PT93525B - Processo para a preparacao de polipeptideo pe40 modificado - Google Patents

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Description

A quimioterapia, tradicional do cancro baseia-se na capacidade das drogas para matar células tumorais em pacientes com cancro. Infelizmente, estas mesmas drogas frequentemente matam células normais da mesma mada que as células tumorais. 0 grau em que uma droga contra o cancro mata células tumorais relativamente às células normais é uma indicação de grau de selectividade do composto para as células tumorais. Um métoda para aumentar a selectividade de drogas contra o cancro relativamente às células tumorais é libertar as drogas preferencialmente nas células tumorais evitando ao mesmo tempo as populações de células normais. Um outro termo para libertação selectiva de agentes quimioterapêuticos em populações específicas de células é o direccionamento.
direccionamento de drogas para células tumorais pode ser conseguido de várias maneiras. Um métoda baseia-se na presença de moléculas de receptores específicos na superfície das células tumorais. Outras moléculas, referidas como agentes de direccionamento podem ser reconhecidas e ligarem-se a estes receptores da superfície celular. Estes agentes de direccionamento incluem, e.g., anticorpos, factores de crescimento au hormonas. Os agentes de direccionamento que reconhecem e se ligam a receptores específicos da superfície celular são referidos como alvejando as células que possuem aqueles receptores. Por exemplo muitas células tumorais possuem uma protêina na sua. superfície designada receptor ao factor de crescimento epidérmico. Vários factores de crescimento incluindo o factor de crescimento epidérmico (EGF) e o factor de crescimento transformante-alfa (TGF-alfa) reconhecem e ligam-se ao receptor de EGF nas células turaorais. EGF e TGF—alfa são pois agentes de direccionamento para estas células tumorais.
Os agentes de direccionamento por eles próprios não matam as células tuniorais. Outras moléculas incluindo venenos celulares ou toxinas podem ser ligadas a agentes de direccionamento para criar moléculas híbridas que possuem domínios de direccionamento para células tumorais e da toxina celular. Estas moléculas híbridas funcionam como venenos selectivos para células tumorais devido às suas capacidades para alvejar as células tumorais e depois matar estas células através do seu componente toxina. Alguns dos venenos celulares mais patentes usados na construção destas moléculas hibrída.s são toxinas ba.cteria.na.s que inibem a síntese protéica em células de mamífero. A exotoxina A de Pseudomonas (PE-A) é uma destas toxinas ba.ctérianas e tem sida usada para construir moléculas híbridas direccianador-toxina (Patente U.S. 4. 545. 985).
PE-A é uma proteína bacteriana de óó KD que é extremamente tóxica para as células de mamífero. A molécula de PE-A cantem tr'ã's domínios funcionais:
1) D domínio deligação amino-terminal, responsável pela ligação a uma célula susceptível;
2) 0 domínio de translocação localizado internamente, responsável pela libertação da toxina para o citossol;
3) 0 domínio enzimático amino-terminal, responsável pela intoxicação celular.
A PE-A tem sido usada na construção de moléculas de direccionador-taxina, agentes anti-cancro em que a molécula de óó KD é combinada com um agente direccionador
4específico de tumor (anticorpo monoclonal ou factor de crescimento). As moléculas direccionador-toxina produzidas deste modo tem maior toxicidade para células possuidoras de receptores para o agente de direccionamento.
Um problema, com esta abordagem é que o híbrido de PE-A e anticorpo ou factor de crescimento ainda possui uma toxicidade razoável mente elevada para células normais. Esta toxicidade é largamente devida à ligação da protéina híbrida a células através do domínio de ligação da PE-A. Para ultrapassar este problema, uma proteína foi produzida por via recombinante a qual possui apenas os domínios enzimático e de trans .1 ocação da exctoxina A de Pseudomonas (Hwang Cell, 49:127-132 1787). Esta proteina foi designaet a 1 da PE ma vez que tem um peso molecular de 40KD.. PE^ não possui o domínio de ligação de PE-A e è incapaz de se ligar a células de menops tóxica mamífero. Assim ΡΕ.Λ è consideràvelmente 40 do que a proteina intacta de 66KD. Como resultado, as moléculas de direccionador-toxina produzidas com PE^. foram muito mais especificos na sua toxicidade celular (Chawdhary et al.. Proc. Natl. Acad.
84:4583-4542, 1737).
Sc i. USA,
Ao trabalhai·—se com PE^^ encontrou-se que osresíduos císteina nas posiçSes 265, 287, 372 e 377 (numeração das moléculas nativas de PE-A de 66KD; Gray et al, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 81 , 2645-2647 (1784)) interferiram com a construção das moléculas de direccionador-toxina usando métodos de conjugação química. A natureza reactiva das ligaçSes dissu.1 fureto que estes resíduas formam levou a ambiguidade relativamente è integridade química do produto toxina direccionada.
LISTA DE TRABALHOS RELACIONADOS
1. A Patente U.S. 4.545.985 ensina que a exotoxina A de pseudomonas pode ser conjugado com anticorpos ou com o factor de crescimento epídermico. A Patente 4.545.985 ensina ainda que estes conjugados podem ser usados para, matar células tumorais humanas.
2. A Patente U.S. 4.664.911 ensina que os anticorpos podem ser conjugados com a cadeia A ou com a cadeia B de ricino que é uma toxina obtida a parir de plantas. A Patente 4.664.911 ainda ensina que estes conjugados podem ser usados para matar células tumorais humanas.
3. A Patene U.S. 4.675.382 ensina que hormonas tais como a hormona estimuladora de melamócitos (MSH) pode ser ligada, a uma porção da protéina da toxina da difteria via ligações peptidicas. A Patente 4.675.382 ensina ainda que os genes que codificam estas protéinas podem ser ligados uns aos outros para dirigir a síntese de uma protéina de fusão híbrida usando técnicas de DNA recombinante. Esta protéina de fusão tem capacidade para se ligar a células que possuem receptores MSH.
4. Murphy et al., PNAS USA 33:8258-8262 1986, ”Genetic construction expression, and melamona-selctive cytotoxiCity of a diphteria toxina-related alpha-me1anocute-stimulating hormons fusion protein. Este artigo ensina que uma protéina de fusão híbrida produzida em bactérias usando tecnologia de DNA recombinante e consistindo numa fracção de proteína da toxina da difteria ligada á hormona estimuladora de melanócitos alfa ligar-se-à e matará células de melanoma humana.
—6—
5. Kelley et a 1 . , PNAS USA 85:3930—5934 1988, Inerleukin 2-diphtheria toxin fusion protein can abolish cell-mediated immunity in viva. Este artigo ensina que uma proteína de fusão híbrida produzida em bactérias usando tecnologia de DNA recombinante e consistindo numa fracção da proteína da toxina da difteria ligada a interleuquina 2 funciona em ratinhos labro para suprimir a imunidade celu1 ar.
