MXPA06009897A - Composiciones y metodos para el diagnostico topico y el transporte terapeutico. - Google Patents

Composiciones y metodos para el diagnostico topico y el transporte terapeutico.

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Michael D Dake
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Abstract

Se proporcionan composiciones y metodos que son utiles para la administracion, incluyendo la administracion transdermica de agentes biologicamente activos, tales como agentes terapeuticos que no son proteinas, no son nucleotidos y agentes terapeuticos basados en proteinas excluyendo insulina, toxinas de botulina, fragmentos de anticuerpos y VEGF. Las composiciones y metodos son particularmente utiles para la administracion topica de agentes antimicoticos y agentes antigenicos adecuados para la inmunizacion. Alternativamente, se pueden preparar composiciones con componentes utiles para enviar al objetivo la administracion de composiciones, asi como componentes de elaboracion de imagen.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL DIAGNOSTICO TÓPICO Y EL TRANSPORTE TERAPÉUTICO REFERENCIAS CRUZADAS CON SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama la prioridad sobre la Solicitud de Patente Norteamericana No. 60/550,014 presentada en Marzo 3, 2004 cuyo contenido está incorporado en su totalidad a la presente descripción como referencia. DECLARACIÓN CON RESPECTO A LOS DERECHOS DE LA INVENCIÓN HECHA BAJO UNA INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO PATROCINADO FEDERALMENTE No aplicable Antecedentes de la Invención La piel protege los órganos del cuerpo de las amenazas ambientes externas y actúa como un termostato para mantener la temperatura del cuerpo. Consiste de varias capas diferentes, cada una con funciones especializadas. La capa principal incluye la epidermis, la dermis y la hipodermis. La epidermis es una capa de estratificación de las células del epitelio que se encuentra encima de la dermis, la cual consiste del tejido conectivo. Tanto la epidermis como la dermis son soportadas además por la hipodermis, como una capa interna de tejido adiposo. La epidermis, la capa superior de la piel, tiene solamente un espesor de 0.1 a 1 .5 milímetros (Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, páginas de la 1 a la 7 (1998). Consiste de queratinocitos y está dividida en varias capas basadas en su condición de diferenciación. La epidermis puede ser clasificada además en el corneo del estrato y la epidermis viable, la cual consiste del melpigiano granular y las células básales. El corneo del estrato es higroscópico y requiere por lo menos 10 en peso % de humedad para mantener flexibilidad y suavidad. La higroscopicidad se atribuye, en parte, a la capacidad de mantener el agua de la queratina. Cuando la capa coratinosa que es de suavidad y flexibilidad se convierte en áspera y quebradiza, da como resultado la piel seca. La dermis, la cual reside justamente debajo de la epidermis, tiene un espesor de 1 .5 a 4 milímetros. Es la más gruesa de las capas de la piel. Además, la dermis también aloja la mayor parte de las estructuras de la piel, incluyendo las glándulas sudoríficas y de grasa (las cuales secretan substancias a través de las aberturas de la piel denominadas poros o comedos), los folículos del cabello, los extremos de los nervios y los vasos sanguíneos y de la linfa (Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, páginas 1 a 7 (1998)). Sin embargo, los componentes principales de la dermis son el colágeno y la elastina. La hipodermis es la capa más profunda de la piel. Actúa tanto como un aislante para la conservación de calor del cuerpo, como un absorbente de choques para la protección de órganos (Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, páginas 1 a 7 (1998)). Además, la hipodermis también almacena la grasa para las reservas de energía. El pH de la piel generalmente es entre 5 y 6. La acidez se debe a la presencia de ácidos amino amfotéricos, ácido láctico y ácidos grasos de las secreciones de las glándulas sebáceas. El término "capa acida" se refiere a la presencia de substancias solubles en agua en la mayor parte de las regiones de la piel. La capacidad de amortiguamiento de la piel, se debe en parte a estas secreciones almacenadas en la capa queratinosa de la piel. Las arrugas, uno de los signos del envejecimiento de acuerdo con los cortos, puede ser ocasionada por cambios bioquímicos, histológicos y fisiológicos que se acumulan del daño ambiental (Publicación de Benedetto, en International Journal de Dermatology, 38: páginas 641 a 655 (1999)). Además, existen otros factores secundarios que ocasionan los dobleces, surcos y pliegues de las arrugas faciales (libre de Stegman et al., "La Piel de la Cirugía Dermatológica Cosmética del Envejecimiento de la Cara" (Stegman et al. , The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Sugery, 2a ed., St. Louis, MO: Mosby Year Book: páginas 5 a 15 (1990)). Estos factores secundarios incluyen ei jalado constante de la gravedad, la presión de la posición frecuente y constante sobre la piel (es decir, durante el sueño), movimientos faciales repetidos ocasionados por la contracción de los músculos faciales (libro de Stegman et al., "La Piel de la Cirugía Dermatológica Cosmética del Envejecimeinto de la Cara" (Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Sugery, 2a ed., St. Louis, MO: Mosby Year Book: páginas 5 a 15 (1990)). Se han utilizado técnicas diferentes con el objeto de molificar potencialmente algunos de los signos del envejecimiento. Estas técnicas se encuentran en un rango de los humectantes faciales que contienen ácidos alfa hidroxi y retinol hacia los procedimientos quirúrgicos e inyecciones de neurotoxinas. Una de las funciones principales de la piel es proporcionar una barrera al transporte de agua y substancias potencialmente peligrosas para la homeostatis normal. El cuerpo se deshidrataría rápidamente sin una piel semipermeable y firme, la piel ayuda a evitar la entrada de las substancias peligrosas en el cuerpo. Aunque la mayor parte de las substancias no pueden penetrar la barrera, se han desarrollado un número de estrategias para aumentar de manera selectiva la permeabilidad de la piel con un éxito variable. Debido aque el agente terapéutico no nucleótido ni proteína, tal como los antimicóticos no pueden penetrar eficientemente en la piel con el objeto de proporcionar los efectos terapéuticos de los agentes antimicóticos, deben de ser inyectados en la actualidad en la piel o administrados sistémicamente. La Administración Federal de Alimentos y Fármacos ha aprobado dicho procedimiento para el tratamiento de la infección micótica. En dichos tratamientos, el agente antimicótico es administrado mediante una inyección o dosificación monitoreada. Sin embargo, dicho tratamiento puede causar efectos laterales adversos. La aplicación tópica de agentes antimicóticos proporciona una administración local para un tratamiento más deseable y más seguro el cual es una alternativa, debido a la naturaleza indolora de la aplicación, la capacitación reducida para aplicar la terapéutica antimicótica, dosificaciones más pequeñas necesarias para afectar y para alcanzar el resultado clínico terapéutico y para limitar los efectos laterales generalmente asociados con la administración sistémica. Debido a que los agentes antigénicos adecuados para la inmunización no pueden penetrar en la piel de manera eficiente, con el objeto de proporcionar los efectos terapéuticos de los agentes antigénicos adecuados para la inmunización, las toxinas deben de ser inyectadas actualmente. La Administración Federal de Alimentos y Fármacos ha aprobado dicho procedimiento para el tratamiento de, por ejemplo, la malaria, rabia, ántrax, tuberculosis o inmunizaciones relacionadas con la infancia, tales como contra hepatitis B, difteria, tosferina, tétanos, influenza por el Haemophilus tipo b, virus de la polio inactivado, viruelas, sarampión, rubéola, varicela, neumococos, hepatitis A e influenza. En dichos tratamientos, el agente antigénico para inmunización es administrado mediante una inyección monitoreada. Sin embargo, dicho tratamiento debe ser incómodo y más generalmente comprende algo de dolor. La aplicación tópica del agente antigénico para la inmunización proporciona una alternativa de tratamiento más segura y deseable debido a su naturaleza de aplicación indolora y un área de superficie más grande de tratamiento que puede ser cubierta, la capacitación reducida para aplicar el terapéutico, las dosis más pequeñas necesarias para afectar y alcanzar el resultado clínico terapéutico. La administración transdérmica de otros terapéuticos también es un área de gran interés debido a, por ejemplo, el potencial de disminución de la incomodidad del paciente, la administración directa de agentes terapéuticos en la corriente sanguínea y las oportunidades de administración monitoreada por medio de grupos de aparatos construidos especialmente y/o de formulaciones de liberación controlada y técnicas. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona métodos y composiciones que se pueden aplicar ampliamente a las composiciones de agentes terapéuticos y cosméticos diversos que pueden ser enviados al objetivo o elaborados en imágenes para maximizar la administración a un tipo particular. La presente invención se relaciona además con formulaciones para la administración transdérmica de proteínas diferentes a la insulina, la toxina de botulino, fragmentos de anticuerpos y VEGF preferentemente aquellos que tienen un peso molecular menor de 20,000 kD. Dichos agentes basados en proteínas pueden incluir, por ejemplo, un antígeno adecuado para la inmunización. En otro aspecto, la presente invención se refiere a formulaciones para la administración transdérmica de agentes terapéuticos que no son nucleótidos ni proteínas tales como por ejemplo, ciertos antimicóticos. La invención excluye especialmente la insulina, las toxinas botulínicas, el VEGF y fragmentos de anticuerpos cuando es empleado el término "terapéuticos" o "proteína biológicamente activa". Debido a que los antígenos adecuados para la inmunización tienen otras actividades biológicas, tales como el montaje de una respuesta inmune, estos permanecen incluidos en los aspectos apropiados de la presente invención. La presente invención se refiere además a formulaciones para la administración transdérmica de un agente terapéutico que no es nucleótido ni proteína, tales como antimicóticos. Los agentes antimicóticos adecuados incluyen, por ejemplo, amfotericina B, fluconazol, flucitosina, itraconazol, quetoconazol, clotpmazol, econozol, griseofulvina, miconazol, nistatina o ciclopirox y similares. Esta invención se refiere además a formulaciones para la administración transdérmica de agentes antigénicos adecuados para la inmunización que pueden ser agentes nucleótidos que no son proteínas, antígenos basados en proteínas o híbridos de los mismos. Los antígenos adecuados incluyen por ejemplo, aquellos para los agentes ambientales, patógenos o bioamenazas. Los agentes adecuados preferentemente incluyen, por ejemplo, la malaria, la rabia, el ántrax, la tuberculosis o las inmunizaciones relacionadas con la infancia, tales como contra la hepatitis B, difteria, tosferina, tétanos, influenza por Haemophilus tipo b, virus de la polio inactivado, viruela, sarampión, rubéola, varicela, neumococos, hepatitis A e influenza. Dichos antígenos adecuados para la inmunización tienen otras actividades biológicas, tales como el montaje de una respuesta inmune, permaneciendo incluidos en los aspectos apropiados de la presente invención. Los agentes que no cruzan realmente la piel son substancialmente más pequeños que por ejemplo, la insulina (más preferentemente agentes de tamaño menor de 20,000 kD - o que tienen propiedades fisicoquímicas diferentes que pueden ser administrados a través de todavía otro aspecto de la presente invención. Específicamente, los antígenos deseables para las inmunizaciones pueden ser transportados por la piel sin inyección a través de la presente invención. El resultado presenta una alternativa libre de inyección para las inmunizaciones de la infancia y potencialmente bioamenazas importantes o amenazas ambientales. Además, el terapéutico que no es nucleótido ni proteína, tales como ciertos agentes antimicóticos, por ejemplo, se han caracterizado por una penetración tópica deficiente particularmente para infecciones micóticas, tales como la oncomicosis o la infección de las uñas de los dedos y las placas de las uñas. Por consiguiente, la presente invención se refiere además a las formulaciones tópicas para administración transdérmica de substancias terapéuticas y de diagnóstico, que incluyen proteínas particularmente aquellas que tienen un peso molecular menor de 20,000 kD y otros agentes activos biológicamente tales como, por ejemplo, un agente terapéutico que no es nucleótido ni proteína, tal como ciertos antimicóticos o alternativamente un agente de inmunización. Dichos antígenos adecuados para la inmunización tienen otras actividades biológicas, tales como el montaje de una respuesta inmune y éstos permanecen incluidos en los aspectos apropiados de la presente invención. Los agentes antimicóticos adecuados incluyen, por ejemplo, amfotericina B, fluconazol, flucitosina, itraconazol, quenaconazol, clotrimazol, econozol, griseofulvina, miconazol, nistatina o ciclopirox y similares. Los agentes adecuados incluyen preferentemente, por ejemplo, agentes contra la malaria, la rabia, ántrax, tuberculosis e inmunizaciones relacionadas con la infancia, tales como contra la hepatitis B, difteria, tosferina, tétanos, influenza por Haemophilus tipo b, virus de la polio inactivado, viruela, sarampión, rubéola, varicela, neumococos, hepatitis A e influenza. La presente invención proporciona una composición que tiene una proteína biológicamente activa y un vehículo. El vehículo incluye una estructura polimérica que tiene adherida a la misma en los ramificación cargados de manera positiva y está presente en una cantidad efectiva para la administración transdérmica. La asociación entre el vehículo y la proteína activas biológicamente no es covalente. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición que contiene un agente biológicamente activo que no es nucleótido ni proteína y un vehículo. El vehículo incluye una estructura polimérica que tiene adherida la estructura de la misma grupos de ramificación cargados positivamente y está presente en una cantidad efectiva para la administración transdérmica. La asociación entre el vehículo y el agente activo biológicamente que no es proteína ni nucleótido no es covalente. Todavía otro aspecto de la presente invención es proporcionar un equipo para la administración de una proteína biológicamente activa a un sujeto. El equipo incluye un aparato para la administración de la proteína activa biológicamente a la piel o epitelio del sujeto y una composición que tiene un vehículo polimérico con grupos de ramificación cargados positivamente adjuntos a la misma. Los grupos de ramificación cargados positivamente pueden ser seleccionados de -(gly)n?-(arg)n2, VIH-TAT y fragmentos de los mismos y Antenapedia PTD y fragmentos de los mismos, en donde el subscrito n1 es un entero de 0 a aproximadamente 20 y el subscrito n2 es independientemente un número non de aproximadamente 5 a aproximadamente 25. La asociación entre el vehículo y la proteína biológicamente activa no es covalente. La presente invención proporciona también un método de administración de una proteína biológicamente activa a un sujeto. El método incluye la aplicación tópica a la piel o epitelio del sujeto de la proteína en conjunto con una cantidad efectiva de un vehículo. El vehículo incluye una estructura polimérica que tiene adherido a la misma grupos de ramificación cargados positivamente. La asociación entre el vehículo y la proteína biológicamente activa no es covalente.
Adicionalmente, la presente invención proporciona un método de administración de un agente biológicamente activo que no es nucleótido ni proteína a un sujeto. El método incluye la aplicación tópica a la piel o el epitelio del sujeto de un agente biológicamente activo en conjunto con una cantidad efectiva de un vehículo. El vehículo puede incluir una estructura polimérica que tiene adherido a la misma grupos de ramificación cargados positivamente. La asociación entre el vehículo y el agente biológicamente activo no es covalente. Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición que contiene un antígeno adecuado para la inmunización y un vehículo. El vehículo incluye una estructura polimérica que tiene adherido a la misma grupos de ramificación cargados positivamente y están presentes en una cantidad efectiva para la administración transdérmica. La asociación entre el vehículo y el antígeno no es covalente. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un equipo para la administración de un antígeno adecuado para la inmunización a un sujeto. El equipo incluye un aparato para administrar el antígeno adecuado para la inmunización en la piel o epitelio y una composición con un vehículo. El vehículo incluye una estructura polimérica que tiene adherida a la misma grupos de ramificación cargados positivamente seleccionados de -(gly)ni-(arg)n2, VIH-TAT y fragmentos de los mismos y Antenapedia PTD, en donde el subscrito n 1 es un entero de 0 a aproximadamente 20 y el subscrito n2 es independientemente un entero non de aproximadamente 5 a aproximadamente 25. La asociación entre el vehículo y el antígeno no es covalente. Todavía otro aspecto de la presente invención es proporcionar un método de administración de antígeno adecuado para la inmunización a un sujeto. El método incluye la aplicación tópica a la piel o epitelio del sujeto del antígeno adecuado para la inmunización en conjunto con una cantidad efectiva de un vehículo. El vehículo contiene una estructura polimérica que tiene adherida a la misma grupos de ramificación cargados positivamente. La asociación entre el vehículo y el antígeno no es covalente. La presente invención también proporciona una composición que contiene una porción de elaboración de imagen y/o un agente de envío al objetivo y un vehículo. El vehículo incluye una estructura polimérica que tiene adherida a la misma grupos de ramificación cargados positivamente y está presente en una cantidad efectiva para la administración transdérmica. La asociación entre el vehículo, la porción de elaboración de imagen o el agente de envío al objetivo no es covalente. En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un complejo no covalente de: (a) una estructura cargada positivamente; y (b) por lo menos un miembro seleccionado de: i) una primera estructura cargada negativamente que tiene una pluralidad de porciones de elaboración de imagen adheridas o una pluralidad de porciones de elaboración de imagen cargadas negativamente; ii) una segunda estructura cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de envío al objetivo adheridos o una pluralidad de porciones de envío al objetivo cargadas negativamente; i¡¡) un agente biológicamente activo que no es nucleótido ni proteína iv) una proteína terapéutica que no es insulina, toxina de botulino, fragmentos de anticuerpo o VEGF. en donde el complejo es el portador de una carga positiva neta.
El agente biológico en este aspecto de la presente invención, puede ser ya sea un agente terapéutico o un agente cosmético. La invención estudia específicamente la insulina, las toxinas botulínicas, el VEGF y fragmentos de anticuerpos en donde se emplea el término "terapéutico" o "proteína biológicamente activa". Debido a que los antígenos adecuados para la inmunización tienen otras actividades biológicas, tales como el montaje de una respuesta inmune, éstos permanecen incluidos en los aspectos apropiados de la presente invención. Alternativamente, los agentes candidato pueden ser utilizados para determinar la eficacia in vivo de estos complejos no covalentes. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un complejo no covalente de una estructura cargada positivamente que tiene por lo menos adherido al mismo un grupo eficiente y un agente para la elaboración de imagen molecular, por ejemplo, un agente de elaboración de imagen óptica. Más preferentemente, en esta aplicación, el agente será enviado al objetivo a un agente particular para un efecto terapéutico y/o de diagnóstico. Por ejemplo, el agente de elaboración de imagen óptica puede estar asociado con una estructura cargada positivamente y un componente de melanona objetivo para la diagnosis tópica enviada al objetivo del melanoma. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la administración de un agente biológico a la superficie celular de un sujeto, comprendiendo dicho método, la administración a dicho sujeto de una composición tal y como se describió anteriormente. Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la preparación de una composición terapéutica o cosmética, comprendiendo el método la combinación de un componente de estructura cargada positivamente y al menos un elemento seleccionado de: i) una primera estructura cargada negativamente que tiene una pluralidad de porciones de elaboración de imagen adheridas o una pluralidad de porciones de elaboración de imagen cargadas negativamente; ii) una segunda estructura cargadas negativamente que tiene una pluralidad de agentes de envío al objetivo adheridos o una pluralidad de porciones de envío al objetivo cargadas negativamente; iii) un agente biológicamente activo que no es nucleótido ni proteína; iv) una proteína terapéutica diferente a la insulina, toxinas de butolino, VEGF y fragmentos de anticuerpo con un vehículo farmacéutico o cosmecéuticamente aceptable para formar un complejo no covalente que tiene una carga positiva neta. Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un equipo para la formulación de una composición de administración terapéutica o cosméutica, comprendiendo el equipo un componente de estructura cargado positivamente y por lo menos un componente seleccionado de los grupos del i) hasta el iv) anteriores, junto con instrucciones para la preparación de la composición de administración. Todavía en otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende un agente biológicamente activo tal como una proteína que tiene un peso molecular menor de 20,000 kD y otros agentes biológicamente activos tales como, por ejemplo, un agente terapéutico que no es nucleótido ni proteína, tal como ciertos antimicóticos alternativamente un agente para la inmunización y un vehículo que comprende una vehículo cargado positivamente que tiene una estructura que tiene la ramificación cargada positivamente o "grupos eficientes" todos aquí descritos. El agente biológicamente activo puede estar basado en proteínas (por ejemplo, una proteína que tiene un peso molecular menor de 20,000 kD), un agente terapéutico que no es nucleótido ni proteína (por ejemplo, ciertos agentes antimicóticos) o un antígeno para la inmunización. Los agentes antimicóticos adecuados incluyen, por ejemplo, amfotericina B, fluconazol, flucitosina, itraconazol, quetoconazol, clotrimazol, econozol, griseofulvina, miconazol, nistatina o ciclopirox y similares. Como se emplea en la presente descripción, los agentes antigénicos adecuados para la inmunización pueden ser antígenos basados en proteínas los cuales no alterar terapéuticamente los niveles de glucosa en la piel, agentes no nucleótidos ni proteínas o híbridos de los mismos. Por lo tanto, los agentes incluidos son por ellos mismos antígenos adecuados para la inmunización. Los antígenos adecuados incluyen, por ejemplo, aquellos para los agentes ambientales, patógenos y bioamenazas. Otros ejemplos de antígenos adecuados incluyen aquellos que pueden ser utilizados para las inmunizaciones contra la malaria, la rabia, el ántrax, la tuberculosis o aquellos relacionados con las inmunizaciones infantiles, tales contra la hepatitis B, difteria, tosferina, tétano, influenza por Haemophilus tipo b, virus de la polio inactivado, sarampión, viruela, rubéola, varicela, neumococos, hepatitis A e influenza. Más preferentemente, el vehículo cargado positivamente es un polipéptido de cadena larga cargado positivamente o un polímero no peptidilo cargado positivamente, por ejemplo, una polialquilénimina. Los agentes terapéuticos que no son nucleótidos ni proteínas y las proteínas que no tienen normalmente la capacidad de reticular la piel o el epitelio de manera apreciable [en relación con el complejo del mismo agente y los portadores de la presente invención] y que tienen un efecto terapéutico en la disminución de la glucosa en la sangre tienen una superficie que difiere ampliamente y propiedades fisicoquímicas que normalmente harían dudosa, ya sea una técnica que proporciona la administración transdérmica de, por ejemplo, insulina, serían aplicables a los terapéuticos que no son proteína y las proteínas. Sin embargo, los vehículos de la presente invención que tienen una estructura cargada positivamente con grupos de ramificación cargados positivamente, como aquí se describen, tienen de manera bastante sorprendente la capacidad de proporcionar la administración transdérmica de la proteína y los terapéuticos que no son proteína. Los vehículos particulares adecuados para la administración transdérmica de las proteínas particulares pueden ser identificados fácilmente utilizando pruebas, tales como las que se describen en los ejemplos. Dicha proteína puede, por ejemplo, ser una proteína pequeña que tiene un peso molecular menor de 20,000 kD. Como se usa en la presente descripción, la palabra "terapéutico" en el contexto de la glucosa en la sangre, se refiere a la disminución de los niveles de la glucosa en la sangre suficientes para aliviar síntomas agudos o signos de hiperglicemia, por ejemplo, en pacientes diabéticos. La presente invención también proporciona un método de preparación de una composición farmacéutica o cosmética que comprende la combinación de un vehículo que comprende un polipéptido cargado positivamente o un polímero no peptidilo cargado positivamente, tal como una polialquilénimina de cadena larga (en donde el polipéptido o polímero no peptidilo, tienen una ramificación cargada positivamente o grupos "eficientes" como aquí se definen, con un agente biológicamente activo tal como por ejemplo, una proteína que tiene un peso molecular menor de 20,000 kD. Alternativamente, el vehículo puede ser combinado con otros agentes activos biológicamente tales como, por ejemplo, un agente terapéutico que no es proteína ni nucleótido (por ejemplo, ciertos antimicóticos) o alternativamente un agente para la inmunización. La presente invención también proporciona un equipo para la preparación o formulación de una composición que comprende un vehículo y una substancia terapéutica, así como ingredientes adicionales que se necesitan para producir una formulación que se puede utilizar, o una premezcla que puede ser a la vez utilizada para producir dicha formulación. Dicho tipo puede consistir de un aplicador y otro aparato para la aplicación de las composiciones y componentes de la misma de acuerdo con los métodos de la presente invención. Como se usa en la presente descripción, "aparato" se puede referir, por ejemplo, a un instrumento o aplicador adecuado para la administración, la mezcla o la preparación de otra manera de las composiciones de acuerdo con los métodos de la presente invención. La presente invención también proporciona aparatos para la transmisión transdérmica de un agente biológicamente activo que está contenido dentro de una composición que incluye un vehículo que comprende un polipéptido cargado positivamente preferentemente de cadena corta a una longitud de cadena intermedia y otro vehículo polimérico no peptidilo de cadena larga que tiene una ramificación cargada positivamente o grupos "eficientes" como aquí se definen. Dichos aparatos pueden ser tan simples en su construcción como un parche para la piel o pueden ser aparatos más complicados que pueden incluir medios para abastecer y monitorear el abastecimiento de la composición y opcionalmente medios para monitorear el padecimiento del sujeto en uno o más aspectos, incluyendo el monitoreo de la reacción del sujeto a las substancias que están siendo suministradas. En otro aspecto de la presente invención, el aparato puede contener solamente un agente biológicamente activo terapéutico y un vehículo que puede ser aplicado por separado a la piel. Por consiguiente, la presente invención también comprende un equipo que incluye, tanto un aparato para la administración por medio de la piel con un material que contiene un vehículo o estructura cargado positivamente y que es adecuado para la aplicación a la piel o epitelio de un sujeto. En general, la presente invención también comprende un método para la administración de un agente biológicamente activo que incluye la administración tópica de una cantidad eficiente de un agente biológicamente activo en conjunto con un polipéptido cargado positivamente o un polímero no polipeptidilo, tal como una polialquilénimina que tiene grupos de ramificación cargados positivamente, como aquí se describen. El término "en conjunto con" significa que se administran dos componentes en un procedimiento de combinación, la cual puede comprender ya sea la combinación de los mismos en una composición la cual luego es administrada al sujeto o la administración de los mismos por separado, pero de una manera tal que actúan juntos para producir la administración requerida de una cantidad efectiva del agente biológicamente activo. Por ejemplo, una composición que contiene el vehículo cargado positivamente puede ser aplicada primero a la piel del sujeto, seguida por la aplicación de un parche u otro aparato en la piel que contiene el agente biológicamente activo. La presente invención también se refiere a métodos de aplicación del agente biológicamente activo a los tejidos del epitelio, incluyendo aquellos diferentes a las células de la piel epitelial, por ejemplo, células oftálmicas del epitelio o células del sistema gastrointestinal. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 proporciona una representación esquemática de los componentes utilizados en la presente invención. La figura 2 proporciona una representación esquemática de varias modalidades de la presente invención. Las figuras 3 y 4 representan los resultados de la administración transdérmica de un plásmido que contiene el transgen para la beta-galactosidasa de E. Coli, tal y como se describe en el Ejemplo 2. La figura 5 representa los resultados de la administración transdérmica de un plásmido que contiene un transgen para la beta-galactosidasa de E. Coli, tal y como se describe en el Ejemplo 3.
