JPH0335793A - 修正されたｐｅ↓４↓０の産生 - Google Patents

修正されたｐｅ↓４↓０の産生

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JPH0335793A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 伝統的ながん化学療法は、がん患者において腫瘍細胞を
殺しうる薬物の能力に存在している。残念ながら、これ
らの薬物はしばしばｌｌｆｆ１瘍細胞だけでなく正常細
胞も殺してしまう。制がん剤が正常細胞よりも腫瘍細胞
を殺す程度は、腫瘍細胞に関する化合物選択度の指標で
ある。制がん剤の腫瘍細胞選択性を高める１つの方法は
、正常細胞群を回避しながら薬物を優先的にＮｆ１ｆ！
に細胞に運搬することである。特定細胞群に対する化学
療法剤の選択的運搬に関するもう１つの用語は“標的化
”である。腫瘍細胞に対する薬物標的化はいくつかの方
法で達成することができる。１つの方法は、腫瘍細胞の
表面上にみられる特異的レセプター分子の存在に依存し
ている。“標的化剤”としても呼ばれる他の分子もこれ
らの細胞表面レセプターを認識して、それに結合するこ
とができる。これらの“標的化剤”としては、例えば抗
体、増殖因子又はホルモンがある。特異的細胞表面レセ
プターを認識してそれと結合する“標的化剤”は、それ
らのレセプターを有する細胞を標的にするといわれてい
る。例えば、多くの腫瘍細胞はそれらの表面上に表皮増
殖因子レセプターと呼ばれるタンパク質を有している。
表皮増殖因子（ＥＧＦ）及び形質転換増殖因子−α（Ｔ
ＧＦ−α）を含めた数種の増殖因子は、腫瘍細胞上のＥ
ＧＦレセプターを認識してそれと結合する。したがって
、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αはこれらの腫瘍細胞に関する“
標的化剤１である。
“標的化剤”自体は腫瘍細胞を殺さない。細胞毒物又は
毒素を含めた他の分子は、腫瘍細胞標的化及び細胞毒素
ドメインの双方を有するハイブリッド分子を作成するた
め“標的化剤”に結合させることができる。これらのハ
イブリッド分子は、腫瘍細胞を標的にしてしかる後それ
らの毒素成分を介しそれらの細胞を殺すそれらの能力の
おかげで腫瘍細胞選択毒物として機能する。これらのハ
イブリッド分子を組立てる上で用いられる最も強力な細
胞毒物の１つは、哺乳動物細胞においてタンパク賞合成
を阻害する細菌毒素である。シュードモナス外毒素Ａ　
（ＰＥ−Ａ）はこれら細胞毒素の１つであって、ハイブ
リッド“標的化毒素”分子を組立てるために用いられた
（米国特許第４．５４５，９８５号明細書）。
ＰＥ−Ａは哺乳動物細胞に対して極めて毒性の強い６６
ｋＤ細胞タンパク質である。ＰＲ−Ａ分子は３つの機能
性ドメイン：ｌ〉感受性細胞との結合に関与するアミノ
末端結合ドメイン；２）シトソールへの毒素運搬に関与
する内部存在“トランスロケーティング（ｔｒａｎｓｌ
ｏｃａｔｉｎｇ）″ドメイン；３）細胞中毒に関与する
カルボキシ末端酵素ドメインを含んでいる。ＰＥ−Ａは
抗がん剤たる“標的化毒素”分子の組立てに用いられた
が、その場合６６ｋＤ分子はＩｌｉ瘍特異性“標的化剤
”（モノクローナル抗体又は成長因子）と組合されてい
る。この方法で得られる“標的化毒素”分子は、“標的
化剤”に関するレセプターを有する細胞に対して高毒性
を有する。
このアプローチにおける問題は、ＰＲ−Ａ抗体又は増殖
因子ハイブリッドが正常細胞に関してなおもある程度高
い毒性を有していることである。
この毒性は、ＰＥ−Ａの結合ドメインを介した細胞への
ハイブリッドタンパク質結合のせいで大きい、この問題
を克服するため、シュードモナス外毒素Ａの酵素及び“
トランスロケーティングドメインのみを含んだタンパク
質が組換え産生された〔ワンら、セル、第４８巻、第１
２９−１３７頁、１９８７年（Ｈｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ
４０　Ｃｅ１１．４８　：　１２９−１３７．１９８７
）　）　、このタンパク質は、それが４０ｋＤの分子量
を有するためＰＥ、。と命名された。
ＰＥ４０はＰＥ−Ａの結合ドメインを欠き、哺乳動物細
胞と結合できない。このためＰＥ４０は完全６６ｋＤタ
ンパク質よりも著しく低毒性である。
その結果、ＰＥ４０で得られたハイブリッド“標的化毒
素°分子はそれらの細胞毒性に関して更に一層特異的で
あった〔チャウダリーら、プロシーディング・オブ・ナ
シッナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第８
４巻、第４５８３−４５４２頁、１９８７年（Ｃｈａｕ
ｄｈａｒｙ　ｅｔ　ａｔ４０　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏ
ｆ　　Ｎａｔ１０ｎａｌ　　Ａｃａｄｅｍｙ　　ｏｆ　
　５ｃｉｅｎｃｅ　　ＵＳＡ、８４：　　４５８３−４
５４２、　１９８７）　　）　　。
ＰＥ４０に関して研究したところ、２６５．２８７．３
７２及び３７９位のシスティン残基〔天然６６ｋＤ　　
ＰＥ−Ａ分子からナンバリング；グレイ　（Ｇｒａｙ）
　ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
−・オプ・サンエンスＵＳＡ。
第８１巻、第２６４５−２６４９頁、１９８４年〕は化
学的複合化方法による“標的化毒素”分子の組立てを妨
げることが判明した。これらの残基が形成するジスルフ
ィド結合の反応性は、生成物“標的化毒素”の化学的統
一性に関してバラツキを生じさせる。
１、米国特許第４．５４５，９８５号明細書ではシュー
ドモナス外毒素Ａが抗体又は表皮増殖因子と複合化でき
ることを開示している。米国特許第４，５４５，９８５
号明細書では更にこれらの複合体がヒト腫瘍細胞を殺す
ために使用できることを開示している。
２、米国特許第４，６６４，９１１号明細書では抗体が
植物から得られた毒素たるリシンのＡ鎖又はＢ鎖と複合
化できることを開示している。米国特許第４．６６４，
９１１号明細書では更にこれらの複合体がヒト腫瘍細胞
を殺すために使用できることを開示している。
３、米国特許第４，６７５，３８２号明細書ではメラニ
