DK171683B1 - Analogifremgangsmåde til fremstilling af human-H1-relaxinanalog - Google Patents

Description

DK 171683 B1

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af human-Hl-relaxinanalog, som har den i figur 2 viste sekvens, og som har human-Hl-relaxin-aktivitet, hvorhos A-kæden er forkortet med op til 9 aminosyrer i den aminoter-5 minale ende, og/eller B-kæden er forkortet med op til 9 aminosyrer i den aminoterminale ende og med op til 9 aminosyrer i den carboxylterminale ende, eller af en hvilken som helst af A-kæderne (A(l-24), A(2-24), A(3-24)) i kombination med en hvilken som helst af B-kæderne B(Ι-ΙΟ 23) til B(l-32)

Litteraturreferencer, som der med et tal henvises til i den efterfølgende beskrivelse, er samlet omtalt i slutningen af beskrivelsen.

15

Pionerarbejde af Hisaw (1) tydede på en vigtig rolle for peptidhormonet relaxin i pattedyr på grund af dets evne til at udvide symphysis pubis (skambensfugen eller -sammenføjningen) og derved lette fødselsprocessen. Relaxin 20 syntetiseres og opbevares i corpus luteum i ovarierne (æggestokkene) under graviditet (drægtighed) og frigøres i blodstrømmen forud for fødslen. Rådighed over ovarier har muliggjort isolering og aminosyresekvensbestemmelse af relaxin fra grise (2,3), rotter (4) og hajer (5). Det 25 biologisk aktive hormon består af to peptidkæder (kendt som A- og B-kæderne), der er sammenholdt ved disulfidbindinger, nemlig 2 inter-kæde bindinger og 1 intra-kæde binding. Strukturen ligner således meget insulin med hensyn til placeringen af disulfidbindingerne, hvilket har ført til 30 spekulation om et fælles stamgen for disse hormoner (2,3).

Rekombinant-DNA-metoder er blevet anvendt til isolering af cDNA-kloner for både rotte- og svinerelaxin (6), jvf. også DK patentansøgning nr. 615/83. Syntetiske, undecamere 35 nukleotider fremstillet på basis af aminosyresekvensinfor- mation blev anvendt som primere til syntese af cDNA-prober (-prøvemidler), som var stærkt beriget med relaxin-sekven-ser, og som identificerede relaxin-cDNA-kloner i gen- DK 171683 B1 2 "biblioteker" hidrørende fra ovarievæv. Relaxinstrukturge-net fandtes at kode for en enkeltkæde-precursor, som ligner præproinsulin med hensyn til den overordnede konfiguration, dvs. signalpeptid/B-kæde/C-peptin/A-kæde.

5

Svine- og rottepræprorelaxin indeholder et uventet stort forbindelsespeptid med 105 henholdsvis 104 enheder (eng: residues) i sammenligning med rotteinsulin, der har et C-peptid med ca. 30 aminosyreenheder. En høj grad af sekvens-10 homologi i C-peptidet i rotte- og svinerelaxin tyder på en rolle ud over simpel sikring af den korrekte dannelse af disulfidbinding af A- og B-kæderne. Opfinderne forudså, at strukturelle begrænsninger af sekvensafvigelse, der har været gældende under evolutionen, ville have resulteret i 15 et C-peptidområde med tilsvarende høj grad af sekvenshomo- logi i det humane relaxingen. Opfinderne har følgelig, som beskrevet i det følgende, benyttet prober baseret på C-peptidområdet i svinerelaxin i stedet for rotterelaxin ved udvælgelse af det humane relaxingen, fordi de samlede 20 proteinsekvensdata indicerede, at humane proteiner generelt afviger mindre fra svineproteiner end fra rotteproteiner (8).

Skønt det for adskillige forskningsgrupper har været et 25 langtidsmål at bestemme strukturen af humanrelaxin og at etablere en mulighed for klinisk intervention i vanskelige fødselstilfælde har den begrænsede rådighed over humane ovarier hidrørende fra graviditetsperioden forhindret en direkte aminosyresekvensbestemmelse. Opfindernes fremgangs-30 måde var at søge (eng: screen) direkte efter det humane relaxingen i et genbibliotek (samling af arveanlæg eller gener) under anvendelse af et område af porcinrelaxin-cDNA som probe (prøvemiddel). Denne fremgangsmåde resulterede i den heldige identifikation af en genomisk klon, ud fra 35 hvilken strukturen af hele kodeområdet for præprorelaxin er blevet bestemt.

Det antages nu, at enten det hermed beskrevne gen, som er DK 171683 B1 3 blevet betegnet "Hl", eller "H2"-genet, der er beskrevet i den samtidige DK patentansøgning nr. 5737/83, eller begge forekommer i humant reproduktivt væv, f.eks. ovarie- og placentavæv og/eller andre væv, der omfatter men ikke er 5 begrænset til fordøjelseskanalen, hjernen og huden, eftersom begge gener koder for peptider med relaxinlignende aktivitet.

Corpus luteum i ovarier såvel som decidual- (moderhinde-) 10 og placentavæv er de mest sandsynlige steder for eks- pressionering (manifestation) af relaxinbeslægtede gener.

I betragtning af den udbredte distribuering af mange peptidhormoner er det imidlertid højst sandsynligt, at relaxinget også er manifesteret i ikke-reproduktive væv, 15 herunder hjernen og mavetarmkanalen. Relaxin har generelt egenskaber som vækstfaktor og er i stand til at ændre bindevævs natur og påvirke glatte musklers kontraktion. Det formodes, at enten den ene eller den anden eller begge de genstrukturer, der er beskrevet i nærværende beskrivelse og 20 i den samtidige DK patentansøgning nr. 5737/83, i vid udstrækning er fordelt i legemet. Det antages, at de relaxinpeptider, der ekspressioneres af sådanne gener, spiller en vigtig fysiologisk rolle ud over deres veldokumenterede hormonale funktion under reproduktionen.

25

Naturligt human-relaxin har vist sig at være yderst fordelagtigt som fødselsforberedende hjælpemiddel, idet det fremmer blødgøring og udvidelse af livmoderhalsen hos fødende kvinder og nedsætter dermed fødselsubehaget og -30 smerterne hos disse, mindsker risikoen for behov for kejsersnit og nedsætter barnets/fosterets stressbelasning uder fødslen. På grund af sin artsnaturlige beskaffenhed må human-relaxin endvidere antages at være mere hensigtsmæssigt, mere effektivt og gine anledning til færre 35 bivirkninger, herunder allergier og overfølsomhedssyndro- mer, end hvad der vil være tilfældet ved anvendelse af ikke-artsspecifikt relaxin, såsom eksempelvis svine- eller rotterelaxin. Det samme gælder det med den foreliggende DK 171683 B1 4 opfindelse fremstillede human-Hl-relaxinanalog.

