JP2670001B2 - ヒト−レラキシン遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】この発明は、分子クローニング及
びヒト−レラキシンをコードする遺伝子配列の特徴付け
に関する。この発明はさらに、ヒト−レラキシン、プロ
レラキシン及びプレプロレラキシンを製造するための組
換ＤＮＡ技法に関する。 【０００２】さらに詳しくは、この発明は、分離されそ
して精製された(クローン化された)、プロレラキシン、
プレプロレラキシン、及びヒト−レラキシンのＡ及び／
又はＢ及び／又はＣペプチド鎖をコードするヒト−遺伝
子、該遺伝子の分離及び精製方法、並びに該遺伝子を宿
主細胞に移入しそして該宿主細胞中で複製せしめる方法
に関する。クローン化された遺伝子は、宿主−発現性の
原核性又は真核性遺伝子と融合した場合、宿主細胞によ
り発現される。従って、この遺伝子は、治療用ヒト−レ
ラキシンの製造に有用である。 【０００３】この発明はさらに、ペプチドたるヒト−レ
ラキシン、プロレラキシン及びプレプロレラキシン、こ
れらの配列を構成する個々のペプチド鎖、並びにこれら
のペプチドの変形に関する。 【０００４】この発明はさらに、個々のレラキシン鎖及
び上記のその変形をコードする変形された遺伝子に関す
る。 【０００５】この明細書において(番号)により引用した
文献は後にまとめて記載してある。 【０００６】 【従来の技術】ヒサウ(Ｈisaw)(１)の先駆的な研究によ
り、哺乳動物のペプチドホルモンであるレラキシンの重
要な役割が、その恥骨結合弛緩作用及びこの作用に基く
分娩促進作用により示唆された。レラキシンは、妊娠中
に卵巣の黄体中で合成されここに貯蔵され、そして分娩
に先立って血流中に放出される。卵巣を得ることによ
り、豚(２,３)、ラット(４)、及びサメ(５)のレラキシ
ンの分離及びアミノ酸配列の決定が可能となった。生物
学的に活性なホルモンは、ジスルフィド結合により結合
された２つのペプチド鎖(Ａ鎖及びＢ鎖)から成り、この
ジスルフィド結合は、２つの鎖間結合と１つの鎖内結合
から成る。従って、この構造はジスルフィドの配置にお
いてインスリンに非常に類似しており、このことからこ
れらのホルモンの遺伝子は先祖を共通にすると推定され
る。 【０００７】ラットレラキシン及び豚レラキシンのいず
れについてもcＤＮＡクローンの分離に組換ＤＮＡ技法
が適用された(６)。なお、オーストラリア特許出願第１
１８３４／８３(ＰＦ２６９６／８２)を参照のこと。ア
ミノ酸配列情報を基礎にして調製された合成１１連ヌク
レオチドが、卵巣組織から誘導されたライブラリー中の
レラキシンcＤＮＡクローンを同定するためのcＤＮＡプ
ローブを合成するためのプライマーとして使用された。
該プローブはレラキシンcＤＮＡ配列に関し非常に濃縮
されたものである。レラキシン構造遺伝子は、全体構造
においてプレプロインスリンに類似する単鎖前駆体、す
なわちシグナルペプチド／Ｂ鎖／Ｃペプチド／Ａ鎖をコ
ードすることが見出された。 【０００８】豚及びラットのプレプロレラキシンは、約
３０残基のＣペプチドを有するラットのインスリンと比
較して、それぞれ１０５残基及び１０４残基の予想外に
大きな連結ペプチドを含有する。ラット及び豚のレラキ
シンのＣ−ペプチドにおける配列の高度な相同性によ
り、単にＡ鎖及びＢ鎖の正しいジスルフィド結合の形成
を確保するのみならず他の機能が存在することが示唆さ
れる。発明者等は、進化の過程における配列構造の変化
に対して制約が加えられた結果、ヒトのレラキシン遺伝
子においても同様に、Ｃ−ペプチド領域が高度な配列の
相同性を有すると予想した。後記のごとく、発明者等
は、ヒトのレラキシン遺伝子の選択においてはラットの
レラキシンのＣ−ペプチド領域ではなく豚のレラキシン
のＣ−ペプチド領域を基礎にしたプローブを使用した。
これは、蓄積された蛋白質の配列データにより、一般に
ヒト蛋白質はラットの蛋白質よりも豚のそれに近いこと
が示されている(８)からである。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】幾つかのグループが、
ヒト−レラキシンの構造を決定し、そしてこれを難産の
症例において臨床的に使用する途を確立することを長期
目標としてきたが、妊娠中のヒトの卵巣を入手するのに
限界があるためアミノ酸配列を直接決定することができ
なかった。発明者等の研究方法は、プローブとして豚の
レラキシンcＤＮＡの領域を用いてゲノムライブラリー
から直接的にヒト−レラキシン遺伝子を選択することで
あった。この方法によりゲノムクローンの同定に成功
し、このクローンからプレプロレラキシン全コード領域
の構造が決定された。 【００１０】発明者等が「Ｈ１」と称してこの明細書に記
載する遺伝子及び発明者等の係属中の出願第ＰＦ７２４
７／８２号に記載されている「Ｈ２」遺伝子はいずれもレ
ラキシン様活性を有するペプチドを発現するから、これ
らの一方又は両者はヒトの生殖組織、例えば卵巣及び胎
盤、及び／又は腸、脳及び皮膚を含む他の組織(これら
に限定されない)中で発現されると信じられる。 【００１１】卵巣の黄体、並びに脱落膜組織及び胎盤組
織が、レラキシン関連遺伝子が発現する可能性が最も高
