PT98048B - Metodo de tratamento de celulas cancerosas da bexiga utilizando proteinas hibridas, nomeadamente pe40 modificado ligado a tgf-alfa - Google Patents

Metodo de tratamento de celulas cancerosas da bexiga utilizando proteinas hibridas, nomeadamente pe40 modificado ligado a tgf-alfa Download PDF

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Description

APLICAÇÕES RELACIONADAS
Esta aplicação de patente é uma continuação em parte da aplicação da patente com o no. de série 07/542,281, datada de Junho 21, 1990»
ANTECEDENTES DO INVENTO
A quimioterapia de cancro tradicional depende da capacidade que as drogas têm de matar as células do tumor, em pacientes com cancro, Intelizmente, estas mesmas drogas frequentemente matam células normais, assim como as células do tumor alcance que uma droga de cancro tem de matar células do tumor em vsz de células normais, é uma indicação do grau de selectividade do composto para as células do tumor» Um método para aumentar a selectividade das drogas de cancro em relação às células do tumor
é a distribuição das drogas preferencialmente às células do tumor, enquanto que evitam as populações de células normais, Um outro termo para a distribuição selectiva de agentes quimioterapêuticos a populações especificas de células é o alvo”. Drogas alvo para células de tumor podem ser conseguidas em vários dias.
Um método engloba a presença de moléculas de receptor especificas encontradas na superfície das células do tumor, Outras moléculas.
referidas como agentes alvo, podem reconhecer e ligarem—se a esses receptores de superfície das células·» Estes agentes alvo incluem, e„g„, anti-corpos, factores de crescimento, ou hormonas» Agentes alvo que reconhecem e se ligam aos receptores de superfície das células específicas, são células que possuem aqueles receptores» tumor da bexiga possuem uma proteína nas referidos como o alvo das Por exemplo, células do suas superfícies chamada
I
receptor do factor de crescimento epidérmico. Factor—alfa de transformação do crescimento CTSF-alfa) reconhece e liga-se ao receptor E8F nas células do tumor da bexiga. TSF-alfa é por conseguinte, um agente alvo para estas células de tumor.
alvo de tumor e híbridas actuam
Agentes alvo por eles próprios não matam as células do tu.mor. Outras moléculas que incluem venenos celulares ou toxinas podem ser ligadas aos agentes alvo de modo a criar moléculas híbridas que possuem ambas células toxinas celulares dominantes. Estas molécula·:
como venenos selectivos de células de tumor, devido às suas capacidades para alvejar as células do tumor e depois matar aquelas células por via do seu componente de toxina. Alguns dos venenos celulares mais potentes usados na construção destas moléculas híbridas são toxinas bacterianas, que inibem a síntese de protéina em células de mamíferos. Exotoxina A de pseudomonas é uma destas destas toxinas bacterianas, e tem sido usada para a construção de moléculas alvo—toxina híbridas (Patente dos E.U. 4.545,985),
Exotoxina A de pseudomonas intoxica células ds mamíferos por, em primeiro lugar, ligação ã. superfície das células, depois entram no citoplasma das células e inactivam o factor de elongação 2, que é uma protéina celular necessária para a síntese de protéinas. Exotoxina A de pseudomonas tem sido usada para a construção de moléculas híbridas anti-cancerosas usando anti-corpos monoclonais e hormonas de protéinas. Contudo, um problema com estas maléculas híbridas é a exibição de toxidade em relação às células normais. Pelo menos parte da toxidade associada com as moléculas híbridas, que contêm exotoxina A de pseudomonas, é devido ã capacidade da exotoxina A de pseudomonas por ela prória, de ligação a e de entrar em muitos tipos de células de mamíferos. Por conseguinte, as moléculas ......
de híbridos formadas entre ϊ
&
exotoxina A de pseudomonas ε os agentes alvo específicos podem-se ligar a muitas células normais, em adição às células que reconhecem com o “agente alvo. Um método de lidar com este problema é modificar as oxotoxinas A de pseudomonas de modo que já não sejam capazes de ligação a células normais» Isto pode ser conseguido através da remoção daquela porção de molécula de pseudomonas de exotoxina A que é responsável por esta actividade de ligação,. Uma forma truncada da molécula de pseudomonas de exotoxina A foi preparada, que retém a capacidade de inactivação do factor de elongação 2, mas já não é capaz de ligação a células de mamíferos» Esta molécula de exotoxina A de pseudomonas modificada é chamada exotoxina de pseudomonas - 4® ou PE^ft (Hwang, et al», Ce11 48: 129 - 136 1987).
PE/10 tem sido ligado a várias moléculas alvo
TGF - alfa CChaudhary, et al». PNAS USA 84s 4583 caso de TGF-alfa, moléculas híbridas que contêm PE^ft e incluindo 4542 1987)., Mo TGF-alfa dominantes são capazes de ligação específica às células do tumor intoxicam estas células via De modo que, para que esta que possuem receptores EBF e que inibição de síntese de protéina. molécula híbrida efieientemente se ligue ao receptor EBF ela deve assumir a configuração apropriada» A ligação do receptor eficaz é também dependente em ter o domínio alvo apropriadamente exposto, de modo que seja acessível para ligação» Quando moléculas híbridas TGF—alfa e PE^ são produzidas como uma função de protéina em bactérias usando técnicas de ADN recombinante, a maioria das moléculas híbridas exibem uma actividade de ligação ao receptor EBF, pobre»
I £
DESCRlçaO DAS FUBLICAçSES
1. Patente dos E.U. 4.545.985 ensina que as exotoxinas A de pseudomonas podem ser quimicamente conjugadas a um anti-corpo ou ao factor de crescimento epidérmico. Enquanto que esta patente ainda ensina que estes conjugados podem ser usados para matar células de tumores humanos, estas toxinas quimicamente ligadas tem-se mostrado como tendo níveis indesejáveis, específicos de actividade»
2. Patente dos E.U. 4.664.9Í1 ensina que anticorpos podem ser conjugados ã cadeia A ou ã cadeia B da ricina, que é uma toxina obtida a partir das plantas» A Patente 4.664.9ÍÍ ainda ensina que estes conjugados podem ser usados para matar células de tumor humano»
3. Patente dos E.ti. 4.675.382 ensina que hormonas como a hormona que estimula o melanócito (HEM) pode ser ligada a uma porção de protéina de toxina diptéria via ligação peptidica. A Patente 4.675.382 ainda ensina que os genes que codificam estas protéinas podem ser unidos em conjunto através de a síntese directa de uma protéina de função híbrida usando técnicas de ADN recombinante. Esta função proteica tem a capacidade de ligação de células que possuem receptores HEM.
4. Murphy. et al., PNAS USA 8-5 s 8258 - 8262 1986, Construção genética, expressão, e melanomaselectividade de citoxida.de de uma protéina de fusão hormonal que estimula o alfa-melanócito, relacionada com toxina diptéria. Este artigo ensina que uma protéina de função híbrida produzida em bactérias usando tecnologia de ADN recombinante e que consiste numa porção
de protéina de toxina diptêria junta a hormona de estimulação de alfa-melanácito, ligar-se-á e matará células de melanoma humano.
5« Allured. et al
PNAS fc'3 s 1320
1324 19S6, Estrutura de exotoxina A de Pseudomonas de seruainosa e»
Arisgstrom»
Este artigo ensina a estrutura a três exotoxina A de pseudomonas» dimensões de protéina da
6» Hwanq. et al,
Ce11 43 κ 129
136 1987
Domínio funcional de Exotoxina de Pseudomonas identificado por Análise Deletion do Gene expresso em E. coli» Este artigo ensina que a protéina de exotoxina A de pseudomonas pode ser dividida em três domínios funcionais distintos responsáveis pors ligação a células de mamíferos, translocação de membranas lisomonais ao longo da protéina de toxina, e ribolisação de ADP do factor de elongsção 2 nas células de mamíferos. Este artigo ainda ensina que estes domínios funcionais correspondem a regiões distintas da protéina de exotoxina A de pseudomonas.
7. Chaudhary. et al.PNAS USA 84s 453S - 4342 1937, Actividade de uma protéina de fusão recorabinante entre o factor de transformação do crescimento tipo alfa e a toxina de Pseudomonas» Este artigo ensina que as protéinas de fusão híbrida formadas entre PE-40 e factor alfa de transformação do crescimento e produzida em bactérias usando técnicas de ADN recorabinante, ligar-se-á e matará células de tumor humano que possuem receptorss de crescimento epidérmico.