Structure Angstrom.
proteína A
Allured et of exotoxin Este artigo -da exotoxina al_. , PNAS USA 83:1320-1324 1986,
A of Pseudomonas aeruginosa at 3.0 ensina a estrutura tridimensional da de pseudomonas.
“Functiona1 by Deletion Este artigo
7. Hwang et al_. , Cell 43:129-136, 1937,
Domains of Pseudomonas Exotoxin Identified Analysis of the Gene Expressed in E.co1i.
ensina que a proteína A da exotoxina de pseudomonas pode ser dividida em tr'ê's domínios func:ionais distintos responsáveis por: ligação a células de mamífero, transbocação da proteína toxina através das membranas lisossonais e ribosilação com ATP do factor de alongação 2 dentro das células de mamífero. Este artigo ensina ainda que estes domínios funcionais correspondem a regiões distintasda proteína A da exotoxina de pseudomonas.
8. □ pedido de patente europeia 0 261 671 publicado em 30 de Março de 1988 ensina que uma fracção da proteína A da exotoxina de pseudomonas pode ser produzida não possuindo a função de ligação às células da proteína A completa da exotoxina de pseudomonas mas tendo as funções de translocação e ribosilação com ATP da proteína A total da exotoxina de pseudomonas. A fracção da proteína A da exotoxina de pseudomonas que mantém as funções de translocação e ribosilação com ADF' da proteína A completa de exotoxina de pseudomonas é designada exotoxina de pseudoinonas-40 ou PE-40. PE-40 consiste nos resíduos de aminoãcidos 252-613 da proteína A completa da exotoxina de pseudomonas como definido em Gray et al . , PMAS USA SI :2645-2649 1984. Este pedido de patente ensina ainda que F'E-40 pode ser ligada ao factor de crescimento transformante-alfa para formar uma proteína híbrida de fusão produzida em bactérias usando técnicas de DMA recombinante.
ming growth Este artigo
9. Chau.dhary et al. , PNAS USA 84:4538-4542, 1987,
Activity of a recombinant fusion protein between transforfactor type alpha and Pseudomonas exotoxin. ensina que as proteínas híbridas de fusão formadas entre PE-40 e o factor de crescimento transformante alfa e produzidas em bactérias usando técnicas de DNA recombinante ligar-se-ão e matarão células tumorais humanas possuidoras de receptores do factor de crescimento epidérmico.
10. Bailon et al.. Biotechnology, pág. 1326-1329 Nov. 1988. Purification and Partial Characterization of an interleukin 2-pseudomonas exotoxin fusion protein. Este artigo ensina que as proteínas híbridas de fusão formadas entre PE-40 e interleuquina 2 e produzidas em bactérias usando técnicas de DMA recombinante ligar-se-ão e matarão linhas de células humanas possuidoras de receptores da interleuquina 2.
OBJECTIVOS DO INVENTO
Constitui um objectivo do presente invento proporcionar modificações de ΡΕ^,θ inteqrida.de química e estrutura definida de moléculas de conjugado formados entre agentes de direccionamento e ΡΕ4Λ que ofereçam uma melhor modificada. é um outro objec um método para a preparação e modificada de entre proteíi agentes de direccionamento outros objectivos do presente da descrição que se segue.
SUMÁRIO DO INVENTO ivo deste invento proporcionar recuperação do domínio de F'E^ as de fusão formadas entre e FE.,- modificada. Estes e invento serão óbvios a partir presente invento proporciona modificações do domínio de PE^ que eliminara as ambiguidades químicas A substituição de provocadas pelas císteinas em F'E4f5. outros aminécidos tais como, e.g. resíduos por alanina, ou deleção de dois ou císteina melhora as propriedades biológicas e químicas dos conjugados formados entre ΡΕ^θ modificada e um agente? de de cisteina em mais resíduos direccionamento.
ΡESCRIçSQ DETALHADA DO INVENTO
As moléculas híbridas produzidas por conjugação de EGF e F'E,,. são caracterizadas em três sistemas de ensaios
Η V principais. Estes ensaios incluem: 1- ADF'-ribosi 1 ação do factor alongação 2 o qual mede a actividade enzimática de EGF-F’E4ft a qual inibe a síntese proteica em mamíferos, 2inibição da ligação de EGF’ marcado radioactivamente ao receptor de EGF em vesículas membranas de células A431 o que mede a actividade de ligação ao receptor de EGF de EGF-PE4ft,
3-C 4,5-dimeti 1 tiazol-2-i 11-2,5~dif en.i 1 tetrazól io (MTT) em formazano que é usado para medir a sobrevivência de células tumorais após exposição a EGF—PE^^. Estes ensaias são efectuados como préviamente descrio (Chung et al , Infection and Immunity, 16:832-641 1977, Cohen et al . , J. Biol. Chem.,
257:1523-1531 1982, Riemen etal., Peptides 8:077-885, 1987,
Mossman, J. Immu.nol. Methods, 65:55-63 1983).
Para criar conjugadas da proteína EGF-ΡΕ^θ com estrutura química definida melhores c a rac te r í s tic as biológicas, usámos moléculas de TGF-alfa-ΡΕ^θ expressos por via recombinante como fonte de material para PE^ modificada. Primeiro produzimos uma série de moléculas de DNA recombinante que codificaram TGF-alfa-PE versões -40· 0 gene
TGF-alfa-ΡΕ^θ original ou parental foi clonado molecularmente num vector bacteriano plasmídeo de expressão TAC (pTAC TGF'57-ΡΕ^) usando segmentos distintos de DNA clonado como descrita no Exemplo 1. O clone de DNA pTAC TGF57-PE especif icamente modificadas de TGF-alfa-F‘E.
ou ’40r foi reagente de partida para construir versões especif icamente modificadas do DNA de TGF-alfa-PE^. As modificações específicas do DNA de pTAC T6F57-PE^^ envolve mutações específicas de sítio na sequência de DNA codificador necessárias para substituir dois ou quatro dos codSes císteina dentro do domínio PE^ do DNA de pTAC TGF57-PE^^ com codSes para outros aminoácidos. Como alternativa, as mutações específicas de sítio podem ser alteradas de modo a eliminar dois ou quatro dos codSes císteina dentro usado como do domínio ΡΕ4Λ de pTAC TGF57-PE
As mutaçSes específicas de sítio no DNA de pTAC TGF57—ΡΕ^θ foram construídas usando osmétodos de Winter et al . , Nature 299:756-758 1982. No Exempla 2 estão apresentadas exemplos específicos dos DNAs mutagenizados de pTAC TGF57~PE4f).
Na T a be 1 a está apresentada a sequência de
aminoácidos de TGF-al fa-PE^ parental. Os quatro
de císteina no d om ί n i o PE^ da proteína híbrida.