La figura 6 representa los resultados de la administración transdérmica de un plásmido que contiene el transgen de la beta-galactosidasa de E. Coli, tal y como se describe en el Ejemplo 4. La figura 7 representa los resultados de la administración transdérmica de la toxina de botulino, tal y como se describe en el Ejemplo 5. La figura 8 es una ilustración fotográfica de los resultados de la administración transdérmica de una toxina de botulino, tal y como se describe en el Ejemplo 6. La figura 9 es una ilustración fotográfica de los complejos de elaboración de imagen del Ejemplo 9 seguidos por la distribución en el campo de luz (paneles a y c) para células pigmentadas de melanoma con agentes de elaboración de imagen óptica fluorescentes (paneles b y d) para dos campos diferentes y diferentes magnificaciones (paneles a y b en 10X contra los paneles c y d en magnificaciones de 40X). La figura 10 es una ilustración fotográfica que muestra la tinción de NeutrAvidina positiva, tal y como se describe en el Ejemplo 10 en dos diferentes magnificaciones. Las Partes (a) y (b) de la figura 10a son en la magnificación 10X y las partes (c) y (d) son en la magnificación 20X. Las partes (e) y (f) de la figura 10(b) son en la magnificación de 20X para la tinción repetida. La figura 11 representa los resultados de la toxicidad relativa de las estructuras del vehículo, tal y como se describen en el Ejemplo 1 1.
La figura 12 representa los resultados de la eficiencia de la administración del gen transdérmico, tal y como se describe en el Ejemplo 1 1. La figura 13 es una ilustración fotográfica de la administración selectiva de la muestra de la elaboración de imagen óptica a las células CEA-positivas que muestran una imagen en el campo de brillo de la carcinoma del colon y un co-cultivo de fibroblastos (panel a) y la imagen de fluorescencia del carcinoma de colon (panel b), tal y como se describe en el Ejemplo 1 1. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un sistema basado en componentes para la administración persistente selectiva de un agente de elaboración de imagen y otros agentes terapéuticos. Las características individuales de las composiciones pueden ser seleccionadas para designar los componentes deseados en las formulaciones del lado de la cama. Adicionalmente, en un aspecto, las porciones de envío al objetivo específico y de elaboración de imagen están proporcionadas para que formen un complejo no covalente (preferentemente iónico) con una estructura positiva. Colocando estos componentes de una manera no covalente en el complejo, la presente invención elimina la necesidad de adherir componentes en ubicaciones precisas de una estructura positiva, en contraste con otras estrategias, las cuales aumentan la complejidad y el gasto y disminuyen la eficiencia a un nivel que todavía no se ha reportado una combinación exitosa, debido a las limitaciones esféricas. En otro aspecto de la presente invención, ciertas substancias pueden ser administradas de manera transdérmica mediante el uso de ciertos vehículos cargados positivamente solos, sin requerir la inclusión de una estructura negativa. En estos casos, la sustancia o el derivado del mismo tiene funcionalidades suficientes para asociarlas con los vehículos de la presente invención de una manera no covalente, preferentemente de manera iónica. El término "suficiente" en este contexto se refiere a una asociación que puede ser determinada, por ejemplo, el cambio en el dimensionamiento de la partícula o la espectrofotometría funcional contra los componentes solos. Se proporciona el entendimiento adicional de la presente invención haciendo referencia a la figura 1. En esta figura, los componentes se muestran como (1 ) una estructura sólida que tiene adherido grupos cargados positivamente (a los que también nos referimos como grupos de eficiencia mostrados como círculos obscurecidos adheridos a una barra oscurecida), por ejemplo, (Gly)ni-(Arg)n2 (en donde el subscripto n1 es un entero de 3 a aproximadamente 5 y el subscripto n2 es un entero non de aproximadamente 7 a aproximadamente 17) o campos TAT; (2) porciones de elaboración de imagen (triángulos abiertos adheridos a una barra de luz); (3) agentes de envío al objetivo y/o (4) agentes activos biológicamente (círculos abiertos adheridos a una barra de luz) tales como agentes terapéuticos que no son nucleótidos ni proteína o agentes terapéuticos basados en proteínas diferentes a la insulina, toxinas botulínicas, VEGF y fragmentos del anticuerpo; la figura 2 ilustra varios ejemplos de composiciones de componentes múltiples en donde los grupos son ilustrados tal y como se establece en la figura 1 . Por ejemplo, en la figura 2, se ilustra una primera composición de componentes múltiples en la cual una estructura cargada positivamente tiene asociada un componente de elaboración de imagen, un componente de envío al objetivo y un agente terapéutico. Se ilustra una segunda composición de componentes múltiples, la cual está diseñada para la elaboración de imagen diagnóstico/pronóstico. En esta composición, la estructura cargada positivamente se forma en un complejo tanto en los componentes de elaboración de imagen óptica como con los componentes de envío al objetivo, por ejemplo, reconociendo el melanoma para crear la plataforma de detección tópica del melanoma. La presente invención descrita con mayor detalle a continuación, proporciona un número de composiciones adicionales útiles en programas terapéuticos y de diagnóstico. Composiciones El término "agente biológicamente activo" como se usa en la presente descripción se refiere a un agente terapéutico que cura una enfermedad o alivia un problema relacionado con la salud (incluyendo, problemas relacionados con la salud que son evaluados subjetivamente y/o cosméticos). Por ejemplo, el agente biológicamente activo puede ser una proteína terapéutica, y en ciertas modalidades, preferentemente es una proteína con un peso molecular menor de 20,000 kD. Sin embargo, observar que la presente invención excluye específicamente, la insulina, las toxinas de botulino, el VEGF y fragmentos del anticuerpo, cuando es empleado el término "terapéutico" o "proteína biológicamente activa". Sin embargo, debido a que los antígenos adecuados para la inmunización tienen otras actividades biológicas, tales como el montaje de una respuesta inmune, estos permanecen incluidos en los aspectos apropiados de la presente invención. En otras modalidades de la presente invención, el agente biológicamente activo puede ser un agente que no es nucleótido ni proteína, (por ejemplo, ciertos agentes antimicóticos). Se proporcionan otros ejemplos no limitativos de los agentes biológicamente activos adecuados, tal y como se explica en la presente descripción. En todos los aspectos de la presente invención, la asociación de los vehículos tal y como aquí se describen y el agente biológicamente activo es mediante la interacción no covalente, la cual puede incluir, por ejemplo, interacciones iónicas, enlace de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o combinaciones de las mismas. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona una composición que comprende un complejo no covalente de: a) una estructura cargada positivamente; y b) por lo menos un elemento seleccionado de: i) una primera estructura cargada negativamente que tiene una pluralidad de porciones de elaboración de imagen adheridas o una pluralidad de porciones de elaboración de imagen cargadas negativamente; ii) una segunda estructura cargada negativamente que tiene adherida una pluralidad de agentes de envío al objetivo o una pluralidad de porciones de envío objetivo cargadas negativamente; iii) un agente biológicamente activo que no es nucleótido ni proteína; iv) una proteína terapéutica que no es insulina, toxinas botulínicas, VEG F y fragmentos del anticuerpo, en donde el vehículo portador es una carga positiva neta. En un grupo de las modalidades, la composición comprende por lo menos dos elementos seleccionados de los grupos de la i) a la iv). En otros grupos de modalidades, la composición comprende por lo menos un elemento de cada uno de los g rupos i) y ii) y uno seleccionado ya sea del iii) o del iv). Preferentemente, la estructura cargada positivamente tiene una longitud de aproximadamente 1 a 4 veces las longitudes combinadas de los elementos del grupo b). Alternativamente, la estructura cargada positivamente tiene una proporción de carga de aproximadamente 1 a 4 veces la carga combinada de los elementos del gru po b). En algunas modalidades, la densidad de la carga es uniforme y la longitud de las proporciones de carga son aproximadamente las mismas. Las proporciones de tamaño a tamaño (longitud) pueden ser determinadas basadas en estudios moleculares de los componentes o pueden ser determinadas de las masas de los componentes.
El término "cargado positivamente", significa que el vehículo tiene una carga positiva bajo por lo menos algunas condiciones de fase de solución, más preferentemente por lo menos bajo algunas condiciones compatibles fisiológicamente. Más específicamente, "cargado positivamente" como se usa en la presente descripción, significa que el grupo en cuestión contiene funcionalidades que son cargadas bajo todas las condiciones de pH, tales como amina cuaternaria o que contienen una funcionalidad la cual puede adquirir la carga positiva bajo ciertas condiciones de fase de solución, tales como cambios de pH en el caso de aminas primarias. Más preferentemente, "cargado positivamente" como se usa en la presente descripción se refiere a aquellas funcionalidades, que tienen el comportamiento de asociarse con los aniones en condiciones fisiológicamente compatibles. Los polímeros con una multiplicidad de porciones cargadas positivamente no necesitan ser homopolímeros, como lo podrán apreciar aquellos expertos en la técnica. Otros ejemplos de las porciones cargadas positivamente son bien conocidos en la técnica anterior y pueden ser empleados fácilmente, como lo podrán apreciar aquellos expertos en la técnica. Los vehículos cargados positivamente descritos en la presente invención los cuales por ellos mismos no tienen una actividad terapéutica representan compuestos novedosos los cuales tienen utilidad, por ejemplo, en composiciones y métodos tal como aquí se describen. Por lo tanto, en otro aspecto de la presente invención, se detallan estos componentes novedosos los cuales pueden incluir cualquier vehículo que comprenda una estructura cargada positivamente que tiene grupos de ramificación cargados positivamente adheridos tal y como aquí se describen, y los cuales no tienen por ellos mismos una actividad biológica terapéutica. La presente invención excluye específicamente fragmentos de anticuerpo cuando es empleado el término "terapéutico" o "proteína biológicamente activa". Sin embargo, debido a que los antígenos adecuados para la inmunización tienen otras actividades biológicas, tales como el montaje de una respuesta inmune, eso permanecen incluidos en los aspectos apropiados de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un agente biológicamente activo y un vehículo que comprende una estructura cargada positivamente. El agente biológicamente activo puede ser, por ejemplo, una proteína (particularmente aquella que tiene un peso molecular menor de 20,000 kD), un agente terapéutico que no es nucleótido ni proteína (tales como ciertos antimicóticos) o un agente de inmunización. El vehículo puede ser, por ejemplo, un polipéptido o polímero no peptidilo, cargado positivamente, el cual puede ser, ya sea un hetero- o un homopolímero tal como una polialquilénimina. El polipéptido o polímero no peptidilo puede tener una ramificación cargada positivamente, o grupos de "eficiencia" como aquí se definen. Cada agente terapéutico basado en proteína y agente terapéutico que no es nucleótido ni proteína tiene propiedades fisicoquímicas diferentes las cuales alteran las características del complejo total. Dichos vehículos cargados positivamente se encuentran entre los materiales que se describen más adelante como estructuras cargadas positivamente. La presente invención también proporciona un método de administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente biológicamente activo que comprende la aplicación a la piel o el epitelio del sujeto (el cual puede ser un humano u otro mamífero) el agente biológicamente activo y una cantidad de estructura cargada positivamente que tiene grupos de ramificación que son efectivos para proporcionar la administración transdérmica de la proteína al sujeto. En este método, la proteína y el vehículo cargado positivamente pueden ser aplicados como una composición de mezcla previa, o pueden ser aplicados por separado a la piel o el epitelio. Por ejemplo, la proteína puede ser un parche para la piel u otro aparato y el vehículo puede estar contenido en un líquido u otro tipo de composición que es aplicado a la piel antes de la aplicación del parche para la piel. Estructura cargada positivamente La estructura cargada positivamente (a la que también nos referimos como un "vehículo" cargado positivamente generalmente es una cadena lineal de átomos, ya sea con grupos en la cadena portadores de una carga positiva en un pH fisiológico o con grupos portadores de una carga positiva adherida a la cadena lateral que se extiende desde la estructura. Preferentemente, la estructura cargada positivamente misma no tendrá una actividad biológica terapéutica o enzimática. La estructura lineal es una estructura de hidrocarburos, la cual es en algunas modalidades, interrumpida por heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno, azufre, silicón y fósforo. La mayor parte de los átomos de la cadena de la estructura generalmente son de carbono. Adicionalmente, la estructura con frecuencia será un polímero de unidades de repetición (por ejemplo, aminoácidos, poli(etilenoxi), poli(propilenoamina), polialquilénimina, y similares) pero puede ser un heteropolímero. En un grupo de modalidades, la estructura cargada positivamente es una polipropilénamina en donde el número de átomos de nitrógeno amina están presentes como grupos de amonio (tetra-substituidos) portadores de una carga positiva. En otra modalidad, la estructura cargada positivamente es un polímero no peptidilo, el cual puede ser un hetero- o un homopolímero, tales como una polialquilénimina, por ejemplo, una polietilénimina o polipropilénimina, que tiene un peso molecular de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 2,500,000, preferentemente de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 1 ,800,000, y más preferentemente de aproximadamente 500,000 a aproximadamente 1 ,400,000. En otros grupos de modalidades, la estructura tiene adherida una pluralidad de porciones de cadena lateral que incluyen grupos cargados positivamente (por ejemplo, grupos amonio, grupos piridinio, grupos fosfonio, grupos sulfonio, grupos guanidinio o grupos amidinio). Las porciones de cadena lateral de este grupo de modalidades pueden ser colocadas en separaciones a lo largo de la estructura y que sean consistentes en separaciones o variables. Adicionalmente, la longitud de las cadenas laterales puede ser similar o diferente. Por ejemplo, en un grupo de modalidades, las cadenas laterales pueden ser lineales o cadenas de hidrocarburo ramificadas que tienen de uno a veinte átomos de carbono y que terminan en un extremo distante (lejos de la estructura) en uno de los grupos cargados positivamente observados anteriormente. En todos los aspectos de la presente invención, la asociación con el vehículo y el agente biológicamente activo es mediante una interacción no covalente, los ejemplos no limitativos de los cuales incluyen interacciones iónicas, enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o combinaciones de los mismos. En un grupo de modalidades, la estructura cargada positivamente es un polipéptido que tiene grupos múltiples de cadena lateral cargados positivamente (por ejemplo, lisina, arginina, ornitina, homoarginina y similares). Preferentemente, el polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 1 ,500,000, más preferentemente de aproximadamente 25,000 a aproximadamente 1 ,200,000, aún más preferentemente de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 1 ,000,000. Un experto en la técnica apreciará que cuando se utilizan grupos de aminoácidos en esta porción de la presente invención, las cadenas laterales pueden tener ya sea, la forma D- ó L-(configuración R ó S) en el centro del enlace. Alternativamente, la estructura puede ser un análogo de un polipéptido, tal como un peptoide. Ver, por ejemplo, las publicaciones de Kessler, Angew en Chem. Int. Ed. Engl. 32: página 543 (1993); Zuckermann et al. en Chemtracts-Macromol. Chem. 4: página 80 (1992); y Simón et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 89: página 9367 (1992)). Brevemente, un peptoide es una poliglicina en la cual la cadena lateral está enlazada a los átomos de nitrógeno de la estructura, en vez de los átomos de a-carbono. Igual que en el anterior, una porción de las cadenas laterales generalmente terminarán en un grupo cargado positivamente para proporcionar un componente de estructura cargado positivamente. La síntesis de los peptoides se describe, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,877,278. Como se usa el término en la presente descripción, las estructuras cargadas positivamente que tienen una construcción de estructura de peptoide son consideradas "no péptidos" ya que no están compuestos de aminoácidos que tienen cadenas laterales que ocurren de manera natural en las localizaciones de a-carbono. Una variedad de las estructuras puede ser utilizada empleando, por ejemplo, imitaciones estéricas o electrónicas de polipéptidos en donde los enlaces de amida del péptido son reemplazados por subrogados tales como enlaces éster, tioamidas (-CSNH-), tioamida inversa (-NHCS-), aminometileno (-NHCH2-) o metilénamino inverso (-CH2NH-), grupos ceto-metileno (-COCH2-), fosfinato (-PO2RCH2-), fosfonamidato y éster fosfonamidato (-PO2RNH-), péptido invertido (-NHCO-), trans-alqueno (-CR=CH-), fluoroalqueno (-CF=CH-), dimetileno (-CH2CH2-), tioéter (-CH2S-), hidroxietileno (-CH(OH)CH2-), metilenoxi (-CH2O-), tetrazol (CN4), sulfonamido (-SO2N H-), metilénsulfonamido (-CH RSO2N H-), sulfonamida invertida (-NHSO2-) y estructuras con malonato y/o subunidades gem-diamino-alquilo, por ejemplo, tal y como los revisan en la publicación de Fletcher et al. ((1 998) en Chem. Rev. 98: página 763) y detalladas por las referencias citadas en el mismo. Muchas de las substituciones anteriores dan como resultado estructuras de polímero aproximadamente isotérico en relación con las estructuras formadas de ácidos a-amino. En cada una de las estructuras proporcionadas anteriormente, las cadenas laterales pueden estar enlazadas para portar un grupo cargado positivamente. Por ejemplo, las estructuras enlazadas a sulfonamida (-SO2NH- y -N HSO2-) pueden tener grupos de cadenas laterales enlazados a los átomos de nitrógeno. De un modo similar, los enlaces hidroxietileno (-CH(OH)CH2-) pueden ser portadores de un grupo de cadena lateral enlazado a un substituyente hidroxi. Un experto en la técnica puede adaptar fácilmente otras químicas de enlace para producir grupos de cadenas laterales cargados positivamente utilizando, métodos sintéticos estándar. En una modalidad particularmente preferida, la estructura cargada positivamente es un polipéptido que tiene grupos de ramificación (a los que también nos referimos como grupos eficientes) que comprende -(gly)n?-(arg)n2, VI H-TAT o fragmentos de los mismos, o el campo de transducción de la proteína de Antenapedia, o un fragmento de la misma, en el cual el subscrito n 1 es un entero de 0 a 20, y más preferentemente de 0 a 8, y aún más preferentemente de 2 a 5, y el subscrito n2 es independientemente un entero non de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, más preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 17, y más preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 13. Las modalidades adicionalmente preferidas todavía son aquellas en las cuales, el fragmento VIH-TAT que tiene la fórmula (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q ó (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q en donde los subscritos p y q son cada uno independientemente un entero de 0 a 20, y el fragmento es enlazado a la estructura ya sea por medio de la terminal C o la terminal N del fragmento. Los fragmentos VIH-TAT preferidos son aquellos en los cuales los subscritos p y q son independientemente cada uno enteros de 0 a 8, más preferentemente de 2 a 5. En otra modalidad preferida, la cadena lateral cargada positivamente o el grupo de ramificación es el campo de transducción de la proteína de Antenapedia (Antp) (PTD), o un fragmento de la misma que retiene la actividad. Preferentemente, el vehículo cargado positivamente incluye grupos de ramificación cargados positivamente de cadena lateral en una cantidad de por lo menos aproximadamente el 0.05%, como un porcentaje del peso total del vehículo, preferentemente de aproximadamente el 0.05% a aproximadamente el 45% en peso, y más preferentemente de aproximadamente el 0.1 % a aproximadamente el 30% en peso. Para los grupos de ramificación cargados positivamente que tienen la fórmula -(gly)n?-(arg)n2, la cantidad más preferida es de aproximadamente el 0.1 % a aproximadamente el 25%. En otra modalidad particularmente preferida, la porción de la estructura es una polilisina y los grupos de ramificación cargados positivamente son enlazados a los grupos amino de la cadena lateral de lisina. La polilisina utilizada en esta modalidad particularmente preferida tiene un peso molecular de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 1 ,500,000, preferentemente de aproximadamente 25,000 a aproximadamente 1 ,200,000, y más preferentemente de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 1 ,000,000. Puede ser cualquiera de las polilisinas que se consiguen comercialmente (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, EUA) tales como, por ejemplo, polilisinas que tienen MW > 70,000, polilisinas que tienen un MW de 70,000 a 150,000, polilisinas que tiene de un MW de 150,000 a 300,000, y una polilisina que tiene un MW > 300,000. La selección de la polilisina apropiada dependerá de los componentes restantes de la composición y será suficiente proporcionar una carga positiva neta general a la composición para proporcionar una longitud que preferentemente es de aproximadamente una a aproximadamente cuatro veces la longitud combinada de los componentes cargados negativamente. Los grupos de ramificación cargados positivamente preferidos o los grupos de eficiencia incluyen, por ejemplo, -gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg(-Gly3Arg7) ó VIH-TAT. En otra modalidad preferida, la estructura cargada positivamente es una polialquilénimina de cadena larga tal como el polietilénimina, por ejemplo, una que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 ,000,000. Las estructuras o moléculas del vehículo cargadas positivamente que comprenden polipéptidos o polialquiléniminas, que tienen los grupos de ramificación descritos anteriormente, son compuestos novedosos y forman un aspecto de la presente invención. En una modalidad de la presente invención, solamente el vehículo cargado positivamente que tiene grupos de ramificación cargados positivamente es necesario para la administración transdérmica de la substancia activa (por ejemplo, un agente biológicamente activo, o un agente de elaboración de imagen/envío al objetivo). En una modalidad de este caso, el vehículo cargado positivamente es un polipéptido (por ejemplo, lisina, arginina, ornitina, homoarginina, y similar) que tiene múltiples grupos de cadena lateral cargados positivamente como se describieron anteriormente. Preferentemente, el polipéptido tiene un peso molecular de por lo menos aproximadamente 10,000. En otra modalidad, el vehículo cargado positivamente es un polímero no peptidilo, tal como una polialquilénimina que tiene múltiples grupos de cadena lateral cargados positivamente que tienen un peso molecular de por lo menos aproximadamente 100,000. Dichas polialquiléniminas incluyen, polietileno- y polipropiléniminas. En cualquier caso, para utilizarlo como un agente solo necesario para la administración transdérmica, la molécula de vehículo cargada positivamente incluye un grupo de ramificación o eficiencia cargado positivamente, que comprende -(gly)n?-(arg)n2, en el cual el subscrito n 1 es un entero de 0 a 20 más preferentemente de 0 a 8, y aún más preferentemente de 2 a 5, y el subscrito n2 es independientemente un número non de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, más preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 17, y aún más preferentemente de aproximadamente 7 a aproximadamente 13, VI H-TAT o fragmentos del mismo, o un PTD Antenapedia o fragmentos del mismo. Preferentemente, los grupos de ramificación o cadena lateral que tiene la fórmula general -(gly)n?