Den foreliggende opfindelse angår således en analogifremgangsmåde til fremstilling af human-Hl-relaxinanalog, som 5 har den i figur 2 viste sekvens, og som har human-Hl- relaxin-aktivitet, hvorhos A-kæden er forkortet med op til 9 aminosyrer i den aminoterminale ende, og/eller B-kæden er forkortet med op til 9 aminosyrer i den aminoterminale ende og med op til 9 aminosyrer i den carboxyl terminale ende, 10 eller af en hvilken som helst af A-kæderne (A(l-24), A(2- 24), A(3-24)) i kombination med en hvilken som helst af B-kæderne B(l-23) til B(l-32), hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at A- og B-kæderne af relaxinet i deres fulde længde, deres modificerede eller forkortede former 15 forenes ved en i sig selv kendt fremgangsmåde til forening af A- og B-kæderne i insulin.

Følgende forkortelser anvendes i beskrivelsen: 20 Hl: det heri beskrevne relaxingen, som er afledt fra en genomisk klon,

H2: relaxingenet, der er beskrevet i den samtidige DK

patentansøgning nr. 5737/83, og som er afledt fra en cDNA-klon, 25 DNA : deoxyribonukleinsyre A: adenin RNA : ribonukleinsyre T : thymin cDNA : komplementært DNA G : guanin 30 (syntetiseret enzymatisk ud C : cytosin fra en mRNA-sekvens) U : uracil mRNA : meddeler-RNA (messenger-RNA) DK 171683 B1 5

Koderelationerne mellem nukleotidsekvensen i DNA og aminosyresekvensen i protein er alment kendt som den genetiske kode og er anført nedenfor.

5 Første Tredie base base IS' endel _Anden base_ fS'enden) li £ A £

Phe Ser Tyr Cys U

^ Phe Ser Tyr Cys C

Leu Ser Stop Stop A

Leu Ser Stop Trp G

Leu Pro His Arg U

c Leu Pro His Arg C

Leu Pro Gin Arg A

Leu Pro Gin Arg G

Ile Thr Asn Ser U

^ Ile Thr Asn Ser C

Ile Thr Lys Arg A

Met Thr Lys Arg G

Val Ala Asp Gly U

q Val Ala Asp Gly C

Val Ala Glu Gly A

Val Ala Glu Gly G

DK 171683 B1 6

De forkortelser, der anvendes for aminosyrerne i tabellen, identificeres som følger: 5 Phenylalanin (Phe) Histidin (His)

Leucin (Leu) Glutamin (Gin)

Isoleucin (Ile) Asparagin (Asn)

Methionin (Met) Lysin (Lys)

Valin (Val) Asparaginsyre (Asp) 10 Serin (Ser) Glutaminsyre (Glu)

Prolin (Pro) Cystein (Cys)

Threonin (Thr) Tryptophan (Trp)

Alanin (Ala) Arginin (Arg)

Tyrosin (Tyr) glycin (Gly) 15

Hver 3-bogstavkode (kaldet en codon) i tabellen, f.eks.

AUG, CAU (også kendt som en deoxynukleotidtriplet eller nukleotidtriplet) svarer til et trinukleotid i mRNA med en 5'-ende til venstre og en 3'-ende til højre. Bogstaverne 20 står for de purin- eller pyrimidinbaser, der udgør nukleo- tidsekvensen. Alle de DNA-sekvenser, der refereres til heri, er sekvenser på den streng, hvis sekvens svarer til mRNA-sekvensen med thymin (T) i stedet for uracil (U).

25 I den efterfølgende beskrivelse vil der blive henvist til den tilhørende tegning, hvor: fig. 1 er et forkortet restriktionsenzymkort over de to genomiske kloner, der er nævnt nedenfor, 30 fig. 2 viser mRNA-sekvensen for kodeområdet i humanrelaxin-genet og aminosyresekvensen i humanpræprorelaxin, og fig. 3 viser en sammenligning af humanpræprorelaxin- og 35 mRNA- sekvenser med tilsvarende sekvenser i porcinpræprore- laxin.

Den originale kilde til genetisk materiale var et bibliotek DK 171683 B1 7 af humane genomiske kloner. Screen-søgning i dette "bibliotek" under anvendelse af svinerelaxin-cDNA-prober gav to kloner indeholdende kodningssekvenser for humanrelaxin.

5 Den i figurerne 2 og 3 viste mRNA-sekvens blev bestemt ved de i det følgende beskrevne metoder. Det vil ses, at et enkelt intron på 3,4 kb afbryder kodeområdet i forbindel-sespeptidet (C). Strukturen for humanpræprorelaxir. blev udledt ud fra den genomiske sekvens ved sammenligning med 10 homologe strukturer i svine- og rotterelaxin. Bekræftelse af A- og B-peptidkædestruktureme er blevet tilvejebragt ved syntese og kæderekombination in vitro, hvilket frembringer et materiale, der er biologisk aktivt ved uteruskontraktionsforsøg.

15

In vitro fremstillingsmåden for præprorelaxinet er endnu ikke fuldt ud kendt, men ved analogislutning ud fra svinerelaxin ville man forvente at spaltning af signalpep-tidet ved Ala-1-Lys1-bindingen. Tilsvarende forudsiges 20 udskæring af C-peptidet at forekomme ved Leu -Ser og 336 137

Arg -Arg , hvorved der fremkommer B- og A-kæder på 32 henholdsvis 24 enheder.

Som det er anført i opfindernes redegørelse over studier af 25 svinerelaxin findes der kernesekvenser i svinerelaxinets B- og A-kæder, som indeholder alle væsentlige elementer for biologisk aktivitet. Opfindernes synteseundersøgelser af humanrelaxinkæden viser tilsvarende resultater, som omtalt mere detaljeret i det følgende.

30

Et dobbeltstrenget DNA-fragment, der koder for humanpræ-prorelaxin, og som omfatter en kodende streng og en komplementær streng, der svarer til den fuldstændige mRNA-sekvens (codon'erne -25 til 160), er vist i figur 2 på den 35 tilhørende tegning.