3Aplicação da Patente Europeia 0 261 671 publicada em
Março 19S3, ensina que uraa de pseudomonas, que tem falta toda a protéina de exotoxina translocação e as funções d<
porção de protéina de exotoxina A da função de ligação celular em A d© pseudomonas, mas possui a ribosilação de ADP em toda a
J ί
Η
protéina de exotoxina A de pseudoaionas, pode ser produzida. A porção que retém a translocação e as funções de ribosilação de ADP em toda a protéina de exotoxina A de pseudomonas é chamada exotoxina de pseudomonas - 40 ou PE-40» 0 PE-40 consiste nos resíduos de amino ácidos 252 - 613 de toda a protéina de exotoxina A de pseudomonas, como definido por Bray, et al., PNAS USA Bí i 2645 - 2649 1984. Esta aplicação da patente ainda ensina que o PE-40 pode ser ligado ao factor-alfa de transformação do crescimento, para a formação de uma protéina de fusão híbrida produzida em bactérias, usando técnicas de ADN recombinante.
Kelley et al., PNAS USA 85 s 3980
3984 1988,
Protéina de fusão de toxina diftéria e de interleucina 2 pode abolir a imunidade induzida pela célula in vivo. Este artigo ensina que uma protéina de fusão híbrida produzida em bactétias usando tecnologia de ADN recombinante e que consiste numa porção de protéina de toxina diftéria, junta as funções da interleucina 2 em ratos, para a supressão de imunidade induzida pelas células»
IQ.Bailon, Biotechnoloqy, pp. 1326 Purificação e Caracterização Parcial da protéina Pseudomonas e de Interleucina 2» Este artigo protéinas de fusão híbridas formadas entre PE-40 e produzidas em bactérias usando técnicas de ligar—se—ão a e matarão células humanas· gue poss irster leucina 2.
1329 Nov» Í9SS» de e x o to x i n a de ensina que as e interleucina 2 ADN recombinante uem receptores de
11» Edwards. et al.» Mol» Cell. Biol. 9s 1989 descreve a preparação de moléculas híbridas TBE modificadas que têm sido encontradas como tendo tratamento de células de tumor da bexiga.
•ΊΟΧ.7 rSCi ,*
-alfa utilidade PE40 no i
12» Heimbrook, et al., Proc» Natl» Acad» Sei. USA 87s 4697 -- 4701 1990 descreve a eficácia in vivo de TQF-alfa - PE^ modificado em significativamente prolongar a sobrevivência de ratos, que contêm xenógrafos de células de tumores humanas.
OBJECTIVQS DG INVENTO çam ~i “agente alvo' έ um objectivo do presente invento fornecer modificações de PE40 que permitam uma ligação eficiente das moléculas híbridas formadas a partir de TSF-alfa e PE40 modificado a receptores celulares em células de tumor da bexiga, que reconteds TSF-alfa» Ê um outro objectivo deste invento fornecer um método para matar selectivamente células de tumor da bexiga» Um outro objectivo S fornecer uma molécula híbrida que aumente a potência entre TSF-alfa e as moléculas de modificadas» Um outro objectivo do invento é fornecer composições farmacêuticas que contêm como ingrediente activo uma molécula híbrida que contém um domínio de Pt,... íou região) em que o domínio de PE»,.. foi modificado de modo a melhorar a protéina híbrida do receptor de crescimento epidérmico, em células de tumor da bexiga» Estes e outras objectivos do presente invento serão aparentes a partir da descrição seguinte.
SUMÁRIO DO INVENTO presente invente fornece uma moléculê híbrida compreende um domínio ds PE^ modificado ligado a TSh-alfa» 0 domínio de PE^ft modificado melhora ligação do receptor desta molécula de híbrido» A
Llfíl uOifíá.nÍ.O <3 -SC O„ VjLCfc&dS? substi tuição que a 1 vo de de
outras amina ácidos neutros como, e.g., alanina, por exemplo resíduos de cistéina sns PE^, ou destruição de resíduos de cistéina, melhora a ligação de moléculas híbridas aos receptores reconhecidos pelo domínio alvo. As moléculas híbridas do presente invento ligam-se mais eficazmente aos receptores alvo em células de tumor humano, do que as moléculas híbridas que têm PE^ não modificado, e têm utilidade na morte de células de tumor da bexiga.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO
Moléculas híbridas formadas entre TSF-alfa e PE
são caracterizadas por três sistemas de ensaio primários. Estes ensaios incluem! 1 - ribosilação de ADP do factor de elongação 2, que mede a actividade enzimática de TSF-alfa - PE^ft5 que? inibe a síntese de protéina de células em mamíferos, 2 - inibição de ESP radiomarcado ligado ao receptor de E'BF em membranas ds vesículas de células A43Í, que mede a actividade de ligação do receptor de EBF de TSE-alfa - PE»,-» e 3 ~ polifsrização ds células assim
W * ensaiadas por converção de brometo de 3-E4?5-dimetiItiazaI-2~-iI3-2,5-difeniltetrazélio CMTT) a formazano, que é usado na medição da sobrevivência de células de tumor seguido pela exposição de TSF-alfa - PE^. Estes ensaios são realizados como previamente descrito (Bominic, er al., Infection and Immunity í&s 832 - 841 1977, Cohen, st al», J, Biol. Chem» 257? 1523 - 1531 1982, Riemen, et al., Peptides 8s 877 - S85 1987, Mosmann J, Immunol. Methods 65 s 55 - 63 1983)»
Para criar novas moléculas híbridas de TSF com características de ligação de receptor superior, alfa - PE40 em primeiro lugar, produziu—se um.
série de moléculas de ADN reco ffi b i na n te que
codificam ambos TSF-alfa modificadas de TSF-alfa - PE vt-rsões especif icamen te □ gene TSF-alfa - PE „ original
PE „... ou 4«
Zj.0 ' ou parenteral foi clonado molecularments no vector plasmídeo de expressão TAC (pTAC TBF57 -- PE40) usando segmentos distintos de ADW clonado, como descrito no Exemplo í, □ clone pTAC TGP57 ΡΕ4Θ foi usado como agente de partida para a construção de versSes especif icamen te modificadas de TSF-alfa - PE^fí ADN, As modificações específicas de pTAC TGF57 - PE4© ADN que envolvem mutações em sítios específicos na sequência de código de ADN, necessitam da substituição de dois ou quatro codons de cístéina no domínio de PEflí-, de pTAC TGF57 ~ ΡΕ4Θ ADW com codons para outros amino ácidos. Em alternativa, as mutações de sítios específicos podem ser realizadas de modo a remover dois ou quatro dos codons de cístéina, no domínio de PE40 de pTAC T6F57 - PE40» As mutações de sítios específicos em pTAC TGF57 - ΡΕ4Θ ADN foram construídas usando os métodos de Winter, et al., Nature 299s 756 - 75Θ 1982« Exemplos específicos de pTAC TGF57 - PE4Ô ADN mutados são apresentados no Exemplo 3. A sequência de amino ácidos da protêina híbrida codificada por pTAC TGF57 - PE4© ADN é apresentada no Quadro 3« Ds quatro resíduos de cístéina no domínio de
PE,,.-, de protêina híbrida TbF-alfa - PE_„ -507 parenteral são designados por resíduos Cys
Cy (quadro 3) □s resíduos de amino ácidos no domínio de ΡΕ^β são numerados como definida em Gray, et al«, PNAS USA 9Í s 2645 -- 2649 (1984)« As protèinas híbridas- TSF-alfa - PE^ modificadas geradas a partir de pTAC TBF57 - PE4© ADN especif icamen te mutadas cont'é'm substituições ou remoção de dois resíduos de ΡΕλα com N terminal / CT nn*? ··?·—yn
3/2
JS7..
ECví
T7Q.
Cys' '1 ou dois resíduos com C terminal ECys'’' e Cys-;:'zv3, ou ambos ECys2&°, Cys2®7, Cys~’z2 e Cys'5z<?3, Para simplificar a nomenclatura para a descrição das protèinas híbridas modificadas produzidas a partir destes pTAC TGF57 - PE4© ADN mutados foram designados os resíduos de amino ácidos nas posições M terminal de locus “A” e os resíduos nas posições C terminal de
265 i
locus B. Quando os resíduos de cistéina estão presentes nas duas posições ds ΡΕ,Λ N terminal, como na molécula híbrida TSF-alfa - PE^ft parenteral, o locus é capitalizado Ci.e. ”A“>» Quando estas cistéinas estão substituídas com outros amino ácidos neutros como, por exemplo, glicina, alanina, fenilalanina, vslina,leucina, isoleucina, tirosina, bistídina, triptofano, serina, treonina ou metionina, ou remoção das posições N terminal, o locus é representado por um caso inferior a. Identicamente, se os resíduos de amino ácido nas duas posições C terminal são cistéinas, o locus é representado por um caso superior ,!B, enquanto que um caso inferior b representa este locus quando os resíduos de amino ácido nestas posições estão substituídos com outros amino ácidos ou estão removidos. Assim quando todos os quatros resíduos ds cistéina no domínio de PE^ft de TSF-alfa PE4ft estão substituídos com alaninas, a protéina híbrida modificada é designada TBF-alfa - PE^ Uffl ma^° similar a protéina híbrida TSF-alfa - PE^ parenteral com cistéinas nas posições de resíduo amino ácido 265, 287, 372 e 379 pode ser designada por
TSF-alfa - PE,rt AB.
