PT93525B - Processo para a preparacao de polipeptideo pe40 modificado - Google Patents
Processo para a preparacao de polipeptideo pe40 modificado Download PDFInfo
- Publication number
- PT93525B PT93525B PT93525A PT9352590A PT93525B PT 93525 B PT93525 B PT 93525B PT 93525 A PT93525 A PT 93525A PT 9352590 A PT9352590 A PT 9352590A PT 93525 B PT93525 B PT 93525B
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- gly
- arg
- glu
- allah
- pro
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 17
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims abstract description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 6
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 claims description 22
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical group BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 3
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 claims 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 2
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 5
- -1 e.g. Chemical class 0.000 abstract description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 abstract description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 22
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 18
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 18
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 15
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 14
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 14
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 13
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 13
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 11
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 11
- UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O UFPXDFOYHVEIPI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 9
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 9
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 8
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 8
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 8
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 7
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 5
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 5
- KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N Glu-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KKCUFHUTMKQQCF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 5
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 5
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N Ala-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N 0.000 description 4
- NONSEUUPKITYQT-BQBZGAKWSA-N Arg-Asn-Gly Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N)CN=C(N)N NONSEUUPKITYQT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- YBIAYFFIVAZXPK-AVGNSLFASA-N Arg-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O YBIAYFFIVAZXPK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- YKZJPIPFKGYHKY-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YKZJPIPFKGYHKY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- BHQQRVARKXWXPP-ACZMJKKPSA-N Asn-Asp-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N BHQQRVARKXWXPP-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- ULZOQOKFYMXHPZ-AQZXSJQPSA-N Asn-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ULZOQOKFYMXHPZ-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 4
- ZKAOJVJQGVUIIU-GUBZILKMSA-N Asp-Pro-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ZKAOJVJQGVUIIU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- LTUVYLVIZHJCOQ-KKUMJFAQSA-N Glu-Arg-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LTUVYLVIZHJCOQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)C[NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 4
- JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N Gly-Thr-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCC(O)=O JQFILXICXLDTRR-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 4
- LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N Gly-Thr-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LLWQVJNHMYBLLK-CDMKHQONSA-N 0.000 description 4
- PASHZZBXZYEXFE-LSDHHAIUSA-N Gly-Trp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)NC(=O)CN)C(=O)O PASHZZBXZYEXFE-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 4
- XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N Gly-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- KBBFOULZCHWGJX-KBPBESRZSA-N Gly-Tyr-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)CN)O KBBFOULZCHWGJX-KBPBESRZSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N His-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- FVEWRQXNISSYFO-ZPFDUUQYSA-N Ile-Arg-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N FVEWRQXNISSYFO-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 4
- YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 4
- BLFXHAFTNYZEQE-VKOGCVSHSA-N Ile-Trp-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N BLFXHAFTNYZEQE-VKOGCVSHSA-N 0.000 description 4
- CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N Leu-Ala-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CQQGCWPXDHTTNF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- MMEDVBWCMGRKKC-GARJFASQSA-N Leu-Asp-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N MMEDVBWCMGRKKC-GARJFASQSA-N 0.000 description 4
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 4
- BMVFXOQHDQZAQU-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N BMVFXOQHDQZAQU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N Pro-Arg-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- BNBBNGZZKQUWCD-IUCAKERBSA-N Pro-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 BNBBNGZZKQUWCD-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- XKHCJJPNXFBADI-DCAQKATOSA-N Pro-Asp-Lys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O XKHCJJPNXFBADI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N Pro-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 4
- JCLAFVNDBJMLBC-JBDRJPRFSA-N Ser-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JCLAFVNDBJMLBC-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 4
- ADPHPKGWVDHWML-PPCPHDFISA-N Thr-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N ADPHPKGWVDHWML-PPCPHDFISA-N 0.000 description 4
- GRQCSEWEPIHLBI-JQWIXIFHSA-N Trp-Asn Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 GRQCSEWEPIHLBI-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 4
- LGEYOIQBBIPHQN-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 LGEYOIQBBIPHQN-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 4
- XGZBEGGGAUQBMB-KJEVXHAQSA-N Tyr-Pro-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O XGZBEGGGAUQBMB-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 4
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 4
- KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N glyclproline Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 4
- 108010062266 glycyl-glycyl-argininal Proteins 0.000 description 4
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 4
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 4
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 108010025826 prolyl-leucyl-arginine Proteins 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- LXAARTARZJJCMB-CIQUZCHMSA-N Ala-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LXAARTARZJJCMB-CIQUZCHMSA-N 0.000 description 3
- KVPHTGVUMJGMCX-BIIVOSGPSA-N Asp-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O KVPHTGVUMJGMCX-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 3
- CJUKAWUWBZCTDQ-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-Lys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O CJUKAWUWBZCTDQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- WAJDEKCJRKGRPG-CIUDSAMLSA-N Cys-His-Ser Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N WAJDEKCJRKGRPG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 3
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000276457 Gadidae Species 0.000 description 3
- MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N Glu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- CVPXINNKRTZBMO-CIUDSAMLSA-N Glu-Arg-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)CN=C(N)N CVPXINNKRTZBMO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N HJIFPJUEOGZWRI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N Gly-Pro-Glu Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JJGBXTYGTKWGAT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- KIAOPHMUNPPGEN-PEXQALLHSA-N Ile-Gly-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N KIAOPHMUNPPGEN-PEXQALLHSA-N 0.000 description 3
- CAHCWMVNBZJVAW-NAKRPEOUSA-N Ile-Pro-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N CAHCWMVNBZJVAW-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 3
- RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N L-prolylglycine Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCC[NH2+]1 RNKSNIBMTUYWSH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- SFKOEHXABNPLRT-KBPBESRZSA-N Phe-His-Gly Chemical compound N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)NCC(O)=O SFKOEHXABNPLRT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 3
- VFDRDMOMHBJGKD-UFYCRDLUSA-N Phe-Tyr-Arg Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N VFDRDMOMHBJGKD-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 3
- CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N Pro-Arg-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CYQQWUPHIZVCNY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N Thr-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O TWLMXDWFVNEFFK-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 3
- NRUPKQSXTJNQGD-XGEHTFHBSA-N Thr-Cys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O NRUPKQSXTJNQGD-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 3
- AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N 0.000 description 3
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BWZOPYPOZJBVLQ-UHFFFAOYSA-K aluminium glycinate Chemical compound O[Al+]O.NCC([O-])=O BWZOPYPOZJBVLQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 3
- 108010072405 glycyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 3
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 2
- GDVDRMUYICMNFJ-CIUDSAMLSA-N Arg-Cys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GDVDRMUYICMNFJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- NBKLEMWHDLAUEM-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NBKLEMWHDLAUEM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- YKKHFPGOZXQAGK-QWRGUYRKSA-N Cys-Gly-Tyr Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YKKHFPGOZXQAGK-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- LVNMAAGSAUGNIC-BQBZGAKWSA-N Cys-His Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 LVNMAAGSAUGNIC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N Glu-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- BIRKKBCSAIHDDF-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O BIRKKBCSAIHDDF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N Gly-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)CN)C(=O)O LYZYGGWCBLBDMC-QWHCGFSZSA-N 0.000 description 2
- KYFGGRHWLFZXPU-KKUMJFAQSA-N His-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N KYFGGRHWLFZXPU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- WRPDZHJNLYNFFT-GEVIPFJHSA-N His-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O WRPDZHJNLYNFFT-GEVIPFJHSA-N 0.000 description 2
- 101000619708 Homo sapiens Peroxiredoxin-6 Proteins 0.000 description 2
- 101500027527 Homo sapiens Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102100022239 Peroxiredoxin-6 Human genes 0.000 description 2
- KNPVDQMEHSCAGX-UWVGGRQHSA-N Phe-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KNPVDQMEHSCAGX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N Thr-Cys-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 2
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 2
- MWDNZMWVENFVHT-UHFFFAOYSA-L (2-decoxy-2-oxoethyl)-[2-[2-[(2-decoxy-2-oxoethyl)-dimethylazaniumyl]ethylsulfanyl]ethyl]-dimethylazanium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].CCCCCCCCCCOC(=O)C[N+](C)(C)CCSCC[N+](C)(C)CC(=O)OCCCCCCCCCC MWDNZMWVENFVHT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- IMMKUCQIKKXKNP-DCAQKATOSA-N Ala-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CCCN=C(N)N IMMKUCQIKKXKNP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GFBLJMHGHAXGNY-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GFBLJMHGHAXGNY-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PUBLUECXJRHTBK-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PUBLUECXJRHTBK-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- NZGRHTKZFSVPAN-BIIVOSGPSA-N Ala-Ser-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NZGRHTKZFSVPAN-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N Arg-Ala-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SGYSTDWPNPKJPP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OSASDIVHOSJVII-WDSKDSINSA-N Arg-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N OSASDIVHOSJVII-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N WYBVBIHNJWOLCJ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XYOVHPDDWCEUDY-CIUDSAMLSA-N Asn-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XYOVHPDDWCEUDY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GMCOADLDNLGOFE-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asp-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)C(=O)N GMCOADLDNLGOFE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N Asp-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N Asp-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N Asp-Ser-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O KGHLGJAXYSVNJP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000763236 Colpodella Species 0.000 description 1