Blandt de underenheder, der er indbefattet i dette DNA-fragment, er gener, som ekskluderer ikke- kodende områder.

DK 171683 B1 8 såsom dem, der er vist i figur 3, gener, som indeholder de individuelle strukturgener, der koder for signalpeptidkæden og A, B-og C-kæderne i humanpræprorelaxin (se figur 3), og enhver kombination af disse kæder, f.eks. de gener, der 5 koder for A- og B-peptidkæderne, separat eller som pro- relaxin (med C-kæden).

Mere specielt koder et dobbeltstrenget DNA-fragment for humanprorelaxin, hvilket dobbeltstrenget DNA omfatter en 10 kodende streng og en komplementær streng, der svarer til de codon, der er nummereret som 1 til 160 af mRNA-sekvensen vist i figur 2 på den tilhørende tegning.

Dobbeltstrengede DNA-fragmenter, som særskilt koder for A-15 og/eller B- og/eller C-kæderne i humanrelaxin, og som omfatter en kodende streng og en komplementær streng svarende til codon7erne med numrene 1-32, 33-136 og 137-160 af mRNA-sekvensen, er vist i fig.2 på den tilhørende tegning.

20

De ovenfor beskrevne gener kan ud over de specificerede codon7erne også inkludere passende "start"- og "stop"-codon'erne, dvs. AUG henholdsvis UGA (codon -26 og 161 i figur 2).

25

En fagmand vil forstå, at polymorfe former af generne kan forekomme.

Som vist ovenfor indeholder den genetiske kode redundancer, det vil sige, at visse aminosyrer kodes med mere end en 30 codon.

Som allerede anført ovenfor fremstilles der peptider med relaxinaktivitet, og som adskiller sig fra B- og/eller A-kædestrukturerae i naturlig relaxin. Disse forskelle kan 35 omfatte udeladelse af en eller flere aminosyrer og/eller vedføjning af yderligere aminosyrer og/eller substitution af forskellige aminosyrer i de naturlige kæder.

DK 171683 B1 9 A- og B-peptidkæderne og også prorelaxin og præprorelaxin kan fremstilles ved de sædvanlige fremgangsmåder til genekspression, dvs. dyrkning af celler, der indeholder den behørigt transformerede transfervektor, og isolering og 5 oprensning af det (de) ønskede peptid (er), der er pro duceret af cellerne.

Relaxinanaloger kan fremstilles ved direkte kombination af separate A- og B-kæder ved en hvilken som helst af de 10 fremgangsmåder, der for tiden kendes og bruges til frem stilling af insulin.

På tilsvarende måde som insulin kan relaxinanalog fremstilles ud fra prorelaxin ved oxidation eller anden 15 omdannelse af sulfhydrylgrupperne på A- og B-peptiderne i relaxin, der er fremstillet som beskrevet heri, til dannelse af disulfidtværbindinger mellem A- og B-peptiderne, og derpå udskære C-peptiderne, f.eks. ved en enzymkatalyseret hydrolyse, som er specifik for bindingerne, som 20 sammenbinder C-peptidet med A- og B-peptiderne.

Ved en sådan fremgangsmåde reduceres en blanding af de S-sulfonerede A- og B-kæder, hvorpå blandingen overlades til oxidation i luft.

25

Det er også med opfindelsen blevet opdaget, at nyttevirkningen ved den ovenanførte fremgangsmåde forbedres, når den ene af eller både A- og B-kæderne foreligger i form af et S-thioethyl-cys-derivat i stedet for på S-sulfoformen.

30 I beskrivelsen til Australsk patent nr. 561.670 er det vist, at den ene af eller både A- og B-kæderne i relaxinet kan forkortes ved amino- og/eller carboxyterminalerne uden væsentligt tab af biologisk aktivitet og under opnåelse af 35 bedre kombinationsudbytter. Disse metoder er ligeså anvendelige til fremstilling af humanrelaxin.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes ved analogifremgangsmåden DK 171683 B1 10 en humanrelaxin-analog, som 1 det væsentlige består af forkortede og/eller modificerede former af de naturlige B-og/eller A-peptidkæder.

5 Undersøgelser af både svine- og menneskerelaxin har vist, at relaxinaktiviteten kan være til stede ved A-kæder så korte som A(10-24) og B-kæder så korte som B(10-22), selv om de praktiske minima forventes at være A (4-24) henholdsvis B(4—23).

10

Generelt kan A-kæden varieres fra A(1-24) til A(10-24) og B-kæden fra B(l-32) til B(10-22).

De foretrukne kombinationer afledes fra: 15

A _B

En hvilken (1*24) med en hvilken (1-23) som helst af (2-24) som helst af (op-til) (3-24) (1-32) 20

Modifikatoner af B- og/eller A-kæderne sker ved enten "genetisk" modifikation, som beskrevet ovenfor, eller kemisk modifikation af B- og/eller A-kæderne (i enten fuld længde eller forkortet form) forud for forening ved 25 fremgangsmåden ifølge opfindelsen. To typer modifikation kan benyttes enten enkeltvis eller i kombination.

Den første type involverer modifikation af en eller flere af de aminosyrer, som forekommer i de naturlige eller 30 forkortede B- og/ eller A-ksder. Denne modifikation vil almindeligsvis involvere beskyttelse af de aktive grupper på en eller flere af aminosyrerae ved i sig selv kendte metoder, og beskyttelsesgrupperne kan om ønsket fjernes efter forening af de (modificerede) A- og B-kæder.

35

Eksempler på denne type modifikation omfatter acetylering, formylering eller lignende beskyttelse af frie aminogrup-per, herunder den N-terminale, amidering af C-terminale DK 171683 B1 11 grupper eller dannelsen af estere af hydroxyl- eller carboxylgrupper. Formylgruppen er et typisk eksempel på en let fjernelig beskyttelsesgruppe.

5 Den anden type modifikation omfatter erstatning af et eller flere af de naturlige aminosyrer i B- og/eller A-kæderne med en herfra forskellig aminosyre (herunder B-formen af en naturlig aminosyre). Denne generelle modifikationstype kan også involvere fjernelse af en naturlig aminosyre fra kæden 10 eller tilføjelse af en eller flere ekstra aminosyrer til kæden.

