PE (100 ng/ml)ou PE (100 ng/ml) com extractos contendo em excesso de diferentes porções de PE (Quadro 2). Após 15 minutos a 379C, o meio ê removido e substituído por DMEM e BSA a 0,2% frescos. Quatro horas mais tarde, determina-se a taxa.de síntese de proteína adicionando ao meio ( H) leucina (de modo a obter uma concentração final de 2-4 uCi/ml) durante 1 hora.
Na execução preferida do invento o domínio estrutural do gene de exotoxina de Pseudomonas é inserido num vector de expressão T7 a jusante do local de ligação do riboroma e do cordão de iniciação ATG que o acompanha (tal como se mostra na Figura 1), tal como :atrás se descreveu. Para produzir proteínas recombinantes, células são cultivadas a 379C até se obter um valor A65Q = 0,3. Adiciona-se então IPTG a uma concentração de 1mM para induzir a RNA polimerase de T7 e incuba-se durante 2 horas. Produz-se uma série de plasmídeos, tal como se mostra no Exemplo 1.
Em seguida , constroi-se um clone que codifica uma molécula de PE sem uma sequência líder (pJH4) e em que se coloca uma metonina ao lado da alamina na terminação amino da forma processada da PE nativa (Quadro 1). A proteína produzida por pJH4 é denomunada Met-PE. São produzidas grandes quantidades de Met-PE após a indução por intermédio de IPTG, representando 20% da totalidade das proteínas da célula. Actividade de ribosilação de ADP equivalente a 0,1 mg de PE nativa é encontrada no sobrenadante, e 0,2 mg no sedimento por mg da totalidade das proteínas da célula. A molécula de PE produzida por pJH8 difere das moléculas de PE nativas pela presença de uma metionina adicional na terminação amino.
pJH8, produzido a partir de pJH4 tal como atrás se referiu, exprime uma proteína na qual a maior parte do Domínio Ia foi eliminador (conservando-se apenas a metionina adicionada e três aminoácidos na terminação amino). A técnica de immunoblotting revela que esta proteína tem 45 kd e é expressa numa concentração de aproximadamente 0,04 mg/mg de proteínas da célula. Uma elevada actividade de ribosilação de ADP é exibida quando se exclui da mistura de reacção ureia e DTT. Em contraste com a PE nativa (em que a adição de ureia e DTT activo a ribosilação de ADP), a adição de ureia e DTT a pJH8 reduz (em cerca de 30%) a actividade de ribosilação de ADP.
Porque a actividade de ribosilação de ADP da PE reside na extremidade carboxilo da molécula, produziu-se o plasmídeo pJH17, construído a partir de pJH4 (tal como se referiu acima). Este plasmídeo contém o Domínio III e 20 aminoácidos do Domínio Ib. Extractos deste plasmídeo contêm niveis elevados de actividade de ribosilação de ADP, equivalentes a 0,06 mg de PE (Quadro 1). Pela técnica de immunoblotting foi detectada a presença de uma proteína de 31 kd, numa concentração de 0,03 mg/mg de proteínas da célula.
Nenhum dos plasmídeos produzidos pelo processo atrás referido (e descritos nos Exemplos), à exepção de pJH1, pJH2 e pJH4 exibem uma capacidade de destruir células significativa, apesar de muitos deles exibirem uma elevada actividade enzimática (Quadro 1). Estes plasmídeos revelam evitar a inibição da síntese de proteínas ou a destruição das células pela PE nativa, quando se expõe células durante 15 minutos a PE nativa numa concentração de 0,1 ug/ml, na presença de 3-5 ug/ml de várias toxinas modificadas. Os dados do Quadro III mostram que os plasmídeos que exprimem, quer o Domínio Ia isoladamente, quer o Domínio I, metade do Domínio II e o
Domínio III, evitam que a PE iniba a síntese de proteínas.
