JP4596391B2 - 細胞透過性ペプチド - Google Patents

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Description

本発明は、細胞内への透過性を有するペプチド、および該ペプチドと生理活性物質を連結してなるペプチドコンジュゲートに関する。また、本発明は、前記ペプチド又はペプチドコンジュゲートを含むワクチン、経皮吸収用製剤、特に経皮吸収用テープ製剤に関する。
近年、細胞質内への侵入能を有する機能性ペプチド（PTD；Protein Transduction Domain）がいくつか同定され、核酸や蛋白質等の経皮・経粘膜吸収や脳デリバリーに有効なDDSキャリアとしてPTDを展開しようとする試みが注目されている。例えば、特許文献１において、HIV-1 Tat タンパク質由来のペプチドを用いてペプチド・蛋白質を導入する試みがなされている。しかし、これらPTDは細胞特異性に乏しく、蛋白質等の細胞内導入効率も不十分であるため、既存PTDの改良や新規PTDの同定が必須となっている。本観点から世界的にPTDの立体構造解析に基づいたアナログ作製や細胞への吸着性向上を目的としたカチオン性アミノ酸導入体の作製が、ペプチド合成によりトライ・アンド・エラーで進められている。しかし、合成できるペプチドの種類（多様性）にも限界があり、TATペプチドに勝るPTDは未だ見いだされていない。
特開平１０−３３１８６号公報
従って、本発明の１つの目的は、TATペプチド（Tat 48-60）よりも効率よく細胞内に透過するペプチド、該ペプチドと細胞透過性の乏しい生理活性物質を連結してなるペプチドコンジュゲートを提供することである。
また、本発明の他の目的は、該ペプチド又はそのコンジュゲートを含むワクチンを含む薬学的組成物および経皮吸収用製剤を提供することである。
更に、本発明の目的は、該ペプチドを使用して生理活性物質を細胞内に導入することである。
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、まず、１億種以上もの多様性を有するペプチドをコードする遺伝子ライブラリを作製して各々をファージミドベクターに組み込み、ファージ外殻蛋白質であるg3pの先端に各ペプチドを提示させ、このようにして得られたペプチド表面提示ファージを細胞に添加して、細胞に結合する／あるいは細胞内へ侵入する能力を有するペプチドをパンニングにより選択濃縮した。次いで、これら選択濃縮したペプチドと単独では細胞内に侵入することが出来ないタンパク質合成阻害因子（PSIF）との融合体を細胞に添加して、蛋白質合成阻害を指標とした細胞質移行性（細胞膜透過性）の評価を行うことで、TATペプチド（Tat 48-60）よりも効率よく細胞内へ侵入する能力をもつペプチドを網羅的かつ迅速に創製できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、以下の各項に示す発明に関する：
項１． 配列番号１〜１６からなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチド。
項２． 配列番号１、５、６、７、９、１０、１１、１５および１６からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記項１に記載のペプチド。
項３． 少なくとも１つのCys残基を前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に付加してなる上記項１又は２に記載のペプチド。
項４． 上記項１〜３のいずれかに記載のペプチドと生理活性物質とを直接的にまたは架橋剤を介して間接的に連結してなるペプチドコンジュゲート。
項５． 上記項１〜３のいずれかに記載のペプチド又は上記項４に記載のペプチドコンジュゲートを含むワクチン。
項６． 上記項１〜３のいずれかに記載のペプチド又は上記項４に記載のペプチドコンジュゲートを含む経皮吸収用製剤。
項７． 生理活性物質を細胞内に導入するための上記項１〜３のいずれかに記載のペプチドの使用。
本発明によれば、単独で投与した場合に細胞内に移行し難いポリペプチド、核酸、糖を高効率で細胞内に導入することができる。
細胞内に導入されて生物活性を示すポリペプチド、核酸、糖などの生理活性物質を細胞内に導入することにより、各種の疾患の治療が期待できる。
一般に、ペプチドないし蛋白質、核酸、糖などの生体関連物質は親水性が高く、細胞膜を通過することは困難である。このような物質の生理活性を利用する場合、細胞内に生理活性を保持したまま送達する必要がある。生体関連物質がエンドサイトーシス経路で細胞内に送達された場合、細胞内で代謝・分解されてしまい、その生理活性が失われてしまう可能性が高い。従って、エンドサイトーシス経路以外の経路で生体関連物質を送達することが好ましい。
一方で最近、HIV由来のTATペプチドといったPTD（Protein Transduction Domain）と蛋白質との複合体・融合体が、BBBバリア（血液−脳関門）を通過し、血中から脳内へ移行できること、細胞外から細胞内へ侵入できることなどが判明し、PTDをペプチド性DDSキャリアとして適用しようとする試みが注目されて、例えばアルツハイマー病やパーキンソン病といった脳神経疾患に対して治療効果を発揮し得る「イントラボディ」や「シャペロン」といった蛋白質を有効な医薬品として適用しようとする試みに大きな期待が寄せられている。