-(arg)n2 como aquí se describe. Otras modalidades preferidas, son aquellas en las cuales los grupos de ramificación o eficiencia son fragmentos de VI H-TAT que tienen la fórmula (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q, ó (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q, en donde los subscritos p y q son cada uno independientemente un entero de 0 a 20 y el fragmento es enlazado a la molécula del vehículo, en cualquiera de la terminal-C o la terminal-N del fragmento. Los grupos de ramificación lateral pueden tener, ya sea la forma D- ó L-(configuración R ó S) en el centro del enlace. Preferentemente los fragmentos de VI H-TAT son aquellos en los cuales los subscritos p y q son cada uno independientemente enteros de 0 a 8, más preferentemente de 2 a 5. Otras modalidades preferidas son aquellas en las cuales los grupos de ramificación son grupos de PTD Antenapedia o fragmentos de los mismos que retienen la actividad del grupo. Estos son conocidos en la técnica, por ejemplo, a partir de la publicación de Consolé et al. , en J . Biol. Chem. 278: página 351 09 (2003). En una modalidad particularmente preferida, el vehículo es una polilisina con los grupos de ramificación cargados positivamente enlazados a los grupos amino de la cadena lateral de lisina. La polilisina utilizada en esta modalidad particularmente preferida puede ser cualquiera de las polilisinas que se consiguen comercialmente (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri , EUA), tales como, por ejemplo, polilisina q ue tiene MW > 70, 000, polilisina que tiene un MW de 70,000 a 1 50,000, polilisina que tiene un MW de > 1 50, 000 a 300, 000 y polilisina que tiene un MW > 300, 000. Sin embargo, preferentemente la polilisina tiene un MW de por lo menos aproximadamente 1 0, 000. Los grupos de eficiencia o de ramificación cargados positivamente preferidos incluyen , por ejemplo, -gly-gly-gly-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-(-Gly3Arg7), VI H-TAT o fragmentos del mismo, y PTD Aritenapedia o fragmentos de la misma. Otros componentes Además, del componente de estructura cargada positivamente, las composiciones de componentes múltiples de la presente invención , comprenden por lo menos un componente de los siguientes: i) una primera estructura cargada negativamente que tiene una pluralidad de porciones de elaboración de imagen enlazadas o una pluralidad de porciones de elaboración de imagen cargadas negativamente; ii) una segunda estructura cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de envío al objetivo enlazados o una pluralidad de porciones de envío al objetivo cargadas negativamente; iii) un agente biológicamente activo que no es nucleótido ni proteína; iv) una proteína terapéutica que no es insulina, toxinas botulínicas, VEGF y fragmentos de anticuerpos. En un aspecto relacionado aquí descrito, en algunas modalidades o composiciones de la presente invención, la estructura o vehículo cargado positivamente puede ser utilizado solo para proporcionar la administración transdérmica de ciertos tipos de substancias. Las combinaciones de los agentes biológicamente activos como aquí se describen tales como, por ejemplo, combinaciones terapéuticos que no son proteínas ni nucleótidos, tales como agentes antimicóticos o proteínas que no son insulina, toxina de botulino, VEGF y fragmentos de anticuerpo (particularmente aquellos que tienen un peso molecular menor de 20,000 kD) y agentes antigénicos adecuados para la inmunización también pueden ser empleados en estas composiciones. En un aspecto relacionado a la presente invención, algunas modalidades o composiciones incluirán un agente de elaboración de imagen, tal como un agente adecuado para la elaboración de imagen de resonancia magnética o elaboración de imagen óptica. Estas modalidades o composiciones pueden, por ejemplo, proporcionar una administración tópica de un agente de elaboración de imagen óptico para el melanoma. Las estructuras cargadas negativamente, cuando son utilizadas para ser los portadoras de las porciones de elaboración de imagen, porciones de envío al objetivo y agentes terapéuticos, pueden variar de las estructuras (similares a las aquí descritas) las cuales tienen grupos múltiples portadores de una carga negativa en pH fisiológico. Alternativamente, las porciones de elaboración de imagen, porciones de envío al objetivo y agentes terapéuticos con suficientes porciones de la superficie cargadas negativamente no requerirán el enlace a una estructura adicional para la formación del complejo iónico con las estructuras cargadas positivamente, como lo podrá apreciar fácilmente un experto en la técnica. La palabra "suficiente" en este contexto incluye que esté presente una densidad adecuada de grupos cargados negativamente en las superficies de las porciones de elaboración de imagen, porciones de envío al objetivo o agentes terapéuticos para proporcionar una atracción iónica con las estructuras cargadas positivamente anteriormente descritas. En estos casos, la substancia o derivado de las mismas tienen una carga negativa suficiente para asociarlas con los vehículos cargados positivamente de la presente invención de una manera no covalente. Alternativamente, se pueden emplear otras porciones no cargadas hasta una densidad suficiente para proporcionar la asociación no covalente no iónica con las estructuras del vehículo de la presente invención, como lo podrá apreciar un experto en la técnica. El término "suficiente" en el contexto de las interacciones no covalentes no iónicas o iónicas puede ser determinada, por ejemplo, mediante un cambio en el dimensionamiento de la partícula o la espectrofotometría funcional contra los componentes solos. Los grupos cargados negativamente adecuados son ácidos carboxílicos, ácidos fosfínicos, fosfónicos o fosfóricos, ácidos sulfónicos o sulfónicos y similares. En otras modalidades, la estructuras cargada negativamente es un oligosacárido (por ejemplo, dextrano). Todavía en otra modalidad, la estructura cargada negativamente es un polipéptido (por ejemplo, un ácido poli glutámico, ácido poli aspártico, o un polipéptido en el cual los residuos de ácido glutámico o ácido aspártico son interrumpidos por los aminoácidos no cargados). Las porciones descritas con mayor detalle más adelante (porciones de elaboración de imagen, agentes de envío al objetivo y agentes terapéuticos) pueden ser enlazadas a la estructura que tienen más de un grupo pendiente, generalmente por medio de los enlaces éster. Alternativamente, los aminoácidos los cuales interrumpen los aminoácidos cargados negativamente que están enlazados a las terminales de la estructura cargada negativamente, pueden ser utilizados para enlazar las porciones de elaboración de imagen o porciones de envío al objetivo, por medio de, por ejemplo, enlaces disulfuro (a través de un residuo de cisteína), enlaces amida, enlaces éter (a través de los grupos serina o treonina hidroxilo) y similares. Las porciones de elaboración de imagen y porciones de envío al objetivo pueden ellas mismas ser aniones pequeños en la ausencia del polímero cargado negativamente. Las porciones de elaboración de imagen, porciones de envío al objetivo y agentes terapéuticos también pueden ser ellos mismos modificados de manera covalente para producir una superficie suficiente de porciones cargadas negativamente para la formación del complejo iónico con las estructuras cargadas positivamente como lo podrán apreciar fácilmente aquellos expertos en la técnica. En ambos de estos casos, la substancia o un derivado de la misma tiene una carga negativa suficiente para asociarla con los vehículos cargados positivamente de la presente invención de manera no covalente. El término "suficiente" en este contexto se refiere a una asociación que puede ser determinada, por ejemplo, mediante el cambio en el dimensionamiento de partícula o la espectrofotometría funcional contra los componentes a. Porciones de elaboración de imagen Una variedad de porciones de elaboración de imagen o de diagnóstico son útiles en la presente invención y están presentes en una cantidad efectiva que dependerá de la condición que está siendo diagnosticada o de la que se está formando una imagen, la ruta de administración, la sensibilidad del agente, el aparato utilizado para la detección del agente y similares. Los ejemplos de los agentes de elaboración de imagen o de diagnóstico adecuados incluyen, agentes de contraste radiopacos, agentes de contraste paramagnéticos, agentes de contraste superparamagnéticos, porciones de elaboración de imagen óptica, agentes de contraste CT, y otros agentes de contraste. Por ejemplo, los agentes de contraste radiopacos (para la elaboración de imagen de rayos X) incluirán compuestos de yodo orgánico e inorgánico (por ejemplo, diatrizoato), metales radiopacos y sus sales (por ejemplo, plata, oro, platino y sus similares) y otros compuestos radiopacos (por ejemplo, sales de calcio, sales de bario, tales como sulfato de bario, tántalo u óxido de tántalo). Los agentes de contraste paramagnético adecuados (para la elaboración de imagen MR) ¡ncluyen ácido triaminopentaacético gadolinio dietileno (Gd-DTPA) y sus derivados y otros complejos de gadolinio, manganeso, hierro, disprosio, cobre, europio, erbio, cromo, níquel y cobalto, incluyendo complejos con ácido 1 ,4,7, 10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N'"-tetraacético (DOTA), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido 1 ,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N"-triacético (DO3A), ácido 1 ,4,7-triazaciclononano-N,N',N"-triacético (NOTA), ácido 1 ,4,8, 1 1 -tetraazaciclotetradecano-N, N',N",N"'-tetracético (TETA), ácido hidroxibenciletileno-diamina diacético (HBED) y similares. Los agentes de contraste superparamagnéticos adecuados, (para la elaboración de imagen MR) incluyen magnetitos, óxidos de hierro superparamagnético, óxidos de hierro monocristalino, particularmente en formas de complejo de cada uno de estos agentes que pueden ser enlazados a la estructura cargada negativamente. Todavía otros agentes de elaboración de imagen adecuados son los agentes de contraste CT, incluyendo, agentes yodinados y no yodinados y agentes de contraste CT iónicos y no iónicos, así como agentes de contraste tales como marcas-hilos u otros agentes efectivos diagnósticamente. Los agentes de elaboración de imagen ópticos adecuados, por ejemplo, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5; Cy7, Cy7.5, verde Oregon 488, verde Oregon 500, verde Oregon 514, proteína fluorescente Verde, 6-FAM, Rojo Texas, Hex, TET y HAMRA. Otros ejemplos de agente de diagnóstico incluyen marcadores. Puede ser empleada una amplia variedad de marcadores o etiquetas, tales como radionuclidos, harinas, enzimas, substratos de enzimas, cofactores de enzimas, inhibidores de enzima, ligandos (particularmente haptenos) y similares. Todavía otras substancias útiles son aquellas marcadas con especies o componentes radioactivos, tales como glucoheptonato 99mTc. La elección para enlazarla a la porción de elaboración de imagen de una estructura cargada negativamente dependerá de una variedad de condiciones. Ciertos agentes de elaboración de imagen son neutrales en pH fisiológico y preferentemente, serán enlazados a la estructura cargada negativamente o modificada covalentemente para incluir, porciones cargadas negativamente para formar un complejo con el vehículo cargado positivamente. Otros agentes de elaboración de imagen son portadores de suficiente carga negativa para formar un complejo con el vehículo cargado positivamente, aún en la ausencia de la estructura cargada negativamente. En estos casos, la substancia o derivado de la misma tiene carga negativa suficiente para asociarse con el vehículo cargado positivamente de la presente invención de manera no covalente. El término "suficiente" en este contexto se refiere a una asociación que puede ser determinada, por ejemplo, mediante el cambio en el dimensionamiento de la partícula o la espectrofotometría funcional contra el componente solo. Un ejemplo de la porción de elaboración de imagen cargada negativamente, es un ion de fosfato, el cual es útil para la elaboración de imagen de resonancia magnética. Agentes de envío al objetivo Una variedad de agentes de envío al objetivo son útiles en las composiciones aquí descritas. Generalmente, los agentes de envío al objetivo son enlazados a la estructura cargada negativamente tal y como se describe para las porciones de elaboración de imagen anteriores. Los agentes de envío al objetivo pueden ser cualquier elemento que hace posible dirigir un agente terapéutico u otro componente de la composición a un sitio particular o alterar el tropismo del complejo en relación con el del complejo sin el agente de envío al objetivo. El agente de envío al objetivo puede ser un agente de envío al objetivo extracelular. Dicho agente también puede ser un agente de envío al objetivo intracelular, permitiendo que un agente terapéutico pueda ser dirigido hacia los compartimentos de células particulares (por ejemplo, la mitocondria, el núcleo y similares). De la manera más simple el agente puede ser un anión pequeño el cual, en virtud del cambio de la distribución de la carga neta, altera el tropismo del complejo de superficies de células que tienen cargas altamente negativas y componentes de matriz extracelular a una variedad más amplia de células o hasta específicamente lejos de la mayor parte de superficies altamente negativas. El agente o agentes de envío al objetivo son preferentemente enlazados, de manera covalente o no covalente, a una estructura cargada negativamente de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, el agente de envío al objetivo es enlazado covalentemente a poliaspartato, dextrano sulfatado o fosforilado y similares, que sirven como un componente de estructura cargada negativamente, preferentemente por medio de la vía del enlace. En un grupo de modalidades, el agente de envío al objetivo es un péptido fusogénico para promover la transfección celular (es decir, para favorecer el paso de la composición o sus elementos a través de las membranas, o para ayudar en el egreso de los endosomas o para cruzar la membrana nuclear). El agente de envío objetivo también puede ser un ligando de receptor de célula para el receptor que está presente en la superficie del tipo de célula, tal como por ejemplo, una proteína de azúcar, transferrina, o asialo-orosomucoide. Otros agentes de envío al objetivo útiles incluyen azúcares, péptidos, hormonas, vitaminas, citocinas, aniones pequeños, lípidos o secuencias o fracciones derivadas de estos elementos y las cuales permiten el enlace específico con sus receptores correspondientes. Preferentemente, los agentes de envío al objetivo son azúcares y/o ligandos de receptores celulares péptidos o fragmentos de los mismos, receptores o fragmentos de receptores y similares. Más preferentemente, los agentes de envío al objetivo son ligandos del receptor de factor de crecimiento, de receptores de citocina o de receptores de lectina celular o receptores de proteína de adhesión. El agente de envío al objetivo también puede ser un azúcar, lo que hace posible, tener como objetivo las lectinas tales como los receptores de asialoglicoproteína. Todavía en otras modalidades, el agente de envío al objetivo es utilizado en la ausencia de una estructura cargada negativamente. En este grupo de modalidades, el agente de envío al objetivo es el portador de suficientes porciones cargadas negativamente para formar un complejo iónico con los vehículos cargados positivamente como se describió anteriormente. En estos casos, la substancia o un derivado de la misma tiene una carga negativa suficiente para asociarse con los vehículos cargados negativamente de la presente invención, de una manera no covalente. El término "suficiente" en este contexto se refiere a una asociación que puede ser determinada, por ejemplo mediante el cambio de dimensionamiento de partícula o por medio de la espectrofotometría funcional contra los componentes solos. Los agentes de envío al objetivo cargados negativamente adecuados para este grupo de modalidades, son agentes de envío al objetivo basados en proteínas que tienen una carga negativa neta en el pH fisiológico, así como agentes de envío al objetivo que pueden facilitar la adhesión a una superficie celular particular, tales como polianiones pequeños (por ejemplo, fosfato, aspartato y citrato) los cuales pueden cambiar el envío al objetivo basados en la carga neta de superficie de la célula que es el objetivo. Agentes biológicamente activos Una variedad de agentes biológicamente activos incluyendo tanto agentes terapéuticos como cosmmecéuticos, son útiles en la presente invención y están presentes en una cantidad efectiva que dependerá • del padecimiento que está siendo tratado, profilácticamente o de otra manera, la ruta de administración, la eficacia del agente y el tamaño y susceptibilidad del paciente al régimen de tratamiento. Como se observó anteriormente, la presente invención específicamente excluye toxinas botulínicas, VEGF y fragmentos de anticuerpo cuando es empleado el término "terapéutico" o "proteína biológicamente activa". Además, la presente invención excluye específicamente proteínas terapéuticas con capacidad de lograr alteraciones terapéuticas de los niveles de glucosa en la sangre (por ejemplo, para tratar la hiperglucemia), tales como insulina. Dichos antígenos, adecuados para la inmunización tienen otras actividades biológicas (tales como, el montaje de una respuesta inmune) y sin embargo, éstos permanecen incluidos en los aspectos apropiados de la presente invención. Los agentes antigénicos adecuados para la inmunización pueden ser antígenos basados en proteínas los cuales no alteran terapéuticamente los niveles de glucosa en la sangre, agentes que no son nucleótidos ni proteínas o híbridos de los mismos. Sin embargo, los nucleótidos que codifican los antígenos no son específicamente adecuados para las composiciones de la presente invención,. Por lo tanto, los agentes incluidos son ellos mismos antígenos adecuados para la inmunización. Los antígenos adecuados incluyen, por ejemplo, aquellos para agentes ambientales, patógenos o bioamenazas. Los agentes antigénicos adecuados preferentemente incluyen, por ejemplo, tratamientos relacionados con antígenos para la malaria, la rabia, el ántrax, la tuberculosis o inmunizaciones relacionadas con la infancia, tales como contra la hepatitis B, la difteria, la tosferina, el tétano, la influenza por Haemophilus tipo b, virus de la polio inactivado, sarampión, paperas, rubéola, varicela, neumococos, hepatitis A e influenza. Los agentes terapéuticos adecuados que pueden ser enlazados a una estructura cargada negativamente pueden ser encontrados esencialmente en cualquiera de las clases de agentes, incluyendo por ejemplo, agentes analgésicos, agentes antiasmáticos, antibióticos, agentes antidepresivos, agentes antidiabéticos, agentes antimicóticos, antieméticos, antihipertensores, agentes antiimpotencia, agentes anti-inflamatorios, agentes anti-neoplásticos, agentes anti-VIH, agentes antivirales, agentes anxiolíticos, agentes anticonceptivos, agentes para la fertilidad, agentes antitrombóticos, agentes protrombóticos, hormonas, vacunas, agentes inmunosupresores, vitaminas y similares. Alternativamente, suficientes grupos cargados negativamente pueden ser introducidos en el agente terapéutico para lograr la formación de un complejo iónico con las estructuras cargadas positivamente descritas anteriormente. Existen muchos métodos adecuados tales como fosforilación o sulfatación como podrá ser apreciado fácilmente por un experto en la técnica. Además, ciertos agentes por ellos mismos poseen porciones cargadas negativamente adecuadas para asociarlas con el vehículo cargado positivamente descrito anteriormente y no requieren el enlace a una estructura cargada negativamente. En estos casos, la substancia o un derivado de la misma tiene una carga negativa suficientemente para asociarla con los vehículos cargados positivamente de la presente invención de una manera no covalente. El término "suficiente" en este contexto se refiere a una asociación que puede ser determinada, por ejemplo, mediante el cambio en el dimensionamiento de partícula o la espectrofotometría funcional contra los componentes solos. Los agentes cosmecéuticos adecuados incluyen, por ejemplo, factor de crecimiento de la epidermis (EGF), así como la hormona de crecimiento humano y antioxidantes. Más particularmente los agentes terapéuticos útiles en la presente invención incluyen analgésicos tales como lidocaína, novocaína, bupivacaína, procaína, tetracaína, benzocaína, cocaína, mepivacaína, etidocaína, proparacaína, ropivacaína, prilocaína y similares; los agentes antiasmáticos tales como azelastina, cetotifen, traxanox, corticosteroides, cromolina, nedocromil, albuterol, mesilato de bitolterol, pirbuterol, salmeterol, terbutilina, teofilina y similares. Los agentes antibióticos tales como neomicina, estreptomicina, cloramfenicol, norfloxaxina, ciprofloxacina, trimetoprim, sulfametiloxazol, antibióticos ß-lactamo, tetraciclina y similares, agentes antidepresivos, tales como nefopam, oxipertina, imipramina, trazadona y similares, agentes antidiabéticos, tales como biguanidinas, sulfonilureas y similares, antieméticos y antipsicóticos tales como cloropromazina, flufenazina, perfenazina, proclorperazina, prometazina, tietilperazina, triflupromazina, haloperidol, escopolamina, difenidol, trimetobenzamida y similares. Los agentes neuromusculares, tales como atracurio, mivacurio, rocuronio, succinilcolina, doxacurio, tubocurarina, agentes antimicóticos, tales como amfotericina B, nistatina, candicidina, itraconazol, cetoconazol, miconazol, clotrimazol, fluconazol, ciclopirox, econazol, naftifina, terbinafina, griseofulvina, ciclopirox y similares; los agentes antihipertensivos, tales como propanolol, propafenona, oxiprenolol, nifedipina, reserpina y similares; agentes anti-impotencia, tales como donadores de óxido nítrico y similares; agentes anti-inflamatorios incluyendo agentes anti-inflamatorios esteroides, tales como cortisona, hidrocortisona, dexametasona, prednisolona, prednisona, fluazacort y similares, así como agentes anti-inflamatorios que no son de esteroides, tales como indometacina, ibuprofeno, ramifenizona, prioxicam y similares; agentes antineoplásticos, tales como adriamicina, ciciofosfamida, actinomicina, bleomicina, duanorubicina, doxorubicina epirubicina, mitomicina, rapamicina, metotrexato, fluorouracil, carboplatina, carmustina (BCNU), cisplatino, etoposida, interferonas, fenesterina, taxol (incluyendo análogos y derivados), camptotecina y derivados de los mismos, vinblastina, vincristina y similares; agentes anti-VIH (por ejemplo antiproteolíticos); agentes antivirales, tales como amantadina, metisazona, idoxuridina, citarabina, aciclovir, famciclovir, ganciclovir, foscarnet, sorivudina, trifluridina, valaciclovir, cidofovir; didanosina, estavudina, zalcitabina, zidovudina, ribavirina, rimantatina y similares; los agentes anxiolíticos, tales como dantroleno, diazepam y similares; inhibidores de COX-2; agentes anticonceptivos, tales como progestogena y similares, agentes anti-trombóticos, tales como inhibidores de GPIIb/ll la, activadores de plasminogen del tejido, estreptocinasa, urocinasa, heparina y similar; agentes protrombóticos, tales como trombina, factores V, Vil, VII I y similares; hormonas, tales como hormonas de crecimiento, prolactina, EGF (factor de crecimiento de la epidermis) y similares; agentes inmunosupresores, tales como ciclosforina, azatioprina, mizorobina, FK506, prednisona y similares; vitaminas, tales como vitaminas A, D, E, K y similares; otros agentes activos terapéutica o medicinalmente. Ver por ejemplo, el libro de GOODMAN & GILMAN'S "LAS BASES FARMACOLÓGICAS DE LOS TERAPÉUTICOS", "THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS", Novena Edición Hardman, et al., eds. McGraw-Hill, (1996). En las modalidades más preferidas el agente biológico seleccionado de proteínas que tienen un peso molecular menor a 20,000 kD y otros agentes biológicamente activos, tales como por ejemplo, agentes terapéuticos que no son nucleótidos ni proteínas, tales como ciertos antimicóticos o agentes antigénicos para inmunización. Como en todos los aspectos de la presente invención, los ejemplo adecuados excluyen específicamente la insulina, las toxinas de botulinio, VEGF y fragmentos de anticuerpo. Como se observó anteriormente, para los agentes de envío al objetivo y los agentes de elaboración de imagen se pueden utilizar ciertos agentes biológicos o cosmecéuticos y son aquellos que generalmente son portadores de una carga negativa neta en pH fisiológico para formar un complejo como un vehículo cargado positivamente. Los ejemplos incluyen antígenos para la inmunización, los cuales incluyen generalmente proteínas y glucoproteínas y muchos agentes antimicóticos, tales como agentes para la elaboración de imagen al objetivo del melanoma con o sin un potencial terapéutico inherente. En estos casos, la substancia o un derivado de la misma tiene una carga negativa suficiente para asociarse con los vehículos cargados positivamente de la presente invención de una manera no covalente. El término "suficiente" en este contexto se refiere a una asociación que puede ser determinada, por ejemplo, mediante el cambio de dimensionamiento de partículas o la espectrofotometría funcional contra los componentes solos. Estructuras cargadas negativamente gue tienen porciones de elaboración de imagen. agentes de envío al objetivo o agentes terapéuticos enlazados Para tres de los grupos anteriores de los componentes, incluyendo las porciones de la elaboración de imagen, los agentes de envío al objetivo y los agentes terapéuticos, los compuestos individuales son enlazados a una estructura cargada negativamente, modificada covalentemente para introducir porciones cargadas negativamente o emplearlas directamente si el compuesto contiene suficientes porciones cargadas negativamente para conferir la formación del complejo iónico a la estructura cargada positivamente descrita con anterioridad. Cuando es necesario, generalmente el enlace es por medio del grupo de enlace utilizado para enlazar de manera covalente al agente particular a la estructura a través de grupos funcionales presentes en el agente, así como en la estructura. Son útiles una variedad de grupos de enlace en este aspecto de la presente invención. Por ejemplo, ver la publicación de Hermanson, en Bioconjugate techniques, Academic Press, San Diego, CA (1996); Wong, S.S. , Ed. , Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL (1991 ); Senter, et al., en J. Org. Chem. 55: página 2975 a 2978 (1990); y Koneko, et al. , en Bioconjugate Chem. 2: página 133 a 141 (1991 ). En algunas modalidades, los agentes terapéuticos, de diagnóstico o de envío al objetivo no tendrán un grupo funcional disponible para el enlace o un grupo de enlace y pueden ser modificado primero para incorporar, por ejemplo, un substituyente hidroxi, amino o tiol. Preferentemente, el substituyente se proporciona en una porción que no es de interferencia del agente y puede ser utilizado para enlazar un grupo de enlace y no afectará de manera adversa la función del agente. Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden un complejo no covalente de una estructura cargada positivamente que tiene por lo menos enlazado al mismo un grupo eficiente y en este aspecto de la presente invención, la estructura cargada positivamente puede ser esencialmente cualquiera de las estructuras cargadas positivamente mencionadas con anterioridad y también comprenderán (como con las estructuras seleccionadas anteriores) por lo menos un grupo de eficiencia enlazado. Los grupos de eficiencia adecuados incluyen, por ejemplo (GIy)ni-(Arg)n2 en donde el subscrito n1 es un entero de 3 a aproximadamente 5 y el subscrito n2 es independientemente un número non de aproximadamente 7 a aproximadamente 17; y los campos TAT. Por ejemplo, los campos TAT pueden tener la fórmula (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q, ó (gly)q-RKKRRQRRR-(gly)q, en donde el subscrito p y q son cada uno independientemente un entero de 0 a 20 y el fragmento es enlazado a la molécula del vehículo, ya sea por medio de la terminal C o de la terminal N del fragmento. Los grupos de ramificación lateral pueden tener ya sea la forma D-ó-L (configuración R ó S) en el centro del enlace. Preferentemente los fragmentos VIH-TAT son aquellos en los cuales los subscritos p y q son independientemente cada uno enteros de 0 a 8 y más preferentemente de 2 a 5.