Toxicidade em Relação a Animais
Murganhos tratados com PE nativa morrem devido à destruição do figado. A dose letal para um murganho de 20 gramas ê de 0,1-0,2 ug. Os dados referidos no Quadro IV revelam que a PE com a eliminação do Domínio Ia apresenta uma toxicidade nos murganhos consideravelmente reduzida. Murganhos foram injectados intraperito nealmente, quer com PE nativo, quer com PE a que faltava o Domínio Ia. Todos os murganhos que receberam 1,0 ug de PE nativa e metade dos que receberam 0,2 ug de PE morreram num intervalo de 48 horas. Dois dos três murganhos que receberam 50 ug de PEIa morreram, todos os que receberam 20 ug de PE Ia sobreviveram; e todos os murganhos que receberam 5 ug PE Ia sobreviveram. Por conseguinte, PE Ia é mais de 100 vezes menos toxico do que a PE nativa com base no peso.
Fusão de Genes Usando Exotoxina de Pseudomonas Modificada Recombinante gene de PE modificada deste invento, contido especificamente em pJH8, foi fundido com sequências de DNA codificando o factor de crescimento de transformação alfa humano (a-TGF) ou a interleuquina 2 humana (il-2). Ver os Exemplo 7 e 8 para os promenores relativos a estas fusões de genes. A PE modificada pode ser usada em fusões com qualquer hormona peptídica, factor de crescimento ou outra proteína de reconhecimento celular polipeptídica para os quais exista nas células um receptor específico. Alguns exemplos incluem: insulina,
-15glucagen, endofinas, hormona de crescimento, hormona de estimulação do melanócito, transferrina, bombesina, lipoprotéinas de baixa densidade, hormona de luteinização, e asialoglicoproteínas.
EXEMPLOS
EXEMPLO 1
Tal como se revela no Quadro 1, o processo do presente invento foi usado para construir vários plasmídeos contendo fusões de diferentes porções do gene estrutural da PE e do promotor tardio de T7. pJH2 contém o gene estrutural da PE intacto com um segmento que codifica uma sequência líder modificada à frente . pJH4 contém o gene estrutural da PE intacto com a adição de um codão de metionina na terminação amino. pJH7 contém o gene que codifica o Domínio estrutural III da PE (aminoácidos 405-613). pJH8 contém o gene que codifica o Domínio estrutural II, lb e III da PE (aminoácidos 253-613). pJH13 codifica PE com a eliminação da primeira metade do domínio estrutural II englobando os aminoácidos 253-307. pJH14 codifica o domínio estrutural Ia da PE (aminoácidos 1-252). pJH17 codifica o Domínio estrutural III com uma sequência adjacente adicional de 20 aminoâcidos do Domínio lb (aminoácidos 385-613).
pJH1 foi construído constando parcialmente a PE nativa (pE 0) com BamHI tendo a forma linear de DNA sido eluída e cortada completamente com EcoRI. 0 fragmento de DNA de 2,0 kb derivado de pE 0, que tem locais BamHI e EcoRI nas duas extremidades, foi depois inserido em pAR 2156, que tinha sido completamente cortado com BamHI e EcoRI.
pJH2 foi construído cortando parcialmente pJH1 com BamHI. A forma linear de DNA foi isolada e completamente cortada com Ndel. 0 fragmento de DNA de 610 kb foi aproveitado para se construir pJH2, ligando-o com o duplex oligonucleótido sintético
5' T AT GA A A A A A C T T T T T C T A G 5' pJH4 foi construído cortando par cialmente pJH2 com Taql. 0 DNA linearizado (610 kb) foi isolado e cortado completamente com Ndel. A fragmento maior de DNA (5,9 kb) foi separado e ligado com o duplex oligonucléotido sintético.
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A C C G G C T T C T T C G A A A G C 5’ (que contém um local HindIII --AAGCTT).
TTCGAA pJH7 foi construído cortando parcialmente pJH4 com AatlI. 0 fragmento de DNA linearizado (5,9 kb) foi depois completamente cortado com HindIII. 0 fragmento de DNA de 4,7 kb que tem locais AatlI e HindIII nas extremidades após separação foi incubado com S1 nuclease para remoção das extremidades coesivas, seguindo-se ligação com ligase de T4.
pJH8 foi construído tal como se descreveu na apresentação específica do invento.