ン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）のようなホルモンがペプ
チド結合を介してジフテリア毒素タンパク質の一部に結
合できることを開示している。米国特許第４．６７５，
３８２号明細書では更にこれらのタンパク質についてコ
ードする遺伝子がＭｉ換えＤＮＡ技術を用いてハイブリ
ッド融合タンパク質の台底を指示するよう互いに結合で
きることを開示している。この融合タンパク質は、Ｍ　
Ｓ　ＩＩレセプターを有する細胞と結合しうるｎヒカを
有している。
４、　マーフ４−　（Ｍｕｒｐｈｙ）　　ら、ＰＮＡＳ
　　ＵＳＡ。
第８３巻、第８２５８−８２６２頁、１９８６年、ジフ
テリア毒素関連α−メラニン細胞刺激ホルモン融合タン
パク質の遺伝子組立て、発現及びメラノーマ選択的細胞
毒性。この論文では、組換えＤＮＡ技術で細菌から産生
されかつα−メラニン細胞刺激ホルモンに結合された一
部のジフテリア毒素タンパク質からなるハイブリッド融
合タンパク質がヒトメラノーマ細胞に結合してそれを殺
すことについて開示している。
５、　ケリー（Ｋｅｌｌｅｙ）　　ら、ＰＮＡＳ　　Ｕ
ＳＡ、第８５巻、第３９８０−３９８４頁、１９８８年
、インターロイキン２−ジフテリア毒素融合タンパク質
はインビボで細胞性免疫を遮断することができる。この
論文では、組換えＤＮＡ技術で細菌から産生されかつイ
ンターロイキン２に結合された一部のジフテリア毒素タ
ンパク質からなるハイブリッド融合タンパク質がヌード
マウスで細胞性免疫を抑制するように機能することを開
示している。
６、了りエアード（ＡＩｌｕｒｅｄ）ら、Ｐ　Ｎ　Ａ　
Ｓ　　ＵＳＡ第８３巻、第１３２０−１３２４頁、１９
８６年、３入のシュードモナス・アエルギノサ（ｐ３６
ｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａの構
造。この論文では、シュードモナス外毒素Ａタンパク質
の三次元構造について開示している。
７、ワンら、セル、第４８巻、第１２９−１３６頁、１
９８７年、大腸菌で発現される遺伝子の欠失分析で確認
されたシュードモナス外毒素の機能性ドメイン。この論
文では、シュードモナス外毒素Ａタンパク質が哺乳動物
細胞との結合、リソソーム膜を通過する毒素タンパク質
のトランスロケーティング及び哺乳動物細胞内における
延長因子２のＡＤＰリボシル化に関与する３つの異なる
機能性ドメインに分けうろことを開示している。この論
文では更にこれらの機能性ドメインがシュードモナス外
毒素Ａタンパク質の異なる領域に対応することを開示し
ている。
８．１９８８年３月３０日付で公開された欧州特許出願
２６１．６７１号明細書では、全シュードモナス外毒素
Ａタンパク質の細胞結合機能を欠くが但し全シュードモ
ナス外毒素Ａタンパク質のトランスロケーティング及び
ＡＤＰリボシル化機能を有するシュードモナス外毒素Ａ
タンパク質の一部が産生できることを開示している。全
シュードモナス外毒素Ａタンパク質のトランスロケーテ
ィング及びＡＤＰす・ボシル化機能を留めたシュードモ
ナス外毒素Ａタンパク質の一部はシュードモナス外毒素
４０又はＰＥ−４０と呼ばれる。ＰＥ−４０は、グレイ
ら、ＰＮＡＳ　　ＵＳＡ、第８１巻、第２６４５−２６
４９頁、１９８４年で定義されるように全シュードモナ
ス外毒素Ａタンパク質のアミノ酸残基２５２−６１３か
らなる。この特許出願では更にＰＥ−４０が形質転換増
殖因子−αと結合して組換えＤＮＡ技術により細菌から
産生されるハイブリノド融合タンパク質を形成できるこ
とを開示している。
９、　チャウダリーら、ＰＮＡＳ　　ＵＳＡ、第８４巻
、第４５３８−４５４２頁、１９８７年、形質転換増殖
因子α型とシュードモナス外毒素との組換え融合タンパ
ク質の活性。この論文では、ＰＥ−４０及び形質転換増
殖因子−αから形成されかつ組換えＤＮＡ技術で細菌か
ら産生されるハイブリッド融合タンパク質が表皮増殖因
子レセプターを有するヒト腫瘍細胞と結合してそれを殺
すことを開示している。
１０、ベイロン（Ｂａｉｌｏｎ）ら、バイオテクノロジ
ー（Ｂ１０ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　、第１３２６−１
３２９頁、■９８８年１１月、インターロイキン２−シ
ュードモナス外毒素融合タンパク質の精製及び部分的特
徴。この論文では、ＰＥ−４０及びインターロイキン２
から形成されかつ組換えＤＮＡ技術で細菌から産生され
るハイブリッド融合タンパク質がインターロイキン２レ
セプターを有するヒト細胞系と結合してそれ殺すことを
開示している。
本発明の目的は、“標的化剤”及び修正ＰＥ、。
から形成される複合体分子において改善された化学的統
一性及び所定の構造を示すＰＥ、。の修正体を提供する
ことである。本発明のもう１つの目的は、“標的化剤”
及び修正ＰＥ４０で形成された融合タンパク質から修正
ＰＥａｏドメインを製造及び回収する方法について提供
することである。本発明のこれらの及び他の目的は、以
下の記載から明らかとなるであろう。
本発明は、ＰＥ４０においてシスティンに起因する化学
的バラツキを解消したＰＥ４０ドメインの修正体につい
て提供する。ＰＥ４０におけるシスティン残基の例えば
アラニンのような他のアミノ酸への置換又は２以上のシ
スティン残基の欠失によって、修正ＰＥ、。及び標的化
剤から形成される複合体の生物学的及び化学的性質を改
善することができる。
ＥＧＦ及びＰＥ４０の複合化により得られるハイブリッ
ド分子は３種の一次アッセイ系で特徴付けられる。これ
らのアッセイとしては、（１）哺乳動物タンパク質合成
を阻害するＥＧＦ−ＰＥ、。の酵素活性を測定する延長
因子２のＡＤＰリボシル化、ｆ２）ＥＧ　Ｆ　−Ｐ　Ｅ
４０のＥＧＦレセプター結合活性を測定するＡ４３１細
胞由来膜ベシクル上のＥＧＦレセプターに対する放射線
標識ＥＧＦ結合の阻害及び（３１Ｅ　Ｇ　Ｆ　−Ｐ　Ｂ
　ａ。との接触後における腫瘍細胞の生存率を測定する
ために用いられる３−（，４０５−ジメチルチアゾール
−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムプロ
ミド（ＭＴＴ）からホルマザンへの変換で評価されるよ
うな細胞生存率がある。これらのアッセイは前記のよう
