KR930003515B1 - 인체릴랙신(relaxin)을 암호하는 유전자의 분리방법 및 릴랙신 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

인체릴랙신(relaxin)을 암호하는 유전자의 분리방법 및 릴랙신 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법

제 1 도는 두가지 게놈클론의 약술된 제한효소지도다.

제 2 도는 인체 릴랙신 유전자의 암호 영역의 mRNA 서열 및 인체 프리프로릴랙신 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

제 3 도는 인체의 프리프로릴랙신 및 mRNA 서열과 이에 상등하는 돼지의 프리프로릴랙신 서열을 비교한 것이다.

본 발명은 인체릴랙신을 암호로하는 유전자 서열의 분자클로닝(cloning) 및 특성규명에 관한 것이며, 또한 인체릴랙신프로릴랙신 및 프리프로릴랙신의 제조에 이용되는 DNA 재조합 기술에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 프로릴랙신, 프리프로릴랙신을 암호하는 분리 정제된 클론화된 인체 유전자 및 인체릴랙신의 A 및/또는 B 및/또는 C 펩티드 사슬, 상기 유전자들을 분리 및 정제하는 방법, 그리고 이 유전자 들을 숙주세포로 전이시켜 복제하는 방법에 관한 것이다. 클론화된 유전자는 숙주의 형질 발현성 원핵 세포 또는 진핵세포 유전자와 융합되면, 숙주 세포에 의해 형질발현된다. 따라서 이 유전자는 치료 목적의 인체릴랙신을 제조하는데 있어서 유용하다.

또한 본 발명은 인체릴랙신, 프로릴랙신, 프리프로릴랙신 펩티드, 이들 서열을 함유하는 각각의 펩티드사슬, 그리고 이 펩티드들의 변형 형태에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 각각의 릴랙신 사슬 및 상기 변형 형태를 암호하는 변형 유전자들에 관한 것이다.

주 : 하기 설명에서 사용되는 참고 문헌은 본 상세한 설명 말미에 함께 수록되어 있다.

Hisaw(1926년판 Proc. Soc. Exp. Biol. Med23, 661-663)에 의한 선구적 작업으로 펩티드 호르몬인 릴랙신이 포유동물에서 치골 결합부를 확장하는 효과로 인해 출산을 용이하게 하는 중요한 역할을 갖고 있음이 알려졌다. 릴렉신은 임신중에 난소의 황체내에서 합성 및 저장되고, 분만에 앞서 혈류내로 방출된다. 난소를 이용하여 돼지(Schwabe, C.,등의 1977년판 Biochem. Biophys. Res. Commun. 75, 503-510 ; James, R., 등의 1977년판 Nature 267, 544-546)래트(John, M. J., 등의 1981년판 Endocrinology 108, 726-729) 및 상어(Schwabe. C., 등에 의해 Ann. N. Y. Acad. Sci 380, 6 12(1982년판))로 부터 릴랙신을 분리 및 그 아미노산 서열 결정을 할 수 있다. 생물학적 활성이 있는 본 호르몬은 디설파이드 결합, 즉 2개의 사슬간 결합과 하나의 사슬내 결합으로 연결된 두개 펩티드 사슬(A 및 B사슬로 알려짐)로 구성되어 있다. 이 구조는 디설파이드 결합의 위치에 있어서 인슐린과 유사한데, 이것은 이들 호르몬들(Schwabe, C., McDonald, J.K. and SteinetZ, B.C. Biochem. Biophys. Res. Commun. 75, 503-510(1977). James, R., Niall, H., Kwok, S. and Bryant-Greenwood, G. Nature 267 544-546(1977))이 공통의 조상 유전자로부터 전래된 것일수 있다는 가능성을 예견케한다. DNA 재조합 기술을 래트 및 돼지의 릴랙신(Hundson P.등에 의해 1981년판 Nature 291, 127-131 cDNA클론을 분리하는데 사용한다. (호주 특허출원 제11834/83(PF 2696/82)호 참조). 아미노산 서열에 관한 정보를 기초로 제조된 합성운데카머(undecamer) 뉴클레오티드는 난소 조직으로부터 유래된 라이브러리중에서 릴랙신 cDNA 클론을 동정하며, 릴랙신 cDNA서열내에 다량 존재하는 cDNA 프로오브의 합성용 프라이머(primer)로 사용되었다. 릴랙신 구조 유전자는 전체 배열에서 프리프로인슐린과 유사한 단일 사슬 전구체, 즉 시그널(신호) 펩티드/B사슬/C펩티드/A사슬을 암호하는 것으로 알려졌다.

래트인슐린이 약 30잔기의 펩티드를 갖고 있는 것에 비해 돼지 및 래트 프리프로 릴랙신들은 각각 예상밖으로 105개 및 104개 잔기를 갖는 큰 연결 펩티드를 함유한다. 래트 및 돼지 릴랙신의 C-펩티드에서 서열 동족성이 상당히 큰것은 A 및 B 사슬이 정확한 디 설파이드 결합을 형성하는 것이 확실하다는 것 이상의 다른 의미를 암시한다. 본 발명자들은 진화과정에 적용되는 서열 분화에 대한 구조적 구속성이 인체 릴랙신 유전자에서 상당히 높은 서열 동족성을 갖는 C-펩티드 영역을 나타내게 한 것으로 예측였다. 따라서 후술되는 바와같이, 본 발명자들은 인체릴랙신 유전자를 선택하는데 있어서 래트 릴랙신보다 돼지의 C-펩티드 영역에 기초한 프로오브를 사용하였는바, 이것은 단백질 서열 데이타에 의하면 인체의 단백질은 일반적으로 래트의 단백질 보다 돼지의 단백질로부터 적게 변이 하였음이 알려졌기 때문이다(Daghoff, M.O., 등에 의해 DNA 1,51-58(1981)).

비록 인체 릴랙신구조를 결정하여 난산의 경우에 임상적 조절을 할수 있는 방안을 강구하려는시도가 있어왔으나, 임신중의 인체 난소를 입수하는데 따르는 어려움 때문에 직접적인 아미노산 서열의 결정이 어려웠다. 본 발명자들은 돼지 릴랙신의 cDNA영역을 프로오브(probe)로 사용하여 게놈 라이브러리내에서 인체 릴랙신 유전자를 직접 선별하여다. 이런 방법으로 프로프로릴랙신의 전암호 영역의 구조를 결정할 수 있는 게놈 클론을 성공적으로 동정할 수 있다.

본 출원인의 공계류 출원건인 제 PF 2747/82에 기술된 "H2" 및 "H1"유전자로 명명된 이들 양 유전자 모두 릴랙신 유사활성을 갖는 펩티드를 형질발현하기 때문에 사람의 생식 기관조직, 예컨대 난소 및 태반 내뿐 아니라 소화관, 뇌 및 피부 같은 다른 조직내에서도 형질 발현된다고 사료된다. PF 7247/82는 1982년 12월 13일자로 오스트레일리아에 특허출원된 것으로서, 본 발명의 인체릴랙신을 암호하는 제 1 유전자인 H1-릴랙신의 유전자 단편을 프로오브로 사용하여, 임신 여성의 난소조직에서 얻어진 cDNA 클론의 라이브러리를 선별 조사한 결과, 얻어진 cDNA서열이 본 발명의 H1-릴랙신 유전자 서열과는 상이한 형태임을 밝히고, 이를 H2-릴랙신으로 명명한후, 그 특성을 규명한 발명에 관한 것이다.

자궁의 탈락막 및 태반조직뿐만 아니라 난소의 황체 릴랙신 단편을 유전자를 형질 발현하기에 가장 적합한 위치이다. 그러나, 여러가지 펩티드 호르몬의 광범위한 분포 측면에서보면, 릴랙신 유전자는 뇌 및 위장 관계를 포함한 기타 비생식기 조직내에서도 또한 형질발현될 수 있다. 릴랙신은 광범위한 성장인자의 성질을 갖으며, 결체조직의 특성을 변화시키고 평활근 수축에 영향을 줄수 있다. 본 발명자들은 본 명세서 및 상기 특허출원 PF 7247/82에 기술된 유전자 구조물들 중 하나 또는 둘 모두가 체내에 광범위하게 분포되어 있는 것으로 추론하고 있다. 이런 유전자들로부터 형질발현된 릴랙신 펩티드들은 생식과정 동안 주지되어 있는 호르몬 기능외에도 중요한 생리적 역활을 수행하는 것으로 생각된다.

