JP2635035B2 - Ｃｙｓコドン修飾ＤＮＡ - Google Patents
Ｃｙｓコドン修飾ＤＮＡInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 本発明は一部政府基金で行われ、政府は本発明に関し
て、一定の権利を有する。
て、一定の権利を有する。
本発明は、毒素分子の類似体を産生するための組み換
えDNA技術の利用、および、同分子の医学的疾患の治療
への使用に関するものである。
えDNA技術の利用、および、同分子の医学的疾患の治療
への使用に関するものである。
本明細書は、特異的結合性リガンド部位および毒素部
位（例えば、リシンあるいはジフテリア毒）を含むハイ
ブリッド分子の多くの実例を含む；リガンドは毒素が標
的とすべき不要な細胞に結合し、リガンドが結合しない
健康な細胞には影響を及ぼさない。
位（例えば、リシンあるいはジフテリア毒）を含むハイ
ブリッド分子の多くの実例を含む；リガンドは毒素が標
的とすべき不要な細胞に結合し、リガンドが結合しない
健康な細胞には影響を及ぼさない。
例えば、バッチャ（Bacha）らは、米国特許第4,468,3
82号（これによって、参考として含める）に於いて、神
経ペプチドホルモン（例えば、甲状腺刺激ホルモン放出
ホルモン）と酵素学的に活性を持つジフテリア毒断片か
ら、硫黄含有基を用いて修飾した後修飾した分子を反応
させてジスルフィド結合によって結合されて作製したハ
イブリッド分子を示している。この手法の欠点は、双方
の分子の修飾部位が正確に調節できないため、最終産物
が不均質であり、修飾や結合によってハイブリッド分子
の毒性あるいは結合能が弱まっている分子も含むことで
ある。
82号（これによって、参考として含める）に於いて、神
経ペプチドホルモン（例えば、甲状腺刺激ホルモン放出
ホルモン）と酵素学的に活性を持つジフテリア毒断片か
ら、硫黄含有基を用いて修飾した後修飾した分子を反応
させてジスルフィド結合によって結合されて作製したハ
イブリッド分子を示している。この手法の欠点は、双方
の分子の修飾部位が正確に調節できないため、最終産物
が不均質であり、修飾や結合によってハイブリッド分子
の毒性あるいは結合能が弱まっている分子も含むことで
ある。
この不均質性の問題を扱う方法は、マーフィーPCT国
際公告番号WO/83/03971（これによって参考として含め
る）に述べられている。マーフィー出願は、ハイブリッ
ドタンパク質の毒素部分と特異的結合部分の各々をコー
ドする遺伝子によってコードされるハイブリッドタンパ
ク質を示している。本方法は当然DNAにコードされるペ
プチドリガンドにのみ適用し得る。
際公告番号WO/83/03971（これによって参考として含め
る）に述べられている。マーフィー出願は、ハイブリッ
ドタンパク質の毒素部分と特異的結合部分の各々をコー
ドする遺伝子によってコードされるハイブリッドタンパ
ク質を示している。本方法は当然DNAにコードされるペ
プチドリガンドにのみ適用し得る。
本発明は、全ての毒素分子に対してあらかじめ決定さ
れた同一の部位で、リガンドがペプチドであるかどうか
に関わらず、あらゆる特異的結合リガンドに連結し得る
毒素分子を与えるものである。
れた同一の部位で、リガンドがペプチドであるかどうか
に関わらず、あらゆる特異的結合リガンドに連結し得る
毒素分子を与えるものである。
本発明は、一つの側面としては、細胞毒素活性を示す
程度には大きく、一般的な真核細胞に対する結合を示さ
ない程度に小さい毒素分子断片をコードするDNA塩基配
列を一般的な特徴とする；該DNA配列は、望ましくはシ
ステインコドンによってコードされるシステイン残基に
よって細胞特異的リガンドに結合する際に細胞毒性酵素
活性を示すDNA塩基配列によってコードされるような断
片に位置する、天然には存在しないシステインコドンを
含む。
程度には大きく、一般的な真核細胞に対する結合を示さ
ない程度に小さい毒素分子断片をコードするDNA塩基配
列を一般的な特徴とする；該DNA配列は、望ましくはシ
ステインコドンによってコードされるシステイン残基に
よって細胞特異的リガンドに結合する際に細胞毒性酵素
活性を示すDNA塩基配列によってコードされるような断
片に位置する、天然には存在しないシステインコドンを
含む。
望ましい態様においては、毒素はジフテリア毒，リシ
ン，あるいはアブリンである；システインコドンは毒素
をコードするDNA塩基配列のＣ未満をコードする末端、
あるいは、その100塩基対以内に導入される；リガンド
はペプチドホルモン，タンパク質性増殖因子（インター
ロイキンI,インターロイキンII,インターロイキンIII,
あるいはＢ細胞増殖因子が望ましい），抗体，あるいは
ステロイドホルモン（例えば、エストラジオール）であ
る。
ン，あるいはアブリンである；システインコドンは毒素
をコードするDNA塩基配列のＣ未満をコードする末端、
あるいは、その100塩基対以内に導入される；リガンド
はペプチドホルモン，タンパク質性増殖因子（インター
ロイキンI,インターロイキンII,インターロイキンIII,
あるいはＢ細胞増殖因子が望ましい），抗体，あるいは
ステロイドホルモン（例えば、エストラジオール）であ
る。
別の側面として、本発明は、いかなる反応性硫黄基含
有毒素分子にもあらかじめ決定された一定の形式で結合
し得る、特異的結合性ペプチドおよびそれをコードする
DNA塩基配列を特徴とする。本発明の本側面のDNA塩基配
列は、特異的細胞結合性を示すのに十分大きいリガンド
断片（望ましくは上記に列挙したものの一つ）をコード
する；該遺伝子は、望ましくは、システインコドンによ
ってコードされるシステイン残基を介して毒素に連結す
る際に特異的細胞結合性を示すDNA塩基配列によってコ
ードされるような断片に位置する、天然には存在しない
システインコドンを含む。
有毒素分子にもあらかじめ決定された一定の形式で結合
し得る、特異的結合性ペプチドおよびそれをコードする
DNA塩基配列を特徴とする。本発明の本側面のDNA塩基配
列は、特異的細胞結合性を示すのに十分大きいリガンド
断片（望ましくは上記に列挙したものの一つ）をコード
する；該遺伝子は、望ましくは、システインコドンによ
ってコードされるシステイン残基を介して毒素に連結す
る際に特異的細胞結合性を示すDNA塩基配列によってコ
ードされるような断片に位置する、天然には存在しない
システインコドンを含む。
本発明は、また、上記ハイブリッド分子の作製法と同
様に、本発明のCys−修飾毒素およびリガンドを用いて
作製されるハイブリッド分子も特徴とする。
様に、本発明のCys−修飾毒素およびリガンドを用いて
作製されるハイブリッド分子も特徴とする。
本発明の他の特徴および利点は、以下の望ましい態様
および請求の範囲から明らかになるであろう。
および請求の範囲から明らかになるであろう。
まず、図面の簡単な説明を示す。
図面 第１図は、プラスミドpABC1508内の、本発明における
DNA断片の部分的制限酵素地図である。
DNA断片の部分的制限酵素地図である。
第２図は、ジフテリア毒素分子の模式図である。
第３図は、コリネファージベータtoxの3.9kb Bam HI
−Ｉ制限断片上の、ジフテリアtox遺伝子の位置および
向きを示す制限酵素地図である。
−Ｉ制限断片上の、ジフテリアtox遺伝子の位置および
向きを示す制限酵素地図である。
第４図および第５図は、pABC1508の構成に関する過程
の模式図である。
の模式図である。
第６図は、α−MSHをコードするDNAを含むプラスミド
pMSH53の模式図である。
pMSH53の模式図である。
第7A図および第7B図は、tox 228対立遺伝子およびその
隣接した領域のヌクレオチド配列と、その上段に示した
アミノ酸配列である；tox 228対立遺伝子は幾つかの突然
変異を除いては、野生型tox対立遺伝子と同じである
が、tox 228対立遺伝子にはNru I部位が存在することは
重要である（第7A図および第7B図はカクツオレク（Kacz
orek）ら、（1983）Science 221,855の第１図から転用
したものである）。
隣接した領域のヌクレオチド配列と、その上段に示した
アミノ酸配列である；tox 228対立遺伝子は幾つかの突然
変異を除いては、野生型tox対立遺伝子と同じである
が、tox 228対立遺伝子にはNru I部位が存在することは
重要である（第7A図および第7B図はカクツオレク（Kacz
orek）ら、（1983）Science 221,855の第１図から転用
したものである）。
tox遺伝子 tox遺伝子およびそれがコードするジフテリア毒素成
分について簡単に述べる。
分について簡単に述べる。
第２図および第３図は、各々、コリネファージベータ
toxの3.9kb BamH I制限フラグメント上に位置するジフ
テリア毒素分子およびジフテリアtox遺伝子を示してい
る。第7A図および第7B図は、tox 228対立遺伝子の塩基配