本発明のペプチドは、BBBバリア（血液−脳関門）及び細胞膜を通過し得、生物活性の発現と吸収性の改善にも大きな効果を発揮するものと期待される。
上記したように、本発明によれば、TATペプチド（Tat 48-60）よりも高い細胞透過性を有する細胞透過性ペプチドを得ることができる。本発明の細胞透過性ペプチドを得るために、本発明者は、より具体的には実施例に示すように、次のような実験を行った：
ファージ表面提示：
18個のアミノ酸をランダムに並べた「ランダム18a.a.ペプチドライブラリ」と、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１７）を有するTATペプチド（Tat 48-60）のうち、αへリックスの基点である３つのアミノ酸（即ち、第１番目のＧ、第７番目のＱ、および第１１番目のＰ）を固定してその他のアミノ酸を置換した「TATペプチドライブラリ」を作製した。20種類のアミノ酸をコードし得るNNS配列を導入したプライマーを用いてPCRを行い、PCR断片をファージミドベクターに組み込んだ。このベクターを大腸菌TG1に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、多様な種類のペプチドを、ファージマイナー外殻蛋白質であるg3pの先端に発現するファージライブラリを作製した。ライブラリから任意にピックアップしたクローンのDNAシークエンスを解析した結果、独立したクローンで構成されていることを確認した。ファージ表面提示法は当業者に公知の方法である（図１参照）。
パンニング：細胞内移行能を有するペプチドをスクリーニングするため、作製した各ファージライブラリについて、A431細胞（ヒト表皮細胞）に対するパンニング(panning)を行った。パンニングを繰り返すにつれ、細胞に結合する／あるいは細胞内へ侵入する能力をもつクローンが選択・濃縮されていることを確認した。また、一般的にPTDは塩基性アミノ酸を多く含むという特徴を有しているが、パンニングによって濃縮された各クローンは塩基性アミノ酸とともに、トリプトファン(W)を多く含むことが明らかとなった（表１参照）。パンニング法は当業者に公知の方法である（図２参照；Nature Biotechnology Vol.21, 546-552, 2003）。
ライブラリ遺伝子を組み込むファージミドベクターとしては、特に限定されないが、例えばpCANTAB5E（アマシャムバイオサイエンス社製）が挙げられる。ペプチドを表面提示したファージの作製方法は公知である（Applied and Environmental Microbiology Vol.63, 263-269, 1997）。
得られたペプチド表面提示ファージを精製後、セルパンニング（Cell panning）に使用する。セルパンニングに使用できる細胞としては、本発明の細胞透過性ペプチドで生理活性物質を侵入させる細胞であれば特に限定されないが、例えばA431細胞（ヒト表皮細胞）が挙げられる。パンニングの回数は、特に限定されず、１〜１０回、好ましくは２〜８回、より好ましくは３〜５回である。既にパンニングが十分に行われていれば、Outputファージ／Inputファージの比はほぼ一定となる。
ペプチドの細胞内移行能の評価（PSIFによる細胞傷害性試験）：次に、各ライブラリ遺伝子を蛋白質合成阻害因子であるPSIF発現ベクターに組換え、ペプチドとPSIFとの融合体を用い、PSIFによる細胞傷害性を指標にペプチドの細胞内移行活性を評価した。PSIF自体は細胞内への移行能をもたないため、ペプチドが細胞内移行活性をもたない限り細胞傷害性を示さない。ペプチドとPSIFとの融合体を産生した大腸菌培養上清を用いてスクリーニングを行った結果、パンニングを繰り返すにつれ、細胞内へ侵入する能力をもつクローンが選択・濃縮されていることを確認できる。さらに、現在最も導入効率に優れていると言われるTATペプチドよりも導入効率の高いクローンを多数得ることに成功した。
本発明者は、タンパク質合成阻害因子（PSIF）を高濃度で細胞に添加しても細胞は死滅しないが、PSIFとTATとの融合体を細胞に添加すると細胞が死滅するという事実を発見し、この事実からこのPSIFそのものは単独で細胞内に侵入できないが、TATと融合させるとPSIFは細胞内に侵入できることを見出した。
即ち、菌体由来の蛋白質合成阻害因子（PSIF）そのものは、単独で細胞内に侵入できないため、蛋白合成阻害を全く示さない。一方でTAT（最小11merのペプチド）のようなPTDと融合・結合させることで、細胞質への移行能をPSIFに付与すると、蛋白合成阻害活性を初めて発揮するようになる。
PSIF（蛋白質合成阻害因子）としては、ジフテリアトキシン（GenBank; A04646）もしくは緑膿菌菌体外毒素（Pseudomonas exotoxin）（GenBank; K01397）の蛋白質合成阻害活性領域などが挙げられ、いずれも利用可能である。
本発明のペプチド
本発明によれば、TATペプチド（Tat48-60）よりも高い細胞透過性を有するペプチドが提供される。
