JPH0798839B2 - 修正されたｐｅ▲下４▼▲下０▼の産生 - Google Patents

修正されたｐｅ▲下４▼▲下０▼の産生

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JPH0798839B2
JPH0798839B2 JP2069889A JP6988990A JPH0798839B2 JP H0798839 B2 JPH0798839 B2 JP H0798839B2 JP 2069889 A JP2069889 A JP 2069889A JP 6988990 A JP6988990 A JP 6988990A JP H0798839 B2 JPH0798839 B2 JP H0798839B2
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Description

【発明の詳細な説明】 伝統的ながん化学療法は、がん患者において腫瘍細胞を
殺しうる薬物の能力に存在している。残念ながら、これ
らの薬物はしばしば腫瘍細胞だけでなく正常細胞も殺し
てしまう。制がん剤が正常細胞よりも腫瘍細胞を殺す程
度は、腫瘍細胞に関する化合物選択度の指標である。制
がん剤の腫瘍細胞選択性を高める１つの方法は、正常細
胞群を回避しながら薬物を優先的に腫瘍細胞に運搬する
ことである。特定細胞群に対する化学療法剤の選択的運
搬に関するもう１つの用語は“標的化”である。腫瘍細
胞に対する薬物標的化はいくつかの方法で達成すること
ができる。１つの方法は、腫瘍細胞の表面上にみられる
特異的レセプター分子の存在に依存している。“標的化
剤”としても呼ばれる他の分子もこれらの細胞表面レセ
プターを認識して、それに結合することができる。これ
らの“標的化剤”としては、例えば抗体、増殖因子又は
ホルモンがある。特異的細胞表面レセプターを認識して
それと結合する“標的化剤”は、それらのレセプターを
有する細胞を標的にするといわれている。例えば、多く
の腫瘍細胞はそれらの表面上に表皮増殖因子レセプター
と呼ばれるタンパク質を有している。表皮増殖因子（EG
F）及び形質転換増殖因子−α（TGF−α）を含めた数種
の増殖因子は、腫瘍細胞上のEGFレセプターを認識して
それと結合する。したがって、EGF及びTGF−αはこれら
の腫瘍細胞に関する“標的化剤”である。
“標的化剤”自体は腫瘍細胞を殺さない。細胞毒物又は
毒素を含めた他の分子は、腫瘍細胞標的化及び細胞毒素
ドメインの双方を有するハイブリッド分子を作成するた
め“標的化剤”に結合させることができる。これらのハ
イブリッド分子は、腫瘍細胞を標的にしてしかる後それ
らの毒素成分を介しそれらの細胞を殺すそれらの能力の
おかげで腫瘍細胞選択毒物として機能する。これらのハ
イブリッド分子を組立てる上で用いられる最も強力な細
胞毒物の１つは、哺乳動物細胞においてタンパク質合成
を阻害する細菌毒素である。シュードモナス外毒素Ａ
（PE−Ａ）はこれら細胞毒素の１つであって、ハイブリ
ッド“標的化毒素”分子を組立てるために用いられた
（米国特許第4,545,985号明細書）。
PE−Ａは哺乳動物細胞に対して極めて毒性の強い66kD細
胞タンパク質である。PE−Ａ分子は３つの機能性ドメイ
ン:1）感受性細胞との結合に関与するアミノ末端結合ド
メイン;2）シトソールへの毒素運搬に関与する内部存在
“トランスロケーティング（translocating）”ドメイ
ン;3）細胞中毒に関与するカルボキシ末端酵素ドメイン
を含んでいる。PE−Ａを抗がん剤たる“標的化毒素”分
子の組立てに用いられたが、その場合60kD分子は腫瘍特
異性“標的化剤”（モノクローナル抗体又は成長因子）
と組合されている。この方法て得られる“標的化毒素”
分子は、“標的化剤”に関するレセプターを有する細胞
に対して高毒性を有する。
このアプローチにおける問題は、PE−Ａ抗体又は増殖因
子ハイブリッドが正常細胞に関してなおもある程度高い
毒性を有していることである。この毒性は、PE−Ａの結
合ドメイン介して細胞へのハイブリッドタンパク質結合
のせいで大きい。この問題を克服するため、シュードモ
ナス外毒素Ａの酵素及び“トランスロケーティング”ド
メインのみを含んだタンパク質が組換え産生された〔ワ
ンら、セル、第48巻、第129-137頁、1987年（Hwang et
al.,Cell,48:129-137,1987）〕。このタンパク質は、そ
れが40kDの分子量を有するためPE40と命名された。PE40
はPE−Ａの結合ドメインを欠き、哺乳動物細胞と結合で
きない。このためPE40は完全66kDタンパク質よりも著し
く低毒性である。その結果、PE40で得られたハイブリッ
ド“標的化毒素”分子はそれらの細胞毒性に関して更に
一層特異的であった〔チャウダリーら、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
USA、第84巻、第4583-4542頁、1987年（Chaudhary et a
l.,Proceeding of National Academy of Science USA,8
4,4583-4542,1987）〕。
PE40に関して研究したところ、265、287、372及び379位
のシステイン残基〔天然66kD PE−Ａ分子からナンバリ
ング；グレイ（Gray）ら、プロシーディング・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUSA、第81
巻、第2645-2649頁、1984年〕は化学的複合化方法によ
る“標的化毒素”分子の組立てを妨げることが判明し
た。これらの残基が形成するジスルフィド結合の反応性
は、生成物“標的化毒素”の化学的統一性に関してバラ
ツキを生じさせる。
1.米国特許第4,545,985号明細書ではシュードモナス外