Formålet med sådanne modifikationer er at øge kombinations-udbytterne af A- og B-kæderne under samtidig opretholdelse 15 af produktets aktivitet, dvs. relaxin eller en hermed analog, eller at forstærke eller modificere aktiviteten af produktet ved et givet kombinationsudbytte. Denne modifikation kan udstrækkes til at omfatte fremstilling af syntetiske analoger, som har relaxin-blokerende eller -antago-20 nistiske virkninger.

Et specifikt eksempel på den første modifikationstype er modificeringen af tryptofanenheden (Trp) ved B2 ved addition af en formylgruppe.

25

Eksempler på den anden modifikationstype er erstatning af Met- delen ved B24 med norleucin (Nle), vali (Val), alanin (Ala), glycin (Gly), serin (Ser) eller homoserin (HomoSer).

30 Ved dette aspekt af opfindelsen dannes humanrelaxinanaloger ud fra naturlige eller forkortede B- og/eller A-kæder, der er modificeret som beskrevet ovenfor.

A- og B-peptidkæderne og også prorelaxin og præprorelaxin 35 kan fremstilles ved sædvanlige genekspressionsfremgangs måder, det vil sige dyrkning af en mikroorganisme, som indeholder den behørige, transformerede transfervektor, og isolering og rensning af det ønskede peptid (eller pepti- DK 171683 Bl 12 der), der er produceret af mikroorganismen.

De således frembragte peptidprodukter kan foreligge i form af et fusionsprotein, i hvilket det ønskede peptid er 5 forbundet med en del af et procaryotisk protein.

Opfindelsen beskrives og illustreres yderligere ved den efterfølgende beskrivelse og de benyttede eksperimentelle procedurer og de herved opnåede resultater.

10 A. Eksperimentelle procedurer (i) Bakterie- οσ fag-stammer 15 E.coli RR1 blev benyttet som den bakterielle vært for rekombinantplasmider (pBR322) indeholdende porcinrelaxin-cDNA-indsatser som beskrevet tidligere (7).

Biblioteket (samlingen) af humane genomiske kloner blev 20 venligst stillet til rådighed af T. Maniatis. Genomiske DNA-fragmenter på ca. 15-20 kb fra den partielle Hae 111/Alu 1 fragmentation af human-DNA (9) blev klonet ved koblinger i lambdafagvektoren Charon 4A (10) og opformeret i E.coli LE392 -celler.

25

Fag-DNA (efter klonselektion) blev fremstillet efter lysering af E.coli DP50supF -celler i en 1 liter kultur (10).

30 Små DNA-fragmenter (fra fragmentationen af fag-DNA) blev subklonet til sekvensanalyse i H13 bakteriofagvektorerne mp7,l, mp8 og mp9 (venligst stillet til rådighed af Dr.

J.Messing) og overført til E.coli JM101 -celler.

35 (il) Fremstilling af hybridiserinosprober (porcin-DNAl

Radioaktivt mærkede prober blev fremstillet ved primede synteser på forskellige DNA-fragmenter under anvendelse af DK 171683 B1 13 denaturerede, statistisk vilkårlige primere (3 eller 4 baser) af kalvethymus-DNA (11). Porcin-DNA-skabelonen (100-200 ng) blev denatureret med de statistisk vilkårlige primere (løg) ved kogning i 20 μΐ H20 i 2 minutter. Syntese 5 blev indledt ved tilsætning af 30 μΐ reaktionsblanding indeholdende 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 10 mH MgCl2, 5 enheder E.coli DNA-Polymerase l, 500 M af respektivt dCTP, dGTP, dTTP og 0,3 μΜ a-[32P]-dATP (ca.

3000 Ci/mmol, Amersham). Efter inkubering ved 37°C i 30 10 minutter blev reaktionen bragt til afslutning ved for tynding i 300 ml af en puffer indeholdende 0,3 M NaCl, 10 mH Tris-HCl, pH 8,0, ImM EDTA, og reaktionsblandingen blev passeret gennem en Sephadex-G50-søj le (l cm x 5cm) i samme puffer. Den radioaktivt mærkede probe blev indsamlet fra 15 topfraktionerne ved udtømt rumfang og præcipiteret med 2 rumfang ethanol ved -20°C i 2 timer under anvendelse af tRNA (10Mg) som bærer (carrier).

.i li i.L.-ScregnlnqsprQcedyrer 20

Lambda-fag (λ) indeholdende genomiske DNA-fragmenter blev dyrket på blød agar med ca. 10 fag/plade med 13 cm diameter og overført til nitrocellulosefiltre (Schleicher & Schull BA85) som beskrevet af Benton og Davis (12).

25 Filtre blev hybridiseret med den radioaktivt mærkede probe ved 40°C i 18 timer i modificeret Denhart's opløsning (13) indeholdende 5 x SSC og 25% formamid. Filtrene blev vasket i 2 x SSC ved 30°c i 1 time inden eksponering af røntgenfilm (Kodak XS-5) i 24 timer. Områder af pladen, som 30 udviste positiv hybridisering blev subkultiveret og screenet igen successivt indtil en enkelt positiv plaque kunne udvælges. Fag blev indhøstet efter lysering af 1 liter kultur af E.coli I DP50supF -celler, og DNA blev fremstillet ved fremgangsmåderne, der er beskrevet af 35 Maniatis (10) og Yamamoto og Alberts (14).

DK 171683 B1 14 fivl DNA-sekvensanalvse

Restriktions fragmenter af den udvalgte rekombinant-fag blev subklonet direkte i Eco RI, Pst 1 eller Sma 1-spaltnings-5 stedet i fag M13mp8. Koblinger (ligationer) blev frembragt

i 20 μΐ reaktionsblandinger indeholdende 10 mM Tris-HCl, pH

8,0, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, ImM ATP, 1 enhed T4-DNA-ligase, DNA (100 ng) og M13-fagvektoren (50 ng). Efter inkubering ved 40° natten over blev rekombinant-DNA overført til 10 E.coli JMlOlceller (15). Plague indeholdende kodeområdet blev udvalgt (selekteret) ved en tilsvarende metode, som den ovenfor beskrevne med hensyn til genomisk screening, bortset fra, at M13-fagen blev udpladet med mindre tæthed 3 (10 fag/plade med 9 cm diameter). Positive plague blev 15 dyrket til opnåelse af et preparativt udbytte af enten en enkeltstrenget skabelon eller en replikativ dobbeltstrenget (rf) form (15). Enkeltstrengede skabeloner blev sekvenssorteret direkte ved metoden af Sanger et al. (16) under anvendelse af enten en M13-specifik primer (Collaborative 20 Research) eller syntetiske primere, der var komplementære til forskellige sekvenser i kodeområdet. Komplet sekvensanalyse af subklonerne blev opnået ved spaltning af rf-formen på forskellige steder med forskellige restriktionsenzymer og derpå subklonet i M13 ved stump-endekobling (15) 25 eller ved direkte endemærkning af fragmenter og sekvensbe stemmelse ved metoden ifølge Maxam og Gilbert (17). DNA-sekvens blev analyseret og sammenlignet med svine- og rotterelaxinsekvenser under anvendelse af computerprogrammer (18) .