い部位である。しかしながら、多くのペプチドホルモン
が広い範囲に分布していることから考えて、レラキシン
遺伝子が脳及び胃腸管を含む非生殖組織においても発現
する可能性が強い。レラキシンは生長因子としての一般
的性質を有し、そして結合組織の性質を変え、平滑筋の
収縮に影響を与えることができる。発明者等は、この明
細書に記載する遺伝子構造及び係属中の特許出願第ＰＦ
７２４７／８２号に記載されている遺伝子構造の両者又
は一方が体内に広く分布しているものと信ずる。発明者
等は、これらの遺伝子により発現されるレラキシンペプ
チドが、生殖中のよく知られているホルモン機能のほか
に重要な生理的役割を演ずることを示唆する。 【００１２】 【課題を解決するための手段】この明細書においては次
の略号を用いる。 Ｈ１ : この明細書に記載するレラキシン遺伝子で
あって、ゲノムクローンに由来する。 Ｈ２ : 係属中の出願第ＰＦ７２４７／８２号に記
載されているレラキシン遺伝子であって、cＤＮＡに由
来する。 ＤＮＡ : デオキシリボ核酸 ＲＮＡ : リボ核酸 cＤＮＡ : 相補的(コンプレメンタリー)ＤＮＡ(mＲＮ
Ａ配列から酵素的に合成される。) mＲＮＡ : メッセンジャーＲＮＡ Ａ : アデニン Ｔ : チミン Ｇ : グアニン Ｃ : シトシン Ｕ : ウラシル 【００１３】ＤＮＡ中のヌクレオチド配列と蛋白質中の
アミノ酸配列とのコード関係は遺伝コードとして全面的
に知られており、次にこれを示す。 【表１】【００１４】上の表１中に使用するアミノ酸の略号は次
の意味を有する。 【表２】 フェニルアラニン(Ｐhe) ヒスチジン (Ｈis) ロイシン (Ｌeu) グルタミン (Ｇln) イソロイシン (Ｉle) アスパラギン (Ａsn) メチオニン (Ｍet) リジン (Ｌys) バリン (Ｖal) アスパラギン酸(Ａsp) セリン (Ｓer) グルタミン酸 (Ｇlu) プロリン (Ｐro) システイン (Ｃys) スレオニン (Ｔhr) トリプトファン(Ｔry) アラニン (Ａla) アルギニン (Ａrg) チロシン (Ｔyr) グリシン (Ｇly) 【００１５】表中に示した各３文字コードン、例えばＡ
ＵＧ、ＣＡＵ(デオキシヌクレオチドトリプレット又は
ヌクレオチドトリプレットとしても知られている)は、m
ＲＮＡのトリヌクレオチドに対応し、左側に５'末端を
有し、右側に３'末端を有する。文字は、ヌクレオチド
配列を形成するプリン塩基又はピリミジン塩基を示す。
この明細書に記載するすべてのＤＮＡ配列は鎖状を成し
ており、その配列はmＲＮＡ配列に対応し、但し、ウラ
シル(Ｕ)の代りにチミン(Ｔ)を含んでいる。 【００１６】遺伝子材料の採取源はヒト−ゲノムクロー
ンのライブラリーである。豚のレラキシンcＤＮＡプロ
ーブを用いるこのライブラリーのスクリーニングにより
ヒト−レラキシンのコード配列を含有する２つのクロー
ンが得られた。 【００１７】図２〜図３及び図４〜図７に示すmＲＮＡ
配列は後に記載する方法により決定された。３.４kbの
１個のイントロンが連結(Ｃ)ペプチドのコード領域を中
断していることが明らかであろう。ヒト−プレプロレラ
キシンの構造を、豚及びラットのレラキシンの相同構造
と比較することによりゲノム配列から推定した。Ａ及び
Ｂペプチド鎖の構造を、合成、及び子宮収縮試験におい
て生物学的に活性である物質を生成する鎖連結(試験管
内)により確認した。 【００１８】プレプロレラキシンの生体内プロセシング
の態様は十分には解明されていないが、豚レラキシンの
ジクナルペプチドの切断から類推して、Ａla^-1−Ｌys¹
結合において生ずると予想される。同様に、Ｃペプチド
の切り離しはＬeu³²−Ｓｅｒ^３３、及びＡｒｇ^１３６−
Ａrg¹³⁷において生じ、これにより、それぞれ３２残基
及び２４残基のＢ鎖及びＡ鎖が生ずると予想される。 【００１９】豚レラキシンについての発明者等の研究に
よれば、豚レラキシンＢ鎖及びＡ鎖中に、生物学的活性
のために必須のすべての要素を含有するコアー配列が存
在する。ヒト−レラキシン鎖についての発明者等の合成
研究においても同様の結果が得れた。これは、後に詳細
に記載する。 【００２０】この発明の１つの観点に従えばヒト−プレ
プロレラキシン発現遺伝子が提供される。さらに詳しく
は、この発明のこの観点に従えば、図２〜図３に示す完
全mＲＮＡ(コードン−２５〜１６０)配列に対応するコ
ード鎖及び相補鎖を含んで成る、ヒト−プレプロレラキ
シンの発現のための二重鎖ＤＮＡ断片が提供される。 【００２１】この発明はさらに、この明細書に記載する
プレプロレラキシン遺伝子配列の任意のサブユニット、
又は該配列もしくはそのサブユニットの同等物を含む。
これらのサブユニットの中には、非コード領域を含まな
い遺伝子、例えば図４〜図７に示す遺伝子、シグナルペ
プチド、及びヒト−プレプロレラキシンのＡ、Ｂ、及び
Ｃ鎖(図４〜図７)をコードする個々の構造遺伝子を含む
遺伝子、並びにこれらの鎖の任意の組合わせをコードす
る遺伝子、例えばＡ及びＢペプチド鎖を別個に発現する
遺伝子、又は(Ｃ鎖と共に)プロレラキシンとして発現す
る遺伝子が含まれる。 【００２２】この発明の他の観点に従えば、ヒト−プロ
レラキシンを発現する遺伝子が提供される。さらに詳し