본 명세서에 사용된 약어는 다음과 같다.

H1-게놈클론으로부터 추론된 본 명세서내의 릴랙신 유전자

H2-cDNA클론으로부터 추론되고 특허출원 PF 7247/82에 기술된 릴랙신 유전자

DNA-데옥시리보핵산 RNA-리보핵산

cDNA-상보 DNA(mRNA 서열로부터 효소를 이용하여 합성됨)

mRNA-메신저 RNA

A-아데닌 T-티민 G-구아닌 C-시토신 U-우라실

DNA의 뉴클레오티드 서열과 단백질내의 아미노산 서열간의 유전 정보관계는 유전암호(code)로 알려져 있으며, 이하에 열거하는 바와 같다.

상기 표에 사용된 아미노산들의 약어는 다음과 같이 정의된다.

페닐알라닌 (Phe) 히스티딘 (His)

로이신 (Leu) 글루타민 (Gln)

이소로이신 (Ile) 아스파라긴 (Asn)

메티오닌 (Met) 리신 (Lys)

발린 (Val) 아스파르트산 (Asp)

세린 (Ser) 글루탐산 (Glu)

프롤린 (Pro) 시스테인 (Cys)

트레오닌 (Thr) 트립토판 (Try)

알라닌 (Ala) 아르기닌 (Arg)

티로신 (Tyr) 글리신 (Gly)

상기 표에 나타낸 3문자로된 각각의 코돈 예컨대, AUG, CAU(다른 방식으로는 데옥시뉴클레오티트 트리플레트 또는 뉴클레오티드 트리플레트로 표현함)은 왼쪽에 5'-말단, 오른쪽에 3'-말단을 갖는 mRNA의 트리뉴클레오티드에 상응하는 것이다. 각각의 문자들은 뉴클레오티드 서열을 형성하는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 나타낸다.

본 명세서내에 기술하는 모든 DNA 서열은 티민(T)이 우라실(U)로 치환되어 있는 mRNA 서열과 상응하는 스트랜드로 구성되어 있다.

유전물질의 원료공급원은 인체의 게놈클론의 라이브러리이다.

이 라이브러리를 돼지 릴랙신 cDNA 프로오브를 사용하여 선별함으로써 인체릴랙신의 암호서열을 함유한 두개의 클론을 산출했다.

제 2도 및 제 3도에 나타낸 mRNA 서열은 후술되는 방법에 의해 결정되었다. 3.4kb의 단일 인트론(intron)이 연결펩티드(C)의 암호영역을 가로막고 있는 것을 알수 있을 것이다. 인체 프리프로릴랙신의 구조는 돼지 및 래트 릴랙신의 유사구조와 비교하여 게놈서열로 부터 추론되었다. A 및 B 펩티드 사슬구조는 시험관 내에서의 합성 및 사슬 재조합에 의해 확인되었는데, 이것은 자궁수축 검정법에서 생물학적 활성이 있는 물질을 제공한다.

프리프로릴랙신의 시험관내 프로세싱(processing) 방법은 아직 충분히 알려지지는 않았으나 돼지 릴랙신과의 유사성에 의거하여 시그날 펩티드를 Ala^-1-Lys^-1결합에서 절단시키는 것으로 예측된다.

유사하게 C 펩티드의 절단은 Leu³²-Ser³³및 Arg¹³⁶-Arg¹³⁷에서 발생하여 각각 32개 및 24개 잔기를 갖는 B 및 A사슬을 산출할 것으로 예상된다.

돼지 릴랙신에 대한 본 발명자들의 연구에서 알려진 바와같이, 돼지 릴랙신 B 및 A사슬내에는 생물학적 활성에 필요한 모든 필수 요소를 포함하는 코어(core) 서열이 존재한다. 인체 릴랙신 사슬에 대한 합성연구도 유사한 결과를 나타내는데 상세한 것은 이후 기술한다.

본 발명은 인체 프리프로릴랙신은 형질발현하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

특히, 본 발명은 인체 프리프로릴랙신을 형질발현하는 이본쇄 DNA 단편을 제공하는데, 이것은 첨부된 도면의 제 2 도에 나타낸 완전한 mRNA 서열(코돈-25에서 160까지)에 상응하는 암호쇄 및 상보쇄로 구성된다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 프리프로릴랙신 유전자 서열의 서브유니트 또는 상기 서열 또는 서브유니트의 그 어떤 동등물도 포함한다. 본 발명에 속하는 서브유니트들 중에는 제 3 도에 나타낸 것처럼 비암호 영역을 배제한 유전자, 사람 프리프로릴랙신의 신호 펩티드 사슬 및 A, B와 C사슬을 암호하는 각각의 구조 유전자를 함유한 유전자 및 이들 사슬의 그 어떤 조합 예컨대 A 및 B펩티드 사슬을 단독으로 또는 C사슬과 함께 프로릴랙신 상태로 형질 발현하는 유전자등이 있다.

따라서 본 발명은 인체 프로릴랙신을 형질 발현하는 유전자를 제공한다.

특히 본 발명은 인체 프로릴랙신을 형질발현하는 이본쇄 DNA 단편을 제공하는데, 이것은 첨부도면중 제 2 도에 나타낸 mRNA 서열의 1-160 코든번호에 상응하는 암호쇄 및 상호쇄로 구성된다.

또다른 면으로 본 발명은 인체 릴랙신의 A, B 및 C사슬 또는 이 사슬중 2개 또는 그 이상의 조합체를 각각 형질발현하는 유전자를 제공한다. 특히, 본 발명은 인체 릴랙신의 A 및/또는 B 및/또는 C사슬들을 각각 형질 발현하는 이본쇄 DNA 단편을 제공하는데, 이것은 첨부도면중 제 2 도에 나타낸 mRNA 서열의 1-32, 33-136 및 137-160 코든번호에 상응하는 암호쇄 및 상보쇄로 구성된다.

상술된 유전자에는 특정코돈 외에 적절한 "개시" 및 "종료" 코돈을 포함하며, 예컨대 AUG 및 UGA (제 2 도중 -26과 161코돈)가 각각 개시 및 종료코돈으로 포함된다.

본 분야의 숙련자는 상기 유전자의 다양한 형태가 존재함을 인지할 수 있을 것이며, 그러한 형태들도 본 발명에 포함된다.

본 발명은 추가로 상기 서열, 이것의 서브유니트 또는 동등물과 상응하는 RNA 서열, 이것의 서브유니트 또는 동등물의 상보체(complements)를 포함한다.

본 발명의 또다른 태양으로, 상기 정의한 유전자에 상응하는 데옥시뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 전이 벡터가 제공된다.

상술한 바와 같이 유전자 암호는 유전자 중복(redundancy)을 나타내는데, 즉 어떤 아미노산은 한개 이상의 코돈에 의해 암호된다.

따라서 본 발명은 도면에 서술된 코돈 또는 그들의 cDNA 동등물이 동일 아미노산을 암호하는 다른 코돈으로 대체된 데옥시뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한 이미 기술된 바와같이, 천연릴랙신의 B 및 또는 A 사슬 구조와 다른 릴랙신 활성을 갖는 펩티드가 제조될 수 있다. 이같은 차이점은 천연사슬에 하나이상의 아미노산을 누락시키거나, 하나이상의 아미노산을 첨가시키거나, 여러가지 아미노산을 치환시켜 얻어진다.

따라서 본 발명은 또한 하나 이상의 천연코돈이 누락 및/또는 그 천연코돈에 의해 암호된 것과는 다른 아미노산을 나타내는 코돈으로 대체되거나 및 또는 추가 코돈이 천연 서열에 첨가된 유전자 및 상술된 DNA 전이벡터를 포함한다.