本発明のペプチドは細胞透過性を発揮する部分として、３〜３０、好ましくは３〜２０、より好ましくは３〜１８のアミノ酸配列を有する。ペプチドのアミノ酸数が多くなるにつれ、ペプチドの免疫原性が高くなる傾向にあるので、細胞膜を透過し難い生理活性物質の機能を細胞内において発現させる場合には、短いペプチド配列が好ましい。また、本発明のペプチドを免疫を誘導するためのワクチンとして投与する場合には、免疫誘導に関与する任意のペプチドを連結したものであってもよい。例えば細胞性免疫を誘導するために免疫細胞表面に提示されるペプチドを結合してワクチンとして投与する場合、ペプチドはより長いものであってもよい。
一方、本発明のペプチドを細胞透過性がないか乏しい生理活性物質（例えばペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、多糖、糖蛋白、糖脂質）と連結して細胞内に導入する場合には、ペプチドはより短いものが適当であるかもしれない。
本明細書中で、「生理活性物質」とは、細胞内に導入された場合に該細胞の機能又は状態に影響を与えることができる物質であればよく、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、多糖および糖蛋白質が挙げられるが、これらに限定されない。
このような場合、例えば細胞内の酵素（ペプチダーゼ、エステラーゼなどの加水分解酵素）により切断されるようにアミド結合（ペプチド結合）、エステル結合、チオエステル結合などを介して結合してもよい。或いは、細胞内は通常還元性であるので、ジスルフィド（−ＳＳ−）結合を介して細胞内に導入したい生理活性物質を結合しておけば、細胞内で切断されて生理活性物質を遊離させることができる。或いは目的とする生理活性物質と特定物質の組み合わせ（例えば核酸−本発明ペプチドが結合したポリカチオン、アビジンが結合した本発明ペプチド−ビオチンが結合した生理活性物質、抗体−本発明ペプチドが結合した抗原など）を使用することもできる。
本発明のペプチドは、皮膚ないし消化管、あるいは注射した組織（筋肉、皮下、血管内皮など）の細胞膜を透過することができる。
本明細書中で、「細胞透過性」とは、細胞膜を透過し、細胞内に侵入することができる性質を意味する。従って、本発明のペプチドに生理活性物質を連結あるいは複合体とした場合、該ペプチドは、生理活性物質と共に、細胞膜を透過し、細胞内に侵入することができる。
本明細書中で、「細胞に結合する」とは、単に細胞の表面に結合することをいい、一方、「細胞内へ侵入する」とは、細胞の表面に結合するだけでなく、細胞膜を透過し、更に細胞内に侵入することをいう。
本明細書中において、「標的細胞」とは、生理活性物質を侵入させようとする細胞であれば特に限定されないが、例えば血管内皮細胞や粘膜上皮細胞、皮膚細胞（角化細胞）、筋肉細胞、各種臓器の細胞、血液細胞（リンパ球、マクロファージ、Ｔ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞など）が挙げられる。
本発明のペプチドとしては、配列番号１〜１６のいずれか、好ましくは配列番号１、５、６、７、９、１０、１１、１５および１６のいずれかで表されるポリペプチドが挙げられる。これらの配列は、細胞透過性を保持する限りにおいて１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加したポリペプチドを含む。
改変されたペプチドが細胞透過性を有する限り、「アミノ酸の欠失、置換又は付加」の程度及びそれらの位置などは、特に制限されない。本発明において「細胞透過性」とは、本発明のペプチドと結合した生理活性物質が、細胞膜を透過し、細胞内に導入されることを意味する。
アミノ酸の置換・付加・欠失の手段としては、該ペプチドをコードするＤＮＡを経由して行う場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967)〕などが例示できる。ＤＮＡは、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成することもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で合成することもできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。さらに、本発明のペプチドは、ペプチド合成機を用いて固相合成法により合成することもでき、置換・付加・欠失は、ペプチド合成機を用いる場合には保護アミノ酸の種類を変えることにより容易に行うことができる。又、Ｄ−アミノ酸やサルコシン（N-メチルグリシン）等の特殊なアミノ酸を導入することもできる。
細胞内に導入されるポリペプチド（生理活性物質）の具体例としては、カルボニックアンヒドラーゼ、ミオグロビン、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ロイシンジッパーや亜鉛フィンガーモチーフを有する転写因子、Fas p53などのアポトーシス誘導タンパク質、欠損により代謝異常の疾病を誘発するアデノシンデアミナーゼなどのタンパク質（酵素を含む）及び酵素阻害剤（例えばカルパインインヒビター）、遺伝情報発現調節因子（例えばＩκＢ、ＮＦκＢ）、ペプチドホルモン（インスリン、カルシトニン等）などが例示されるが、これらに限定されない。