に行われる〔チャンら、インフェクション・アンド・イ
ムニティ、第１６巻、第８３２−８４０Ｌ１９７７年（
Ｃｈｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ４０　ＩｎｆｅｃＨｏｎ　ａｎ
ｄ　ｆ＋ｗｕｎｉｔｙ。
１６　：　８３２−８４１．１９７７）　　？コーエン
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケもストリー
、第２５７巻、第１５２３−１５３１頁、１９８２年（
Ｃｏｈｅｎｅｔ　ａｌ−＋　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
１０ｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５７：１
５２３−１５３１　、１９８２）　　；リーメンら、ペ
プタイデス、第８巻、第８７７−８８５頁、１９８７年
（Ｒｉｅｍｅｎｅｔ　ａｌ４０　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　
８　：　８７？−８８５，１９８７）　　；モスマン、
ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ、第６５
巻、第５５−６３頁、１９８３年（Ｍｏｓｓｍａｎ、　
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉａｃ＋ｏｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ。
６５　：　５５−６３．１９８３）　）。
所定の化学的構造及び優れた生物学的特徴を有するＥＧ
Ｆ−ＰＥ、。タンパク質複合体を得るため、我々は修正
ＰＥａ。の原料物質として組換え発現ＴＧＦ−α−ＰＥ
、。分子を用いた。我々は最初、ＴＧＦ−α−ＰＥ、。
又はＴＧＦ−α−ＰＥａ。の特異的修正体のいずれかに
ついてコードする一連の組換えＤＮＡ分子を産生した０
元の又は親のＴＧＦ−α−ＰＥ、。遺伝子は、実施例１
で記載されたようにクローニングＤＮＡの異なるセグメ
ントを用いて細菌ＴＡＣ発現プラスミドベクター（ｐＴ
ＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０）で分子クローニングされた
。ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０　　ＤＮＡクローンは
、ＴＧＦ−α−ＰＥ、。　ＤＮＡの特異的修正体を組立
てるための出発試薬として用いられた。ｐＴＡＣＴＧＦ
５７−ＰＥ４０　　ＤＮＡの特異的修正では、ｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０ＤＮＡのＰＥ４０ドメイン内にお
いて２又は４つのシスティンコドンを他のアミノ酸コド
ンで置換するために必要なりＮＡコード配列中における
部位特異的変異を要する。一方部位特異的変異では、ｐ
ＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０のＰＥ、。ドメイン内にお
いて２又は４つのシスティンコドンを欠失させるように
工学処理してもよい。ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０　
　ＤＮＡにおける部位特異的変異は、ウィンターら、ネ
ーチャー、第２９９巻、第７５６−７５８頁、１９８２
年（Ｗｉｎｔｅｒｅｔ　ａｌ４０　Ｎａｔｕｒｅ、　２
９９　：　７５６−７５８．１９８２）の方法を用いて
行われた。変異されたｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０　
　ＤＮＡの具体例は実施例２で示されている。
本ＴＧＦ−α−ＰＲ，。のアミノ酸配列は第２表で示さ
れている。親ＴＧＦ−α−ＰＥ、。ハイブリッド融合タ
ンパク質のＰＥ、。ドメインにおける４つのシスティン
残基は、残基Ｃｙｓ２６５５Ｃｙｓ２Ｂ？Ｃｙ３３１２
及びＣｙｓ”″として示される。アミノ酸残基は天然６
６ｋＤ　　ＰＥ−Ａ分子に関して規定されたようにナン
バリングされる（グレイら、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第
８１巻、第２６４５２６４９頁、１９８４年）。修正Ｐ
Ｅ４０分子を得るために用いられる修正ＴＧＦ−α−Ｐ
Ｅｏ融合タンパク質では、残基（ＣｙｓＺ６５及びＣｙ
ｓ２１１７〕又は（Ｃｙｓコ？２及びＣｙｓ３７９　）
又は（（、ｙｓｔｂ％。
Ｃ，ｓｔｍ’Ｉ、ＣｙｓＩ？！及びＣｙｓ３？９　）の
置換又は欠失が生じている。修正融合タンパクから得ら
れる修正ＰＥ、。分子の命名を簡素化するため、我々は
２６５及び２８７位のアミノ酸残基を“Ａ”座とし３７
２及び３７９位の残基を“Ｂ”座として示した。システ
ィンが親ＴＧＦ−α−ＰＥ、。融合タンパク質と同様に
アミノ酸残基２６５及び２８７に存在する場合、座は大
文字（即ち＠Ａ”）で表される。
システィンが他のアミノ酸で置換されるか又は残基２６
５及び２８７から欠失される場合、座は“ａ”で表され
る。同様に３７２及び３７９位のアミノ酸残基がシステ
ィンである場合圧はＢ″で表され、一方“ｂ”は３７２
又は３７９位のアミノ酸残基が他のアミノ酸で置換され
るか又は欠失された場合におけるこの座を表す。このた
めＰＥ４０ドメインにおける４つすべてのシスティン残
基がアラニンで置換されるか又は欠失された場合、修正
ＰＲ，。はＰＥａｏａＥｌと表示される。同様に、アく
ノ酸残基２６５．２８７．３７２及び３７９位にシステ
ィンを有する親ＴＧＦ−α−ＰＥ、。融合タンパク質か
ら得られた親ＰＥ、。はＰＥ、。ＡＢと表示することが
できる。
原料物質（即ち、ＴＧＦ−α−ＰＥａａＡＢハイブリッ
ドタンパク質並びに修正ＴＧＦ−α−Ｐｔ＋、。Ａｂ、
ａＢ及びａｂハイブリッドタンパク質）は、ラインメイ
ヤー（Ｌｉｎｅ＊ｅｙｅｒ）ら、バイオテクノロジー、
第５巻、第９６０−９６５頁、１９８７年で記載された
ＴＡＣ発現ベクター系を用いて大腸菌から産生される。
これらの細菌で産生される原料タンパク質は、細菌を塩
酸グアニジンで溶離ししかる後亜硫酸ナトリウム及びテ
トラチオン酸ナトリウムを加えて回収かつ精製される。