본 발명의 전이벡터는 특히 숙주세포에 전이되었을때 복제가 확실히 되는 유전정보를 포함한다. 이같은 세포로는 예컨데 박테리아, 효모 및 사상균 같은 원핵미생물의 세포 및 포유동물 세포나 세포주를 포함한 진핵세포를 들 수 있다.

박테리아 유전학에서 통상 사용되는 전이벡터로는 플라스미드 및 특정 박테리오파지의 DNA이다. 파지 DNA 및 박테리아 플라스미드가 둘모두 본 작업에서 전이벡터로 이용되었다. 그러나 다른 형태의 전이벡터들로 사용할 수 있다. 이같은 전이벡터를 제조하고, 이것을 미생물내로 형질전환하는 일반적인 기술은 본 기술분야에 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 상기 기술한 어떤 전이벡터에 의해 형질전환된 원핵 또는 진행세포를 포함한다. 한가지 바람직한 미생물은 대장균(에스케리키아 콜리=E.Coli)이 일반적이지만, 다른 적합한 미생물이 사용될 수 있다.

추가로 본 발명은 어떠한 전이벡터를 제한효소로 절단하여 제조된 DNA 분자와 인체 프리프로릴랙신을 암호하는 데옥시뉴클레오티드 서열을 결찰시키는 것을 특징으로 하는 인체 프리프로릴랙신을 암호하는 데옥시뉴클레오티드 서열을 유지하고 복제하는데 이용되는 DNA 전이벡터의 제조방법을 제공한다.

인체 프로릴랙신과 인체릴랙신의 A 및 B사슬을 암호하는 데옥시뉴클레오티드 서열을 유지하고 복제하는데 이용되는 DNA 전이벡터는 적절한 데옥시뉴클레오티드로 부터 유사하게 제조된다.

A 및 B펩티드 사슬 그리고 또한 프로릴랙신 및 프리프로릴랙신은 유전자 형질발현에 사용되는 통상의 통상방법에 의해 제조될 수 있는데, 예컨대 적절한 형질전환된 전이벡터를 함유하고 있는 세포를 성장시키고, 세포에 의해 제조된 필요한 펩티드를 분리정제 함으로써 제조된다.

따라서, 본 발명은 추가로 상술된 제조방법에 따라 제조된 인체 프리프로릴랙신을 암호하는 데옥시뉴클레오티드 서열을 함유한 형질발현 전이벡터로 형질전환된 세포배양체를 배양하는 것을 특징으로 하는 그 C-말단서열로서 인체프리프로릴랙신의 아미노산 서열을 함유하고, N-말단 서열로서 진핵 또는 원핵 단백질의 일부를 포함하는 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

인체프로릴랙신에 대한 아미노산 서열 및 인체릴랙신의 A와 B 사슬에 대한 아미노산 서열을 함유하는 융합단백질은 유사한 방법으로 제조될 수 있다.

그렇게 제조된 융합 펩티드 생성물은 목표펩티드가 숙주 세포의 특징적인 원핵 또는 진행단백질의 일부와 연결된 상태의 융합단백질 형태를 나타낸다. 이같은 융합단백질 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

본 발명은 또한 인체의 프로릴랙신을 암호하는 상술한 서열의 형질발현에 적합한 조건하에서 상기 기술된 것처럼 제조된 상기 인체 프로릴랙신을 암호하는 데옥시뉴클레오티드 서열을 함유한 형질발현 전이벡터에 의해 형질전환된 세포배양체를 배양하고, 이 세포의 용해물 또는 배양 배지포로부터 인체 프로릴랙신을 정제함을 특징으로 하는 C펩티드에 의해 서로 분리된 A 및 B 펩티드를 함유한 인체 프로릴랙신을 합성하는 방법을 포함한다.

목적 펩티드는 어떤 적절한 공지된 절단방법에 의해 융합생성물로부터 회수할 수 있다.

상기 지적한 바와같이, 전이벡터는 코돈 치환/누락/첨가에 의해 변형될 수 있으며, 이같은 변형은 변형된 융합펩티드를 생성시킨다.

이런점에서 적절한 변형방법은 예컨대 B/C 또는 C/A사슬의 접합부에서 융합펩티드의 절단을 촉진하거나, 연속되는 화학적 또는 생물학적 프로세싱중에 펩티드 사슬의 양태를 변화시킬 수 있다.

상술한 바와같이, 본 발명은 또한 인체 릴랙신, 프로릴랙신 및 프리프로릴랙신을 제공한다.

릴랙신은 현재 공지된 인슐린 제조방법에 이용되는 방법을 이용해서 각각의 A 및 B 사슬을 직접 조합시켜 제조할 수 있다.

인슐린의 경우와 마찬가지 방법으로, 릴랙신은 상술한 방법으로 제조된 릴랙신의 A 및 B 펩티드상의 설피드릴기를 산화시키거나, 전환시켜 A 및 B 펩티드 사이에 디설파이드 결합을 형성시키고나서, 예를들면 A 및 B 펩티드에 C 펩티드를 연결시키는 결합에 특이적인 효소 촉매된 가수분해법으로 C-펩티드를 절단시켜 프로릴랙신으로 부터 제조할 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가로 인체 릴랙신을 합성하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 릴랙신(그들의 전길이, 단축 또는 변형 형태)의 A 및 B사슬을 인체 인슐린의 A 및 B 사슬을 결합시키는 공지된 방법에 의해 결합시키는 것으로 구성된다. 이같은 한가지 방법에는 S-설폰화된 A 및 B 사슬의 혼합물을 환원시킨 후, 공기중에서 상기 혼합물이 산화되도록 방치하는 것으로 구성된다.

본 발명자들은 또한 상기 방법의 효율이 A 및 B 사슬중 하나 또는 둘 모두가 S-설포형태보다 S-티오에틸-시스(Cys)유도체의 형태일때 개선된다는 점을 알았다.

본 발명자들의 호주 특허 출원 제15413/83호(PF 4385/82)에는 또한 릴랙신 A 및 B 사슬중 하나 또는 둘 모두를 중대한 생물학적 활성의 손실 없이 결합수율이 향상되도록 아미노 및/또는 카르복시말단에서 단축시킬 수 있음을 기술하고 있다. 이런 기법은 인체 릴랙신 제조에도 동등하게 적용될 수 있다.

본 발명은 또한 주로 천연 B 및/또는 A 펩티드 사슬의 단축 또는 변형 형태로 구성된 인체 릴랙신 유사물을 제공한다.

본 발명은 또한 인체 릴랙신의 유사물을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 단축 및/또는 변형된 B 및/또는 A 펩티드 사슬을 제조하는 단계, 그리고 이들을 상기 기술된 방법중 하나로 결합시키는 단계로 구성된다.

본 발명자들이 돼지 및 인체 릴랙신을 사용하여 연구한 결과, 릴랙신 활성은 비록 예견되는 실제의 최소활성이 각각 A(4-24) 및 B(4-23)이기는 하더라도, A(10-24)만큼 단축된 사슬 그리고 B(10-22) 만큼 단축된 사슬에서도 릴랙신 활성이 존재함을 알 수 있었다.

일반적으로, A사슬 A(1-24)에서 A(10-24)까지 다양하며 B 사슬은 B(1-32)에서 B(10-22)까지 다양하다.

바람직한 조합은 하기 A중 임의의 것과 하기 B중 임의의 것을 조합한 것이다.

본 발명에 따른 B 및/또는 A 사슬의 변형은 본 발명의 방법을 수행하기 앞서 상술한 것처럼 "유전적"변형 또는 B 또는 A 사슬의 화학적 변형(전체길이 또는 짧아진 형태중 어느 하나로)을 가하는 것도 포함된다. 두 가지 유형의 변형을 각각 단독으로 또는 병행하여 사용할 수도 있다.

첫번째 유형은 천연 또는 짧아진 B 및/또는 A 사슬에서 발생하는 하나 이상의 아미노산 변형이다. 이같은 변형은 일반적으로 공지방법으로 한개 이상의 아미노산에 존재하는 활성기를 보호시키는 공정을 수반하며, 이어서 변형된 A 및 B 사슬을 결합시킨 후 필요에 따라 상기 보호기를 제거할 수 있다.