本発明のペプチドに連結されて細胞内に導入されるポリペプチドは特に限定されず、任意のポリペプチドが挙げられる。該ポリペプチドの分子量は５００〜１００万程度、好ましくは１０００〜５０万程度が例示され、分泌タンパク、膜結合タンパク、ペプチドホルモンなどの種類も問わない。
細胞内に導入されるポリペプチドと本発明のペプチドは、本発明ペプチドがシステイン残基を有する場合には、ポリペプチドのシステイン残基と−ＳＳ−結合を介して連結してもよく、適当な架橋剤を介して連結してもよい。また、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドと導入されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（遺伝子）を、好ましくは直接に結合し、ベクターに導入し、大腸菌等の宿主細胞内で発現させるなどの常法により、本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端（好ましくはＣ末端側）に導入されるタンパク質ないしポリペプチドが直接連結されたペプチドコンジュゲートを得ることができる。同様に、核酸や糖についても、適当な架橋剤を介して連結することができる。
架橋剤としては、本発明の細胞透過性ペプチドと導入されるタンパク質ないしポリペプチド、核酸または糖を結合できる少なくとも２価の架橋剤であれば特に限定されないが、例えばN-(6-マレイミドカプロイルオキシ)コハク酸イミドエステル(EMCS)などが挙げられる。
本発明の細胞透過性ペプチドのＣ末端側には、例えばCys、Gly-Cysなどの様式でCys残基を、Ｎ末端側には、例えばCys、Cys-Glyなどの様式でCys残基をさらに結合するのが好ましい。該Cys残基のＳＨ基は、EMCSのマレイミド基に付加反応させたり、導入されるタンパク質ないしポリペプチドがフリーのＳＨ基を有する場合には−ＳＳ−結合により導入されるタンパク質ないしポリペプチドに、連結することができる。−ＳＳ−結合を介して連結した場合には、細胞内で該−ＳＳ−結合が還元され、非修飾のタンパク質ないしポリペプチドが遊離されるので好ましい。
ファージ表面に提示させるためのペプチドライブラリは、全てのアミノ酸がランダムであるものであってもよく、TATペプチドの一部は一定のままその他のアミノ酸がランダムであるものであってもよい。例えば、TATペプチドライブラリは、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１７）のうち、αへリックスの基点である３つのアミノ酸（即ち、第１番目のＧ、第７番目のＱ、および第１１番目のＰ）を固定してその他のアミノ酸をランダムに置換して作製することができる。
ペプチドコンジュゲート
本発明のペプチドに結合させる生理活性物質は、特に限定されないが、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、多糖および糖蛋白質からなる群から選択される。生理活性物質は、本発明ペプチドのどの部分に結合させても構わないが、Ｃ末端またはＮ末端、特にＣ末端に結合させるとリコンビナントの作製が容易であるので好ましい。
本発明のペプチドは、経皮吸収性、粘膜吸収性とも良好であるので、局所投与剤、例えば軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、クリーム剤、吸入剤、点鼻剤などが挙げられ、特に経皮吸収用テープ製剤が好ましい。
本発明はまた、本発明のペプチド又はペプチドコンジュゲートを含むワクチンに関する。従来のワクチン法は体液性免疫を賦活する、すなわち抗原特異的な抗体の産生を高めるものであり、細胞外に放出されたウイルス粒子等の除去には有効であるが、ウイルス感染の主体となる感染細胞や癌細胞の除去に対しては効力が無い。ウイルス感染等の治療には、細胞性免疫を高める必要がある。細胞内に抗原が入ることによって細胞性免疫が高められることは公知である。従って、本発明のペプチドと抗原とを連結させたコンジュゲートであれば、細胞内に抗原を入れることができ、ワクチンとして非常に有用であり得る。
本発明において、細胞内に導入される生理活性物質である防御抗原とは、病原微生物（細菌、真菌、ウイルス等）の感染防御抗原となる該微生物由来蛋白、癌細胞特異的に発現する変異蛋白、あるいは免疫原性を保持したそれらのペプチド断片等の他、従来生ワクチンまたは不活化ワクチンとして使用される生弱毒性微生物またはその死菌などもすべて包含する。微生物由来蛋白としては、例えばＨＩＶ由来蛋白、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスの表面抗原、インフルエンザウイルスの表面抗原等が、また、癌細胞特異的変異蛋白としては、癌化細胞分化抗原蛋白等が挙げられる。該防御抗原は１種のみでも、複数の防御抗原を混合して使用してもよい。
本発明の抗原特異的なペプチドコンジュゲートを含む薬学的組成物は、経口剤、非経口剤のいずれでもよく、例えば外用剤の形態であってもよい。具体的には、例えば、防御抗原を、適当な軟膏基剤と混和して調製される軟膏剤や、あるいは粘着層を基剤として、防御抗原を該粘着層に植種する形に存在させるかもしくは該粘着層に埋め込む形で存在させて徐放放出が可能となるように設計された粘着テープ製剤が挙げられる。