TGF-alfa-PE díN parental são designados resíduos
resíduos le fusão 265 r.. 287 „. 37
Cis , Cis
Cis* de aminoácidos são de
As proteínas de fusão TGF-al fa-PE^ modificadas e Cis . Ds resíduos numerados como definido para a molécula nativa de PE-A 66KD (Gray et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, EU, 2645-2649 1984) usadas para gerar as moléculas de PE., modificadas contêm ** ~ ^65 ^87 substituições ou deleções dos resíduos CCis* e Cis 3 ou r„. 372 „. 379.. r„. 265 „ . 287 379 _ _
CCis e Cis 3 ou CCis , Cis e Cis 3. Para
Iocuí simplificar a monenclatura para as moléculas de ΡΕ^θ modificadas geradas a partir das proteínas de fusão modificadas, designamos os resíduos de aminoácidos nas posições 265 e 287 como o locus A e os resíduas nas posições 372 e 379 o B . Quando as cisteinas estão presentes nos resíduos >o e :omo na proteína de fusão parental TGF-alfa-PE , o locus é capitalizado (i.e. “A)
Quando as cisteinas são substituídas com outros aminoácidos ou eliminadas dos resíduos 265 e 237, o locus é representado por uma letra pequena a em baixo. Be modo semelhante quando os resíduos de aminoácidos nas posições 372 e 379 são cisteinas, o locus é representado por uma letra B em expoente enquanto uma letra b em baixo representa este locus quando os resíduos de aminoácidos nas posições 372 ou 379 são substituídos por outros aminoácidos ou eliminados. Assim quando os quatro resíduos de císteina no domínio ΡΕ^θ são substituídos com alaminas ou eliminados a PE^0 modificada é designada PE^^ab. De modo semelhante PP40 parental derivada da proteína de fusão TGF-al fa-PE^ com císteina nas posições dos resíduos de aminoácidos 265, 2S7, 372 e 379 podem ser designadas PE^ AB.
-11Os materiais de partida (i.e. a proteína híbrida TGF-alfa-ΡΕ^θΑΒ e as proteínas híbridas modificadas TGF-alfa~PE^ Ab, a Be ab) são produzidas em E.coli usando o sistema vector de expressão TAC descrito por Linemeyer et al . , Bi.otechnology 5:9ó€’-9ó5 1987. as proteínas de partida produzidas nestas bactérias foram colhidas e purificadas por lise das bactérias em hidrocloreto de guanidina seguido da adição de sulfito de sódio e tetrationato de sódio. Esta mistura de reacção foi subsequentemente dialisada e adicionada ureia para solubilizar proteínas que tenham precipitado da solução. A mistura foi centrifugada para remover material insolúvel e as proteínas híbridas recombinantes de partida TGF-al fa-PE^ foram separadas usando cromatografia de permuta iónica, seguido de cromatografia de exclusão por tamanho, seguido mais u.ma vez de cromatografia de permuta iónica.
Uma vez que o único resíduo de metiomina nas proteínas híbridas de parida está situado entre os domínios TGF-alfa e ΡΕ^θ, o tratamento com CNBr clivará as proteínas de partida, devido as proteínas PE^ modificadas e TGF-alfa. Os derivados S-sulfonatos purificados de TGf-alfa-FE^ foram então sujeitos a tratamento com CNBr para remover a fracção TGF da molécula. A fracção ΡΕ^θ modificada pretendida foi purificada por cromatografia de permuta iónica seguido de cromatografia de exclusão por tamanho. A ΡΕ^θ purificado modificada foi então derivatizada com um reagente heterobifuncional adequado, e.g. SPDP, para permitir a conjugação do agente de direccionamento pretendido. Após conjugação usou-se a cromatografia de exclusão por tamanho para isolar o conjugado de entre os materiais rião conjugados. Uma vez isolado o conjugado purificado, ele é testado quanto à actividade biológica usando o ensaio de ADP-ribosilação e os
-12ensaios importantes de liqação a receptores e viabilidade celular.
Ds exemplos que se sequem ilustram o presente invento sem no entanto limitar o mesmo. Todas as reacções enzimáticas necessárias às manipulações de biologia molecular, a menos que de outra modo seja especificado foram efectuados como descrito em Maniatis et al . , (1982) Em: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press.
Exemolo 1
Construção de clones de TGF-aifa-PE^.
□ segmento de usando trás séries de
-13DNA recombinante contenda DNA de
DNA de TGF-alfa oliqonucleotideos descrito por Defeo-Jones et al., Molecular and foi construído sintéticos como gene sintético de do clone pUC-19
Cellular TGF-alfa contendo
Biology 3:2999-3007 1983. Este foi clonado em p{JC-19. 0 DNA
TGF-alfa humano recombinante foi digerido com Sph I e EcoRI. A digestão gerou um fragmento de DNA de 2,3 K.b contendo todo o pUC-19 e a fracção 5' de TGF-alfa. 0 fragmento de 2,8 Kb foi purificado e isolado por electroforese em gel. Sintetizou-se uma cassete oligonuc1eotidica EcoRI a Sph I. esta cassete sintética tinha, a sequência indicada abaixo:
5'-CGGACCTCCTGGCTGCGCATCTAGG-3 ’
3'-GTACGCCTGGAGGACCBACGCGTAGATCCTTAA-í
Por conveniência, esta cassete oligonucleotídica foi designada 57. A cassete 57 foi emparelhada e ligada ao fragmento de 2,8 kb contenda TGF-alfa e formando um plasmídeo circularizado. Ds clones que continham a cassete foram identificados por hibridação com o DNA da cassete 57 marcada radioactivamente. A presença de TGf-alfa humano foi confirmada por sequenciação de DNA. A sequenciação também confirmou a presença de um sítio Esp recentemente introduzido no extrema 3' da sequência de TGF-alfa. Este plasmídeo designado TGF-al fa-57/p!JC-19 foi digerido com Hind III e Fsp I que deu origem a um fragmento de 168 pb contendo o gene TGF-alfa (GF-alfa-57). Uma preparação separada de pUC-19 foi digerida com Hind III e EcoRI que deu origem ao DNA
Λ
-14vector pUC-19 de 2,68 kb. 0 DMA de ΡΕ^Λ foi isolado a partir do plasmídeo pVC 8 (Cbaudhary et al, PNAS USA 84:4538-4542 1987). pVC8 foi digerido usando Mde I. Formou-se então um extrema cerse neste DNA usando as condições convencionais da reacção Klenow (Maniatis et al., supra p.113). 0 DMA com extremos cerses foi então sujeito a uma segunda digestão com EcoRI para dar origem a um fragmento EcoRI-Nde I de 1,3 kb (com extremos cerses) contenda PE^,, □ fragmenta Hind III-Fsp I de TGF-alfa-57 (168 pb) foi liqado ao vector pUC-19 de 2,68 kb. Após incubação durante a noite, o fragmento de DMA EcoRI-Nde extremos
Esta segunda ligação decorreu durante a noite. 0 produto da reacção de ligação foi então usado para transformar células
I (com cerses) da PE^ft foi adicionado à mistura de ligação
JM 109. identificados por
Os clones contendo TGF-alfa-57 ΡΕ^θ em pUC-19 foram hibridação com DNA de TGF-alfa-57 PE
4© marcado radioactivamente e o DNA deste clone foi isolado,
TGF-alfa-57 ΡΕ^θ foi removido do vector pUC-19 e transferido por Linemeyer et al., para um sistema vector TAC descrito Bio-Technology 5:960-965 1987). O pUC-19 foi digerido com Hind III e EcoRI para gerar u.m de 1,5 kb contendo TGF-alfa-57 PE
TGF-alfa-57 ΡΕ^θ em fragmento fragmento
Neste de DNA gerou-se fragmentos cerses usando condições convencionais de reaccão com Klenow (Maniatis cAS et al. , op ci.t. . □ vector TAC foi digerida com Hind III e EcoRI. Gerou-se extremos cerses no DNA do vector TAC digerido usando as condições convencionais de reacção com Klenow (Maniatis et al., op. cit. 0 vector de extremos cerses de 2,7 kb foi. isolada usando electroforese em gel. 0 fragmento TGF-alfa-57 PE^ de extremos cerses foi então ligado ao vector TAC de extremos cerses. D plasmídeo qerado por esta ligação foi usado para transformar células JM 109. Os clones candidatos contendo TGF-alfa-57 ΡΕΛΛ foram •χ
-15identificados por hibridação conforme indicado atrás sequenciados. 0 clone contendo a construção pretendida foi designado pTAC TGF57-PE^t?í. 0 plasmídeo gerado por estas manipulações está descrita na Tabela í. Na Tabela 2 está descrita a sequência de nucleótidos dos codSes de aminoácidos da proteína de fusSo TGF-alfa-PE β codificada pelo DNA de pTAC T6F-57-PE^ft. Na Tabela 3 está apresentada a sequência de aminoácidos codificada pelo gene TGF-57-ΡΕ^.