이런 유형의 변형법의 예로는 N-말단을 포함한 유리 아미노기의 아세틸화, 포르밀화 또는 유사한 보호방법, C-말단기의 아미드화 또는 히드록실이나 카르복실기의 에스테르 형성 등을 포함할 수 있다.

포르밀기는 용이하게 제거되는 보호성기의 대표적인 실예이다.

두번째 유형의 변형법은 B 또는 A사슬내의 고유 아미노산들중 하나 이상이 다른 아미노산(천연 아미노산의 D-형태를 포함하여)으로 치환시키는 것이다. 일반적인 변형 방법은 또한 천연 아미노산을 사슬로 부터 누락시키거나, 가외의 아미노산을 하나 이상 사슬에 첨가하는 것으로 구성된다.

이같은 변형 방법의 목적은 릴랙신 또는 이것의 유사물 같은 생성물의 활성을 유지하면서 A 및 B 사슬의 결합 수율을 향상시키거나, 주어진 결합 수율에 대해 생성물의 활성을 변형 또는 강화시키기 위한 것이다. 이같은 변형 방법은 릴랙신 차단 또는-길항 작용을 갖는 합성 유사물의 생성에도 확대 적용시킬 수 있다.

첫번째 유형으로 변형시키는 구체적인 예는 B2 위치에 존재하는 트립토판(Trp) 잔기에 포르밀기를 첨가하여 변형시키는 것이다.

두번째 유형으로 변형시키는 구체적인 예는 B24 위치에 존재하는 Met 잔기를 노르로이신(Nle), 발린(Val), 알라닌(Ala), 글리신(Gly), 세린(Ser) 또는 호모세린(Homo Ser)으로 치환하는 것을 들 수 있다.

본 발명은 또한 상술한 바와 같이 본 발명에 따라 변형된 천연 또는 짧아진 B 및/또는 A 사슬로부터 수득된 인체 릴랙신 유사물도 포함한다.

A 및 B 펩티드 사슬, 그리고 프로릴랙신 및 프리프로릴랙신은 유전자 형질 발현 과정 즉, 알맞게 형질 전환된 전이 벡터를 함유하는 미생물을 성장시키고, 이어서 상기 미생물에 의해 생산된 펩티드를 분리 및 정제함으로써 제조할 수 있다.

수득된 펩티드 생성물은 목적하는 펩티드가 원핵세포의 단백질 부분과 결합되어 있는 융합 단백질 형태이다.

이하에는 실험 방법들 및 그로부터 수득된 결과들을 기술하여 본 발명을 보다 상세히 설명 및 예시하고자 한다.

A. 실험과정

(ⅰ) 박테리아 및 파지균주

E. Coli RR1(Bolivar, F., R.L.등에 의해 1977년판 Gene 2 : 95에 공지됨 ; Collaborative Research Inc.에서 입수)은 전술한 바와 같은 돼지의 릴랙신 cDNA삽입물을 함유한 재조합 플라스미드(pBR 322)(Sutcliffi J.G.에 의해 1979년판 Cold spring Harb. Quant. Biol 43, 77에 공지됨 ; Haley, J., Hudson, P. Scanlon등에 의해 1982년 DNA 155-162에 공지됨 ; Sigma Chemical Company시판.)에 대한 박테리아 숙주로서 사용되었다.

인체 게놈 클론의 라이브러리는 티. 마니아티스(T. Maniatis)에 의해 제공되었다. 인체 DNA(Lawn, R.M. Fritsch 및 Maniatis, T., 등에 의해 1978년판 Cell 15, 1157-1174에 공지됨)의 부분적 Hae111/Alu1절단으로부터 얻어진 15-20Kb정도의 게놈 DNA 단편들을 링커(linker)에 의해 람다 파지 벡터 샤론-4A(Maniatis, T., Hardison등에 의해 1978년판 Cell 15. 687-701에 공지됨 ; 1977년판 Science 196, 161-169 Frederick R. Blattener등에 의해 기술됨 ; 미합중국 매디슨 소재의 Laboratory of Genetics at the University of Wisconsin에서 입수함)내로 클론화시키고, E. Coli LE 392(Borck, K. J. D.등에 의해 1976년판 Mol. Gen. Genet 146 : 199에 공지됨 ; Aldrich Chemical Company에서 입수)세포내에서 증식 시켰다. 파지 DNA(클론 선택후)는 E. Coli DP 50 supF(Leader P.D. Tiemeier와 L.Enquist에 의해 1977년판 Science 196 : 175 공지됨 ; Maniatis, T., 등에 의해 1978년판 Cell 15, 687-701에 공지됨 ; Amersham Corporation에 입수)세포를 1

배양체에서 용해시켜 제조했다.

작은 DNA 단편(파지 DNA을 절단시켜 얻음)들은 서열 분석을 위해 M13박테리오파지 벡터 mp7.1, mp8 및 mp9(닥터. 제이. 메씽이 제공함 ; Messsing, J에 의해 1979년판 Recomb. DNA Tech, Bull 2(2) : 43에 공지 ; Messing, Terviera J.에 의해 1982년판 Gene 19, 269에 공지됨 ; Sigma chemical Company시판)내에 서브클로닝하고, E. Coli JM101세포내로 (Messing J.에 의해 1979년 Recomb. DNA. Tech. Bull2(2) : 43에 공지됨 ; Aldrich Chemical Company에서 입수)형질 전환시켰다.

(ⅱ) 하이브리드하 프로오브(돼지 DNA)의 제조

방사능 표지된 프로오브를 송아지 흉선 DNA(Taylor, J. M., Illmersee, R., and Summers, J. Biochim. Biophys. Acta 442 324-330(1976))의 변성된 불규칙 프라이머(3 또는 4개의 염기)를 이용하여 여러가지 DNA단편상에서 합성에 의해 제조했다.

돼지의 DNA주형(100-200ng)을 불규칙 프라이머(1μg)와 함께 물 20μl중에서 2분간 가열하여 변성시켰다. 합성은 50mM Tris-HCl pH 8.0, 50mM NaCl, 1mM DTT, 10mM MgCl₂, E. Coli DNA폴리머라 제 I 5유니트, dCTP, dGTP, dTTP 각 500M 및 0.3μM α-[³²P]-dATP(대략 3000Ci/mmol, 아메르샴)이 함유되어 있는 반응 혼합물 30μl를 첨가함으로써 개시된다. 37℃에서 30분간 배양한 후, 반응은 0.3 M NaCl, 10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA가 함유된 완충액 300ul로 희석시켜 종결시키고, 동일한 완충색으로 세파댁스-G50컬럼(1cm×5cm)을 통과시켰다. 방사능 표지된 프로오브는 피이크 분획분으로부터 공급부피에서 수취하여, 에탄올 2배 용량을 사용해 -20℃에서 2시간 동안 tRNA(10μg)을 캐리어로 사용하여 침전시켰다.

(ⅲ) 선별과정

게놈 DNA단편들을 함유한 람다파지를 직경 13cm 직경의 플레이트당 약 10⁵파아지 비율로 소프트아가상에서 성장시켜, 벤톤 및 데이비스(Benton, W.D. and Davis, R. Science 196, 180-183(1977)가 설명한대로 니트로셀룰로오스 필터(슐라이헤드 및 슐 BA 85)에 전이시켰다. 필터를 5×SSC 및 25% 포름아미드를 함유한 변형된 덴하르트 용액(Denhardt, D.T. Biochem. Biophys. Res. Commun, 23, 641-646(1966)중에서 18시간 40℃로 방사능 표지된 프로우브와 함께 하이브리드시켰다. 필터를 X-레이 필름(코닥 XS-5)에서 24시간동안 노출시키기 전에, 30℃에서 1시간 동안 2×SSC로 세척했다. 양성 하이브리드화를 나타내는 플레이트의 영역을 단일 양성 플래그(plaque)를 선택할 수 있을때까지 계속 계대 배양시키고, 재선별했다.