列を与える。
toxの3.9kb BamH I制限フラグメント上に位置するジフ
テリア毒素分子およびジフテリアtox遺伝子を示してい
る。第7A図および第7B図は、tox 228対立遺伝子の塩基配
列を与える。
第２図に示されるように、ジフテリア毒素遺伝子は数
個の“領域”から成っており、分子のアミノ末端から始
めて、次のように特徴づけられる；疎水性シグナル配
列；酵素的に活性を有するフラグメントA,切断領域を含
む露出したプロテアーゼ感受性ジスルフィドループ（DS
L）l1;例えば、親水性両親媒性領域および疎水性領域の
ような脂質関連領域を含む、フラグメントB;DSLl2;およ
び、カルボキシ末端ａ。DSL・l1は３個のアルギニン残
基を含む；フラグメントＡとフラグメントＢとの間のSa
u 3A1部位（第３図参照）は、ジフテリア毒素遺伝子上
の３つのアルギニン残基のうち最も下流のものに対応す
る位置に存在する。
個の“領域”から成っており、分子のアミノ末端から始
めて、次のように特徴づけられる；疎水性シグナル配
列；酵素的に活性を有するフラグメントA,切断領域を含
む露出したプロテアーゼ感受性ジスルフィドループ（DS
L）l1;例えば、親水性両親媒性領域および疎水性領域の
ような脂質関連領域を含む、フラグメントB;DSLl2;およ
び、カルボキシ末端ａ。DSL・l1は３個のアルギニン残
基を含む；フラグメントＡとフラグメントＢとの間のSa
u 3A1部位（第３図参照）は、ジフテリア毒素遺伝子上
の３つのアルギニン残基のうち最も下流のものに対応す
る位置に存在する。
ジフテリア毒素が、感受性の真核細胞を中毒にする過
程には、少なくとも以下の過程を含む：（ｉ）ジフテリ
ア毒素が感受性細胞表面上の特異的受容体に結合する；
（ii）受容体に結合しつつ、エンドサイト−シス小胞に
内在化する；（iii）内在化より前に、あるいは、エン
ドサイト−シス小胞内で、毒素分子がＮ末端から47,000
ダルトンの領域で切断される（あるいはプロセッシング
される）；（iv）エンドサイト−シス小胞のpHが5.5以
下になると、プロセッシングをうけた型の毒素が、受容
体に結合したまま、自発的にエンドソーム膜に挿入され
る；（ｖ）膜内に埋め込まれると、脂質関連領域が孔を
形成する；（vi）フラグメントＡとフラグメントＢの間
の、l1でタンパク質分解的切断が起きる；（vii）その
後、フラグメントＡ、あるいは、フラグメントＡを含む
ポリペプチドが細胞質に排出される；（viii）フラグメ
ントＡの触媒活性、すなわち、伸長因子２のニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド依存性アデノシン二リン酸
リボシル化が、中毒細胞の死をひきおこす。細胞質に導
入されたフラグメントＡの単一の分子が細胞を殺すため
に十分であることは明らかである。
程には、少なくとも以下の過程を含む：（ｉ）ジフテリ
ア毒素が感受性細胞表面上の特異的受容体に結合する；
（ii）受容体に結合しつつ、エンドサイト−シス小胞に
内在化する；（iii）内在化より前に、あるいは、エン
ドサイト−シス小胞内で、毒素分子がＮ末端から47,000
ダルトンの領域で切断される（あるいはプロセッシング
される）；（iv）エンドサイト−シス小胞のpHが5.5以
下になると、プロセッシングをうけた型の毒素が、受容
体に結合したまま、自発的にエンドソーム膜に挿入され
る；（ｖ）膜内に埋め込まれると、脂質関連領域が孔を
形成する；（vi）フラグメントＡとフラグメントＢの間
の、l1でタンパク質分解的切断が起きる；（vii）その
後、フラグメントＡ、あるいは、フラグメントＡを含む
ポリペプチドが細胞質に排出される；（viii）フラグメ
ントＡの触媒活性、すなわち、伸長因子２のニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド依存性アデノシン二リン酸
リボシル化が、中毒細胞の死をひきおこす。細胞質に導
入されたフラグメントＡの単一の分子が細胞を殺すため
に十分であることは明らかである。
修飾tox遺伝子 第１図に、本発明のペプチドをコードする、プラスミ
ドpABC1508の領域が示されている。
ドpABC1508の領域が示されている。
第１図に示されるDNA領域は、ラムダPRプロモーター
（天然にtox遺伝子と関連しているプロモーターと置換
されている）;ATG開始部位；酵素活性を有する、ジフテ
リア毒のフラグメントＡをコードするDNA塩基配列；ジ
フテリア毒のフラグメントＢをコードするDNA領域部
分；および、Cysコドンを含むリンカーを含む。
（天然にtox遺伝子と関連しているプロモーターと置換
されている）;ATG開始部位；酵素活性を有する、ジフテ
リア毒のフラグメントＡをコードするDNA塩基配列；ジ
フテリア毒のフラグメントＢをコードするDNA領域部
分；および、Cysコドンを含むリンカーを含む。
第１図から第３図について述べると、本発明のDNA塩
基配列を作製するのに用いたジフテリアtox遺伝子部分
は、酵素活性を有するフラグメントＡ（および望ましく
はフラグメントＡに先立つ疎水性リーダー配列）をコー
ドする領域、および少なくともMsp I部位までで終了す
るフラグメントＢコード領域を含有する。第３図に示す
ように、フラグメントＡコード領域（リーダー配列を含
む）は、便利なSau 3AI部位の直下流から始まる。Msp I
部位は、バッチャら（前出）に示されたような、交差反
応物質45（cross reacting material 45;CRM 45）をコ
ードするtox遺伝子領域の末端に、ほぼ位置している。
ジフテリア毒分子のこの部分はフラグメントＢの脂質関
連領域を含むが、l2は含まず、第２図ではｙとｚとの間
のフラグメントＢ部分として示されている。用いられた
フラグメントＢコード領域は、Msp Iを超えた部位か
ら、Sph I部位までの何処でも終了させることが可能で
ある。Sph I部位を用いた場合は、l2は含まれ、フラグ
メントＢ部分は第３図におけるｙとｘとの間の部分とな
る。前述のように、Msp IとSph Iとの間のいかなる領域
端も使用可能である；その一例は、Nru I部位での領域
端であり、該領域端はMsp Iでの領域端と同様に、l2を
含まないフラグメントをコードする。Msp Iを末端とす
るものよりも短い領域は、横断する脂質関連領域を含ま
ず、従って毒性に必要な孔形成を起こさないため、使用
するべきではない。Sph Iより下流の領域端によってコ
ードされるフラグメントＢ部分は、ジフテリア毒受容体
結合領域を含むことを避けるために、使用するべきでは
ない。（Nru I部位は野性型tox対立遺伝子には見いださ
れないが、カクツオレク（Kaczorek）ら、（1983）Scie
nce 221,855に示された変異体tox 228対立遺伝子にのみ
存在する。） 図示されたDNA構造（第１図）では、Cys（システイ
ン）コドンはtoxをコードするDNA塩基配列のＣ末端に位
置する。この位置により、Cys（システイン）コドンを
含むリンカーがフラグメントＡの酵素活性に影響を与え
ないことが確実となる。フラグメントＡコード領域の下
流の、分子内の他の位置も使用可能である。すなわち、
Cys含有リンカーは、フラグメントＢコード領域の何処
へでも挿入可能である。
基配列を作製するのに用いたジフテリアtox遺伝子部分
は、酵素活性を有するフラグメントＡ（および望ましく
はフラグメントＡに先立つ疎水性リーダー配列）をコー
ドする領域、および少なくともMsp I部位までで終了す
るフラグメントＢコード領域を含有する。第３図に示す
ように、フラグメントＡコード領域（リーダー配列を含
む）は、便利なSau 3AI部位の直下流から始まる。Msp I
部位は、バッチャら（前出）に示されたような、交差反
応物質45（cross reacting material 45;CRM 45）をコ
ードするtox遺伝子領域の末端に、ほぼ位置している。
ジフテリア毒分子のこの部分はフラグメントＢの脂質関
連領域を含むが、l2は含まず、第２図ではｙとｚとの間
のフラグメントＢ部分として示されている。用いられた
フラグメントＢコード領域は、Msp Iを超えた部位か
ら、Sph I部位までの何処でも終了させることが可能で
ある。Sph I部位を用いた場合は、l2は含まれ、フラグ
メントＢ部分は第３図におけるｙとｘとの間の部分とな
る。前述のように、Msp IとSph Iとの間のいかなる領域
端も使用可能である；その一例は、Nru I部位での領域
端であり、該領域端はMsp Iでの領域端と同様に、l2を
含まないフラグメントをコードする。Msp Iを末端とす
るものよりも短い領域は、横断する脂質関連領域を含ま
ず、従って毒性に必要な孔形成を起こさないため、使用
するべきではない。Sph Iより下流の領域端によってコ
ードされるフラグメントＢ部分は、ジフテリア毒受容体
結合領域を含むことを避けるために、使用するべきでは