毒素Ａが抗体又は表皮増殖因子と複合化できることを開
示している。米国特許第4,545,985号明細書では更にこ
れらの複合体がヒト腫瘍細胞を殺すために使用できるこ
とを開示している。
2.米国特許第4,664,911号明細書では抗体が植物から得
られた毒素たるリシンのＡ鎖又はＢ鎖と複合化できるこ
とを開示している。米国特許第4,664,911号明細書では
更にこれらの複合体がヒト腫瘍細胞を殺すために使用で
きることを開示している。
3.米国特許第4,675,382号明細書ではメラニン細胞刺激
ホルモン（MSH）のようなホルモンがペプチド結合を介
してジフテリア毒素タンパク質の一部に結合できること
を開示している。米国特許第4,675,382号明細書では更
にこれらのタンパク質についてコードする遺伝子が組換
えDNA技術を用いてハイブリッド融合タンパク質の合成
を指示するよう互いに結合できることを開示している。
この融合タンパク質は、MSHレセプターを有する細胞と
結合しうる能力を有している。
4.マーフィー（Murphy）ら、PNAS USA、第83巻、第8258
-8262頁、1986年、ジフテリア毒素関連α−メラニン細
胞刺激ホルモン融合タンパク質の遺伝子組立て、発現及
びメラノーマ選択的細胞毒性。この論文では、組換えDN
A技術で細菌から産生されかつα−メラニン細胞刺激ホ
ルモンに結合された一部のジフテリア毒素タンパク質か
らなるハイブリッド融合タンパク質がヒトメラノーマ細
胞に結合してそれを殺すことについて開示している。
5.ケリー（Kelley）ら、PNAS USA、第85巻、第3980-398
4頁、1988年、インターロイキン２−ジフテリア毒素融
合タンパク質はインビボで細胞性免疫を遮断することが
できる。この論文では、組換えDNA技術で細菌から産生
されかつインターロイキン２に結合された一部のジフテ
リア毒素タンパク質からなるハイブリッド融合タンパク
質がヌードマウスで細胞性免疫を抑制するように機能す
ることを開示している。
6.アリュアード（Allured）ら、PNAS USA第83巻、第132
0−1324頁、1986年、３Åのシュードモナス・アエルギ
ノサ（Pseudomonas aeruginosa）外毒素Ａの構造。この
論文では、シュードモナス外毒素Ａタンパク質の三次元
構造について開示している。
7.ワンら、セル第48巻、第129-136頁、1987年、大腸菌
で発現される遺伝子の欠失分析で確認されたシュードモ
ナス外毒素の機能性ドメイン。この論文では、シュード
モナス外毒素Ａタンパク質が哺乳動物細胞との結合、リ
ソソーム膜を通過する毒素タンパク質のトランスロケー
ティング及び哺乳動物細胞内における延長因子２のADP
リボシル化に関与する３つの異なる機能性ドメインに分
けうることを開示している。この論文では更にこれらの
機能性ドメインがシュードモナス外毒素Ａタンパク質の
異なる領域に対応することを開示している。
8.1988年３月30日付で公開された欧州特許出願261,671
号明細書では、全シュードモナス外毒素Ａタンパク質の
細胞結合機能を欠くが但し全シュードモナス外毒素Ａタ
ンパク質のトランスロケーティング及びADPリボシル化
機能を有するシュードモナス外毒素Ａタンパク質の一部
が産生できることを開示している。全シュードモナス外
毒素Ａタンパク質のトランスロケーティング及びADPリ
ボシル化機能を留めたシュードモナス外毒素Ａタンパク
質の一部はシュードモナス外毒素40又はPE-40と呼ばれ
る。PE-40は、グレイら、PNAS USA、第81巻、第2645-26
49頁、1984年で定義されるように全シュードモナス外毒
素Ａタンパク質のアミノ酸残基252-613からなる。この
特許出願では更にPE-40が形質転換増殖因子−αと結合
して組換えDNA技術により細菌から産生されるハイブリ
ッド融合タンパク質を形成できることを開示している。
9.チャウダリーら、PNAS USA、第84巻、第4538-4542
頁、1987年、形質転換増殖因子α型とシュードモナス外
毒素との組換え融合タンパク質の活性。この論文では、
PE-40及び型質転換増殖因子−αから形成されかつ組換
えDNA技術で細菌から産生されるハイブリッド融合タン
パク質が表皮増殖因子レセプターを有するヒト腫瘍細胞
と結合してそれを殺すことを開示している。
10.ベイロン（Bailon）ら、バイオテクノロジー（Biote
chnology）、第1326-1329頁、1988年11月、インターロ
イキン２−シュードモナス外毒素融合タンパク質の精製
及び部分的特徴。この論文では、PE-40及びインターロ
イキン２から形成されかつ組換えDNA技術で細菌から産
生されるハイブリッド融合タンパク質がインターロイキ
ン２レセプターを有するヒト細胞系と結合してそれ殺す
ことを開示している。
本発明の目的は、“標的化剤”及び修正PE40から形成さ
れる複合体分子において改善された化学的統一性及び所
定の構造を示すPE40の修正体を提供することである。本
発明のもう１つの目的は、“標的化剤”及び修正PE40で
形成された融合タンパク質から修正PE40ドメインを製造
及び回収する方法について提供することである。本発明
のこれらの及び他の目的は、以下の記載から明らかとな
るであろう。
本発明は、PE40においてシステインに起因する化学的バ
ラツキを解消したPE40ドメインの修正体について提供す
る。PE40におけるシステイン残基の例えばアラニンのよ
うな他のアミノ酸への置換又は２以上のシステイン残基
の欠失によって、修正PE40及び標的化剤から形成される
複合体の生物学的及び化学的性質を改善することができ
る。
EGF及びPE40の複合化により得られるハイブリッド分子
は３種の一次アッセイ系で特徴付けられる。これらのア
ッセイとしては、（１）哺乳動物タンパク質合成を阻害