くは、この発明の上記の観点に従えば、図２〜図３に示
すmＲＮＡ配列の１〜１６０のコードンに対応するコー
ド鎖及び相補鎖を含んで成るヒト−プロレラキシンを発
現する二重鎖ＤＮＡ断片が提供される。 【００２３】この発明の他の観点に従えば、ヒト−レラ
キシンのＡ、Ｂ及びＣ鎖、又はこれらの鎖の２以上の任
意の組合わせを別個に発現する遺伝子が提供される。さ
らに詳しくは、この発明の上記の観点に従えば、図２〜
図３に示すmＲＮＡ配列の１〜３２、３３〜１３６、及
び１３７〜１６０のコードンに対応するコード配列及び
相補配列を含んで成り、ヒト−レラキシンのＡ鎖及び／
又はＢ鎖及び／又はＣ鎖を個別に発現する二重鎖ＤＮＡ
断片が提供される。 【００２４】上記の遺伝子は、特定されたコードンのほ
かに適当な「開始」コードン及び「停止」コードン、すなわ
ち、それぞれＡＵＧ及びＵＧＡ(図２〜図３における−
２６及び１６１のコードン)を含むであろう。 【００２５】当業者はこれらの遺伝子の多形(polymorph
icforms)が存在することを認めるであろう。このような
多形もこの発明に含まれる。 【００２６】この発明はさらに、前記の配列、サブユニ
ット又は同等物、及び対応するＲＮＡ配列、サブユニッ
ト又は同等物の相補体をも包含する。 【００２７】この発明の他の観点に従えば、前記の遺伝
子に対応するデオキシヌクレオチド配列を含んで成るＤ
ＮＡ移転ベクターが提供される。 【００２８】前記のごとく、遺伝コードは重複性を有す
る。すなわち、あるアミノ酸は複数のコードンによりコ
ードされる。従って、この発明は、図に示したコードン
が同じアミノ酸をコードする他のコードンによって置き
換えられているデオキシヌクレオチド配列を包含する。 【００２９】さらに、すでに記載したごとく、天然レラ
キシンのＢ鎖及び／又はＡ鎖と構造を異にし、レラキシ
ン活性を有するペプチドを製造することができる。この
構造の差異には、天然鎖中の１個又は複数個のアミノ酸
の除去及び／又は付加及び／又は置換が含まれる。 【００３０】従って、この発明はさらに、天然コードン
が除去されておりそして／又は天然コードンによってコ
ードされるアミノ酸と異るアミノ酸をコードするコード
ンにより置き換えられておりそして／又は天然配列に追
加のコードンが付加されている前記の遺伝子及びＤＮＡ
移転ベクターをも包含する。 【００３１】この発明の移転ベクターはさらに、特に、
宿主細胞に移入された場合に自己の複製を保障する遺伝
情報を含有する。この宿主細胞には、例えば原核微生物
の細胞及び真核細胞、例えば細菌、酵母、糸状菌の細
胞、哺乳動物の細胞、及びセルラインが含まれる。 【００３２】細菌遺伝学において一般に使用される移転
ベクターの例にはプラスミド及びある種のバクテリオフ
ァージのＤＮＡが含まれる。この発明においてはファー
ジＤＮＡ及び細菌プラスミドの両者を使用した。しかし
ながら他のタイプの移転ベクターを使用することができ
ることが理解できよう。このような移転ベクターを形成
し、そしてこれを微生物に導入する一般的な方法はよく
知られている。 【００３３】この発明はさらに前記の移転ベクターのい
ずれかにより形質転換された原核細胞及び真核細胞を包
含する。非常に親しまれているエッセリヒア・コリ(Ｅs
cherichia coli)が好ましい微生物の１つであるが、他
の任意の適当な微生物を使用することもできる。 【００３４】この発明の他の観点に従えば、ヒト−プレ
プロレラキシンをコードするデオキシヌクレオチド配列
を、制限酵素によって移転ベクターを切断することによ
り調製されたＤＮＡ分子と連結することを特徴とする、
ヒト−プレプロレラキシンをコードするデオキシヌクレ
オチド配列を維持しそして複製するために使用するＤＮ
Ａ移転ベクターの製造方法が提供される。 【００３５】同様にして、適当なデオキシヌクレオチド
から、ヒト−プロレラキシンをコードするデオキシヌク
レオチド配列、並びにヒト−レラキシンのＡ鎖及びＢ鎖
をコードするデオキシヌクレオチド配列を維持し、そし
て複製するために使用するＤＮＡ移転ベクターを調製す
ることができる。 【００３６】Ａペプチド鎖及びＢペプチド鎖、並びにプ
ロレラキシン及びプレプロレラキシンは、通常の遺伝子
発現方法により、すなわち適切に導入された移転ベクタ
ーを含有する細胞を増殖せしめ、そして該細胞により生
産された目的ペプチドを分離し、そして精製することに
より製造することができる。 【００３７】この発明はさらに、上記の方法により調製
された、ヒト−プレプロレラキシンをコードするデオキ
シヌクレオチドを含んで成る発現移転ベクターにより形
質転換された細胞を培養することを特徴とする、Ｃ末端
配列としてヒト−プレプロレラキシンのアミノ酸配列を
含みそしてＮ末端配列として真核性又は原核性蛋白質の
一部分を含んで成る融合蛋白質の製造方法を包含する。 【００３８】同様にして、ヒト−プロレラキシン、並び
にヒト−レラキシンのＡ鎖及びＢ鎖を含んで成る融合蛋
白質を製造することができる。こうして得られた融合ペ
プチド生成物は、所望のペプチドが宿主に特異的な原核
性又は真核性蛋白質の一部に連結された融合蛋白質の形
で存在するであろう。このような融合蛋白質も又この発