ない。（Nru I部位は野性型tox対立遺伝子には見いださ
れないが、カクツオレク（Kaczorek）ら、（1983）Scie
nce 221,855に示された変異体tox 228対立遺伝子にのみ
存在する。） 図示されたDNA構造（第１図）では、Cys（システイ
ン）コドンはtoxをコードするDNA塩基配列のＣ末端に位
置する。この位置により、Cys（システイン）コドンを
含むリンカーがフラグメントＡの酵素活性に影響を与え
ないことが確実となる。フラグメントＡコード領域の下
流の、分子内の他の位置も使用可能である。すなわち、
Cys含有リンカーは、フラグメントＢコード領域の何処
へでも挿入可能である。
ジフテリア毒以外に、DNAがコードするペプチド鎖で
ある他の毒素も使用可能である；例としては、シリン，
植物毒アブリンなど。
ある他の毒素も使用可能である；例としては、シリン，
植物毒アブリンなど。
リガンド 本発明で使用される特異的結合性リガンドは、リガン
ドの結合領域全体あるいは結合領域の効果的部分を含
む、リガンド全体あるいはリガンドの一部から構成され
得る。リガンド分子の結合領域の全体あるいは大部分を
含むことが最も好ましい。13アミノ酸の小さなペプチド
であるアルファ−MSH、あるいは、17アミノ酸からなる
ベーターMSHの場合には、受容体特異的結合領域を含
む、該分子のＣ末端の９アミノ酸からなる該分子の一部
が使用可能であり、あるいは、より望ましくは、該分子
全体を使用することが可能である。最低限細胞結合に関
与していないリガンドの一部が含まれていることが最も
望ましく、その場合、修飾により結合が阻害される可能
性を最小にし、上記非結合部分において修飾を行うこと
ができる。例えば、アルファ−MSHの修飾の場合は、分
子のＣ末端は特異的結合性領域を含むため、Ｎ末端ある
いはその近傍で修飾を行うことが望ましい。
ドの結合領域全体あるいは結合領域の効果的部分を含
む、リガンド全体あるいはリガンドの一部から構成され
得る。リガンド分子の結合領域の全体あるいは大部分を
含むことが最も好ましい。13アミノ酸の小さなペプチド
であるアルファ−MSH、あるいは、17アミノ酸からなる
ベーターMSHの場合には、受容体特異的結合領域を含
む、該分子のＣ末端の９アミノ酸からなる該分子の一部
が使用可能であり、あるいは、より望ましくは、該分子
全体を使用することが可能である。最低限細胞結合に関
与していないリガンドの一部が含まれていることが最も
望ましく、その場合、修飾により結合が阻害される可能
性を最小にし、上記非結合部分において修飾を行うこと
ができる。例えば、アルファ−MSHの修飾の場合は、分
子のＣ末端は特異的結合性領域を含むため、Ｎ末端ある
いはその近傍で修飾を行うことが望ましい。
結合領域が位置する、細胞特異的リガンド内の領域
は、現在多くの上記リガンドについて知られている。さ
らに、固相ポリペプチド合成における最近の進歩によ
り、多数のリガンド断片を合成し、殺されるべき細胞に
対する結合能を調べることによって、本技術に熟達した
者が実質的にあらゆるペプチドリガンドの結合領域を決
定することが可能である。
は、現在多くの上記リガンドについて知られている。さ
らに、固相ポリペプチド合成における最近の進歩によ
り、多数のリガンド断片を合成し、殺されるべき細胞に
対する結合能を調べることによって、本技術に熟達した
者が実質的にあらゆるペプチドリガンドの結合領域を決
定することが可能である。
本発明のハイブリッド分子が結合し、殺す細胞の特異
的種類は、ハイブリッド分子の結合領域が与える特異的
リガンドによって決定される。殺されるべき特定の細胞
の種類に特異的な結合領域を有する細胞特異的リガンド
は全て使用可能である。例えば、アルファ−MSHあるい
はベーターMSHを用いて作製したハイブリッドタンパク
質はメラノサイト（melanocyte）と選択的に結合でき、
最初黒色腫および転移黒色腫部分の治療においてハイブ
リッド分子が有用となる。使用可能な他の特異的結合性
リガンドは、タンパク質性増殖因子インターロイキンI,
インターロイキンII,インターロイキンIII,およびＢ細
胞増殖因子を含む。インターロイキンIIは、活性化Ｔ細
胞の関与するアレルギー反応および全身性紅斑性狼瘡
（Systemic Lupus Erythmatosis;SLE）などの自己免疫
病における機能のために、特に重要である。Ｂ細胞増殖
因子を用いて作製したハイブリッド分子は、Ｂ細胞増殖
因子受容体を持ち、過敏病反応および臓器拒絶反応に関
与している、増殖しつつあるＢ細胞を殺す、免疫抑制剤
として使用することができる。
的種類は、ハイブリッド分子の結合領域が与える特異的
リガンドによって決定される。殺されるべき特定の細胞
の種類に特異的な結合領域を有する細胞特異的リガンド
は全て使用可能である。例えば、アルファ−MSHあるい
はベーターMSHを用いて作製したハイブリッドタンパク
質はメラノサイト（melanocyte）と選択的に結合でき、
最初黒色腫および転移黒色腫部分の治療においてハイブ
リッド分子が有用となる。使用可能な他の特異的結合性
リガンドは、タンパク質性増殖因子インターロイキンI,
インターロイキンII,インターロイキンIII,およびＢ細
胞増殖因子を含む。インターロイキンIIは、活性化Ｔ細
胞の関与するアレルギー反応および全身性紅斑性狼瘡
（Systemic Lupus Erythmatosis;SLE）などの自己免疫
病における機能のために、特に重要である。Ｂ細胞増殖
因子を用いて作製したハイブリッド分子は、Ｂ細胞増殖
因子受容体を持ち、過敏病反応および臓器拒絶反応に関
与している、増殖しつつあるＢ細胞を殺す、免疫抑制剤
として使用することができる。
特異的結合性タンパク質の他の主要な種類は、抗体で
ある。最も有用な抗体は、腫瘍に対するものである；こ
のような抗体（一般的にはモノクローナル）は、共有結
合した細胞毒素と共に用いられる標的試薬（targeting
agent）として既によく知られている。本発明において
は、抗腫瘍抗体（望ましくは、抗体全体ではなく、Fab
部分のみ）は、腫瘍細胞の表面決定基を認識し、受容体
を媒介とするエンドサイトシスによって同細胞内に取り
込まれるものである；キャッピングが行われた後に表出
する抗体は、さほど効果的ではない。
ある。最も有用な抗体は、腫瘍に対するものである；こ
のような抗体（一般的にはモノクローナル）は、共有結
合した細胞毒素と共に用いられる標的試薬（targeting
agent）として既によく知られている。本発明において
は、抗腫瘍抗体（望ましくは、抗体全体ではなく、Fab
部分のみ）は、腫瘍細胞の表面決定基を認識し、受容体
を媒介とするエンドサイトシスによって同細胞内に取り
込まれるものである；キャッピングが行われた後に表出
する抗体は、さほど効果的ではない。
細胞特異的結合領域を有する他の有用なポリペプチド
リガンドは、ソマトタスタチン，卵胞刺激ホルモン（卵
巣細胞に特異的）；黄体形成ホルモン（卵巣細胞に特異
的）；甲状腺刺激ホルモン（甲状腺刺激に特異的）；バ
ソプレッシン（子宮細胞，膀胱細胞，腸細胞に特異
的）；プロラクチン（乳細胞に特異的）および成長ホル
モン（ある種の骨細胞に特異的）である。
リガンドは、ソマトタスタチン，卵胞刺激ホルモン（卵
巣細胞に特異的）；黄体形成ホルモン（卵巣細胞に特異
的）；甲状腺刺激ホルモン（甲状腺刺激に特異的）；バ
ソプレッシン（子宮細胞，膀胱細胞，腸細胞に特異
的）；プロラクチン（乳細胞に特異的）および成長ホル
モン（ある種の骨細胞に特異的）である。
ペプチドホルモンは、毒素分子のシステイン（Cys）
と反応するSH基で修飾しなければならない。これは、以
下に示すtox遺伝子の場合と類似の方法で、ホルモンを
コードするDNA塩基配列中の適当な部位にCysコドンを含
むリンカーを挿入することによって行われる。もしく
は、SH基そのもの、あるいは、Cys残基の一部として、
固相ペプチド合成法によってSH基を導入することも可能
である。例えば、ペプチドへのSH基の導入は、ヒスキー
（Hiskey），（1981）Peptides ３,137に述べられてい
る。分子の修飾は、また、バチャ（Bacha）ら、米国特
許第4,468,382号、（前出）に示された、ペプチドホル
モンである、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンの修飾に
関して述べられた方法に従って行うこともできる。同様
に、タンパク質は、DNAレベル、あるいは、タンパク質
化学レベルで修飾可能である。タンパク質へのSH基の導
入は、マッセン（Massen）ら、（1983）Eur.J.Biochem.
134，２,32に示されている。
と反応するSH基で修飾しなければならない。これは、以
下に示すtox遺伝子の場合と類似の方法で、ホルモンを
コードするDNA塩基配列中の適当な部位にCysコドンを含
むリンカーを挿入することによって行われる。もしく