Ambas protéina iBF—alfa — PE.. AB e as protéinas 40 ~ híbridas TBF—alfa — PE.,.X modificadas são produzidas em E. coli 40 usando o sistema de vecfor de expressão TAC, descrito por Linemeyer, et al., Bio-Technolocy 5: 960 - 965 19S7. As protéinas híbridas recombinanfes produzidas nestas bactérias sã.o colhidas e purificadas por dissolução de tecidos de bactérias em hidrocloreto de guadínina, seguido por adição de sulfureto de sódio e de tetrationato de sódio. Esta mistura reaccional sofre subsequentemente diálise e ureia é adicionada para solubilizar as protéinas que precipitaram da solução. A mxstura é a seguir centrifugada para a remoção de portéínas e as protéinas TSF-alfa - PE,, híbridas recooibinsntes são separadas usando cromatografia de permuta. iónica, seguido por cromatograf ia de exclusão )
ι
dimensional, seguido novamente uma vez por cromatografia de oermuta iónica» As orotéinas híbridas TGF-alfa — PE», purificadas são a seguir expostas a agentes de redução, como betamercapto-etanol, de modo s permitir a formação de ligações de disulíureto na protéina híbrida entre pares de resíduos de cistéina» Finalmente, as protéinas híbridas refeitas são sujeitas a cromatografia de exclusão por dimensão e de permuta iónica para o isolamento de proteína TGF-alfa -- PE», altamente pura» Para arecisar detalhes, este esquema de purificação está descrito no Exemplo 4» Uma vez purificada e refeita a actividade biológica destas protéinas híbridas, podem ser caracterizadas usando os ensaios de ribosilação de ADR, ligação do receptor de EGF, ε proliferização de células, como descrito acima»
Em alternativa, híbridas TGF-alfa aB e TGF—alfa das» As oactérxas são ε preferencialmente, as protéinas
- PE.
PE», AB, TGF-alfa - PE», Ab, TGÍ--aifa 4v> 40 '40
PE^ft ab são produzidas em bactérias transformacultivadas e a pasta de células sofre dissolução de tecidos e é tratada, preferencialmente por centrifugação, para a remoção dos escombros e ds protéinas indesejáveis» A protéina híbrida desejada depois έ precipitada por adição de um sal de sulfato, preferencialmente , ao líquido sobrenadante. 0 precipitado é sulfitolizada, refeito por adição de excesso de |1—mercapto—etanol, concentrado e separado por cromatografia de permuta iónica e cromatografia de quelação metálica. Detalhes específicos estão descritos no Exemplo 5»
Uma utilidade importante de situa-se na sua capacidade de ligação tumor da bexiga humana» As protéinas a aqui, têm utilidade em matar células de usadas para este fim com a formação de num líquido fisiologicamente aceitável modif xcado TuF a 1 fa a e de matar células de nti-cancerosas desc ri tas cancro da bexiga e são uma solução ou suspensão como, por exemplo, água * i
esterelizada, água para injecção, solução salina ou, preferencialmente, solução salina tamponizada ou solução salina tamponizada contendo uma protêina de suporte como, por exemplo, albumina de soro humano, e.g» solução salina tamponizada. com fosfato ou PBS que contém albumina de soro humano. A solução ou suspensão contém desde cerca de 0.1 mg a cerca de 10 mg de protèina híbrida anti-cancerosa por 60 ml de líquido fisiologicamente -aceitável. Mais preferencialmente, contém desde cerca de @,5 mg a cerca de 5 mq por 60 ml, e roais preferencialroents, contém desde cerca de 2 mg a cerca de 4 mg por 60 ml de líquido fisiologicamente aceitável » método do presente invento consiste no contacto de células de cancro da bexiga com a solução ou suspensão que contém as protéinas anti-cancercsas descritas aqui, durante Uffl periodo desde menos do que uma hora, por exemplo, cerca ds 30 minutos, a um período de várias horas, por exemplo, atê quatro horas, à temperatura ambiente» No caso de animais de laboratório a solução ou suspensão é administrada via um cateter trans-uretra»
Enquanto que a utilização de moléculas híbridas de modificado TGF-alfa é descrita aqui e nos exemplos- seguintes, deve ser entendido que o âmbito do presente invento inclui como agentes alvo TGF-alfa, EOF, outros membros da família EGF de hormonas peptídeas que se ligam ao receptor de EGF nas células de tumor da bexiga, factor de crescimento do vírus fibroma Shope, e factor de crescimento do virus vaccinia e que a toxina á qual o agente alvo está acouplado também inclui ΡΕ4Λ, toxina diptéria, toxina de rícino ou. outros membros da classe de ribosil-ação de AGP de venenos de células em mamíferos.
Os exemplos seguintes ilustram o presente invento sem, contudo, limitarem o mesmo» Todas as reacçSes enzimáticas que
necessitam de manipulações outra modo seja indicado biológicas moleculares, a menos que de foram realizadas como descrito em
Ma n lati s.. et_a 1 <1982/ Em5 Molecular ;lonmg:
.aboratorv
Manual, Cold Spring Harbor
Exemplo 1
Construção ds clones de ADN recombinante que contém TGF-alfa - PE.,. ADN
-ϋ-:-0 segmento de TBF-alfa ADN foi construído usando três partes de oligonucleotídeos sintéticos, como descrito por Defeo-Jones, et al», Molecular and Cellulsr Biology Ss 2999 - 3Θ07 1988» Este gene TSF-alfa sintético foi clonado em pUC-19. ADN do clone pUC-19 que contém TGF-alfa humano recombinante, foi digerido com Sph I e Eco RI. A digestão gerou um fragmento 2.Θ kb ADN que contém todas as porções pUC-19 e 5' de TBF-alfa. 0 fragmento
2.Θ kb foi purificado e isolado por electroforese em gel. Uma Eco Rl para a cassete de oligonucleotídeo de Sph I foi sintetizada. Esta cassete sintética tinha a sequência indicada a seguir;
5' -CGGACCTCCTBGC-TBCBCATCT ABB-3 *
3'-6TACGCCTGGAGGACCGACSCGTASATCCTTAA-5‘
Por conveniência, esta cassete de oliqonucliotídeo foi nomeada por 57. A cassete 57 foi anelada e ligada a TSF-alfa que contém o fragmento 2.B kb, formando um plasmídeo circulado. Clones que continham a cassete foram identificados por hibridizaçSo á cassete radiomarcada 57 ADN. A presença de TBF-alfa humano foi confirmado pela sequência de ADN. A sequência também foi confirmada pela presença de um sitio Fsp I novamente introduzido na extremidade 3’ da sequência TGF-alfa. Este plas-mídeo 3 nomeado por TGF-alfa - 57ZpUC-19, foi digerido com HinD III e Fsp I que gerou um fragmento 168 bp que contém um gene TGF-alfa (TGF-alfa— -57)» Uma preparação em separado de pUC-19 foi digerida com HinD ,68 kb pUC-19 ADN. O PE
ADN
III e Eco RI que gerou, um vector foi isolado do plasmídeo pVC 8 (Chaudhary, et al., PNAS USA 84; 4538 - 4542 1987). 0 pVC 8 foi digerida usando Nde I. Uma extremidade nivelada foi depois gerada neste ADN através da utilização de condições padrão da reacção de Klenow (Maniatis, et al. „ supra. p» ÍÍ3). 0 ADN ds extremidade nivelada foi depois sujeito a usa segunda digestão com Eco RI para gerar um fragmento 1„3 Eco RI a Nde I ícom extremidade nivelada) que contém PE^. TSF-alfa-57 HinD III ao fragmento Fsp I Cl68 bp) foi ligado vector 2.68 kb pUC-19« Seguindo a incubação durante a noite5 fragmento 1.3 kb Eco Rl -a Nde I ícom extremidade nivelada) PE kb □
ao o
4D
ADN foi adicionado à mistura de ligação. Este segundo produto de ligação foi depois usado para a transformação de células 3N 109,. Clones contendo TGF-alfa-57 ΡΕ^β em pUC-19 foram identificados por hibridização a TSF-alfa-57 PE40 ADN radiomarcado e o ADN deste clone foi isolado,, 0 TGF-alfa-57 PE^ foi removido a partir do vector pUC-19 e transferido para um sistema de vector TAC descrita por Linemeyer, et al., Bio-Technology 5; 960 - 965 1987). 0 TGF-alfa-57 ΡΕΛΛ em pUC-19 foi digerido com Hin.D III e com Eco RI para gerar um fragmento 1.5 kb que contém TGF-alfa-57 PE^-j. Uma extremidade nivelada foi gerada neste fragmento de ADN usando condições reaccionais padrão Klenow ÍManiatis5 et al.„ 1 oc, cit.) . □ vector TAC foi digerido com HinD III e cons Eco RI. Uma extremidade nivelada foi gerada no vector TAC digerido de ADN usando condições reaccionais padrão Klenow (Maniatis, et al., ____gÃ.t=)» 0 vector ds extremidade nivelada 2.7 kb foi isolado usando electroforese em gel. G fragmento TGF-alfa-57 extremidade nivelada foi depois ligado ao vector
PE40 de
TAC de extremidade nivelada» 0 plasmídeo gerado por esta ligação foi usado para a transformação ds células JM 109„ Clones candidatos gue contêm TSF-alfa-57 ΡΕΔ^ foram identificados por hibridização como indicado acima e sequenciados» 0 clone contendo a construção desejada foi nomeada por pTAC TBF57- PE4©» □ plasmídeo gerado por estas manipulações está descrito no Quadro 1. ft sequência nucleofílica ds codons de amino ácido de protéina fundida TSF-alfa ΡΕ,λ codificada em oTAC TGF-57-PE40 A.DN está descrita no Quadro 2« A sequência de amino ácido codificada pelo gene TGF-57-PE40 está indicada no Quadra 3.