- UUOYKFNULIOCGJ-GUBZILKMSA-N Cys-Glu-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N UUOYKFNULIOCGJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- RRJOQIBQVZDVCW-SRVKXCTJSA-N Cys-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CS)N RRJOQIBQVZDVCW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031334 Elongation factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N Glu-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O NLKVNZUFDPWPNL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OAGVHWYIBZMWLA-YFKPBYRVSA-N Glu-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OAGVHWYIBZMWLA-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N Glu-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 1
- PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N Gly-Ala-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PUUYVMYCMIWHFE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MFVQGXGQRIXBPK-WDSKDSINSA-N Gly-Ala-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFVQGXGQRIXBPK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MOJKRXIRAZPZLW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N Gly-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN)C(=O)O WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ZKJZBRHRWKLVSJ-ZDLURKLDSA-N Gly-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)O ZKJZBRHRWKLVSJ-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N His-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XMAUFHMAAVTODF-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 101001077660 Homo sapiens Serine protease inhibitor Kazal-type 1 Proteins 0.000 description 1
- AQCUAZTZSPQJFF-ZKWXMUAHSA-N Ile-Ala-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O AQCUAZTZSPQJFF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N L-Prolyl-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 108010000410 MSH receptor Proteins 0.000 description 1
- 101800001751 Melanocyte-stimulating hormone alpha Proteins 0.000 description 1
- YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YRAWWKUTNBILNT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ONGCSGVHCSAATF-CIUDSAMLSA-N Met-Ala-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ONGCSGVHCSAATF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101000606416 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Acyltransferase PE Proteins 0.000 description 1
- WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N N-L-arginyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCN=C(N)N WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100386053 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cys-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010077519 Peptide Elongation Factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N Phe-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- TXJJXEXCZBHDNA-ACRUOGEOSA-N Phe-Phe-His Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)O)N TXJJXEXCZBHDNA-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- IAOZOFPONWDXNT-IXOXFDKPSA-N Phe-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O IAOZOFPONWDXNT-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- ALJGSKMBIUEJOB-FXQIFTODSA-N Pro-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ALJGSKMBIUEJOB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N Pro-Glu-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FRKBNXCFJBPJOL-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N Pro-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MOQDPPUMFSMYOM-KKUMJFAQSA-N Ser-His-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CO)N MOQDPPUMFSMYOM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO BXLYSRPHVMCOPS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102100025144 Serine protease inhibitor Kazal-type 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 101150109894 TGFA gene Proteins 0.000 description 1
- STGXWWBXWXZOER-MBLNEYKQSA-N Thr-Ala-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 STGXWWBXWXZOER-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 1
- BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N Thr-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O BIYXEUAFGLTAEM-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N Thr-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BVOVIGCHYNFJBZ-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N Thr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- MXNAOGFNFNKUPD-JHYOHUSXSA-N Thr-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MXNAOGFNFNKUPD-JHYOHUSXSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150063325 ab gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- VFNGKCDDZUSWLR-UHFFFAOYSA-N disulfuric acid Chemical class OS(=O)(=O)OS(O)(=O)=O VFNGKCDDZUSWLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010092114 histidylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M phenylmercury acetate Chemical compound CC(=O)O[Hg]C1=CC=CC=C1 XEBWQGVWTUSTLN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000774 poly(2-methoxyaniline-5-sulfonic acid) polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-thiol Chemical compound SC1=CC=CC=N1 WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002943 spectrophotometric absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- ZJHHPAUQMCHPRB-UHFFFAOYSA-N urea urea Chemical compound NC(N)=O.NC(N)=O ZJHHPAUQMCHPRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N α-msh Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WHNFPRLDDSXQCL-UAZQEYIDSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/66—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells
- A61K47/665—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid the modifying agent being a pre-targeting system involving a peptide or protein for targeting specific cells the pre-targeting system, clearing therapy or rescue therapy involving biotin-(strept) avidin systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6817—Toxins
- A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A quimioterapia, tradicional do cancro baseia-se na capacidade das drogas para matar células tumorais em pacientes com cancro. Infelizmente, estas mesmas drogas frequentemente matam células normais da mesma mada que as células tumorais. 0 grau em que uma droga contra o cancro mata células tumorais relativamente às células normais é uma indicação de grau de selectividade do composto para as células tumorais. Um métoda para aumentar a selectividade de drogas contra o cancro relativamente às células tumorais é libertar as drogas preferencialmente nas células tumorais evitando ao mesmo tempo as populações de células normais. Um outro termo para libertação selectiva de agentes quimioterapêuticos em populações específicas de células é o direccionamento.
direccionamento de drogas para células tumorais pode ser conseguido de várias maneiras. Um métoda baseia-se na presença de moléculas de receptores específicos na superfície das células tumorais. Outras moléculas, referidas como agentes de direccionamento podem ser reconhecidas e ligarem-se a estes receptores da superfície celular. Estes agentes de direccionamento incluem, e.g., anticorpos, factores de crescimento au hormonas. Os agentes de direccionamento que reconhecem e se ligam a receptores específicos da superfície celular são referidos como alvejando as células que possuem aqueles receptores. Por exemplo muitas células tumorais possuem uma protêina na sua. superfície designada receptor ao factor de crescimento epidérmico. Vários factores de crescimento incluindo o factor de crescimento epidérmico (EGF) e o factor de crescimento transformante-alfa (TGF-alfa) reconhecem e ligam-se ao receptor de EGF nas células turaorais. EGF e TGF—alfa são pois agentes de direccionamento para estas células tumorais.
Os agentes de direccionamento por eles próprios não matam as células tuniorais. Outras moléculas incluindo venenos celulares ou toxinas podem ser ligadas a agentes de direccionamento para criar moléculas híbridas que possuem domínios de direccionamento para células tumorais e da toxina celular. Estas moléculas híbridas funcionam como venenos selectivos para células tumorais devido às suas capacidades para alvejar as células tumorais e depois matar estas células através do seu componente toxina. Alguns dos venenos celulares mais patentes usados na construção destas moléculas hibrída.s são toxinas ba.cteria.na.s que inibem a síntese protéica em células de mamífero. A exotoxina A de Pseudomonas (PE-A) é uma destas toxinas ba.ctérianas e tem sida usada para construir moléculas híbridas direccianador-toxina (Patente U.S. 4. 545. 985).
PE-A é uma proteína bacteriana de óó KD que é extremamente tóxica para as células de mamífero. A molécula de PE-A cantem tr'ã's domínios funcionais:
1) D domínio deligação amino-terminal, responsável pela ligação a uma célula susceptível;
2) 0 domínio de translocação localizado internamente, responsável pela libertação da toxina para o citossol;
3) 0 domínio enzimático amino-terminal, responsável pela intoxicação celular.
A PE-A tem sido usada na construção de moléculas de direccionador-taxina, agentes anti-cancro em que a molécula de óó KD é combinada com um agente direccionador
4específico de tumor (anticorpo monoclonal ou factor de crescimento). As moléculas direccionador-toxina produzidas deste modo tem maior toxicidade para células possuidoras de receptores para o agente de direccionamento.
Um problema, com esta abordagem é que o híbrido de PE-A e anticorpo ou factor de crescimento ainda possui uma toxicidade razoável mente elevada para células normais. Esta toxicidade é largamente devida à ligação da protéina híbrida a células através do domínio de ligação da PE-A. Para ultrapassar este problema, uma proteína foi produzida por via recombinante a qual possui apenas os domínios enzimático e de trans .1 ocação da exctoxina A de Pseudomonas (Hwang Cell, 49:127-132 1787). Esta proteina foi designaet a 1 da PE ma vez que tem um peso molecular de 40KD.. PE^ não possui o domínio de ligação de PE-A e è incapaz de se ligar a células de menops tóxica mamífero. Assim ΡΕ.Λ è consideràvelmente 40 do que a proteina intacta de 66KD. Como resultado, as moléculas de direccionador-toxina produzidas com PE^. foram muito mais especificos na sua toxicidade celular (Chawdhary et al.. Proc. Natl. Acad.
84:4583-4542, 1737).
Sc i. USA,
Ao trabalhai·—se com PE^^ encontrou-se que osresíduos císteina nas posiçSes 265, 287, 372 e 377 (numeração das moléculas nativas de PE-A de 66KD; Gray et al, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 81 , 2645-2647 (1784)) interferiram com a construção das moléculas de direccionador-toxina usando métodos de conjugação química. A natureza reactiva das ligaçSes dissu.1 fureto que estes resíduas formam levou a ambiguidade relativamente è integridade química do produto toxina direccionada.
LISTA DE TRABALHOS RELACIONADOS
1. A Patente U.S. 4.545.985 ensina que a exotoxina A de pseudomonas pode ser conjugado com anticorpos ou com o factor de crescimento epídermico. A Patente 4.545.985 ensina ainda que estes conjugados podem ser usados para, matar células tumorais humanas.
2. A Patente U.S. 4.664.911 ensina que os anticorpos podem ser conjugados com a cadeia A ou com a cadeia B de ricino que é uma toxina obtida a parir de plantas. A Patente 4.664.911 ainda ensina que estes conjugados podem ser usados para matar células tumorais humanas.
3. A Patene U.S. 4.675.382 ensina que hormonas tais como a hormona estimuladora de melamócitos (MSH) pode ser ligada, a uma porção da protéina da toxina da difteria via ligações peptidicas. A Patente 4.675.382 ensina ainda que os genes que codificam estas protéinas podem ser ligados uns aos outros para dirigir a síntese de uma protéina de fusão híbrida usando técnicas de DNA recombinante. Esta protéina de fusão tem capacidade para se ligar a células que possuem receptores MSH.
4. Murphy et al., PNAS USA 33:8258-8262 1986, ”Genetic construction expression, and melamona-selctive cytotoxiCity of a diphteria toxina-related alpha-me1anocute-stimulating hormons fusion protein. Este artigo ensina que uma protéina de fusão híbrida produzida em bactérias usando tecnologia de DNA recombinante e consistindo numa fracção de proteína da toxina da difteria ligada á hormona estimuladora de melanócitos alfa ligar-se-à e matará células de melanoma humana.
—6—
5. Kelley et a 1 . , PNAS USA 85:3930—5934 1988, Inerleukin 2-diphtheria toxin fusion protein can abolish cell-mediated immunity in viva. Este artigo ensina que uma proteína de fusão híbrida produzida em bactérias usando tecnologia de DNA recombinante e consistindo numa fracção da proteína da toxina da difteria ligada a interleuquina 2 funciona em ratinhos labro para suprimir a imunidade celu1 ar.
Structure Angstrom.
proteína A
Allured et of exotoxin Este artigo -da exotoxina al_. , PNAS USA 83:1320-1324 1986,
A of Pseudomonas aeruginosa at 3.0 ensina a estrutura tridimensional da de pseudomonas.
“Functiona1 by Deletion Este artigo
7. Hwang et al_. , Cell 43:129-136, 1937,
Domains of Pseudomonas Exotoxin Identified Analysis of the Gene Expressed in E.co1i.
ensina que a proteína A da exotoxina de pseudomonas pode ser dividida em tr'ê's domínios func:ionais distintos responsáveis por: ligação a células de mamífero, transbocação da proteína toxina através das membranas lisossonais e ribosilação com ATP do factor de alongação 2 dentro das células de mamífero. Este artigo ensina ainda que estes domínios funcionais correspondem a regiões distintasda proteína A da exotoxina de pseudomonas.