-17pJH13 foi construído cortando parcialmente pJH4 com Aval. 0 fragmento de DNA linearizado foi depois completamente cortado com EcoRI. 0 DNA de 4,7 kb que tem cortes Aval e EcoRI em ambas as extremidades foi incubado com S1 para remoção das extremidades caesivas (fragmento de DNA 1). pdH4 foi parcialmente cortado com Sal I. 0 fragmento de DNA linearizado foi depois completamente cortado com EcoRI. 0 fragmento de DNA de 1,0 kb que tem locais Sall e EcoRI nas extremidades foi incubado com klenow DNA polimerase I e dNTP, para preenchimento das extremidades coesivas (fragmento de DNA 2). 0 fragmento de DNA 1 (4,7 kb) e o fragmento de DNA 2 (1,0 kb) foram ligados a 4SC, de um dia para o outro.
pJH14 foi construído cortando par cialmente pJH4 com Aval. 0 fragmento de DNA limerizado foi depois completamente cortado com EcoRI. 0 fragmento de DNA de 4,7 kb que tem locais Aval e EcoRI nas extremidades foi incubado com S1 para remoção das extremidades coesivas, seguindo-se ligação com ligase de T4.
pJH17 foi construído tal como se descreve na apresentação específica do invento.
EXEMPLO 2
As técnicas de SDS-PAGE e ribosilação de ADP e a análise da capacidade de destruição de células foram usadas para medir a quantidade e actividade das toxinas recombinantes (produzidas pelos plasmídeos descritos no Exemplo 1). Os resultados são indicados no Quadro 1.
EXEMPLO 3
Realizaram-se experiências para determinar a toxicidade das substâncias recombinantes do presente invento. Os resultados são indicados no Quadro 2.
EXEMPLO 4 efeito das várias deleções sobre a síntese de proteínas na célula foi determinado, na presença e na ausência de PE nativa. Os resultados são indicados no Quadro 3. 0 Domínio Estrutural Ia (pJH14) e o Domínio estrutural I, metade de II, e III (pJH13) foram extraídos do sedimento das células sonicadas com ureia 8M. 10 ul de cada extracto, equivalente a 3-5 ug de proteínas recombinantes, foram usadas em cada ensaio. Os Domínios estruturais II, Ib e III (pJH8) estavam presentes no sobrenadante das células BL21(DE^)/pJH8 sonicadas. Foram usados 10 ul de extracto equivalentes a 2 ug de toxina recombinante. As células foram tratadas tal como se indica no Quadro 3 durante 15 minutos com e sem PE nativa na concentração de 0,1 ug/ml, seguindo-se uma lavagem com 1 ml de DMEM; incubação durante 4 horas em DMEM e 0,2% de BSA, e depois incubação com H-lencina durante 1 hora.
EXEMPLO 5
Tal como se indica no Quadro 4, a dose causando a morte nos murganhos foi determinada injectando murganhos Balb/c intraperitonealmente com quantidades variáveis de PE ou PE Ia contidas em 1,0 ml de soro fisiológico esterilizado e 10 mg/ml de albumina humana esterilizada. Os animais foram observados diariamente durante duas semanas. Todas as mortes ocorreram num espaço de 48 horas.
EXEMPLO 6
Tal como se indica na Figura 3, uma imunotoxína composta pela proteína de 45 kD produzida por pJH8 conjugada por meio de uma ligação dissulfureto a um anticorpo relativamente ao receptor de transferrina humana (ΡΕ^^-ΗΒ21) destrói as células humana que expressam o receptor de transferrina (ID5Q 3ng/ml). Tem um efeito ínfimo ou nulo em células de murganho que não ex pressam o receptor de receptor de transferrina humana a uma conçentração de 1000 ng/ml, enquanto que a PE nativa conjugada por meio de uma ligação sulfureto a HB21 des trói sem especificidade células de murganho a um valor de IDçq de 29 ng/ml. Os dados na Figura 3 indicam que a toxicidade não específica de PE45-HB21 é 100 vezes inferior à de PE-HB21.