明を構成する。 【００３９】この発明はさらに、前記の方法により調製
された前記のヒト−プロレラキシンをコードするデオキ
シヌクレオチド配列を含んで成る発現移転ベクターによ
り形質転換された細胞を、ヒト−プロレラキシンをコー
ドする前記の配列の発現に適する条件下で培養し、そし
て前記細胞の分解物又は培養液からヒト−プロレラキシ
ンを精製することを特徴とする、Ｃペプチドにより相互
に分離されたＡペプチド及びＢペプチドを含んで成るヒ
ト−プロレラキシンの合成方法をも包含する。 【００４０】任意の適当な公知の切断法により、融合生
成物から目的ペプチドを回収することができる。 【００４１】すでに記載したごとく、コードンの除去／
置換／付加により移転ベクターを変形することができ、
このような変形により変形された融合ペプチドが生ず
る。このようにして適当な変形を行うことにより、融合
ペプチドの切断、例えばＢ／ＣもしくはＣ／Ａ鎖結合部
における切断を促進し、又は次に行う化学的もしくは生
物学的処理の間におけるペプチド鎖の挙動を変えること
ができる。 【００４２】前記のごとく、この発明はさらにヒト−レ
ラキシン、プロレラキシン及びプレプロレラキシンを提
供する。 【００４３】レラキシンは、インスリンの製造のために
現在知られている任意の方法により別々のＡ鎖及びＢ鎖
を直接結合することにより製造することができる。又、
インスリンの場合と同様に、前記のようにして製造され
たレラキシンのＡペプチド及びＢペプチド上のスルヒド
リル基を酸化するか、又は他の方法で転換して該Ａペプ
チド及びＢペプチド間にジスルフィド架橋を形成させ、
そして次にＣペプチドを除去することにより、例えばＣ
ペプチドとＡ及びＢペプチドとの間の結合に特異的な酵
素的加水分解により除去することにより、プロレラキシ
ンからレラキシンを製造することができる。 【００４４】従って、この発明はさらに、レラキシンの
Ａ鎖及びＢ鎖（完全な長さにおいて、又は短縮されたも
しくは変形された形において)を、ヒト−インスリンの
Ａ鎖及びＢ鎖の結合のために知られている方法によって
結合せしめることから成るヒト−レラキシンの合成方法
を提供する。この方法の１つは、Ｓ−スルホン化された
Ａ鎖及びＢ鎖の混合物を還元し、そして次にこの混合物
を空気中で酸化することから成る。 【００４５】発明者等はさらに、Ａ鎖及びＢ鎖の一方又
は両方がＳ−スルホ形ではなくＳ−チオエチル−cys誘
導体の形である場合に上記方法の効率が改良されること
を見出した。 【００４６】発明者等は、オーストラリア特許出願第１
５４１３／８３号(ＰＦ４３８５／８２)において、生物
学的活性の有意な喪失を伴わないでレラキシンのＡ鎖及
びＢ鎖の一方又は両者のアミノ末端及び／又はカルボキ
シ末端を短縮することができ、これにより結合収率を改
良することができることを示した。 【００４７】この発明の他の観点に従えば、短縮されそ
して／又は変形された天然Ｂペプチド鎖及びＡペプチド
鎖により本質上構成されるヒト−レラキシン類似体が提
供される。 【００４８】この発明の上記の観点に従えば、短縮され
そして／又は変形されたＢペプチド鎖及び／又はＡペプ
チド鎖を形成し、そして次に上記の任意の方法によって
前記のペプチド鎖を結合せしめる段階を含んで成るヒト
−レラキシン類似体の製造方法が提供される。 【００４９】発明者等の研究により、レラキシン活性は
Ａ(１０〜２４)から成る短いＡ鎖及びＢ(１０〜２２)か
らなる短いＢ鎖により生ずることが示された。もっと
も、実際的に予想される最小鎖はＡ(４〜２４)及びＢ
(４〜２３)である。 【００５０】一般に、Ａ鎖はＡ(１〜２４)ないしＡ(１
０〜２４)の範囲で変化することができ、Ｂ鎖はＢ(１〜
３２)ないしＢ(１０〜２２)の範囲で変化することがで
きる。 【００５１】好ましい組合わせは、 【化１７】 から誘導される。 【００５２】この発明におけるＢ鎖及び／又はＡ鎖の変
形は、前記の「遺伝的」変形、及びこの発明の結合に先立
つＢ鎖及び／又はＡ鎖の化学的変形(完全な長さにおけ
る又は短縮された形における)が含まれる。２つのタイ
プの変形を単独で又は組合わせて用いることができる。 【００５３】第１のタイプの変形は、天然の又は短縮さ
れたＢ鎖及び／又はＡ鎖における１個又は複数個のアミ
ノ酸の変形に関する。一般にこのような変形にはそれ自
体公知の方法による１個又は複数個のアミノ酸上の活性
基の保護が含まれ、そして所望により、保護基は(変形
された)Ａ鎖及びＢ鎖の結合の後除去される。 【００５４】このようなタイプの変形の例には、Ｎ末端
アミノ基を含む遊離アミノ基のアセチル化、ホルミル化
もしくはこれらと同様の保護、Ｃ末端基のアミド化、又
はヒドロキシル基もしくはカルボキシル基のエステル形
成が含まれる。ホルミル基が容易に除去しうる保護基の
代表例である。 【００５５】第２のタイプの変形には、Ｂ鎖及び／又は
Ａ鎖中の１個又は複数個の天然アミノ酸の他のアミノ酸
(Ｄ−型の天然アミノ酸を含む)による置換が含まれる。
また、このタイプの変形には鎖からの天然アミノ酸の除
去、又は鎖への１個もしくは複数個の余分のアミノ酸の
付加が含まれる。 【００５６】このような変形の目的は、生成物、すなわ
ちレラキシンもしくはその類似体の活性を維持しながら