8. □ pedido de patente europeia 0 261 671 publicado em 30 de Março de 1988 ensina que uma fracção da proteína A da exotoxina de pseudomonas pode ser produzida não possuindo a função de ligação às células da proteína A completa da exotoxina de pseudomonas mas tendo as funções de translocação e ribosilação com ATP da proteína A total da exotoxina de pseudomonas. A fracção da proteína A da exotoxina de pseudomonas que mantém as funções de translocação e ribosilação com ADF' da proteína A completa de exotoxina de pseudomonas é designada exotoxina de pseudoinonas-40 ou PE-40. PE-40 consiste nos resíduos de aminoãcidos 252-613 da proteína A completa da exotoxina de pseudomonas como definido em Gray et al . , PMAS USA SI :2645-2649 1984. Este pedido de patente ensina ainda que F'E-40 pode ser ligada ao factor de crescimento transformante-alfa para formar uma proteína híbrida de fusão produzida em bactérias usando técnicas de DMA recombinante.
ming growth Este artigo
9. Chau.dhary et al. , PNAS USA 84:4538-4542, 1987,
Activity of a recombinant fusion protein between transforfactor type alpha and Pseudomonas exotoxin. ensina que as proteínas híbridas de fusão formadas entre PE-40 e o factor de crescimento transformante alfa e produzidas em bactérias usando técnicas de DNA recombinante ligar-se-ão e matarão células tumorais humanas possuidoras de receptores do factor de crescimento epidérmico.
10. Bailon et al.. Biotechnology, pág. 1326-1329 Nov. 1988. Purification and Partial Characterization of an interleukin 2-pseudomonas exotoxin fusion protein. Este artigo ensina que as proteínas híbridas de fusão formadas entre PE-40 e interleuquina 2 e produzidas em bactérias usando técnicas de DMA recombinante ligar-se-ão e matarão linhas de células humanas possuidoras de receptores da interleuquina 2.
OBJECTIVOS DO INVENTO
Constitui um objectivo do presente invento proporcionar modificações de ΡΕ^,θ inteqrida.de química e estrutura definida de moléculas de conjugado formados entre agentes de direccionamento e ΡΕ4Λ que ofereçam uma melhor modificada. é um outro objec um método para a preparação e modificada de entre proteíi agentes de direccionamento outros objectivos do presente da descrição que se segue.
SUMÁRIO DO INVENTO ivo deste invento proporcionar recuperação do domínio de F'E^ as de fusão formadas entre e FE.,- modificada. Estes e invento serão óbvios a partir presente invento proporciona modificações do domínio de PE^ que eliminara as ambiguidades químicas A substituição de provocadas pelas císteinas em F'E4f5. outros aminécidos tais como, e.g. resíduos por alanina, ou deleção de dois ou císteina melhora as propriedades biológicas e químicas dos conjugados formados entre ΡΕ^θ modificada e um agente? de de cisteina em mais resíduos direccionamento.
ΡESCRIçSQ DETALHADA DO INVENTO
As moléculas híbridas produzidas por conjugação de EGF e F'E,,. são caracterizadas em três sistemas de ensaios
Η V principais. Estes ensaios incluem: 1- ADF'-ribosi 1 ação do factor alongação 2 o qual mede a actividade enzimática de EGF-F’E4ft a qual inibe a síntese proteica em mamíferos, 2inibição da ligação de EGF’ marcado radioactivamente ao receptor de EGF em vesículas membranas de células A431 o que mede a actividade de ligação ao receptor de EGF de EGF-PE4ft,
3-C 4,5-dimeti 1 tiazol-2-i 11-2,5~dif en.i 1 tetrazól io (MTT) em formazano que é usado para medir a sobrevivência de células tumorais após exposição a EGF—PE^^. Estes ensaias são efectuados como préviamente descrio (Chung et al , Infection and Immunity, 16:832-641 1977, Cohen et al . , J. Biol. Chem.,
257:1523-1531 1982, Riemen etal., Peptides 8:077-885, 1987,
Mossman, J. Immu.nol. Methods, 65:55-63 1983).
Para criar conjugadas da proteína EGF-ΡΕ^θ com estrutura química definida melhores c a rac te r í s tic as biológicas, usámos moléculas de TGF-alfa-ΡΕ^θ expressos por via recombinante como fonte de material para PE^ modificada. Primeiro produzimos uma série de moléculas de DNA recombinante que codificaram TGF-alfa-PE versões -40· 0 gene
TGF-alfa-ΡΕ^θ original ou parental foi clonado molecularmente num vector bacteriano plasmídeo de expressão TAC (pTAC TGF'57-ΡΕ^) usando segmentos distintos de DNA clonado como descrita no Exemplo 1. O clone de DNA pTAC TGF57-PE especif icamente modificadas de TGF-alfa-F‘E.
ou ’40r foi reagente de partida para construir versões especif icamente modificadas do DNA de TGF-alfa-PE^. As modificações específicas do DNA de pTAC T6F57-PE^^ envolve mutações específicas de sítio na sequência de DNA codificador necessárias para substituir dois ou quatro dos codSes císteina dentro do domínio PE^ do DNA de pTAC TGF57-PE^^ com codSes para outros aminoácidos. Como alternativa, as mutações específicas de sítio podem ser alteradas de modo a eliminar dois ou quatro dos codSes císteina dentro usado como do domínio ΡΕ4Λ de pTAC TGF57-PE
As mutaçSes específicas de sítio no DNA de pTAC TGF57—ΡΕ^θ foram construídas usando osmétodos de Winter et al . , Nature 299:756-758 1982. No Exempla 2 estão apresentadas exemplos específicos dos DNAs mutagenizados de pTAC TGF57~PE4f).
Na T a be 1 a está apresentada a sequência de
aminoácidos | de | TGF-al fa-PE^ | parental. | Os quatro |
de císteina | no | d om ί n i o PE^ | da proteína | híbrida. |
TGF-alfa-PE | díN | parental são | designados | resíduos |
resíduos le fusão 265 r.. 287 „. 37
Cis , Cis
Cis* de aminoácidos são de
As proteínas de fusão TGF-al fa-PE^ modificadas e Cis . Ds resíduos numerados como definido para a molécula nativa de PE-A 66KD (Gray et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, EU, 2645-2649 1984) usadas para gerar as moléculas de PE., modificadas contêm ** ~ ^65 ^87 substituições ou deleções dos resíduos CCis* e Cis 3 ou r„. 372 „. 379.. r„. 265 „ . 287 379 _ _
CCis e Cis 3 ou CCis , Cis e Cis 3. Para
Iocuí simplificar a monenclatura para as moléculas de ΡΕ^θ modificadas geradas a partir das proteínas de fusão modificadas, designamos os resíduos de aminoácidos nas posições 265 e 287 como o locus A e os resíduas nas posições 372 e 379 o B . Quando as cisteinas estão presentes nos resíduos >o e :omo na proteína de fusão parental TGF-alfa-PE , o locus é capitalizado (i.e. “A)
Quando as cisteinas são substituídas com outros aminoácidos ou eliminadas dos resíduos 265 e 237, o locus é representado por uma letra pequena a em baixo. Be modo semelhante quando os resíduos de aminoácidos nas posições 372 e 379 são cisteinas, o locus é representado por uma letra B em expoente enquanto uma letra b em baixo representa este locus quando os resíduos de aminoácidos nas posições 372 ou 379 são substituídos por outros aminoácidos ou eliminados. Assim quando os quatro resíduos de císteina no domínio ΡΕ^θ são substituídos com alaminas ou eliminados a PE^0 modificada é designada PE^^ab. De modo semelhante PP40 parental derivada da proteína de fusão TGF-al fa-PE^ com císteina nas posições dos resíduos de aminoácidos 265, 2S7, 372 e 379 podem ser designadas PE^ AB.
-11Os materiais de partida (i.e. a proteína híbrida TGF-alfa-ΡΕ^θΑΒ e as proteínas híbridas modificadas TGF-alfa~PE^ Ab, a Be ab) são produzidas em E.coli usando o sistema vector de expressão TAC descrito por Linemeyer et al . , Bi.otechnology 5:9ó€’-9ó5 1987. as proteínas de partida produzidas nestas bactérias foram colhidas e purificadas por lise das bactérias em hidrocloreto de guanidina seguido da adição de sulfito de sódio e tetrationato de sódio. Esta mistura de reacção foi subsequentemente dialisada e adicionada ureia para solubilizar proteínas que tenham precipitado da solução. A mistura foi centrifugada para remover material insolúvel e as proteínas híbridas recombinantes de partida TGF-al fa-PE^ foram separadas usando cromatografia de permuta iónica, seguido de cromatografia de exclusão por tamanho, seguido mais u.ma vez de cromatografia de permuta iónica.
Uma vez que o único resíduo de metiomina nas proteínas híbridas de parida está situado entre os domínios TGF-alfa e ΡΕ^θ, o tratamento com CNBr clivará as proteínas de partida, devido as proteínas PE^ modificadas e TGF-alfa. Os derivados S-sulfonatos purificados de TGf-alfa-FE^ foram então sujeitos a tratamento com CNBr para remover a fracção TGF da molécula. A fracção ΡΕ^θ modificada pretendida foi purificada por cromatografia de permuta iónica seguido de cromatografia de exclusão por tamanho. A ΡΕ^θ purificado modificada foi então derivatizada com um reagente heterobifuncional adequado, e.g. SPDP, para permitir a conjugação do agente de direccionamento pretendido. Após conjugação usou-se a cromatografia de exclusão por tamanho para isolar o conjugado de entre os materiais rião conjugados. Uma vez isolado o conjugado purificado, ele é testado quanto à actividade biológica usando o ensaio de ADP-ribosilação e os
-12ensaios importantes de liqação a receptores e viabilidade celular.