次いでこの反応混合物は透析され、溶液から沈澱したタ
ンパク質を溶解させるため尿素が加えられる。混合物は
不溶性物質を除去するため遠心され、組換えハイプリン
トＴＧＦ−α−ＰＥａ。原料タンパク質はイオン交換ク
ロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーしか
る後再度イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離さ
れる。
ハイブリッド原料タンパク質中の単一メチオニン残基は
ＴＧＦ−α及びＰＥ４０ドメイン間に位置することから
、ＣＮＢｒ処理によれば原料タンパク質を開裂させて修
正ＰＥ、。タンパク質及びＴＧＦ−αを生じる。このた
めＴＧＦ−α−ＰＥ４０の精製Ｓ−スルホネート誘導体
は、分子のＴＧＦ部分を除去するためＣＮＢｒ処理に付
される。所望の修正ＰＥ、。部分は、イオン交換クロマ
トグラフィーしかる後サイズ排除クロマトグラフィーに
より精製される。次いで精製された修正ＰＥ、。は、所
望の標的化剤と複合化させるため５ＰＤＰのように適切
なヘテロ三官能性試薬で誘導化される。複合化後、サイ
ズ排除クロマトグラフィーが複合体を非複合物質から単
離するために用いられる。精製された複合体が単離され
たら、それはＡＤＰリボシル化アソセイ並びに関連レセ
プター結合及び細胞生存アンセイを用いて生物学的活性
に関し試験される。
下記実施例は本発明について示しているが、しかしなが
ら本発明をそれに限定するものではない。
分子生物学操作にとって必要なすべての酵素反応は、他
に指示のない限りマニアナイスら、１９８２年、分子ク
ローニング：実験マニュアル、コールド・スプリング・
ハーバ−・ブレス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。
（１９８２）　Ｉｎ　：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ
　、　Ｃｏ’ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒ
ｅｓｓ）で記載されたように行われる。
実施例１ ＴＧＦ−α−ＰＥ、。ＤＮＡ含有組換えＤＮＡクローン
の　１て ＴＧＦ−αＤＮＡセグメントをデフニオ−ジョーンズら
、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、第
８巻、第２９９９−３００７頁、１９８８年（Ｄｅｆｅ
ｏ−Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｂ１０ｌｏｇｙ、　８　：
　２９９９−３００７．１９８８）で記載されたように
３組の台底オリゴヌクレオチドを用いて組立てた。この
合成Ｔ　Ｇ　Ｆ−α遺伝子をｐｕｃ−１９に組込んでク
ローニングした。組換えヒトＴＧＦ−α含有ｐＵＣ−１
９クローンからのＤＮＡを５ｐｈｌ及びＥｃｏＲＩで切
断した。切断により、）ＵＣ−１９のすべてとＴＧＦ−
αの５′部分とを含む２．８ｋｂＤＮＡ断片を得た。２
．８ｋｂ断片をゲル電気泳動により精製かつ単離した。
ＥｃｏＲＩ〜５ｐｈｌオリゴヌクレオチドカセットを合
成した。
この合成カセットは下記配列を有していた＝５嘗　　　
　　　　　　　　　　　３Ｉ３督　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５Ｉ便宜上、このオリ
ゴヌクレオチドカセットを５７と命名した。カセット５
７をアニーリングして、環状プラスくド形＊２．８ｋｂ
断片を含むＴＧＦ−αに結合させた。カセットを含むク
ローンは放射線標識カセット５７ＤＮＡとのバイブリフ
ト形成により同定した。ヒトＴＧＦ−αの存在はＤＮＡ
配列決定により確認した。配列決定では、ＴＧＦ−α配
列の３′末端に新たに導入されたＦｓｐＪ部位の存在に
ついても確認した。ＴＧＦ−α−５７／ｐＵＣ−１９と
命名されたこのプラスミドをＨｉｎｄ　ｍ及びＦｓｐｌ
で切断し、Ｔ　Ｇ　Ｆ　−ｔｘ遺伝子を含んだ１６８ｂ
ｐ断片（ＴＧＦ−α−５７）を得た。
別のｐＵＣ−１９調製物をＨ３ｎｄｌｌｌ及びＥｃｏＲ
Ｉで切断し、２．６８ｋｂ　ｐＵｃ　−１９ベクターＤ
ＮＡを得た。ＰＥ４０ＤＮＡをプラスξドｐｖｃｓから
単離した（チャウダリーら、ＰＮＡＳ　　ＵＳＡ、第８
４巻、第４５３８−４５４２頁、１９８７年）。
ｐｖｃａをＮｄｅｌで切断した０次いでフラッシュ末端
を標準条件のフレノウ反応でこのＤＮＡ上に形成させた
（マニアナイスら、前掲、第１１３頁）次いでフラッシ
ュ末端化ＤＮＡをＥｃｏＲＩによる第二の切断に付して
、ＰＥ、。を含んだ１．３　ｋｂＥｃｏＲＩ　＝Ｎｄｅ
　Ｉ　　（フラッシュ末端化）切断を得た。ＴＧＦ−ｃ
ｒ　−５７Ｈｉｒ、ｄＩ［［及びＦｓｐｌ断片（１６８
ｂｐ）を２．６８ｋｂ　ｐｕｃ−１９ベクターに結合さ
せた。−夜インキュベート後９．１．３ｋｂＥｃｏＲＩ
　〜Ｎｄｅ　ｌ　　（フラッシュ末端化）ＰＥ、。
ＤＮＡ断片を結合混合物に加えた。この第二の結合を一
夜続けた。次いで結合反応生成物を用いて、ＪＭ１０９
細胞を形質転換させた。ｐＵＣ−１９中にＴＧＦ−α−
５７ＰＥ４０を含むクローンを放射線標識ＴＧＦ−α−
５’　７　Ｐ　Ｅ４Ｇ　ＤＮＡとのバイブリフト形成に
より同定し、このクローンからＤＮＡを単離した。ＴＧ
Ｆ−α−５７ＰＥ、。をｐＵＣ−１９ベクターから除去
し、ラインマイヤーら、バイオテクノロジー、第５巻、
第９６０−９６５頁、１９８７年で記載されたＴＡＣベ
クター系に移した。ｐＵｃ−１９中のＴＧＦ−α−５７
Ｐ　Ｅ４０をＨｉｎｄ　ｍ及びＢｃｏＲＩで切断し、Ｔ
ＧＦ−α−５７ＰＥ４０を含んだ１．５　ｋｂ断片を得
た。フラッシュ末端を標準フレノウ反応条件下でこのＤ
ＮＡ断片上に形成させた（マニアナイスら、前掲）、Ｔ
ＡＣベクターをｌ１ｉｎｃｌ　ｍ及びＥｃｏＲＩで切断
した。フラッシュ末端を標準フレノウ反応条件下で切断
されたＴＡＣベクターＤＮＡ上に形成さセた（マニアナ
イスら、前掲）。２．７ｋｂフラツシユ末端化ベクター
をゲル電気泳動で単離した。
次いでフラッシュ末端化ＴＧＦ−α−５７ＰＥ、。
断片をフラッシュ末端化ＴＡＣベクターに結合させた。
この結合により得られたプラスミドを用いてＪＭ１０９