Exemplo 5
Construção de Versões Modificadas de TSF-alfa - F'R,.-, recombinante que contém clones de ΑΡΝϊ Substituição de Alaninas por Cistéinas
TSF-alfa - ΕΈ4θ aB:
□ clone pTAC TSF57-PE40 foi digerido com Sphl e BamHI e o fragmento 748 bp SpftX-BamHI (especificando os amino ácido com C terminal de TSF-al' o amino ácido 4 ligante; e os amino ácidos
240 com N terminal de PE^> foi isolado, 0 vector M13 mpl? de ABN foi cortado com Sphl. e BamHI ε o vector de ABN foi isolado» O fragmento /48 bp SphX-BamHI TSF-alfa - PE4í:, foi ligado ao vector M13 da ABN durante a noite aos 15°C» Células hospedeiras bacterianas foram transformadas com esta mistura de ligação, clones candidatos foram isolados e o ssu plasmídeo de ABN foi sequencia— do para assegurar que estes clones continham os ADNs recombinantes apropriados» ABN ds cadeia simples foi preparado para mutagé— niss»
IS
Um oligonucleotídeo Coligo #132) foi sintetizado e usado na mutagénise directa em sítio para a introdução de um sítio Hpal em TSF-alfa -·· PE,,.. de ADN na posição 272 no amino » «.$7 ácido de PE^í
5* CTBGftSCSTTAACCCSTC 3' Coligo #132)
Uma consequência desta mutagénise directa em sítio foi a conversão do resíduo número 272 em PE,... a partir de fenilalanina. a leucina» A mutagénise foi realizada como descrito por Winter et al.» Nature, 299:
Um clone candidato que contém um sitio Hpal criado agora foi isolado ε sequenciado para avaliar a presença de sequência genética mutada, Este clone foi depois cortado com Sphl s Sall. Um fragmenta 198 bp especificando o amino ácido 5 com C terminal de TSF-alfa e os amino ácidos fel com N terminal de PE,.
e contendo o sítio Hpal introduzido agora foi isolado e subclonado novamente no plasmídso pTAC TBF57 - PE40 nos sítios Sphl-Sphl.. Células hospedeiras bacterianas foram transformadas, um clone candidato foi isolado e o seu plasmídeo de ADN foi sequenciado para a assegurar que este clone continha o ADN recombinante apropriado. Por conveniência este clone foi nomeado por pTAC T8F57 - PE^-132, pTAC TBF'57-ΡΕ^ .^-132 foi digerido com Sphl e Hpal e um fragmento 3.9ó Kb de ADN foi isolado. Uma cassete de ol igonu .1 ceotideo sintético Coligo #153) que contém os amino ácidos 5 com C terminal de TSF—alfa e os amino ácidos 32 com N terminal de ΡΕ^β s que contém extremidades compatíveis Sphl e Hpal foi sintetizado e ligado a pTAC TGF57-PE40-Í32 digeridos ’ CBGACCTCCTGGCCATBGCCGAAGAGGGCGGCAGCCTGGCCGCTGACCGCGCA
3' GTACGCCTGGACCGGTACCGGCTTCTCCCGCCBTCGBACCGGCGCGCACTGGCBCGT
CCAGGCTGCACACCTGCCGTGGAGACGTT 3'
GGTCCGACGTGTGGACGGCGACCTCTGAA 5' Coligo #153)
Esta cassete de oligonuleotídeo incorpora uma variação no TGF-alfa - PE^ ADN de modo que o codon que especifica a alanina no resíduo 51 foi eliminado e o codon que especifica cistéina no resíduo 264 de PE^ft agora especifica alanina. Por conveniência, este plasmídeo de ADN foi chamado pTAC TGF57-PE43pTAC TGF57-PE43-132,153 ADM» Clones candidatos foram identificados por hibridação e o seu plasmídeo de ADIM foi sequenciado para assegurar que continha o ADN recombinante apropriado» pTAC TGF57-PE40-132,153 ADN foi digerido com Hpal e Sall e um vector 3.95 kb de ADM foi. isolado. Uma cassete de oligonucleotídeo sintético Coligo #142) que contém os resíduos de amino ácido 272 a 3*39 de PE^0 e contém extremidades Hpal e Sall compatíveis foi sintetizado e ligada a 3.95 Kb pTAC TGF/PE40 132,153 de ADN.
5' AACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTBG6AACAACTGGA6CAGGCTGGCTATCCGGTGC 3’ TTSGGCAGTA6CGGTCGGCGCGCCGACCCTTSTTGACCTCGTCCGACCGATAG6CCACG
AGCGGCTGBTCGCCCTCTACCTGGCGGCGCGGCT8TCGTGGAACCAGG 3'
TCGCCGACCAGCGGGAGATGGACC6CCGCGCC6ACAGCACCTTGGTCCASCT 5' <01igo # 142)
Esta cassete de oligonucleotídeo modificou o codon especifico da cistéina no resíduo 2S7 de modo que este codon
especifica agora alanina, Por conveniência este plasmídeo de ADN mutado foi chamado pTAC TBF57- PE40-132,153,142. Células hodpedeiras bacterianas foram transformadas com este plasmídeo e clones candidatos foram identificados por hibridação. Estes clones foram isolados e o seu plasmídeo de ADN foi ssquenciado para assegurar que continha o AlíN recombinante apropriado. 0 plasmídeo pTAC TSF57-Pe40-132,153,142 codifica a variante TSF-alfa - de cistéinas com N terminal no locus ISA substituídas por alaninas. Por conseguinte, seguindo a nomenclatura descrita previamente esta versão modificada de TSF-alfa
PEZp;} é chamada TSF-alfa ΡΕ^β aB« A sequência de amino ácido codificada pelo gene TSF-alfa - PE,,, a)3 é indicado no Quadro 4, í|, ϊ/%
TSF-alfa - PE4@ Ab:
□ clone pTAC TSF57-PE40 foi digerido com Sphl e BamHI s o fragmento 748 bp Sphl-BamHI (especificando os amino ácidos 4 com C terminal do amino ácido 4 ligante TSF-alfa s os amino ácidos 240 com N terminal de PE } foi isolado. 0 vector M13 mp!9 de ADN foi cortado com Sphl e BamHI e o vector de ADN foi isolado. 0 fragmento 748 bp Sphl-BamHI TSF-alfa - PE4p. foi ligado ao vector M13 de ADN durante a noite aos Í5OC„ Células hospedeiras bacterianas foram transformadas com esta mistura de ligação, clones candidatos foram isolados e α seu plasmídeo de ADN foi sequenciado para assegurar que estes clones continham os ADNs recombinantes apropriados» ADMs de cadeia simples foram preparados por mutagénise.