파지는 E. Coli I DP 50 supF 세포 및 마니아티스(Maniatis, T., Hardison, R.E., Lacy, E., Lauer, J., O'Connell, C., and Quon, D. Cell 15, 687-701(1978), 야모도또 및 알베르트(Yamamoto, K.R. and Alberts, B.M. Virology 40, 734-744(1970)가 설명한 방법으로 제조된 DNA의 배양체 1

를 용해시켜 수거했다.

(ⅳ) DNA 서열분석

선택된 재조합 파지의 제한 단편들을 직접 파지 M13 mp8의 Eco.R1, Pstl 또는 Sma1 부위내로 서브클로닝시킨다. 결찰은 10mM Tris-HCl pH 8.0, 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 1mM ATP, T₄DNA리가제 1유니트, DNA(100ng) 및 M13파지벡터(50ng)를 함유한 20μl반응액중에서 실시했다.

40℃에서 하룻밤 배양한 후, 재조합 DNA를 E. Coli JM 101 세포(Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B.G., Smith, A. J. A. and Roe, B. A. J. Mol. Biol. 143, 161-178(1980))내로 형질 전환시킨다. 암호영역을 함유한 플래그들을 상기 게놈 선별공정과 유사한 기법으로 선택하며, 단 M13파지를 저밀도(10³파지/9cm직경 플레이트)로 평판시킨다. 양성 플래그는 일본쇄 주형 또는 복제성이본쇄(rf)형태(Sanger, F., Coulson, A.R., Barrell, B.G., Smith, A.J.A. and Roe, B.A. j. Mol. Biol. 143, 161-178(1980))중 하나로 정량 가능한 수율로 생장된다. 일본쇄 주형은 암호 영역내의 여러 서열에 대해 상보적인 M13-특이적 프라이머(콜레보레이티브 리서취) 또는 합성 프라이머중 하나를 이용하여 생거등의(Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. Proc. Natn. Acad. Sci. 74, 5463-5467(1977))의 방법으로 직접 서열 결정되었다. 서브클론들의 완전한 서열 분석은 rf형태를 여러 부위에서 여러가지 제한 효소로 절단한 후, 블런트말단 결찰법(Sanger, F., Coulson, A.R., Barrell, B. G., Smith, A.J.A. and Roe, B.A.J. Mol. Biol. 143, 161-168(1980)) 또는 직접 말단-표지된 단편을 이용해 M13내로 서브클로닝시키고, 맥삼 및 길버트(Maxam, A.M. and Gilbert, W. Proc. Natn, Acad. Sci. 74, 560-564(1977))의 방법으로 서열 결정함으로써 얻어졌다. DNA서열을 분석하고, 컴퓨터 프로그램(Staden, R. Nucl. Acids, Res. 6, 2601-2610(1979))을 이용하여 돼지 및 래트의 릴랙신 서열과 비교하였다.

B. 결과

제 1 도는 게놈 클론의 약술된 제한 효소지도를 나타내고 있다. 크기는 킬로염기쌍(Kb)로 나타냈으며, 절단부위는 EcoR1(R), Pst1(P) 및 Hpa11(H)로 표시하였다. 게놈 클론 λH5는 C펩티드(엑손 Ⅱ)(제 1 도내의 A^*제 1 도)내의 Alu1부위에 결합된 EcoR1 링커에서 종료하고 있다. 암호 영역에 대한 확정된 뉴클레오티드 서열은 게놈 클론λH7으로부터 EcoR1 및 Pst1 단편을 M13 mp8내로 서브클로닝하고 하기 기술된 방법중 하나로 처리함으로써 얻어졌다.

(1) 제 1 도의 M13주형상에 파선(---)으로 나타낸 것처럼 직접 서열 결정하거나,

(2) 점선(……)으로 나타낸 합성 뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 직접 서열 결정하거나,

(3) DNA단편의 말단을 표시하고, 화학적 분해 방법에 의해 직선(―)으로 나타낸 것처럼 서열 결정함.

서열 결정에 이용된 프라이머는 a : 5'TTCGCAATAGGCA 및 b : 5'GCACAATTAGCT이다.

제 2 도는 인체 릴랙신 유전자의 암호 영역을 나타낸 것이다. 인체 프리프로릴랙신 아미노산 및 mRNA서열(상부)과 이에 상응하는 돼지의 릴랙신 서열을 비교한 것은 제 3 도에 나타내었다. 이 서열은 별표로 표시한 뉴클레오티드 동일성 및 네모로 표시된 아미노산 동족성을 최대로 나타내기 위해 일렬로 만들었다. 아미노산 B-사슬의 시작부위로부터 번호를 표시했다. 엑손/인트론/엑손 경계에서의 인트론 서열을 하부에 표시된 DNA로 나타내었다.

(ⅰ) 게놈 클론의 분리 및 특성규명

인체 게놈 클론은 첨부도면 제 3 도에 나타낸 C-펩티드(7)에서 아미노산 45-95 상응하는 돼지의 릴랙신 DNA클론의 짧은 (150bp)단편으로 제조된 프로오브를 사용해 라이브러리를 선별함으로써 동정하였다. 이 단편은 HpaⅡ 및 Hinf1으로 분해시켜 클론으로부터 절단하였으며 래트 및 돼지 릴랙신 서열 사이의 최대 동족성을 갖는 영역(뉴클레오티드 레벨에서 71%)에 상응한다. 게놈 클론 뱅크로부터 λH5 및 λH7으로 명명된 2개의 강한 양성 파지를 분리하였다. 이들 양성 클론들은 각각 5' 및 33' 엑손 영역(이후 "엑숀 Ⅰ" 및 "엑숀 Ⅱ"로 칭함)에 특이적인 돼지의 릴랙신 CDNA의 2개의 분리단편을 프로오브 사용하여, 제한 효소 분석을 통해 추가로 특성규명을 실시했다. 두개의 단편들은 래트의 동족성 릴랙신 유전자(6)내의 인트론부위에 상응하는 (몇몇 염기한 도내에서)단일 HpaⅡ 부위에서 돼지의 릴랙신 cDNA 클론을 절단함으로써얻어졌다. λH5 및 λH7 클론을 서던 블로트(Southern bbt) 분석한 결과, 인체 릴랙신 유전자의 암호 영역은 3.4Kb(제 1 도 참조)의 단일 인트론이 개재되어 있음을 알았다.

(ⅱ) 게놈 클론의 서열분석

이용된 방법은 λH5 및 λH7 을 제한효소로 완전히 분해시킨 분해물들을 M13벡터내에 서브클로닝 시키고 나서 엑손 Ⅰ및 Ⅱ에 특이적인 돼지의 릴랙신 프로오브를 이용하여 선별하는 것이다. 양성 서브클론들은 방법 부분에 기술된 기술을 조합하여(상기 A(ⅳ)번) 서열 결정했다.

λH7클론의 엑손 Ⅱ영역은 C-펩티드의 EcoR1 부위에서 시작되어 A사슬의 전체 암호서열을 거쳐 종료 코돈으로 이어지는 2.0Kb EcoR1 단편내에 포함되어 있다(제 1 도 참조).

이 단편의 서열결정은 2.0kb단편 전체를 함유한 M13주 형상에서 직접 개시하는데 사용되는 A사슬 주변 영역에 특이적인 뉴클레오티드 프라이머를 합성함으로써 상당히 도움이 된다. 엑손 Ⅱ내에 있는 C-펩티드의 잔류 53bp를 함유하고 있는 서브클로닝된 EcoR1 단편은 프로오브로서 돼지 CDNA를 사용하면 동정할 수 없었다. 본 영역에 대한 서열은 엑손 Ⅱ의 전영역이 함유되어 있는 λH7로부터 서브클로닝된 Pst1단편에 의해 산출되었다.

λH5의 엑손 Ⅱ 영역을 서열결정한 결과 λH7처럼 C-펩티드 내에 동일한 EcoR1 부위에서 시작되어 링커로 종료되는 매우 짧은 70bp단편이 존재함을 알게되었으며, 게놈 라이브러리 생성 과정중에 원래 게놈 DNA내의 Alu1부위에 부착되어 있다. 따라서 λH5는 릴랙신 유전자의 불완전한 클론으로 명명되어 더 이상 분석되지 않았다.