EXEMPLO Ί
Construção do gene de fusão factor de crescimento de transformação alfa-PE. pJH8 foi tratado com Tth 1111 a fim de se construir um plasmídeo mais pequeno, pVC8, com menos locais Avall. pVC8 foi cortada parcialmente com Avall e ligado a um oligonucléotido sintético (30 bp) que contém um local STuI, um local Tth 1111, e um codão de paragem, de modo a criar pVC31. pVC31 foi cortado com Tth 1111 e preenchido com um fragmento Klenow, um fragmento de DNA polimerase, e ligado a um clone de extremi-ΣΟ-
dades rombas contendo o gene alfa-TGF (pVC33). 0 DNA de alfa-TGF, p-hTGF-10-925 /Derynck et al., Cell, 38:287-297 (1984)7 foi cortado com EcoRI e Bgll para dar origem a um fragmento de 322 pb que foi isolado e cortado com Fnu 4HI e tratado com polimerase de T4 para dar origem a um fragmento de 152 pb que foi por sua vez ligado a pVC31 a fim de se criar o gene de fusão PE-alfa TGF. Quando expresso em E. coli B121, este plasmídeo produz uma proteína que reage com anticorpos relativamente a alfa-TGF e a PE e que tem uma massa molecular de 51000.
EXEMPLO 8
Construção do Gene de Fusão IL-2-PE pVC8 foi cortado com Avall na posição 1190, o fragmento de 3,6 foi isolado, as suas extremidades de cadeia simples preenchidas com enzima de Klenow e, desfosforilado para dar origem ao fragmento I. 0 clone PST-5 /Gallo et al., PNAS, 81:2543-2547 (1984)7 foi cortado com Bsp 1286 nas posições 105 e 669 e tratado com polimerase de T4 para preenchimento das extremidades. 0 fragmento de 564 pb foi ligado ao fragmento I a fim de se criar pHL-1 e transformado em células de expressão de BL21. Aquando da indução, foi produzida uma proteína de 60 kd que reage com anticorpos relativamente a IL-2 e a PE, e que possui actividade de ribosilação de ADP.
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N.D. = não determinado a = agregado o = positivo pela técnica Western n = não visivel na SDS-PAGE
QUADRO 2
Construção Domínio Presente Dimensões de Proteína
pJH4 met, I, II, III 68 kd
pJH7 III 28 kd
pJH8 II, lb, III 45 kd
pJH13 I, half of II, III 63 kd
p JH14 Ia 32 kd
pJH17 20 a.a. of lb, III 31 Kd
QUADRO 4
Toxina Dose (ug) Mortes
PE 50 2/3
PE 20 0/3
PE 5 0/3
PE 10 2/3
PE 1.0 3/3
PE 0.3 3/3
PE 0.2 1/2
PE 0.1 0/3
QUADRO 3
3
Incorporação em H-leucina (cpm χ 10-)
Domínio testado sem
nenhuma 11,2 +
Ia 11,5 +
II, Ib, & III 11,7 +
I, 1/2 II, III 10,7 +
ureia 8M (10 ul) 11,1 +
PE com PE
(I, II, III)
0,1 2,3 + 0,2
0,15 9,4 + 0,3
0,15 2,4 + 0,2
0,15 9,2 + 0,2
0,1 2,9 + 0,2
Declaração de Depósito
Os plasmideos que se seguem foram depositados na American Type Cultive Collection (Colecção Americana de Culturas Tipo) em Rockville, Maryland, sob os números ATCC respectivos, antes da entrega deste pedido de patente, e aquando da sua concessão serão mantidos durante um período de trinta (30) anos a partir da data de depósito ou de cinco (5) anos após o último pedido de um tal depósito, ou durante o período de vigência da patente, qual deles for o mais prolongado. Os depósitos serão substituídos se as culturas mutarem ou se degradarem durante o termo do depósito:
pJH12 ATCC 67205
pHL-1 ATCC 67206
pVC33 ATCC 67207
pJH8 ATCC 67208
p JH14 ATCC 67209
I

Claims (35)

19. - Processo para a produção de uma proteína ou péptido modificados, em relação aos quais não estão presentes ou não são induzidos anticorpos na generalidade da população humana em que a proteína ou péptido têm um domínio de ligação que normalmente estabelece a ligação a uma célula de mamífero e em que a proteína ou péptido são normalmente tóxicos para a célula de mamífero, caracterizado por compreender as etanas seguintes :
obtenção da proteína ou péptido a partir de uma bactéria, planta ou animal; e modificação da proteína ou péptido mediante remoção do domínio de ligação de uma multiplicidade de aminoâcidos eficaz na eliminação ou redução da sua capacidade de se ligar à célula de mamífero, eliminando ou reduzindo deste modo a toxicidade da proteína ou péptido em relação à célula de mamífero, em que a totalidade do domínio de ligação ou menos do que isso é removida da proteína ou péptido obtidos a partie de uma bactéria ou animal, e menos do que a totalidade do domínio é removida da proteína ou péptido obtidos a partir de uma planta.
29. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína ou péptido modificados conterem uma região polipeptídica que é eficaz no transporte de proteína ou péptido através de uma membrana celular.
39. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína ou péptido modificados serem derivados de exotoxina de Pseudomonas.
42. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a exotoxina de Pseudomonas modificada apresentar uma toxicidade reduzida re lativamente a células de mamífero.
55. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por essa proteína ou péptido modificados serem produzidos por intermédio de técnicas de DNA recombinante.
63. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína ou péptido modificados conterem pelo menos uma parte de uma hormona sendo tal parte eficaz no estabelecimento da ligação a um receptor da hormona, de um factor de crescimento, sendo tal parte eficaz no estabelecimento da ligação a um receptor celular do factor de crescimento, de um anticorpo, sendo tal parte eficaz no estabelecimento da ligação a um antigénio na superfície celular, ou de um antigénio, sendo tal parte eficaz no estabelecimento da ligação à superfície de um linfócito.
72. - Processo para a produção de um plasmídeo contendo DNA que codifica uma proteína ou péptido modificados, em relação aos quais não estão presentes ou não são induzidos anticorpos na generalidade da população humana em que a proteína ou péptido têm um domínio de ligação que normalmente estabelece a ligação a uma célula de mamífero e em que a proteína ou péptido são normalmente tóxicos para a célula de mamífero, caracterizado por se compreender as etapas seguintes: obtenção do DNA da proteína ou péptido a partir de uma bactéria, planta ou animal;
modificação do DNA do domínio de ligação dessa pro-27- teína ou péptido mediante remoção do domínio de ligação do DNA que codifica uma multiplicidade de aminoácidos eficaz na eliminação ou redução da sua capacidade de se ligar à célula Humana, eleminando ou reduzindo deste modo a toxicidade da proteína ou péptidos relativamente à célula de mamífero, em que a totalidade do domínio de ligação ou menos do que isso é removida da proteína ou péptido obtidos a partir de uma bactéria ou animal, e menos do que a totalidade do domínio de ligação é removida da proteína ou péptido obtidos a partir de uma planta;
e inserção desse DNA num plasmídeo que esta adaptado de modo a expressar a proteína num hospedeiro adequadamente transformado.
8â. - Processo para a produção de uma imunotoxina adequada para ser utilizada em seres humanos ou animais, caracterizado por compreender as etapas seguintes:
obtenção de um anticorpo capaz de reconhecer células;
obtenção de uma toxina, em que essa toxina é uma proteína ou um péptido modificado, em relação aos quais não estão presentes ou são induzidos anticorpos na generalidade da população humana, em que a proteína ou péptido têm um domínio de ligação que normalmente estabelece a ligação a uma célula de mamífero e em que a proteína ou péptido são normalmente tóxicos para a célula de mamífero;
modificação da toxina mediante remoção do dominio de ligação de uma multiplicidade de aminoácidos eficaz na eliminação ou redução da sua capacidade de se ligar à célula de mamífero, eliminando ou reduzindo deste modo a toxicidade da proteína ou péptido relativamente à célula de mamífero, em que a totalidade do domínio ou menos do que isso é removida bactéria ou animal, da proteína ou péptido obtido de uma e menos do que a totalidade do domínio de ligação é removida da proteina ou péptido obtidos a partir de uma planta; e conjugação do anticorpo e da toxina.