Ａ鎖及びＢ鎖の結合収率を上昇せしめること、又は所定
の結合収率において生成物の活性を上昇せしめ又は変え
ることにある。このような変化は、レラキシン遮断効果
又はレラキシン拮抗効果を有する合成類似体の製造にも
適用することができよう。 【００５７】第１のタイプの変形の特定の例はホルミル
基の付加によるＢ２のトリプトファン残基の変形であ
る。 【００５８】第２のタイプの変形の特定の例は、Ｂ２４
のメチオニンのノルロイシン(Ｎle)、バリン(Ｖal)、ア
ラニン(Ａla)、グリシン(Ｇly)、セリン(Ｓer)又はホモ
セリン(Ｈomo Ｓer)による置換である。 【００５９】上記の観点において、この発明は、この発
明に従って上記のごとく変形された天然の又は短縮され
たＢ鎖及び／又はＡ鎖から形成されるヒト−レラキシン
を包含する。 【００６０】Ａペプチド鎖及びＢペプチド鎖、並びにさ
らにプロレラキシン及びプレプロレラキシンは通常の遺
伝子発現法により、すなわち適当に形成された移転ベク
ターを含有する微生物を増殖せしめ、そして該微生物に
より生産された目的ペプチドを分離しそして精製するこ
とにより製造することができる。 【００６１】こうして得られたペプチド生成物は、目的
ペプチドが原核性蛋白質の一部と連結されている融合蛋
白質の形で存在することができる。 【００６２】 【実施例】次に、実験方法及びそれにより得られた結果
を記載することによりこの発明をさらに具体的に説明す
る。 【００６３】Ａ．実験方法 (i) 細菌及びファージの株 すでに記載されている(７)ように、豚−レラキシンcＤ
ＮＡ挿入部を含有する組換プラスミド(pＢＲ３２２)の
細菌宿主としてＥ.コリＲＲ１を使用した。ヒト−ゲノ
ムクローンのライブラリーはＴ.マニアチス(Ｍaniatis)
氏から入手した。ヒト−ＤＮＡのＨaeIII／ＡluＩ部分
分解により得られた約１５〜２０kbのゲノムＤＮＡ断片
(９)をリンカーによりλファージＣharon４Ａ(１０)に
クローニングし、そしてＥ.コリＬＥ３９２細胞中で増
加せしめた。ファージＤＮＡ(クローン選択の後)は、１
lの培養液中Ｅ.コリＤＰ５０supＦの溶菌の後に調製し
た。ＤＮＡ小断片(ファージＤＮＡの分解により得られ
たもの)を、配列分析のためにＭ１３バクテリオファー
ジベクターmp７.１、mp８及びmp９[Ｊ.メッシング(Ｍes
sing)教授から入手]にサブクローニングし、そしてＥ.
コリＪＭ１０１細胞に導入して形質転換した。 【００６４】(ii) ハイブリド形成プローブ(豚ＤＮＡ)
の調製 牛胸腺ＤＮＡの変性されたランダムプライマー(３又は
４塩基)を用いて種々のＤＮＡ断片上でプライム合成を
行うことにより放射性標識プローブを調製した(１１)。
豚−ＤＮＡテンプレート(１００〜２００ng)をランダム
プライーと共に２０μlの水中で２分間煮沸することに
より変性した。５０mＭトリス−ＨＣl(pＨ８.０)、５０
mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＴ、１０mＭ ＭgＣl₂、５ユニ
ット(Ｕ)のＥ.コリＤＮＡポリメラーゼ１、それぞれ５
００μＭずつのdＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰ、及び０.３
μＭ α−[³²Ｐ]−dＡＴＰ[約３０００Ｃi／mmol、アマ
ーシャム(Ａmersham)]を含有する反応混合物３０μlを
加えることにより合成を開始した。３７℃にて３０分間
インキュベートした後、０.３Ｍ ＮaＣl、１０mＭトリ
ス−ＨＣl(pＨ８.０)、１mＭ ＥＤＴＡを含有する緩衝
液３００μlにより稀釈することにより反応を停止し、
そして同じ緩衝液中セファデックス−Ｇ５０カラム(１c
m×５cm)を通過せしめる。放射性標識プローブをボイド
ボリウム(void volume)におけるピーク分画から集め、
そして担体としてtＲＮＡ(１０μg)を用いながら２容量
のエタノールにより、−２０℃にて２時間沈澱せしめ
た。 【００６５】(iii) スクリーニング法 ゲノムＤＮＡ断片を含有するλファージをソフトアガー
上、直径１３cmのプレート当り約１０⁵ファージの密度
で増殖せしめ、そしてベントン(Ｂenton)及びデービス
(Ｄavis)の方法(１２)によりニトロセルロース濾紙[シ
ュライカ−アンドシュル(Ｓchleicher＆Ｓchull)ＢＡ８
５]に移した(１２)。濾紙を、５×ＳＳＣ及び２５％ホ
ルムアミドを含有する改変されたデンハート(Ｄenhart)
の溶液中で４０℃にて１８時間、放射性標識プローブと
共にハイブリド形成せしめた(１３)。濾紙を、２×ＳＳ
Ｃ中で３０℃にて１時間洗浄し、その後で２４時間にわ
たりＸ−線フィルム(コダックＸＳ−５)を露光せしめ
た。プレートのハイブリド形成陽性の領域を培養し、そ
して単一の陽性プラグが得られるまで再スクリーニング
を行った。１lの培養液中のＥ.コリＩＤＰ５０supＦ細
胞が溶菌した後にファージを回収し、そしてマニアチス
(１０)、及びヤマモト及びアルバート(Ａlberts)(１４)
の方法に従ってＤＮＡを調製した。 【００６６】(iv) ＤＮＡ配列分析 選択された組換ファージの制限断片を、ファージＭ１３
mp８のＥcoＲＩ、ＰstＩ又はＳmaＩ部位に直接サブクロ