엑손 Ⅰ영역의 서열분석은 두개의 EcoR1 단편 서브클론들의 개별적인 서열분석이 필요한 신호 펩티드 내의 EcoR1 부위로 인해 다소 복잡성을 나타내었다. EcoR1부위에 걸친 중복은 λH7로부터 중복 배열이 함유된 Alu Ⅰ 서브클론을 동정함으로써 지지되었다.

C. 변형된 인체 릴랙신(hRLX)A(1-24)-B(1-25)의 합성

(ⅰ) 사람 릴랙신의 A-사슬, hRLX A(1-24)의 합성

게놈 클론의 뉴클레오티드 서열로부터 상술한 것처럼 추론된 인체 릴랙신 A-사슬의 1-24잔기에 상응하는 아미노산 서열은 메리필드(예 : 바레니, 지, 및 메티필드, 알. 비이. "펩티드", 이. 그로스 ＆ 제이. 마이엔호퍼 아카데믹 프레스, 뉴욕 1-284페이지, 1980)에 의해 설명된 일반 원칙에 의해 고체상 방법으로 합성되었다. N-α-3급 부틸옥시카르보닐*-4-메틸-벤질-L-시스테인(*이후 "BOC"로 표현함)을 탐의 방법(합성(Synthesis) 12, 955-957, 1979)을 이용하여 0.30mmole/gm 수준으로 페닐 아세트아미도 메틸(PAM)결합을 통해 1% 가교형태의 플리스티렌 수지에 결합시킨다. BOC-L-CYS-PAN수지(8.0g)를 베크만 모델 990펩티드 합성기의 반응용기에 옮기고, 23 잔기에서 1잔기까지의 아미노산 서열을 각각 적당히 보호된 아미노산을 단계적으로 부가시켜 조립해간다. 각 아미노산의 아미노말단 BOC보호기는 상기 수지를 염화 메틸렌중의 35% 트리폴루오로초산을 사용해 30분간 처리하고, 염화메틸렌중의 5% 디이소프로필 에틸아민을 사용해 15분간 중화시켜 제거했다. 각 처리가 종료된 후, 수지를 염화 메틸렌으로 철저히 세척했다. 서열내의 다음 아미노산(α-아미노 위치에서 BOC기로 적절히 보호되고, 적절히 보호된 측쇄 작용기를 가지고 있는 형태)을 디씨클로헥실카르보디이미드(DCC)를 이용하여 수지에 결합시킨다. 염화메틸렌중에 용해되어 있는 DCC를 도입하기전에 10분간 수지를 염화메틸렌중의 아미노산과 함께 교반했다. 2.5몰 과량(6.0mmole)의 아미노산 및 DCC를 각 결합에 이용되었다. 1시간 동안 교반후, 수지샘플을 반응 혼합물로부터 제거하고 카이저 등의 닌히드린 방법을 이용하여 유리 아미노기의 존재여부를 시험했다(분석 생화학, 34,595-598, 1970). 닌히드린 시험이 완전결합을 나타내는 음성이면, 반응사이클을 BOC 탈보호 반응, 중화 및 다음 아미노산과의 결합등으로 계속 진행된다. 닌히드린 시험이 양성이면, 결합반응을 추가 아미노산 및 DCC를 이용해한다.

측쇄 작용기를 갖는 아미노산은 하기 보호된 유도체 상태로 사용된다 :

N-α-BOC-2, 6-디클로로벤질-L-티로신 ;

N-α-BOC-ξ-클로로벤질옥시카르보닐-L-리신 ;

N-α-BOC-L-세린-O-벤질 에테르 ;

N-α-아밀옥시카르보닐-N^G-토실-L-아르기닌 ;

N-α-BOC-L-트레오닌-O-벤질에테르 ;

N-α-BOC-S-에틸 메르캅토-L-시스테인(A-사슬서열위치 15,11 및 10의 CYS에 해당);

N-α-BOC-L-글루탐산-r-벤질 에테르.

1-24 펩티드 서열을 조립한 후, 아미노 말단 아르기닌 상의 최종 BOC기는 탈보호-중화 싸이클을 이용하여 제거하고, 펩티드-수지는 진공하에 건조시켰다(펩티드 수지 17.0g). 펩티드 -수지(2g) 일부는 아니솔(2ml)의 존재하 0℃에서 30분간 무수 불화수소산으로 처리한다. 수지-펩티드와 불화수소산(HF)의 접촉시간은 오일펌프 진공하에 HF를 신속히 제거함으로서 최소로 유지한다. 이후 수지-펩티드를 에틸 아세테이트로 수회 세척하여 과량의 아니솔을 제거하고, 펩티드를 1M 초산액층으로 추출하고, 본 용액을 동결건조시킨다. 조펩티드(S-티오에틸유도체 상태로 아직 보호되어 있는 10,11 및 15위치의 시스테인을 갖음)의 수율 4400mg이다. 조펩티드의 초기정제는 0.1M초산을 사용하여 바이오겔 p10상에서 겔-여과시켜 수행하였다. 본 칼럼에서 얻어진 주요 피크를 나타내는 분획분들은 분자량 약 3000정도에 상응하는 위치에서 용출되는데, 이것을 수취하여 동결 건조시킨다. 이 펩티드 샘플의 아미노산 분석결과는 1-24 서열의 모든 아미노산이 정확한 비율로 존재함을 나타낸다.

[S : 티오에틸 cys 10,11,15]-hRLX A (1-24)펩티드의 추가 정제공정은 0.1% TFA-물/아세토니트릴 용매계를 이용하는 워터스 C-18 본다팩 컬럼상에서 정량용 가열상 HPLC를 이용해 실시되었다.

겔-여과로 정제된 펩티드 샘플(160mg)은 두등에 의해 Scientia Sinica, 101, 84-104(1961)에 상술된 방법에 따라, 아황산 나트륨 및 사황화 나트륨의 혼합물로 S-설폰화시킨다(전반응 시간 : 3시간). S-설폰화 반응 동안 형성된 침전은 여과 제거하고 침전 및 상등액 둘 모두를 증류수로 4℃에서 48시간 동안 증류수에 대해 투석시킨다. 투석백의 내용물을 동결건조시켜 상등액으로부터 펩티드 81.4mg 그리고 S-설폰 반응동안 형성된 침전으로부터 펩티드 53.2mg을 산출하였다. "가용성"[S-설포 cys 10,11,15,24]hRLX A (1-24)펩티드 샘플은 Tris-Hcl완충액 pH 8.3중의 DEAE샘플 로오스 상에서 이온 교환 크로마토그래피로 정제한다. 펩티드는 3.0ms 내지 85.0ms의 전도도 범위를 이용하여 tris-Hcl완충액의 선형 Nacl구배를 사용해 컬럼으로부터 용출시켰다. 20 내지 30ms의 전도도에서 이온교환컬럼으로부터 용출되는 주요 피크를 나타내는 분획분을 투석시키고, 동결건조시켜 펩티드를 회수했다. 정량용 HPLC를 S-설폰화된 펩티드의 추가 정제공정에 이용했다.

(ⅱ) 짧아진 인체 릴랙신 B-사슬, hRLX B (1-25)의 합성

인체 릴랙신 B-사슬의 1-25잔기에 상응하는 아미노산 서열을 전술한 방법 및 매그램당 Ser 0.01mmole을 갖는 N-α-3급 부틸옥시카르보닐-O-벤질-L-세린-페닐 아세트아미도메틸 폴리스티렌수지를 사용하여 합성을 개시한다. A-사슬 합성에 이용되는 측쇄 보호성 기가 또한 10 및 22위치에 있는 두개의 시스테인에 대한 S-에틸 유도체를 포함하는 B-사슬 합성에도 이용된다. 4 및 5위치의 아스파라긴산 잔기를 N-α- BOC-α-벤질 에스테르 유도체로서 첨가한다. 18위치의 글루타민은 DMF중의 N-α-BOC-L-글루타민-P-니트로페닐에스테르를 이용하는 활성 에스테르 방법에 의해 결합된다. 2위치의 트립토판 결합이후 0.1% 인들을 트리 플루오로초산 탈보호 시약에 첨가하고 염화메틸렌으로 세척한다.