Ds exemplos que se sequem ilustram o presente invento sem no entanto limitar o mesmo. Todas as reacções enzimáticas necessárias às manipulações de biologia molecular, a menos que de outra modo seja especificado foram efectuados como descrito em Maniatis et al . , (1982) Em: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press.
Exemolo 1
Construção de clones de TGF-aifa-PE^.
□ segmento de usando trás séries de
-13DNA recombinante contenda DNA de
DNA de TGF-alfa oliqonucleotideos descrito por Defeo-Jones et al., Molecular and foi construído sintéticos como gene sintético de do clone pUC-19
Cellular TGF-alfa contendo
Biology 3:2999-3007 1983. Este foi clonado em p{JC-19. 0 DNA
TGF-alfa humano recombinante foi digerido com Sph I e EcoRI. A digestão gerou um fragmento de DNA de 2,3 K.b contendo todo o pUC-19 e a fracção 5' de TGF-alfa. 0 fragmento de 2,8 Kb foi purificado e isolado por electroforese em gel. Sintetizou-se uma cassete oligonuc1eotidica EcoRI a Sph I. esta cassete sintética tinha, a sequência indicada abaixo:
5'-CGGACCTCCTGGCTGCGCATCTAGG-3 ’
3'-GTACGCCTGGAGGACCBACGCGTAGATCCTTAA-í
Por conveniência, esta cassete oligonucleotídica foi designada 57. A cassete 57 foi emparelhada e ligada ao fragmento de 2,8 kb contenda TGF-alfa e formando um plasmídeo circularizado. Ds clones que continham a cassete foram identificados por hibridação com o DNA da cassete 57 marcada radioactivamente. A presença de TGf-alfa humano foi confirmada por sequenciação de DNA. A sequenciação também confirmou a presença de um sítio Esp recentemente introduzido no extrema 3' da sequência de TGF-alfa. Este plasmídeo designado TGF-al fa-57/p!JC-19 foi digerido com Hind III e Fsp I que deu origem a um fragmento de 168 pb contendo o gene TGF-alfa (GF-alfa-57). Uma preparação separada de pUC-19 foi digerida com Hind III e EcoRI que deu origem ao DNA
Λ
-14vector pUC-19 de 2,68 kb. 0 DMA de ΡΕ^Λ foi isolado a partir do plasmídeo pVC 8 (Cbaudhary et al, PNAS USA 84:4538-4542 1987). pVC8 foi digerido usando Mde I. Formou-se então um extrema cerse neste DNA usando as condições convencionais da reacção Klenow (Maniatis et al., supra p.113). 0 DMA com extremos cerses foi então sujeito a uma segunda digestão com EcoRI para dar origem a um fragmento EcoRI-Nde I de 1,3 kb (com extremos cerses) contenda PE^,, □ fragmenta Hind III-Fsp I de TGF-alfa-57 (168 pb) foi liqado ao vector pUC-19 de 2,68 kb. Após incubação durante a noite, o fragmento de DMA EcoRI-Nde extremos
Esta segunda ligação decorreu durante a noite. 0 produto da reacção de ligação foi então usado para transformar células
I (com cerses) da PE^ft foi adicionado à mistura de ligação
JM 109. identificados por
Os clones contendo TGF-alfa-57 ΡΕ^θ em pUC-19 foram hibridação com DNA de TGF-alfa-57 PE
4© marcado radioactivamente e o DNA deste clone foi isolado,
TGF-alfa-57 ΡΕ^θ foi removido do vector pUC-19 e transferido por Linemeyer et al., para um sistema vector TAC descrito Bio-Technology 5:960-965 1987). O pUC-19 foi digerido com Hind III e EcoRI para gerar u.m de 1,5 kb contendo TGF-alfa-57 PE
TGF-alfa-57 ΡΕ^θ em fragmento fragmento
Neste de DNA gerou-se fragmentos cerses usando condições convencionais de reaccão com Klenow (Maniatis cAS et al. , op ci.t. . □ vector TAC foi digerida com Hind III e EcoRI. Gerou-se extremos cerses no DNA do vector TAC digerido usando as condições convencionais de reacção com Klenow (Maniatis et al., op. cit. 0 vector de extremos cerses de 2,7 kb foi. isolada usando electroforese em gel. 0 fragmento TGF-alfa-57 PE^ de extremos cerses foi então ligado ao vector TAC de extremos cerses. D plasmídeo qerado por esta ligação foi usado para transformar células JM 109. Os clones candidatos contendo TGF-alfa-57 ΡΕΛΛ foram •χ
-15identificados por hibridação conforme indicado atrás sequenciados. 0 clone contendo a construção pretendida foi designado pTAC TGF57-PE^t?í. 0 plasmídeo gerado por estas manipulações está descrita na Tabela í. Na Tabela 2 está descrita a sequência de nucleótidos dos codSes de aminoácidos da proteína de fusSo TGF-alfa-PE β codificada pelo DNA de pTAC T6F-57-PE^ft. Na Tabela 3 está apresentada a sequência de aminoácidos codificada pelo gene TGF-57-ΡΕ^.
Exemplo 2
Construção de versões modificadas de clones de DNA contendo TGF-alf a-PErecombinante:
Substituição de císteinas por alaminas
TGF-alfa-PE40 aB:
clone pTACTGF57-PE40 foi digerido com Sphl e BamHI e isolado o fragmento SphI~BamHI de 75úpb (especificando os 5 aminoácidos C-terminal de TGF-alfa e os 243 aminoácidos N-terminais de PE..)„ D DMA do vector ΙΊ13 mpl9 40 foi cortado com Sphl e BamHI e isolado o DMA vector. 0 fragmento SphRI-BarnHI de TGF-alfa-PEfoi ligado ao DNA do vector 1Ί13 durante a noite a 15 C. As células hospedeiras bacterianas foram transformadas com esta mistura de ligação, os clones candidatos foram isolados e o seu DNA de plasmídeo foi sequenciado para assegurar que estes clones continham os DNAs recombinantes correctos. Preparou-se DNA de cadeia simples para mutagénese.
Sintetizou-se um oligonuc1etídeos (oligo #132) e usou-se na mutagénese dirigida para introduzir um sítio Hpal no DNA de TGF-alfa-PE^ na posição de aminoácidos 272 de
PE,,:
4q
5' CTGGAGCGTTAACCCGTC 3' (oligo #132)
Uma consequência desta, mutagénese dirigida foi a conversão do resíduo número 272 em ΡΕ^θ de feni1alamina para leucina. A mutagénese foi efectuada como descrito por Winter et al., Nature, 299:756-759 1982.
-17Um clone candidato contendo o novo sítio Hpal criado foi isolado e sequenciado para validar a presença da sequência genética mutagenizada. Este clone foi então cortado com Sphl e Sall. Um fragmento de 21® pb especifican do os 5 aminoãcidos C-terminais de TSF-alfa e os 7® aminoácidos N-terminais de PE^ft e contendo o sítio Hpal recentemente introduzido foi isolado e subclonado novamente no plasmídeo parental pTAC TGF57-PE4® nos sítios Sphl-Sall. As células hospedeiras bacterianas foram transformadas, um clone candidata foi isolada e a seu DNA de plasmídeo foi sequenciado para assegurar que este clone continha o DNA recombinante correcto. Por conveniência este clone foi designado pTAC TGF57-PE4®-132.
pTAC TGF57-F‘E4®~132 foi digerido com Sphl e Hpal e isolado um fragmento de DNA de 3,Pó kb. Uma cassete oligonucleotídica sintética (oligo #153) abrangendo os 5 aminoãcidos C-terminais de TGF-alfa e os 32 aminoãcidos N-terminais do PE^^ e contendo extremos compatíveis Sphl e Hpal foi sintetizado e ligado ao pTAC TGF57—PE40—132 digerido:
5' CGGACCTCCTGGCCATGGCCGAAGAGGGGGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCA
3’ gtacgcctggaggaccggtaccggcttctcccgccgtcggaccggcgcgactggcgcgt
CCAGCTGCACACCTGCCGCTGGAGACGTT 3'
GGTCGACGTGTGGACGGCGACCTCTGCAA 5' (oligo #153)
Esta cassete oligonucleotídica incorporou uma alteração no DNA de TGF-a1fa-PE^ de tal forma que o codão que especificava cisteina no resíduo 265 agora passou a especificar alamina. Por conveniência este DNA de plasmídeo foi designado pTAC TGF57-PE40-132, 153. As células hospedeiras bacterianas foram transfarmadas com DNA de pTAC
TGF57-PE40-132, 153. Os clones candidatos foram identificados por hibridação isolados s o seu DNA de plasmídeo foi sequenciado para assegurar que continha o DNA recombinante
-18adequado.
DNA de pTAC TGF57-PE4®-132, 153
Hpal e Sall e isolado um DNA ol igonucleotídica sintética resíduos de aminoácidos 272 mos Hpal e Sall compátiveis de pTAC TGF/PE4® 132, 153 de vector de 3,95k (oligo 4142) a 309 de PE^ e foi sintetizada
3,95 kb.
foi digerido com b. Uma cassete abrangendo os contendo extree ligada ao DNA
5' aacccgtcatcgccagccgcgcggctgggaacaactggagcaggctggctatccggtgc 3’ TTGGGCAGTAGCGGTCGGCGCGCCGACCCTTGTTGACCTCGTCCGACCGATAGGCCACG
AGCGGCTGGTCGCCCTCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGG 3'
TCGCCGACCAGCGGGAGATGGACCGCCGCGCCGACAGCACCTTGGTCCAGCT 5' (oligo #142)
Esta, cassete ol igonucleotídica altera o codão que especifica císteina no resíduo 287 de tal forma que o codão passa a especificar alamina. Par conveniência este DNA de plasmídeo mutagenizado foi designado pTAC TBF57-PE4®~132, 153, 142. As células hospedeiras bacterianas foram transformadas com este plasmídeo e os clones candidatos foram identifiçados por hibridação. Estes clones foram isoladas e o seu DNA de plasmídeo foi sequenciado para assequrar que continha α DNA recombinante adequado. 0 plasmídeo pTAC TGF57-PE40-132 153 142 codifica o variante TGF-alfa-PE^ com ambas as císteinas no locus A substituídas por alaminas.