は、SH基そのもの、あるいは、Cys残基の一部として、
固相ペプチド合成法によってSH基を導入することも可能
である。例えば、ペプチドへのSH基の導入は、ヒスキー
（Hiskey），（1981）Peptides ３,137に述べられてい
る。分子の修飾は、また、バチャ（Bacha）ら、米国特
許第4,468,382号、（前出）に示された、ペプチドホル
モンである、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンの修飾に
関して述べられた方法に従って行うこともできる。同様
に、タンパク質は、DNAレベル、あるいは、タンパク質
化学レベルで修飾可能である。タンパク質へのSH基の導
入は、マッセン（Massen）ら、（1983）Eur.J.Biochem.
134，２,32に示されている。
本発明で有用な、非ペプチド性特異的結合リガンドの
主要なものは、ステロイドホルモンである。その例は、
エストロゲン、および、エストラジオールのようなエス
トロゲン誘導体である；これらは、現在前立腺癌腫、お
よび閉経後乳腺癌腫の治療に使用されている。これらの
ホルモンを含むハイブリッド分子、あるいはその類似物
質は、上記疾患の治療に同量あるいはより少量の投与で
使用可能である。ステロイドホルモンの誘導は、イカガ
ワら、（1981）J.Org.Chem.46，18,3747に述べられてい
るような標準的方法を用いて行うことができる。例え
ば、ステロイドホルモン 17−ベータ−エストラジオー
ルの水酸基をSH基と置換して修飾し、下に示す物質を得
る。
主要なものは、ステロイドホルモンである。その例は、
エストロゲン、および、エストラジオールのようなエス
トロゲン誘導体である；これらは、現在前立腺癌腫、お
よび閉経後乳腺癌腫の治療に使用されている。これらの
ホルモンを含むハイブリッド分子、あるいはその類似物
質は、上記疾患の治療に同量あるいはより少量の投与で
使用可能である。ステロイドホルモンの誘導は、イカガ
ワら、（1981）J.Org.Chem.46，18,3747に述べられてい
るような標準的方法を用いて行うことができる。例え
ば、ステロイドホルモン 17−ベータ−エストラジオー
ルの水酸基をSH基と置換して修飾し、下に示す物質を得
る。
遺伝子構造 一般的に、プラスミドは標準的技術によって操作す
る。プラスミドDNAは、製造業者（例えば、ニュー・イ
ングランド・バイオラブズ社，ベバーリー社，マス社な
ど）に推奨される条件で、制限エンドヌクレアーゼによ
って切断する。制限断片は、200ng/mlのエチジウムブロ
マイドを含むTBE（89mM ホウ酸,89mM トリズマベース
〔シグマケミカル社，ミズーリ州セントルイス〕,2.5mM
EDTA,pH7.0）中、80−100Vで30−60分間、１％水平ア
ガロースゲルによる電気泳動を行う。短いDNA断片は、
８％垂直ポリアクリルアミドゲルで100Vで２−５時間電
気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色する。ゲル
は、赤色フィルターを用い、紫外トランスイルミネイタ
ー上で、ポラロイド667型フィルムで写真撮影を行う。
る。プラスミドDNAは、製造業者（例えば、ニュー・イ
ングランド・バイオラブズ社，ベバーリー社，マス社な
ど）に推奨される条件で、制限エンドヌクレアーゼによ
って切断する。制限断片は、200ng/mlのエチジウムブロ
マイドを含むTBE（89mM ホウ酸,89mM トリズマベース
〔シグマケミカル社，ミズーリ州セントルイス〕,2.5mM
EDTA,pH7.0）中、80−100Vで30−60分間、１％水平ア
ガロースゲルによる電気泳動を行う。短いDNA断片は、
８％垂直ポリアクリルアミドゲルで100Vで２−５時間電
気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色する。ゲル
は、赤色フィルターを用い、紫外トランスイルミネイタ
ー上で、ポラロイド667型フィルムで写真撮影を行う。
プラスミドpABC508は、二種のDNA断片、すなわち、フ
ラグメントＡをコードするものとフラグメントＢの部分
をコードするものとを融合することによって構成し、そ
れに、Cysコドンを含むリンカーを連結させた。
ラグメントＡをコードするものとフラグメントＢの部分
をコードするものとを融合することによって構成し、そ
れに、Cysコドンを含むリンカーを連結させた。
第４図に示すように、上記融合プラスミドは、ジフテ
リア毒素遺伝子のフラグメントＡコード領域を含むpDT2
01、および、フラグメントＢコード領域の大部分を含む
pDT301の２つのプラスミドから構成した。これらのDNA
断片の各々の構造を、以下に述べる。
リア毒素遺伝子のフラグメントＡコード領域を含むpDT2
01、および、フラグメントＢコード領域の大部分を含む
pDT301の２つのプラスミドから構成した。これらのDNA
断片の各々の構造を、以下に述べる。
プラスミドpDT301は、フラグメントＢのＣ末端17アミ
ノ酸を除く全体をコードするSau 3A I−１配列をtox対
立遺伝子から切り出すことによって作製した。Cla I,Ms
p I,およびSph Iの制限酵素切断部位を有する上記配列
を、プラスミドpUC8（ヴイエラ（Viera）ら、（1982）G
ene 19,259）のBamH I部位に挿入し、pDT301を得た。プ
ラスミドpDT201はフラグメントＡをコードするSau 3A I
−２配列（第３図）を含む（レオング（Leong）ら、（1
983）Science 220,515参照）。（大腸菌（E.coli）中の
pDT301およびpDT201は、メリーランド州ロックビルのア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れ、それぞれATCC受託番号39360および39359を与えられ
ている。出願人の特許権使用権者、セラゲン者（Serage
n Inc.）は、ここに発行された特許期間終了前に上記培
養菌が死滅した場合に該培養菌を復活させる責任がある
こと、および、上記特許の発行、寄託期日以降少なくと
も30年間はいつ寄託物が一般に入手可能とされるかをAT
CCに告知する責任があることを承認する。上記時期まで
は、37CFRδ1.14および35USCδ112項により寄託物は特
許局長官が入手可能となる。） さらに第４図で示されるように、プラスミドpDT301を
以下に述べるように、Cysコドンを含むリンカーを付加
することにより修飾した。合成リンカーは、380A DNAシ
ンセサイザー（アプライド・バイオシステム社，カリフ
ォルニア州フォスターシティ）を使用し、調製ポアガラ
ス固相支持体上で、21マーと29マーのオリゴヌクレオチ
ドを、両端に4bpの1/2 Sph Iおよび1/2 Hind III−本鎖
配列を残して21bpの相同なコアによってハイブリッド形
成を行うことにより構成した。上記リンカーは、以下の
塩基配列を有する。
ノ酸を除く全体をコードするSau 3A I−１配列をtox対
立遺伝子から切り出すことによって作製した。Cla I,Ms
p I,およびSph Iの制限酵素切断部位を有する上記配列
を、プラスミドpUC8（ヴイエラ（Viera）ら、（1982）G
ene 19,259）のBamH I部位に挿入し、pDT301を得た。プ
ラスミドpDT201はフラグメントＡをコードするSau 3A I
−２配列（第３図）を含む（レオング（Leong）ら、（1
983）Science 220,515参照）。（大腸菌（E.coli）中の
pDT301およびpDT201は、メリーランド州ロックビルのア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れ、それぞれATCC受託番号39360および39359を与えられ
ている。出願人の特許権使用権者、セラゲン者（Serage
n Inc.）は、ここに発行された特許期間終了前に上記培
養菌が死滅した場合に該培養菌を復活させる責任がある
こと、および、上記特許の発行、寄託期日以降少なくと
も30年間はいつ寄託物が一般に入手可能とされるかをAT
CCに告知する責任があることを承認する。上記時期まで
は、37CFRδ1.14および35USCδ112項により寄託物は特
許局長官が入手可能となる。） さらに第４図で示されるように、プラスミドpDT301を
以下に述べるように、Cysコドンを含むリンカーを付加
することにより修飾した。合成リンカーは、380A DNAシ
ンセサイザー（アプライド・バイオシステム社，カリフ
ォルニア州フォスターシティ）を使用し、調製ポアガラ
ス固相支持体上で、21マーと29マーのオリゴヌクレオチ
ドを、両端に4bpの1/2 Sph Iおよび1/2 Hind III−本鎖
配列を残して21bpの相同なコアによってハイブリッド形
成を行うことにより構成した。上記リンカーは、以下の