ーニングした。１０mＭトリス−ＨＣl(pＨ８.０)、１０
mＭ ＭgＣl₂、１mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＡＴＰ、１ＵのＴ
４ ＤＮＡ リガーゼ、ＤＮＡ(１００ng)及びＭ１３ファ
ージベクター(５０ng)を含有する反応液２０μl中で連
結を行った。４０℃にて一夜インキュベートした後、組
換ＤＮＡをＥ.コリＪＭ１０１細胞に形質転換した(１
５)。ゲノムスクリーニングについて前記したのと同様
にしてコード領域を含有するプラクを選択した。但し、
Ｍ１３ファージを低い密度(１０³ファージ／９cm直径の
プレート)でプレートした。陽性プラクを増殖せしめ、
単鎖テンプレート形又は複製可能な二重鎖形(rf)を調製
した(１５)。単鎖テンプレートの配列を、Ｍ１３−特異
的プライマー(コラボラティブリザーチ)又はコード領域
の種々の配列に相補的な合成プライマーを用いてサンガ
ー(Ｓanger)等の方法(１６)に従って直接決定した。サ
ブクローンの完全配列分析は、種々の制限酵素を用いて
rf形を複数の部位で切断し、次に平滑末端連結によりＭ
１３にサブクローニングし(１５)、あるいは断片を直接
に末端標識し、そしてマクサム及びジルバートの方法
(１７)により配列決定することにより行った。ＤＮＡ配
列を分析し、そしてコンピュータを用いて豚及びラット
のレラキシン配列と比較した(１８)。 【００６７】Ｂ．結果 次に、図面を用いて検討する。図１はゲノムクローンの
制限酵素地図の概略を示す。大きさをキロ・塩基対(kb)
で示し、そして切断部位をＥcoＲＩ(Ｒ)、ＰstＩ(Ｐ)、
及びＨpaII(Ｈ)として示す。ゲノムクローンλＨ５はＣ
ペプチド(エクソンII)中のＡluＩ部位(図１中のＡ＊)に
付加されたＥcoＲＩリンカーに末端を有する。コード領
域を含む最終的なヌクレオチド配列は、ゲノムクローン
λＨ７から次のようにして編集した。すなわち、ＥcoＲ
Ｉ及びＰstＩ断片をＭ１３mp８にサブクローニングし、
そして次に(１) Ｍ１３テンプレート上で直接配列決定
する[図１中、破線(---)で示されている]、(２) 合成ヌ
クレオチドプライマーを用いて直接配列決定する[点線
(・・・)で示されている]、(３) ＤＮＡ断片を末端標識
し、そして化学的分解により配列決定する[実線(−)で
示されている]、のいずれかを行う。配列決定に使用し
たプライマーは(a)５'ＴＴＣＧＣＡＡＴＡＧＧＣＡ及び
(b)５'ＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＡＧＣＴである。 【００６８】図２〜図３はヒト−レラキシン遺伝子のコ
ード領域を示す。ヒト−プレプロレラキシンのアミノ酸
配列及びmＲＮＡ配列(上段)と豚−レラキシンの配列(下
段)との比較を図４〜図７に示す。同一部分が最大にな
るように配列を配置してあり、ヌクレオチドが同一であ
る部分がスター印により示されており、そしてアミノ酸
が同一である部分が箱で囲んである。アミノ酸にはＢ鎖
の出発部位から番号が付してある。エクソン／イントロ
ン／エクソン境界におけるイントロン配列は小文字でＤ
ＮＡ表記されている。 【００６９】(i) ゲノムクローンの分離及び特色付け 図４〜図７に示すＣペプチド中のアミノ酸４５〜９５に
対応する豚レラキシンcＤＮＡクローンの短い(１５０b
p)断片から作られたプローブ(７)によりライブラリーを
スクリーニングすることによりヒト−ゲノムクローンを
同定した。この断片を、ＨpaII及びＨinfＩによる分解
によってクローンから切り出し、そしてラット及び豚の
レラキシン配列の間で最大の相同性のある領域(ヌクレ
オチドレベルにおいて７１％)と対応した。ゲノムクロ
ーンバンクからλＨ５及びλＨ７と称する強い陽性を示
すファージを分離した。これらの陽性クローンを、それ
ぞれ５'及び３'エクソン領域(エクソンＩ及びエクソンI
Iと称する)に特異的な２つの別々の豚−レラキシンcＤ
ＮＡの断片をプローブとして使用して制限酵素分析によ
りさらに特徴付けを行った。２つの断片は、相同のラッ
ト−レラキシン遺伝子(６)におけるイントロン領域に対
応する(数塩基以内)単一のＨpaII部位において豚レラキ
シンcＤＮＡクローンを切断することにより生じた。λ
Ｈ５及びλＨ７のサザン・ブロット分析により、ヒト−
レラキシン遺伝子のコード領域は３.４kbの単一のイン
トロンにより中断されていることが示された(図１参
照)。 【００７０】(ii) ゲノムクローンの配列分析 λＨ５及びλＨ７の完全制限酵素分解物をＭ１３ベクタ
ーにサブクローンし、そしてエクソンＩ及びエクソンII
に特異的な豚−レラキシンプローブを用いてスクリーニ
ングした。陽性のサブクローンの配列を、方法の部[前
記Ａ(iv)]に記載した技法を組合わせて用いることによ
り決定した。λＨ７クローンのエクソンII領域は、Ｃペ
プチドのＥcoＲＩ部位から始まりＡ鎖の全コード領域を
通って停止コードンに続く２.０kb ＥcoＲＩ断片に含ま
れていた(図１参照)。Ａ鎖付近の領域に特異的なヌクレ
オチドプライマーを合成することによりこの断片の配列
決定は相当に容易になった。このプライマーは、全２.