Portanto, seguindo a nomenclatura descrita anteriormente esta versão modificada de TGF-alfa-ΡΈ^θ é designada TGF—alfa
-PE4A a B. A sequência de aminoácidos codificada pelo gene
TGF-alfa-ΡΕ^θ está apresentada na Tabela 4.
TGF-alfa-PE4© Ab:
□ clone pTAC57-PE40 foi digerido com Sphl e BamHI e isolado o fragmenta Sphl-BamHI de 750 pb (especificando as 5 aminoácidos C-terminais de TGF-alfa e os 252 aminoácidos N-terminais de PE. ,2. 0 DNA do vector M13 mpl9 foi cortado com Sphl e BamHI e isolado o DNA vector. 0 fragmento Sphl-BamHI de 750 pb de TGF-alfa-PE^ foi ligada ao DNA do vector M13 durante a noie a ÍS^C. As células hospedeiras bacterianas foram transfarmadas com esta mistura de ligação, os clones candidatos foram isolados e o seu DNA de plasmídeo foi sequenciado para assegurar que estes clones continham os DNAs recombinantes correctos. Preparou~se DNA de cadeia simples para mutagénese.
Sintetizou-se um oligonucleotídeo (oligo #133) e usou-se na mutagénese dirigida para introduzir um sítio BstelI no DNA de TGF-alfa-ΡΕ^θ na posição de aminoácidos 369 do PE40:
5' GACGTGGTGACCCTGAC 3' (oligo #133)
Uma consequência desta mutagénese foi a conversão do resíduo serina na posição 369 da PE^ numa treomina.
Um clone de DNA contenda o sítio BstelI recentemente criado foi identificado, isolado e sequenciado para assegurar a presença do DNA recombinante correcto. Este clone foi em seguida digerido com as enzimas de restrição
Apal e Sall. Uma inserção de DMA de 120 pb contendo o sítio
BstelI recentemente criado foi isolado e ligado <
TGF57-PE40 que também tinha sido digerido com Apsl e
Células hospedeiras bacterianas foram transformadas clone candidato foi isolado e sequenciado para assegurar que o DNA recombinane correcto estava presente. Este DNA de plasmídeo recentemente criado foi designado pTAC TGF57-PE40-133. Ele foi digerido com BstelI e Apal e isolado o fragmento de DNA vector de 2,65 kb.
-20pTAC Sal I .
e um aliminadado enzimas de
Sinetizou-se uma cassete oliqonucleotídica BstelI-Apal (oligo #155) que abrangeu a região de TGF-a1fa-PE^ clone pTAC TGF57-PE40-133 digerido com as restrição BstelI e Apal. Esta cassete também especificou a sequência nucleotidica para extremos compatíveis BstelI e Apal.
5' 6TGACCCTGACCGCGCCGGTCGCCGCCGGTGAAGCTGCGGGCC 3'
3' GGACTGGCGCGGCCAGCGGCGGCCACTTCGACGC 5' (oliqo #155)
Esta cassete oligonucleotídica alterou os codões das císteinas nos resíduos 372 especificadores de alaminas. A #155 foi ligada ao fragmento DMA vector de 2,ó5 kb. Células hospedeiras bacterianas foram transformadas e os clones candidatos foram isolados e sequenciados para assegurar que o DNA recombinante adequada estava presente. Este clone de DNA recentemente criado foi designado pTAC TGF57-PE40-133, 155. Ele codifica a variante de TGF-alfa-PE^ com ambas as císteinas no locus B substituídas por alaminas. Portanto seguindo a nomenclatura arãs descrita esta versão modificada de TGF-alfa-PE, e 377 de cassete oliqonucleotídica
PE^ft para codSes foi designada TGF-alfa-PE
Ab.
sequência de aminoácidos codificada pelo gene TGF-al fa-PE^ está apresentada na Tabela 5.
TGF-alfa-PE., ab:
-PE^f1 Ab foi também digerido com Sall e Apal plasmídeo pTAC-TGF57-PE40-132, 153, 142 codificador de TGF-alfa-ΡΕ^θ aB foi digerida com Sall e Apal e o fragmenta de DNA vector resultante de 3,8 kb foi isolado. G plasmídeo pTAC TGF57—ΡΕ4Θ—133, 155 codificador de TGF-alfae isolada a fragmento de DNA resultante de 140 pb contendo as alterações de císteina para alamina nos resíduos de aminoácidos 372
379 de ΡΕ^θ. Estes dois DNAs foram ligados um ao ouro e
e
Os um usados para transformar células hospedeiras bacterianas. clones candidatos foram identificados por hibridação com fragmento de DNA de 140 pb marcado radioactivamente derivado de pTAC TGF57-PE40-133, 155. 0 DNA de plasmídeo dos clones candidatos foi isolado s sequenciado para assequrar a presença, do DNA recombinante correcta. Este clone de DNA recentemente criado foi designado pTAC TGF57-PE40-132, 153,
142, 133, 155. Este plasmídeo codifica a variante TGF-alfa-PE^ft com as quatro císteinas nos 1ociA e B substituídas por alaminas. Portanto, seguindo a nomenclatura anteriormente descrita esta versão modificada de TGF-al fa-PE^ é designada TGF-al fa-PE^ ab,
A sequência de aminoácidos codificada pelo gene TGF-al fa-PE^ ab está apresentada na Tabela 6.
1.
Exemplo
ProduçSo e isolamento de proteínas de partida recombinantes TGF-alfa-PE. .
Células de E col i JM-109 transformadas foram cultivadas em frascos de agitação de 11 em 500 ml de caldo
LB na presença de 100 ug/ml de ampicilina a 371C. Após o valor de absorvSncia especfotomêtrica A... ter atingido 0,6 Ó00 adicionou-se isopropil B-D-tiogalactopiranosido para uma concentração final, de 1 mM. Após 2 horas as células foram colhidas por centrifugação.
As células foram lisadas em hidrocloreto de guanidina 8M, 50 mM ris, 1 mM EDTA, ρΗΒ,Θ por agitação à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura de lise foi levada a sulfito de sódio 0,4 M e tetrationato de sódio 0,1 M através da adição de reagentes sólidos e o pH foi ajustado a 9,0 com IM NaOH. A reacção foi deixada a decorrer à temperatura ambiente durante ló horas.
A solução de proteína foi dialisada contra um excesso de volume de 10 000 vezes de 1 mM EDTA a 4^C. A mistura foi então levada a ureia 6M, 50 mM NaCl, 50 mM Tris, pH8,0, à temperatura ambiente e agitado durante 2 horas. 0 material não dissolvido foi removido por centrifugação a 32 000 xg durante 30 minutos.
□ sobrenadante clarificado do passo anterior foi aplicado numa colu.na de 26x40 cm de DEAE Sepharose Fast-Flow (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) equilibrada com ureia 6M, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH8,0 a um fluxo de lml/minuto. A coluna foi lavada com o tampão de equílibrio até os
evidenmateriais não absorvidas serem removidos, conforme ciada por uma absorvãncia espectofotométicra de UV Α^.θ^ abaixo de 0,1 no tampão de equilíbrio tal como sai da coluna. A proteína de fusão absorvida foi eluida da coluna com u.m gradiente de 11 de NaCl 50—350 mM e depois concentrada rííim concentrador Ainicom com uma célula agitada adaptado com uma membrana YM-30.
A proteína de fusão concentrada (8 ml) foi aplicada. numa coluna de 2,5x 100 cm de Sephacryl S-300 (Pharmacia LKB Biotechmology, Inc.) equilibrada com ureia 6M, 5Õ mM Tris, 50 mM NaCl, ρΗΘ,Ο, a um fluxo de 0,25ml/minuto. A coluna foi eluida com mais tampão de equilíbrio e colheram-se fracções de 3ml. As fracções contendo actividade? de
TGF-alfη-ΡΕλλ forain reunidas. η·ν
As fracções reunidas da coluna S-300 foram aplicadas numa coluna Sepharose Q Fast-Flow de 1,6x40 cm (Pharmacia LKB Biotechnoloqy, Inc.) equilibrada com ureia 6M, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pHS,0 num fluxo de 0,7 ml/minuto. A coluna foi lavada com o tampão de equilíbrio e depois eluida com um gradiente de 600 ml de NaCl 50-450 mM. As fracções contendo a actividade de TGF-a.1 fa-PE„Λ foram reunidas e depois dialisadas contra 50 mM glicina pH'?,0 e guardadas a
Exemplo 4
Clivagem de proteínas de partida TGF-al f a-PE^ com CNBr e isolamento de PEe modificadas (F'E^ AB, FE^ Ab, PE^ aB, PE4. ab)
A proteína de fusão pretendida, ainda na forma sulfonada foi dial isada contra 107. (v/v) de ácido acético em água, depois liofilizada. A proteína liofilizada foi dissolvida numa quantidade suficiente de 0,1M HC1 desgascado para dar uma concentração de proteína de Img/ml. A solução de proteína/HCl continha 5 moles de triptofano/mole de proteína, de fusão. Adicionou-se CNBr (500 equivalentes por equivalente de metionina) e deixou-se decorrer a reacção durante 18 horas à temperatura ambiente no escuro. Os fragmentos de digestão grandes, incluindo a PE^ modificada, pretendida, foram então separadas da mistura de reacção por filtração em gel (e.g., Sephadez G-25) em ácido acético a 257. (v/v). as fracções contendo PE^ modificada foram reunidas e liofilizadas.
No caso das proteínas modificadas contendo císteina (i.e. F’E^ft AB, PE^ aB e PE^ é necessário formar as fontes dissulfureto necessárias antes de se proceder à purificação. A proteína liofilizada é pois dissolvida numa quantidade suficiente de 50 mM glicina, pl-i 10,5 para dar uma UV Ας,θή=0,1 . Adicionou-se beta-merca.ptoctanol para dar numa proporção molar de 4:1 relativamente ao número teónico de grupos 3-sulfonat.a presentes na amostra de proteína. Deixou-se prosseguir a reacção durante ló horas a 4^C, após o que a solução foi dialisada contra um excesso de 10 000 vezes de um tampão contendo 20 mM Tris, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, pHS,0.
As fracções da coluna de permuta aniónica contendo a PE^ pretendida foram reunidas com base na actividade de
ADP-ribosilação e no teÊr proteico determinado por SDS-PAGE.