塩基配列を有する。
上記リンカーは、アラニン３残基をコードし、Cysコ
ドン（TGT）および終止コドン（TAG）を含む。（この構
造は、本発明によるCys含有ペプチドの発現を可能にす
るだけでなく、特異的結合リガンドをコードする遺伝子
のPst I部位への挿入も可能にする。） 第４図に示されるように、pDT301をSph IおよびHind
IIIで切断し、第４図の“E"で示されたDNA領域を除去
し、次に、Cysコドン含有リンカーをプラスミドのSph
I,Hind III部位に連結し、プラスミドpBC508を得た。次
に、pBC508をHind IIIおよびSau 3A Iで切断し、フラグ
メント１を得た。
ドン（TGT）および終止コドン（TAG）を含む。（この構
造は、本発明によるCys含有ペプチドの発現を可能にす
るだけでなく、特異的結合リガンドをコードする遺伝子
のPst I部位への挿入も可能にする。） 第４図に示されるように、pDT301をSph IおよびHind
IIIで切断し、第４図の“E"で示されたDNA領域を除去
し、次に、Cysコドン含有リンカーをプラスミドのSph
I,Hind III部位に連結し、プラスミドpBC508を得た。次
に、pBC508をHind IIIおよびSau 3A Iで切断し、フラグ
メント１を得た。
さらに第４図に示されるように、プラスミドpDT201を
Hind IIIで切断し、一本鎖末端をDNAポリメラーゼＩ
（クレノー断片）でフイル・インした。得られたプラン
ト末端を二本鎖EcoR I （ニュー・イングランド バイオラブズ社，マサチュー
セッツ州ベバリー）に連結してpDT201′を得、次にEcoR
IおよびSau3Aで切断し、フラグメント２を得た。
Hind IIIで切断し、一本鎖末端をDNAポリメラーゼＩ
（クレノー断片）でフイル・インした。得られたプラン
ト末端を二本鎖EcoR I （ニュー・イングランド バイオラブズ社，マサチュー
セッツ州ベバリー）に連結してpDT201′を得、次にEcoR
IおよびSau3Aで切断し、フラグメント２を得た。
フラグメント１およびフラグメント２を等モル濃度で
混合して、標準的方法で連結し、続いて、混合液をEcoR
IおよびHind IIIで切断した。切断した混合液は、次
に、単独のEcoR IおよびHind III部位を含む。pEMBL8
（デンテ（Dente）ら、（1983）Nucleic Acids Res.11,
1645）をEcoR IおよびHind IIIで切断したものに連結
し、pABC508を得た。プラスミドpABC508は以下に述べる
ように、適当な宿主、例えば大腸菌に形質転換し、Cys
修飾毒素分子を産生することができる。
混合して、標準的方法で連結し、続いて、混合液をEcoR
IおよびHind IIIで切断した。切断した混合液は、次
に、単独のEcoR IおよびHind III部位を含む。pEMBL8
（デンテ（Dente）ら、（1983）Nucleic Acids Res.11,
1645）をEcoR IおよびHind IIIで切断したものに連結
し、pABC508を得た。プラスミドpABC508は以下に述べる
ように、適当な宿主、例えば大腸菌に形質転換し、Cys
修飾毒素分子を産生することができる。
異なる方法として、天然に存在するtoxプロモーター
を以下に示すように異なるプロモーターで置換すること
が可能である。
を以下に示すように異なるプロモーターで置換すること
が可能である。
ラムダPRプロモーターは、発現ベクターpEMBL8ex3
（デンテら、前出）に含まれている。第５図に、tox遺
伝子の開始部位付近のDNA配列および対応するアミノ酸
配列を示す。pABC508をEcoR Iで切断し、次に、１マイ
クログラムのDNAあたり１ユニットの酵素を用いて37℃
で10−15分間、Bal31で処理した。得られたDNA断片の混
合液は、BamH I に連結し、大腸菌HB101（ベセスダ・ラボラトリーズ
社，メリーランド州ガイサースブルグ）に形質転換し、
toxの５′端をコードする領域の塩基配列、および、得
られたクローンのうち30個の塩基配列を決定した。第５
図に示したDNA配列を含む一つのクローンを精製し、Bam
H I−Hind IIIフラグメントを単離し、BamH IおよびHin
d IIIで切断したpEMBL8ex3に挿入した。得られたプラス
ミドpABC1508は、ラムダPRプロモーターおよびATG翻訳
開始コドンを含む。外来のアスパラギン残基およびプロ
リン残基をこの過程で挿入した。第５図において、Cro
はラムダのCro遺伝子を表し、SDはシャイン−ダルガル
ノ配列を表す。ラムダPRプロモーターは、ラムダc I遺
伝子によって制御される。本例においては、PRプロモー
ターが30℃で不活性であり、37℃で活性化される変異
体、c I857温度感受性リプレッサー遺伝子を使用した。
（デンテら、前出）に含まれている。第５図に、tox遺
伝子の開始部位付近のDNA配列および対応するアミノ酸
配列を示す。pABC508をEcoR Iで切断し、次に、１マイ
クログラムのDNAあたり１ユニットの酵素を用いて37℃
で10−15分間、Bal31で処理した。得られたDNA断片の混
合液は、BamH I に連結し、大腸菌HB101（ベセスダ・ラボラトリーズ
社，メリーランド州ガイサースブルグ）に形質転換し、
toxの５′端をコードする領域の塩基配列、および、得
られたクローンのうち30個の塩基配列を決定した。第５
図に示したDNA配列を含む一つのクローンを精製し、Bam
H I−Hind IIIフラグメントを単離し、BamH IおよびHin
d IIIで切断したpEMBL8ex3に挿入した。得られたプラス
ミドpABC1508は、ラムダPRプロモーターおよびATG翻訳
開始コドンを含む。外来のアスパラギン残基およびプロ
リン残基をこの過程で挿入した。第５図において、Cro
はラムダのCro遺伝子を表し、SDはシャイン−ダルガル
ノ配列を表す。ラムダPRプロモーターは、ラムダc I遺
伝子によって制御される。本例においては、PRプロモー
ターが30℃で不活性であり、37℃で活性化される変異
体、c I857温度感受性リプレッサー遺伝子を使用した。
pABC1508を、慣習的方法（例えば、マニアティス（Ma
niatis）ら、（1984）Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに
述べられているもの）を用いて、大腸菌HB101（例え
ば、大腸菌JM101あるいは5Y327などの別のものも使用可
能）に形質転換し、ジフテリアtox遺伝子産物の発現を
分析した。toxシグナル配列への、正に電荷したアスパ
ラギン残基の導入は、toxポリペプチドの、組み換え宿
主の細胞周辺腔への輸送に影響を与えなかった。
niatis）ら、（1984）Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに
述べられているもの）を用いて、大腸菌HB101（例え
ば、大腸菌JM101あるいは5Y327などの別のものも使用可
能）に形質転換し、ジフテリアtox遺伝子産物の発現を
分析した。toxシグナル配列への、正に電荷したアスパ
ラギン残基の導入は、toxポリペプチドの、組み換え宿
主の細胞周辺腔への輸送に影響を与えなかった。
Cys修飾毒素をコードするDNAを含むベクターで形質転
換を行った大腸菌細胞は、例えば、１リットルあたり10
gトリプトン、10gNaCl、5g酵母抽出物を含み、さらに10
0μg/mlアンピシリンを添加したルリア培地（Luria Bro
th）などの、標準的培養条件下で培養する。細胞周辺腔
に輸送されるジフテリア毒関連分子を、細胞周辺腔抽出
物から精製する。細胞周辺腔抽出物は、A590が約1.0と
なるまで、体積9.5リットルで37℃において培養した細
胞から調製する。ここで示すように天然のtoxプロモー
ターを、温度感受性c I857遺伝子の制御下で、温度感受
性c I857調節配列と置換した場合は、細胞は30℃で培養
し、発現は培養温度を15分間42℃に上昇させることによ
って誘導する。次に培養菌を40℃でさらに１時間培養す
る。いずれの場合も、培養液を0.45μメンブレン（ペリ
コンシステム社，ミリポアコーポレーション社，ベッド
フォード社，マス社）を用いて過し、約１リットルに
濃縮し、４℃に冷却する。菌を遠心によって回収し、氷
冷した20％ショ糖、30mM トリス−HCl、1mM EDTA、pH
7.5に再懸濁し、リゾチーム（最終濃度750μg/ml）で30
分間反応させる。スフェロプラストを遠心によって除去
し、2mgのｐ−アミジノフェニルメチルスルホニルフル
オライド（ｐ−APMSF,カルバイオケム社，カリフォルニ
ア州サンディエゴ）を加え、0.2μメンブレンによっ
て、細胞周辺腔抽出物の過滅菌を行う。
換を行った大腸菌細胞は、例えば、１リットルあたり10
gトリプトン、10gNaCl、5g酵母抽出物を含み、さらに10