Administración transdérmica de ciertas otras moléculas Se ha descubierto que los vehículos cargados positivamente que se explicaron con anterioridad pueden ser utilizados para la administración transdérmica de proteínas y otros agentes biológicamente activos (por ejemplo, proteínas que tienen un peso molecular menor de 20,000 kD, agentes terapéuticos que no son nucleótidos ni proteínas, tales como ciertos agentes antimicóticos, agentes antigénicos para inmunización). El uso del vehículo cargado positivamente hace posible la transmisión de la proteína o el gen marcador tanto dentro como fuera de las células de la piel y la administración del mismo en una cantidad efectiva y en forma activa a un tejido subyacente. La administración local puede producir de esta manera reducciones en la dosificación, reduce la toxicidad y permite una optimización más precisa de la dosificación para los efectos deseados en relación con materiales que se pueden inyectar o implantar, particularmente en el caso de agentes antimicóticos, agentes antigénicos adecuados para inmunización o agentes para la elaboración de imagen molecular de padecimientos de la piel, tales como por ejemplo, el melanoma. Esta modalidad puede incluir una cantidad de aniones polivalentes preferentemente pequeños (por ejemplo, fosfato, aspartato o citrato) y se puede llevar a cabo en ausencia substancial de dicho polianión. De un modo similar, el término "proteína" incluye proteínas extractadas de fuentes naturales, así como proteínas que pueden ser obtenidas sintéticamente, por medios químicos o recombinantes. La proteína también puede ser una forma o modificada o en la forma de, por ejemplo, un péptido recombinante, una proteína de fusión o una molécula híbrida. La proteína en algunos casos puede ser una porción de una molécula de proteína más grande que posee la actividad necesaria. Las proteínas preferibles son aquellas que tienen un peso molecular menor de 20000 kD [por ejemplo, aquellas que pueden ser utilizadas en las composiciones y métodos transdérmicos, tales como antígenos para inmunización], las cuales puede variar ampliamente en sus propiedades fisicoquímicas. De un modo similar, los agentes terapéuticos que no son nucleótidos ni proteínas, incluyendo agentes antimicóticos pueden ser obtenidos de fuentes naturales o pueden ser sintetizados. Las composiciones de la presente invención preferentemente son en la forma de productos que van a ser aplicados a la piel o epitelio de los sujetos o pacientes (por ejemplo, humanos u otros mamíferos que necesitan el tratamiento particular). El término "que necesita" significa que incluye tanto necesidades farmacéuticas como relacionadas con la salud, así como necesidades que tienden a ser sean más cosméticas, estéticas o subjetivas. Las composiciones también pueden ser utilizadas, por ejemplo, para alterar o mejorar la apariencia del tejido facial. En general las composiciones son preparadas mezclando las proteínas particularmente aquellas que tienen un peso molecular menor a 20 000 kD u otro agente biológicamente activo, tal como por ejemplo, un agente terapéutico no nucleótido ni proteína o alternativamente un agente para la inmunización que va a ser administrado con un vehículo cargado positivamente y generalmente con uno o más vehículos excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales. En su forma más simple pueden contener un vehículo diluyente farmacéuticamente aceptable acuoso simple, tal como solución salina, la cual puede ser regulada. Sin embargo, las composiciones pueden contener otros ingredientes típicos en composiciones farmacéuticas o cosmecéuticas tópicas, incluyendo, un vehículo aceptable dermatológicamente o farmacéuticamente, vehículo o medio (por ejemplo, un vehículo, portador o medio que es compatible con los tejidos a los cuales serán aplicados). El término "aceptable dermatológicamente o farmacéuticamente" como se usa en la presente descripción , significa que las composiciones o componentes de la misma son adecuados para utilizarse en contacto con estos tejidos o para uso en pacientes en general sin una toxicidad indebida, incompatibilidad, instabilidad, respuesta alérgica y similares. Como es apropiado, las composiciones de la presente invención, pueden contener cualquier ingrediente convencionalmente utilizado en los campos romados en consideración y particularmente, en cosmética y dermatología. En todos los aspectos de la presente invención, la asociación entre el vehículo y el agente biológicamente activo es por medio de la interacción no covalente, la cual puede incluir, por ejemplo, interacciones iónicas como enlace de hidrógeno, fuerzas de van der Waals o combinaciones de las mimas. Las composiciones pueden ser previamente formuladas o pueden ser preparadas al momento de la administración, por ejemplo, proporcionando un equipo para ensamblar en el momento o antes del momento de la administración. Alternativamente y como se mencionó con anterioridad, las proteínas terapéuticas y la estructura cargada positivamente pueden ser administradas en forma separada al paciente, por ejemplo, proporcionando un equipo que contiene un parche para la piel u otro aparato de abastecimiento que contiene la proteína terapéutica y un líquido, gel, crema o similar, que contiene el vehículo cargado positivamente (opcionalmente otros ingredientes). En esa modalidad particular, la combinación es administrada aplicando el líquido u otra composición que contiene vehículo para la piel, seguido por la aplicación del parche en la piel u otro dispositivo. Las composiciones de la presente invención son aplicadas como para administrar una cantidad efectiva de proteínas terapéuticas u otras substancias benéficas, tales como agentes de elaboración de imagen o de envío al objetivo. Para la administración transdérmica el término "cantidad efectiva" se refiere a cualquier composición o método que proporciona una administración transdérmica mayor del agente biológicamente activo en relación con el agente en la ausencia del portador. Para los antígenos, "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para permitir que un sujeto monte una respuesta inmune al antígeno después de la aplicación o una serie de aplicaciones del antígeno. Para agentes antimicóticos "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para reducir los síntomas o signos de la infección micótica. Para otros agentes biológicamente activos que no alteran terapéuticamente los niveles de glucosa en la sangre, "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para ejercer un efecto biológico o terapéutico caracterizado para ese agente en, por ejemplo, la oficina del médico o similar sin inducir toxicidad importante. La presente invención excluye específicamente fragmentos de anticuerpos en donde es empleado el término "terapéutico" o "proteína biológicamente activa". Sin embargo, debido a que los antígenos adecuados para la inmunización tienen otras actividades biológicas, tales como el montaje de una respuesta inmune, estos permanecen incluidos en los aspectos apropiados de la presente invención. Las composiciones pueden contener una cantidad efectiva apropiada de una proteína terapéutica u otro agente biológicamente activo para la aplicación en forma de tratamiento de una sola dosis, 0 puede ser más concentrada, ya sea para la dilución en el lugar de administración o para el uso de aplicaciones múltiples. En general, las composiciones que contienen proteínas (particularmente aquellas que tienen un peso molecular menor de 20,000 kD) u otros agentes biológicamente activos contendrán de aproximadamente 1 x 10-20 a aproximadamente 25% en peso del agente biológicamente activo y de 1 x 10-19 a aproximadamente 30% en peso del vehículo cargado positivamente. En general, las composiciones que contienen agentes terapéuticos que no son nucleótidos ni proteínas o alternativamente un agente para la inmunización contendrán de aproximadamente 1 x 10-10 hasta aproximadamente el 49.9% en peso del antígeno o de aproximadamente 1 x 10-9 a aproximadamente 50% en peso del vehículo cargado positivamente. La cantidad de moléculas del vehículo o la proporción de las mismas al agente biológicamente activo dependerá del vehículo seleccionado por utilizarse en la composición en cuestión. La cantidad apropiada o proporción de la molécula del vehículo en un caso determinado, puede ser determinada fácilmente, por ejemplo, realizando uno o más experimentos, tales como los que se describen más adelante. Las composiciones de la presente invención pueden incluir soluciones, emulsiones (incluyendo microemulsiones), suspensiones, cremas, lociones, gels, polvos u otras composiciones sólidas o líquidas usadas para aplicación a la piel y otros tejidos en donde las composiciones pueden ser utilizadas. Dichas composiciones pueden contener, además de los agentes biológicamente activos y la molécula del vehículo otros ingredientes generalmente utilizados en dichos productos, tales como antimicrobiales, humectantes y agentes de hidratación, agentes de penetración, conservadores, emulcificadores, aceites naturales o sintéticos, solventes, tensioactivos, detergentes, agentes de gel y fijación, emolientes, antioxidantes, fragancias, rellenadores, estresantes, ceras, solventes de olor, partes de tintes, agentes colorantes, polvos, agentes de control de viscosidad y agua, y opcionalmente incluyen anestésicos, agentes anticomezón, extractos botánicos, agentes de acondicionamiento, agentes de brillo u oscurecimiento, brillo, humectantes, mica, minerales, polifenoles, siliconas o derivados de los mismos, bloqueadores solares, vitaminas y fitomedicinas. Las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden ser en la forma de composiciones de liberación controlada o liberación sostenida, en donde la substancia de las proteínas que va a ser administrada y el vehículo son encapsulados o contenidos de otro modo, dentro de un material, de modo que son liberados sobre la piel de una manera controlada con el paso del tiempo. La substancia que va a ser administrada y el vehículo pueden estar contenidos dentro de matrices, liposomas, vesículas, microcápsulas, microesferas y similares o dentro de un material particulado sólido y todos los cuales son seleccionados y/o construidos para proporcionar la liberación de la substancia o substancias con el paso del tiempo. La substancia terapéutica del vehículo puede ser encapsulada junta (por ejemplo, en la misma cápsula) o por separado (en cápsulas separadas). La administración de las composiciones de la presente invención a un sujeto es, por supuesto, otro aspecto de la presente invención. La administración mediante parches en la piel y similares, con liberación controlada y/o monitoreo, es probable que sea un método común de modo que la composición de la presente invención con frecuencia será administrada según está contenida en un parche para la piel u otro dispositivo. En el caso de los antígenos adecuados para las inmunizaciones, las composiciones son administradas más preferentemente bajo la dirección de un doctor u otro profesional de la salud. Éstas pueden ser administradas en una serie de tratamientos periódicos con el paso del tiempo. Para la administración transdérmica de los antígenos adecuados para las inmunizaciones para los propósitos mencionados anteriormente, se aplica tópicamente una composición, tal y como se describió anteriormente a la piel o a una placa de la uña o la piel que la rodea. De un modo similar, en el caso de terapéuticos que no son nucleótidos ni proteínas, tales como agentes antimicóticos, preferentemente las composiciones son administradas bajo la dirección de un doctor u otro profesional de la salud. Ellas pueden ser administradas en un solo tratamiento o en una serie de tratamientos periódicos con el tiempo. Para la administración transdérmica, tal y como se describió anteriormente, las proteínas terapéuticas de una composición son aplicadas tópicamente a la piel.
Los equipos para la administración de las composiciones de la presente invención, ya sea bajo la dirección de un profesional del cuidado de la salud o por el paciente, también pueden incluir un aplicador acostumbrado adecuado para ese propósito. En el caso de un aplicador a la uña del dedo o a la placa de la uña del dedo del pie o las estructuras anatómicas que lo rodean, dicho aplicador puede incluir, por ejemplo, una placa de uña de prótesis, una laca, un esmalte para las uñas con un agente de color, un gel o una combinación de cualquiera o todos de estos.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a métodos para la administración tópica de la combinación del vehículo cargado positivamente descrito anteriormente con una cantidad efectiva de un agente biológicamente activo (por ejemplo, una proteína con un peso molecular menor de 20,000 kD, los antígenos adecuados para la inmunización, los agentes antimicóticos o los agentes terapéuticos que no son nucleótidos ni proteínas). Como se describió anteriormente, la administración puede ser efectuada mediante el uso de una composición de acuerdo con la presente invención que contiene los tipos y cantidades apropiadas de estas dos substancias, específicamente el vehículo y el agente biológicamente activo. Sin embargo, la presente invención también incluye la administración de estas dos substancias en combinación, aunque no necesariamente en la misma composición. Por ejemplo, la substancia terapéutica puede ser incorporada en forma seca en el parche para la piel u otro dispositivo de abastecimiento y el vehículo cargado positivamente puede ser aplicado a la superficie de la piel antes de la aplicación del parche, de modo que los dos actúan juntos, dando como resultado la administración transdérmica deseada. En ese sentido, las dos substancias (el vehículo y el agente biológicamente activo) actúan en combinación y tal vez, interactúan para formar una combinación o composición en el sitio. Métodos para preparar las composiciones En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar una composición farmacéutica, comprendiendo el método la combinación de un componente de estructura cargada positivamente y por lo menos un elemento seleccionado de: i) una primera estructura cargada negativamente que tiene una pluralidad de porciones de elaboración de imagen enlazadas o una pluralidad de porciones de elaboración de imagen cargadas negativamente; ¡i) una segunda estructura cargada negativamente que tiene una pluralidad de agentes de envío al objetivo o una pluralidad de porciones de envió al objetivo cargadas negativamente; iii) un agente biológicamente activo que no es nucleótido ni proteína; iv) una proteína terapéutica diferente a insulina, toxinas botulínicas, VEGF o fragmentos de anticuerpo, con un vehículo aceptable farmacéuticamente para formar un complejo no covalente que tiene una carga positiva neta. En algunas modalidades de la presente invención, la estructura cargada, positivamente o el vehículo puede ser utilizados solos para proporcionar la administración transdérmica de ciertos tipos de substancias. En este caso, se prefieren las composiciones y métodos que comprenden de aproximadamente 1 x 10-20 a aproximadamente 25% en peso del agente biológicamente activo y de aproximadamente 1 x 10-19 a aproximadamente 30% en peso del vehículo cargado positivamente. También se prefieren composiciones y métodos que contienen un agente terapéutico que no es nucleótido ni proteína, como un agente antimicótico, agentes de elaboración de imagen selectivos para la diagnosis de padecimientos de la piel, tales como el melanoma o un agente antigénico adecuado para la inmunización, en donde las composiciones y métodos comprenden de aproximadamente 1 x 10-10 a aproximadamente 49.9% en peso del antígeno o de aproximadamente 1 x 10-9 a aproximadamente 50% en peso del vehículo cargado positivamente. La amplia aplicabilidad de la presente invención se ilustra por la facilidad con la cual pueden ser formuladas una variedad de composiciones farmacéuticas. Generalmente, las composiciones son preparadas mezclando el componente de la estructura cargada positivamente con los componentes de interés deseados (por ejemplo, componentes de envío al objetivo, de elaboración de imagen o terapéuticos) en proporciones y una secuencia para obtener composiciones que tienen una carga positiva neta variable. En muchas modalidades, las composiciones pueden ser preparadas, por ejemplo, al lado de la cama utilizando los vehículos farmacéuticamente aceptables y los diluyentes para la administración de la composición. Alternativamente, las composiciones pueden ser preparadas mediante la mezcla adecuada de los componentes y luego liofilizada y almacenada (generalmente a temperatura ambiente o más baja) hasta que son utilizadas o formuladas en un vehículo de administración adecuado. Las composiciones pueden ser formuladas para proporcionar las mezclas adecuadas para diferentes modos de administración, cuyos ejemplos no limitativos incluyen la administración tópica, cutánea, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular y transdérmica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención contienen preferentemente un vehículo el cual es farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, en particular para la inyección directa en el órgano deseado o para la administración tópica (a la piel y/o membrana de la mucosa). Las composiciones farmacéuticas pueden ser en particular, estériles, soluciones isotónicas y composiciones secas (por ejemplo, composiciones secadas por congelación) las cuales pueden ser reconstituidas mediante la adición de agua esterilizada o solución salina fisiológica, para preparar las soluciones inyectables. Alternativamente, cuando las composiciones van a ser aplicadas tópicamente (por ejemplo, cuando se desea la administración transdérmica) el componente o componentes de interés pueden ser aplicados en forma seca a la piel (por ejemplo, por medio del uso de un parche para la piel) en donde la piel es tratada por separado con la estructura o vehículo cargado positivamente. De esta manera, la composición general es formada esencialmente en el sitio y administrada al paciente o sujeto. Métodos de uso de las composiciones Métodos de administración Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas a un sujeto, célula o sitio objetivo, ya sea in vivo o ex vivo utilizando una variedad de métodos. De hecho, puede ser utilizada cualquiera de las rutas normalmente utilizadas para introducir una composición en contacto final con el tejido que va a ser tratado. Preferentemente, las composiciones serán administradas con vehículos farmacéuticamente aceptables. Los métodos adecuados de administración de dichos compuestos están disponibles y son bien conocidos para los expertos en la técnica. Aunque se puede utilizar más de una ruta para administrar una composición particular, una ruta particular puede proporcionar frecuentemente una reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son determinados en parte, por la composición particular que está siendo administrada, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención (ver por ejemplo "CIENCIAS FARMACÉUTICAS DE REMINGTON" (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES) 17A ed. 1985. La administración puede ser, por ejemplo, intravenosa, tópica, intraperitoneal, subdérmica, subcutánea, transcutánea, intramuscular, oral, intra-articular, parenteral, intranasal o mediante inhalación. Por lo tanto, los sitios de administración adecuados incluyen pero no están limitados a, la piel, bronquios, aparato gastrointestinal, ojo y oído. Las composiciones generalmente incluyen un vehículo o excipiente farmacéuticamente convencional y pueden incluir adicionalmente otros agentes medicinales, vehículos, adyuvantes y similares. Preferentemente, la formulación será de aproximadamente el 5% al 75% en peso de una composición de la presente invención, consistiendo el resto, de los excipientes farmacéuticos adecuados. Los excipientes apropiados pueden ser diseñados para la composición particular y ruta de administración mediante métodos bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, "CIENCIAS FARMACÉUTICAS DE REMINGTON" (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES), 18A ED., Mack Publishing Co. , Easton, PA (1990)). Las formulaciones pueden tomar la forma de sólidos, semisólidos, polvos liofilizados o formas de dosificación líquida, tales como por ejemplo, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retención, cremas, ungüentos, lociones, aerosoles o similares. Las modalidades en donde la composición farmacéutica toma la forma de una pildora, tableta o cápsula, la formulación puede contener junto con la composición biológicamente activa, cualquiera de los siguientes: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato de dicalcio y similares; un desintegrante, tal como almidón o derivados del mismo; un lubricante, tal como estearato de magnesio y similares, y un enlazador, tal como almidón, goma de acacia, polivinil pirrolidona, gelatina, celulosa y derivados de la misma. Las composiciones pueden ser presentadas en dosis unitarias o en contenedores sellados de dosis múltiples, tales como ampolletas o frascos. Las dosis administradas a un paciente deberán ser suficientes para lograr la respuesta terapéutica benéfica en el paciente con el paso del tiempo. En algunas modalidades, se puede administrar una formulación de liberación sostenida a un organismo o a una célula en cultivo y puede llevar las composiciones deseadas. La composición de liberación sostenida puede ser administrada al tejido de un organismo, por ejemplo mediante inyección. El término "liberación sostenida" significa que la composición se hace disponible para la asimilación por el tejido o célula en cultivo que la rodean por un período de tiempo más largo de lo que sería logrado mediante la administración de la composición en un medio menos viscoso, por ejemplo, una solución salina. Las composiciones solas o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden hacer en formulaciones de aerosol (es decir, pueden ser "nebulizadas") para ser administradas mediante inhalación. Las formulaciones en aerosol pueden ser colocadas en propulsores presurizados aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. Para la administración mediante inhalación, las composiciones también pueden ser administradas en la forma de un polvo seco (por ejemplo, Nektar). Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral tales como por ejemplo, por rutas intravenosa, intramuscular, intradérmica y subcutánea, incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas, isotónicas, las cuales pueden contener antioxidantes, reguladores, bacteriostatos y solubles para presentar la formulación y para hacer isotónica la formulación y compatible con la sangre del receptor pretendido y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizadores, agentes espesantes, estabilizadores y conservadores. Otros métodos de administración incluyen pero no están limitados a, administración utilizando balones angioplásticos, catéteres y formaciones de gel. Los métodos para la administración de balones angioplásticos, catéteres y formación de gel, son bien conocidos en la técnica. Métodos de elaboración de imagen Un experto en la técnica entenderá que las composiciones de la presente invención pueden ser diseñadas para una variedad de usos de elaboración de imagen. En una modalidad, la colonoscopía virtual puede ser realizada utilizando un sistema basado en el componente para la elaboración de imagen. En la actualidad, la colonoscopía virtual comprende esencialmente la inyección de contraste en el colon y la visualización de las imágenes en el CT, luego la reconstrucción de una imagen 3-D. Podrían ser empleadas técnicas similares para la resonancia magnética. Sin embargo, las feces, la mucosa y todo el aire sirven como barreras de contraste y pueden dar una superficie artificial a la reconstrucción de la pared del colon. La visión del contraste de envío al objetivo celular ayudaría a superar estas barreras para proporcionar una construcción de la pared real y ayudar a evitar, tanto los positivos falsos como los negativos falsos. Existen varios medios en los que pueden ser aplicados aquí los sistemas basados en componentes. De una manera más simple, la estructura de eficiencia catiónica podría ser aplicada con un solo agente de contraste, por ejemplo, un agente CT, MR o de contraste óptico. Por lo tanto, la capa de superficie celular podría ser visualizada y cualesquiera irregularidades u obstrucciones detalladas en la reconstrucción de la imagen. Sin embargo, el sistema basado en los componentes ofrece una opción adicional de agregar un segundo agente específico. Este agente podría consistir de una estructura de eficiencia catiónica, una porción de elaboración de imagen diferente y componentes de envío al objetivo, por ejemplo, teniendo como objetivo dos características de los antígenos del cáncer de colon. Las porciones de elaboración de imagen desde las simples a las de diagnóstico, podrían ser seleccionadas de modo que fuera el contraste CT y el otro contraste MR, de modo que ambas fueran contraste MR siendo un agente T2 y el otro un agente T1. De esta manera, la superficie podría ser reconstruida como estaba anteriormente y cualesquiera regiones específicas para un antígeno de tumor podrían ser visualizadas y colocadas en la reconstrucción original. Adicionalmente, podrían ser incorporados agentes terapéuticos también en el sistema de diagnóstico al objetivo. Se podrían aplicar estrategias similares a la enteritis regional y a la colitis ulcerativa (y combinadas nuevamente con la terapia). Alternativamente, las porciones de elaboración de imagen óptica o los métodos de detección podrían ser empleados, por ejemplo, en el caso de una diagnosis o administración de melanoma, preferentemente en conjunto con una porción de elaboración de imagen fluorescente. En estas modalidades, la detección puede ser visual ayudada por la imagen o basada completamente en la imagen, por ejemplo, mediante análisis de una imagen de campo oscuro. EJEMPLOS Eiemplo 1 Este ejemplo ilustra la administración transdérmica de un complejo muy grande, es decir un plásmido que contiene un transgen de proteína fluorescente azul (BFP), utilizando una estructura o vehículo cargado positivamente de la presente invención. Selección de la estructura: La estructura cargada positivamente fue ensamblada mediante el enlace covalente de -Gly3Arg7 a polilisina MW 150 000 por medio del carboxilo de la glicina terminal a las aminas libres de las cadenas laterales de lisina a un grado de saturación del 18% (es decir 18 de cada 100 residuos de lisina son enlazados covalentemente a un -GIy3Arg7). La estructura modificada fue designada "KNR2" para indicar el segundo tamaño del vehículo peptidilo. La policación de control fue polilisina no modificada de (designada "K2", Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) del mismo tamaño y del mismo lote. La policación de control adicional Superfect® (Quiagen) la cual es un agente basado en dendrímero activado, fue seleccionado como una referencia para altos índices de transfección in vitro (es decir, simultáneamente el control positivo y la referencia para el estado de la eficiencia de la técnica contra la toxicidad in vitro). Selección del agente terapéutico: Se emplearon un plásmido de 8 kilobases (plantilla basada en pSport, Gibco BRL, Gaithersburg , MD) que contiene el transgen completo de la proteína fluorescente azul (BFP) y secuencias de flanqueo parciales operadas por un promotor de citomegalovirus (CMV). El BFP sirve como un marcador identificable para las células que han sido transfectadas, luego se transcribe y traduce el gen y puede ser visualizado directamente (es decir, sin tinción adicional) bajo un microscopio de fluorescencia. Por lo tanto, solamente las células en las cuales el complejo ha cruzado tanto la membrana del plasma como la membrana nuclear antes de la administración de la carga útil, puede tener la expresión del transgen. Este plásmido particular tiene un peso molecular de aproximadamente 2.64 millones y por lo tanto, fue seleccionado para evaluar la administración de terapéuticos muy grandes por medio de estos complejos. Preparación de muestras: En cada caso, se empleó un exceso de policación para ensamblar un complejo final que tiene un excedente de carga positiva. Aunque la densidad de carga creciente aumenta el tamaño (es decir, más estructuras presentes por complejo) aumenta el factor de la densidad del factor de eficacia por el complejo que puede compensar estos cambios. Por lo tanto, puede ocurrir una densidad óptima en proporciones bajas (es decir, basadas en el tamaño) o en proporciones altas (es decir, basadas en la densidad del factor de eficiencia) y ambas son evaluadas en este caso para el KNR2. Las proporciones óptimas para la eficiencia del K2 y la eficiencia del Superfect fueron seleccionadas basadas en la recomendación de los fabricantes y los reportes anteriores sobre la eficiencia máxima. La dosis terapéutica de nucleótidos fue estandarizada en todos los grupos y tuvo un volumen total y pH final de la composición para ser evaluados en el cultivo celular. Se prepararon las siguientes mezclas: 1 ) K2 en una proporción de carga 4: 1 a 0.5 mg/mL solución de plásmido que expresa la proteína fluorescente azul promovida por el promotor CMV. 2) KNR2 en una proporción de 1 5: 1 a 0.5 mg/mL solución de plásmido que expresa la proteína azul fluorescente promovida por el promotor de CMV. 3) KN R2 en una proporción de 1 0: 1 a 0.5 mg/mL solución del plásmido que expresa la proteína fluorescente azul promovida por el CMV. 4) KN R2 en una proporción de 4: 1 a 0.5 mg/mL de solución de un plásmido que expresa la proteína fluorescente azul promovida por un promotor de CMV. 5) KN R2 en una proporción de 1 .25: 1 a 0.5 mg/mL de solución de plásmido que expresa la proteína fluorescente azul promovida por un promotor de CMV. 6) Superfect de acuerdo con la recomendación del fabricante en una proporción de carga de 5: 1 a 0.5 mg/mL solución del plásmido que expresa la proteína fluorescente azul promovida por un promotor de CMV. Protocolos de cultivo celular: Todos los experimentos de cultivo celular se realizaron por observadores a ciegas de la identidad de los grupos de tratamiento. En una placa de 6 depósitos, se agregaron 1.0 mL de cada solución, a las células del músculo liso aórtico humano primario confluente HA-VSMC (paso 21 : ATCC, Rockville, MD) y cultivados en M-199 con suero al 10% durante 48 horas a 37 grados Celsius y 10% de CO2. Los depósitos de control sin tratar fueron evaluados también y cada grupo fue evaluado en depósitos N=5 por grupo. Análisis de eficiencia: Se obtuvieron fotografías de baja magnificación (total 10X), de las placas intactas de células por los observadores a ciegas en 60 grados, 180 grados y 200 grados de la parte superior de cada depósito utilizando un microscopio de epi-fluorescencia Nikon E600 con un filtro BFP y lentes planos apochromat. La Suite de análisis de imagen Image Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) fue empleada para determinar el porcentaje del área celular total que fue positivo. Este resultado fue normalizado al área total de las células por cada uno y reportado, la eficiencia de la administración del gen (% de células totales que expresan el transgen en niveles detectables).