するEGF-PE40の酵素活性を測定する延長因子２のADPリ
ボシル化、（２）EGF-PE40のEGFレセプター結合活性を
測定するA431細胞由来膜ベシクル上のEGFレセプターに
対する放射線標識EGF結合の阻害及び（３）EGF-PE40と
の接触後における腫瘍細胞の生存率を測定するために用
いられる３−〔4,5−ジメチルチアゾール−２−イル〕
−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）から
ホルマザンへの変換で評価されるような細胞生存率があ
る。これらのアッセイは前記のように行われる〔チャン
ら、インフェクション・アンド・イムニティ、第16巻、
第832〜841頁、1977年（Chung et al.,Infection and I
mmunity,16:832-841、1977）；コーエンら、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第257巻、第1
523-1531頁、1982年（Cohen et al.,Journal of Biolog
ical Chemistry,257:1523-1531、1982）；リーメンら、
ペプタイデス、第８巻、第877-885頁、1987年（Riemen
et al.,Peptides,8:877-885、1987）；モスマン、ジャ
ーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ、第65巻、第
55-63頁、1983年（Mossman,Journal of Immunological
Methods,65:55-63、1983）〕。
所定の化学的構造及び優れた生物学的特徴を有するEGF-
PE40タンパク質複合体を得るため、我々は修正PE40の原
料物質として組換え発現TGF−α−PE40分子を用いた。
我々は最初、TGF−α−PE40又はTGF−α−PE40の特異的
修正体のいずれかについてコードする一連の組換えDNA
分子を産生した。元の又は親のTGF−α−PE40遺伝子
は、実施例１で記載されたようにクローニングDNAの異
なるセグメントを用いて細菌TACの発現ブラスミドベク
ター（pTAC TGF57-PE40）で分子クローニングされた。p
TAC TGF57-PE40 DNAクーロンは、TGF−α−PE40 DNAの
特異的修正体を組立てるための出発試薬として用いられ
た。pTAC TGF57-PE40 DNAの特異的修正では、pTAC TGF5
7-PE40 DNAのPE40ドメイン内において２又は４つのシス
テインコドンを他のアミノ酸コドンで置換するために必
要なDNAコード配列中における部位特異的変異を要す
る。一方部位特異的変異では、pTAC TGF57-PE40のPE40
ドメイン内において２又は４つのシステインコドンを欠
失させるように工学処理してもよい。pTAC TGF57-PE40
DNAにおける部位特異的変異は、ウィンターら、ネーチ
ャー、第299巻、第756-758頁、1982年（Winter et al.,
Nature,299:756-758、1982）の方法を用いて行われた。
変異されたpTAC TGF57-PE40 DNAの具体例は実施例２で
示されている。
本TGF−α−PE40のアミノ酸配列は第２表で示されてい
る。親TGF−α−PE40ハイブリッド融合タンパク質のPE
40ドメインにおける４つのシステイン残基は、残基Cys
265、Cys287、Cys372及びCys379として示される。アミ
ノ酸残基は天然66kD PE−Ａ分子に関して規定されたよ
うにナンバリングされる（グレイら、プロシーディング
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスUS
A、第81巻、第2645-2649頁、1984年）。修正PE40分子を
得るために用いられる修正TGF−α−PE40融合タンパク
質では、残基〔Cys265及びCys287〕又は〔Cys372及びCy
s379〕又は〔Cys265、Cys287、Cys372及びCys379〕の置
換又は欠失が生じている。修正融合タンパクから得られ
る修正PE40分子の命名を簡素化するため、我々は265及
び287位のアミノ酸残基を“A"座とし372及び379位の残
基を“B"座として示した。システインが親TGF−α−PE
40融合タンパク質と同様にアミノ酸残基265及び287に存
在する場合、座は大文字（即ち“A"）で表される。シス
テインが他のアミノ酸で置換されるか又は残基265及び2
87から欠失される場合、座は“a"で表される。同様に37
2及び379位のアミノ酸残基がシステインである場合座は
“B"で表され、一方“b"は372又は379位のアミノ酸残基
が他のアミノ酸で置換されるか又は欠失された場合にお
けるこの座を表す。このためPE40ドメインにおける４つ
すべてのシステイン残基がアラニンで置換されるか又は
欠失された場合、修正PE40はPE40abと表示される。同様
に、アミノ酸残基265、287、372及び379位にシステイン
を有する親TGF−α−PE40融合タンパク質から得られた
親PE40はPE40ABと表示することができる。
原料物質（即ち、TGF−α−PE40ABハイブリッドタンパ
ク質並びに修正TGF−α−PE40Ab、aB及びabハイブリッ
ドタンパク質）は、ラインメイヤー（Linemeyer）ら、
バイオテクノロジー、第５巻、第960-965頁、1987年で
記載されたTAC発現ベクター系を用いて大腸菌から産生
される。これらの細菌で産生される原料タンパク質は、
細菌を塩酸グアニジンで溶離ししかる後亜硫酸ナトリウ
ム及びテトラチオン酸ナトリウムを加えて回収かつ精製
される。次いでこの反応混合物は透析され、溶液から沈
澱したタンパク質を溶解させるため尿素が加えられる。