細胞を形質転換させた。ＴＧＦ−α−５７ＰＥ４０を含
んだ候補クローンは上記のようなハイブリソド形成によ
り同定し、配列決定した。
所望の組立てを含んだクローンはｐ　Ｔ　Ａ　ＣＴＧＦ
５７−ＰＥ４０と命名した。これらの操作で得られたプ
ラスミドは第１図で示されている。ｐＴＡＣＴＧＦ５７
−ＰＥ４０　　ＤＮＡでコードされたＴＧＦ−α−ＰＥ
、。融合タンパク質のア逅ノ酸コドンに関するヌクレオ
チド配列は第１表で示されている。ＴＧＦ５７−ＰＥ４
０遺伝子でコードされたア逅ノ酸配列は第２表で示され
ている。
実施例２ ＤＮＡクローンを含んだ組換えＴＧＦ−α−ＰＥ、。
修正体の組立てニジスティンのアラニンによ装置ＴＧ　
Ｆ−α　　Ｐ　ＥａｏａＢ　： クローンｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０を５ｐｈｌ及び
ＢａｍＨＩで切断し、７５０ｂｐ　５ｐｈｌ　−Ｂａｍ
ＨＩ断片（ＴＧＦ−αのＣ末端５アミノ酸及びＰＥ、。
のＮ末端２４３ア逅）酸に相当を単離した。Ｍ１３ｎ＋
ｐ１９ベクターＤＮＡを５ｐｈｒ及びＢａｍＨＩで切断
し、ベクターＤＮＡを単離した。
７５０ｂｐ　５ｐｈｌ　−Ｂａ閘ＨＩ　　ＴＧＦ−ｃｒ
−ＰＥ、。
断片を１５℃で一夜かけてＭ１３教クターＤＮＡに結合
させた。細菌宿主細胞をこの結合混合物で形質転換し、
候補クローンを単離し、それらのプラスミドＤＮＡを配
列決定して、これらのクローンが適正な組換えＤＮＡを
含むことを確認した。−本鎖ＤＮＡを変異誘発用に製造
した。
オリゴヌクレオチド（オリゴ＃１３２）を合成し、部位
特異的変異誘発に用いて、ＴＧＦ−α−ＰＥ、。ＤＮＡ
中にＰＥ４０のア亙ノ酸２７２位でＨｐａ１部位を導入
した： ５１　ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＴＡＡＣＣＣＧＴＣ３’　
　　　（第１ノゴ１１１３２）この部位特異的変異誘発
の１つの結果は、ＰＨ４０の２７２位残基におけるフェ
ニルアラニンからロイシンへの変換であった。変異誘発
はウィンターら、ネーチャー、第２９９巻、第７５６−
７５８頁、１９８２年で記載されているように実施した
。
新たに形成されたＨｐａ１部位を含む候補クローンを単
離し、配列決定して、変異遺伝子配列の存在を確認した
。次いでこのクローンを５ｐｈｌ−３ａｌＩで切断した
。ＴＧＦ−αのＣ末端５アミノ酸及びＰＥ４０のＮ末端
７０アミノ酸に相当しかつ新たに導入されたＨｐａ１部
位を含む２１０ｂｐ断片を単離し、Ｓｐｈ　Ｔ　−Ｓａ
ｌ　１部位で親ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０プラスミ
ドに再度組込みサブクローニングした。細菌宿主細胞を
形質転換し、候補クローンを単離し、そのプラスミドＤ
ＮＡを配列決定して、このクローンが適正な組換えＤＮ
Ａを含むことを確認した０便宜上、このクローンはｐＴ
ＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２と命名した。ｐＴＡ
ＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２を５ｐｈｌ及びＨｐａ
Ｉで切断し、３．９６ｋｂ　　ＤＮＡ断片を単離した。
ＴＧＦ−αのＣ末端５アミノ酸及びＰＥ４０のＮ末端３
２アミノ酸に相当しかつ５ｐｈｌ及びＨｐａｌ適合末端
を含む合成オリゴヌクレオチドカセット（オリゴ＃１５
３）を合威し、切断されたｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４
０−１３２に結合させた： （オリゴ＄１１５３） このオリゴヌクレオチド力セントは、残基２６５におい
てシスティンを特定するコドンが今度はアラニンを特定
するようにＴＧＦ−α−ＰＥａａＤＮＡを変化させた。
便宜上、このプラスミドＤＮＡはｐＴＡＣＴＧＦ５７−
ＰＥ４０−１３２゜１５３と命名した。細菌宿主細胞を
ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２．１５３ＤＮＡ
で形質転換した。候補クローンをハイブリッド形成によ
り同定し、単離し、それらのプラスミドＤＮＡを配列決
定して、それが適正な組換えＤＮＡを含むことを確認し
た。
ｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２．１５３　ＤＮ
ＡをＨｐａｌ及び５ａｌｌで切断し、３．９５ｋｂベク
ターＤＮＡを単離した。ＰＥ、。のアミノ酸残基２７２
〜３０９に相当しかつＨｐａＴ及び５ａｌｌ適合末端を
含む合成オリゴヌクレオチドカセント（オリゴ１１２）
を合成し、３．９５ｋｂ　ｐ’ｒＡＣＴＧＦ／ＰＥ４０
　１３２，１５３ＤＮＡに結合させた： （オリゴ１１４２） このオリゴヌクレオチドカセントは残基２８７において
システィンを特定するコドンを変換させ、このコドンが
今度アラニンを特定するようにさせる。便宜上、この変
異プラスミドＤＮＡをｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０−
１３２．１５３，１４２と命名した。細菌宿主細胞をこ
のプラスミドで形質転換し、候補クローンをハイブリソ
ド形成により同定した。これらのクローンを単離し、そ
れらのプラスミドＤＮＡを配列決定して、それが適正な
組換えＤＮＡを含むことを確認した。ｐ　Ｔ　Ａ　ＣＴ
Ｃ；Ｆ５７−ＰＥ４０−１３２，１５３．１４２プラス
ミドは、座“Ａ″における双方のシスティンがアラニン
で置換されたＴＧＦ−α−ＰＥ４０変異体についてコー
ドしている。したがって前記命名法に従い、ＴＧＦ−α
−ＰＥ４０のこの修正体はＴＧ　Ｆ　　ａ　　Ｐ　Ｅａ
ｏａＢと命名される。ＴＧＦα−ＰＥ、。ａＢ遺伝子で
コードされたアミノ酸配列は第３表で示されている。
ＴＧＦ−α−ＰＥ４０Ａｂ　： クローンｐＴＡＣＴＧＦ５７−ＰＥ４０を５ｐｈｌ及び
Ｂａ５ＨＩで切断し、７５０ｂｐＳｐｈ　ｒ　−Ｂａｍ
ＨＩ断片（Ｔ　Ｇ　Ｆ　−αのＣ末端５アξ）酸及びＰ
Ｅ５ｏのＮ末端２５２アミノ酸に相当）を単鎖した。　
Ｍ　ｌ　３ｍｐ１９ベクターＤＮＡを５ｐｈｒ及びＢａ
＋ｓＨＩで切断し、ベクターＤＮＡを単離した。
７５０ｂｐＳｐｈＩ　−ＢａｓＨＩ　　ＴＧＦ−ａ−Ｐ
Ｅ、。