아미노말단리신 잔기로부터 BOC기를 제거하고 진공건조시킨 후 펩티드-수지의 최종 중량은 12.2gm이었다. 펩티드 수지(5g)일부를 아닐솔(2ml)존재하에 0℃에서 30분간 무수 불화수소산으로 처리하고 B-사슬 펩티드를 A-사슬에 대해 상술된 방법을 이용하여 분리한다. 조[S-티오에틸 시스 10,22] hRLX×B(1-25)(1.40g)은 0.1M초산중의 바이오겔 p10상에서 겔여과하고, 정량용 HPLC를 사용해 정제했다.

겔여과로 정제된 펩티드 샘플(150mg)을 pH 8.3 에서 3시간 동안 S-설폰화 시킨다. 본 반응혼합물을 여과하고, 침전 및 상등액을 증류슈에 대해 투석했다. 동결건조후 회수한 "가용성"펩티드는 92mg이고, "불용성" 펩티드는 55mg이다. S-설포화된 B-사슬 펩티드는 C-18가역상 컬럼 및 0.1% TFA-물-아세토니트릴 용매계를 사용하여 정량용 HPLC로 추가 정제했다.

(ⅲ) 사슬 결합

합성 hRLX×A(1-24) 및 hRLX×B(1-25)펩티드는 인슐린에 오관해 챤스와 호르만(오스트레일리마 특허출원 68844/81)에 의해 설명된 방법을 사용하여 상술한 방법으로 결합되는데, 여기서 S-설폰화된 펩티드는 pH 10.5 의 글리신 완충액 중에서 펩티드 농도 10mg/ml로 A : B의 비율이 2 : 1이 되도록 혼합했다. 글리신 완충액 중의 디티오트레이톨을 각 S-설포기에 대해 총 1.0 실프히드릴기가 되도록 첨가했다. 이후 반응 혼합물을 개방 용기 중에서 24시간 동안 교반했다.

본 공정에 대한 추가 변형 방법으로서, 본 발명지들은 생물학적 활성 릭랙신을 제조하기 위한 사슬 결합 반응은 인슐린의 경우에 챤스 및 호르만에 의해 명시된 S-설포형태보다는 펩티드 사슬중 하나 또는 둘 모두를 이것의 S-티오에틸-cys 유도체로 사용할때 효과적으로 진행됨을 발견하였다. S-티오에틸 cys 펩티드를 사용함으로써 본 펩티드를 S-설포 유도체로 전환 시키는데 필요한 반응 및 정제 단계를 제거할 수 있다. 본 발명자들의 경험에 의하면 릴래신 펩티드의 S-설폰화반응은 정제가 어려운 S-설포펩티드가 되는 부반응을 수반하여 지수율을 초래한다.

상기 조건을 이용하는 경우 비퀴비스트 및 폴(Acta Endocrinol, 29, 135-136, 1958)의 래트 자궁 수축 검정법으로 측정한 생물학적 활성에 의하면 사슬 결합 수율은 0.24 내지 3.1%였다.

[실시예 1]

[사슬 결합 반응]

인체 릴랙신[S-티오에틸 cys 10,11,15] A (1-24)(건조 중량 3.60mg, 아미노산 분석에 의한 펩티드 2.0mg, 0.68μmole)를 용량 3ml의 마개달린 플라스틱 원심분리 튜브중의 pH 10.5의 0.1M 글리신 완충액 200μl에 용해시켰다. pH 10.5의 0.1M글리신 완충액 100μl중에 용해시킨 인체 릴랙신[S-설포cys 10,11] B(1-25)(1.89mg, 아미노산 분석에 의한 펩티드 1.0mg, 0.33μmole)을 첨가하고 본 혼합물을 진탕한다. pH 10.5의 0.1M 글리신 완층액중의 디티트레이톨(DDT)저장 용액(10ml 중의 DTT 1.15μmole)의 일부(15.2μl, 1.73μmole DTT)을 펩티드 용액에 첨가하고 간단히 진탕한 후, 반응 혼합물을 공기중에서 4℃로 24시간 동안 방치한다. 이후 이것을 원심분리하고 상등액의 일부 표본 샘플을 래트 자궁 수축 검정법에서 릴랙신 생물학적 활성에 대해 시험했다. 반응 혼합물의 일부 표본 샘플은 용량에 따라 래트 자궁의 자발적 수축을 억제한다. 75μl의 표본 샘플은 돼지의 천연 릴랙신 A22 B31 표준물과 비교하여 0.70%의 사슬 결합 수율에 상응되는 자긍 수축 억제 효과를 나타냈다.

[실시예 2]

H1-유전자 서열에 기초한 인체 릴랙신 펩티드의 추가 합성

하기 표에 수록된 합성 릴랙신 펩티드는 제 2 도에 나타낸 H1인체 릴랙신 유전자 서열로부터 유래된 A및 B사슬에 해당하는 아미노산 서열로부터 제조되었다. 각각의 펩티드 사슬은 상기에서 A(1-24) 및 B(1-25) 펩티드의 경우에 대해 설명된 방법에 따라 제조되고 정제되었다. 이런 공정의 변형 방법에는 B(3-25) 아미드 및 B(1-25)아미드 펩티드를 이용하였으며 여기서 PAM 수지 결합은 벤즈 히드릴 아민 (BHA)를 폴리스티렌수지로 대체되었다. BHA수지를 사용함으로써 유지 카르복시형태보다 아미드 형태인 C-말단을 갖는 펩티드가 형성되었다.

특별한 언급이 없는 한 사슬 결합 반응은 S-티오 에틸 cys 유도체로서의 A-사슬 및 S-설포 cys유도체로서의 B-사슬을 사용하여 전술한 바와 같이 수행되었다.

하기표에 수록된 모든 합성 유사물들은 래트의 자궁 수축검정법에서 릴랙신과 유사한 생물학적 활성을 나타내었다. 각 펩티드 사슬의 결합수율은 표준물로서 돼지릴랙신 A(1-22) - B(1-31)을 사용한 생물학적 검정 결과로 부터 계산되었다.

[참고문헌]

1. Hisaw, F.L. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 23, 661-663(1926)

2. Schwabe, C., McDonald, J.K, and Steinetz, B.C. Biochem. Biophys. Res. Commun. 75, 503-510(1977).

3. James, R., Niall, H., Kwok, S. and Bryant-Greenwood, G. Nature, 267, 544-546 (1977).

4. John, M.J., Walsh, J.R., Borjesson, B.W. and Niall, H.D. Endocrinology 108, 726-729(1981).

5. Schwabe, C., Gowan, L.K. and Reinig, J.W., Ahn. N.Y. Acad. Sci. 380, 6-12(1982).

6. Hudson, P., Haley, J., Cronk, M., Shine, J. and Niall, H, Nature, 291, 127-131 (1981).

7. Haley, J., Hudson, P., Scanlon, D., John, M., Cronk, M., Shine, J., Tregear, G. and Niall, H. DNA 1, 155-162 (1982).

8. Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M., Chen, H.R., Hunt, L.T., Barker, W.C and Orcutt, B.C. DNA 1,

9. Lawn, R.M., Fritsch, E.F., Parker, R.C. Blake, G. and Maniatis, T. Cell, 15, 1157-1174 (1978).

10. Maniatis, T., Hardison, R.E., Lacy, E., Lauer, J., O'Connell, C., and Quon, D. Cell 15, 687-701 (1978).

11. Taylor, J.M., Illmersee, R., and Summers, J. Biochim. Bicphys. Acta 442, 324-330 (1976),

12. Benton, W.D. and Davis, R. Scienece 196, 180-183 (1977).

13. Denhardt, D.T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, 641-646 (1966).

14. Yamamoto, K.R. and Alberts, B.M. Virology 40, 734-744 (1970).

15. Sanger, F., Coulson, A.R., Barrell, B.G., Smith, A.J.A. and Roe, B.A. J. Mol. Biol. 143, 161-178 (1980).

16. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. Proc. Natn, Acad. Sci. 74, 5463-5467 (1977).