混合物は不溶性物質を除去するため遠心され、組換えハ
イブリッドTGF−α−PE40原料タンパク質はイオン交換
クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーし
かる後再度イオン交換クロマトグラフィーを用いて分離
される。
ハイブリッド原料タンパク質中の単一メチオニン残基は
TGF−α及びPE40ドメイン間に位置することから、CNBr
処理によれば原料タンパク質を開裂させて修正PE40タン
パク質及びTGF−αを生じる。このためTGF−α−PE40の
精製Ｓ−スルホネート誘導体は、分子のTGF部分を除去
するためCNBr処理に付される。所望の修正PE40部分は、
イオン交換クロマトグラフィーしかる後サイズ排除クロ
マトグラフィーにより精製される。次いで精製された修
正PE40は、所望の標的化剤と複合化させるためSPDPのよ
うに適切なヘテロ二官能性試薬で誘導化される。複合化
後、サイズ排除クロマトグラフィーが複合体を非複合物
質から単離するために用いられる。精製された複合体が
単離されたら、それはADPリボシル化アッセイ並びに関
連レセプター結合及び細胞生存アッセイを用いて生物学
的活性に関し試験される。
下記実施例は本発明について示しているが、しかしなが
ら本発明をそれに限定するものではない。分子生物学操
作にとって必要なすべての酵素反応は、他に指示のない
限りマニアティスら、1982年、分子クローニング：実験
マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・プレス
〔Maniatis et al.,（1982）In:Molecular Cloning:A L
aboratory Manual,Cold Spring Harbor Press〕で記載
されたように行われる。
実施例１ TGF−α−PE40DNA含有組換えDNAクローンの組立て TGF−αDNAセグメントをデフェオージョーンズら、モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、第８巻、
第2999-3007頁、1988年（Defeo-Jones et al.,Molecula
r and Cellular Biology,8:2999-3007,1988）で記載さ
れたように３組の合成オリゴヌクレオチドを用いて組立
てた。この合成TGF−α遺伝子をpUC-19に組込んでクロ
ーニングした。組換えヒトTGF−α含有pUC-19クローン
からのDNAをSphI及びEcoRIで切断した。切断によりpUC-
19のすべてとTGF−αの５′部分とを含む2.8kbDNA断片
を得た。2.8kb断片をゲル電気泳動により精製かつ単離
した。EcoRI〜SphIオリゴヌクレオチドカセットを合成
した。この合成カセットは下記配列を有していた： ５′−CGGACCTCCTGGCTGCGCATCTAGG−３′ ３′−GTACGCCTGGAGGACCGACGCGTAGATCCTTAA−５′ 便宜上、このオリゴヌクレオチドカセットを57と命名し
た。カセット57をアニーリングして、環状プラスミド形
成2.8kb断片を含むTGF−αに結合させた。カセットを含
むクローンは放射線標識カセット57DNAとのハイブリッ
ド形成により同定した。ヒトTGF−αの存在はDNA配列決
定により確認した。配列決定では、TGF−α配列の３′
末端に新たに導入されたFspI部位の存在についても確認
した。TGF−α−57/pUC-19と命名されたこのプラスミド
をHindIII及びFspIで切断し、TGF−α遺伝子を含んだ16
8bp断片（TGF−α−57）を得た。別のpUC-19調製物をHi
ndIII及びEcoRIで切断し、2.68kb pUC-19ベクターDNAを
得た。PE40DNAをプラスミドpVC8から単離した（チャウ
ダリーら、PNAS USA、第84巻、第4538-4542頁、1987
年）。pVC8をNdeIで切断した。次いでフラッシュ末端を
標準条件のクレノウ反応でこのDNA上に形成させた（マ
ニアティスら、前掲、第113頁）。次いでフラッシュ末
端化DNAをEcoRIによる第二の切断に付して、PE40を含ん
だ1.3kb EcoRI〜NdeI（フラッシュ末端化）切断を得
た。TGF−α−57HindIII及びFspI断片（168bp）を2.68k
b pUC-19ベクターに結合させた。一夜インキュベート
後、1.3kb EcoRI〜NdeI（フラッシュ末端化）PE40DNA断
片を結合混合物に加えた。この第二の結合を一夜続け
た。次いで結合反応生成物を用いて、JM109細胞を形質
転換させた。pUC-19中にTGF−α−57PE40を含むクロー
ンを放射線標識TGF−α−57PE40DNAとのハイブリッド形
成により同定し、このクローンからDNAを単離した。TGF
−α−57PE40をpUC-19ベクターから除去し、ラインマイ
ヤーら、バイオテクノロジー、第５巻、第960-965頁、1
987年で記載されたTACベクター系に移した。pUC-19中の
TGF−α−57PE40をHind III及びEcoRIで切断し、TGF−
α−57PE40を含んだ1.5kb断片を得た。フラッシュ末端
を標準クレノウ反応条件下でこのDNA断片上に形成させ
た（マニアティスら、前掲）。TACベクターをHind III
及びEcoRIで切断した。フラッシュ末端を標準クレノウ
反応条件下で切断されたTACベクターDNA上に形成させた
（マニアティスら、前掲）。2.7kbらフラッシュ末端化
ベクターをゲル電気泳動で単離した。次いでフラッシュ
末端化TGF−α−57PE40断片をフラッシュ末端化TACベク
ターに結合させた。この結合により得られたプラスミド
を用いてJM109細胞を形質転換させた。TGF−α−57PE40
を含んだ候補クローンは上記のようなハイブリッド形成