0μg/mlアンピシリンを添加したルリア培地（Luria Bro
th）などの、標準的培養条件下で培養する。細胞周辺腔
に輸送されるジフテリア毒関連分子を、細胞周辺腔抽出
物から精製する。細胞周辺腔抽出物は、A590が約1.0と
なるまで、体積9.5リットルで37℃において培養した細
胞から調製する。ここで示すように天然のtoxプロモー
ターを、温度感受性c I857遺伝子の制御下で、温度感受
性c I857調節配列と置換した場合は、細胞は30℃で培養
し、発現は培養温度を15分間42℃に上昇させることによ
って誘導する。次に培養菌を40℃でさらに１時間培養す
る。いずれの場合も、培養液を0.45μメンブレン（ペリ
コンシステム社，ミリポアコーポレーション社，ベッド
フォード社，マス社）を用いて過し、約１リットルに
濃縮し、４℃に冷却する。菌を遠心によって回収し、氷
冷した20％ショ糖、30mM トリス−HCl、1mM EDTA、pH
7.5に再懸濁し、リゾチーム（最終濃度750μg/ml）で30
分間反応させる。スフェロプラストを遠心によって除去
し、2mgのｐ−アミジノフェニルメチルスルホニルフル
オライド（ｐ−APMSF,カルバイオケム社，カリフォルニ
ア州サンディエゴ）を加え、0.2μメンブレンによっ
て、細胞周辺腔抽出物の過滅菌を行う。
次に、Cys修飾毒素関連分子をフェニルセファロース
（ファルマシア・ファイン・ケミカル社，ニュージャー
ジー州ピスカタウェイ）およびDEAEセルロースを用い、
実質的にラプオーリ（Rappuoli）ら、（1985）Biotechn
ology,p.165に述べられている方法でクロマトグラフィ
ーを行い、精製する。細胞周辺腔抽出物は、10mMクリン
酸ナトリウム（pH7.2）に対して透析し、硫酸アンモニ
ウムを13％（w/v）になるように加える。続いて粗抽出
液を、13％硫酸アンモニウムを含む10mMクリン酸緩衝液
で平衡化したフェニルセファロースカラムにかける。修
飾毒素が溶出され、それを10mMクリン酸緩衝液に対して
透析し、次にDEAEセルロースカラムにかける。リン酸緩
衝液で洗浄後、DEAEセルロースカラムをリン酸緩衝液の
直線的NaCl勾配で展開する。
（ファルマシア・ファイン・ケミカル社，ニュージャー
ジー州ピスカタウェイ）およびDEAEセルロースを用い、
実質的にラプオーリ（Rappuoli）ら、（1985）Biotechn
ology,p.165に述べられている方法でクロマトグラフィ
ーを行い、精製する。細胞周辺腔抽出物は、10mMクリン
酸ナトリウム（pH7.2）に対して透析し、硫酸アンモニ
ウムを13％（w/v）になるように加える。続いて粗抽出
液を、13％硫酸アンモニウムを含む10mMクリン酸緩衝液
で平衡化したフェニルセファロースカラムにかける。修
飾毒素が溶出され、それを10mMクリン酸緩衝液に対して
透析し、次にDEAEセルロースカラムにかける。リン酸緩
衝液で洗浄後、DEAEセルロースカラムをリン酸緩衝液の
直線的NaCl勾配で展開する。
次に、修飾毒素を、ズッカー（Zucker）ら、（1984）
Molecular Immunol.21,785の方法で作製した抗体を含
む、抗ジフテリア毒イムノアフィニティーカラムにおけ
る。完全に洗浄した後、4Mグアニジンヒドロクロライド
で修飾毒素を溶出し、直ちにリン酸緩衝液に対して透析
する。続いて、精製された修飾毒素を、透析バッグを乾
燥したセファデックスＧ−200上に置くことにより、約1
00μg/mlに濃縮する。精製操作は全て４℃で行い。修飾
毒素は少量ずつ分注し、使用するまで−76℃で保存す
る。
Molecular Immunol.21,785の方法で作製した抗体を含
む、抗ジフテリア毒イムノアフィニティーカラムにおけ
る。完全に洗浄した後、4Mグアニジンヒドロクロライド
で修飾毒素を溶出し、直ちにリン酸緩衝液に対して透析
する。続いて、精製された修飾毒素を、透析バッグを乾
燥したセファデックスＧ−200上に置くことにより、約1
00μg/mlに濃縮する。精製操作は全て４℃で行い。修飾
毒素は少量ずつ分注し、使用するまで−76℃で保存す
る。
特異的結合リガンド：アルファ−MSH 第６図に、アルファ−MSHをコードするDNA挿入物を含
むプラスミドpMSH53を示す。pMSH53は、以下のような、
両端に1/2Pst I部位を有するアルファ−MSHコード配列
を、pUC8に挿入することによって作製された： プラスミドpMSH53は、標準的方法を用いて、例えば大
腸菌などの培養細菌細胞中におけるアルファ−MSH産生
のための発現ベクターの作製に使用し得る。さらに、上
記発現に先立ち、前述のtox遺伝子に関する方法と同様
の方法で、Cys含有リンカーをアルファ−MSHコード配列
のＮ末端あるいはその近傍に融合し、ジフテリア毒フラ
グメントに添加されたCys残基と反応可能なＮ末端のCys
残基を含む、修飾アルファ−MSHを産生することができ
る。もしくは、Cys含有MSH分子は、反応性のSH基が存在
するか、あるいは翻訳後、すなわちDNAレベルではな
く、タンパク質化学レベルでSH基を付加した、いかなる
毒素分子ともに化学的に結合が可能である。
むプラスミドpMSH53を示す。pMSH53は、以下のような、
両端に1/2Pst I部位を有するアルファ−MSHコード配列
を、pUC8に挿入することによって作製された： プラスミドpMSH53は、標準的方法を用いて、例えば大
腸菌などの培養細菌細胞中におけるアルファ−MSH産生
のための発現ベクターの作製に使用し得る。さらに、上
記発現に先立ち、前述のtox遺伝子に関する方法と同様
の方法で、Cys含有リンカーをアルファ−MSHコード配列
のＮ末端あるいはその近傍に融合し、ジフテリア毒フラ
グメントに添加されたCys残基と反応可能なＮ末端のCys
残基を含む、修飾アルファ−MSHを産生することができ
る。もしくは、Cys含有MSH分子は、反応性のSH基が存在
するか、あるいは翻訳後、すなわちDNAレベルではな
く、タンパク質化学レベルでSH基を付加した、いかなる
毒素分子ともに化学的に結合が可能である。
上述のように組み換えDNA技術を用いてアルファ−MSH
を作製するのではなく、アルファ−MSHを生物体から精
製するか、あるいは商業的に入手することも可能である
（例えば、シグマケミケル社，ミズーリ州セントルイス
など）。
を作製するのではなく、アルファ−MSHを生物体から精
製するか、あるいは商業的に入手することも可能である
（例えば、シグマケミケル社，ミズーリ州セントルイス
など）。
化学的結合 有用なCysを遺伝子工学的手法によってリガンドに結
合させた後、あるいは、リガンドが有用な反応性Cys残
基あるいは他の硫黄含有基を含む場合、毒素とリガンド
の双方を還元し、1:5から1:20の割合で毒素とリガンド
を混合することによって結合させ、ジスルフィド反応を
室温で完全に行わせる（一般的には20分から30分）。次
に、上記混合液をリン酸緩衝生理食塩水でよく透析を行
い、反応していないリガンド分子を除去する。精製の最
終段階は、毒素−毒素二量体およびホルモン−ホルモン
二量体から、毒素−ホルモン複合体を分子の大きさによ
って分離することによる；これは、リン酸緩衝生理食塩
水中でセファデックスG100クロマトグラフィーによって
行う。
合させた後、あるいは、リガンドが有用な反応性Cys残
基あるいは他の硫黄含有基を含む場合、毒素とリガンド
の双方を還元し、1:5から1:20の割合で毒素とリガンド
を混合することによって結合させ、ジスルフィド反応を
室温で完全に行わせる（一般的には20分から30分）。次
に、上記混合液をリン酸緩衝生理食塩水でよく透析を行
い、反応していないリガンド分子を除去する。精製の最
終段階は、毒素−毒素二量体およびホルモン−ホルモン
二量体から、毒素−ホルモン複合体を分子の大きさによ
って分離することによる；これは、リン酸緩衝生理食塩
水中でセファデックスG100クロマトグラフィーによって
行う。
使 用 法 毒素−リガンドハイブリッド分子は、リガンドが選択
的に結合できる一群の不要細胞が存在することを特徴と
する医学的疾患、例えば癌など、にかかっている哺乳
類、例えばヒトに投与する。ハイブリッド分子の投与量
は、疾患の型，疾患の範囲，大きさ，および、疾患を持
つ哺乳動物の種類によって異なる。一般的に、投与量
は、他の制癌剤を癌の治療の際に使用する範囲である
が、分子の特異性のために、より少量しか必要としない
場合もある。
的に結合できる一群の不要細胞が存在することを特徴と
する医学的疾患、例えば癌など、にかかっている哺乳
類、例えばヒトに投与する。ハイブリッド分子の投与量
は、疾患の型，疾患の範囲，大きさ，および、疾患を持
つ哺乳動物の種類によって異なる。一般的に、投与量
は、他の制癌剤を癌の治療の際に使用する範囲である
が、分子の特異性のために、より少量しか必要としない
場合もある。
ハイブリッド分子は、あらゆる便利な方法で投与する