軟膏剤の場合、軟膏基剤としてワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコン、植物油、ロウ等の油脂系基剤、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、オイセリン等の乳剤性基剤、マクロゴール類等の水溶性基剤などが例示される。また、必要に応じてパラオキシ安息香酸エステル類等の保存剤を添加してもよい。
防御抗原の経皮接種は、該軟膏剤を皮膚表皮に塗布することにより行うことができる。軟膏剤中の防御抗原含有量は、該軟膏剤を通常量塗布した際の投与量が、１種の抗原について０．１μｍｏｌ／ｃｍ2 〜１ｍｍｏｌ／ｃｍ2の範囲となるように調整されるのが好ましい。
防御抗原の経皮接種の特に好ましい態様は、本発明の粘着テープ製剤（「経皮吸収型テープ製剤」ともいう）であり、これは皮膚表皮に貼付するものである。本発明の粘着テープ製剤は、防御抗原が適度に徐放されるように設計されていると同時に、粘着層表面に植種されるかもしくは粘着層中に埋め込まれた該防御抗原が、少なくとも本来の防御抗原としての機能を保持する程度に安定に存在することが必要である。また、この粘着テープ製剤の粘着力は、表皮に十分接着するほどに強く設計されていることも重要である。使用される粘着剤は、防御抗原の抗原性を低下または変化させないことが必須であるが、上記の条件を充足する粘着剤であれば、アクリル系ポリマー粘着剤であっても、ゴム系ポリマー粘着剤であってもよい。特に、好適に用いられる粘着剤としては親水性ポリマーからなる粘着剤が挙げられる。
親水性ポリマーとしては、アラビアゴム，カルボキシメチルセルロースなどの水溶性天然高分子など、またビニルピロリドン、ビニルアルコール、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−メトキシエチルアクリレート、アクリル酸などの水溶性モノマーを重合してなるポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリメトキシエチルアクリレート、ポリアクリル酸など、さらにこれら水溶性モノマーの２種以上の共重合体が例示される。また本発明で求められる親水性を損なわない範囲内で、アクリル酸ブチルやアクリル酸−２−エキシヘキシルなどの疎水性モノマーが重合された粘着性高分子であってもよい。
粘着層には、さらに適度な粘着性を付与するために、親水性または水溶性の低分子物質を添加してもよい。親水性または水溶性の低分子物質としては、沸点が１００〜４００℃の高沸点液状化合物が挙げられる。その具体例として多価アルコール、糖アルコールなどが挙げられるが、この時タンパク質と反応して褐変反応（メイラード反応）など起こさない還元糖が好ましく用いられる。多価アルコールとしてはエチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、液状ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，１，１−トリヒドロキシプロパン、グリセリンなど還元糖としては、ソルビトール、ソルビタン、エリスリトール、キシリトール、トレハロースなどが挙げられる。
またグリセリンとエチレングリコールやプロピレングリコールとのエーテル型付加体であるポリオキシエチレングリセルエーテルやポリオキシプロピレンソルビトールエーテルやポリオキシエチレンソルビタンエーテルでもよい。これらの親水性又は水溶性低分子物質の使用量は、粘着層を形成する粘着剤の５〜９０重量％範囲で添加される。
本発明のテープ製剤で用いる柔軟なシート状の支持体は、取扱時破壊しない程度に十分な強度があれば特に材質は限定されないが、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリエーテル、ポリウレタン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどからなるプラスチックフィルムが好適に用いられる。
本発明の粘着テープ製剤は、例えば、上記の粘着性親水性ポリマーと親水性低分子物質を含有する水溶液または水／アルコール混合溶液に、防御抗原を必要な濃度で含むように調整された水分散液または水／アルコール混合分散液を加えてよく混合分散させた後、柔軟なシート状の支持体上に一定の厚さで塗布し、１０〜２００℃の範囲の適当な温度で乾燥することによって製造される。この時乾燥温度は、塗布した粘稠な分散液中の内容物の変質を防ぐためにはできるだけ低い温度が好ましく、通常３０〜１００℃の温度の範囲が用いられる。この方法で製造される粘着テープ製剤の粘着層は必要な濃度で、且つ均一に防御抗原を含有することになる。また、防御抗原の全体もしくは一部が、形成された粘着層に埋め込まれている形で存在しており、結果的に該防御抗原が適度に徐放されるように設計されることになる。また、本発明の粘着テープ製剤の別の製造方法としては、上記の粘着性親水性高分子と親水性低分子物質を含む水溶液または水／アルコール混合溶液をそのまま柔軟なシート状の支持体上に一定の厚さで塗布し、１０〜２００℃の範囲の適当な温度で乾燥させることによって、また必要に応じて架橋処理することによって、まず防御抗原を含有しない粘着テープを製造した後、防御抗原を必要な量で含むように調整された水分散液または水／アルコール混合分散液を、該粘着テープの粘着層表面に必要な防御抗原植種量になるように塗布し、水またはアルコールを蒸散乾燥させる方法が挙げられる。防御抗原を含む粘着層領域と、防御抗原を含まない粘着層領域を有する剤型の粘着テープ製剤は、上記２通りの製造方法を適当に組み合わせることにより製造することができる。