30 B. Resultater I den efterfølgende diskussion vil der blive henvist til tegningen.

35

Fig. 1 viser et forkortet restriktionsenzymkort over de genomiske kloner.

DK 171683 B1 15

Størrelserne er angivet i kilobasepar (kb) og spaltningssteder er betegnet EcoRl (R), Pst 1 (P) og Hpa 11 (H). Den genomiske klon ΛΗ5 ender ved en Eco RI-kobling, der er knyttet til Alu 1-positionen i C-peptidet (exon II) (A i 5 fig. l). Den definitive nucleotidsekvens over kodeområdet blev opstillet ud fra den genomiske klon gH7 ved subkloning af Eco RI og Pst 1 fragmenter i M13mp8 og derpå enten: (1) direkte sekvensbestemmelse på Ml3-skabeloner, hvilket 10 i fig. 1 er vist med stiplede linier (----------), (2) direkte sekvensbestemmelse under anvendelse af syntetiske nukleotidprimere, hvilket er vist med prikkede linier (****), eller (3) endemærkning af DNA-fragmenter og sekvensbestemmelse 15 ved kemisk nedbrydning, vist med fuldt optrukne linier ( - ).

De til sekvensbestemmelsen benyttede primere var:

20 a: 5'TTCGCAATAGGCA og b: 5'GCACAATTAGCT

Fig. 2 viser kodeområdet i det humane relaxingen.

En sammenligning af humanpræprorelaxinaminosyre- og mRNA-25 sekvens (øvre) med den tilsvarende svinerelaxinsekvens (nedre) er vist i fig. 3. Sekvenserne er blevet opstillet på linie, således at der fremkommer størst mulig homologi med identiske nucleotider angivet ved stjerner og aminosyreho-mologier med indrammede områder. Aminosyrerne er nummereret 30 fra starten af B-kæden. Intronsekvensen ved exon/intron/en- xon-grænserne er præsenteret ved den nedre DNA-notation.

(i) Isolering oa karakterisering af genomiske kloner 35 Humane genomiske kloner blev identificeret ved screening af "biblioteket" med prober fremstillet ud fra et kort (150 bp) fragment af den svinerelaxin-cDNA-klon, der svarer til aminosyrerne 45-95 i C-peptidet (7), som opstillet i fig.3 DK 171683 B1 16 på den tilhørende tegning. Dette fragment blev udskåret fra klonen ved "fordøjelse" med Hpa II og Hinf 1 og svarende til området med maximal homologi (71% på nucleotidniveauet) mellem rotte- og svinerelaxinsekvenseme. Fra den genomiske 5 klonsamling blev der isoleret to stærkt positive fager betegnet λΗ5 og λΗ7. Disse positive kloner blev yderligere karakteriseret ved restriktionsenzymanalyse under anvendelse af to separate fragmenter fra svinerelaxin-cDNA, der er specifik for 5#- henholdsvis 3'-exon-områderne (i 10 det følgende kaldt "exon I" og "exon II"), som prober. De to fragmenter blev frembragt ved spaltning af svinerelaxin-cDNA-klonen i et enkelt Hpa Il-spaltningssted, der (indenfor nogle få baser) svarer til en intronposition i det homologe rotterelaxingen (6). "Southern blot"-analyse af AH5-15 og ΛΗ7-klonerne afslørede, at kodeområdet i humanrelaxin- genet er afbrudt af en enkelt intron på 3,4 kb (se fig.l).

(il) Sekvensanalvse af de genomiske kloner 20 Den benyttede strategi gik ud på at subklone komplette re striktions fordøj el ser af λΗ5 og λΗ7 i Ml3-vektorer og derpå foretage screening under anvendelse af svinerelaxinprober, der var specifikke for exon I og II. De positive subkloner blev sekvensbestemt ved en kombination af metoder, der er 25 beskrevet i metodeafsnittet A(iv) ovenfor.

Exon II -området i λΗ7-klonen var indeholdt i et 2,0 kb EcoRl- fragment begyndende med et EcoRl-spaltningssted i C-peptidet og fortsættende gennem hele kodesekvensen af A-30 kæden til den afsluttende kodon (se fig.l). Sekvensbe stemmelsen af dette fragment blev lettet betragteligt ved syntesen af nucleotidprimere, der er specifikke for områder omkring A-kæden, og som blev benyttet til direkte primning på Ml3-skabelonen, der indeholdt hele 2,0 kb fragmentet.

35 Det subklonede Eco Rl-fragment indeholdende de øvrige 53 bp af C-peptidet i exon II kunne ikke identificeres med svine-cDNA som probe. Sekvensen over dette område blev opnået med et subklonet Pst 1 fragment fra gH7, som indeholdt hele DK 171683 B1 17 exon II -området.

Sekvensbestemmelse af exon II -området af XH5 afslørede et yderst kort 70 bp fragment begyndende i samme Eco Rl-spalt-5 nlngssted i C-peptidet som XH7 (se fig.l), men afsluttende med en Eco Rl-kobling, som var blevet knyttet til et Alu 1-spaltningssted 1 det oprindelige genomlske DNA under frembringelsen af det genomlske bibliotek. λΗ5 blev derfor betegnet som en ufuldstændig klon af relaxingenet og blev 10 ikke analyseret yderligere.

Sekvensanalyse af exon I -området blev lettere kompliceret af et Eco Rl-spaltningssted i signalpeptidet, hvilket nødvendiggjorde en uafhængig sekvensbestemmelse af to 15 Eco Rl-fragment-subkloner. Overlapningen over Eco Rl- positionen blev understøttet af en identificering af en Alu I -subklon fra XH7, som indeholdt den overlappende sekvens.