Análisis de toxicidad: Los depósitos fueron evaluados posteriormente por observadores a ciegas en un ensayo de exclusión de tinte (se excluyó el tinte de las células viables, mientras que el de las no viables no se pudo excluir) seguido por la solubilización en SDS al 0.4% en solución salina regulada con fosfato. Las muestras fueron evaluadas en el espectrofotómetro en Spectronic Genesys 5 UV/VIS en una longitud de onda de 595 nm (azul), para evaluar cuantitativamente las células no viables como una medida directa de la toxicidad del agente de transfección. Las muestras fueron estandarizadas a números idénticos de células ajustando las concentraciones para que coincidieran con los valores OD280 antes de las mediciones de OD595. Manejo de los datos v análisis estadístico: La tinción positiva total fue determinada por un observador a ciegas por medio del análisis de imagen del lote utilizando el software Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) y fue normalizada a un área transversal total para determinar el porcentaje de tinción positiva de cada uno. Los errores promedio y estándar fueron determinados posteriormente por cada grupo con una confianza del análisis de importancia en un 95% en mediciones repetidas de una vía ANOVA utilizando el software Statview (Abacus, Berkeley, CA). Resultados: Eficiencias: Los resultados de las eficiencias son los siguientes (promedio más o menos error estándar): 1 ) 0.1 63 ± 0.106% 2) 10.642 ± 2.1 95% 3) 8.797 ± 3.839% 4) 1 5.035 ± 1 .098% 5) 1 7.574 ± 6.807% 6) 1 .199 + 0.573% Las corridas #4 y #5 exhibieron mediciones repetidas significativas estadísticamente (P<0.05 por un factor ANOVA con la prueba de Fisher PLSD y TU KEY-A posthoc una mejora de la eficiencia de la administración del gen en relación, tanto con la polilisina sola como el Superfect. Toxicidades: Los datos promedio de toxicidad son los siguientes (reportados en AU en OD595; valores bajos, tales como el presente con solución salina solo se correlaciona con una baja toxicidad, mientras los valores más altos, tales como el valor presente en la condición 1 indica una alta toxicidad celular): Solución salina - 0.057 A; 1) 3.460 A; 2) 0.251 A; 3) 0.291 A; 4) 0.243 A; 5) 0.297 A; 6) 0.337 A. Conclusiones: Se puede lograr una administración del gen más eficiente y menos toxica con una proporción de 1 .25 a 4.0 de KNR2 al ADN que los controles, aún aquellos del Superfect estándar dorado actual. Este experimento confirma la capacidad de los complejos terapéuticos para una administración bastante grande en las membranas utilizando este portador. Ejemplo 2 Este ejemplo ilustra el transporte de un nucleótido grande en la piel por un vehículo de la presente invención después de una sola administración. Selección de estructura: Las estructuras cargadas positivamente fueron ensambladas mediante el enlace covalente de -Gly3Arg7 a polilisina (MW 150,000) por medio del carboxilo de la terminal glicina a las aminas libres de las cadenas laterales de lisina en un grado de saturación del 18% (es decir, 18 de cada 100 residuos de lisina son enlazados covalentemente al -Gly3Arg7). Esta estructura modificada fue designada "KNR2" como la anterior. La policación de control fue polilisina sin modificar (designada "K2"), Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) del mismo tamaño y del mismo lote. Una policación de control adicional Superfect (Qiagen) la cual es un agente basado en un dendrímero activado, fue seleccionada como una referencia para los altos índices de transfección (es decir, el control positivo y referencia simultáneos para la eficiencia de las condiciones de la técnica contra la toxicidad in vitro). Selección del agente terapéutico: Para el presente experimento, se empleó un plásmido de 8.5 kilobases (plantilla basada en pSport Gibco BRL, Gaithersburg, MD) con un contenido del transgen completo de E. Coli beta galactosidasa (ßgal) y secuencias de flanqueo parciales promovidas por un promotor de citamegalovirus (CMV). En este caso el ßgal sirve como un marcador identificable para las células que han sido transfectadas, luego transcritas y traducidas al gen y pueden ser visualizadas directamente después de la tinción específica para la enzima extraña. Por lo tanto, solamente las células en las cuales el complejo cruzado a la piel alcanzaron entonces la célula objetivo, y fueron traslocalizados en ambas la membrana del plasma y la membrana nuclear, antes de la administración de la carga útil que puede tener la expresión del transgen. Este plásmido particular tiene un peso molecular de aproximadamente 2,805,000. Preparación de muestras: En cada caso, se empleó un exceso de policación para ensamblar el complejo final que tiene un exceso de carga positiva. Las proporciones óptimas para la eficiencia del K2, la eficiencia del KNR2 y la eficiencia del Superfect fueron seleccionadas basadas en la recomendación del fabricante y experimentos anteriores in vitro para determinar la eficiencia máxima. La dosis terapéutica de nucleótidos fue estandarizada en todos los grupos y tuvo un volumen total de pH final de la composición para ser aplicada tópicamente. Las muestras fueron preparadas de la siguiente manera: Grupo marcado AK1 : 8 microgramos de plásmido ßgal (p/CMV-sport-ßgal) por alícuota final (es decir, total de 80 microgramos) y portador peptidilo KNR2 en un índice de carga de 4: 1 fueron mezclados hasta la homogeneidad y diluidos en 200 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 1.8 ml de humedecedor Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros para los experimentos in vivo. Grupo marcado AL 1 : 8 microgramos de plásmido ßgal (p/CMV-sport-ßgal) por alícuota final (es decir, 80 microgramos total) y K2 en una proporción de carga de 4: 1 fueron mezclados hasta la homogeneidad y diluidos a 200 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 1 .8 mL de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros para los experimentos in vivo. Grupo marcado AM1 : 8 microgramos de plásmido de ßgal (p/CMV-sport-ßgal) por alícuota final (es decir 80 microgramos total) y Superfect en una proporción de carga de 5:1 fueron mezclados hasta la homogeneidad y diluidos a 200 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 1.8 mL de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros para los experimentos in vivo.
Experimentos en animales para determinar las eficiencias de la administración transdérmica después de un solo tratamiento con vehículos peptidilo v terapéuticos de los nucleótidos: Los animales fueron anestesiados mediante inhalación de isoflurano durante la aplicación de los tratamientos. Después de ser anestesiados, 8 ratones negros C57 (n=4 por grupo) se midieron dosis de 200 microlitros del tratamiento apropiado aplicado a la porción del cráneo de la piel de la espalda dorsal (seleccionada porque el ratón no puede alcanzar esta región con la boca o los miembros). Los animales no se sometieron a tratamiento depilatorio. Los animales fueron recuperados en un entorno con calor controlado para evitar la hipotermia y una vez que tuvieron respuesta, se les proporcionaron alimentos y agua ad libitum durante la noche. 24 horas posteriores al tratamiento, los ratones fueron eutanizados mediante inhalación de CO2 y los segmentos tratados de la piel, fueron recolectados en un espesor total por observadores a ceigas. Los segmentos de tratamiento fueron divididos en tres porciones iguales y la porción craneal fue fijada en formalina regulada neutral al 10% por un período de 2 a 16 horas y luego almacenados en 70% de etanol hasta que la incrustación de parafina. La porción central fue congelada instantánea y empleada directamente para la tinción de beta galactosidasa a una temperatura de 37 grados Celsius en secciones como se describieron anteriormente (Waugh, J.M., M. Kattash, J. Li, E. Yuksel, M.D. Kuo, M. Lussier, A.B. Weinfeld, R.
Saxena, E.D.Rabinovski, S. Thung, S.L.C. Woo, y S.M. Shenaq. Local Overexpression of Tissue Plasminogen Activator to Prevent Arterial Thrombosis in an in vivo Rabbit Model. Proc Nati Acad Sci EUA. 1999 96(3): páginas 1065 a 1070, y también la publicación de EIkins CJ, Waugh JM, Amabile PG, Minamiguchi H, Uy M, Sugimoto K, Do YS, Ganaha F, Razavi MK, Dake MD. Development of a platform to evalúate and limit in-stent restenosis. Tissue Engineering 20002 Jun;8(3); páginas 395 a 407. El segmento caudal tratado fue congelado instantáneo para los estudios de solubilización. Toxicidad: La toxicidad fue evaluada mediante la exclusión de tinte en secciones de pares para aquellos que se les analizó la eficiencia anteriormente. Las secciones solamente pasaron por la tinción, ya sea para la eficacia o para la toxicidad, ya que los métodos no se pueden co-emplear de manera confiable. Para el análisis de toxicidad, las secciones fueron sumergidas en tinte de exclusión durante 5 minutos, luego incubadas a una temperatura de 37 grados Celsius durante 30 minutos en un 10% de CO2. Cualesquiera células que no excluyeron el tinte en este período de tiempo, fueron consideradas como no viables. Manejo de datos v análisis estadístico: La recolección de datos y el análisis de imagen fueron realizados por observadores a ciegas. Las secciones teñidas como se indicó anteriormente, fueron fotografiadas en su totalidad en un microscopio Nikon E600 con lentes apochromat-planos. Las imágenes resultantes pasaron por el análisis de imagen por el procesamiento de análisis de imagen de lote utilizando el software Image Pro Plus, como las anteriores con la confirmación manual para determinar el número positivo de actividad de la enzima de beta-galactosidasa (azul con el método de substrato empleado en este caso) o toxicidad celular. Estos resultados fueron normalizados a un número transversal total de células mediante la tinción de rojo rápido nuclear, para cada una y tabulados como el porcentaje de la tinción positiva transversal. Posteriormente, el error promedio y estándar fueron determinados de cada grupo con el análisis de la importancia en un nivel de confianza del 95% en medidas repetidas ANOVA de una vía utilizando el software Statview (Abacus, Berkeley, CA). Resultados: Los resultados se resumen en la tabla siguiente y se ilustran en la figura 3. El vehículo de administración de peptidilo transdérmica cargada positivamente logró aumentos estadísticamente importantes en la eficiencia de administración y la expresión del transgen contra ambos el K2 (control esencialmente negativo) y el estándar de referenciación para la eficiencia, Superfect. Mientras el Superfect no logró mejoras importantes estadísticamente sobre el K2, el KNR2 tuvo mejoras más grandes en un orden de mejora de la magnitud en la eficiencia de administración contra el Superfect en este sistema del modelo. Tabla 1 : El promedio y error estándar para células positivas de beta-galactosidasa como el porcentaje total del número de grupos de tratamiento.
P=0.0001 (importancia en el 99%) Los resultados de la toxicidad se presentan en la figura 4, la cual ilustra el porcentaje del área total de células no viables que permanecieron durante las 24 horas posteriores del tratamiento. En este caso, el K2 exhibe una toxicidad celular estadísticamente importante en relación con el KNR2 o el Superfect, aún en una dosis en donde el K2 tiene baja eficiencia de transferencia como se describió anteriormente (Amabile, P.G., J.M. Waugh, T. Lewis, C.J. EIkins, T. Janus, M.D. Kuo, y M. D. Dake. Intravascular Ultrasound Enhances in vivo Vascular Gene Delivery. J. Am. Col. Cardiol.2001 June; 37(7): páginas 1975 a 1980). Conclusiones: El vehículo transdérmico peptidilo puede transportar complejos grandes por la piel con eficiencias altas, particularmente debido a las restricciones de expresión del transgen del tamaño total del complejo descrito anteriormente. El área positiva fue empleada aquí, en vez del número positivo para el análisis, ya que (1 ) el método es simplificado grandemente y tiene una aptitud mayor en el análisis de imagen, (2) las demostraciones deficientes del punto ya han sido presentadas en el I I. B de manera conclusiva, (3) las mediciones del área proporcionan un alcance más amplio para entender los resultados in vivo, ya que los componentes no celulares ocupan una porción substancial de la sección transversal, y (4) la comparación con los complejos del vehículo no peptidilo todavía más grandes fueron facilitadas. Ejemplo 3 Este ejemplo usa la administración transdérmica de un terapéutico basado en nucleótidos grandes sobre la piel utilizando un vehículo peptidilo cargado positivamente de la presente invención en 7 aplicaciones diarias consecutivas. Selección de la estructura: La estructura peptidilo cargada positivamente fue ensamblada mediante el enlace covalente de -Gly3Arg7 a polilisina (MW 150,000) por medio del carboxilo de la terminal de glisina a las aminas libres de las cadenas laterales de lisina en una grado de saturación del 18% (es decir, 18 de cada 100 residuos de lisina son enlazados covalentemente al -Gly3Arg7). La estructura modificada fue designada "KNR2". La policación de control fue polilisina sin modificar (designada "K2", Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) del mismo tamaño y del mismo lote. Selección del agente terapéutico: Para el presente experimento, se empleó un plásmido de 8.5 kilobases (plantilla basada en pSport Gibco BRL, Gaithersburg, MD) que contiene el transgen completo, para la beta-galactosidasa de E. Coli (ßgal) y secuencias parciales de flanqueo promovidas por el promotor de citomegalovirus (CMV). Este plásmido particular tiene un peso molecular de aproximadamente 2,805,000 y por lo tanto, fue seleccionado para evaluar la administración de terapéuticos muy grandes por la piel por medio de los vehículos peptidilo. Preparación de muestras: En cada caso, se empleó un exceso de policación para ensamblar un complejo final que tuvo un exceso de carga positiva. Las proporciones del experimento fueron seleccionadas para experimentos paralelos de una sola dosis presentados en el experimento anterior. La dosis del terapéutico-Nucleótido fue estandarizada en todos los grupos y tuvo un volumen total y pH final de la composición que va a ser aplicada tópicamente. Las muestras se prepararon de la siguiente manera: El grupo marcado AK1 : se mezclaron 8 microgramos del plásmido ßgal (p/CMV-sport-ßgal) por alícuota final (es decir, 240 microgramos totales) y el vehículo peptidilo KNR2 en una proporción de carga de 4: 1 hasta la homogeneidad y se diluyeron a 600 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 5.4 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas en porciones de 200 microlitros para los experimentos in vivo. Grupo marcado AL1 : se mezclaron 8 microgramos de plásmido ßgal (p/CMV-sport-ßgal) por alícuota final (es decir, 240 microgramos en total) y K2 en una proporción de carga de 4: 1 hasta la homogeneidad y se diluyeron en 600 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 5.4 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros para los experimentos in vivo. Experimentos en animales para determinar las eficiencias acumulativas de la administración transdérmica después de siete tratamientos de una vez al día con los vehículos peptidilo v los terapéuticos de nucleótidos: Los animales fueron anestesiados por medio de inhalación de isoflurano durante la aplicación de los tratamientos. Después de haber sido anestesiados, a tres ratones negros C57 (n=4 por grupo) se les midieron dosis de 200 microlitros del tratamiento apropiado aplicados a la porción craneal de la piel del lomo posterior (seleccionada debido a que el ratón no pueda alcanzar esta región, con la boca o los miembros). Los animales no pasaron por un tratamiento depilatorio. Los animales fueron recuperados en un ambiente de calor controlado para evitar la hipotermia y una vez que ya podían dar una respuesta, se les proporcionaron alimento y agua ad limitum durante la noche. Este procedimiento se repitió una vez al día a la misma hora aproximada del día durante siete días. Después del tratamiento de siete días, los ratones fueron eutanizados por medio de la inhalación CO2 y los segmentos de la piel tratada fueron cultivados en un espesor total por observadores a ciegas. Los segmentos tratados fueron divididos en tres porciones iguales, la porción craneal fue fijada en 10% formalina regulada neutral durante un período de 12 a 16 horas y luego almacenadas en 70% de etanol hasta la incrustación de parafina. La porción central fue congelada instantáneamente y empleada directamente para la tinción de beta galactosidasa a una temperatura de 37 grados Celsius en secciones como se describió anteriormente. El segmento caudal tratado fue congelado instantáneamente para los estudios de solubilización. Manejo de los Datos y Análisis Estadístico: La recolección de datos y el análisis de imagen los realizaron observadores a ciegas. Las secciones teñidas como se indicó anteriormente fueron fotografiadas en su totalidad en su microscopio Nikon E600 con lentes apochromat planos. Las imágenes resultantes pasaron por el procesamiento del análisis de imagen de lote utilizando el software Image Pro Plus como anteriormente con la confirmación manual para determinar el área positiva para la actividad de la enzima de beta-galactosidasa. Estos resultados fueron normalizados a un área transversal total por cada uno y tabulados en porcentaje como una tinción positiva transversal. Posteriormente, el error promedio y estándar fueron determinados para cada grupo con el análisis de importancia en un nivel de confianza del 95% en mediciones repetidas ANOVA de una sola vía utilizando el software Statview (Abacus, Berkeley, CA). Resultados: Los resultados se resumen en la tabla siguiente y se ilustran en la figura 5. El vehículo de administración transdérmica peptidilo logró aumentos estadísticamente importantes en la eficiencia de administración y la expresión del transgen contra el K2. Tabla 2: Error promedio y estándar para la expresión acumulativa del transgen beta-galactosidasa como un porcentaje del área total después de 7 aplicaciones de una dosis diaria por cada grupo de tratamiento.
P=0.0012 (Importante en un 99%) Ejemplo 4 (vehículo no peptidilo). Este ejemplo ilustra la administración transdérmica de un terapéutico basado en un nucleótido grande en la piel, utilizando un vehículo no peptidilo cargado positivamente de la presente invención en siete aplicaciones consecutivas diarias. Selección de la estructura: La estructura cargada positivamente fue ensamblada mediante el enlace covalente de -Gly3Arg7 a polietilénimina (PEÍ, MW 1 ,000,000) por medio del carboxilo de la terminal de glicina a las iminas libres de las cadenas laterales PEÍ en un grado de saturación del 30% (es decir, 30 de cada 100 residuos de lisina son enlazados covalentemente a un -Gly3Arg7). La estructura modificada fue designada "PEIR" para indicar un vehículo no peptidilo grande. La policación del control PEÍ sin modificar (designada "PEÍ", Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) del mismo tamaño y del mismo lote.