本発明の粘着テープ製剤は、通常、防御抗原量が、１種の抗原について０．１μｍｏｌ／ｃｍ2 〜１ｍｍｏｌ／ｃｍ2 の範囲で含まれるように設計調整されるのが好ましい。
本発明は更に、生理活性物質を細胞内に導入するための上記細胞透過性ペプチドの使用に関する。生理活性物質としては、核酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、多糖および糖蛋白質からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
以下、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
また、実験の概略を図３に示す。
実施例１
ペプチドライブラリの作製
全20種類のアミノ酸がランダムに並んだ「ランダム18a.a.ペプチドライブラリ」、およびHIVのTat蛋白質に由来するTatペプチド（13mer；Tat48-60）の一部がランダムなアミノ酸に置換された「TATペプチドライブラリ」を作製するため、PCR法を用い、全20種類のアミノ酸をコードするランダムな塩基配列（NNS配列；N=A/T/G/C、S=G/C）がアミノ酸18個分並んだ遺伝子ライブラリと、Tatペプチドの塩基コドンの一部がＮＮＳ配列に置換された遺伝子ライブラリを調製した。
ランダム18a.a.ペプチドライブラリ作製にはプライマー、oligo-1（5’-GATTACGCCAAGCTTTGGAGCCTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC -3’；配列番号１８）およびoligo-2（5’- CGGCGCACCTGCGGCCGCSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNGGCCATGGCCGGCTGGGCCGCATAGAAAGG-3’ ；配列番号１９）を用い、pY03’ FLAG（pUC18プラスミドにFLAG発現コドンを組み込んだもの）をテンプレートとしてアニーリング温度を65℃で1分、伸長反応を68℃で1分に設定し、KOD-plus-DNA Polymerase（東洋紡株式会社）を用いてPCRを35サイクル行った。
TAT.ペプチドライブラリ作製にはプライマー、oligo-1（5’- GATTACGCCAAGCTTTGGAGCCTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC-3’；配列番号１８）およびoligo-3（5’-CGGCGCACCTGCGGCCGCSNNSNNCGGSNNSNNSNNCTGSNNSNNSNNSNNSNNSNNACCGGCCATGGCCGGCTGGGCCGCATAGAAAGG -3’ ；配列番号２０）を用い、pY03’ FLAGをテンプレートとしてアニーリング温度を65℃で1分、伸長反応を68℃で1分に設定し、KOD-plus-DNA Polymeraseを用いてPCRを35サイクル行った。
これらのPCR産物をPCR purification kit（Qiagen companies）で精製した。得られたPCR産物をHindIIIおよびNotI（東洋紡株式会社）で処理し、あらかじめHindIIIおよびNotIで処理したファージミドベクターpY03’FLAGとT4 ligase（Roche Diagnostics）を用いて16℃、16時間ライゲーション反応を行った。あらかじめ2YT培地（Invitrogen TM life technologies）30mLでOD600=0.4まで培養し、ミリQ水で3回洗浄操作を行い、10%グリセロール溶液で200μLに懸濁し氷冷しておいた大腸菌TG1（Stratagene（登録商標））に対して、精製後の溶液10μLを添加し、Gene purser（登録商標）II（Bio-Rad Laboratories,Co.,Ltd.）を用い、2.5kV、0.25μF、200Ωでエレクトロポレーションを行った。その後、2%グルコース含有2YT培地を添加し、1時間培養した後、一部をとって50μg/mLアンピシリン（Sigma-Aldrich,Inc.）、2%グルコース含有2YT培地で段階希釈した後、クロンディスク（Clontech Laboratories, Inc.）に播種し、一晩培養した。
シークエンス解析
得られたコロニーから任意に選択した各クローンのプラスミドをQIAprep（登録商標） Miniprep kit（QIAGEN）を用いて回収し、DNA sequencing Kit（Applied Biosystems）および5x Sequencing Buffer（Applied Biosystems）を用いてシークエンス反応を行った。その後、PERFORMA Gel Filtration Cartridge（Edge Bio Systems）を用いて精製し、減圧加熱により乾燥させた。シークエンス解析はABI PRISM 310（Applied Biosystems）により行った。