20 C. Syntese af et modificeret humanrelaxin fhRLXl A(l-24) - Bf1-25) (ii Syntese af humanrelaxin-A-kæde. hRLX Af1-24) 25

Aminosyresekvensen svarende til enhederne 1-24 i humanrela-xin-A-kæden udledt som beskrevet ovenfor ud fra nucleotids-ekvensen i den genomiske klon blev syntetiseret ved faststof fase-proceduren ifølge de generelle principper, der 30 er beskrevet af Herrifield (f.eks. Barany, G. og Merrifi- eld, R.B. i "The Peptides”, red.: E.Gross & J. Meienhofer, Academic Press, N.Y., s.1-284, 1980).

Ν-α-tert-butyloxycarbonyl -4-methyl-benzyl-L-cystein ( i 35 det følgende betegnet "BOC") blev koblet til en 1% tværbun den polystyrenharpiks via phenylacetamidomethyl (PAM) -koblingen i et omfang på 0,30 mmol/g under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Tam et al., (Synthesis 12. 955-057, DK 171683 B1 18 1979). BOC-L-CYS-PAM-harpiksen (8,0 g) blev overført til en reaktionsbeholder i en Beckman model 990 peptidsyntetisør, og aminosyresekvensen fra enhed 23 til 1 blev samlet ved den trinvise tilsætning af hver aminosyre beskyttet på 5 passende måde. Den aminoterminale BOC-beskyttelsesgruppe på hver aminosyre blev fjernet ved behandling af harpiksen med 35% trifluoreddikesyre i methylenchlorid i 30 minutter efterfulgt af en neutralisation med 5% diisopropylethylamin i methylenchlorid i 15 minutter. Efter hver behandling blev 10 harpiksen vasket grundigt med methylenchlorid. Den næste aminosyre i sekvensen (med α-aminogruppen passende beskyttet af BOC-gruppen, og hvor det var nødvendigt med en passende beskyttelse af en funktionel sidekædegruppe) blev koblet til harpiksen under anvendelse af dicyclohexyl-15 carbodiimid (DCC). Harpiksen blev omrørt med aminosyren i methylenchlorid i 10 minutter forud for indføringen af DCC'et, som også var opløst i methylenchlorid. Et 2,5 molær overskud (6,0 mmol) af aminosyre og DCC blev benyttet ved hver kobling. Efter omrøring i 1 time blev en prøve af 20 harpiksen fjernet fra reaktionsblandingen og undersøgt for tilstedeværelse af frie aminogrupper under anvendelse af ninhydrinproceduren ifølge Kaiser et al. (Anal. Biochem., 34 r 595-598, 1970). Hvis ninhydrinprøven var negativ indicerende fuldstændig kobling, blev reaktionscyklussen 25 fortsat med BOC-beskyttelsesfjernelse, neutralisation og kobling med næste aminosyre. I tilfælde af en positiv ninhydrinprøve blev koblingsreaktionen gentaget med yderligere aminosyre og DCC.

30 Aminosyrer med funktionelle sidekædegrupper blev benyttet i form af følgende beskyttede derivater: N-e-BOC-2,6-dichlorbenzyl-L-tyrosin, N-a-B0C-£-chlorben-zyloxycarbonyl-L-lysin, N-a-BOC-L-serin-0-benzylether, N-a-

Q

35 amyloxycarbonylN -tosyl-L-arginin, N-a-BOC-L-threonin-O- benzylether, N-a-BOC-S-ethylmercapto-L-cystein (til CYS i A-kædesekvensposition 15, 11 og 10), N-a-BOC-L-glutamin-syre-q-benzylester.

DK 171683 B1 19

Efter samling af 1-24 peptidsekvensen blev den sidste BOC-gruppe på det aminoterminale arginin fjernet under anvendelse af afbeskyttelses-neutralisationscyklussen, og peptidharpiksen blev tørret i vakuum (vægt af peptidharpiks 5 17,0 g). En portion af peptidharpiksen (2 g) blev behandlet med vandfri hydrogenfluorid i nærværelse af anisol (2 ml) ved 0°C i 30 minutter. Den totale kontakttid for harpiks-peptidet med hydrogenfluorid (HF) blev holdt på et minimum (ikke over 70 minutter) ved hurtig fjernelse af HF under 10 vakuum fra en oliepumpe. Harpikspeptidet blev derpå vasket adskillige gange med ethylacetat til fjernelse af anisol-overskud, peptidet blev ekstraheret i 1M eddikesyre, og opløsningen blev lyophiliseret. Udbyttet af rå-peptid (med -V cyteinet i positionerne 10, 11 og 15 stadig beskyttet som 15 S-thioethylderivater) var 440 mg. Indledende rensning af rå-peptidet skete ved gelfiltrering på Biogel P10 i 0,1 M eddikesyre. De fraktioner, der repræsenterede hovedtoppen fra denne søjle, og som blev elueret på et sted svarende til en molekylvægt på ca. 3000, blev opsamlet og lyophili-20 seret. Aminosyreanalyse af en prøve af dette peptid indicerede, at alle aminosyrerne i 1-24 sekvensen forekom i det rette forhold.

Yderligere rensning af [S-thioethyl-Cys10'11'15]-hRLX A(l-25 24)- peptidet blev udført ved præparativ omvendt fase HPLC

på en Waters C-18 Bondapak-søjle under anvendelse af et 0,1% TFA-vand / acetonitril-solventsystem.

En prøve (160 mg) af det ved gelfiltrering rensede peptid 30 blev S-sulfoneret med en blanding af natriumsulfit og natriumtetrathionat (samlet reaktionstid 3 timer) ifølge fremgangsmåden beskrevet af Du et al., (Scientia Sinica,ΙΟΙ, 84-104 (1961)). Præcipitatet, der dannedes under S-sulfoneringsreaktionen, blev fjernet ved filtrering, og 35 både præcipitatet og supernatantopløsningen blev dialyseret mod destilleret vand ved 4°C i 48 timer. Indholdene i dialyseposerne blev lyophiliseret til opnåelse af 81,4 mg peptid fra supernatantopløsningen og 53,2 mg peptid fra DK 171683 B1 20 præcipitatet, som fremkom under S-sulphoneringsreaktionen.

En prøve a det "opløselige·' [S-sulfo-Cys10 # 11,15,24 ]-hRLX A (1-24) -peptid blev renset ved ionbytningskromatografi på DEAE-cellulose i tris-HCl-puffer, pH 8,3. Peptidet blev 5 elueret fra søjlen med en liniær gradient af NaCl i tris- HCl-puffer under anvendelse af et konduktivitetsområde på fra 3,0 mS til 85,0 mS. Fraktioner repræsenterende hovedtoppen, som blev elueret fra ionbytningssøjlen ved en konduktivitet på 20-30 mS blev dialyseret, og det indvundne 10 peptid blev lyophiliseret. Forberedt HPLC blev benyttet til yderligere rensning af det S-sulphonerede peptid.