Um uligonueleotídeo Coligo #133) foi sintetizado e usado em mutagénise directa em sítio para a introdução de um sítio Bsfcell em ιUr—alta — ADN na posição do amino ácido 2(69 de PE40s
GACGTGGTGACCCTGAC 3
Coligo #1331
Uma consequência desta mutagênise foi a conversão do resíduo de ser ina na posição 36? de ΡΕΛΛ <5- uma treonina.
com encimas ds restrição Apal inserido em ADN que contêm o
Um clone de ADN que contém um sítio Bstell criado agora foi identificado? isolado e sequenciado para assegurar a presença do ADN recombinante apropriado, Este clone foi a seguir digerido e Sall» Um fragmento de 120 bp sítio Bstell agora criado foi isolado e ligado a pTAC TGF57- que também foi digerido com
Apal e Sall» Células hospedeiras bacterxanas foram transforatadas, e um clone candidato foi isolado e sequenciado para assegurar que o ADN recombinante apropriado estava presente» Este plasmídeo de ADN agora criado foi chamado pTAC TGr57-PE4®~133
Foi diqerid com listeII e Apal e o isolado, •ragmento do vector 2.65 Kta de ADN foi
Uma. cassete de oligonucleotídeo Bstell a Apall Coligo #155) foi sintetizada que continha a região de TSF-alfa - PE,...
*02 foi apagada do clone pTAC TSF57-PE40—Í33» digerida com encimas de restrição Bstell e Apall» Esta cassete também especificava a sequência nucleotídica para as extremidades compatíveis Bstell Apal» fa
5' GTGACCCTGACCGCGCCGGTCGCCGCCGGTGAAGCTGCSGGCC 3'
3’ BGACTGGCGCGGCCAGCGGCGGCCACTTCGACGC 5' íoligo #155)
Esta cassete cligonuclsot.id.ica modou os codons da cistêina nos resíduos 372 e 379 de ΡΕ^β para os codons que especificam alaninas. Cassete oligonucleotidica #155 foi ligada ao fragmento do vector 2„65 Kb de ADN, Células hospedeiras bacterxanas foram transformadas e os cisnes candidatos foram
isolados e sequenciados para assegurar que o ADN recorabinante apropriado estava presente. Este clone de ADN agora criado foi chamado pTAC TGF57-PE40-133,155» Isto codifica a variante TSF-alfa ·-- com ambas cistèinas no locus B substituídas por alaninas. Por conseguinte, seguindo nomenc1atura descr i ta previamente esta versão modificada de TGF-alfa - PE.,-, é chamada
TSF-alfa
PE40 Ab» A sequência de amino ácido codificada pelo gene TBF~alfa - PE4^ Ab está indicada no Quadro 5,
TBF-alfa - PE40 abs plasmideo pTAC-TSF57-PE40~132,153,142 que codifica TGF-alfa - ΡΕ^0 a.B foi digerido com Sall e Apal ε o fragmento de ADN do vector 3.8.Kb foi isolado. D plasmideo pTAC TGF57-PE40133,155 que codifica
-alta
PE,.- foi *40 ;ambém digerido com
Sall e Apal e o fragmento de ADN 140 bp que contém as variações de cistéina a alanina nos resíduos de amino ácidos 372 e 379 de PE^^ foi isolado» Estes dois ADNs foram ligados em conjunto e usados para a transformação de células hospedeiras bacterianas» Clones candidatas foram identificados por hibridação com um 140 bp ADN radiomarcado a partir de pTAC TGF57-PE40-133,155» Plasmídeo de ADN dos clones candidatos foi isolado e sequenciado para assegurar a presença do ADN recorabinante apropriado. Este clone de ADN agora criado foi chamado pTAC T3F57-PE40-Í32,153,142,133,155» Este plasmideo codifica a variante TGF-alfa - FE40 com todas as quatro cistèinas no loci “A e !,Bn substituídas por alaninas» Por conseguinte, seguindo a nomenclatura descrita previamente, esta versão de TGF-alfa - PE^0 é chamada TGF-alfa - PE40 ab» A sequência de amino ácido codificada pelo gene TGF-alfa — PE está indicada no Quadro 6» ab
Exemplo 3
Construção de versões modificadas de TBF-alfa - F'E^ recombinante que contém clones de ADN; Remoção dos resíduos de cistéina
TBF-alfa
PE..,, aB,
TSF-alfa - PE», Ab, e TBF-alfa
PEçfi ,3-k Podem ser também construídos por remoção dos resíduos de ds TGF-alga-PEift foi Exemplo 3
PE„, aB, 4© conseguida identicamente como descrito no à excepção da que; para o oligonucleotídeo TSF-alfa a cassete é modificada de tal modo que o codon de alanina pretendida para a posição 265 é removida oligonucleotídica 142 é modificada de alanina pretendida para a posição 287 é removida.:. Para o oliqonue a cassete tal modo que o codon de cleotídeo TSF-alfa-PE,, Ab, a cassete 4fef
155 é modificada de tal modo que os codons de alanina pretendidos para o resíduo 372 e
377 são removidos. Para TSF-al fa-PE..,, ab os fragmentos de ADN usados para a construção deste gene recombinante são retirados do gene TSF-al fa-PE , aE= e do gene TSF-al fa-PEAb descritos neste 4(*í exemplo.
Exemplo 4
Produção e isolamento de protéinas de fusão TSF-alfa —
PE recombinante
Produção da protéina de fusão
Células d© E. coli JM-109 foram cultivadas, eat frascos de agitação de 1 L em 5©© ml de de ampicilina aos 37^0. Depois fotométrica A600 ter atingido isopropilo foi adicionado até Depois de 2 horas» as células · í sopa LB» na presença de 10© mg/ml do valor de absorvância espectro8fàs B-D-tio-galactopiranosido de uma concentração final de 1 mM» oram colhidas por centrifugação»
S-Sulfonação da protéina de fusão
As células sofreram di reto de guanidina a 8 M, Tris agitação a temperatura .ambiente, tecidos dissolvidos foi levada tetrationato da sódio ©,1 M por pH foi ajustado a 9,© com NaOH. tura ambiente durante 16 horas» ssolução dos tecidos em hidroclo5© mM de pH 8, EDTA 1 mH por durante 2 horas» A mistura dos a sulfureto de sódio 0,4 Μ e a adição ds reagentes sólidos e o
A reacção foi deixada à tempera-
Preparação para crom-atograf ia
A solução de protéina em excesso de 10.000 vezes de EDFA í mM, depois levada a ureia 6M ¥ Uí £ UMtte?
soτrbu αiai1s© contra um aos 4’~'C. A mistura foi Tris 50 mM de pH 8=,0, NaCl 50 mM à temperatura ambiente e agitada durante 2 horas» Qualquer material não dissolvido foi removido por centrifugação a 32.000 χ g durante 30 minutos»
Cromatografia DEAE F.F» Sepharose sobrenadante límpido do passo anterior foi aplicado a uma coluna 26 x 40 cm DEAE Fast Flow (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.) equilibrada com ureia 6M? Tris 50 mM a pH 8,0, NaCl 50 mM a uma. velocidade de refluxo de í ml/minuto. A coluna fo.i lavada com o tampão de equilíbrio até que os materiais não absorvidos foram removidos como evidenciado por ursa absorvância espectrofotométrica de UV 280 inferior a 0,1 no tampão de equilíbrio, como existe a coluna, A protéina de fusão absorvida foi eluida da coluna com uns 1000 ml de um gradiente de NaCl 50 - 35'G mM e depois com concentrador Amicon de célula agitado, adaptado com uma membrana YM--30,
Sephacryl S—500
A protéina de fusão concentrada (8 ml) foi aplicada a uma coluna
1ΘΘ cm Sephacryl
-30€$ ί P ha rmac i a
LKB pH
A de
Biotechnology Inc») equilibrada com ureia 6M, Tris 5© mM a 3,©5 NaCl 5© mM a uma velocidade de fluxo de 0,25 ml/minuto coluna foi eluída com tampão de equilíbrio adicional e 3 ml fracções recolhidas» FracçSe
-PE,,., foram juntas» stendo actividade de
TGF-alfaCromatoqrafia 0—sepharose
As fracções juntas obtidas da coluna S-30© foram aplicadas a uma coluna 1,6 x 40 cm G-SeqharoseCPharmacia LKB Biotechnology, Inc») equilibrada com ureia 6M, Tris 5© mM a pH 8,0, NaCl 50 mM a uma velocidade de fluxo de 0,7 ml/minuto» A coluna foi lavada com o tampão de equilíbrio e depois eluída com um 60© ml de um gradiente de NaCl 5© - 45© mM» As fracções contendo a actividade de TGF-alfa - PE^ foram juntas e depois sofreram diálise contra glicina 5© mM a pH 9,© e armazenadas a -2© °C.
Refazer da proteína
Uma amostra de proteína foi aquecida e diluída a uma absorvãncia espectrofotomêtrica a UV A2S© = ©,í em glicina 5© mM a pH 10,5» Bets-mercaptostanol foi adicionado para originar uma razão molar 4sí do número teórico de grupos 5—sulfonados presentes na amostra de protèina» A reacção foi deixada decorrer durante 16 horas aos 4°C, depois dos quais a solução sofreu diálise contra um excesso de 10.00© vezes de solução salina fisiologicamente tamponizada e foi armazenada aos ~20°C«
Exemplo 5
Produção e Isolamento de Protéinas de Fusão TGF-alfa PE..