93. - Processo de acordo com a | reivindicação 8, caracterizado por a toxina ser uma exotoxina de Pseudomonas.
10a. - Processo de acordo coma | reivindicação 9, caracterizado por a exotoxina de Pseudomonas ser enzimaticamente activa mas ter uma toxicidade reduzida relativamente a células de mamíferos.
11a. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a exotoxina modificada ser produzida por técnicas de DNA recombinante.
12a. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a exotoxina modificada conter os domínios Ib, II e III da exotoxina de Pseudomonas .
13a. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a toxina apresentar todas as caracteristicas da exotoxina de Pseudomonas recombinante pJH8.
14a. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a exotoxina conter o domínio III e os 20 aminoácidos adjacentes do domínio Ib da exotoxina de Pseudomonas.
153. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a exotoxina apresentar todas as caracteristicas de exotoxina de Pseudomonas recombinante pJH17.
163. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a toxina ter sido modificada mediante eliminação de um aminoâcido do domínio Ia.
17â. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a toxina ter sido modificada mediante eliminação de pelo menos 11 aminoácidos no domínio Ia.
183. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a toxina ter sido modificada mediante eliminação de pelo menos 11 aminoácidos no domínio Ia e adição de um resíduo adicional de me tionina à extremidade amino.
19a. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a toxina ter sido modificada mediante eliminação de pelo menos 25 aminoácidos no domínio Ia.
20a. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a toxina ter sido modificada mediante eleminação de pelo menos 70 aminoácidos no domínio Ia.
212. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a toxina ter sido modificada mediante eliminação de pelo menos 130 aminoácidos do domínio Ia.
}
222. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a imiinotoxína se basar em pJH8 ou pJH14.
232. - Processo para a produção de uma imunotoxina, caracterizado por compreender as etapas seguintes:
inserção de um gene de exotoxina de Pseudomonas modificado num vector de expressão;
inserção desse vector de expressão numa célula hospedeira adequada; e cultura dessa célula hospedeira sob condições em que seja produzida a imunotoxina recombinante.
242. - Processo de acordo com a * reivindicação 23, caracterizado por o gene de exotoxina de Pseudomonas modificado conter os domínios Ib, II e III da exotoxina de Pseudomonas.
252. - Processo de acordo com a 1 reivindicação 23, caracterizado por o gene de exotoxina de Pseudomonas modificado conter a domínio III e os 20 aminoácidos adjacentes do domínio Ib da exotoxina de Pseudomonas.
262. - Processo para a produção de um conjugado toxina-suporte, caracterizado por compre-31- ender as etapas seguintes:
obtenção da toxina a partir de uma bactéria, planta ou animal, em que a toxina é uma proteína ou péptido modificados, em relação aos quais não estão presentes ou não são induzidos anticorpos na generalidade da população humana, em que a proteína ou péptido têm um domínio que normalmente estabelece a ligação a uma célula de mamífero e em que a proteína ou péptido são normalmente tóxicos para a célula de mamíferos;
modificação da toxina por remoção do domínio de ligação de uma multiplicidade de aminoácidos eficaz na eliminação ou redução da sua capacidade de se ligar a células de mamíferos, eliminando ou reduzindo deste modo a toxicidade da proteína ou péptido em relação às células de mamífero, em que a totalidade do domínio de ligação ou menos do que isso é removida da proteína ou péptido obtidos a partir de uma bactéria ou animal, e menos do que a totalidade do domínio de ligação é removida da proteína ou péptido obtidos a partir de uma planta;
obtenção de uma proteína de reconhecimento celular de polipéptidos para a qual existe um receptor ou local de ligação celular específico; e conjugação da toxina e da proteína.