０kb断片を含有するＭ１３テンプレート上に直接プライ
ムするのに使用した。エクソンII中の残りの５３bpのＣ
ペプチドを含有するサブクローンされたＥcoＲＩ断片は
プローブとして豚cＤＮＡを用いて同定することができ
なかった。この領域を含む配列は、完全なエクソンII領
域を含むλＨ７からのサブクローンされたＰstＩ断片に
より決定した。 【００７１】λＨ５のエクソンII領域の配列決定によ
り、これが、λＨ７と同一のＣペプチド中のＥcoＲＩ部
位から始まるが(図１参照)、ゲノムライブラリーの作成
中にもとのゲノムＤＮＡ中のＡluＩ部位に付加したＥco
ＲＩリンカーにおいて終るきわめて短い７０bpの断片で
あることが判明した。従ってλＨ５はレラキシン遺伝子
の不完全なクローンであることが明らかとなり、以後分
析を行わなかった。エクソンＩの配列分析は、シグナル
ペプチド中にＥcoＲＩ部位が存在するためわずかに複雑
となり、２つのＥcoＲＩ断片のサブクローンの配列を別
々に決定する必要があった。ＥcoＲＩ部位の重複が、重
複配列を含むλＨ７からのＡluＩ断片のサブクローンの
同定により支持された。 【００７２】Ｃ．変性されたヒト−レラキシン(hＲＬ
Ｘ)Ａ(１〜２４)−Ｂ(１〜２５)の合成 (i) ヒト−レラキシンＡ鎖、hＲＬＸ Ａ(１〜２４)の合
成 前記の遺伝子クローンのヌクレオチド配列から推定され
たヒト−レラキシンＡ鎖の１〜２４の残基に対応するア
ミノ酸配列を、メリフィールド(Ｍerrifield)[例えば、
バラニー(Ｂarany) Ｇ.及びメリフィールド Ｒ.Ｂ.，Ｔ
he Ｐeptides,Ｅ.Ｇross及びＪ.Ｍeienhofer，アカデミ
ック・プレス，ニューヨーク,1-284頁,1980年]により記
載された一般的原理による固相法により合成した。 【００７３】Ｎ−α−tert−ブチルオキシカルボニル＊
−４−メチルベンジル−Ｌ−システイン(＊ＢＯＣと略
す)を、タム(Ｔam)等の方法(Synthesis 12, 955-957,19
79年)を用いて、フェニルアセトアミドメチル(ＰＡＭ)
結合を介して１％架橋ポリエチレン樹脂に、０.３０ミ
リモル／g樹脂のレベルでカップリングせしめた。ＢＯ
Ｃ−Ｌ−ＣＹＳ−ＰＡＭ樹脂(８.０g)を、ベックマンモ
デル９９０ペプチドシンセタイザーの反応容器に入れ、
そしてそれぞれ適当な保護アミノ酸を段階的に付加する
ことによって残基２３から１までのアミノ酸配列を組み
立てた。各アミノ酸のアミノ末端ＢＯＣ保護基は、塩化
メチレン中３５％トリフルオロ酢酸により３０分間樹脂
を処理し、そして次に、塩化メチレン中５％ジイソプロ
ピルエチルアミンにより１５分間中和することにより除
去した。それぞれの処理の後、塩化メチレンにより樹脂
を十分に洗浄した。配列中の次のアミノ酸(α−アミノ
基がＢＯＣ基により適当に保護されており、必要により
側鎖官能基が適当に保護されている、)を、ジシクロヘ
キシルカルボジイミド(ＤＣＣ)を使用しながら樹脂にカ
ップリングせしめた。樹脂を塩化メチレン中アミノ酸と
共に１０分間撹拌し、その後で塩化メチレンに溶解した
ＤＣＣを導入した。各カップリングのために２.５モル
の過剰量(６.０ミリモル)のアミノ酸及びＤＣＣを使用
した。１時間撹拌した後、反応混合物から樹脂のサンプ
ルを取り出し、そしてカイゼル(Ｋaiser)等のニンヒド
リン法(Anal.Biochem., 34, 595-598, 1970年)を用いて
遊離アミノ基の存在を試験した。ニンヒドリン反応が陰
性であってカップリングが完結したことが示されれば、
ＢＯＣ脱保護、中和及び次のアミノ酸のカップリングに
よって反応サイクルを継続した。ニンヒドリン試験陽性
の場合には追加のアミノ酸及びＤＣＣを用いてカップリ
ング反応を反復した。 【００７４】側鎖官能基を有するアミノ酸は次の保護誘
導体として使用した。すなわち、Ｎ−α−ＢＯＣ−２,
６−ジクロロベンジル−Ｌ−チロシン、Ｎ−α−ＢＯＣ
−ξ−クロロベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、
Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｌ−セリンＯ−ベンジルエステル、Ｎ
−α−アミルオキシカルボニル−Ｎ^G−トシル−Ｌ−ア
ルギニン、Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｌ−スレオニンＯ−ベンジ
ルエーテル、Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｓ−エチルメルカプト−
Ｌ−システイン(Ａ−鎖配列位置１５、１１及び１０の
システイン)、Ｎ−α−ＢＯＣ−Ｌ−グルタミン酸−γ
−ベンジルエステルである。 【００７５】１〜２４ペプチド配列の組立てに続き、ア
ミノ末端アルギニン上の最後のＢＯＣ基を、脱保護中和
サイクルを用いて除去し、そして真空中でペプチド樹脂
を乾燥した(ペプチド−樹脂の重量１７.０g)。ペプチド
−樹脂−の一部分(２g)を、アニソール(２ml)の存在下
で０℃にて３０分間無水弗化水素(ＨＦ)により処理し
た。オイルポンプ真空下でＨＦを急速に除去することに