—40Recombinante
E. coli da estirpe JM—ÍB9, que contém o plasmídeo TSF-alfa - PE^ apropriado, foi cultivado aos 37 *C em meio complexo (Bauer, et al,, Biotechnology e Bioengeneering lá 933-41 (1974)) cons antibiótico a 100 mg/ml» A expressão TGF-PE^ foi induzida após adição de isoprop.il tiogalactosídeo 1 mM, depois a cultura atingiu uma absorvSncia a 600 nm de 2,5« A cultura foi colhida por filtração de fluxo cruzado seguido por um período de indução de nove horas, a foi congelada aos -70°C«
A pasta de células foi aquecida em gelo em 4 volumes de de sódio 50 mM, pH 7,8, para a formação de uma suspensão que passou através de 4 camadas de tecido porouso e depois duas vezes através de uma prensa Ratin-Suilin aos 9 »000 psi» A suspensão filtrada foi centrifugada num rotor Sorvall SS-3 a 9000 rpm (13,000 x g) durante 30 minutos para a remoção de escombros»
Solução de sulfato de amónio saturado foi adicionado ao líquido sobrenadante gota a gota com agitação até 20 % de saturação (250 ml/L) a temperatura ambiente. A suspensão foi agitada aos 4':’C durante 0,5 -· 1 hora, e depois foi centrifugada no rotor SS-3 a rpm (13.000 x g? durante 20 minutos.
Sulfato ds amónio saturado foi adicionado ao líquido
“ρ·£7 */ / •ί'Τ,Ρ ml/1
a solução foi
trifugado como
de sódio 5í 3» mM,
agitado aos 4’:'C durante 0,5 - 1 hora e depois t anteriormente» □ pelote foi resuspenso em fosfato de sódio 50 mM,
NH/30., a 50 Ζ, ρΗ 7,5 -a 1/4 do volume de partida, agitado como *T *t· anteriormente s centrifugado no Sorvai 1 3A-680 a 5.080 rpm (3.608 >i ç) durante 15 minutos, em tubos de polipropíleno» 0 sobrenadante líquido -foi descarregado e o pelete rsssuspenso a 10 mg de protéina/ml em Tris 5® mM, guadinina-HCl SM, pH 9,© á temperatura ambiente»
Wa^SO^ foi adicionado até uma concentração de 0,4 M e Na^8^0t foi adicionado até uma concentração de 0,1 M. O pH foi verificado? se não for 9,0, um ajustamento apropriado é feito com HCi ou NaOH, Depois de agitação durante a noite à temperatura ambiente, a protéina sulfitolizsds sofreu diálise exaustiva contra Gly-Cl 58 mM, ρΗ 9,8 aos 4*C»
A protéina foi depois diluída a @,i mg/ml em Gly-Cl 50 mM, ρΗ 10,5 e um execssso molar de 40 vezes de fá-mercaptoetanol <87 mM de (S-Me a 0,1 mg/ml) foi adicionado» A mistura foi agitada aos 4°C durante cerca de 15 horas, e a protéina reconstruída sofreu diálise durante cerca de 15 horas aos 4°C contra Tis-Cl 20 mM, NaCl 50 mM, ρΗ 9,0, A protéina foi depois carregar uma coluna de Q-Sepharose pré-equilibrada em Tris-Cl 20 mM, NaCl 50 mM, pH 6,ô aos 4*C, usando cerca de G,3 ml de resina/mg de protéina e eluição com um gradiente linear sal de NaCl desde 50 mM a 500 mM em Trís-C'1 20 mM, pH 8,0 (dimensão do gradiente =6-10 volumes de coluna)»
As fracções absorção de UV Α^θ^, el Uma coluna de que1ação que1ação Sepharose 4B c protéina» A coluna foi squilitarad IM, pH 7,0» Para assegurar que da coluna foram analisadas e juntas por ectroforess ds gel e por manchas Western» metálica foi preparads por tratamento de om uuou-^ usanoo 0,0 a 1 ml de resina/mg de com Tris-acetato 50 mM, NaCl -ienhum Cu’1·’2 foi eluído, uma
ÍV
segunda coluna livre de instalada na descarga da
A amostra Tris-acetato 58 mM, quelação metálica à um volume de coluna metal ds quelação de Sepharose 4B **f* c** coluna de carga de Cu de (3—Sepharose junta foi diluída ls2 NaCl ÍM, pH 7,0, e foi carregar a coluna temperatura ambiente» A coluna foi lavada de tampão de equilíbrio, e a protéina foi em com foi eluída com um gradiente linear de imidazole desde 8 a 70 mM, mantendo o pH 7,0, no tampão de equilíbrio (dimensão do gradiente Ί0 a 40 volumes de coluna)» de coluna foram analisadas e juntas por absorção UV A„...,, electroforese gel e por manchas Western,
Exemplo &
Oito linhas de células ds carcinoma da bexiga humana foram obtidas em American Type Culture Collection (ATCC) em ãmpolas congeladas» Elas foram imediatamente cultivadas e passadas através de monocamadas de acordes com as instruções fornecidas por ATCC» Depois de caracterização da velocidade de crescimento de cada linha de células, as células foram colocadas em pratos de 96 de fundo com a diluição apropriada para a formação de camadas sub-confluentes em fundos controlados no fim do ensaio» No dia seguinte estas culturas sub-confluentes, que mantinham ou um meio
MEN livre de soro, F‘RMI 1640 ou um meio McCov 5A, foram utili sadas num ensaio ds morte ds células padrão (Mosmann, d» Immunol, Methotís 65; 55 - 63, 1983; Edwards et al»„ Mol» Cell» Biol» ?!
2360 - 2867). 96 de fundo a horas depois,
Cada linha da células ' 10.000 células viáveis as células foram lavadas foram semeadas em pratos de por fundo. Vinte © quatro s e colocadas em meio livre
3© de soro que contém o composto teste sob estudo. Quarenta e oito horas depois» o número de células sobreviventes foi quantificado por utilização de ensaio de MTT [brometo de 3~<3,4-dimetiltiazol-2-il)~2,5-difeniltetrazálio3 como descrito por Kosmann, supra,, A actividade da toxina contra cada linha de células foi ensaiada, e os dados estão sumarizados no quadro seguinte, com actividade contra células £431 (carcinoma vulva) apresentadas para compara-
fictividade de TGF—alf a—FE4€* (EX 5) contra Linhas de Células de Carcinoma da Bexiga Humana
Linha de Células
ÇE^pM)*
J-82 13©
RT-4 18®
5A37 18©
SCaBER 23®
UMUC-3 83©
T-24 84©
TCCSUP 7«©©©
HTÍ197 í1.©0©
A431 79
* concentração (picomoles/litro) que reduz o número de células que sobrevivem depois de 4Θ horas a 5® % do número de células de controle.