断片を１５℃で一夜かけてＭ１３ベクターＤＮＡに結合
させた。細菌宿主細胞をこの結合混合物で形質転換し、
候補クローンを単離し、それらのプラスミドＤＮＡを配
列決定して、これらのクローンが適正な組換えＤＮＡを
含むことを確認した。
−本鎖ＤＮＡを変異誘発用に製造した。
オリゴヌクレオチド（オリゴ＃１３３）を合成し、部位
特異的変異誘発に用いて、ＴＧＦ−α−ＰＥ４０ＤＮＡ
中にＰＥ、。のアミノ酸３６９位でＢｓｔｅ　１１部位
を導入した： この変異誘発の１つの結果は、ＰＥ４０の３６９位にお
けるセリン残基のトレオニンへの変換であった。
新たに形成されたＢｓｔｅ　Ｉｆ部位を含むＤＮＡクロ
ーンを同定し、単離し、配列決定して、適正な組換えＤ
ＮＡの存在を確認した。次いでこのクローンをＡｐａｌ
及び５ａｌｌ制限酵素で切断した。新たに形成されたＢ
ｓｔｅ　Ｕ部位を含む１２０ｂｐインサ一トＤＮＡ断片
を単離し、Ａｐａｌ及び５ａｌｌで切断されたｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０に結合させた。細菌宿主細胞を形
質転換し、候補クローンを単離し、配列決定して、適正
な組換えＤＮＡが存在することを確認した。この新たに
形成されたプラスミドＤＮＡはｐＴＡＣＴＧＦ５７ＰＥ
４０−１３３と命名した。それをＢｓｔｅ　Ｈ及びＡｐ
ａｌで切断し、２．６５ｋｂベクタ−ＤＮＡ断片を単離
した。
Ｂｓｔｅ■及びＡｐａｌ制限酵素で切断されたｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３クローンから欠失された
ＴＣＦ−α−ＰＥ、０の領域に相当するＢｓｔｅ■〜Ａ
ｐａｌオリゴヌクレオチド力セント（オリゴ＃１５５）
を合成した。このカセットはＢｓｔｅ　ＩＩ及びＡｐａ
Ｉ適合末端に関するヌクレオチド配列についても特定し
ていた。
（オリゴ１１５５） このオリゴヌクレオチドカセットは、ＰＥａ。の残基３
７２及び３７９のシスティンに関するコドンをアラニン
について特定するコドンに換えた。
オリゴヌクレオチドカセット付１５５を２，６５ｋｂベ
クタ−ＤＮＡ断片に結合させた。細菌宿主細胞を形質転
換し、候補クローンを単離し、配列決定して、適正な組
換えＤＮＡが存在することを確認した。この新たに形成
されたＤＮＡクローンはｐＴＡＣＴＧＦ５？−ＰＥ４０
−１３３．１５５と命名した。これは座＠Ｂ″における
双方のシスティンがアラニンで置換されたＴＧＦ−α−
ＰＥ、。
変異体についてコードしている。したがって前記命名法
に従い、ＴＧＦ−α−ＰＥ、。のこの修正体はＴＧＦ−
α−ＰＥ、。Ａｂと命名される。ＴＧＦ−α−ＰＥ、。
Ａｂ遺伝子でコードされたアミノ酸配列は第４表で示さ
れている。
ＴＧＦ−α−ＰＥ４０ａ　ｂ　： ＴＧＦ−α−ＰＥ４０ａＢについてコードするｐＴＡｃ
−ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３２．１５３．１４２プラ
スミドを５ａｌｌ及びＡｐａｌで切断し、得られた３、
８ｋｂベクタ−ＤＮＡ断片を単離した。
ＴＧＦ−α−ＰＥ、。ＡｂについてコードするｐＴＡＣ
ＴＧＦ５７−ＰＥ４０−１３３．１５５プラスミドも５
ａｌＩ及びＡｐａｌで切断し、ＰＥ、。のアミノ酸残基
３７２及び３７９においてシスティンからアラニンに変
えて得られる１４０ｂｐＤＮＡ断片を単離した。これら
２つのＤＮＡを互いに結合させ、細菌宿主細胞を形質転
換させるために用いた。候補クローンは、ｐＴＡＣＴＧ
Ｆ５７−ＰＥ４０−１３３．１５５からの放射線標識１
４０ｂｐ　ＤＮＡとのハイブリッド形成により同定した
。候補クローンからのプラスミドＤＮＡを単離し、配列
決定して、適正な組換えＤＮＡの存在を確認した。この
新たに形成されたＤＮＡクローンはｐＴＡＣＴＧＦ５７
−ＰＥ４０−１３２．１５３．１４２．１３３．１５５
と命名した。このプラスミドは、座″Ａ″及びＢ″にお
ける４つのすべてのシスナインがアラニンで置換された
ＴＧＦ−α−ＰＥ、。
変異体についてコードしている。したがって前記命名法
に従い、ＴＧＦ−α−ＰＥ、。のこの修正体はＴＧＦ−
Ｏｆ−ＰＥ４０ａｂと命名される。ＴＧＦ−α−ＰＥ、
。ａｂ遺伝子でコードされたアミノ酸配列は第５表で示
されている。
実施例３ 組換えＴＧＦ−α−ＰＥ４０原料タンパク質の産生び 形質転換された大腸菌ＪＭ−１０９細胞をｌｌ振盪フラ
スコ内においてＬＢブロス５００ｄ中チアンピシリン１
００μ たｅＡ＆。。スペクトル測定吸光度値が０．　６に達し
た後、イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを
最終濃度１ｍＭまで加えた。２時間後、細胞を遠心によ
り回収した。
細胞を室温で２時間攪拌することによりｐＨ８．０の８
Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍ阿トリス、１＋ＭＥＤＴＡ中
で溶解させた。溶解混合物を固体試薬の添加により０．
　４　Ｍ亜硫酸ナトリウム及び０．　１　Ｍテトラチオ
ン酸ナトリウムに溶解させ、ｐＨをＩＭＮａＯｌｌで９
．０に調整した。反応を室温で１６時間続けた。
タンパク質溶液を４℃で１０．０００倍過剰容量の１ｍ
ＭＥＤＴＡに対し透析した。次いで混合物を室温でｐｎ
ｓ．ｏの６Ｍ尿素、５　０ｍＭ　Ｍａｃｅ　、　５　０
ｍＭ　トリスに溶解し、２時間撹拌した。未溶解物質を
３２、０００Ｘ　ｇで３０分間の遠心により除去した。
前記ステップから清澄化された上澄をｐｌ（８．０の６
Ｍ尿素、５０ｍＭ）リス、５　０ｍＭ　ＮａＣ１で平衡
化された２６Ｘ４０ｃｎＤＥＡＥセフアロース・ファー
スト・フロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ
ｉｅ）カラム〔ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー
社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂ１０ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．）　）に流速１ｍ／５ｈｉｎで適用
した。カラムをすべての未吸着物質が除去されるまで平
衡緩衝液で洗浄したが、これはそれがカラムを出るとき