As fracções reunidas foram concentradas usando uma membrana com um peso molecular de exclusão de 3© ©©O (YM-3©, Amicon).
As fracções reunidas foram aplicadas numa coluna de 2,6x1©© cm de filtração em gel Sephacryl S-20© (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.), equilibrada e eluida com 2© mM Tris, 5© mM NaCl, 1 mM EDTA, pHS,© num fluxo de ©,75ml/minuto. As fracções da cromatografia de filtração em gel foram reunidas com base na ADP-ribosilação e SDS-PAGE.
Se bem que este processo de material suficientemente puro para a maior parte dos fins, incluiu-se um outro passo cromatográf .ico para produzir material altamente homogéneo» Este passo cromatográfico final foi a filtração em gel de alta resolução, usando uma coluna de ©,75x6© cm Bio-Sil TSK-25© (Bio-Rad). Na preparação para a cromatografia na coluna TSK-25©, as amostras são concentradas num sistema Centriprep—3© (Amicon) e a concentração proteica A amostra foi dissolvida em ureia 6M, mM, 1©© mM NaCl, pH7,1, A coluna foi fosfato de sódio 1©© mM, 1©© mM NaCl, ©,5 ml/minuto. As fracções do passo de filtração em gel de alta resolução foram reunidas com base na ADP-ribosilação e SDS-PAGE.
ajustada a 5 mg/ml. fosfato de sódio 1©© eluida. com ureia 6M, 7,1, a um fluxo de
Exemplo 5
-26Conjugação de EGF com PE^fts modificadas e isolamento dos conjugados
Para conjugar EGF com ΡΕ^θ modificada, é necessário derivatizar EGF e F’E4ô com agentes heterobifuncionais de modo a conseguir-se uma ligação covalente entre as duas moléculas. Na preparação para a derivatização, as amostras fosfato solução de PE, de ΡΕ^θ modificada são dialisadas contra O,1M NaCl, de sódio O,1M, pH'7,0. Após dialise, a modificada foi ajustada a 4 mg/ml de ΡΕ^θ usando o tampão de diálise, dando uma concentração de 100 uM. Uma quantidade suficiente de uma solução 20 mM de N-succinimidi1-3-<3-piridil ti tio > -propionato (SF'DP, Flerce) em etanol foi adicionada à solução de proteína para dar uma concentração final de 300 uN para SPDP. Esta concentração represena uma proporção de 3sl de SPDP para PE40. A reacção de derivatização decorreu á temperatura ambiente durante 30 minutos, com agitação ocasional da mistura. A reacção foi parada pela adição de um grande excesso de glicina (aproximadamente um excesso molar de 50 vezes relativamente à quantidade inicial de SPDP). 0 derivado resulante de 3-(2—piridi1d.i tio)propioni1o foi designado PDP-ΡΕ^θ. Os reagentes não proteicos foram removidos odo produto por diálise intensa contra ureia 6M, '40
0,lN NaCl, fosfato de sódio 0,lM, pH7,5. F’DP introduzidos na PE,^ modificada descrito por Carlsson et al „ , Biochem. J número de grupos determinado como
173:723-737, 1973.
derivado PDP-EGF é preparado por dissolução de EGF liofilizado (grau de pureza Receptor, Col1aborative Research) numa quantidade suficiente de 0,lM NaCl, fosfato de sódio õ,lN pH7,0 para dar uma concentração final de 150
uM para EGF. Uma quantidade suficiente de uma solução 20 rnM de SPDP em etanol foi adicionado à solução de EGF para dar uma concentração final de 450 uM para SPDP, represenando uma proporção de 3:1 de SPDP para EGF. a reacção de derivatização decorreu, à temperatura ambiene durante 30 minutos, com aqitação ocasional da mistura. A reacção foi parada pela adição de um grande excesso de glicina (um excesso molar de aproximadamente 60 vezes relativamente à quantidade inicial de SPDP). Os reagentes não proteicos foram removidos da produto por diálise extensiva contra ureia 6M, 0,1M NaCl, fosfato de sódio 0,1M, pH7,5. 0 número de grupas PDP introduzidos em EGF foi determinado como descrito por Carlsson et al. , Efiochem. J . , 173: 723-737 1978) .
Usando os derivados descritos atrás PDP-PE
4© ou
PDP—EGF podem ser reduzidos a pH acídico de forma, a gerar o derivado de 3-tiopropionilo, na presença de dissulfuratos intactos nativos (Carlsson et al., supra). No entanto, a estratégia preferida é a geração de um tiol livre na PE modifiçada.
PDP-PE.,, (0,4 ml de uma solução 100 uM de PDP-PE...
· 40 en ureia óM, 0,1M NaCl, fosfato de sódio 0,1M, pH7,5) foi dialisado contra várias mudas de 500 ml de um tampão contendo ureia 6M, acetato de sódio 25 mM, pH5,5 a 4^C. Após diálise adicionou-se 20 u.l de ditiotreitol 100 mM (concentração final 5 mM) ao PDP-ΡΕ^θ. A redução decorreu durante 10 minutos à temperatura ambiente e foi terminada por diálise da mistura de reacção contra ureia óM, acetato de sódio 25 mM, EDTA 1 mM, pH5,5, a 4^C. Repetiu—se a diálise contra este tampão e a amostra foi depois dialisada contra 0,1M Na.Ll , fosfato de sódio 0,1M, pH7,5. 0 material gerado por estas manipulações foi designado tiopropion i 1-PE^ .
-28Nat preparação para conjugação, F’DF'--EGF (0,8 ml de uma solução 150 υΙΊ sm ureia óM, Ο,ΙΙΊ NaCl, fosfato de sódio 0,1M, pH7,5) foi d.ialisado contra várias midas de 0,ÍM NaCl, fosfato de sódio 0,1M, pH7,5 a 4k:)C, piara libertar a amostra ds ureia. Depois desta diâlise, a solução de F’DF'-E8F e a solução de tiopropiioni 1-F'E4f) foram combinadas e a mistura de reacção incubada à temperatura ambiente durante 1 hora. 0 progresso da reacção pode ser controlado medindo a liberação de piridina-2-tiona como descrito (Carlsson et al., supra). a reacção foi parada por diâlise contra várias mudas de ureia 6M, 0,1M NaCl, fosfata de sódio 0,1M, pH7,5, a 4^0.
Os conjugados foram purificados por cromatografia de exclusão por tamanho, usando uma coluna de alta resolução de 0,75x60 cm de Bio-Sil TSK-250 (Bio-Rad).
eluida com ureia óM, fosfato de sódio 0,1M pH7,1 , a um fluxo de 0,5 ml/minutc·. As fracçSes do passo de filtração em gel de alta resolução foram com base na ADP-ribosilação e SDS-PAGE.
A coluna foi NaC1 0,1Μ,
Exemplo 6
Conjugação de TSF-alfa com PE^^s modificadas e isolamento dos conjugados
Conjugação de TGF-alfa com PE^s modificados. Os conjugados de TGF-alfa e de PE^ modificada foram preparados de modo análogo aos conjugados de EOF descritos no Exemplo
Exemplo 7
Actividades biológicas dos conjugados de TGF-alfa-PE^ft modificada
As actividades biológicas importantes dos conjugados de TGF-al fa-PE^ modificada são semelhantes às respectivas actividades biológicas da TGF-alfa-PE^ híbrida descrita no pedido de patente U.S. N.S. 312 540 entregue em 17 de Fevereiro de 1787 por Allen Oliff, Deborah D. Jones e Gwynneth Edwards.