Exemplo 7
Comparação de Várias Linhas de Células de Cancro Contra TGF-alfa - PE., AB, TGF-alfa - PE., ab do EX. 4 e TGF-alfa - PE., ab do EX. 5
CE5@S CpMl
Células Esquamousas AB ÍEX.4) ÍEX.51
A-431 39 163
A-431 146 161
A-431 314 183
A-431 77 297 207
HeLs 8356 310088 3988
SCC-4 “>*? “7 4m4< t 861 445
Scc-9 443 647 218
SCC-15 106 392 193
SCC-25 39 147 67
Glioblastoma
U13SMG 2fe?8tí9 >316nM 216609
U373MG >3i6nt f >316nM 2# 4-1*5 ò 4·
Adenocarcinoma do Peito
MDA-MB-46S 78 527 253
58 207 94
MCF-7 ί’3Π I :i6nM >316ηΜ ftrfsnocarcíriGflia do Colan
HT-29 7605
Linhas de Células Normais
CHO
NR-6
3ϊ6πΜ >3±6πΜ >3X6nM
316nM >3í6nM >3í6nM
I
Quadro 2
ATBSCTGCA6CAGTGGTGTCCCATTTTAATGACTGCCCA8ATTCCCACACTCAGTTCTGCTTCCATGGAACATGCAGGTTTTTGSTGCAGGAGGACAAGCCGSCATSTGTCTGCCATTCTSGGTACGTTSGTGCGCGCTGTGAGCATGCGGACCTCCTGGCTATGGCCGAAGABGGCGGCAGCCTGGCCGCCTGACCGCGCACCAGGCTTGCTTGCCACCTBCCGCTGGAGACTTTCACCCBTCATCGCCAGCCGCBCBGCTGGGAACAACTGGAGCAGT8CG8CTATCCG6TGCAGCSGCTGGTCGCCCTCTACCTBGGGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGGTCGACCAGGTGATCCGCAACGCCCTGGCCAGCCCCGGCAGCSGCBGCGACCTGGSCGAAGCGATCCGCGAGCABCCGGAGCAGGCCCGTCTGGCCCTGACCCTGGCCGCCGCC8AGAG8CAGCGCTTCGTCCGGCAG8GCACCGGCAACGACGAGGCCGGCGCGGCCAACGCCGAGGTGGTGAGCCTGACCTSCCCGGTCGCCGCCGGTGAATGCGCGSGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCCCTGCTGGAGCGCAACTATCCCACTSGCGCGGAGTTCCTCGGCGACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCSCGGCACSCAGAACTSGACSGTGSAeCGBCTBCTCCAGSCGCACCSCCAAGTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTCGGCTACCACGGCACCTTCCTCGAA8CGGC6CAAAGCATCGTCTTCGGCGGGGTGCGCGCGCGCAGCCAGGAGCTGGACGCGATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCGGCGCTGGCCTACGGCTACGCCCAGGACCAGGAACCCGACGCACGCGGCCGgatccgcaacggtggcctgctgcgggtgtatgtsgcgcgctcgagcctgccgggcttctaccgcACCAGCCT8ACCCT8GCCGCGCC88AGGCGGCGGGCSAGGTCGAACGSCT8ATC6í3CCATCCGC~
TGCCGCTSCGCCTGGACGCCATCACCGGCCGCGAGGAGGAAGGCGGGCGCCTGGAGAGCATTCT”
CGGCTGGCCGCTGGCCGAGCGCACCGTGGTGATTCCCTGGGCGATCCCCACCGACCCGCGCAAC6TCSGCGGCSACCTC8ACCC8TCCA8CATCGCCGACAA8SAACAGGC8ATCAGGBGCCTGCCGBACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGCGCGAGGACCTGAAGTAA
QUADRO 3
Sequência de amino ácidos de TSF-alfa-PE
4® •1' TSFa'
Met Ala Ala Ala'Vai Vai Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His ió
Thr Gin Phe Cys ·—. t
Phe His Sly Thr Cys Arg Phe Leu Vai Gin Glu Asp Lys Pro Ala Cys 36
Vai Cys His Ser
TSFa
Sly Tyr Vai Sly Ala Arg Cys Slu His Ala Asp Leu Leu Ala'Ala Met ' PE
Ala Glu'Glu Sly
263
Sly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Cys His Leu Pro Leu
X /
Slu Thr Phe Thr
283
Arg His Arg Gin Pro Arg Sly trp Slu Gin Leu Slu Sln Cys Sly Tyr 293
Pro Vai Sln Arg
303
Leu Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Sln Vai Asp 313
Sln Vai Ile Arg
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Sly Ser Sly Sly Asp Leu Sly Slu Ala Ile 333
Arg Glu Sln Pro
343
(31 u Gin Ala Arg 353 Leu Ala Leu 5 hr Leu Al tó Ala Ala . Slu Ser Slu Arg
Phe Vai Arg Gin -y .· ?·
Gly Thr Gly Asn Asp Glu ela Gly a 1 a Ala Asn Ala Asp Vai Vai Ser
3 z ·>
Leu Thr Cys Pro
Vai Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Por 333 Ala. Asp Ser Gly Asp Ala Leu
393
Leu Glu Arg Asn 403
Tyr Pro Thr Gly A1 a Glu Phe Leu G1 y Asp Gly Gly Asp Vai Ser Phe
413
Ser Thr Arg Gly 4 aí
Thr Gin Asn T rp Thr Vai Glu Arg Leu Leu Gin Ala M is Arg Gin Leu
433
Glu Glu Arg Gly 443
Tyr Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala. G1 n Ser
453
í le Vai Phe Gly 463
Gly Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala. He Trp Arg Gly Phe
473
Tyr He Ala Gly 483
Asp Pro A1 a Leu Ala Tvr z G1 y Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala
493
Arg Gly Arg He « 4 4t
Arg Asn G1 y Ala 513 Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu
S1 y Phe Tyr Arg
52'T
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Sly Glu Vai Glu
Leu Ile G1 y His 543
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Sly Pro Glu Glu Glu Sly
553
Sly Arg Leu Glu 563
Thr Ile Leu Sly Trp Pro Leu Ala G1 u Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser
573
Ala Ile Pro Thr 583
Asp Pro Arg Asn Vai Sly Sly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp
593
Lys Glu Gin Ala 603
Ile -ziS Γ- Ala Leu Pro Asp Tyr A1 a Ser Gin Pro Sly i v= Pro Pro Arg
613
Glu Asp Leu Lys
QUADRO 4
Sequência de amino ácidos de TBF-alfa-FE, -aB
-4 -1 ' TGFa 6
Met Ala Ala Ala Vai Vai Ser Hxs Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His
16
Thr Gin Phe Cys O A
Phe His íi 1 v Thr Cys Arg Phe Leu Vai Gin Glu Asp Lys Pro Ala Cys
36
Vai Cys His Ser 46 SA TGFa '
Gly Tyr Vai Gly Ala Arg Cys Glu His ela Asp Leu ftla'íiet Ala
Glu 'Glu Gly Gly 264
Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala. His Gin Ala Ala His Leu Pro Leu Glu
2/4
Thr Leu Thr A r g 284
His Arq Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu Gin A1 a Gly Tyr Pro
294
Vai Gin Arg Leu
Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Vai Asp Gin
314
Vai I le Arg Asn 324
A1 a Leu A1 a Ser Pro 81y Ser G1 y Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Are
Glu Gin Pro Glu
334
344
ΒI n Vai Ala Arg Arg Gin Leu Gly Ala Lsu Thr Leu Ala rt *1 . rtià ♦,5<S4 Ala Glu wSf Glu Arg Phe
Thr Sly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Vai Vai Ser Leu
374
Thr Cys Pro Vai 364
Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro h 1 a Asp Ser Gly Asp A i & L.GU Leu
394
Glu Arg Asn Tyr 404
Pro Thr Glu Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp V5 c I Ser Phe Ser
4Í4
Thr Arg 61 y Thr 424
Gin Asn Trp Thr Vai Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu Glu
434
Glu Arg Gly Tyr 444
Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala ALa Gin Ser Ile
454
Vai Phe S1 y Gly 4í?4
Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala He Trp Arg Gly Phe Tyr
474
He Ala Gly Asp 484
Pro A1 <3, Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg
494
Gly Arg He Arg
504 f Λ
Asn © 1 y Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly
5Í4
Phe Tyr Arg Thr 524
Ser Leu Thr Leu A1 a Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu
534
Ile Gly His Pro 544
Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro G1 u G1 u Glu SI y Gly
554
Arg Leu Glu Thr 564
Ile Leu Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Va1 Ile Pro Ser Ala
574
Ile Pro Thr ftsp 584
Pre Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp P ro Ser Ser Ile Pro Asp Lys
594
Glu Gin Ala I le 6ô4
Ser Ala Leu Pro Asp AlaSer Gin Pro Gly Lys Pro Pro < Arg i Glu
Asp Leu Lys
614
Quadro 5
Sequência de amino ácidos de TSF-alfa-ΡΕ^θ Ab
-1'TSFa rteu i-íla Ala Ais'Vai Vai Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp tíer Hxs
Thr Bln Phe Cys bc,Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Vai Sin Glu Asp Lys Pro Ala Cys
Vai Cys His Ser
TGFs
50,
Gly Tyr Vai Gly Ala Arg Cys Gku His Ala Asp Leu. Leu. Ala'Ala Met
A1 a G1 u' G1 u θ 1 y
Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Cys His Leu Pro Leu 273
Glu Thr Phe Thr
283
Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu Gin Cys Gly Tyr 293
Pro Vai Gin Arg
303
Leu Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Vai Asp 313
Gin Vai Ile Arg
Asn Ala Leu Ala Ser Pru Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile
Arg Glu Gin Por
343
81u 81n Ala. Arq Leu Ala Leu Thr Leu Ala ALa ALa Glu Ser Glu Arg
Phe Vai Arg Gin
Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala .Asp Vai Vai Thr
Leu Thr Ala Pro
ALa Leu
Vai Ala Ala Gly Glu Ala Ala Gly Pre Ala Asp Ser Gly Asp
TO”?
Leu Glu Arg Asn
403
Tyr Pre Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Vai Ser Phe 413
Ser Thr Arq Gly
423 lhr Gin Asn Trp Thr Vai Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu 433
Glu Glu Arq Glv
443
Tyr Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gin Ser 453
Ile Vai Phe Gly •HS-i
Gly Vai Arg Ala Arg 473
Tyr Ile Ala Gly
Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe
Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pre Asp Ala 493
Arg Gly Arg Ile
Arg Asn 01 y Ala Leu Leu n____ mí y Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu
513
Gly Phe Tyr Arg
523
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu AI <3. Ala Gly Glu Va 1 Glu
ET”?”’?’