Selección del agente terapéutico: Para el presente experimento, se empleó un plásmido de 8.5 kilobases (plantilla basada en pSport, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) que contiene el transgen completo de la beta-galactosidasa de E. Coli (ßgal) y secuencias de flanqueo parcial promovidas por un promotor de citomegalovirus (CMV). Este plásmido particular tiene un peso molecular de aproximadamente 2,805,000. Preparación de las muestras: En cada caso, se empleó un exceso de policación para ensamblar un complejo final que tiene un excedente de carga positiva. La dosis terapéutica de nucleótidos fue estandarizada en todos los grupos y tuvo un volumen total y pH final de la composición que va a ser aplicada tópicamente. Las muestras fueron preparadas de la manera siguiente: Grupo marcado AS: Se mezclaron 8 microgramos de plásmido ßgal (p/CMV-sport-ßgal) por alícuota final (es decir, 240 microgramos en total), y el PEÍ de control a una proporción de carga de 5: 1 hasta la homogeneidad y se diluyeron en 600 microlitros con regulador Tris-EDTA. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 5.4 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros para los experimentos in vivo. Grupo marcado AT: Se emplearon 8 microgramos del plásmido ßgal (p/CMV-sport-ßgal) por alícuota final (es decir, 240 microgramos en total) y el vehículo no peptidilo compuesto PEIR ("PEIR") en una proporción de carga de 5: 1 hasta la homogeneidad y se diluyeron con 600 microlitros de regulador Tris-EDTA. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 5.4 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros para los experimentos in vivo. Grupo marcado AU: Se emplearon 8 microgramos de plásmido ßgal (p/CMV-sport-ßgal) por alícuota final (es decir, 240 microgramos en total) y vehículo no peptidilo Essentia altamente purificado PEIR ("PEIR puro") en una proporción de carga de 5: 1 hasta la homogeneidad y se diluyeron en 600 microlitros con regulador Tris-EDTA. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 5.4 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros para los experimentos in vivo. Experimentos en animales para determinar las eficiencias acumulativas de administración transdérmica después de 7 tratamientos de una vez al día con los vehículos no peptidilo v los terapéuticos nucleótidos: Los animales fueron anestesiados por medio de la inhalación de isoflurano durante la aplicación de los tratamientos. Después de ser anestesiados, a 6 ratones negros C57 (n=3 por grupo) se les midieron dosis de 200 microlitros del tratamiento apropiado aplicado a la porción craneal de la piel del lomo dorsal (seleccionado porque el ratón no pueda alcanzar esta región con la boca o los miembros). Los animales no pasaron por tratamiento depilatorio. Los animales fueron recuperados en un entorno de calor controlado para evitar la hipotermia y una vez que podían dar una respuesta, se les proporcionaron alimentos y agua ad libitum durante toda la noche. Este procedimiento se repitió una vez al día y a la misma hora del día aproximadamente durante 7 días. Después de 7 días de tratamiento, los ratones fueron eutanizados por medio de inhalación de CO2 y los segmentos de piel tratados fueron cultivados en su espesor completo por observadores a ciegas. Los segmentos tratados fueron divididos en tres porciones iguales de la porción craneal y la porción craneal fue fijada en formalina regulada neutral al 10% durante un período de 12 a 16 horas y luego almacenada en 70% de etanol hasta la incrustación de parafina. La porción central fue congelada instantáneamente y empleada directamente para la tinción de beta-galactosidasa en una temperatura de 37° Celsius en secciones como se describió anteriormente. El segmento caudal tratado fue congelado instantáneo para estudios de solubilización. Manejo de los datos v análisis estadístico: La recolección de datos y el análisis de imagen se realizaron por observadores a ciegas. Las secciones teñidas como se indicó anteriormente fueron fotografiadas en su totalidad en un microscopio Nikon E600 con lentes apochromat planos. Las imágenes resultantes pasaron por el procesamiento de análisis de imagen de lote utilizando el software Image Pro Plus con la confirmación manual para determinar el área positiva para la actividad de la enzima beta-galactosidasa. Estos resultados fueron normalizados a un área transversal total por cada uno y tabulados como un porcentaje de la tinción positiva transversal. Posteriormente, se determinaron el error promedio y estándar de cada grupo con el análisis de importancia en una confianza del 95% en mediciones repetidas ANOVA de una vía utilizando el software Statview (Abacus, Berkeley, CA). Resultados: Los resultados se resumen en la tabla siguiente y se ilustran en la figura 6. El vehículo de administración transdérmica no peptidilo -en ambas una forma compuesta y una forma ultrapura - logró aumentos estadísticamente importantes en la eficiencia de la administración y expresión del transgen contra el PEÍ . La forma ultrapura del PEI R exhibió una tendencia hacia eficiencias más altas que el PEI R estándar consistente con la actividad específica más alta calculada del reactivo. Tabla 3: Error promedio y estándar de la expresión acumulativa del transgen de beta-galactosidasa como un porcentaje del área total después de 7 aplicaciones de una dosis diaria por cada grupo de tratamiento.
P=0.0058 (Importante en un 99%) Conclusiones: El vehículo transdérmico no peptidilo puede transportar complejos grandes en la piel con altas eficiencias, particularmente debido a las restricciones de la expresión del transgen y el tamaño del complejo total que se explicó anteriormente. Aunque las eficiencias no son tan grandes como aquellas obtenidas con los complejos más pequeños de los vehículos peptidilo, se lograron ganancias importantes. Debe observarse, que la distribución de la expresión del transgen utilizando complejos no peptidilo grandes fue casi exclusivamente basada en el folículo del cabello, mientras que los resultados de los vehículos peptidilo fueron difundidos en todas las secciones transversales. Por lo tanto, el tropismo del tamaño y la estructura pueden ser empleados para trazar un objetivo de administración nano-mecánica. Ejemplo 5 Este experimento demuestra el uso de un vehículo peptidilo para transportar un complejo grande que contiene una toxina de botulino de proteína marcada intacta, en la piel intacta después de un solo momento de administración en relación con los controles. La toxina de botulino fue seleccionada aquí como un sistema de modelo para proteínas grandes, tales como agentes de inmunoleación, por ejemplo. Selección de la estructura: La estructura cargada positivamente fue ensamblada mediante el enlace covalente de -Gly3Arg7 para (MW 1 12,000) polilisina por medio del carboxilo de la terminal glicina a las aminas libres de las cadenas laterales de lisina en un grado de saturación del 18% (es decir, 18 de cada 100 residuos de lisina son enlazados covalentemente al -Gly3Arg7). La estructura modificada fue designada "KNR". La policación de control fue polilisina sin modificar (designada "K", Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) del mismo tamaño y del mismo lote. Agente terapéutico: La marca Botox® de toxina de botulino A (Allergan) fue seleccionada para este experimento. Tiene un peso molecular de aproximadamente 150,000. Preparación de las muestras: La toxina de botulino fue reconstituida de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un alícuota de la proteína fue biotinilado con un exceso molar calculado de 12 dobleces de sulfo-NHS-LC biotina (Pierce Chemical). El producto marcado fue designado como "Btox-b". En cada caso, se empleó un exceso de policación para ensamblar un complejo final que tiene un excedente de carga positiva como en la administración de complejos de nucleótidos grandes altamente negativos. Una carga positiva neutral neta evita la repulsión del complejo de proteína de los proteoglucanos de la superficie celular altamente negativos y la matriz extracelular. La dosis de Btox-b fue estandarizada en todos los grupos y como se hizo con el volumen total y el pH final de la composición que va a ser aplicada tópicamente. Las muestras se prepararon de la manera siguiente: Grupo marcado "JMW-7": Se mezclaron 2.0 unidades de Btox-b por alícuota (es decir, 20 U en total) y el vehículo peptidilo KNR en la proporción de MW calculada de 4: 1 hasta la homogeneidad y se diluyeron hasta 200 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 1.8 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros. Grupo marcado "JMW-8": Se mezclaron 2.0 unidades de Btox-b por alícuota (es decir, 20 U en total) y K en una proporción de carga de 4: 1 , hasta la homogeneidad y se diluyeron a 200 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 1 .8 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros. Experimentos en animales para determinar las eficiencias de administración transdérmica después de un tratamiento de una sola vez, con vehículo peptidilo v toxina de botulino marcada: Los animales fueron anestesiados por medio de inhalación de isoflurano durante la aplicación de los tratamientos. Después de haber sido anestesiados, 6 ratones negros C57 (n=4 por grupo) pasaron por la aplicación tópica de una dosis medida de 200 microlitros del tratamiento apropiado aplicada a la porción craneal en la piel del lomo dorsal (seleccionado porque el ratón no puede alcanzar esta región con la boca o los miembros). Los animales no pasaron por la depilación. A los 30 minutos después del tratamiento inicial, los ratones fueron eutanizados por medio de inhalación de CO2 y los segmentos de la piel tratados fueron cultivados en su espesor total por observadores a ciegas. Los segmentos tratados fueron divididos en tres porciones iguales; la porción craneal fue fijada en formalina regulada neutral al 10% durante un período de 12 a 16 horas y luego almacenada en 70% de etanol hasta la incrustación de parafina. La porción central fue congelada instantáneamente y empleada directamente para la visualización de biotina por los observadores a ciegas, como se resume más adelante. El segmento caudal tratado fue congelado instantáneamente para los estudios de solubilidad. La visualización de biotina fue conducida de la manera siguiente. Brevemente, cada sección fue sumergida durante 1 hora en solución de regulador NeutrAvidin®. Para visualizar la actividad de la fosfatasa alcalina, se lavaron secciones transversales en solución salina cuatro veces y luego se sumergieron en NBT/BCIP (Pierce Scientific) durante 1 hora. Las secciones entonces fueron enjuagadas en solución salina y fotografiadas en su totalidad en un microscopio Nikon E600 con lentes apochromat-planos. Manejo de los datos v análisis estadístico: La tinción total positiva fue determinada por un observador a ciegas, por medio del análisis de imagen de lote utilizando el software Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) y fue normalizado a un área transversal total para determinar el porcentaje de tinción positiva de cada uno. El error promedio y estándar fue determinado posteriormente por cada grupo con una importancia del análisis del 95% de confianza en mediciones repetidas ANOVA de una vía utilizando el software Statview (Abacus, Berkeley, CA). Resultados: El área transversal promedio positiva para la toxina de botulino biotinilada fue reportada como un porcentaje del área total después de la administración tópica de una sola vez del Btox-b, ya sea con KNR ("EB-Btox") ó K ("ni"). Los resultados se presentan en la siguiente tabla y están ilustrados en la figura 7. En la figura 7, el área positiva para la marca fue determinada como el porcentaje del área total después de tres días del tratamiento de una vez al día con "EB-Btox" el cual contenía Btox-b y un vehículo peptidilo KNR y "ni", que contenía Btoxb, con una policación K como control. El error promedio y estándar se ilustran por cada grupo. Tabla 4: Error promedio y estándar para el área de la toxina de botulino marcada como el porcentaje de la sección transversal total después de la administración tópica de una sola vez del Btox-b con KNR (JMW-7) ó K (JMW-8) durante 30 minutos. =0.0001 (Importante en un 99%) Ejemplo 6 El ejemplo 5 demostró que el vehículo transdérmico peptidilo permitió la transferencia eficiente de la toxina de botulino después de la administración tópica en un modelo múrido de piel intacta. Sin embargo, este experimento no indicó si la toxina de botulino de la proteína del complejo fue liberada en una forma funcional después de la translocalización en la piel. El siguiente experimento entonces fue construido para evaluar si la toxina de botulino puede ser administrada terapéuticamente a la piel intacta como un agente tópico utilizando este vehículo peptidilo (nuevamente, sin la modificación covalente de la proteína). La estructura cargada positivamente nuevamente fue ensamblada mediante el enlace covalente de -Gly3Arg7 a polilisina MW 1 12,000 por medio del carboxilo de la terminal de glicina libre de aminas de las cadenas laterales de lisina en un grado de saturación del 18% (es decir, 18 de cada 100 residuos de lisina son adheridos covalentemente al -Gly3Arg7). La estructura modificada fue designada como "KNR". La policación de control fue polilisina no modificada (designada "K", Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) del mismo tamaño y del mismo lote. El mismo agente terapéutico de toxina de botulino fue utilizado como en el ejemplo 5 y preparado de la siguiente manera. Las muestras fueron preparadas de la manera siguiente: Grupo marcado "JMW-9": Se mezclaron 2.0 unidades de toxina de botulino por alícuota (es decir, 60 U en total) y el vehículo peptidilo KNR en una proporción MW calculada de 4: 1 hasta la homogeneidad y se diluyeron a 600 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 5.4 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros. Grupo marcado "JMW-10": Se mezclaron 2.0 unidades de toxina de botulino por alícuota (es decir, 60 U en total) y K en una proporción de carga de 4:1 hasta la homogeneidad y se diluyeron a 600 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 5.4 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas en porciones de 200 microlitros. Grupo marcado "JMW-1 1 ": Se diluyeron 2.0 unidades de toxina de botulino por alícuota (es decir, 60 U en total) sin policación a 600 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 5.4 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros. Experimentos en animales para determinar la eficacia terapéutica después de un tratamiento de una sola dosis con vehículos de peptidilo v toxina de botulino: Los animales fueron anestesiados por medio de inhalación de isoflurano durante la aplicación de los tratamientos. Después de ser anestesiados, 6 ratones negros C57 (n=4 por grupo) pasaron por la aplicación tópica de una dosis medida de 400 microlitros del tratamiento apropiado aplicado de manera uniforme a partir de los dedos de las patas hasta el muslo medio. Se trataron ambos miembros y el tratamiento fue aleatorizado a cualquier lado. Los animales no pasaron por depilación. A los 30 minutos después del tratamiento inicial, se evaluaron los ratones para determinar la capacidad abducción digital de acuerdo con las calificaciones publicadas de abducción digital para la movilidad del pie después de la administración de toxina de botulino (Aoki, KR. Una comparación de los márgenes de seguridad de los serotipos de neurotoxina de botulino A, B, y F en los ratones. Toxicon. 2001 Dec; 39(12): páginas 1815 a 1820). También se evaluó de manera subjetiva la movilidad del ratón. Manejo de los datos v análisis estadístico: Las calificaciones de abducción digital fueron tabuladas independientemente por dos observadores con los ojos vendados. El error promedio y estándar fue determinado posteriormente por cada grupo con un análisis de una importancia del 95% de confianza en mediciones repetidas ANOVA de una vía utilizando un software Statview (Abacus, Berkeley, CA). Resultados: Las calificaciones de abducción digital promedio después de la administración tópica por una sola vez de la toxina de botulino con KNR ("JMW-9"), K ("JMW-10") o diluyente sin policación ("JMW-1 1 "), son presentadas en la tabla siguiente e ilustradas en la fotomicrografía representativa de la figura 8. El vehículo peptidilo KNR presentó una administración funcional de importancia estadística de la toxina de botulino en la piel en relación con ambos controles, los cuales fueron comparables entre ellos. Las repeticiones adicionales independientes (total de tres experimentos independientes todos con conclusiones idénticas en una parálisis estadísticamente importante de la toxina de botulino tópica con KNR, pero no los controles) del presente experimento confirmó los descubrimientos actuales y no reveló diferencias importantes entre la toxina de botulino tópica con o sin K (es decir ambos controles). De manera interesante, los ratones ambularon consistentemente hacia un miembro paralizado (lo cual ocurrió en un 100% de los animales tratados y 0% de controles de cualquiera de los grupos de control). Como se muestra en la figura 8, el miembro tratado con toxina de botulino más el control de polilisina de policación o con toxina de botulino sin policación ("Btox solo") puede movilizar los dígitos (con un mecanismo de defensa cuando son recogidos), pero los miembros tratados con toxina de botulino además del vehículo peptidilo KNR ("Loción Essentia Btox") no podrían ser movidos.
Tabla 5: calificaciones de abducción digital 30 minutos después de la aplicación tópica de una sola vez de toxina de botulino con el vehículo de peptidilo KNR ("JMW-9"), con una K de policación de control ("JMW-10") o solo ("JMW-1 1 ").
P=0.0351 (Importancia en un 95%) Conclusiones: Este experimento sirve para demostrar que el vehículo transdérmico peptidilo puede transportar una cantidad terapéuticamente efectiva de botulino terapéutico en la piel sin modificación covalente del terapéutico. El experimento también confirma que la toxina de botulino no funciona cuando es aplicada tópicamente en los controles. Ejemplo 7 Este experimento demuestra el funcionamiento del vehículo no peptidilo en la presente invención. Selección de la estructura: La estructura cargada positivamente fue ensamblada mediante el enlace covalente de -Gly3Arg7 a polietilénimina (PEÍ) MW 1 ,000,000 por medio del carboxilo de la terminal de glicina a las aminas libres de la cadena lateral PEÍ en un grado de saturación del 30% (es decir, 30 de cada 100 residuos de lisina son enlazados covalentemente al -Gly3Arg7). La estructura modificada fue designada "PEI R" para indicar un vehículo no peptidilo grande. La policación de control fue PEÍ sin modificar (designado "PEÍ", Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) del mismo tamaño y del mismo lote. El mismo agente terapéutico de toxina de botulino fue utilizado como en el ejemplo 5. La toxina de botulino fue reconstituida del producto BOTOX® de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En cada caso, se empleó exceso de policación para ensamblar un complejo final que tenía un exceso de carga positiva como en la administración de complejos de nucleótidos grandes de carga altamente negativa. Una carga positiva o neutral neta, evita la repulsión del complejo de proteína de los proteoglucanos de la superficie celular altamente negativa y la matriz extracelular. La dosis de toxina de botulino fue estandarizada en todos los grupos y tuvo un volumen total y pH final de la composición que va a ser aplicada tópicamente. Las muestras se prepararon de la manera siguiente: Grupo marcado "AZ": Se mezclaron 2.0 unidades de toxina de botulino por alícuota (es decir, 60 U total) y el vehículo no peptidilo PEI R en una forma ultrapura en una proporción MW calculada de 5: 1 hasta la homogeneidad y se diluyeron hasta 600 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 5.4 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros. Grupo marcado "BA": Se mezclaron 2.0 unidades de toxina de botulino por alícuota (es decir, 60 U total) y PEÍ en una proporción de carga de 5: 1 hasta la homogeneidad y se diluyeron a 600 microlitros con solución salina regulada por fosfato. La composición resultante fue mezclada hasta la homogeneidad con 5.4 ml de Cetaphil y se formaron alícuotas de porciones de 200 microlitros. Experimentos en animales para determinar la eficacia terapéutica después del tratamiento de una sola dosis: Los animales fueron anestesiados por medio de inhalación de isoflurano durante la aplicación de los tratamientos. Después de ser anestesiados, 6 ratones negros C57 (n=3 por grupo) pasaron por la aplicación tópica de una dosis medida de 400 microlitros del tratamiento apropiado aplicado de manera uniforme de los dedos de las patas al muslo medio. Se trataron ambos miembros y los tratamientos fueron aleatorizados a cada lado. Los animales no pasaron por depilación. A los 30 minutos después del tratamiento inicial, los animales fueron evaluados por su capacidad de abducción digital de acuerdo con las calificaciones de abducción digital publicadas para la movilidad de la pata después de la administración de toxina de botulino (Aoki, KR. Una comparación de los márgenes de seguridad de los serotipos de neurotoxina de botulino A, B, y F en los ratones. Toxicon. 2001 Dic; 39(12): páginas 1 81 5 a 1 820). También se evaluó subjetivamente la movilidad del ratón. Manejo de los datos v análisis estadístico: Las calificaciones de abducción digital fueron tabuladas independientemente por dos observadores a ciegas. El error promedio y estándar fueron determinados posteriormente por cada grupo con un análisis de importancia en un nivel de confianza del 95% en mediciones repetidas ANOVA de una vía utilizando el software Statview (Abacus, Berkeley, CA). Resultados: Las calificaciones de abducción digital promedio después de administración tópica de una sola vez de la toxina de botulino con PEIR ("AZ") ultrapuro o policación de control PEÍ ("BA") y repetición (una sola repetición independiente para este experimento), se presentan en las tablas siguientes. El vehículo no peptidilo PEIR, presentó una importancia estadística de administración funcional de toxina de botulino en la piel en relación con los controles. Igual que en lo anterior, se observaron que caminaran los ratones en círculos hacia los miembros paralizados. Tabla 6: Repetición 1. Calificaciones de abducción digital 30 minutos después de la administración tópica de una sola vez de toxina de botulino con PEIR ("AZ") ultrapuro, o policación de control PEÍ ("BA"). Se presentan el error promedio y estándar.
P=0.0002 (Importante en un 99%) Tabla 7: Repetición 2. Calificaciones de abducción digital 30 minutos después de la administración tópica de una sola vez de toxina de botulino con PEI R ("AZ1 ") ultrapuro, o policación de control PEÍ ("BA1 "). Se presentan el error promedio y estándar.
P=0.0001 (I mportante en un 99%) Conclusiones: Este experimentó demostró que el veh ículo transdérmico no peptidilo puede transportar dosis terapéuticas de toxinas botulínicas en la piel sin una modificación covalente anterior de la toxina de botulino. Estos descubrimientos complementan aquellos con los agentes de transferencia peptidilo. La opción de utilizar un vehículo no peptidilo o uno peptidilo para lograr el efecto terapéutico permitirá hacer diseños para circunstancias específicas, entornos y métodos de aplicación y agregar amplitud a la plataforma de administración transdérmica de la presente invención . En estos ejemplos, la penetración de la toxina de botulino, ya sea con los veh ículos peptidilo o no peptidilo contra la toxina de botulino tópica sin el vehículo, establece una utilidad adicional de la penetración transdérmica de los antígenos para la inmunización, particularmente para la inmunización con antígenos que cruzan la piel de una manera deficiente de otro modo, tales como el botulino.