(ii) Syntese af forkortet humanrelaxin-B-kæde. hRLX Bf1-25) 15 Aminosyresekvensen svarende til enhederne 1-25 i humanrela- xin-B-kæden blev synteseret under anvendelse af de ovenfor beskrevne procedurer begyndende med 7,0 N-a-tert-butyloxy-carbony 1 -O-benzyl-L-ser in-pheny 1 acetamid-methylpolys tyren-harpiks ladet med 0,1 mmol Ser pr. gram. Sidekædebeskyttel-20 sesgrupperne, der blev benyttet til syntese af A-kæden, blev også benyttet til B- kæden, herunder S-ethylderivatet til begge cysteiner i positionerne 10 og 22. Asparaginsyre-enhederne i positionerne 4 og 5 blev adderet som N-cr-BOC-f-benzylesterderivatet. Glutaminet i position 18 blev koblet 25 ved en fremgangsmåde med aktiv ester under anvendelse af N- β-BOC-L-glutamin-p-nitrophenylester i DMF. Efter kobling af tryptofanet i position 2 blev der tilsat 0,1 % indol til trifluoreddikesyre-afbeskyttelsesreagenset og til de efterfølgende methylenchloridvask.

30

Slutvægten af peptidharpiksen efter fjernelse af BOC-gruppen fra den terminale aminolysinenhed og vacuumtørring var 12,2 g. En portion af peptidharpiksen (5 g) blev behandlet med vandfri hydrogenfluorid i nærværelse af 35 anisol (2 ml) ved 0°C i 30 minutter, og B-kædepeptidet blev isoleret under anvendelse af den ovenfor beskrevne procedure for A-kæden. Det rå [S-thioethyl- Cys10/22]-hRLX B(l-25), (1,40 g) blev renset ved gelfiltrering på DK 171683 B1 21

BioGel PIO i 0,1M eddikesyre efterfulgt af præparativ HPLC.

En prøve (150 mg) af det ved gelfiltrering rensede peptid blev S-sulfoneret ved pH 8,3 i 3 tiner, reaktionsblandingen 5 blev filtreret, og præcipitatet og supernatantopløsningen blev dialyseret mod destilleret vand. Det "opløselige" peptid, der blev indvundet efter lyophilisering, udgjorde 92 mg; det "uopløselige" peptid udgjorde 55 mg. De S-sulfonerede B-kædepeptider blev yderligere renset ved 10 præparativ HPLC under anvendelse af en C-18 omvendt- fasesøjle og et 0,1% TFA-vand-acetonitrilsolventsystem.

fiiii Kædesammenfmining 15 De syntetiske hRLX A(l-24)- og hRLX B(1-25)-peptider blev sammenføjet under anvendelse af fremgangsmåden, beskrevet af Chance og Hoffmann (australsk patentansøgning nr. 68844/81) til insulinkæder, hvorved de S-sulfonerede peptider blev blandet i et forhold A:B på 2:1 ved en 20 peptidkoncentration på 10 mg/ml i glycinpuffer, pH 10,5.

Dithiothreitol i glycinpuffer blev derpå tilsat i en mængde, der samlet tilvejebragte 1,0 sulfhydrylgruppe for hver S-sulfogruppe. Reaktionsblandingen blev derpå omrørt i en åben beholder i 24 timer.

25

Som en yderligere modifikation af denne fremgangsmåde er det blevet opdaget, at kædesammenføjningsreaktionen til dannelse af biologisk aktivt relaxin forløb effektivt, når en eller fortrinsvis begge peptidkæderne blev anvendt som 30 deres S-thioethyl-Cys derivater i stedet for i S-sulf of or men, som angivet af Chance og Hoffmann (citeret ovenfor) i forbindelse med insulin. Anvendelsen af S-thioethyl-Cys-peptiderne eliminerer et reaktions- og rensningstrin, der kræves til omdannelse af peptiderne til S-sulf oderivaterne.

35 Ifølge den erhvervede erfaring ledsages S-sulfoneringsom sætningen af relaxinpeptiderne af sidereaktioner, som gør det vanskeligt at rense S-sulfopeptiderne, hvilket resulterer i lave udbytter.

DK 171683 B1 22

Ved anvendelse af de ovenfor angivne betingelser blev der opnået kædesammenføjningsudbytter på fra 0,24 til 3,1% som målt ved den biologiske aktivitet ved kontraktionsforsøg med rotteuterus ifølge Wiqvist & Paul (Acta Endocrinol., 5 21, 135-136, 1958).

Eksempel på kædesammenfø-iningsreaktion

Humanrelaxin-[S-thioethyl-Cys10'15]-A(l-24), (3,60 mg 10 tør vægt, 2,0 mg peptid ved aminosyreanalyse, 0,68 μιιιοί) blev opløst i 200 μΐ 0,1M glycinpuffer, pH 10,5, i et 3 ml plastcentrifugerør forsynet med prop. Humanrelaxin-[S-sulfo-Cys10'11)-B(l-25), (1,89 mg, 1,0 mg peptid ved aminosyreanalyse, 0,33 μιηοΐ) opløst i 100 μΐ 0,1M glycin-15 puffer, pH 10,5, blev tilsat og blandingen blev omrystet.

En delmængde (15,2 μΐ, 1,73 μιηοΐ DTT) af en stamopløsning af dithiothreitol (DTT), der var fremstillet med 0,1 H glycinpuffer, pH 10,5 (1,15 μιηοΐ DTT i 10 ml), blev tilsat til peptidopløsningen, og efter en kort omrystning fik 20 reaktionsblandingen lov til at henstå ved 4°C i 24 timer under luftens adgang. Blandingen blev derefter centrifugeret, og en prøve af supernatantopløsningen blev testet for biologisk relaxinaktivitet ved rotteuterus-kontraktions forsøg. Delprøver af reaktionsblandingen forhindrede de 25 spontane kontraktioner af en rotteuterus på en dosisafhæn gig måde. En 75 μΐ delprøve forhindrede fuldstændig uteruskontraktioner, hvilket svarer til et kædesammenføjningsudbytte på 0,70% baseret på sammenligning med en naturlig svinerelaxin-A22-B31-standard.