により同定し、配列決定した。所望の組立てを含んだク
ローンはpTAC TGF57-PE40と命名した。これらの操作で
得られたプラスミドは第１図で示されている。pTAC TGF
57-PE40 DNAでコードされたTGF−α−PE40融合タンパク
質のアミノ酸コドンに関するヌクレオチド配列は第１表
で示されている。TGF57-PE40遺伝子でコードされたアミ
ノ酸配列は第２表で示されている。
実施例２ DNAクローンを含んだ組換えTGF−α−PE40修正体の組立
て：システインのアラニンによる置換 TGF−α−PE40aB: クローンpTAC TGF57-PE40をSphI及びBamHIで切断し、75
0bp SphI-BamHI断片（TGF−αのＣ末端５アミノ酸及びP
E40のＮ末端243アミノ酸に相当を単離した。M13mp19ベ
クターDNAをSphI及びBamHIで切断し、ベクターDNAを単
離した。750bp SphI-BamHI TGF−α−PE40断片を15℃で
一夜かけてM13ベクターDNAに結合させた。細菌宿主細胞
をこの結合混合物で形質転換し、候補クローンを単離
し、それらのプラスミドDNAを配列決定して、これらの
クローンが適正な組換えDNAを含むことを確認した。一
本鎖DNAを変異誘発用に製造した。
オリゴヌクレオチド（オリゴ♯132）を合成し、部位特
異的変異誘発に用いて、TGF−α−PE40DNA中にPE40のア
ミノ酸272位でHpaI部位を導入した： ５′CTGGAGACGTTAACCCGTC3′ （オリゴ♯132） この部位特異的変異誘発の１つの結果は、PE40の272位
残基におけるフェニルアラニンからロイシンへの変換で
あった。変異誘発はウィンターら、ネーチャー、第299
巻、第756-758頁、1982年で記載されているように実施
した。
新たに形成されたHpaI部位を含む候補クローンを単離
し、配列決定して、変異遺伝子配列の存在を確認した。
次いでこのクローンをSphI-SalIで切断した。TGF−α−
のＣ末端５アミノ酸及びPE40のＮ末端70アミノ酸に相当
しかつ新たに導入されたHpaI部位を含む210bp断片を単
離し、SphI-Sali部位で親pTAC TGF57-PE40プラスミドに
再度組込みサブクローニングした。細菌宿主細胞を形質
転換し、候補クローンを単離し、そのプラスミドDNAを
配列決定して、このクローンが適正な組換えDNAを含む
ことを確認した。便宜上、このクローンはpTAC TGF57-P
E40-132と命名した。pTAC TGF57-PE40-132をSphI及びHp
aIで切断し、3.96kb DNA断片を単離した。TGF−αのＣ
末端５アミノ酸及びPE40のＮ末端32アミノ酸に相当しか
つSphI及びHpaI適合末端を含む合成オリゴヌクレオチド
カセット（オリゴ♯153）を合成し、切断されたpTAC TG
F57-PE40-132に結合させた： このオリゴヌクレオチドカセットは、残基265において
システインを特定するコドンが今度はアラニンを特定す
るようにTGF−α−PE40DNAを変化させた。便宜上、この
プラスミドDNAをpTAC TGF57-PE40-132,153と命名した。
細菌宿主細胞をpTAC TGF57-PE40-132、153DNAで形質転
換した。候補クローンをハイブリッド形成により同定
し、単離し、それらのプラスミドDNAを配列決定して、
それが適正な組換えDNAを含むことを確認した。
pTAC TGF57-PE40-132、153DNAをHpaI及びSalIで切断
し、3.95kbベクターDNAを単離した。PE40のアミノ酸残
基272〜309に相当しかつHpaI及びSalI適合末端を含む合
成オリゴヌクレオチドカセット（オリゴ♯142）を合成
し、3.95kb pTAC TGF/PE40 132,153DNAに結合させた： このオリゴヌクレオチドカセットは残基287においてシ
ステインを特定するコドンを変化させ、このコドンが今
度アラニンを特定するようにさせる。便宜上、この変異
プラスミドDNAをpTAC TGF57-PE40-132,153,142と命名し
た。細菌宿主細胞をこのプラスミドで形質転換し、候補
クローンをハイブリッド形成により同定した。これらの
クローンを単離し、それらのプラスミドDNAを配列決定
して、それが適正な組換えDNAを含むことを確認した。p
TAC TGF57-PE40-132,153,142プラスミドは、座“A"にお
ける双方のシステインがアラニンで置換されたTGF−α
−PE40変異体についてコードしている。したがって前記
命名法に従い、TGF−α−PE40のこの修正体はTGF−α−
PE40aBと命名される。TGF−α−PE40aB遺伝子でコード
されたアミノ酸配列は第３表で示されている。
TGF−α−PE40Ab: クローンpTAC TGF57−PE40をSphI及びBamHIで切断し、7
50bpSphI-BamHI断片（TGF−αのＣ末端５アミノ酸及びP
E40のＮ末端252アミノ酸に相当）を単離した。M13mp19
ベクターDNAをSphI及びBamHIで切断し、ベクターDNAを
単離した。750bpSphI-BamHI TGF−α−PE40断片を15℃
で一夜かけてM13ベクターDNAに結合させた。細菌宿主細
胞をこの結合混合物で形質転換し、候補クローンを単離
し、それらのプラスミドDNAを配列決定して、これらの
クローンが適正な組換えDNAを含むことを確認した。
一本鎖DNAを変異誘発用に製造した。
オリゴヌクレオチド（オリゴ♯133）を合成し、部位特
異的変異誘発に用いて、TGF−α−PE40DNA中にPE40のア
ミノ酸369位でBste II部位を導入した： ５′GACGTGGTGACCCTGAC3′ （オリゴ♯133） この変異誘発の１つの結果は、PE40の369位におけるセ