La administración de una toxina de botulino funcional asegura que por lo menos cuatro epítopes diferentes han sido ad ministrados transdérmicamente en una condición intacta; el hecho de que la toxina de botulino funcional no fue administrada en ausencia del vehículo en cualquiera de los ejemplos, confirma que el vehículo proporciona un potencial de inmunización importante al agente en la ausencia del vehículo. Debido a que la inmunización requiere que los antígenos crucen la piel en una cantidad suficiente para montar una respuesta inmune, este método permite la administración transdérmica de un antígeno para la inmunización . Debido a que el método no requiere la modificación covalente del antígeno y no necesita comprender la transferencia del gen viral, surgen un número de ventajas en términos de estabilidad de seguridad y eficiencia. Eiemplo 8 Este experimento detalla la producción de vehículos peptidilo y no peptidilo con factores de eficiencia TAT, así como el ensamble de esos vehículos con toxinas botulínicas. Acoplamiento de polietilénimina (PEÍ ) del fragmento TAT GGGRKKRRQRRR: El fragmento TAT GGGRKKRRQRRR (6mg , 0.004 mmol, Sigma Genosys, Houston , TX), todo carente de grupos de protección de cadena lateral fue disuelto en 1 ml de un reg ulador M ES 0.1 M . A esto se le agregó EDC (3 mg, 0.01 6 mmol) seg uido por PEÍ 400k de peso molecular de solución al 50% (p:v) en agua, (-0.02 ml, -2.5 x 1 0-5 mmol). El pH fue determinado en 7.5 por el papel de prueba. Otra porción de 1 ml de MES 0.1 M fue agregada y el pH fue ajustado a -5 mediante la adición de HCl . Otra porción de EDC (5 mg, 0.026 mmol) fue agregada y la reacción, pH~5 fue agitada durante toda la noche. A la mañana siguiente, la mezcla de reacción fue congelada y liofilizada. Se formó pasta en una columna (1 cm de diámetro x 14cm de altura) de Sephadex G-25 (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ) en solución estéril 1 x PBS. La columna fue estandarizada mediante la elución de dextranos FITC (Sigma, St Louis, MO) teniendo un peso molecular de 19kD. El estándar inicialmente eluido en 5 ml de PBS, tenía un pico medio en 6 ml y una cola en 7 ml. La mezcla de reacción liofilizada de lo anterior fue disuelta en un volumen pequeño de PBS y aplicada a la columna. Fue eluida mediante aplicaciones sucesivas de 1 ml de PBS. Las fracciones fueron recolectadas consistiendo la primera de los primeros 3 ml eluidos, incluyendo el volumen de reacción. Las fracciones posteriores fueron de 1 ml. Las fracciones eluidas fueron analizadas para determinar la absorbancia UV en 280 nm. Las fracciones 3, 4 y 5 correspondientes de 5 a 7 ml fueron definidas como un pico de absorbancia modesto. Todas las fracciones fueron liofilizadas y se tomaron los espectros IR. El pico triple característico de guanidina (2800-3000 cm-1 ) del fragmento TAT se vio en las fracciones de la 4 a la 6. Estas fracciones también mostraron un estiramiento de amida en 1700 cm-1 confirmando de este modo, el conjugado del fragmento TAT y el fragmento PEÍ . Se corrió otra iteración utilizando el fragmento TAT GGG RKKRRQRRR (1 1 .6 mg , 0.007 mmol). Esta cantidad fue calculada de modo que una de 30 de las aminas PEÍ se esperaría que se hicieran reaccionar con el fragmento TAT. Esto aproxima la composición del factor de eficiencia de oligoarginina-polilisina original (KN R) descrito anteriormente. El enlace covalente exitoso del fragmento TAT a las aminas PE Í fue confirmado mediante I R como el anterior. Acoplamiento de la Polilisina al fragmento TAT: U na solución de polilisina (1 0 mg 1 .1 x 1 0-4 mmol; Sigma) en 1 ml de MES 0.1 M , pH -4.5 se agregó el fragmento TAT (4 mg , 0.003 mmol) y luego se agregó EDC (3.5 mg , 0.01 83 mmol). La mezcla de reacción resultante (pH - 4.5) fue agitada a temperatura ambiente. La reacción fue congelada a una temperatura de -78°C durante la noche. Al día siguiente la mezcla de reacción fue descongelada a temperatura ambiente y el pH fue ajustado a -8 mediante la adición de bicarbonato de sodio saturado. La mezcla de reacción fue aplicada directamente a la columna Sephadex G-25 constituida y estandarizada como se describió anteriormente. Se eluyó en siete fracciones de 1 ml iniciando después de 5 ml . Se tomó la absorbancia UV en 280, revelando un pico relativo en las fracciones 2, 3 y 4. El I R de las fracciones liofilizadas revelaron el pico característico de guanidina (2800-3000 cm-1 ) en las fracciones del 1 al 7. La fracción 1 ten ía un pico fuerte en 1 730 cm-1 y nada en 1 600 cm-1 , pero las fracciones del 2 al 6 fue realidad lo opuesto. Por lo tanto, se confirmó el enlace covalente exitoso del fragmento TAT al vehículo peptidilo, polilisina, . El fragmento TAT enlazado covalentemente y el PEÍ (PEIT) y el fragmento TAT enlazado covalentemente y la polilisina (KNT) fueron mezclados posteriormente con una toxina de botulino para formar un complejo no covalente como el siguiente: Grupo marcado "J L-1 ": Se mezclaron 2.0 unidades de Btox-b por alícuota (es decir, 20 U en total) y PEIT en una proporción de carga de 4: 1 hasta la homogeneidad y diluidas en 200 microlitros con solución salina regulada por fosfato. Grupo marcado "J L-2": Se mezclaron 2.0 unidades de Btox-b por alícuota (es decir 20 U en total) y KNT en una proporción de carga de 4: 1 hasta la homogeneidad y se diluyeron a 200 microlitros con solución salina regulada por fosfato. Después de la formación del complejo no covalente, las partículas fueron centrifugadas a 12, 000 x g en una microcentrífuga rotatoria durante 5 minutos y luego se volvieron a suspender en 20 microlitros de agua desionizada y se evaporaron en una celda de reflectancia total atenuada con Germanio para el I R. La presencia del Btox-b en los complejos fue confirmada de este modo. En general , este experimento confirmó que los esquemas sintéticos podrían ser aplicados a otros factores de eficiencia y los vehículos resultantes pueden formar complejos con un agente biológicamente activo - en este caso toxina de botulino - como los agentes anteriores utilizando vehículos con ramificación de oligoarginina cargada positivamente o grupos de eficiencia. Eiemplo 9 Este experimento demuestra el funcionamiento del vehículo peptidilo para la elaboración de imagen de un antígeno específico. En este ejemplo, los complejos de uno de los veh ículos peptidilo Essentia, KNR2, con porciones de elaboración de imagen óptica y anticuerpos modificados que tienen como objetivo el melanoma, son adecuados para la detección tópica del melanoma. Selección de la estructura: La estructura peptidilo cargada positivamente fue ensamblada mediante el enlace covalente de -Gly3Arg7 a polilisina (MW 1 50, 000) por medio del carboxilo de la terminal glicina a las aminas libres de las cadenas laterales de lisina en un grado de saturación del 1 8% (es decir, 1 8 de cada 1 00 residuos de lisina son enlazados covalentemente al -Gly3Arg7). La estructura modificada fue designada "KNR2". La policación de control fue polilisina sin modificar (designada "K2", Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) del mismo tamaño y del mismo lote. U n anticuerpo monoclonal múrido en un campo de melanoma humano conservado, gangliosida 2, (IgG3, US Biologicals, Swampscott, MA) fue enlazado covalentemente a una cadena corta de anión de poliaspartato (MW 3,000) por medio del acoplamiento de EDC como la anterior para generar un anticuerpo derivado designado como "Gang2Asp". Adicionalmente, se diseñó el agente de elaboración de imagen aniónico utilizando un oligonucleótido como el polianión en donde la secuencia fue ATGC-J (designada en lo sucesivo "ATGC-J") representado con "J" un fluoroforo de Rojo Texas enlazado, (Sigma Genosys, Woodlands, TX). Para este experimento, se combinaron 6.35 microgramos de Gang2Asp con 0.1 712 microgramos de ATGC-J y luego se formó el complejo con 17.5 microgramos de KNR2 en un volumen total de 200 microlitros de agua desionizada para lograr una proporción final de 5: 1 : 1 : : KN R2:ATGC-J : Gang2Asp. La mezcla fue sometida a agitación de vórtice durante 2 min utos. Los complejos resultantes fueron aplicados a partes de Melanoma H umano CelITek hidratadas y partes de Citoqueratina CelITeck (SDL, Des Plaines, I L) y se incubaron durante 5 minutos antes de la eval uación fotográfica de la distribución de fluorescencia contra la distribución del campo de brillo del pigmento de melanoma en el mismo campo. También se empleaeon los controles adicionales sin ATGC-J o sin Gang2Asp. Resultados: Los complejos no covalentes proporcionaron una distribución del agente de elaboración de imagen óptica que siguió el tropismo del derivado del anticuerpo, en vez de la distribución de los complejos en ausencia del anticuerpo. Lo que es más importante, los complejos siguieron una distribución que coincidía con las células de melanoma pigmentadas como se ilustra en la figura 9. Concl usiones: Este experimento demuestra la producción de un complejo viable de transporte en la piel y visualización del melanoma a través de técnicas ópticas utilizando un vehícu lo adecuado para la administración tópica. Dicho método podría ser empleado, por ejemplo, en conjunto con el establecimiento del margen quirúrgico o podría ser empleado en la vigilancia de rutina del melanoma. Estrategias similares podrían ser empleadas fácilmente para la diagnosis tópica de otros padecimientos también relacionados con la piel , como lo podrán apreciar aquellos expertos en la técnica. Debido a la sensibilidad muy alta de las porciones de elaboración de imagen óptica, se podría lograr una promesa importante en la detección mejorada de estos padeci mientos a través de estos complejos no covalentes. Eiemplo 1 0 Este experimento demuestra la eficiencia y profundidad de penetración de un vehículo peptidilo en la administración transdérmica de una mezcla de proteínas de diferente tamaño y estructura. Métodos: Las proteínas Revitix [Organogénesis, Cantón, MA] fueron biotiniladas y almacenadas a una temperatura de 4° Celsius. La concentración de las proteínas Revitix biotiniladas utilizadas fue de 1 0 a 1 5 ng/µl. El artículo de prueba y los controles comparativos en este estudio se muestran en la Tabla 1 . Este estudio tuvo dos controles, uno con agua desionizada con un pH acoplado al Revitix y el otro con Revitix por el mismo. El artículo de prueba para el grupo de tratamiento fue Revitix con el veh ículo peptidilo. Tabla 8: Descripción del artículo de prueba y controles comparativos Experimentos en animales para determinar la eficiencia acumulativa de la administración transdérmica después de tratamientos de 2 y 9, una vez al día con vehículos peptidilo y proteínas Revitix: Se anestesiaron 6 ratones hembra negros C57 (n=5 por grupo) mediante la inhalación de isoflurano y luego se inyectaron con 0.05 ml de un cocktail anestésico de roedores (de 3.75 ml de 1 00 mg/ml de Cetamina, 3.00 ml de 20 mg/ml de Xilazina, y 23.25 ml de solución salina) intraperitonealmente. Después de que fue anestesiado cada ratón , se rasuró cuidadosamente un sitio de dosis de 2.0 cm x 2.0 cm en el dorso de cada ratón con un sujetador de cabello (Oster) dos días antes del primer día de la aplicación del primer día de tratamiento. Los animales no pasaron por tratamiento depilatorio adicional . Los animales fueron anestesiados mediante la inhalación de isoflurano solamente durante la aplicación de los tratamientos en una crema humectante Cetaphil (Galderma, Fort Worth, TX) y se habían medido dosis de 200 microlitros del tratamiento apropiado aplicado a la porción del cráneo y la piel del lomo dorsal (seleccionado porque el ratón no puede alcanzar esta región con el hocico o con los miembros). Los animales permanecieron bajo anestesia por un período de 2 a 5 minutos mientras que fueron frotados a tratamientos apropiados en la piel con cubiertas de dedos. Los animales fueron recuperados en un ambiente de calor controlado para evitar la hipotermia y una vez que estaban aptos para responder se les proporcionó alimento y agua ad libitum durante la noche. Este procedimiento se repitió una vez al día a la misma hora del día aproximada durante 2 y 9 d ías. Después de un tratamiento de 2 y 9 días, los ratones fueron eutanizados por medio de la inhalación de CO2, y los segmentos de la piel tratada fueron recolectados en un espesor completo y observadores con los ojos vendados a las 8 horas posteriores a la aplicación del último tratamiento. Los segmentos tratados fueron divididos en tres porciones iguales, la porción del cráneo fue fijada en formalina regulada neutral al 1 0% durante un período de 12 a 16 horas y luego almacenadas en etanol al 70% hasta la incrustación en parafina. La porción central fue empleada para NeutrAvidin , Hematoxilina y Eosina y tinción específica de Cloroesterasa. El segmento caudal tratado fue congelado instantáneamente para estudios de solubilización . Manejo de los datos y análisis estadístico: La recolección de datos y el análisis de imagen fueron realizados por observadores a ciegas. Las secciones teñidas fueron fotografiadas con una cámara Retiga 1300B (Qlmaging, Burnaby, BC, Canadá) en un microscopio Nikon E600 con lentes apochromat-planos. La tinción positiva fue determinada por un observador a ciegas utilizando un software de análisis I mage-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Springs, MD) con la extracción del canal verde y la elaboración del umbral y expresadas como pixeles positivos. El análisis estadístico fue determinado posteriormente por cada grupo utilizando el software Statview® (Abacus Concepts, Berkeley, CA) y expresado como el error promedio y estándar. La importancia estadística para todas las comparaciones fue determinada utilizando mediciones repetidas ANOVA de un factor y la prueba post-hoc Fisher PLSD en un nivel de confianza del 95%. Resultados: Las proteínas Revitix fueron marcadas con biotina y se mostró un buen marcado en la variedad de proteínas. La tinción de neutravidina fue utilizada para determinar la administración transdérmica de la proteína de Revitix. Las fotografías del grupo de control (paneles a, c y e) contra el grupo de tratamiento (b, d y f) en dos magnificaciones diferentes se muestra en la figura 10, en donde a y b se encuentran en una magnificación de 10X, y del c al f están en magnificaciones de 20X. El promedio de tinción positiva de neutravidina fue utilizado para la comparación. La tinción positiva promedio del Revitix más la estructura fue significativamente más alta que el agua en el día 3 (50.297 ± 6.394 contra 16.676 ± 2.749) y el Revitix solo (50.297 ± 6.394 contra 18.379 ± 6.394; P = 0.0041 ). Tabla 9: Tinción positiva de NeutraAvidin. Se presentan el error promedio y estándar.
P=0.0041 (Importancia en un 95%) Conclusión: El análisis de gen de las proteínas marcadas con biotina permitió la comparación de la marca in vitro. El punto del tiempo del día 2 fue utilizado para determinar el flujo. Este experimento confirmó un aumento en la importancia estadística en la administración transdérmica de las proteínas marcadas contra ambos grupos de control. Tanto la profundidad como la cantidad de la señal aumentaron de manera notable en el grupo del vehículo contra los controles. De manera interesante, una población diversa de proteínas fue transportada por la piel con estas partículas previamente ensambladas tal y como lo verifica la electroforesis de gel y las evaluaciones espaciales de los tropismos. Eiemplo 11 Estos experimentos demuestran una plataforma de elaboración de imagen molecular novedosa con capacidad de una administración transepitelial al objetivo de muestras fluorescentes mediante el uso del vehículo peptidilo y anticuerpos del antígeno de tumor.
Estructura: La estructura peptidilo cargada positivamente fue ensamblada mediante el enlace covalente de -Arg9 a polisina (MW 1 50, 000) por medio del carboxilo de la terminal glicina a las aminas libres de las cadenas laterales de lisina en un grado de saturación del 1 8% (es decir, 1 8 de cada 1 00 residuos de lisina son enlazados covalentemente al -Arg9). La estructura modificada fue designada "KNR". La policación de control fue polilisina sin modificar (designada "K" Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO) del mismo tamaño y del mismo lote. Métodos: Diseño de la Muestra: La prueba es un sistema de componentes múltiples que se auto-ensamblan basada en las interacciones electrostáticas. Dicho sistema permite la substitución fácil de las porciones funcionales. El componente central es una estructura de vehículo que tiene un excedente de cargas positivas y múltiples CPPs enlazados. Todas las cargas son cargadas negativamente. El complejo final tiene una carga positiva neta para mantener la actividad de transporte. Toxicidad del veh ículo in vitro: Se probó la toxicidad de la siguiente estructura de vehículo: 1 . KN R 2. Poli-L-lisina sin cadenas laterales R9 (K) 3. Superfect (Qiagen , Valencia, CA), un agente de transfección comercial Las células HeLa (ATCC, Manassas, VA) cultivadas en una confluencia del 70% fueron incubadas con 0.4mg de vehículos (n=6 depósitos/grupos) en un medio libre de suero durante 2 horas y luego lavadas con PBS. La toxicidad fue evaluada utilizando un ensayo de exclusión del tinte estándar en donde las células viables excluyen el tinte mientras las no viables no lo hacen. La asimilación del tinte fue medida utilizando un espectrofotómetro (Spectronic Genesys 5 UV/VIS) en una longitud de onda de 595nm. Las muestras fueron estandarizadas al número de células mediante el ajuste de concentraciones para que coincidieran los valores OD280 anteriores con las mediciones OD595. Administración transdérmica del gen reportador in vivo: Para determinar si el vehículo KNR puede administrar cargas de peso molecular grande en la forma de genes reportadores de bioluminiscencia en la barrera del tejido (piel), se probaron las siguientes muestras con estructuras de vehículos variables: 1 . Estructuras: KNR; Controles-K, Superfect, sin vehículo 2. Porciones de carga y elaboración de imagen: El plásmido que expresa la proteína fluorescente azul (BFP, 8kb, 2.6 millones de MW) Los complejos de plásmido-estructura (8µg plásmido) fueron formados por medio de interacciones iónicas (estructura catiónica-ADN aniónico) y luego aplicados a la piel dorsal de 6 ratones negros C57 (n=4 por grupo) diariamente durante 7 días. Los segmentos de la piel tratadas fueron recolectados y la expresión de BFP fue evaluada mediante microscopía de fluorescencia. La eficiencia transdérmica de la administración de gen fue determinada mediante el % de células BFP positivas / células totales solamente en la dermis. Administración al objetivo de muestras de elaboración de imagen a células del tumor: Para determinar si el sistema KNR puede proporcionar una administración al objetivo de las muestras de elaboración de imagen óptica a los antígenos del cáncer de colon, se probaron las siguientes muestras con componentes de envío al objetivo variables: 1. Estructura: KNR 2. Porción de elaboración de imagen: Un oligonucleótido de 4-bases (Sigma-Genosys) marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC, Molecular Probes) 3. Porciones de envío al objetivo: a) Anticuerpo monoclonal para el antígeno del carcinoembriónico (CEA; clon CD66e, US Biological) conjugado covalentemente con poliaspartato aniónico (3K MW) por medio de un acoplamiento EDC; b) Control-Anticuerpo monoclonal para la actina (clon 3G 1 , US Biological) conjugado a poliaspartato. La siguiente formación de los complejos de envío al objetivo de elaboración de imagen KNR, co-cultivados (n=6 depósitos/grupos) en células del carcinoma del colon humano (LS174T, ATCC) que sobre-expresan el CEA y los fibroblastos de ratón de control (3T3, ATCC) fueron incubados con complejos en medios libres de suero durante 2 horas. Las células fueron lavadas posteriormente 3X's con PBS. La administración al objetivo fue evaluada mediante el porcentaje de cuantificación de las células LS174T y las células 3T3 marcadas con FITC. Las células 3T3 y las células LS 174T fueron identificadas mediante la morfología. Resultados: La eficiencia mayor de 20X logrado por el KNR en la administración transdérmica y la expresión del transgen del BFP contra el control (5% ± 2.12% contra 0.25% ± 0.06%, P<0.01 ), que valida la posibilidad de la administración tópica de los complejos lo suficientemente grandes para la elaboración de imagen molecular. En la evaluación de la administración al objetivo, la fluoresceína y las señales TR, cada uno fue un componente diferente del complejo, co-localizada en 40.2% de pixeles de la célula del carcinoma del colon (correlación phi 0.74, P<0.001 ). Las células de fibroblasto de control fueron mínimamente marcadas con fluoresceína o TR mientras que las células de carcinoma de colon 87.6% ± 8.3% fueron positivas para la señal de fluoresceína. Los resultados de la toxicidad relativa de las estructuras del vehículo se muestran en la figura 1 1 y los resultados de la eficiencia de administración de gen transdérmico se muestran en la figura 12. Imagen de campo de brillo del carcinoma de colon (C) y fibroblastos (F, forma de husillo) co-cultivadas después de la aplicación de la muestra de elaboración de imagen específica de CEA (panel a) y la imagen de fluorescencia que muestra la etiquetación de fl uoresceína del carcinoma de colon pero no los fibroblastos (panel b) se ilustran en la figura 1 3. Tabla 10: Administración transdérmica y expresión del transgen de las muestras de elaboración de imagen. Se presentan en porcentaje el error promedio y estándar.