30

Yderligere syntetiske humanrelaxinpeptider baseret på Hl-gensekvensen

De i den efterfølgende tabel 1 angivne syntetiske relaxin-35 peptider blev fremstillet ud fra aminosyresekvenserne for A- og B-kæderne, der er udledt fra den i fig.2 viste Hl-humanrelaxingensekvens. De enkelte peptidkæder blev fremstillet og renset ifølge den ovenfor beskrevne frem- DK 171683 B1 23 gangsmåde i forbindelse med A(l-24)- og B(l-25)-peptiderne.

En modifikation af disse fremgangsmåder blev benyttet til B(3-25)amid- og B(1-25)-amidpeptiderne, ved hvilke PAM-harpikskoblingen blev erstattet med benzhydrylamin (BHA) -5 polystyrenharpiks. Brug af BHA-harpiks resulterer i dannelse af peptider med C-terminus i amidet i stedet for den frie carboxyform.

Hed mindre andet er angivet blev kædesammenføjningen udført 10 som beskrevet tidligere i forbindelse med A-kæden i form af S-thioethyl-Cys derivatet og B-kæden i form af S-sulfo-Cys-derivatet.

Alle de syntetiske analoger i den efterfølgende tabel 1 15 udviste relaxin-lignende biologisk aktivitet ved kontrak tionsforsøg med rotteuterus. Udbytterne ved sammenføjning af de separate peptidkæder blev beregnet ud fra bioforsøgsresultaterne under anvendelse af naturlig svinerelaxin-A(l- 22)-B(1-31) som standard.

20 DK 171683 B1 24 TABEL 1

Sammenføj nings- 5 udbytte (baseret

Syntetisk Hl-humanrelaxinanaloq på mængden af B-kæde 10 A(l—24) + B(l-23) 0,24% A(l-24) + B(l-25) 0,70% A(l—24) + [Ala ]B(l-26 ) 0,92% A(l—24) + B(l-32) 2,00% 15 A(l-24) + B( 1-2 5) amid 0,80% A (1-2 4) + B( 1-2 5) amid med begge kæder i 3,10% S-thioethylform ved kædesammenføjningsreaktionen A(l—24) + B(3-25)amid 0,68% A(l-24) + [N-formyl-Trp2 ] B (2-25) 0,43% 20 DK 171683 B1 25

LITTERATURFERENCER

5 1. Hisaw, F.L. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. £3, 661-663 (1926).

2. Schwabe, C., McDonald, J.K. og Steinetz, B.C. Bi-ochem.Biophys.Res. Commun, 25/ 503-510, (1977).

10 3. James, R., Niall, H., Kwok, S. og Bryant-Greenwood, G. Nature 2§T_, 544-546, (1977).

4. John, M.J., Walsh, J.R., Borjesson, B.W. og Niall, 15 H.D. Endocrinology 108. 726-729, (1981).

5. Schwabe, C., Gowan, L.K. og Reinig, J.W., Ann.N-.Y.Acad.Sci. 380. 6-12, (1982).

20 6. Hudson, P., Haley, J., Cronk, M., Shine, J. og Niall, H. Nature 221, 127-131, (1981).

7. Haley, J., Hudson, P., Scanlon, D., John, M., Cronk, M., Shine, J., Tregear, G. og Niall, H. DNA 1, 155- 25 162 (1982).

8. Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M., Chen, H.R., Hunt, L.T., Barker, W.C. og Orcutt, B.C. DNA 1, 51-58 (1981).

30 9. Lawn, R.M., Fritsch, E.F., Parker, R.C., Blake, G. og Maniatis, T., Cell 15, 1157-1174 (1978).

10. Maniatis, T., Hardison, R.E., Lacy, E., Lauer, J., 35 O'Connell, C. og Quon, D. Cell 15, 687-701 (1978).

11. Taylor, J.M., Illmersee, R. og Summers, J. Biochim.-Biophys. Acta 442, 324-330 (1976).

DK 171683 B1 26 12. Benton, W.D. og Davis, R. Science 196. 180-183 (1977).

13. Denhardt, D.T., Biochem.Biophys.Res.Commun. 22., 641- 5 646 (1966).

14. Yamamoto, K.R. og Alberts, B.M. Virology 40, 734-744 (1970).

10 15. Sanger, F., Coulson, A.R., Barreil, B.G., Smith, A.J.A. og Roe, B.A. (1980): J.Mol.Biol. 143. 161-178, (1980).

16. Sanger, F., Nicklen, S. og Coulson, A.R. Proc.Natn- 15 .Acad.Sci. T±, 5463-5467 (1977).

17. Maxam, A.M. og Gilbert, W. Proc.Nat 1.Acad.Sci.USA 74.

560-564, (1977).

20 18. Staden, R. Nucl.Acids, Res. £, 2601-2610 (1979).

Claims (3)

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af human-Hl-relaxinanalog, som har den i figur 2 viste sekvens, og som 5 har human-Hl-relaxin-aktivitet, hvorhos A-kæden er for kortet med op til 9 aminosyrer i den aminoterminale ende, og/eller B-kæden er forkortet med op til 9 aminosyrer i den aminoterminale ende og med op til 9 aminosyrer i den carboxylterminale ende, eller af en hvilken som helst af A-10 kæderne (A(l-24), A(2-24), A(3-24)) i kombination med en hvilken som helst af B-kæderne B(l-23) til B(l-32), kendetegnet ved, at A- og B-kæderne af relaxinet i deres fulde længde, deres modificerede eller forkortede former forenes ved en i sig selv kendt fremgangsmåde til 15 forening af A- og B-kæderne i insulin.

2. Analogifremgangsmåde til fremstilling af human-relaxinanalog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A- og B-kæderne af relaxin i deres fulde længde, deres 20 modificerede eller forkortede former forenes ved at reducere en blanding af de S-sulfonerede og/eller S-thioalkylerede A- og B-kæder, at blandingen får lov til at oxidere i luft, og at det således fremstillede relaxin eller relaxinanalog indvindes. 25

3. Analogifremgangsmåde til fremstilling af en human-relaxinanalog ifølge krav 1 ud fra humanprorelaxin eller en analog heraf, kendetegnet ved, at sulfhydryl-grupper på A- og B-peptidkædeme omdannes til de sulfidt- 30 værbindinger mellem A- og B-peptiderne, og at C-peptidet derefter fraspaltes.