Leu I le 01 y His
343
Pre Leu Pro Leu Arg Leu Asp η 1 a I la Thr Gly Pro Glu Glu Glu
553
Gly Arg Leu Glu
E.“ / T*
·_ίΟ·->
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu A x a Glu Arg Thr 1 5 .. 1 V -S j. Vai Ile Pro
573
Ala Ile Pro Thr
Asp Pre Arg Asn Vai S1 y Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro
%J*7
Lys G'I u Sin Ala
603
I le Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala ·. £3!=?r Gin Pro G1 y Lys i', r ro Pro
613
Glu Asp Leu Lys . f t
4-3
Quadro 6
Sequência de amino ácidos de TSF-al fa-PE^ ab
-1'TGFa
Met Ala Ala Ala/Vai Vai Ser His Phe Asn Asp Cys ‘Pro Asp Ser His líj
Thr Bln Phe Cys
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Vai Gin Glu Asp Pro L.ys Ala Cys
Vai Cys His Ser
Sly Tyr Vai Sly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Ala !jet Ala .-252 ' rc
G1 u ’ G1 u G1 y G1 y
264
Ser Leu Ala. Ala, Leu Thr Ala His Gin Ala .Ala His Leu Pro Leu Glu
Thr Leu. Thr Ar
284
His Arg Gin Pro Arg Sly Trp Glu Gin Leu Glu Gin Ala Sly Tyr Pro 294
Va.l Gin Arq Leu
304
Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Vai Asp Gin 314
Vai Ile Arq Asn •,>»í4
Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu. Ala Ile Arq 33·4·
Glu Gin Pro Glu
Λ
344
Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Λ 1 HifiS Ala Ala fcj 1 u □er aia Arg Η Hfô
Vai Arg u 1 ϊ ι 354 Gly 3A4
Thr 61 y Asn Asp G1 u Ala θ1 v Ala A i Si Asn Ala Asp Vai Vai Thr Leu.
374
Thr A1 a Pro Vai 3S4
Ala Ala Gly G1 u Ala A1 a Sly Pro M1 a Asp Ser GI y Asp Ala Leu Leu
394
i51 u Arg Asn Tyr 404
Pro Thr S1 y Ala GI u Γ htí L.£?U Gly Asp Gly Gly Asp Vai Ser Phe Ser
414
Thr Arg G1 y Thr 42*i
Gin Asn T rp Thr Vai Glu HFÇ| Leu Leu Gin Ala His Arg 61 n Leu Glu
434
Glu Arg Gly Tyr 444
Vai Phe Vai Gly Tyr His G1 y Thr Phe Leu Glu Ala η 1 a Gin Ser I le
454
Vai Phe Gly Gly 4 £>4
Vai Arg Ala Arg Ser G1 n Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe T y r
te ·* tt / £·%
Ile h 1 a Gly Asp 484
Pra Ala Leu Ala Tyr G1 y Tyr A1 a Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg
494
Gly Arg Ile Arg
rtS-F* Gly Ala Leu Leu Arg VAI Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly
514
Phe Tyr Arg Thr 524
Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu
534
Ue G1 y Pis Pre 544
Leu Pre Leu Arg Leu 1 · ·’· γ· Ala Ile Thr Gly Pro G1 u Glu Glu Gly G1 y
554
Arg Leu Glu Thr 564
Ue Leu G1 y Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile P ro Ser Ala
574
I le Pre Thr Asp 5S4
Pre Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu asp Pro Ss?r* Ser Ile Pro Asp Lys
594
Glu Gin Ala Ile 6ô4
Ser Ala Leu Pre Asp Tyr Ala Ser Gin Pro G1 y Lys Pro Pro Arg Glu
614
Asp Leu Lys

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES
    Ia. - Método para o tratamento de células cancerosas da bexiga, caracterizado por compreender o contacto das células cancerosas da bexiga com uma quantidade de uma proteína híbrida, que compreende um agente que tem por alvo as células seleccionado a partir de um membro da família EGF de hormonas peptídicas que se liga ao receptor de EGF das células do tumor da bexiga, e uma toxina de célula seleccionada a partir dos membros da classe da ribosilação de ADP de venenos de células de mamíferos, sendo a quantidade de proteína híbrida eficaz para matar as células concerosas da bexiga; sendo a gama de dosagem de proteína híbrida de 0,1 mg até 10 mg por dose.
  2. 2a. * Método de acordo com a reivindicação 1, carâcterizado por o agente que tem por alvo as células ser EGF ou TGF-alfa, e a toxina de célula ser PE4Q AB, PE40 Ab, PE4Q aB, ΡΕ4θ ab, toxina da difteria ou toxina ricina.
  3. 3a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína híbrida estar na forma de uma solução ou suspensão, num líquido fisiologicamente aceitável.
  4. 4*. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o líquido ser água esterilizada, água para injecção, solução salina ou solução salina tamponada contendo opcionalmente uma proteína de suporte.
  5. 5a. - Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o liquido ser uma solução salina tamponada com fosfato contendo opcionalmente albumina de soro humano.
    rizado por o líquido fisiologicamente -aceitável conter desde cerca de 0,1 mg a cerca de 10 mg de proteína híbrida por 60 ml» rizado por cerca de O, o líquido fisiologicamente aceitável 5 mg a cerca de 5 mg de proteína híbrida conter por 60 desde
    8a.
    t iL <Σ·.-..ϊ O pCff O cerca de 2 mg
    - Método de acordo com a reivindicação 3, caractelíquido fisiologicamente aceitável conter desde a cerca de 4 mg da proteína híbrida por 6Θ ml»
  6. 9ã« - Método de acordo com a reivindicação 3, caracte— rizado por o contacto ser contínuo durante um período desde cerca de 30 minutos a cerca de 4 horas» rizado por cerca de €
  7. 10a, - Método de acordo com -a a solução salina tamponada ,1 mg a cerca de Í0 mg de pro reivindicação 4, caracte— com fosfato conter desde teína híbrida por 60 ml„ r i ce íia, - Método ado por a solução s ca de 0,5 mg a cerca de acordo com a reivindicação 4, carac slina tamponada com fosfato conter de de 5 mg de proteína híbrida por 60 ml» tesde
    Í2â rizado por a cerca de 2 mg
    - Método de acordo com a reivindicação 4, caractesoluçSo salina tamponada com fosfato conter desde a cerca de 4 mg de proteína híbrida por 60 ml»
  8. 13ã. - Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o contacto ter lugar á temperatura ambiente»
  9. 14a. - Processo para a preparação de uma composição, caracterizado por se incluir na referida composição um líquido fisiologicamente -aceitável que na híbrida TBE-alfa - ΡΕΛ._. aB, 4v
    ΡΕ^θ ab que ê eficaz para matar contêm uma. concentração de proteíTBE-alfa - ΡΕΛ, Ab ou TBE-alfa células concerosas da bexiga»
  10. 15ã. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido líquido conter desde cerca de ®,i mg a cerca de 1® mg de proteína híbrida por 6Ô ml»
    163, - Processo de acordo caracterizado por o referido líquido o a cerca de 5 mg de proteína híbrida po com a reivindicação oter desde cerca de ® && m1»
    14, mg
    173, - Processo ds acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido liquido conter desde cerca de 2 mg a cercai ds 4 mg de proteína híbrida por 6® ml.
    183.- proc esse caracterizado por se obte salina tamponda com fosfato de suporte» de acordo com a reivindicação 15, uma composição que é uma solução opcionalmente contendo uma proteína
    193. caracterizada por soro humano.
    Processo a proteí de acordo com a reivindicação IS, a opcional ds suporte ser albumina de
    203.
    Pro para a preparação de protéinas híbridas
    TBE-alfa - PE„,. a.B, *!·£?
    potência aumentada, com sulfato de uma
    TBE-alfa - PE^ Ab ou lBE-a.lfa - PE^ ab de caracterizado por compreender a precipitação das proteínas híbridas anteriores- que tenha sido expressas numa célula transformada, e a purificação da. proteína híbrida por cromatografia de afinidade usando uma coluna de quelação de metais, e a não sujeição da proteína híbrida ao tratamento com ureia.
    caracteri
    21â. - Processo de acordo tome a< reivindicação 17, ada por o sulfato precipitante ser ÍNH^l^SO^.
PT98048A 1990-06-21 1991-06-20 Metodo de tratamento de celulas cancerosas da bexiga utilizando proteinas hibridas, nomeadamente pe40 modificado ligado a tgf-alfa PT98048B (pt)

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