P<0.01 (I mportancia en 99%) Conclusión : La administración transdérmica de un complejo grande (gen BFP) después de la aplicación tópica y la administración al objetivo de una muestra óptica con paralelos a la distribución del antígeno fueron demostradas utilizando el KN R. Estos estudios confirman la posibilidad de utilizar este sistema para la vigilancia tópica del melanoma o la detección de la submucosa del cáncer de colon . Como lo podrán apreciar aquellos expertos en la técnica, esta plataforma puede ser utilizada para administración al objetivo de productos terapéuticos diagnósticos o combinaciones de ambos. Además, esta plataforma puede ser utilizada para la elaboración de imagen de tiempo real por medio de la colonoscopía o la dematoscopía (o visualización directa), así como los métodos de elaboración de imagen, tales como la colonoscopía virtual. Deberá quedar entendido que los ejemplos y modalidades aquí descritos son solamente para propósitos de ilustración y que los expertos en la técnica podrán sugerir varias modificaciones o cambios a la luz de estas enseñanzas los cuales van a estar incluidos dentro del alcance y propósito de la presente solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente aquí citadas, están incorporadas como referencia en su totalidad para todos los propósitos.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 . Una composición que comprende una proteína biológicamente activa y un vehículo el cual comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente y el cual está presente en una cantidad efectiva para la administración transdérmica, en donde la asociación entre el vehículo y la proteína biológicamente activa no es covalente. 2. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 , en la cual la proteína terapéutica excluye la insulina, toxinas botulínicas, VEGF y fragmentos de anticuerpo. 3. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 2, en la cual la proteína terapéutica no altera terapéuticamente los niveles de glucosa en la sangre. 4. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 2, en la cual la proteína terapéutica excluye las toxinas botulínicas de botulino. 5. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 2, en la cual la proteína terapéutica excluye el VEGF. 6. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 2, en la cual la proteína terapéutica excluye fragmentos de anticuerpos. 7. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada porque la composición proporciona una administración transdérmica mayor de la proteína biológicamente activa en relación con el agente en ausencia del vehículo. 8. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 7 , en la cual la proteína biológicamente activa tiene una actividad terapéutica. 9. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 8, en la cual la proteína terapéutica tiene un peso molecular menor de 20, 000 kD. 1 0. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 , en la cual la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente. 1 1 . U na composición tal y como se describe en la reivindicación 1 0, en la cual la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 0,000 a aproximadamente 1 , 500, 000. 12. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 0, en la cual la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 25, 000 a aproximadamente 1 ,200, 000. 1 3. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 0, en la cual la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 00, 000 hasta aproximadamente 1 , 000 , 000. 14. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 0, en la cual la estructura comprende una polilisina cargada positivamente. 1 5. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 14, en la cual la estructura comprende una polilisina cargada positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 0, 000 a aproximadamente 1 , 500, 000. 1 6. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 14, en la cual la estructura comprende una polilisina cargada positivamente que tiene u n peso molecular de aproximadamente 25, 000 a aproximadamente 1 ,200, 000. 1 7. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 14, en la cual la estructura comprende una polilisina cargada positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 00, 000 a aproximadamente 1 , 000,000. 1 8. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 1 , en la cual la estructura comprende un polímero no peptidilo cargado positivamente. 1 9. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 18, en la cual la estructura de polímero no peptidilo comprende un polialquilénimina cargada positivamente. 20. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 9, en la cual la polialquilénimina es una polietilénimina. 21 . Una composición tal y como se describe en la reivindicación 20 , en la cual la polietilénimina tiene un peso molecular de aproximadamente 1 0, 000 a aproximadamente 2, 500, 000. 22. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 20, en la cual la polietilénimina tiene un peso molecular de aproximadamente 1 00, 000 a aproximadamente 1 , 800 , 000. 23. ' Una composición tal y como se describe en la reivindicación 20, en la cual la polietilénimina tiene un peso molecular de aproximadamente 500, 000 a aproximadamente 1 ,400, 000. 24. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizada porque el veh ículo comprende una estructura polimérica que tiene adheridos grupos de ramificación cargados positivamente seleccionados de -(gly)n 1 -(arg)n2, VI H-TAT y fragmentos de los mismos y PTD Antenapedia y fragmentos de los mismos, en el cual el subscrito n 1 es un entero de aproximadamente 0 a aproximadamente 20 y el subscrito n2 es independientemente un entero non de aproximadamente 5 a aproximadamente 25. 25. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 24, en la cual los grupos de ramificación cargados positivamente son seleccionados de grupos que tienen la fórmula 26. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 25, en la cual el subscrito n 1 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 8. 27. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 25, en la cual el subscrito n 1 es un entero de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. 28. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 25 , en la cual el subscrito n2 es un número non de aproximadamente 7 a aproximadamente 17. 29. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 25, en la cual el subscrito n2 es un número non de aproximadamente 7 a aproximadamente 1 3. 30. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 24, en la cual los grupos de ramificación son seleccionados de VI H-TAT y fragmentos del mismo. 31 . U na composición tal y como se describe en la reivindicación 30, en la cual los grupos de ramificación cargados positivamente enlazados son fragmentos de VI H-TAT que tienen una fórmula (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q, ó (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q en donde los subscritos p y q son cada uno independientemente un entero de aproximadamente 0 a 20. 32. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 24, en la cual los grupos de ramificación son grupos PTD Antenapedia o fragmentos de los mismos. 33. U na composición la cual comprende un agente biológicamente activo que no es nucleótido ni proteína y un veh ículo el cual comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente y la cual está presente en una cantidad efectiva para la administración transdérmica, caracterizado porque la asociación entre el vehículo y el agente biológicamente activo no es covalente. 34. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 33, caracterizado porq ue la composición proporciona una administración transdérmica mayor del agente biológicamente activo en relación con el agente en ausencia del veh ículo. 35. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 34, en la cual el agente biológicamente activo tiene una actividad terapéutica. 36. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 33, en la cual la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente. 37. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 36, en la cual la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 0,000 a aproximadamente 1 ,500, 000. 38. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 36, en la cual la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 25, 000 a aproximadamente 1 ,200, 000. 39. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 36, en la cual la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 00,000 a aproximadamente 1 , 000, 000. 40. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 36, en la cual la estructura comprende una polilisina cargada positivamente. 41 . Una composición tal y como se describe en la reivindicación 40, en la cual la estructura comprende una polilisina cargada positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 0, 000 a aproximadamente 1 ,500, 000. 42. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 40, en la cual la estructura comprende una polilisina cargada positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 25, 000 a aproximadamente 1 ,200, 000. 43. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 40, en la cual la estructura comprende una polilisina cargada positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 00, 000 a aproximadamente 1 , 000, 000. 44. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 33 , en la cual la estructura comprende un polímero no péptidilo cargado positivamente. 45. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 44, en la cual la estructura de polímero no péptidilo comprende una polialquilénimina cargada positivamente. 46. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 45, en la cual la polialquilénimina es una polietilénimina. 47. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 46, en la cual la polietilénimina tiene un peso molecular de aproximadamente 1 0, 000 a aproximadamente 2,500,000. 48. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 46, en la cual la polietilénimina tiene un peso molecular de aproximadamente 1 00, 000 a aproximadamente 1 , 800, 000. 49. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 46, en la cual la polietilénimina tiene un peso molecular de aproximadamente 500, 000 a aproximadamente 1 ,400,000. 50. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 33, en la cual el vehículo comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente seleccionados de -(gly)n 1 -(arg)n2, VI H-TAT y fragmentos de los mismos y PTD Antenapedia y fragmentos en los mismos, en el cual el subscrito n 1 es un entero de aproximadamente 0 a aproximadamente 20 y el subscrito n2 es independientemente un entero non de aproximadamente 5 a aproximadamente 25. 51 . Una composición tal y como se describe en la reivindicación 50 , en la cual los grupos de ramificación cargados positivamente son seleccionados de grupos que tienen la fórmula -(gly)m-(arg)n2. 52. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 51 , en la cual el subscrito n 1 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 8. 53. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 51 , en la cual el subscrito n1 es un entero de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. 54. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 51 , en la cual el subscrito n2 es un número non de aproximadamente 7 a aproximadamente 17. 55. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 51 , en la cual el subscrito n2 es un número non de aproximadamente 7 a aproximadamente 13. 56. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 50, en la cual los grupos de ramificación son seleccionados de VIH-TAT y fragmentos del mismo. 57. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 56, en la cual los grupos de ramificación cargados positivamente enlazados son fragmentos VIH-TAT que tienen la fórmula (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q ó (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q en donde los subscritos p y q son independientemente un entero de 0 a 20. 58. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 50, en la cual los grupos de ramificación son grupos PTD Antenapedia o fragmentos del mismo. 59. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 33, la cual contiene de aproximadamente 1 x 10-20 a aproximadamente 25% en peso del agente biológicamente activo y de aproximadamente 1 x 10-19 a aproximadamente 30% en peso del vehículo. 60. Una composición de liberación controlada tal y como se describe en la reivindicación 33. 61 . Un equipo para la administración de una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 a un sujeto el cual comprende un aparato para la administración del agente biológicamente activo y un vehículo el cual comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente y los cuales están presentes en una cantidad efectiva para la administración transdérmica. 62. Un equipo tal y como se describe en la reivindicación 60 caracterizado porque el agente biológicamente activo excluye la insulina, toxinas botulínicas, VEGF y fragmentos de anticuerpo. 63. Un equipo tal y como se describe en la reivindicación 62, en el cual la composición está contenida en un aparato para la administración de una proteína biológicamente activa a un sujeto por medio de la piel o el epitelio. 64. Un equipo tal y como se describe en la reivindicación 63, en el cual el aparato es un parche para la piel. 65. Un equipo para la administración de una proteína biológicamente activa a un sujeto el cual comprende un aparato para administrar la proteína biológicamente activa a la piel o epitelio y una composición que comprende un vehículo polimérico que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente seleccionados de -(gly)n?-(arg)n2, VI H-TAT y fragmentos de los mismos y PTD antenapedia y fragmentos del mismo, en el cual el subscrito n 1 es un entero de 0 a aproximadamente 20 y el subscrito n2 es independientemente un entero o non de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, caracterizado porque la asociación entre el vehículo y la proteína biológicamente activa no es covalente. 66. Un equipo tal y como se describe en la reivindicación 65, en el cual el aparato es un parche para la piel. 67. Un método de administración de una proteína biológicamente activa a un sujeto que comprende la aplicación tópica a la piel o epitelio del sujeto de la proteína en conjunto con una cantidad efectiva de un vehículo que comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente, caracterizado porque la asociación entre el vehículo y la proteína biológicamente activa no es covalente. 68. Un método tal y como se describe en la reivindicación 66, caracterizado porque la composición proporciona una administración transdérmica mayor de la proteína biológicamente activa en relación con el agente en ausencia del vehículo. 69. Un método tal y como se describe en al reivindicación 68, en el cual la proteína biológicamente activa tiene actividad terapéutica. 70. Un método tal y como se describe en al reivindicación 69, caracterizado porque la proteína terapéutica excluye la insulina, toxina de botulino, VEGF y fragmentos de anticuerpos. 71 . Un método tal y como se describe en la reivindicación 69, caracterizado porque la proteína terapéutica no altera terapéuticamente los niveles de glucosa en la sangre. 72. Un método tal y como se describe en la reivindicación 69 , caracterizado porque la proteína terapéutica excluye la toxina de botulino. 73. U n método tal y como se describe en la reivindicación 69 , caracterizado porq ue la proteína terapéutica excluye fragmentos de anticuerpos. 74. U n método tal y como se describe en la reivindicación 69, caracterizado porque la proteína terapéutica excluye el VEG F. 75. Un método de administración de un agente biológicamente activo que no es nucleótido ni proteína, a un sujeto que comprende la aplicación tópica a la piel o epitelio del sujeto de un agente biológicamente activo en conjunto con una cantidad efectiva de un vehículo que comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente, caracterizado porque la asociación entre el vehículo y el agente biológicamente activo no es covalente. 76. U n método tal y como se describe en la reivindicación 75 , caracterizado porque la composición proporciona una administración transdérmica mayor del agente biológicamente activo en relación con el agente en ausencia del vehículo. 77. Un método tal y como se describe en la reivindicación 76, caracterizado porque el agente biológicamente activo tiene una actividad terapéutica. 78. Un método tal y como se describe en la reivindicación 75, caracterizado porque la proteína biológicamente activa y el vehículo son administrados al sujeto en una composición que contiene ambos componentes. 79. U n método tal y como se describe en la reivindicación 75, caracterizado porque la proteína biológicamente activa y el vehículo son administrados por separado al sujeto. 80. U n método tal y como se describe en la reivindicación 77, caracterizado porque la proteína biológicamente activa y el vehículo son administrados al sujeto en una composición que contiene ambos componentes. 81 . Un método tal y como se describe en la reivindicación 77, caracterizado porque el agente biológicamente activo y el vehículo son administrados por separado al sujeto. 82. U n método tal y como se describe en la reivindicación 75, caracterizado porque la composición es una composición de liberación controlada. 83. U n método tal y como se describe en la reivindicación 77, caracterizado porque la composición es una composición de liberación controlada. 84. Un método tal y como se describe en la reivindicación 75, caracterizado porque el agente biológicamente activo que no es nucleótido ni proteína, es un agente antimicótico. 85. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 33 caracterizada porque el agente biológicamente activo, es un agente antimicótico. 86. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 85 la cual contiene de aproximadamente 1 x 1 0 e-1 0 a aproximadamente 49.9% en peso del agente biológicamente activo y de aproximadamente 1 x 1 0 e-9 a aproximadamente 50% en peso del vehículo. 87. U na composición de liberación controlada tal y como se describe en la reivindicación 85. 88. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 85, caracterizada porque el agente antimicótico es seleccionado de amfotericina B, fluconazol , flucitosina, itraconazol, quetoconazol , clotpmazol , econozol, griseofulvina, miconazol, nistatina, ciclopirox y similares. 89. Un equipo para la administración de un agente biológicamente activo que no es nucleótido ni proteína a un sujeto, el cual comprende un aparato para administrar el agente a la piel o epitelio del sujeto y una composición tal y como se describe en la reivindicación 33. 90. U n equipo tal y como se describe en la reivindicación 89, el cual comprende además un aplicador acostumbrado. 91 . U n equipo tal y como se describe en la reivindicación 89 caracterizado porque el agente es un agente antimicótico y la composición está contenida en un aparato para la administración de un agente antimicótico a un sujeto por medio de la placa de la uña o en las estructuras anatómicas adyacentes. 92. U n equipo tal y como se describe en la reivindicación 89, caracterizado porque el aparato es una placa o laca o una placa de prótesis para la uña. 93. Un método tal y como se describe en la reivindicación 75, caracterizado porque el agente biológicamente activo es un agente para el tratamiento o prevención de los síntomas de la psoriasis. 94. Un método tal y como se describe en la reivindicación 84, caracterizado porque el agente antimicótico y el vehículo son administrados al sujeto en una composición que contiene ambos componentes. 95. Un método tal y como se describe en la reivindicación 84, caracterizado porque el agente antimicótico y el vehículo son administrados por separado al sujeto. 96. Un método tal y como se describe en la reivindicación 84, caracterizado porque la composición es una composición de liberación controlada. 97. Un método tal y como se describe en la reivindicación 84, caracterizado porque el agente antimicótico es selectivo de amfotericina B, fluconazol, flucitosina, ¡traconazol, cetoconazol, clotrimazol, econozol, griseofulvina, miconazol, nistatina, ciclopirox y similares. 98. Un método tal y como se describe en la reivindicación 84, caracterizado porque el agente antimicótico es administrado para tratar los síntomas y signos de una infección micótica. 99. Un método tal y como se describe en la reivindicación 84, caracterizado porque el agente antimicótico es administrado para alterar los síntomas o signos de una enfermedad micótica de la placa de la uña o el lecho de la uña. 1 00. Una composición la cual comprende, un antígeno adecuado para la inmunización y un vehículo el cual comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente y los cuales están presentes en una cantidad efectiva para la administración transdérmica, caracterizado porque la asociación entre el vehículo y el antígeno no es covalente. 1 01 . Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 00 caracterizada porque la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente. 1 02. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 1 01 caracterizada porque la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 1 ,500.00. 1 03. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 01 caracterizada porque la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 25, 000 a aproximadamente 1 ,200, 000. 1 04. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 01 caracterizada porque la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 00,000 a aproximadamente 1 ,000, 000. 1 05. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 01 caracterizada porque la estructura comprende una polilisina cargada positivamente. 106. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 105 caracterizada porque la estructura comprende una polilisina cargada positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 1,500,000. 107. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 105 caracterizada porque la estructura comprende una polilisina cargada positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 25,000 a aproximadamente 1,200,000. 108. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 105 caracterizada porque la estructura comprende un polilisina cargada positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 1,000,000. 109. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 100 caracterizada porque la estructura comprende un polímero no peptidilo cargado positivamente. 110. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 109 caracterizada porque la estructura de polímero no peptidilo comprende una polialquilénimina cargada positivamente. 111. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 110 caracterizada porque la polialquilénimina es un polietilénimina. 112. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 111 caracterizada porque la polietiléninima tiene un peso molecular de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 2,500,000. 113. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 111 caracterizada porque la polietilénimina tiene un peso molecular de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 1,800,000. 114. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 111 caracterizada porque la polietilénimina tiene un peso molecular de aproximadamente 500,000 a aproximadamente 1,400,000. 115. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 100 caracterizada porque el vehículo comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente seleccionados de -(gly)n?-(arg)n2, VIH-TAT y fragmentos de los mismos y PTD antenapedia, en el cual el subscrito n1 es un entero de 0 a aproximadamente 20 y el subscrito n2 es independientemente un número non de aproximadamente 5 a aproximadamente 25. 116. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 115 caracterizada porque los grupos de ramificación cargados positivamente son seleccionados de grupos que tienen la fórmula -(gly)n?-(arg)n2. 117. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 116 caracterizada porque el subscrito n1 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 8. 118. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 1 6 caracterizada porque el subscrito n2 es un entero de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. 1 1 9. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 16 caracterizada porque el subscrito n2 es un número non de aproximadamente 7 a aproximadamente 17. 120. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 1 6 caracterizada porque el subscrito n2 es un número non de aproximadamente 7 a aproximadamente 1 3. 1 21 . U na composición tal y como se describe en la reivindicación 1 1 5 caracterizada porque los grupos de ramificación son seleccionados de VI H-TAT y fragmentos de los mismos. 1 22. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 121 caracterizada porque los grupos de ramificación cargados positivamente enlazados son fragmentos de VI H-TAT que tienen la fórmula (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q , (gly)p- YG RKKRRQRRR-(gly)q , ó (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q en donde los subscritos p y q son independientemente cada uno un entero de 0 a 20. 1 23. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 1 5 caracterizada porque los grupos de ramificación son grupos PTD Antenapedia. 124. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 1 5 caracterizada porque el pol ímero cargado positivamente comprende un polipéptido. 1 25. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 1 24 caracterizada porque el polipéptido es seleccionado de polilisinas, poliargininas, poliornitinas y polihomoargininas. 126. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 125 caracterizada porque el polipéptido es una polilisina. 1 27. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 1 5 caracterizada porque el polímero comprende un polímero no peptidilo cargado positivamente. 1 28. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 27 caracterizada porque el polímero no peptidilo comprende polialquilénimina cargada positivamente. 1 29. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 1 28 caracterizada porque la polialquilénimina es una polietilénimina. 1 30. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 00 caracterizada porque contiene de aproximadamente 1 x 1 0 e-1 0 a aproximadamente 49.9 %en peso del antígeno y de aproximadamente 1 x 1 0 e-9 a aproximadamente 50 %en peso del vehículo. 1 31 . Una composición de liberación controlada tal y como se describe en la reivindicación 1 00. 1 32. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 00 caracterizada porque el antígeno excluye la insulina, toxinas botulínicas, VEG F y fragmentos de anticuerpos. 1 33. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 00, caracterizada porque el antígeno es adecuado para inmunizaciones de la infancia. 1 34. Un equipo para administración de un antígeno adecuado para la inmunización a un sujeto que comprende un aparato para la administración del antígeno adecuado para la administración a la piel o epitelio y una composición que comprende un vehículo que consiste de una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente seleccionados de -(gly)n?-(arg)n2, VI H-TAT y fragmentos del mismo y PTD Antenapedia, caracterizado porque el subscrito n 1 es un entero de aproximadamente 0 a aproximadamente 20 y el subscrito n2 es independientemente un entero non de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, en donde la asociación entre el vehículo y el antígeno no es covalente. 1 35. U n equipo para la administración de un antígeno adecuado para la administración a un sujeto el cual comprende un aparato para administrar el antígeno a la piel o epitelio de una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 00. 1 36. U n equipo tal y como se describe en la reivindicación 1 34, el cual comprende además un aplicador acostumbrado. 1 37. U n equipo tal y como se describe en la reivindicación 1 34 , caracterizado porque la composición está contenida en un aparato para la administración de un antígeno adecuado para la inmunización al sujeto por medio de la piel o epitelio. 138. Un equipo tal y como se describe en la reivindicación 134, caracterizado porque el aparato es aplicado tópicamente. 139. Un equipo tal y como se describe en la reivindicación 134, caracterizado porque el aparato es un parche para la piel. 140. Un método de administración de un antígeno adecuado para la inmunización a sujeto el cual comprende la administración tópica a la piel o epitelio del sujeto del antígeno adecuado para la inmunización en conjunto con una cantidad efectiva de un vehículo que comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente, caracterizado porque la asociación entre el vehículo y el antígeno no es covalente. 141 . Un método tal y como se describe en la reivindicación 140, caracterizado porque el antígeno adecuado para la inmunización y el vehículo son administrados al sujeto y una composición que contiene ambos componentes. 142. Un método tal y como se describe en la reivindicación 140, caracterizado porque el antígeno adecuado para la inmunización y el vehículo son administrados por separado al sujeto. 143. Un método tal y como se describe en la reivindicación 140, caracterizado porque la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente. 144. Un método tal y como se describe en la reivindicación 143, caracterizado porque la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 1 ,500,000. 145. U n método tal y como se describe en la reivindicación 143, caracterizado porque la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 25, 000 a aproximadamente 1 ,200, 000. 146. U n método tal y como se describe en la reivindicación 143, caracterizado porque la estructura comprende un polipéptido cargado positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 00, 000 a aproximadamente 1 ,000, 000. 147. Un método tal y como se describe en la reivindicación 143, caracterizado porque la estructura comprende una polilisina cargada positivamente. 148. U n método tal y como se describe en la reivindicación 147, caracterizado porque la estructura comprende una polilisina cargada positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 0, 000 a aproximadamente 1 , 500, 000. 149. Un método tal y como se describe en la reivindicación 147, caracterizado porque la estructura comprende una polilisina cargada positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 25 ,000 a aproximadamente 1 ,200,000. 1 50. Un método tal y como se describe en la reivindicación 147, caracterizado porque la estructura comprende una polilisina cargada positivamente que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 00, 000 a aproximadamente 1 , 000, 000. 151 .- Un método tal y como se describe en la reivindicación 140, caracterizado porq ue la estructura comprende un polímero no peptidilo cargado positivamente. 1 52. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1 51 , caracterizado porque la estructura de polímero no peptidilo comprende una polialquilenimina cargada positivamente. 1 53. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1 52, caracterizado porque la polialquilénimina es una polietilénimina. 1 54. U n método tal y como se describe en la reivindicación 1 53, caracterizado porque la polietilénimina tiene un peso molecular de aproximadamente 1 0, 000 a aproximadamente 2,500, 00. 1 55.- Un método tal y como se describe en la reivindicación 1 53, caracterizado porque la polietilénimina tiene un peso molecular de aproximadamente 1 00, 000 a aproximadamente 1 ,800, 00. 1 56. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1 53, caracterizado porque la polietilénimina tiene un peso molecular de aproximadamente 500,000 a aproximadamente 4,400,000. 1 57. U n método tal y como se describe en la reivindicación 140, caracterizado porque el vehículo comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente seleccionados de -(gly)n?-(arg)n2, VI H-TAT y fragmentos de los mismos y PTD Antenapedia, en el cual el subscrito n 1 es un entero de 0 a 20, y el subscrito n2 es independientemente un entero non de aproximadamente 5 a aproximadamente 25. 1 58. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1 57, caracterizado porq ue los grupos de ramificación cargados positivamente son seleccionados de los grupos que tienen la fórmula -(gly)n -(arg)n2. 159. Un método tal y como se describe en la reivindicación 158, caracterizado porque el subscrito n1 es un entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 8. 160. Un método tal y como se describe en la reivindicación 158, caracterizado porque el subscrito n1 es un entero de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. 161 . Un método tal y como se describe en la reivindicación 158, caracterizado porque el subscrito n2 es un número non de aproximadamente 7 a aproximadamente 17. 162. Un método tal y como se describe en la reivindicación 158, caracterizado porque el subscrito n2 es un número non de aproximadamente 7 a aproximadamente 13. 163. Un método tal y como se describe en la reivindicación 157, caracterizado porque los grupos de ramificación son seleccionados de VIH-TAT y fragmentos del mismo. 164. Un método tal y como se describe en la reivindicación 163, caracterizado porque los grupos enlazados de ramificación cargados positivamente son fragmentos de VI H-TAT que tienen la fórmula (gly)p-RGRDDRRQRRR-(gly)q, (gly)p-YGRKKRRQRRR-(gly)q, ó (gly)p-RKKRRQRRR-(gly)q en donde los subscritos p y q son cada uno independientemente un entero de 0 a 20. 165. Un método tal y como se describe en la reivindicación 157, caracterizado porque los grupos de ramificación son grupos de PTD Antenapedia. 1 66. U n método tal y como se describe en la reivindicación 1 57, caracterizado porq ue el polímero cargado positivamente comprende un polipéptido. 1 67. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1 66, caracterizado porque el polipéptido es seleccionado de polilisinas, poliargininas, poliornitinas y polihomoargininas. 1 68. Un método tal y como se describe en la reivindicación 1 67, caracterizado porque el polipétido es una polilisina. 1 69. U n método tal y como se describe en la reivindicación 1 57, caracterizado porque el polímero comprende un polímero no peptidilo cargado positivamente. 170. Un método tal y como se describe en la reivindicación 169, caracterizado porque el polímero no peptidilo comprende una polialquilénimina cargada positivamente. 171 . U n método tal y como se describe en la reivindicación 1 70, caracterizado porque la polialquilénimina es una polietilénimina. 1 72. Un método tal y como se describe en la reivindicación 140, caracterizado porque la composición es una composición de liberación controlada. 173. Un método tal y como se describe en la reivindicación 140, caracterizado porque el antígeno adecuado para la inmunización excluye la insulina, toxinas botulínicas, VEGF y fragmentos de anticuerpos. 1 74. Un método tal y como se describe en la reivindicación 140 , caracterizado porque el antígeno es adecuado para inmunizaciones de la infancia. 1 75. Un método tal y como se describe en la reivindicación 140, caracterizado porque el antígeno adecuado para in munizaciones es administrado para proporcionar resistencia a un antígeno ambiental. 1 76. U n método tal y como se describe en la reivindicación 140, caracterizado porque el antígeno adecuado para la inmunización es administrado para proporcionar resistencia a patógenos potenciales. 1 77. U n método tal y como se describe en la reivindicación 140, caracterizado porque el antígeno adecuado para la inmunización es administrado para proporcionar resistencia a una bioamenaza potencial. 178. U na composición la cual comprende una porción de elaboración de imagen y un agente de envío al objetivo y un vehículo el cual comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente y la cual está presente en una cantidad efectiva para la administración transdérmica, caracterizada porque la asociación entre el veh ículo y la porción de elaboración de imagen o el agente de envío al objetivo no es covalente. 1 79. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 1 78, caracterizada porque el agente de elaboración de imagen es un agente de elaboración de imagen óptica. 1 80. U na composición tal y como se describe en la reivindicación 179, caracterizada porque el agente de elaboración de imagen es seleccionado de Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5, verde de Oregon 488, verde de Oregon 500, verde de Oregon 514, proteína fluorescente Verde, 6-FAM, Texas Red, Hex, TET y HAMRA. 181 . Una composición tal y como se describe en la reivindicación 178, caracterizada porque el agente de elaboración de imagen es adecuado para la elaboración de imagen de resonancia magnética. 182. Una composición tal y como se describe en la reivindicación 178, caracterizada porque el agente de envío al-objetivo reconoce el melanoma. 183. Un equipo para la administración a un sujeto de una composición tal y como se describe en la reivindicación 178 el cual comprende un aparato para la administración de porciones de elaboración de imagen y envío al objetivo y un vehículo el cual comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente y los cuales están presentes en una cantidad efectiva para la administración transdérmica. 184. Un método para la administración a un sujeto de una porción de elaboración de imagen y un agente de envío al objetivo el cual comprende aplicar tópicamente a la piel o epitelio del sujeto la porción de elaboración de imagen o el agente de envío al objetivo en conjunto con una cantidad efectiva de un vehículo que comprende una estructura polimérica que tiene enlazados grupos de ramificación cargados positivamente, caracterizados porque la asociación entre el vehículo y la proteína biológicamente activa no es covalente. 185. Un método tal y como se describe en la reivindicación 184, caracterizado porque el agente de elaboración de imagen es una agente de elaboración de imagen óptica. 186. Un método tal y como se describe en la reivindicación 185, caracterizado porque el agente de elaboración de imagen es seleccionado de Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5, verde de Oregon 488, verde de Oregon 500, verde de Oregon 514, proteína fluorescente Verde, 6-FAM, Texas Red, Hex, TET y HAMRA. 187. Un método tal y como se describe en la reivindicación 184, caracterizado porque el agente de elaboración de imagen es adecuado para la elaboración de imagen de resonancia magnética. 188. Un método tal y como se describe en la reivindicación 184, caracterizado porque el agente de envío al objetivo reconoce un melanoma. 189. Un método tal y como se describe en la reivindicación 184, caracterizado porque la composición es aplicada para la selección de pacientes en riesgo de melanoma. 190. Un método tal y como se describe en la reivindicación 184, caracterizado porque la composición es aplicada para ayudar en una excisión quirúrgica del melanoma. 191 . Un método tal y como se describe en la reivindicación 184, caracterizado porque la composición es aplicada en conjunto con técnicas fotográficas o técnicas de análisis de imagen.
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