ファージの作製
作製した２つのライブラリ遺伝子をそれぞれ組み込んだファージミドベクターpCANTAB5E（アマシャムバイオサイエンス社製）を大腸菌TG1にエレクトロポレーションし、その適量を50μg/mLアンピシリン、2%グルコース含有LBプレートに播種し、37℃で一晩培養した。50μg/mLアンピシリン、2%グルコース含有2YT培地を加えてコロニーをすべて回収し、250rpm 37℃でOD600=0.3まで培養した。M13KO7ヘルパーファージ（Invitrogen TM life technologies）を添加し、110rpm 37℃で30分間、250rpm 37℃で30分間培養した後、2,000rpmで10分間遠心し、得られたペレットに対して50μg/mLアンピシリン、100μg/mLカナマイシン（Sigma-Aldrich,Inc.）含有2YT培地を添加して6時間培養することで、ペプチドを表面提示したファージを調整した。
ファージの精製
ファージ粒子を含むTG1培養液を4℃ 2,000rpmで10分間遠心し、上清を回収した。さらに10,000rpmで15分間遠心し、回収した上清に氷冷した20% PEG-8,000（和光純薬株式会社）、2.5M NaCl（和光純薬株式会社）を1/5 volume加え、激しく混和して氷上で2〜3時間静置した。次いで15,000rpmで10分間遠心して得られたファージペレットをNTE Buffer（100mM NaCl、10mM Tris、1mM EDTA）に懸濁し、0.45μmのMillex（登録商標）-HV（MILLIPORE）を用いてフィルターろ過して精製ファージ溶液とした。
セルパンニング
A431細胞（ヒト表皮細胞）を用いて各ライブラリについてパンニングを行った。6穴プレート（NUNCTM）にA431細胞を5.0x105cells/wellで播種し、37℃、飽和蒸気圧、5%炭酸ガス気相下で24時間培養した。PBSで3回洗浄した後、Opti-MEM（Invitrogen TM life technologies）で希釈した2%ウシ血清アルブミン（BSA）を用いて37℃で2時間ブロッキングした。精製したファージについても等量の2%BSAを用いて4℃で1時間ブロッキングした。ブロッキングが終了したファージをA431細胞に加え、15分ごとに振とうしながら37℃で2時間培養した。細胞をPBSで20回洗浄した後、50mM HCl 1mLを加えて4℃で10分間培養した。このファージ溶出液を回収し、1M Tris-HCl pH8.0 500μLを添加した後、その50μLを用いて下記の方法に従いタイターを測定した。残りのファージ溶液は2%グルコース含有2YT培地を4.5mL加えて再度TG1に感染させ、増幅させて上記のファージ作製法に準じてファージを産出し、再度同様のパンニング操作を行ったものを2nd、3rd、4thパンニングとした。
タイター(titer)の測定
2%グルコース含有2YT培地でOD600=0.3まで培養したTG1に対して、10倍希釈で段階希釈したファージ溶液を添加し、37℃で1時間培養した。培養液の一部に50μg/mLアンピシリン、2%グルコース含有2YT培地を添加し、クロンディスクに播種し一晩培養した。各希釈段階でのコロニー数を計測することで、inputファージおよびoutputファージのタイターを算出した。
上述のように、新たな細胞内移行ペプチドを創製するために、18個のアミノ酸をランダムに並べたランダム18a.a.ペプチドライブラリとTatペプチド (Tat 48-60) の一部のアミノ酸を置換したTATペプチドライブラリを作製した。20種類のアミノ酸をコードし得るNNS配列を導入したプライマーを用いてPCRを行い、PCR断片をファージミドベクターに組み込んだ。このベクターを大腸菌TG1に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、多様な種類のペプチドを、ファージマイナー外殻蛋白質であるg3pの先端に発現するファージライブラリを作製した。ライブラリから任意にピックアップしたクローンのDNAシークエンスを解析した結果、独立したクローンで構成されていることを確認した。
細胞内移行能を有するペプチドをスクリーニングするため、作製した各ファージライブラリについて、A431細胞（ヒト表皮細胞）に対するパンニングを行った。パンニングを繰り返すにつれ、細胞に結合する、あるいは細胞内へ侵入する能力をもつクローンが選択・濃縮されていることを確認した。また、一般的にPTDは塩基性アミノ酸を多く含むという特徴を有しているが、パンニングによって濃縮された各クローンは塩基性アミノ酸とともに、トリプトファン（W）を多く含むことが明らかとなった。
４ｔｈパンニング後のペプチドライブラリから任意にピックアップしたものは、下記表１に示すように、塩基性アミノ酸であるリシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）だけでなく、疎水性アミノ酸であるトリプトファン（Ｗ）に富んでいた。
Figure 0004596391
PSIF発現ベクターへの組換え