Exemplo 2
Construção de versões modificadas de clones de DNA contendo TGF-alf a-PErecombinante:
Substituição de císteinas por alaminas
TGF-alfa-PE40 aB:
clone pTACTGF57-PE40 foi digerido com Sphl e BamHI e isolado o fragmento SphI~BamHI de 75úpb (especificando os 5 aminoácidos C-terminal de TGF-alfa e os 243 aminoácidos N-terminais de PE..)„ D DMA do vector ΙΊ13 mpl9 40 foi cortado com Sphl e BamHI e isolado o DMA vector. 0 fragmento SphRI-BarnHI de TGF-alfa-PEfoi ligado ao DNA do vector 1Ί13 durante a noite a 15 C. As células hospedeiras bacterianas foram transformadas com esta mistura de ligação, os clones candidatos foram isolados e o seu DNA de plasmídeo foi sequenciado para assegurar que estes clones continham os DNAs recombinantes correctos. Preparou-se DNA de cadeia simples para mutagénese.
Sintetizou-se um oligonuc1etídeos (oligo #132) e usou-se na mutagénese dirigida para introduzir um sítio Hpal no DNA de TGF-alfa-PE^ na posição de aminoácidos 272 de
PE,,:
4q
5' CTGGAGCGTTAACCCGTC 3' (oligo #132)
Uma consequência desta, mutagénese dirigida foi a conversão do resíduo número 272 em ΡΕ^θ de feni1alamina para leucina. A mutagénese foi efectuada como descrito por Winter et al., Nature, 299:756-759 1982.
-17Um clone candidato contendo o novo sítio Hpal criado foi isolado e sequenciado para validar a presença da sequência genética mutagenizada. Este clone foi então cortado com Sphl e Sall. Um fragmento de 21® pb especifican do os 5 aminoãcidos C-terminais de TSF-alfa e os 7® aminoácidos N-terminais de PE^ft e contendo o sítio Hpal recentemente introduzido foi isolado e subclonado novamente no plasmídeo parental pTAC TGF57-PE4® nos sítios Sphl-Sall. As células hospedeiras bacterianas foram transformadas, um clone candidata foi isolada e a seu DNA de plasmídeo foi sequenciado para assegurar que este clone continha o DNA recombinante correcto. Por conveniência este clone foi designado pTAC TGF57-PE4®-132.
pTAC TGF57-F‘E4®~132 foi digerido com Sphl e Hpal e isolado um fragmento de DNA de 3,Pó kb. Uma cassete oligonucleotídica sintética (oligo #153) abrangendo os 5 aminoãcidos C-terminais de TGF-alfa e os 32 aminoãcidos N-terminais do PE^^ e contendo extremos compatíveis Sphl e Hpal foi sintetizado e ligado ao pTAC TGF57—PE40—132 digerido:
5' CGGACCTCCTGGCCATGGCCGAAGAGGGGGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCA
3’ gtacgcctggaggaccggtaccggcttctcccgccgtcggaccggcgcgactggcgcgt
CCAGCTGCACACCTGCCGCTGGAGACGTT 3'
GGTCGACGTGTGGACGGCGACCTCTGCAA 5' (oligo #153)
Esta cassete oligonucleotídica incorporou uma alteração no DNA de TGF-a1fa-PE^ de tal forma que o codão que especificava cisteina no resíduo 265 agora passou a especificar alamina. Por conveniência este DNA de plasmídeo foi designado pTAC TGF57-PE40-132, 153. As células hospedeiras bacterianas foram transfarmadas com DNA de pTAC
TGF57-PE40-132, 153. Os clones candidatos foram identificados por hibridação isolados s o seu DNA de plasmídeo foi sequenciado para assegurar que continha o DNA recombinante
-18adequado.
DNA de pTAC TGF57-PE4®-132, 153
Hpal e Sall e isolado um DNA ol igonucleotídica sintética resíduos de aminoácidos 272 mos Hpal e Sall compátiveis de pTAC TGF/PE4® 132, 153 de vector de 3,95k (oligo 4142) a 309 de PE^ e foi sintetizada
3,95 kb.
foi digerido com b. Uma cassete abrangendo os contendo extree ligada ao DNA
5' aacccgtcatcgccagccgcgcggctgggaacaactggagcaggctggctatccggtgc 3’ TTGGGCAGTAGCGGTCGGCGCGCCGACCCTTGTTGACCTCGTCCGACCGATAGGCCACG
AGCGGCTGGTCGCCCTCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGG 3'
TCGCCGACCAGCGGGAGATGGACCGCCGCGCCGACAGCACCTTGGTCCAGCT 5' (oligo #142)
Esta, cassete ol igonucleotídica altera o codão que especifica císteina no resíduo 287 de tal forma que o codão passa a especificar alamina. Par conveniência este DNA de plasmídeo mutagenizado foi designado pTAC TBF57-PE4®~132, 153, 142. As células hospedeiras bacterianas foram transformadas com este plasmídeo e os clones candidatos foram identifiçados por hibridação. Estes clones foram isoladas e o seu DNA de plasmídeo foi sequenciado para assequrar que continha α DNA recombinante adequado. 0 plasmídeo pTAC TGF57-PE40-132 153 142 codifica o variante TGF-alfa-PE^ com ambas as císteinas no locus A substituídas por alaminas.