平衡緩衝液中０．１以下のＵＶ　　Ａｔａ。スペクトル
測定吸光度で明らかにされる。吸着された融合タンパク
質を５０〜３５０ｓＭ　ＮａＣｆ勾配置０００−でカラ
ムから溶出させ、しかる後ＹＭ−３０膜装ｖａ攪拌セル
・アミコン濃縮器（ｓｔｉｒｒｅｄ　ｃｅｌｌ　Ａｍ１
ｃｏｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）で濃縮した。
濃縮された融合タンパク質（８−）をｐＨ８，０の６Ｍ
尿素、５０ｅｅＭ）リス、５０ｍＭ　Ｍａｃｌで平衡化
された２、６Ｘ１００Ｃ１ｌセフアクリル（Ｓｅｐｈａ
ｃｒｙｌ）Ｓ−３００カラム（ファルマシアＬＫＢバイ
オテクノロジー社）に流速０．２５　ｗｔ　／　１１１
ｉｎで適用した。
カラムを更に平衡緩衝液で溶出させ、３−分画を集めた
。ＴＧＦ−α−ＰＥ、。活性を有する分画をプールした
。
Ｓ−３００カラムからプールされた分画をｐＨ８，０の
６Ｍ尿素、５（１＋Ｍ）リス、５０ｍＭ　ＮａＣ１で平
衡化された１、６Ｘ４０（Ｊセファロース・ファースト
・フローカラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジ
ー社）に流速０．７ｉｄ／鍋ｉｎで適用した。
カラムを平衡緩衝液で洗浄し、しかる後５０〜４５０ｍ
Ｍ　ＮａＣ１勾配６００−で溶出させた。ＴＧＦ−α−
ＰＥ４０活性を有する分画をプールし、しかる後ｐｌ（
９，０の５０＋＊Ｍグリシンに対して透析し、−２０℃
で貯蔵した。
実施例４ ＴＧＦ−α−ＰＥ４０原料タンパク質のＣＮＢｒ　　開
裂及び修正ＰＥａ。（Ｐｆ！ｎａＡＢＳＰＥｎｅＡｔｌ
−ＰＥ４０ａＢ、　ＰＥｎｏａｂ）の まだＳ−スルホン化形の所望の融合タンパク質を水中１
０％（Ｖ／Ｖ）酢酸に対して透析し、しかる後凍結乾燥
する。凍結乾燥されたタンパク質を十分量の脱気０．Ｉ
ＭＩＣｌに溶解してタンパク質濃度１■／−とする。タ
ンパク質／ＨＣｌ溶液はトリプトファン５モル／融合タ
ンパク質モルを含有している。ＣＮＢｒ　　（５００当
量／メチオニン当量）を加え、反応を暗所中室温で１８
時間続ける０次いで所望の修正ＰＥ４０を含む大きな切
断断片を２５％（Ｖ／Ｖ）酢酸中ゲル濾過（例えば、セ
ファデックスＧ−２５）で反応混合物から分離する。修
正ＰＥ、。を含む分画をプールし、凍結乾燥する。
システィンを含む修正タンパク！（即ち、Ｐ　ＥａｏＡ
　Ｂ　、　Ｐ　Ｅｔａ　ａ　Ｂ及びＰＥｎｏＡｂ）の場
合には、精製前に必須ジスルフィド結合を形成させてお
くことが必要である。このため凍結乾燥タンパク質をｐ
Ｈ１０，５の十分量の５０ｍＭグリシンに溶解してＵＶ
　　Ａ！ＩＩ。−〇、１とする。β−メルカプトエタノ
ールを加え、タンパク賞サンプル中に存在するＳ−スル
ホネート基の理論値以上の４＝１モル比とする０反応を
４℃で１６時間続け、しかる後溶液をｐｏｓ、ｏの２０
ａ＋Ｍ）リス、１ｗＭ　　ＥＤＴＡ。
１００ｓ＋Ｍ　ＮａＣＪ！含有緩衝液１０，０００倍過
剰に対して透析する。
所望のＰＥ、・を含む陰イオン交換カラムからの分画を
５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定されるタンパク質含量及びＡＤ
Ｐリボシル化活性に基づきプールする。プールされた分
画を分子量３０，０００カツトオフ膜（ＹＭ−３０、ア
ミコン）で濃縮する。
プールされた分画をｐＨ８，０の２０ｍＭ）リス、５０
ｓＭＮａｃｊ！、１　ｔａＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａで平衡化さ
れた２、６×１００ＣＪＩセファクリルＳ−２００ゲル
濾過カラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社
）に適用し、流速０．７５　ｒｄ　／　ｗｉｎで溶出さ
せる。ゲル濾過クロマトグラフィーからの分画をＡＤＰ
リボシル化及び５ＤＳ−ＰＡＧＥに基づきプールする。
この操作でほとんどの目的にとって十分純粋な物質を得
ることができるが、高度に均一な物質を得るためにはも
う１つのクロマトグラフィーステップが実施される。こ
の最終クロマトグラフィーステップは０．７５　Ｘ　６
００ｍバイオシル（Ｂ１０−Ｓｉｌ）ＴＳＫ−２５０カ
ラム〔バイオランド（旧ｏ−Ｒａｄ）　）を用いる高分
離能ゲル濾過である。ＴＳＫ−２５０カラムクロマトグ
ラフイーの準備として、サンプルをセントリブレブー３
０　　（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０）装置くアミコン
）で濃縮し、タンパク質濃度を５■／−に調整する。サ
ンプルをｐＨ７，ｉの６Ｍ尿ｉ、１００ｍＭリン酸ナト
リウム、１００ｓＭ　ＮａＣｊ！に溶解ｔル、　カラム
ヲｐＨ７，１５７）６Ｍ尿素、１００ｍＭ’Ｊン酸ナト
リウム、１００ｍＭ　ＮａＣ１テ流速０．５ｄ／ｓｉｎ
にて溶出させる。高分離能ゲル濾過ステップからの分画
をＡＤＰリボシル化及びＳ　Ｄ　Ｓ　−ＰＡＧＥに基づ
きプールする。
実施例５ ＥＧＦの　ＰＥとの人　びへの ＥＧＦを修正ＰＥ、。と複合化させるためには、２分子
間の共有結合が形成されるようにＥＧＦ及びＰＥ、。の
双方をヘテロニ官能性試薬で誘導することが必要である
。誘導化の準備として、修正ＰＥ４０のサンプルをｐＨ
７，０の０．１　Ｍ　ＮａＣｊ！、０．１Ｍリン酸ナト
リウムに対して透析する。透析後、修正ＰＥ、。の溶液
を透析緩衝液で４　ｍｇ／ｄ　Ｐ　Ｅ４０に調整し、濃
度１００μＭとする。エタノール中３−（３−ピリジル
ジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ
、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））２０ｍＭ溶液の十分量をタ
ンパク質溶液に加えて、最終濃度３００μＭ　　５ＰＤ
Ｐとする。この濃度は３：１比の５ＰＤＰ対ＰＥ、。を
表ず。誘導反応を室温で３０分間続けるが、時々混合物
を攪拌する。大過剰のグリシン（初期量の５ＰＤＰより
も約５０倍モル過剰）を加えて反応を終結させる。
得られた３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニ／Ｌ’
ｌ’１　体はＦＤＰ−ＰＥ４０と命名される。非タンパ