リン残基のトレオニンへの変換であった。
新たに形成されたBste II部位を含むDNAクローンを同定
し、単離し、配列決定して、適正な組換えDNAの存在を
確認した。次いでこのクローンをApaI及びSalI制限酵素
で切断した。新たに形成されたBste II部位を含む120bp
インサートDNA断片を単離し、ApaI及びSalIで切断され
たpTAC TGF57-PE40に結合させた。細菌宿主細胞を形質
転換し、候補クローンを単離し、配列決定して、適正な
組換えDNAが存在することを確認した。この新たに形成
されたプラスミドDNAはpTAC TGF57-PE40-133と命名し
た。それをBste II及びApaIで切断し、2.65kbベクターD
NA断片を単離した。
Bste II及びApaI制限酵素で切断されたpTAC TGF57-PE40
-133クローンから欠失されたTGF−α−PE40の領域に相
当するBsteII〜ApaIオリゴヌクレオチドカセット（オリ
ゴ♯155）を合成した。このカセットはBste II及びApaI
適合末端に関するヌクレオチド配列についても特定して
いた。
このオリゴヌクレオチドカセットは、PE40の残基372及
び379のシステインに関するコドンをアラニンについて
特定するコドンに換えた。オリゴヌクレオチドカセット
♯155を2.65kbベクターDNA断片に結合させた。細菌宿主
細胞を形質転換し、候補クローンを単離し、配列決定し
て、適正な組換えDNAが存在することを確認した。この
新たに形成されたDNAクローンはpTAC TGF57-PE40-133,1
55と命名した。これは座“B"における双方のシステイン
がアラニンで置換されたTGF−α−PE40変異体について
コードしている。したがって前記命名法に従い、TGF−
α−PE40のこの修正体はTGF−α−PE40Abと命名され
る。TGF−α−PE40Ab遺伝子でコードされたアミノ酸配
列は第４表で示されている。
TGF−α−PE40ab: TGF−α−PE40aBについてコードするpTAC-TGF57-PE40-1
32、153、142プラスミドをSalI及びApaIで切断し、得ら
れた3.8gbベクターDNA断片を単離した。TGF−α−PE40A
bについてコードするpTAC TGF57-PE40-133、155プラス
ミドもSalI及びApaIで切断し、PE40のアミノ酸残基372
及び379においてシステインからアラニンに変えて得ら
れる140bpDNA断片を単離した。これら２つのDNAを互い
に結合させ、細菌宿主細胞を形質転換させるために用い
た。候補クローンは、pTAC TGF57-PE40-133、155からの
放射線標識140bp DNAとのハイブリッド形成により同定
した。候補クローンからのプラスミドDNAを単離し、配
列決定して、適正な組換えDNAの存在を確認した。この
新たに形成されたDNAクローンはpTAC TGF57-PE40-132、
153、142、133、155と命名した。このプラスミドは、座
“A"及び“B"における４つのすべてのシステインがアラ
ニンで置換されたTGF−α−PE40変異体についてコード
している。したがって前記命名法に従い、TGF−α−PE
40のこの修正体はTGF−α−PE40abと命名される。TGF−
α−PE40ab遺伝子でコードされたアミノ酸配列は第５表
で示されている。
実施例３ 組換えTGF−α−PE40原料タンパク質の産生及び単離 形質転換された大腸菌JM-109細胞を１振盪フラスコ内
においてLBブロス500ml中アンピシリン100μg/ml存在下
37℃で培養した。Ａ600スペクトル測定吸光度値が0.6に
達した後、イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ドを最終濃度1mMまで加えた。２時間後、細胞を遠心に
より回収した。
細胞を室温で２時間攪拌することによりpH8.0の8M塩酸
グアニジン、50mMトリス、1mM EDTA中で溶解させた。溶
解混合物を固体試薬の添加により0.4M亜硫酸ナトリウム
及び0.1Mテトラチオン酸ナトリウムに溶解させ、pHを1M
NaOHで9.0に調製した。反応を室温で16時間続けた。
タンパク質溶液を４℃で10,000倍過剰容量の1mMEDTAに
対し透析した。次いで混合物を室温でpH8.0の6M尿素、5
0mM NaCl、50mMトリスに溶解し、２時間攪拌した。未溶
解物質を32,000×ｇで30分間の遠心により除去した。前
記ステップから清澄化された上澄をpH8.0の6M尿素、50m
Mトリス、50mM NaClで平衡化された26×40cmDEAEセファ
ロース・ファースト・フロー（Sepharose Fast-Flow）
カラム〔ファルマシアLKBバイオテクノロジー社（Pharm
acia LKB Biotechnology Inc.）〕に流速1ml/minで適用
した。カラムをすべての未吸着物質が除去されるまで平
衡緩衝液で洗浄したが、これはそれがカラムを出るとき
平衡緩衝液中0.1以下のUV A280スペクトル測定吸光度で
明らかにされる。吸着された融合タンパク質を50〜350m
M NaCl勾配1000mlでカラムから溶出させ、しかる後YM-3
0膜の装備攪拌セル・アミコン濃縮器（stirred cell Am
icon concentrator）で濃縮した。
濃縮された融合タンパク質（8ml）をpH8.0の6M尿素、50
mMトリス、50mM NaClで平衡化された2.6×100cmセファ
クリル（Sephacryl）Ｓ−300カラム油ファルマシアLKB
バイオテクノロジー社）に流速0.25ml/minで適用した。
カラムを更に平衡緩衝液で溶出させ、3ml分画を集め
た。TGF−α−PE40活性を有する分画をプールした。
Ｓ−300カラムからプールされた分画をpH8.0の6M尿素、