Portanto, seguindo a nomenclatura descrita anteriormente esta versão modificada de TGF-alfa-ΡΈ^θ é designada TGF—alfa
-PE4A a B. A sequência de aminoácidos codificada pelo gene
TGF-alfa-ΡΕ^θ está apresentada na Tabela 4.
TGF-alfa-PE4© Ab:
□ clone pTAC57-PE40 foi digerido com Sphl e BamHI e isolado o fragmenta Sphl-BamHI de 750 pb (especificando as 5 aminoácidos C-terminais de TGF-alfa e os 252 aminoácidos N-terminais de PE. ,2. 0 DNA do vector M13 mpl9 foi cortado com Sphl e BamHI e isolado o DNA vector. 0 fragmento Sphl-BamHI de 750 pb de TGF-alfa-PE^ foi ligada ao DNA do vector M13 durante a noie a ÍS^C. As células hospedeiras bacterianas foram transfarmadas com esta mistura de ligação, os clones candidatos foram isolados e o seu DNA de plasmídeo foi sequenciado para assegurar que estes clones continham os DNAs recombinantes correctos. Preparou~se DNA de cadeia simples para mutagénese.
Sintetizou-se um oligonucleotídeo (oligo #133) e usou-se na mutagénese dirigida para introduzir um sítio BstelI no DNA de TGF-alfa-ΡΕ^θ na posição de aminoácidos 369 do PE40:
5' GACGTGGTGACCCTGAC 3' (oligo #133)
Uma consequência desta mutagénese foi a conversão do resíduo serina na posição 369 da PE^ numa treomina.
Um clone de DNA contenda o sítio BstelI recentemente criado foi identificado, isolado e sequenciado para assegurar a presença do DNA recombinante correcto. Este clone foi em seguida digerido com as enzimas de restrição
Apal e Sall. Uma inserção de DMA de 120 pb contendo o sítio
BstelI recentemente criado foi isolado e ligado <
TGF57-PE40 que também tinha sido digerido com Apsl e
Células hospedeiras bacterianas foram transformadas clone candidato foi isolado e sequenciado para assegurar que o DNA recombinane correcto estava presente. Este DNA de plasmídeo recentemente criado foi designado pTAC TGF57-PE40-133. Ele foi digerido com BstelI e Apal e isolado o fragmento de DNA vector de 2,65 kb.
-20pTAC Sal I .
e um aliminadado enzimas de
Sinetizou-se uma cassete oliqonucleotídica BstelI-Apal (oligo #155) que abrangeu a região de TGF-a1fa-PE^ clone pTAC TGF57-PE40-133 digerido com as restrição BstelI e Apal. Esta cassete também especificou a sequência nucleotidica para extremos compatíveis BstelI e Apal.
5' 6TGACCCTGACCGCGCCGGTCGCCGCCGGTGAAGCTGCGGGCC 3'
3' GGACTGGCGCGGCCAGCGGCGGCCACTTCGACGC 5' (oliqo #155)
Esta cassete oligonucleotídica alterou os codões das císteinas nos resíduos 372 especificadores de alaminas. A #155 foi ligada ao fragmento DMA vector de 2,ó5 kb. Células hospedeiras bacterianas foram transformadas e os clones candidatos foram isolados e sequenciados para assegurar que o DNA recombinante adequada estava presente. Este clone de DNA recentemente criado foi designado pTAC TGF57-PE40-133, 155. Ele codifica a variante de TGF-alfa-PE^ com ambas as císteinas no locus B substituídas por alaminas. Portanto seguindo a nomenclatura arãs descrita esta versão modificada de TGF-alfa-PE, e 377 de cassete oliqonucleotídica
PE^ft para codSes foi designada TGF-alfa-PE
Ab.
sequência de aminoácidos codificada pelo gene TGF-al fa-PE^ está apresentada na Tabela 5.
TGF-alfa-PE., ab:
-PE^f1 Ab foi também digerido com Sall e Apal plasmídeo pTAC-TGF57-PE40-132, 153, 142 codificador de TGF-alfa-ΡΕ^θ aB foi digerida com Sall e Apal e o fragmenta de DNA vector resultante de 3,8 kb foi isolado. G plasmídeo pTAC TGF57—ΡΕ4Θ—133, 155 codificador de TGF-alfae isolada a fragmento de DNA resultante de 140 pb contendo as alterações de císteina para alamina nos resíduos de aminoácidos 372
379 de ΡΕ^θ. Estes dois DNAs foram ligados um ao ouro e
e
Os um usados para transformar células hospedeiras bacterianas. clones candidatos foram identificados por hibridação com fragmento de DNA de 140 pb marcado radioactivamente derivado de pTAC TGF57-PE40-133, 155. 0 DNA de plasmídeo dos clones candidatos foi isolado s sequenciado para assequrar a presença, do DNA recombinante correcta. Este clone de DNA recentemente criado foi designado pTAC TGF57-PE40-132, 153,
142, 133, 155. Este plasmídeo codifica a variante TGF-alfa-PE^ft com as quatro císteinas nos 1ociA e B substituídas por alaminas. Portanto, seguindo a nomenclatura anteriormente descrita esta versão modificada de TGF-al fa-PE^ é designada TGF-al fa-PE^ ab,
A sequência de aminoácidos codificada pelo gene TGF-al fa-PE^ ab está apresentada na Tabela 6.
1.
Exemplo
ProduçSo e isolamento de proteínas de partida recombinantes TGF-alfa-PE. .
Células de E col i JM-109 transformadas foram cultivadas em frascos de agitação de 11 em 500 ml de caldo
LB na presença de 100 ug/ml de ampicilina a 371C. Após o valor de absorvSncia especfotomêtrica A... ter atingido 0,6 Ó00 adicionou-se isopropil B-D-tiogalactopiranosido para uma concentração final, de 1 mM. Após 2 horas as células foram colhidas por centrifugação.
As células foram lisadas em hidrocloreto de guanidina 8M, 50 mM ris, 1 mM EDTA, ρΗΒ,Θ por agitação à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura de lise foi levada a sulfito de sódio 0,4 M e tetrationato de sódio 0,1 M através da adição de reagentes sólidos e o pH foi ajustado a 9,0 com IM NaOH. A reacção foi deixada a decorrer à temperatura ambiente durante ló horas.
A solução de proteína foi dialisada contra um excesso de volume de 10 000 vezes de 1 mM EDTA a 4^C. A mistura foi então levada a ureia 6M, 50 mM NaCl, 50 mM Tris, pH8,0, à temperatura ambiente e agitado durante 2 horas. 0 material não dissolvido foi removido por centrifugação a 32 000 xg durante 30 minutos.