17. Maxam, A.M. and Gilbert, W. Proc. Nathn, Acad. Sci. 74, 560-564 (1977).

18. Staden, R. Nucl. Acids, Res. 6, 2601-2610 (1979).

19. Leder, P., D. Tiemeier and L. Enquist Science 196 : 175 (1977).

20. Messing, J. Recomb DNA Tech Bull 2(2) : 43 (1979).

21. Borck, K., J.D. Beggs, W.J. Brammer A.S. Hoplcins and N.E. Murray Mol. Gen. Genet 146 : 199 (1976).

22. Sutcliffe, J. S. Proc. Nati. Acad. Sci. 75 : 3737 (1978).

23. Sutcliffe, J.G. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43 : 77 (1979).

24. Bolivar, F. R. L. et al. Gene 2 : 95 (1977).

25. Frederick R.B. et al. science 196 : 161-169 (1977).

Claims (21)

1. 돼지 릴랙신의 단편을 프로오브(probe)로 사용하여 인체 게놈클론 뱅크를 선별하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 인체 H1-프리프로 릴랙신을 암호하는 유전자 또는 그들의 동등물 또는 그들의 서브유니트를 분리하는 방법.
2. 인체 H1-프리프로 릴랙신 또는 그들의 서브유니트를 암호하는 데옥시 뉴클레오티드 서열을 유지하고 복제하는데 사용되는 DNA 전이벡터를 제조하는 방법에 있어서, 인체 H1-프리프로 릴랙신의 적절한 데옥시 뉴클레오티드 서열 또는 그 서브 유니트와 제한효소를 이용해 전이벡터를 절단하여 제조된 DNA 분자를 반응시키는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 DNA 전이벡터의 제조방법.
3. 적합한 데옥시 뉴클레오티드 서열을 함유한 형질발현 전이벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 그 N-말단서열은 원핵 단백질의 일부이며 그 C-말단서열은 인체 H1-프리프로 릴랙신의 아미노산 서열 전부 또는 일부인 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질의 제조방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 프로오브는 그 C-펩티드내의 아미노산 45-95에 상응하는 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 돼지 릴랙신 cDNA의 단편일 것을 특징으로 하는 방법.

   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자는 하기한 mRNA 서열 전부 또는 그들의 서브유니트 또는 그와같은 서열의 동등물 또는 서브유니트에 상응하는 암호쇄와 상보쇄로 구성된 이본쇄 DNA 단편으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.

   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자의 서브유니트는 인체 H1-릴랙신의 신호, A, B 또는 C펩티드 사슬 또는 이 사슬들중 2개 또는 그 이상의 조합체를 각각 형질 발현시키는 유전자인 방법
7. 제 5 항에 있어서, 이본돼 DNA 단편의 서브유니트는 하기한 mRNA 서열 또는 이 서열의 동등물에 상응하는 암호쇄 및 상보쇄를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.

   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 서브유니트는 하기 주어진 적절한 mRNA 서열 또는 그 mRNA 서열들이 조합물 또는 그같은 서열의 동둘물에 상응하는 암호쇄와 상보쇄를 함유하는 인체 H1-프리프로 릴랙신 또는 상기 사슬중 2개 또는 그 이상의 조합체의 신호 펩티드, A, B 또는 C펩티드를 형질 발현시키기 위한 이본쇄 DNA단편인 것을 특징으로 하는 방법.

   [신호 펩티드]

   

   A- 사슬

   

   B- 사슬

   

   C- 사슬

   
9. 제 5 항에서 청구된 인체 H1-릴랙신 유전자의 서브유니트 또는 돼지 릴랙신 유전자의 서브유니트 또는 그들의 서브유니트를 프로오브로 사용하는 것으로 구성된 인체 또는 다른 영장류 또는 관련종의 염색체 릴랙신 유전자를 분리하는 방법.
10. 제 2 항에 있어서, 상기 DNA전이벡터는 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 7 항중 어느 한항에서 정의된 바와 같은 유전자 또는 그와같은 유전자의 서브 유니트 또는 그와 같은 유전자의 동등물또는 서브 유니트에 상응하는 cDNA 데옥시 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 2 항에 있어서, 하나 이상의 천연 코돈들 또는 그들의 cDNA동등물을 동일 아미노산을 암호하는 다른 코돈으로 대체하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 2 항 또는 제11항에 있어서, 하나 이상의 천연 코돈들을 누락시키거나, 천연 코돈에 의해 암호되는 것이외의 아미노산을 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
13. 제 2 항에 있어서, 상기 DNA전이 벡터는 박테리아 플라스미드인 방법.
14. 제 2 항에 있어서, 상기 DNA전이 벡터는 박테리오 파아지 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 인체 H1-릴랙신 A-사슬 아미노산 A(1-24) 내지 A(10-24)으로 구성된 A-사슬과 인체 H1-릴랙신 B사슬 아미노산 B(1-32) 내지 B(4-23)으로 구성된 B 사슬을 함유하며, 상기 A-사슬과 B-사슬은 다음과 같은 서열을 갖으며,

    A- 사슬

    

    B-사슬

    

    (ⅰ) 상기 A 및 B-사슬들은 각가의 사슬들의 아미노산들간에 펩티드 결합을 형성시켜 합성하거나 ;

    (ⅱ) 상기 A-사슬을 형질 발현할수 있는 A-사슬을 암호하는 형질 발현 전이벡터로 일차 미생물을 형질 전환시키고, 상기 B-사슬을 형질 발현한 수 있는 B-사슬을 암호하는 형질발현 벡터로 이차 미생물을 형질 전환시키고, 상기 미생물들로부터 상기 A와 B사슬들을 회수한 후 ; 상기 A와 B-사슬들을 결합시키거나, ;

    (ⅲ) 인체프리프로 릴랙신을 암호하는 데옥시 뉴클레오티드 서열을 함유한 형질발현 벡터로 형질전환시킨 미생물을 상기 인체 프리프로 릴랙신의 형질발현에 적절한 조건하에서 배양하고, 상기 프리프로 릴랙신을 회수하며, 상기 A와 B 펩티드 사슬상의 설피드릴기를 A와 B펩티드 사슬 사이의 디설파이드 가교 결합으로 전환시킨후, C-펩티드를 절단 제거하는 것으로 구성된 릴랙신 활성을 갖고있는 폴리펩티드의 제조방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 A-사슬 아미노산 A(1-24) 내지 A(4-24)와 B-사슬 아미노산 B-(1-32) 내지 B(4-23)을 함유하는 방법.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 유리 아미노기에 보호성기를 첨가함으로써 변형되는 방법.
18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 A및 B사슬중 하나 또는 둘 모두에서 천연 아미노산중 하나이상을 상이한 아미노산으로 대체시킴으로써 변형되는 방법.
19. 제15항에 있어서, A-사슬 아미노산 A(1-24)과 B-사슬 아미노산 B(1-32)으로 구성된 상기 폴리 펩티드에 하나이상의 아미노산을 첨가하는 것으로 구성된 방법.
20. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 H1-릴랙신 유사물인 방법.

    A(1-24) + B(1-23)

    A(1-24) + B(1-25)

    A(1-24) + [Ala²⁴]B(1-26)

    A(1-24) + B(1-32)

    A(1-24) + B(1-25) 아미드

    두사슬 모두 - 티오에틸 형태인

    A(1-24) + B(1-25) 아미드

    A(1-24) + [N-포르밀 TRP²]B(1-25)
21. 제15항 또는 16항에 있어서, S-설폰화된 또는 S-티오알킬화된 A및 B사슬의 혼합물을 환원시켜 상기 릴랙신의 A및 B-사슬을 결합하고, 상기 혼합물을 공기중에서 산화시키고, 그렇게 제조된 릴랙신 또는 릴랙신 유사물을 회수하는 단계로 구성된 방법.

Images