50mMトリス、50mM NaClで平衡化された1.6×40cmセファ
ロース・ファースト・フローカラム（ファルマシアLKB
バイオテクノロジー社）に流速0.7ml/minで適用した。
カラムを平衡緩衝液で洗浄し、しかる後50〜450mM NaCl
勾配600mlで溶出させた。TGF−α−PE40活性を有する分
画をプールし、しかる後pH9.0の50mMグリシンに対して
透析し、−20℃で貯蔵した。
実施例４ TGF−α−PE40原料タンパク質のCNBr開裂及び修正PE40
（PE40AB、PE40Ab、PE40aB、PE40ab）の単離 まだＳ−スルホン化形の所望の融合タンパク質を水中10
％（v/v）酢酸に対して透析し、しかる後凍結乾燥す
る。凍結乾燥されたタンパク質を十分量の脱気0.1M HCl
に溶解してタンパク質濃度1mg/mlとする。タンパク質/H
Cl溶液はトリプトファン５モル／融合タンパク質モルを
含有している。CNBr（500当量／メチオニン当量）を加
え、反応を暗所中室温で18時間続ける。次いで所望の修
正PE40を含む大きな切断断片を25％（v/v）酢酸中ゲル
濾過（例えば、セファデックスＧ−25）で反応混合物か
ら分離する。修正PE40を含む分画をプールし、凍結乾燥
する。
システインを含む修正タンパク質（即ち、PE40AB、PE40
aB及びPE40Ab）の場合には、精製前に必須ジスルフィド
結合を形成させておくことが必要である。このため凍結
乾燥タンパク質をpH10.5の十分量の50mMグリシンに溶解
してUV A280＝0.1とする。β−メルカプトエタノールを
加え、タンパク質サンプル中に存在するＳ−スルホネー
ト基の理論値以上の4:1モル比とする。反応を４℃で16
時間続け、しかる後溶液をpH8.0の20mMトリス、1mM EDT
A、100mM NaCl含有緩衝液10,000倍過剰に対して透析す
る。
所望のPE40を含む陰イオン交換カラムからの分画をSDS-
PAGEで測定されるタンパク質含有及びADPリボシル化活
性に基づきプールする。プールされた分画を分子量30,0
00カットオフ膜（YM-30、アミコン）で濃縮する。
プールされた分画をpH8.0の20mMトリス、50mM NaCl、1m
M EDTAで平衡化された2.6×100cmセファクリルＳ−200
ゲル濾過カラム（ファルマシアLKBバイオテクノロジー
社）に適用し、流速0.75ml/minで溶出させる。ゲル濾過
クロマトグラフィーからの分画をADPリボシル化及びSDS
-PAGEに基づきプールする。
この操作でほとんどの目的にとって十分純粋な物質を得
ることができるが、高度に均一な物質を得るためにはも
う１つのクロマトグラフィーステップが実施される。こ
の最終クロマトグラフィーステップは0.75×60cmバイオ
シル（Bio-Sil）TSK-250カラム〔バイオラッド（Bio-Ra
d）〕を用いる高分離能ゲル濾過である。TSK-250カラム
クロマトグラフィーの準備として、サンプルをセントリ
プレプ−30（Centriprep-30）装置（アミコン）で濃縮
し、タンパク質濃度を5mg/mlに調製する。サンプルをpH
7.1の6M尿素、100mMリン酸ナトリウム、100mM NaClに溶
解する。カラムをpH7.1の6M尿素、100mMリン酸ナトリウ
ム、100mM NaClで流速0.5ml/minにて溶出させる。高分
離能ゲル濾過ステップからの分画をADPリボシル化及びS
DS-PAGEに基づきプールする。
実施例５ EGFの修正PE40との複合化及び複合体の単離 EGFを修正PE40と複合化させるためには、２分子間の共
有結果が形成されるようにEGF及びPE40の双方をヘテロ
二官能性試薬で誘導することが必要である。誘導化の準
備として、修正PE40のサンプルをpH7.0の0.1M NaCl、0.
1Mリン酸ナトリウムに対して透析する。透析後、修正PE
40の溶液を透析緩衝液で4mg/mlPE40に調整し、濃度100
μＭとする。エタノール中３−（３−ピリジルジチオ）
プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル〔SPDP、ピアス（Pi
erce）〕20mM溶液の十分量をタンパク質溶液に加えて、
最終濃度300μM SPDPとする。この濃度は3:1比のSPDP対
PE40を表す。誘導反応を室温で30分間続けるが、時々混
合物を攪拌する。大過剰のグリシン（初期量のSPDPより
も約50倍モル過剰）を加えて反応を終結させる。得られ
た３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル誘導体はPD
P-PE40と命名される。非タンパク質試薬をpH7.5の6M尿
素、0.1M NaCl、0.1Mリン酸ナトリウムに対する大規模
透析で生成物から除去する。修正PE40に導入されたPDP
基の数は、カールソンら、バイオケミカル・ジャーナ
ル、第173巻、第723-737頁、1978年（Carlsson et al.,
Biochemical Journal,173:723-737、1978）で記載され
たように調べられる。
PDP-EGF誘導体は、最終濃度150μM EGFとするのに十分
な量のpH7.0の0.1M NaCl、0.1Mリン酸ナトリウム中に凍
結乾燥EGF〔レセプターグレード、コラボレーティブ・
リサーチ（Collaborative Research）〕を溶解させて準
備される。エタノール中十分量の20mM SPDP溶液をEGF溶
液に加えて最終濃度450μM SPDPとするが、これは3:1比
のSPDP対EGFを表す。誘導反応を室温で30分間続ける
が、時々混合物を攪拌する。大過剰のグリシン（初期量
のSPDPよりも約50倍モル過剰）を加えて反応を終結させ
る。非タンパク質試薬をpH7.5の6M尿素、0.1M NaCl、0.