□ sobrenadante clarificado do passo anterior foi aplicado numa colu.na de 26x40 cm de DEAE Sepharose Fast-Flow (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) equilibrada com ureia 6M, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH8,0 a um fluxo de lml/minuto. A coluna foi lavada com o tampão de equílibrio até os
evidenmateriais não absorvidas serem removidos, conforme ciada por uma absorvãncia espectofotométicra de UV Α^.θ^ abaixo de 0,1 no tampão de equilíbrio tal como sai da coluna. A proteína de fusão absorvida foi eluida da coluna com u.m gradiente de 11 de NaCl 50—350 mM e depois concentrada rííim concentrador Ainicom com uma célula agitada adaptado com uma membrana YM-30.
A proteína de fusão concentrada (8 ml) foi aplicada. numa coluna de 2,5x 100 cm de Sephacryl S-300 (Pharmacia LKB Biotechmology, Inc.) equilibrada com ureia 6M, 5Õ mM Tris, 50 mM NaCl, ρΗΘ,Ο, a um fluxo de 0,25ml/minuto. A coluna foi eluida com mais tampão de equilíbrio e colheram-se fracções de 3ml. As fracções contendo actividade? de
TGF-alfη-ΡΕλλ forain reunidas. η·ν
As fracções reunidas da coluna S-300 foram aplicadas numa coluna Sepharose Q Fast-Flow de 1,6x40 cm (Pharmacia LKB Biotechnoloqy, Inc.) equilibrada com ureia 6M, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pHS,0 num fluxo de 0,7 ml/minuto. A coluna foi lavada com o tampão de equilíbrio e depois eluida com um gradiente de 600 ml de NaCl 50-450 mM. As fracções contendo a actividade de TGF-a.1 fa-PE„Λ foram reunidas e depois dialisadas contra 50 mM glicina pH'?,0 e guardadas a
Exemplo 4
Clivagem de proteínas de partida TGF-al f a-PE^ com CNBr e isolamento de PEe modificadas (F'E^ AB, FE^ Ab, PE^ aB, PE4. ab)
A proteína de fusão pretendida, ainda na forma sulfonada foi dial isada contra 107. (v/v) de ácido acético em água, depois liofilizada. A proteína liofilizada foi dissolvida numa quantidade suficiente de 0,1M HC1 desgascado para dar uma concentração de proteína de Img/ml. A solução de proteína/HCl continha 5 moles de triptofano/mole de proteína, de fusão. Adicionou-se CNBr (500 equivalentes por equivalente de metionina) e deixou-se decorrer a reacção durante 18 horas à temperatura ambiente no escuro. Os fragmentos de digestão grandes, incluindo a PE^ modificada, pretendida, foram então separadas da mistura de reacção por filtração em gel (e.g., Sephadez G-25) em ácido acético a 257. (v/v). as fracções contendo PE^ modificada foram reunidas e liofilizadas.
No caso das proteínas modificadas contendo císteina (i.e. F’E^ft AB, PE^ aB e PE^ é necessário formar as fontes dissulfureto necessárias antes de se proceder à purificação. A proteína liofilizada é pois dissolvida numa quantidade suficiente de 50 mM glicina, pl-i 10,5 para dar uma UV Ας,θή=0,1 . Adicionou-se beta-merca.ptoctanol para dar numa proporção molar de 4:1 relativamente ao número teónico de grupos 3-sulfonat.a presentes na amostra de proteína. Deixou-se prosseguir a reacção durante ló horas a 4^C, após o que a solução foi dialisada contra um excesso de 10 000 vezes de um tampão contendo 20 mM Tris, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pHS,0.
As fracções da coluna de permuta aniónica contendo a PE^ pretendida foram reunidas com base na actividade de
ADP-ribosilação e no teÊr proteico determinado por SDS-PAGE.
As fracções reunidas foram concentradas usando uma membrana com um peso molecular de exclusão de 3© ©©O (YM-3©, Amicon).
As fracções reunidas foram aplicadas numa coluna de 2,6x1©© cm de filtração em gel Sephacryl S-20© (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.), equilibrada e eluida com 2© mM Tris, 5© mM NaCl, 1 mM EDTA, pHS,© num fluxo de ©,75ml/minuto. As fracções da cromatografia de filtração em gel foram reunidas com base na ADP-ribosilação e SDS-PAGE.
Se bem que este processo de material suficientemente puro para a maior parte dos fins, incluiu-se um outro passo cromatográf .ico para produzir material altamente homogéneo» Este passo cromatográfico final foi a filtração em gel de alta resolução, usando uma coluna de ©,75x6© cm Bio-Sil TSK-25© (Bio-Rad). Na preparação para a cromatografia na coluna TSK-25©, as amostras são concentradas num sistema Centriprep—3© (Amicon) e a concentração proteica A amostra foi dissolvida em ureia 6M, mM, 1©© mM NaCl, pH7,1, A coluna foi fosfato de sódio 1©© mM, 1©© mM NaCl, ©,5 ml/minuto. As fracções do passo de filtração em gel de alta resolução foram reunidas com base na ADP-ribosilação e SDS-PAGE.
ajustada a 5 mg/ml. fosfato de sódio 1©© eluida. com ureia 6M, 7,1, a um fluxo de
Exemplo 5
-26Conjugação de EGF com PE^fts modificadas e isolamento dos conjugados
Para conjugar EGF com ΡΕ^θ modificada, é necessário derivatizar EGF e F’E4ô com agentes heterobifuncionais de modo a conseguir-se uma ligação covalente entre as duas moléculas. Na preparação para a derivatização, as amostras fosfato solução de PE, de ΡΕ^θ modificada são dialisadas contra O,1M NaCl, de sódio O,1M, pH'7,0. Após dialise, a modificada foi ajustada a 4 mg/ml de ΡΕ^θ usando o tampão de diálise, dando uma concentração de 100 uM. Uma quantidade suficiente de uma solução 20 mM de N-succinimidi1-3-<3-piridil ti tio > -propionato (SF'DP, Flerce) em etanol foi adicionada à solução de proteína para dar uma concentração final de 300 uN para SPDP. Esta concentração represena uma proporção de 3sl de SPDP para PE40. A reacção de derivatização decorreu á temperatura ambiente durante 30 minutos, com agitação ocasional da mistura. A reacção foi parada pela adição de um grande excesso de glicina (aproximadamente um excesso molar de 50 vezes relativamente à quantidade inicial de SPDP). 0 derivado resulante de 3-(2—piridi1d.i tio)propioni1o foi designado PDP-ΡΕ^θ. Os reagentes não proteicos foram removidos odo produto por diálise intensa contra ureia 6M, '40
0,lN NaCl, fosfato de sódio 0,lM, pH7,5. F’DP introduzidos na PE,^ modificada descrito por Carlsson et al „ , Biochem. J número de grupos determinado como
173:723-737, 1973.
derivado PDP-EGF é preparado por dissolução de EGF liofilizado (grau de pureza Receptor, Col1aborative Research) numa quantidade suficiente de 0,lM NaCl, fosfato de sódio õ,lN pH7,0 para dar uma concentração final de 150
uM para EGF. Uma quantidade suficiente de uma solução 20 rnM de SPDP em etanol foi adicionado à solução de EGF para dar uma concentração final de 450 uM para SPDP, represenando uma proporção de 3:1 de SPDP para EGF. a reacção de derivatização decorreu, à temperatura ambiene durante 30 minutos, com aqitação ocasional da mistura. A reacção foi parada pela adição de um grande excesso de glicina (um excesso molar de aproximadamente 60 vezes relativamente à quantidade inicial de SPDP). Os reagentes não proteicos foram removidos da produto por diálise extensiva contra ureia 6M, 0,1M NaCl, fosfato de sódio 0,1M, pH7,5. 0 número de grupas PDP introduzidos em EGF foi determinado como descrito por Carlsson et al. , Efiochem. J . , 173: 723-737 1978) .