作製したライブラリ（input）および2nd、3rd、4thパンニング後のライブラリから回収したプラスミドをNcoI（東洋紡株式会社）およびNotIで処理した。あらかじめNcoIおよびNotIで処理したPSIF発現ベクターpY7（pCantab5eにPSIF発現コドンを組み込んだもの）にライゲーションキットVer.2（宝酒造株式会社）を用いて組み込むことで、ペプチドとPSIFとの融合体を発現するプラスミドを構築した。PSIF（蛋白質合成阻害因子）としては、ジフテリアトキシン（GenBank; A04646）もしくは緑膿菌菌体外毒素（GenBank; K01397）の蛋白質合成阻害活性領域などを利用した。
ペプチドとPSIFとの融合体を含む培養上清の作製
ペプチドとPSIFとの融合体を発現するプラスミドをTG1にエレクトロポレーションにより導入し、得られたコロニーを96穴プレート（NUNCTM）へランダムにピックアップして一晩培養した。50μg/mLアンピシリン、2%グルコース含有2YT培地100μLを新たに添加したプレートに、一晩培養した培養液10μLを添加し、OD600=0.4〜0.5まで培養した。3,000rpmで20分間遠心した後、上清を除き1mM IPTG（Sigma-Aldrich,Inc.）、50μg/mLアンピシリン含有2YT培地200μLを添加し、37℃で12時間培養した。再び3,000rpm 20分間遠心し、得られた上清を以降のスクリーニングに供した。
ペプチドの細胞内移行能の評価（PSIFによる細胞傷害性試験；MTT assay）
96穴プレートにOpti-MEM（Invitrogen TM life technologies）で1.0x104cells/wellに希釈したA431細胞を播種し、終濃度10μg/mLになるようにシクロヘキシミド（和光純薬株式会社）を添加した。次いで、上記の方法に従って作製した培養上清をそれぞれ5μLずつ加え、37℃、飽和蒸気圧、5%炭酸ガス気相下で24時間培養した。その後、5mg/mLのMTT（和光純薬株式会社）溶液を10μL/well加え、さらに37℃で4時間培養した。20% SDS（和光純薬株式会社 Osaka, Japan）/0.01N HClを100μL/well加えて暗所で4時間静置し、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定し（Test wave length;595nm/Reference wave length;655nm）、ペプチドによって細胞内に導入されたPSIFによる細胞傷害性を指標にペプチドの細胞内移行能を評価した。ViabilityはTATペプチド（Tat 48-60）とPSIFとの融合体を含む培養上清を作用させた群を100%として算出した。
上述のように、各ライブラリ遺伝子を蛋白質合成阻害因子であるPSIF発現ベクターに組換え、ペプチドとPSIFとの融合体を用い、PSIFによる細胞傷害性を指標にペプチドの細胞内移行活性を評価した。PSIF自体は細胞内への移行能をもたないため、ペプチドが細胞内移行活性をもたない限り細胞傷害性を示さない。ペプチドとPSIFとの融合体を産生した大腸菌培養上清を用いてスクリーニングを行った結果、パンニングを繰り返すにつれ、細胞内へ侵入する能力をもつクローンが選択・濃縮されていることが判明した。さらに、現在最も導入効率に優れていると言われるTATペプチドよりも導入効率の高いクローンを多数得ることに成功した。
得られたペプチド配列およびViabilityを下記に示す。
Figure 0004596391
図１は、ファージ表面提示法の原理を示す。 図２は、セルパンニングの原理を示す。 図３は、実施例１の実験の概略を示す。

Claims (6)

  1. 配列番号１〜３及び５〜１６からなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチド。
  2. 配列番号１、５、６、７、９、１０、１１、１５および１６からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載のペプチド。
  3. 配列番号１〜３及び５〜１６からなる群から選ばれる少なくとも１種のペプチドのＮ末端及びＣ末端のいずれかに１つのＣｙｓ残基が、又はＮ末端及びＣ末端の両方にそれぞれ１つのＣｙｓ残基が、Ｎ末端にはＣｙｓ又はＣｙｓ−Ｇｌｙの様式で、Ｃ末端にはＣｙｓ又はＧｌｙ−Ｃｙｓの様式で付加してなるペプチド。
  4. 請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドと生理活性物質とを直接的にまたは架橋剤を介して間接的に連結してなるペプチドコンジュゲート。
  5. 請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドと、細胞性免疫及び体液性免疫の少なくとも一方を高められる抗原とを、直接的にまたは架橋剤を介して間接的に連結してなるペプチドコンジュゲートを含むワクチン。
  6. 請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド又は請求項４に記載のペプチドコンジュゲートを含む経粘膜吸収用製剤。
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