TABELA 1
Ampr
ZecoriA
VHindlIIy PE40 (NDEI /PSTI)
íHindIII A VECORlJ
-t>
(BAM hi)
TABELA 2
ATGGCTGCAGCAGTGGTGTCCCATTTTAATGACTGCCCAGATTCCCACACTCAGTTCTGCTTCCATGGAACATGCAGG
TTTTTGGTGCAG6AGGACAAGCCGGCATGTGTCTGCCATTCTGGGTACGTTGGTGCGCGCTGTGAGCATGCGGACCTC ctggctgctatggccgaagagggcggcagcctggccgcgctgaccgcgcaccaggcttgccacctgccgctggagact
TTCACCCGTCATCGCCAGCCGCGCGGCTGGGAACAACTGGAGCAGTGCGGCTATCCGGTGCAGCGGCTGGTCGCCCTC tacctggcggcgcggctgtcgtggaaccaggtcgaccaggtgatccgcaacgccctggccagccccggcagcggcggc
GACCTGGGCGAAGCGATCCGCGAGCAGCCGGAGCAGGCCCTGGCCCTGACCCTGGCCGCCGCCGAGAGCGAGCGCTTC
GTCCGGCAGGGCACCGGCAACGACGAGGCCGGCGCGGCCAACGCCGACGTGGTGAGCCTGACCTGCCCGGTCGCCGCC
GGTGAATGCGCGGGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCCCTGCTGGAGCGCAACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGC
GACGGCGGCGACGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTCCAGGCGCACCGCCAA
CTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTCGGCTACCACGGCACCTTCCTCGAAGCGGCGCAAAGCATCGTCTTCGGCGGG
GTGCGCGCGCGCAGCCAGGACCTCGACGCGATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCGGCGCTGGCCTACGGC
TACGCCCAGGACCAGGAACCCGACGCACGCGGCCGGATCCGCAACGGTGCCCTGCTGCGGGTCTATGTGCCGCGCTCG
AGCCTGCCGGGCTTCTACCGCACCAGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGGCGGCGGGCGAGGTCGAACGGCTGATCGGC
CATCCGCTGCCGCTGCGCCTGGACGCCATCACCGGCCCCGAGGAGGAAGGCGGGCGCCTGGAGACCATTCTCGGCTGG
CCGCTGGCCGAGCGCACCGTGGTGATTCCCTCGGCGATCCCCACCGACCCGCGCAACGTCGGCGGCGACCTCGACCCG
TCCAGCATCCCCGACAAGGAACAGGCGATCAGCGCCCTGCCGGACTACGCCAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGCGCGAG
GACCTGAAGTAA i'
TABELA 3
Sequência de aminoácidos
TGF-a 1fa-ΡΕηθ
-4 Met | -3 Al a | -2 Ala | -i IrGFa1 | His Phe | 6 | 16 Cys 36 | |||||||||||||
Ala | l/al Vai | Ser | Asn 26 | Asp | Cys Pro | Asp | Ser | His Thr | Gin | Phe | |||||||||
Phe | His | Gly | Thr | Cys | Arg | Phe | Leu | Vai | Gin 46 | Glu | Asp | Lys Pro 50 TGFtt | Ala 1 | Cys | Vai | Cys His Ser kc252 | |||
Gly | Tyr | Vai | Gly | Al a | Arg | Cys | Glu | His | Al a | Asp | Leu | u | Al a | kl a | Met | Al a | Glu | blu | Gly |
263 | 273 | ||||||||||||||||||
Gly | Ser | Leu | Ala | Ala | Leu | Thr | Al a | His | Gin | Ala | Cys | His | Leu | Pro | Leu | Glu | Thr | Phe | Thr |
283 | 293 | ||||||||||||||||||
Arg | His | Arg | Gin | Pro | Arg | Gly | Trp | Glu | Gin | Leu | Glu | Gin | Cys | Gly | Tyr | Pro | Vai | Gin | Arg |
303 | 313 | ||||||||||||||||||
Leu | Vai | Ala | Leu | Tyr | Leu | Ala | Ala | Arg | Leu | Ser | Trp | Asn | Gin | Vai | Asp | Gin | Vai | Ile | Arg |
323 | 333 | ||||||||||||||||||
Asn | Ala | Leu | Ala | Ser | Pro | Gly | Ser | Gly | Gly | Asp | Leu | Gly | Glu | Ala | Ile | Arg | Glu | Gin | Pro |
343 | 353 | ||||||||||||||||||
Glu | Gin | Al a | Arg | Leu | Ala | Leu | Thr | Leu | Ala | Ala | Ala | Glu | Ser | Glu | Arg | Phe | Vai | Arg | Gin |
363 | 373 | ||||||||||||||||||
Gly | Thr | Gly | Asn | Asp | Glu | Al a | Gly | Ala | Ala | Asn | Ala | Asp | Vai | Vai | Ser | Leu | Thr | Cys | Pro |
383 | 393 | ||||||||||||||||||
Vai | Ala | Al a | Gly | Glu | Cys | Ala | Gly | Pro | Al a | Asp | Ser | Gly | Asp | Al a | Leu | Leu | Glu | Arg | Asn |
403 | 413 | ||||||||||||||||||
Tyr | Pro | Thr | Gly | Ala | Glu | Phe | Leu | Gly | Asp | Gly | Gly | Asp | Vai | Ser | Phe | Ser | Thr | Arg | Gly |
423 | 433 | ||||||||||||||||||
Thr | Gin | Asn | Trp | Thr | Vai | Glu | Arg | Leu | Leu | Gin | Ala | His | Arg | Gin | Leu | Glu | Glu | Arg | Gly |
443 | 453 | ||||||||||||||||||
Tyr | Vai | Phe | Vai | Gly | Tyr | His | Gly | Thr | Phe | Leu | Glu | Al a | Ala | Gin | Ser | Ile | Vai | Phe | Gly |
463 | 473 | ||||||||||||||||||
Gly | Vai | Arg | Ala | Arg | Ser | Gin | Asp | Leu | Asp | Ala | Ile | Trp Arg Gly | Phe | Tyr | Ile | Ala | Gly |
TABELA 3(Cont.)
Sequência de aminoácidos de TGF-alfa-PE.„
483 493
Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile
503 513
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg
523 533
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly His
543 553
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu
553 573
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr
583 593
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala
603 613
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
TABELA 4
-4 Met | Sequências | d e 1 Vai | aminoác Ser His Phe | idos de TGF 6 Asn Asp Cys Pro | -alfa-PE Asp Ser His | 40aB Thr Gin | Phe | 16 Cys | |||||||||||
-3 Ala | -2 Ala | -1 trGFa Ala pai | |||||||||||||||||
26 | 36 | ||||||||||||||||||
Phe | His | Gly | Thr | Cys | Arg | Phe | Leu | Vai | Gin 46 | Glu | Asp | Lys Pro TGFa50 | Ala 1 | Cys | Vai | Cys | His Ser h252 | ||
Gly | Tyr | Vai | Gly | Ala | Arg | Cys | G1 u | His | Ala | Asp | Leu | Leu | Ala | Kl a | Met | Ala | Glu | bl u | Gly |
263 | 273 | ||||||||||||||||||
Gly | Ser | Leu | Al a | Al a | Leu | Thr | Ala | His | Gin | Ala | Al a | His | Leu | Pro | Leu | Glu | Thr | Leu | Thr |
283 | 293 | ||||||||||||||||||
Arg | His | Arg | Gin | Pro | Arg | Gly | Trp | G1 u | Gin | Leu | Glu | Gin | Ala | Gly | Tyr | Pro | Vai | Gin | Arg |
303 | 313 | ||||||||||||||||||
Leu | Vai | Ala | Leu | Tyr | Leu | Ala | Ala | Arg | Leu | Ser | Trp | Asn | Gin | Vai | Asp | Gin | Vai | Ile | Arg |
323 | 333 | ||||||||||||||||||
Asn | Al a | Leu | Al a | Ser | Pro | Gly | Ser | Gly | Gly | Asp | Leu | Gly | Glu | Ala | Ile | Arg | Glu | Gin | Pro |
343 | 353 | ||||||||||||||||||
Glu | Gin | Al a | Arg | Leu | Ala | Leu | Thr | Leu | Ala | Ala | Ala | Glu | Ser | Glu | Arg | Phe | Vai | Arg | Gin |
363 | 373 | ||||||||||||||||||
Gly | Thr | Gly | Asn | Asp | Glu | Al a | G1 y | Ala | Ala | Asn | Ala | Asp | Vai | Vai | Ser | Leu | Thr | Cys | Pro |
383 | 393 | ||||||||||||||||||
Vai | Ala | Ala | Gly | Glu | Cys | Al a | Gly | Pro | Ala | Asp | Ser | Gly | Asp | Ala | Leu | Leu | Glu | Arg | Asn |
403 | 413 | ||||||||||||||||||
Tyr | Pro | Thr | Glu | Ala | G1 u | Phe | Leu | Gly | Asp | Gly | Gly | Asp | Vai | Ser | Phe | Ser | Thr | Arg | Gly |
423 | 433 | ||||||||||||||||||
Thr | Gin | Asn | Trp | Thr | Vai | Glu | Arg | Leu | Leu | Gin | Ala | His | Arg | Gin | Leu | G1 u | Glu | Arg Gly | |
443 | 453 | ||||||||||||||||||
Tyr | Vai | Phe | Vai | Gly | Tyr | His | Gly | Thr | Phe | Leu | Glu | Ala | Ala | Gin | Ser | Ile | Vai | Phe Gly | |
463 | 473 | ||||||||||||||||||
Gly | Vai | Arg | Ala | Arg | Ser | Gin | Asp | Leu | Asp | Ala | Ile | Trp Arg Gly | Phe | Tyr | Ile | Ala Gly |
TABELA 4
Sequência de aminoácidos de
TGF-alfa-PE40aB
483
Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp 503
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro 523
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala
543
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala lie Thr Gly 563
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr 583
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro 603
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro
493
Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile 513
Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg 533
Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly His 553
Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu 573
Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr
593
Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala 613
Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
TABELA 5
Sequência de aminoácidos | de | TGF-alfa-PE^Q Ab |
-4 -3 -2 -1 IrGFa1 6 | 16 | |
Met Ala Ala Ala |/al Vai Ser His Phe Asn | Asp | Cys Pro Asp Ser His Thr Gin Phe Cys |
26 | 36 | |
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Vai Gin | Glu | Asp Lys Pro Ala Cys Vai Cys His Ser |
50 I ι 252 | ||
46 | TGFft 1 RE | |
Gly Tyr Vai Gly Ala Arg Cys Glu His Ala | Asp | Leu Leu Ala kla Met Ala Glu blu Gly |
263 | 273 | |
Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gin | Ala | Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr |
2Θ3 | 293 | |
Arg His Arg Gin Pro Arg Gly Trp Glu Gin | Leu | Glu Gin Cys Gly Tyr Pro Vai Gin Arg |
303 | 313 | |
Leu Vai Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu | Ser | Trp Asn Gin Vai Asp Gin Vai lie Arg |
323 | 333 | |
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly | Asp | Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gin Pro |
343 | 353 | |
Glu Gin Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala | Ala | Ala Glu Ser Glu Arg Phe Vai Arg Gin |
363 | 373 | |
Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala | Asn | Ala Asp Vai Vai Thr Leu Thr Ala Pro |
383 | 393 | |
Vai Ala Ala Gly Glu Ala Ala Gly Pro Ala | Asp | Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn |
403 | 413 | |
Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly | Gly Asp Vai Ser Phe Ser Thr Arg Gly | |
423 | 433 | |
Thr Gin Asn Trp Thr Vai Glu Arg Leu Leu | Gin | Ala His Arg Gin Leu Glu Glu Arg Gly |
443 | 453 | |
Tyr Vai Phe Vai Gly Tyr His Gly Thr Phe | Leu | Glu Ala Ala Gin Ser Ile Vai Phe Gly |
463 | 473 | |
Gly Vai Arg Ala Arg Ser Gin Asp Leu Asp | Ala | Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly |
TABELA 5
Sequência de aminoácido de TGF-alfa-PE4QAb
483 493
Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile 503 513
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg 523 533
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly His 543 553
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu 563 573
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr 583 593
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin Ala 603 613
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys
Sequê | nci | a de | ami | noáci | dos | ι de T | GF- | a 1: | fa- | pel | ioal | b | |||||||
-4 | -3 | -2 | -1 | IrGFa1 | 6 | 16 | |||||||||||||
Met | Ala | Ala | Ala | kal | Vai | Ser | His | Phe | Asn | Asp | Cys | Pro | Asp | Ser | His | Thr | Gin | Phe | Cys |
26 | 36 | ||||||||||||||||||
Phe | His | Gly | Thr | Cys | Arg | Phe | Leu | Vai | Gin | Glu | Asp | Lys | Pro | Ala | Cys | Vai | Cys | His | Ser |
46 | TGF | a50 | 1 | 1 | rt25 | 2 | |||||||||||||
Gly | Tyr | Vai | Gly | Ala | Arg | Cys | Glu | His | Ala | Asp | Leu | Leu | Ala | Rl a | Met | Ala | Glu | kiu | Gly |
263 | 273 | ||||||||||||||||||
Gly | Ser | Leu | Ala | Ala | Leu | Thr | Ala | His | Gin | Ala | Ala | His | Leu | Pro | Leu | Glu | Thr | Leu | Thr |
283 | 293 | ||||||||||||||||||
Arg | His | Arg | Gin | Pro | Arg | Gly | Trp | Glu | Gin | Leu | Glu | Gin | Ala | Gly | Tyr | Pro | Vai | Gin | Arg |
303 | 313 | ||||||||||||||||||
Leu | Vai | Ala | Leu | Tyr | Leu | Ala | Ala | Arg | Leu | Ser | Trp | Asn | Gin | Vai | Asp | Gin | Vai | Ile | Arg |
323 | 333 | ||||||||||||||||||
Asn | Ala | Leu | Ala | Ser | Pro | Gly | Ser | Gly | Gly | Asp | Leu | Gly | Glu | Ala | Ile | Arg | Glu | Gin | Pro |
343 | 353 | ||||||||||||||||||
Glu | Gin | Ala | Arg | Leu | Ala | Leu | Thr | Leu | Ala | Ala | Ala | Glu | Ser | Glu | Arg | Phe | Vai | Arg | Gin |
363 | 373 | ||||||||||||||||||
Gly | Thr | Gly | Asn | Asp | Glu | Ala | Gly | Ala | Ala | Asn | Ala | Asp | Vai | Vai | Thr | Leu | Thr | Ala | Pro |
383 | 393 | ||||||||||||||||||
Vai | Ala | Ala | Gly | Glu | Ala | Ala | Gly | Pro | Ala | Asp | Ser | Gly | Asp | Ala | Leu | Leu | Glu | Arg | Asn |
403 | 413 | ||||||||||||||||||
Tyr | Pro | Thr | Gly | Ala | Glu | Phe | Leu | Gly | Asp | Gly | Gly | Asp | Vai | Ser | Phe | Ser | Thr | Arg | Gly |
423 | 433 | ||||||||||||||||||
Thr | Gin | Asn | Trp | Thr | Vai | Glu | Arg | Leu | Leu | Gin | Ala | His | Arg | Gin | Leu | Glu | Glu | Arg | Gly |
443 | 453 | ||||||||||||||||||
Tyr | Vai | Phe | Vai | Gly | Tyr | His | Gly | Thr | Phe | Leu | Glu | Ala | Ala | Gin | Ser | Ile | Vai | Phe | Gly |
463 | 473 | ||||||||||||||||||
Gly | Vai | Arg | Ala | Arg | Ser | Gin | Asp | Leu | Asp | Ala | Ile | Trp | Arg | Gly | Phe | Tyr | Ile | Ala | Gly |
-39TABELA 6 (cont.)