Usando os derivados descritos atrás PDP-PE
4© ou
PDP—EGF podem ser reduzidos a pH acídico de forma, a gerar o derivado de 3-tiopropionilo, na presença de dissulfuratos intactos nativos (Carlsson et al., supra). No entanto, a estratégia preferida é a geração de um tiol livre na PE modifiçada.
PDP-PE.,, (0,4 ml de uma solução 100 uM de PDP-PE...
· 40 en ureia óM, 0,1M NaCl, fosfato de sódio 0,1M, pH7,5) foi dialisado contra várias mudas de 500 ml de um tampão contendo ureia 6M, acetato de sódio 25 mM, pH5,5 a 4^C. Após diálise adicionou-se 20 u.l de ditiotreitol 100 mM (concentração final 5 mM) ao PDP-ΡΕ^θ. A redução decorreu durante 10 minutos à temperatura ambiente e foi terminada por diálise da mistura de reacção contra ureia óM, acetato de sódio 25 mM, EDTA 1 mM, pH5,5, a 4^C. Repetiu—se a diálise contra este tampão e a amostra foi depois dialisada contra 0,1M Na.Ll , fosfato de sódio 0,1M, pH7,5. 0 material gerado por estas manipulações foi designado tiopropion i 1-PE^ .
-28Nat preparação para conjugação, F’DF'--EGF (0,8 ml de uma solução 150 υΙΊ sm ureia óM, Ο,ΙΙΊ NaCl, fosfato de sódio 0,1M, pH7,5) foi d.ialisado contra várias midas de 0,ÍM NaCl, fosfato de sódio 0,1M, pH7,5 a 4k:)C, piara libertar a amostra ds ureia. Depois desta diâlise, a solução de F’DF'-E8F e a solução de tiopropiioni 1-F'E4f) foram combinadas e a mistura de reacção incubada à temperatura ambiente durante 1 hora. 0 progresso da reacção pode ser controlado medindo a liberação de piridina-2-tiona como descrito (Carlsson et al., supra). a reacção foi parada por diâlise contra várias mudas de ureia 6M, 0,1M NaCl, fosfata de sódio 0,1M, pH7,5, a 4^0.
Os conjugados foram purificados por cromatografia de exclusão por tamanho, usando uma coluna de alta resolução de 0,75x60 cm de Bio-Sil TSK-250 (Bio-Rad).
eluida com ureia óM, fosfato de sódio 0,1M pH7,1 , a um fluxo de 0,5 ml/minutc·. As fracçSes do passo de filtração em gel de alta resolução foram com base na ADP-ribosilação e SDS-PAGE.
A coluna foi NaC1 0,1Μ,
Exemplo 6
Conjugação de TSF-alfa com PE^^s modificadas e isolamento dos conjugados
Conjugação de TGF-alfa com PE^s modificados. Os conjugados de TGF-alfa e de PE^ modificada foram preparados de modo análogo aos conjugados de EOF descritos no Exemplo
Exemplo 7
Actividades biológicas dos conjugados de TGF-alfa-PE^ft modificada
As actividades biológicas importantes dos conjugados de TGF-al fa-PE^ modificada são semelhantes às respectivas actividades biológicas da TGF-alfa-PE^ híbrida descrita no pedido de patente U.S. N.S. 312 540 entregue em 17 de Fevereiro de 1787 por Allen Oliff, Deborah D. Jones e Gwynneth Edwards.
TABELA 1
Ampr
ZecoriA
VHindlIIy PE40 (NDEI /PSTI)
íHindIII A VECORlJ
-t>
(BAM hi)
TABELA 2
ATGGCTGCAGCAGTGGTGTCCCATTTTAATGACTGCCCAGATTCCCACACTCAGTTCTGCTTCCATGGAACATGCAGG
TTTTTGGTGCAG6AGGACAAGCCGGCATGTGTCTGCCATTCTGGGTACGTTGGTGCGCGCTGTGAGCATGCGGACCTC ctggctgctatggccgaagagggcggcagcctggccgcgctgaccgcgcaccaggcttgccacctgccgctggagact
TTCACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAACTGGAGCAGTGCGGCTATCCGGTGCAGCGGCTGGTCGCCCTC tacctggcggcgcggctgtcgtggaaccaggtcgaccaggtgatccgcaacgccctggccagccccggcagcggcggc
GACCTGGGCGAAGCGATCCGCGAGCAGCCGGAGCAGGCCCTGGCCCTGACCCTGGCCGCCGCCGAGAGCGAGCGCTTC
GTCCGGCAGGGCACCGGCAACGACGAGGCCGGCGCGGCCAACGCCGACGTGGTGAGCCTGACCTGCCCGGTCGCCGCC
GGTGAATGCGCGGGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCCCTGCTGGAGCGCAACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGC
GACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCACCGCCAA
CTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTCGGCTACCACGGCACCTTCCTCGAAGCGGCGCAAAGCATCGTCTTCGGCGGG
GTGCGCGCGCGCAGCCAGGACCTCGACGCGATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCGGCGCTGGCCTACGGC
TACGCCCAGGACCAGGAACCCGACGCACGCGGCCGGATCCGCAACGGTGCCCTGCTGCGGGTCTATGTGCCGCGCTCG
AGCCTGCCGGGCTTCTACCGCACCAGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGCGAGGTCGAACGGCTGATCGGC
CATCCGCTGCCGCTGCGCCTGGACGCCATCACCGGCCCCGAGGAGGAAGGCGGGCGCCTGGAGACCATTCTCGGCTGG
CCGCTGGCCGAGCGCACCGTGGTGATTCCCTCGGCGATCCCCACCGACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACCCG
TCCAGCATCCCCGACAAGGAACAGGCGATCAGCGCCCTGCCGGACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGCGCGAG
GACCTGAAGTAA i'
TABELA 3
Sequência de aminoácidos
TGF-a 1fa-ΡΕηθ
-4 Met -3 Al a -2 Ala -i IrGFa1 His Phe 6 16 Cys 36
Ala l/al Vai Ser Asn 26 Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gin Phe
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Vai Gin 46 Glu Asp Lys Pro 50 TGFtt Ala 1 Cys Vai Cys His Ser kc252
Gly Tyr Vai Gly Al a Arg Cys Glu His Al a Asp Leu u Al a kl a Met Al a Glu blu Gly
263 273
Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Al a His Gin Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr
283 293
Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu Gin Cys Gly Tyr Pro Vai Gin Arg
303 313
Leu Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Vai Asp Gin Vai Ile Arg
323 333
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gin Pro
343 353
Glu Gin Al a Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin
363 373
Gly Thr Gly Asn Asp Glu Al a Gly Ala Ala Asn Ala Asp Vai Vai Ser Leu Thr Cys Pro
383 393
Vai Ala Al a Gly Glu Cys Ala Gly Pro Al a Asp Ser Gly Asp Al a Leu Leu Glu Arg Asn
403 413
Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Vai Ser Phe Ser Thr Arg Gly
423 433
Thr Gin Asn Trp Thr Vai Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu Glu Glu Arg Gly
443 453
Tyr Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Al a Ala Gin Ser Ile Vai Phe Gly
463 473
Gly Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly
TABELA 3(Cont.)