ことが可能である；例えば、注射、あるいは定期的に放
出される移殖片など。ハイブリッドタンパク質は、あら
ゆる非毒性、薬学的に適当なキャリア物質と結合させる
ことができる。
ことが可能である；例えば、注射、あるいは定期的に放
出される移殖片など。ハイブリッドタンパク質は、あら
ゆる非毒性、薬学的に適当なキャリア物質と結合させる
ことができる。
MSHハイブリッド分子の場合、局所性クリームを初期
癌腫細胞を殺すために用い、注射あるいは移殖を用いて
転移細胞を殺すことが可能である。
癌腫細胞を殺すために用い、注射あるいは移殖を用いて
転移細胞を殺すことが可能である。
エストラジオール複合体は、エストラジオールレセプ
ターを有する細胞を特徴とするある種の乳癌に対する結
合特異性を示し、初期細胞および転移細胞の治療に使用
することができる。
ターを有する細胞を特徴とするある種の乳癌に対する結
合特異性を示し、初期細胞および転移細胞の治療に使用
することができる。
他の態様は、以下の請求の範囲に示す。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−42321（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501361（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−500814（ＪＰ，Ａ) 米国特許4468382（ＵＳ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｖｏ ｌ．134（1983）Ｐ．327−330 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎｇｌ, Ｖｏｌ．４（1985），Ｐ．3339−3343 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｖｌ ａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏ ｌ．20（1982），Ｐ．163−176 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏ ｌ．258（1983），Ｐ．1565−1570 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏ ｌ．256（1981），Ｐ．5350−5354 Ｖｉｃｔｏｒ Ｊ．Ｈａｒｕｂｙ ｅ ｔ ａｌ，”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓｔｒ ｏｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉ ｏｎ：Ｐｙｏｃ．ｏｆ ｔｈｅ Ｅｉｇ ｈｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉ ｄｅ Ｓｙｍｐ．”（1983）Ｐｉｅｒｃ ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎ ｙ，Ｐ．837−852 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｏｌ．Ｓ ｃｉ，Ｖｏｌ．80（1983），Ｐ．6853− 6857
Claims (5)
- 【請求項１】細胞毒性活性を示す程度に十分大きく、一
般的な真核細胞結合性を示さない程度に小さいペプチド
毒素分子を含む毒素部分を含有し、該毒素部分は遺伝子
操作によって導入された天然には存在しないシステイン
を含み、該システインによって該毒素部分がペプチド、
タンパク質性増殖因子、あるいはステロイドホルモンか
らなるSH基を有する細胞特異的リガンドにＳ−Ｓ結合で
結合してなる標的指向毒素分子。 - 【請求項２】毒素がジフテリア毒素、リシン、あるいは
アブリンである、請求項１記載の毒素分子。 - 【請求項３】上記ペプチドがホルモンである、請求項１
記載の毒素分子。 - 【請求項４】上記タンパク質性増殖因子がインターロイ
キンＩ、インターロイキンII、インターロイキンIIIま
たはＢ細胞増殖因子である、請求項１記載の毒素分子。 - 【請求項５】上記ステロイドホルモンがエストラジオー
ルである、請求項１記載の毒素分子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US79816385A | 1985-11-13 | 1985-11-13 | |
| US798163 | 1985-11-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63501799A JPS63501799A (ja) | 1988-07-21 |
| JP2635035B2 true JP2635035B2 (ja) | 1997-07-30 |
Family
ID=25172688
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61506140A Expired - Lifetime JP2635035B2 (ja) | 1985-11-13 | 1986-11-13 | Ｃｙｓコドン修飾ＤＮＡ |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0246307B1 (ja) |
| JP (1) | JP2635035B2 (ja) |
| AT (1) | ATE101162T1 (ja) |
| AU (1) | AU6733287A (ja) |
| DE (1) | DE3689620T2 (ja) |
| WO (1) | WO1987002987A1 (ja) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4745180A (en) * | 1986-06-27 | 1988-05-17 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using heparin fragments |
| US5084559A (en) * | 1987-03-27 | 1992-01-28 | Repligen Corporation | Protein a domain mutants |
| US5827934A (en) * | 1988-03-08 | 1998-10-27 | The University Of Wyoming | Cytotoxic diphtheria toxin fragments |
| US5290914A (en) * | 1988-04-28 | 1994-03-01 | Mycogen Corporation | Hybrid diphtheria-B.t. pesticidal toxins |
| US5621078A (en) * | 1989-03-22 | 1997-04-15 | Merck & Co., Inc. | Modified pseudomonas exotoxin PE40 |
| NZ232900A (en) * | 1989-03-22 | 1993-08-26 | Merck & Co Inc | Pseudomonas exotoxin a, pe 40 domain derivatives |
| WO1990012877A1 (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-01 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US5767072A (en) * | 1989-09-14 | 1998-06-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Therapeutic compositions comprising a CD4 peptide and methods of treatment of HIV infections |
| DE69132581T3 (de) * | 1990-03-02 | 2008-07-17 | Boston Medical Center Corp., Boston | Verbesserte chimäre toxine |
| US5376546A (en) * | 1991-11-04 | 1994-12-27 | Xoma Corporation | Analogs of ribosome-inactivating proteins |
| US5837491A (en) * | 1991-11-04 | 1998-11-17 | Xoma Corporation | Polynucleotides encoding gelonin sequences |