1Mリン酸ナトリウムに対する大規模透析で生成物から除
去する。EGFに導入されたPDP基の数はカールソンら、バ
イオケミカル・ジャーナル、第173巻、第723-737頁、19
78年で記載されたように調べられる。
上記誘導体を用いる場合には、完全天然ジスルフィド存
在下で３−チオプロピオニル誘導体を得るためPDP-PE40
又はPDP-EGFのいずれかが酸性pH下で還元することがで
きる（カールソンら、前掲）。しかしながら、好ましい
方法は修正PE40上における遊離チオールの生成である。
PDP-PE40（pH7.5の6M尿素、0.1M NaCl、0.1Mリン酸ナト
リウム中PDP-PE40100mM溶液0.4ml）を４℃でpH5.5の6M
尿素、25mM酢酸ナトリウム含有緩衝液500mlに対して数
回透析する。透析後、100mMジチオスレイトール20μｌ
（最終濃度5mM）をPDP-PE40に加える。還元を室温で10
分間続け、しかる後４℃でpH5.5の6M尿素、25mM酢酸ナ
トリウム、1mMEDTAに対する反応混合物の透析により終
結させる。この緩衝液に対する透析を繰返し、しかる後
サンプルをpH7.5の0.1M NaCl、0.1Mリン酸ナトリウムに
対して透析する。これらの操作で得られる物質はチオプ
ロピオニル−PE40と命名される。
複合化の準備として、PDP-EGF（pH7.5の6M尿素、0.1M N
aCl、0.1Mリン酸ナトリウム中150μＭ溶液0.8ml）を４
℃でpH7.5の0.1M NaCl、0.1Mリン酸ナトリウムに対して
数回透析し、サンプルから尿素を除去する。この透析
後、PDP-EGF溶液及びチオプロピオニル−PE40溶液を合
わせ、反応混合物を室温で１時間インキュベートする。
反応の進行は前記（カールソンら、前掲）のようにピリ
ジン−２−チオンの放出を測定してモニターすることが
できる。
反応を４℃でpH7.5の6M尿素、0.1M NaCl、0.1Mリン酸ナ
トリウムに対する数回の透析により終結させる。
複合体を高分離能0.75×60cmバイオシルTSK-250カラム
（バイオラッド）でのサイズ排除クロマトグラフィーに
より精製する。カラムをpH7.1の6M尿素、0.1Mリン酸ナ
トリウム、0.1M NaClで流速0.5ml/minにて溶出させる。
高分離能ゲル濾過ステップからの分画をADPリボシル化
及びSDS-PAGEに基づきプールする。
実施例６ TGF−αの修正PE40との複合化及び複合体の単離 TGF−αの修正PE40との複合化及び複合体の単離。TGF−
α及び修正PE40の複合体は、実施例５で記載されたEGF
複合体と同様の方法で製造される。
実施例７ TGF−α−修正PE40複合体の生物学的活性TGF−α−修正
PE40複合体の関連生物学的活性は、アレン・オリフ（Al
len Oliff）、デボラ・Ｄ・ジョーンズ（Deborah D.Jon
es）及びギネス・エドワード（Gwynneth Edwards）によ
り1989年２月17日付で出願された米国特許出願第312,54
0号明細書で記載されるハイブリッドTGF−α−PE40の各
生物学的活性と類似している。
【図面の簡単な説明】 第１図はpTAC TGF57-PE40に関する遺伝子地図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ステイーヴン エム．ステイールデイヴア ント アメリカ合衆国，18976 ペンシルヴアニ ア，ウオリンオン，オールド，ニユー ロ ード 57 (56)参考文献 特開 昭61−28394（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1984〔81〕Ｐ．2645−2649

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】PE40aB,PE40Ab,又はPE40abからなる群より
    選択されるポリペプチド、ただしPE40aBは265位及び287
    位のシステインが両方とも他のアミノ酸で置換されてい
    るか欠失していて、372位及び379位のシステインは存在
    するPE40の変異体であり、PE40Abは372位及び379位のシ
    ステインが両方とも他のアミノ酸で置換されているか欠
    失していて、265位及び287位のシスイテンは存在するPE
    40の変異体であり、PE40abは265位及び287位、372位及
    び379位のシステインすべてが他のアミノ酸で置換され
    ているか欠失しているPE40の変異体である。
  2. 【請求項２】PE40aBである、請求項１記載のポリペプチ
    ド。
  3. 【請求項３】PE40Abである、請求項１記載のポリペプチ
    ド。
  4. 【請求項４】PE40abである、請求項１記載のポリペプチ
    ド。
  5. 【請求項５】ａが該当部位におけるシステインの欠失を
    意味する、請求項１記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】ｂが該当部位におけるシステインの欠失を
    意味する。請求項１記載のポリペプチド。
  7. 【請求項７】ａおよびｂの双方が該当部位におけるシス
    テインの欠失を意味する、請求項１記載のポリペプチ
    ド。
  8. 【請求項８】ａが該当部位におけるCys以外のアミノ酸
    によるシステインの置換を意味する、請求項１記載のポ
    リペプチド。
  9. 【請求項９】ａが該当部位におけるalaによるシステイ
    ンの置換を意味する、請求項８記載のポリペプチド。
  10. 【請求項１０】ｂが該当部位におけるCys以外のアミノ
    酸によるシステインの置換を意味する、請求項１記載の
    ポリペプチド。
  11. 【請求項１１】ｂが該当部位におけるalaによるシステ
    インの置換を意味する、請求項10記載のポリペプチド。
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PT93525A (pt) 1990-11-07
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