27â.- Processo para a produção de um factor de crescimento ou de um conjugado péptidico hormona-toxina apropriado para ser usado in vivo com um organismo de uma espécie mamífera, caracterizado por compreender as etapas seguintes:
obtenção de uma toxina modificada em que a toxina modificada é derivada de uma bactéria, planta ou animal e é uma proteína ou péptido modificados, em relação aos quais não estão presentes ou não são induzidos anticorpos na generalidade da população humana, e em que a proteína ou péptido têm um domínio de ligação que normalmente estabelece a ligação a uma célula de mamífero e em que a proteína ou péptido são normalmente tóxicos para a célula de mamífero;
modificação da proteína ou péptido por remoção do domínio de ligação de uma multiplicidade de aminoâcidos eficaz na eliminação ou redução da sua capacidade de se ligar a células de mamíferos, eliminando ou reduzindo deste modo a toxicidade da proteína ou péptido para a célula de mamífero, em que a totalidade do domínio de ligação ou menos do que isso é removida da proteína ou péptido obtidos a partir de uma bactéria ou animal, e menos do que a totalidade do domínio de ligação é removida da proteína ou péptido obtidos a partir de uma planta;
obtenção de um suporte director seleccionado do grupo constituído por sequências de DNA de interleucina 2 e sequências de DNA de factor de crescimento de transformação alfa; e fusão da toxina e do suporte director.
283. - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por a toxina ser uma exotoxina de Pseudomonas modificada.
295. - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por a exotoxina de Pseudomonas modificada ser produzida mediante técnicas de DNA recombinante.
30^. _ Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o suporte director ser um antigênio, um anticorpo, um factor de crescimento, uma hormona, uma linfocina, ou outra proteína de reconhecimento celular de polipéptidos.
31s. - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o suporte director ser uma protéina do soro ou uma proteína do soro modificada, uma endosfina ou uma asialoglicoproteína.
I
32â. - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o suporte director ser insulina, glucagona, hormona luteinizante, factor de crescimento de fibroblasto, factor de crescimento dos nervos, hormona estimulante do melanócito, interleucina 2, } bombesina, ou factor de crescimento de transformação alfa.
33â. - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o suporte director ser lectina.
342. _ Processo de produção de actividade citotóxica dirigida num mamífero caracterizado por se fazer a administração de uma quantidade citotóxica eficaz do conjugado toxina-suporte de acordo com a reivindicação 26, em que a quantidade citotóxica eficaz é menor ou igual a metade (1/2) da dose capaz de provocar a morte do mamífero.
353. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína ou péptido modificados produzidos serem adequados para serem usados como vacina a fim de imunizar activamente animais ou seres humanos ou de produzir imunoglobulinas nos referidos animais ou seres humanos.
363. - Processo para a produção de uma vacina para ser usada na imunização activa de animais ou seres humanos ou na produção de imunoglobulinas nesses animais ou seres humanos, caracterizado por compreender as etapas seguintes:
obtenção a partir de uma bactéria, planta ou animal, de uma proteína ou péptido, em relação aos quais não estão presentes ou não são induzidos anticorpos na generalidade da população humana, em que a proteína ou péptido têm um domínio de ligação que normalmente estabelece a ligação a uma célula de mamífero e em que a proteína ou péptido são normalmente tóxicos para a célula de mamífero;
modificação da proteína ou péptido mediante remoção do domínio de ligação de uma multiplicidade de aminoâcidos eficaz na aliminação ou redução da sua capacidade de se ligar à célula de mamífero, eliminando ou reduzindo deste modo a toxicidade da proteína ou péptido para a célula de mamífero, em que a totalidade do domínio de ligação ou menos do que isso é removida da proteína ou péptido obtidos a partir de uma bactéria ou animal, e menos do que a totalidade do domínio de ligação é removida de uma proteína ou péptido obtidos a partir de uma planta; e processamento da proteína ou péptido modificados a fim de serem usados numa vacina.
373. - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por a etapa de modificação compreender a eliminação de aminoácidos do domínio
II.
383. - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por a etapa de modificação compreender a alteração do domínio Ib ou do domínio III de tal modo que a proteína ou péptido apresentem uma actividade de ribosilação de ADP reduzida ou nula.
-3539a. - Processode acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a exotoxina de Pseudomonas modificada ser modificada por técnicas de DNA recombinante.
40*. - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o suporte director ser um antigênio e em que a exotoxina de Pseudomonas modificada ê produzida por técnicas de DNA recombinante.
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