ク質試薬をｐＨ１７，５（７）　６　Ｍ尿素、０．１　
Ｍ　ＮａＣ１。
０．１Ｍリン酸ナトリウムに対する大規模透析で生成物
から除去する。修正ＰＥ、。に導入されたＦＤＰ基の数
は、カールソンら、バイオケミカル・ジャーナル、第１
７３巻、第７２３−７３７貝、１９７８年（Ｃａｒｌｓ
ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ４０　Ｂ１０ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ。
１７３　：　７２３−７３７．１９７Ｂ）で記載された
ように調べられる。
ＦＤＰ−ＥＧＦ誘導体は、最終濃度１５ｏμＭＥＧＦと
すルノニ十分すＭ　（７）ｐｌ＋　７．　Ｏ（７）　０
．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣＲＯ，Ｉ　Ｍリン酸ナトリウム中に
凍結乾燥ＥＧＦ　（レセプターグレード、コラボレーテ
ィブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ）　）を溶解させて準備される。エタノール
中子分遣の２０ｍＭ　　５ＰＤＰ溶液をＥＧＦ溶液に加
えて最終濃度４５０μＭＳＰＤＰとするが、これは３：
１比の５ＰＤＰ対ＥＧＦを表す。誘導反応を室温で３０
分間続けるが、時々混合物を攪拌する。大過剰のグリシ
ン（初期量の５ＰＤＰよりも約５０倍モル過剰）を加え
て反応を終結させる。非タンパク質試薬をｐＨ７，５の
６Ｍ尿素、０．１Ｍ　Ｍａｃｅ、　０．１Ｍリン酸ナト
リウムに対する大規模透析で生成物から除去する。ＥＧ
Ｆに導入されたＦＤＰ基の数は、カールソンら、バイオ
ケミカル・ジャーナル、第１７３巻、第７２３−７３７
頁、１９７８年で記載されたように調べられる。
上記誘導体を用いる場合には、完全天然ジスルフィド存
在下で３−チオプロピオニル誘導体を得るためＦ　Ｄ　
Ｐ　−Ｐ　Ｅ、。又はＦＤＰ−ＥＧＦのいずれかが酸性
ｐＨ下で還元することができる（カールソンら、前掲）
。しかしながら、好ましい方法は修正ＰＥ、。上におけ
る遊離チオールの生成である。
Ｆ　Ｄ　Ｐ　−Ｐ　Ｅ、。（ｐＨ７，５の６Ｍ尿素、０
．１　ＭＮａＣｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム中Ｆ　Ｄ
　Ｐ　−ＰＨ，。
１００μＭ溶液０．４．ｄ）を４℃でｐｎｓ、ｓの６Ｍ
尿素、２５ｍＭ酢酸ナトリウム含有緩衝液５ｏｏ−に対
して数回透析する。透析後、１００ｍＭジチオスレイト
ール２０μｌ（最終濃度５　ｍＭ）をＰＤＰ〜ＰＥ、。
に加える。還元を室温で１０分間続け、しかる後４℃で
ｐＨ５，５の６Ｍ尿素、２５ｍＭ酢酸すトリウム、ＩＩ
ＩＭＥＤＴＡに対する反応混合物の透析により終結させ
る。この緩衝液に対する透析を繰返し、しかる後サンプ
ルをｐＨ７，５（７）０．１　Ｍ　ＮａＣｊ！、０．１
Ｍリン酸ナトリウムに対して透析する。これらの操作で
得られる物質はチオプロピオニル−ＰＥ４０と命名され
る。
複合化の準備・として、ＦＤＰ−ＥＧＦ　（ｐＨ７，５
＜７）６Ｍ尿素、０．１　Ｍ　ＮａＣ１，０，１Ｍ’Ｊ
　７酸ナトリウム中１５０μＭ？容液０．８　ｒｎｌ　
）を４℃テｐＨ７，５（７）０、１　Ｍ　Ｍａｃｅ、　
０．１　Ｍリン酸ナトリウムに対して数回透析し、サン
プルから尿素を除去する。この透析後、ＦＤＰ−ＥＧＦ
溶液及びチオプロピオニル−ＰＥ４０溶液を合わせ、反
応混合物を室温で１時間インキエベートする０反応の進
行は前記（カールソンら、前掲）のようにピリジン−２
−チオンの放出を測定してモニターすることができる。
反応を４℃でｐＨ７，５の６Ｍ尿素、０．１　Ｍ　Ｎａ
Ｃ１！　。
０．１　Ｍリン酸ナトリウムに対する数回の透析により
終結させる。
複合体を高分離能０．７５Ｘ６０（ＪバイオシルＴＳＫ
−２５０カラム（バイオランド）でのサイズ排除クロマ
トグラフィーにより精製する。カラムをＰＨ７，１の６
Ｍ尿素、０．１　Ｍリン酸ナトリウム、０、１　Ｍ　Ｎ
ａＣＩｔで流速０．５ｍｊ／ｗｉｎにて溶出させる。
高分離能ゲル濾過ステップからの分画をＡＤＰリボシル
化及び５ＤＳ−ＰＡＧＥに基づきプールする。
実施例６ ＴＧＦ−αの修正ＰＥ、。との複合化及び複合体のＴＧ
Ｆ−αの修正ＰＥ４０との複合化及び複合体の単離。Ｔ
ＧＦ−α及び修正ＰＥ、。の複合体は、実施例５で記載
されたＥＧＦ複合体と同様の方法で製造される。
実施例７ ＴＧＦ−α−ＰＥ　　”の ＴＧＦ−α−修正ＰＥ４０複合体の関連生物学的活性は
、アレン・オリフ（Ａｌｉｅｎ　０１ｉｆｆ）、デボラ
・Ｄ・ジョーンズ（Ｄｅｂｏｒａｈ　Ｄ、　Ｊｏｎｅｓ
）及びギネス・エドワーズ（Ｇｗｙｎｎｅｔｈ　Ｈｄｗ
ａｒｄｓ）により１９８９年２月１７日付で出願された
米国特許出願第３１２、５４０号明細書で記載されるハ
イブリッドＴＧＦ−α−ＰＥ、。の各生物学的活性と類
似している。
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【図面の簡単な説明】
第１図はｐＴＡＣ ＧＦ５７ ＰＥ４０に関 する遺伝子地図である。 出 願 人 メルク エンド カムバニー インコーボレーテツド

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ＰＥ＿４＿０ａＢ、ＰＥ＿４＿０Ａｂ又はＰＥ＿４
    ＿０ａｂからなる群より選択されるポリペプチド。 ２、ＰＥ＿４＿０ａＢである、請求項１記載のポリペプ
    チド。 ３、ＰＥ＿４＿０Ａｂである、請求項１記載のポリペプ
    チド。 ４、ＰＥ＿４＿０ａｂである、請求項１記載のポリペプ
    チド。 ５、ａが欠失している、請求項１記載のポリペプチド。 ６、ｂが欠失している、請求項１記載のポリペプチド。 ７、ａ及びｂの双方が欠失している、請求項１記載のポ
    リペプチド。 ８、ａがＣｙｓ以外のアミノ酸である、請求項１記載の
    ポリペプチド。 ９、ａがＡｌａである、請求項８記載のポリペプチド。 １０、ｂがＣｙｓ以外のアミノ酸である、請求項１記載
    のポリペプチド。 １１、ｂがＡｌａである、請求項１０記載のポリペプチ
    ド。
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