Sequência de aminoácidos de TGF-alfa-PE^ab
483
Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gin Asp Gin Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg 503
Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Vai Tyr Vai Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr 523
Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Vai Glu Arg Leu Ile Gly 543
Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu 563
Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Vai Vai Ile Pro Ser Ala Ile Pro 583
Asp Pro Arg Asn Vai Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gin 603
Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gin Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu
Claims (6)
- REIVINDICACSES lâ — Processo para a preparação do polipeptídeo F'E40 aB, PE^0 Ab ou PE^ ab, em que A representa a presença de císteina nas posições 265 e 287 da sequência de aminoácidos de F’E4ô, a representa quer a deleção de císteina nestas posições quer a sua substituição por outro aminoácido, B representa a presença de císteina nas posições 372 e 379 da sequência de aminoácidos de ΡΕ^θ, e b representa quer ; deleção de císteina nestas posições quer a sua substituição por outro aminoácido, caracterizado por compreender a clivagem de uma molécula híbrida na qual um dos polipeptideos ΡΕ^θ modificados anteriores está ligado a outro peptídeo.
- 2â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a clivagem ser efectuada por meio de um agente químico.
- 3â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o peptídeo ao qual o peptídeo PE.. modificado está ligada ser um agente de direccionamento í
- 4â - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o agente químico ser CNBr.
- 5â - Processo de acordo com a reivindicação 1, ) caracterizado por o produto ser PE^ aB.
- 6â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o produto ser ΡΕ^θ Ab.-417â - Processo de acorda com a reivindicação 1 caracterizado por o produto ser PE^ ab.ga - Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a agente de direccionamento ser um anti corpo, um factor de crescimento ou uma hormona.<?a _ Processo de acorda com a rei vind icação 8 caracterizado por o aqente de direccionamento ser TGF-alf ou EGF.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US32721489A | 1989-03-22 | 1989-03-22 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PT93525A PT93525A (pt) | 1990-11-07 |
PT93525B true PT93525B (pt) | 1996-08-30 |
Family
ID=23275618
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PT93525A PT93525B (pt) | 1989-03-22 | 1990-03-21 | Processo para a preparacao de polipeptideo pe40 modificado |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0389043A1 (pt) |
JP (1) | JPH0798839B2 (pt) |
KR (1) | KR0168047B1 (pt) |
CA (1) | CA2012732C (pt) |
FI (1) | FI901420A0 (pt) |
IL (1) | IL93723A (pt) |
NO (1) | NO901315L (pt) |
NZ (1) | NZ232900A (pt) |
PT (1) | PT93525B (pt) |
ZA (1) | ZA902171B (pt) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL98528A0 (en) * | 1990-06-21 | 1992-07-15 | Merck & Co Inc | Pharmaceutical compositions containing hybrid for killing bladder cancer cells |
DE19735105A1 (de) * | 1997-08-13 | 1999-03-04 | Univ Albert Ludwigs Freiburg | Transportsystem zur Einbringung von Proteinen in Zielzellen mit Hilfe eines Fusionsproteins, Nucleinsäurekonstrukte kodierend für die Komponenten des Transportsystems und Arzneimittel, die Komponenten des Transportsystems umfassen |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL90047A (en) * | 1982-10-19 | 1992-12-01 | Cetus Oncology Corp | Cysteine-depleted biologically active muteins other than interferon - ' |
US4545985A (en) * | 1984-01-26 | 1985-10-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Pseudomonas exotoxin conjugate immunotoxins |
WO1987002987A1 (en) * | 1985-11-13 | 1987-05-21 | Murphy John R | Cys codon-modified dna |
US4892827A (en) * | 1986-09-24 | 1990-01-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant pseudomonas exotoxins: construction of an active immunotoxin with low side effects |
-
1990
- 1990-03-13 IL IL9372390A patent/IL93723A/xx active IP Right Grant
- 1990-03-13 NZ NZ232900A patent/NZ232900A/xx unknown
- 1990-03-15 EP EP90200613A patent/EP0389043A1/en not_active Ceased
- 1990-03-21 CA CA002012732A patent/CA2012732C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-21 PT PT93525A patent/PT93525B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-03-21 KR KR1019900003802A patent/KR0168047B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-03-21 NO NO90901315A patent/NO901315L/no unknown
- 1990-03-21 FI FI901420A patent/FI901420A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1990-03-21 ZA ZA902171A patent/ZA902171B/xx unknown
- 1990-03-22 JP JP2069889A patent/JPH0798839B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR0168047B1 (ko) | 1999-01-15 |
NZ232900A (en) | 1993-08-26 |
IL93723A0 (en) | 1990-12-23 |
JPH0798839B2 (ja) | 1995-10-25 |
PT93525A (pt) | 1990-11-07 |
CA2012732C (en) | 1999-09-14 |
JPH0335793A (ja) | 1991-02-15 |
FI901420A0 (fi) | 1990-03-21 |
ZA902171B (en) | 1990-12-28 |
KR900014598A (ko) | 1990-10-24 |
EP0389043A1 (en) | 1990-09-26 |
NO901315D0 (no) | 1990-03-21 |
IL93723A (en) | 1997-02-18 |
NO901315L (no) | 1990-09-24 |
CA2012732A1 (en) | 1990-09-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2903716C (en) | Immunogenic fusion polypeptides | |
CA1331356C (en) | Mutant human angiogenin (angiogenesis factor with superior angiogenin activity) genes therefor and methods of expression | |
TWI794897B (zh) | Glp-2衍生物之長效接合物 | |
EP0467536B1 (en) | Method of treating bladder cancer cells | |
KR0169729B1 (ko) | 하이브리드 단백질, 이의 생산방법 및 이를 함유하는 약제학적 조성물 | |
US5621078A (en) | Modified pseudomonas exotoxin PE40 | |
US5681810A (en) | Diphtheria toxin fragments, conjugates and methods of use to inhibit tumors and leukemia | |
PT93525B (pt) | Processo para a preparacao de polipeptideo pe40 modificado | |
AU697469B2 (en) | Intracellular delivery of chemical agents to a specific cell type | |
JP3135060B2 (ja) | ヘモフィルスインフルエンザb型菌の外皮膜タンパク質P2の部分断片を用いた接合体 | |
AU631200B2 (en) | Production of modified pe40 | |
US6207798B1 (en) | Modified PE40 toxin fusion proteins | |
Riemen et al. | Modified pseudomonas exotoxin PE 40 | |
JP2000507274A (ja) | キャリヤーペプチドとしてのiga1プロテアーゼフラグメント | |
KR20220077590A (ko) | Candida Utilis 유래 요산산화효소-알부민 복합체 및 이의 제조 방법 | |
JP2023535537A (ja) | シスタチオニン-ガンマ-リアーゼを使用するホモシスチン尿症及び高ホモシステイン血症の治療 | |
KR0141315B1 (ko) | 인간 싸이모신 알파 1의 새로운 제조방법 | |
JPH0770194A (ja) | ヒトインターロイキン−2蛋白質 | |
JPH05301892A (ja) | ヒトインターロイキン−2蛋白質およびその製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG3A | Patent granted, date of granting |
Effective date: 19960502 |
|
MM3A | Annulment or lapse |
Effective date: 20041102 |