| US5621083A (en) * | 1991-11-04 | 1997-04-15 | Xoma Corporation | Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins |
| US6146850A (en) | 1991-11-04 | 2000-11-14 | Xoma Corporation | Proteins encoding gelonin sequences |
| US7288254B2 (en) | 1995-10-30 | 2007-10-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Nih | Use of immunotoxins to induce immune tolerance to pancreatic islet transplantation |
| US7517527B2 (en) | 1995-10-30 | 2009-04-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immunotoxin with in vivo T cell suppressant activity and methods of use |
| US7696338B2 (en) | 1995-10-30 | 2010-04-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immunotoxin fusion proteins and means for expression thereof |
| US7125553B1 (en) | 1996-04-15 | 2006-10-24 | The United States of America as represented by the Department of Health and Human Services c/o Centers for Disease Control and Prevention | Methods of inducing immune tolerance using immunotoxins |
| WO1998039425A2 (en) * | 1997-03-05 | 1998-09-11 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Vectors and methods for expression of mutant proteins |
| AU733898B2 (en) | 1997-03-05 | 2001-05-31 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Immunotoxins and methods of inducing immune tolerance |
| FR2827606A1 (fr) * | 2001-07-20 | 2003-01-24 | Pf Medicament | Nouveaux derives d'anatoxines diphteriques et leur utilisation comme porteur |
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|---|---|---|---|---|
| US4468382A (en) | 1982-07-15 | 1984-08-28 | New England Medical Center, Inc. | Polypeptide-toxin hybrid protein |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1662352A3 (ru) * | 1982-05-05 | 1991-07-07 | Генентек, Инк (Фирма) | Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент активатора плазминогена тканевого типа |
| DE3369466D1 (en) * | 1982-05-12 | 1987-03-05 | Harvard College | Fused genes encoding hybrid proteins, cloning vectors containing them and the use thereof |
-
1986
- 1986-11-13 WO PCT/US1986/002444 patent/WO1987002987A1/en active IP Right Grant
- 1986-11-13 AU AU67332/87A patent/AU6733287A/en not_active Abandoned
- 1986-11-13 AT AT86907171T patent/ATE101162T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-11-13 DE DE3689620T patent/DE3689620T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-13 EP EP86907171A patent/EP0246307B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-13 JP JP61506140A patent/JP2635035B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4468382A (en) | 1982-07-15 | 1984-08-28 | New England Medical Center, Inc. | Polypeptide-toxin hybrid protein |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．１３４（１９８３）Ｐ．３２７−３３０ |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２５６（１９８１），Ｐ．５３５０−５３５４ |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２５８（１９８３），Ｐ．１５６５−１５７０ |
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｖｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２０（１９８２），Ｐ．１６３−１７６ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｏｌ．Ｓｃｉ，Ｖｏｌ．８０（１９８３），Ｐ．６８５３−６８５７ |
| Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎｇｌ，Ｖｏｌ．４（１９８５），Ｐ．３３３９−３３４３ |
| Ｖｉｃｔｏｒ Ｊ．Ｈａｒｕｂｙ ｅｔ ａｌ，"Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓｔｒｏｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｐｙｏｃ．ｏｆ ｔｈｅ Ｅｉｇｈｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐ．"（１９８３）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐ．８３７−８５２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| JPS63501799A (ja) | 1988-07-21 |
| AU6733287A (en) | 1987-06-02 |
| DE3689620D1 (de) | 1994-03-17 |
| EP0246307B1 (en) | 1994-02-02 |
| WO1987002987A1 (en) | 1987-05-21 |
| ATE101162T1 (de) | 1994-02-15 |
| DE3689620T2 (de) | 1994-06-16 |
| EP0246307A4 (en) | 1989-06-13 |
| EP0246307A1 (en) | 1987-11-25 |
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Legal Events
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