Sequência de aminoácidos de TGF-alfa-PE.„
483 493
Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile
503 513
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg
523 533
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly His
543 553
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu
553 573
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr
583 593
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala
603 613
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
TABELA 4
-4 Met Sequências d e 1 Vai aminoác Ser His Phe idos de TGF 6 Asn Asp Cys Pro -alfa-PE Asp Ser His 40aB Thr Gin Phe 16 Cys
-3 Ala -2 Ala -1 trGFa Ala pai
26 36
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Vai Gin 46 Glu Asp Lys Pro TGFa50 Ala 1 Cys Vai Cys His Ser h252
Gly Tyr Vai Gly Ala Arg Cys G1 u His Ala Asp Leu Leu Ala Kl a Met Ala Glu bl u Gly
263 273
Gly Ser Leu Al a Al a Leu Thr Ala His Gin Ala Al a His Leu Pro Leu Glu Thr Leu Thr
283 293
Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp G1 u Gin Leu Glu Gin Ala Gly Tyr Pro Vai Gin Arg
303 313
Leu Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Vai Asp Gin Vai Ile Arg
323 333
Asn Al a Leu Al a Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gin Pro
343 353
Glu Gin Al a Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin
363 373
Gly Thr Gly Asn Asp Glu Al a G1 y Ala Ala Asn Ala Asp Vai Vai Ser Leu Thr Cys Pro
383 393
Vai Ala Ala Gly Glu Cys Al a Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn
403 413
Tyr Pro Thr Glu Ala G1 u Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Vai Ser Phe Ser Thr Arg Gly
423 433
Thr Gin Asn Trp Thr Vai Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu G1 u Glu Arg Gly
443 453
Tyr Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gin Ser Ile Vai Phe Gly
463 473
Gly Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly
TABELA 4
Sequência de aminoácidos de
TGF-alfa-PE40aB
483
Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp 503
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro 523
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala
543
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala lie Thr Gly 563
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr 583
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro 603
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro
493
Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile 513
Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg 533
Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly His 553
Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu 573
Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr
593
Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala 613
Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
TABELA 5
Sequência de aminoácidos de TGF-alfa-PE^Q Ab
-4 -3 -2 -1 IrGFa1 6 16
Met Ala Ala Ala |/al Vai Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gin Phe Cys
26 36
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Vai Gin Glu Asp Lys Pro Ala Cys Vai Cys His Ser
50 I ι 252
46 TGFft 1 RE
Gly Tyr Vai Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Ala kla Met Ala Glu blu Gly
263 273
Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr
2Θ3 293
Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu Gin Cys Gly Tyr Pro Vai Gin Arg
303 313
Leu Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Vai Asp Gin Vai lie Arg
323 333
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gin Pro
343 353
Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin
363 373
Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Vai Vai Thr Leu Thr Ala Pro
383 393
Vai Ala Ala Gly Glu Ala Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn
403 413
Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Vai Ser Phe Ser Thr Arg Gly
423 433
Thr Gin Asn Trp Thr Vai Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu Glu Glu Arg Gly
443 453
Tyr Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gin Ser Ile Vai Phe Gly
463 473
Gly Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly
TABELA 5
Sequência de aminoácido de TGF-alfa-PE4QAb
483 493
Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile 503 513
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg 523 533
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly His 543 553
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu 563 573
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr 583 593
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala 603 613
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
Sequê nci a de ami noáci dos ι de T GF- a 1: fa- pel ioal b
-4 -3 -2 -1 IrGFa1 6 16
Met Ala Ala Ala kal Vai Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gin Phe Cys
26 36
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Vai Gin Glu Asp Lys Pro Ala Cys Vai Cys His Ser
46 TGF a50 1 1 rt25 2
Gly Tyr Vai Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Ala Rl a Met Ala Glu kiu Gly
263 273
Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin Ala Ala His Leu Pro Leu Glu Thr Leu Thr
283 293
Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin Leu Glu Gin Ala Gly Tyr Pro Vai Gin Arg
303 313
Leu Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gin Vai Asp Gin Vai Ile Arg
323 333
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gin Pro
343 353
Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin
363 373
Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Vai Vai Thr Leu Thr Ala Pro
383 393
Vai Ala Ala Gly Glu Ala Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn
403 413
Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Vai Ser Phe Ser Thr Arg Gly
423 433
Thr Gin Asn Trp Thr Vai Glu Arg Leu Leu Gin Ala His Arg Gin Leu Glu Glu Arg Gly
443 453
Tyr Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gin Ser Ile Vai Phe Gly
463 473
Gly Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly
-39TABELA 6 (cont.)
Sequência de aminoácidos de TGF-alfa-PE^ab
483
Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg 503
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr 523
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly 543
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu 563
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro 583
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin 603
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu

Claims (6)

  1. REIVINDICACSES lâ — Processo para a preparação do polipeptídeo F'E40 aB, PE^0 Ab ou PE^ ab, em que A representa a presença de císteina nas posições 265 e 287 da sequência de aminoácidos de F’E4ô, a representa quer a deleção de císteina nestas posições quer a sua substituição por outro aminoácido, B representa a presença de císteina nas posições 372 e 379 da sequência de aminoácidos de ΡΕ^θ, e b representa quer ; deleção de císteina nestas posições quer a sua substituição por outro aminoácido, caracterizado por compreender a clivagem de uma molécula híbrida na qual um dos polipeptideos ΡΕ^θ modificados anteriores está ligado a outro peptídeo.
  2. 2â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a clivagem ser efectuada por meio de um agente químico.
  3. 3â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o peptídeo ao qual o peptídeo PE.. modificado está ligada ser um agente de direccionamento í
  4. 4â - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o agente químico ser CNBr.
  5. 5â - Processo de acordo com a reivindicação 1, ) caracterizado por o produto ser PE^ aB.
  6. 6â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o produto ser ΡΕ^θ Ab.
    -417â - Processo de acorda com a reivindicação 1 caracterizado por o produto ser PE^ ab.
    ga - Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a agente de direccionamento ser um anti corpo, um factor de crescimento ou uma hormona.
    <?a _ Processo de acorda com a rei vind icação 8 caracterizado por o aqente de direccionamento ser TGF-alf ou EGF.
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