より、樹脂−ペプチドと弗化水素(ＨＦ)との合計接触時
間を最小(７０分以下)に保持した。次に、樹脂−ペプチ
ドを酢酸エチルにより数回洗浄することにより過剰のア
ニソールを除去し、１Ｍ酢酸によりペプチドを抽出し、
そして溶液を凍結乾燥した。粗ペプチド(１０、１１及
び１５位のシステインはなおＳ−チオエチル誘導体とし
て保護されている)の収量は４４０mgであった。粗ペプ
チドの最初の精製は０.１Ｍ酢酸中バイオゲルＰ１０を
用いるゲル濾過により行った。分子量約３０００に対応
する位置でカラムから溶出した最大ピークを示す分画を
集め、そして凍結乾燥した。このペプチドのサンプルの
アミノ酸分析により、１〜２４配列のすべてのアミノ酸
が正しい比率で存在することが示された。 【００７６】[Ｓ−チオエチルＣys¹⁰,¹¹,¹⁵]−hＲＬＸ
Ａ(１〜２４)ペプチドの前記以後の精製は、ウオーター
ズＣ−１８ボンダパックカラムを用いる調製用逆相ＨＰ
ＬＣにより、０.１％ＴＦＡ−水／アセトニトリル溶剤
系を用いて行った。 【００７７】ゲル濾過により精製したペプチドのサンプ
ル(１６０mg)を、ドゥ−(Ｄu)等[Scientia Sinica, 10
I, 84-104(1961年)]に記載された方法に従って、亜硫酸
ナトリウム及びナトリウムテトラチオネートの混合物を
用いて(合計反応時間を３時間として)Ｓ−スルホン化し
た。Ｓ−スルホン化中に生成した沈澱を濾過し、そして
沈澱及び上澄液の両者を４℃にて４８時間蒸留水に対し
て透析した。透析袋の内容物を凍結乾燥することによ
り、上澄液から８１.４mg、Ｓ−スルホン化反応中に生
じた沈澱から５３.２mgのペプチドを得た。「可溶性」[Ｓ
−スルホＣys¹⁰,¹¹,¹⁵,²⁴]hＲＬＸ Ａ(１〜２４)ペプチ
ドのサンプルをトリス−ＨＣl緩衝液(pＨ８.３)中ＤＥ
ＡＥ−セルロースを用いるイオン交換クロマトグラフィ
ーにより精製した。トリス−ＨＣl緩衝液中ＮaＣl直線
勾配(導電率範囲３.０mＳ〜８５.０mＳ)によりカラムか
らペプチドを溶出した。導電率２０〜３０mＳにおいて
イオン交換カラムから溶出する大ピークを示す分画を透
析し、そして凍結乾燥によりペプチドを回収した。 【００７８】(ii) 短縮されたヒト−レラキシンＢ−
鎖、hＲＬＸＢ(１〜２５)の合成 ヒト−レラキシンＢ−鎖の１〜２５の配列に対応するア
ミノ酸配列を前記の方法に従って合成した。この合成
は、０.１ミリモルＳer／gの負荷量のＮ−α−tert−ブ
チルオキシカルボニル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン−フ
ェニルアセトアミド−メチルポリスチレン樹脂７.０gを
用いて開始した。Ａ鎖の合成において使用した側鎖保護
基を、Ｂ鎖の合成にも使用した。これには１０及び２２
位の両システインのＳ−エチル誘導体が含まれる。４及
び５位のアスパラギン酸はＮ−α−ＢＯＣξ−ベンジル
エステル誘導体として加えた。１８位のグルタミンはＤ
ＭＦ中のＮ−α−ＢＯＣ−Ｌ−グルタミン−p−ニトロ
フェニルエステルを用いる活性エステル法によりカップ
リングせしめた。２位のトリプトファンのカップリング
の後、トリフルオロ酢酸脱保護剤及びこれに次いで用い
る塩化メチレン洗浄液に０.１％インドールを加えた。 【００７９】アミノ末端リジン残基からＢＯＣ基を除去
しそして真空乾燥した後のペプチド−樹脂の最終重量は
１２.２gであった。ペプチド−樹脂の一部(５g)を、ア
ニソール(２ml)の存在下、０℃にて３０分間無水弗化水
素で処理し、そしてＡ鎖について前記した方法を用いて
Ｂ鎖ペプチドを分離した。粗[Ｓ−チオエチルＣy
s¹⁰,²²]hＲＬＸＢ(１〜２５)(１.４０g)を、０.１Ｍ酢
酸中バイオゲルＰ１０によりゲル濾過することにより精
製し、次に調製用ＨＰＬＣにより処理した。 【００８０】ゲル濾過により精製したペプチドのサンプ
ル(１５０mg)を、pＨ８.３において３時間Ｓ−スルホン
化し、反応混合物を濾過し、そして沈澱及び上澄液を蒸
留水に対して透析した。凍結乾燥後、９２mgの「可溶性」
ペプチド及び５５mgの「不溶性」ペプチドが回収された。
Ｓ−スルホン化Ｂ鎖ペプチドを、Ｃ−１８逆相カラム及
び０.１％ＴＦＡ−水−アセトニトリル溶剤系を用いる
調製用ＨＰＬＣによりさらに精製した。 【００８１】(iii) 鎖の結合 合成hＲＬＸ Ａ(１〜２４)及びhＲＬＸ Ｂ(１〜２５)
ペプチドを、チャンス(Ｃhance)及びホフマン(Ｈoffman
n)によりインスリンについて記載された方法(オースト
ラリア特許出願第６８８４４／８１号)を用いて結合せ
しめた。この方法においては、Ｓ−スルホン化ペプチド
を、Ａ:Ｂ＝２:１の比率で、ペプチドの濃度をグリシン
緩衝液(pＨ１０.５)中１０mg／mlとして混合した。次
に、グリシン緩衝液中ジチオスレイトールを、各Ｓ−ス
ルホ基について合計１.０のスルヒドリル基が生ずる量
において加えた。次に、反応混合物を開放容器中で２４
時間撹拌した。 【００８２】発明者等は、この方法の前記以外の変法と
して、ペプチド鎖の一方又は好ましくは両方を、インス
リンの場合についてチャンス及びホフマンにより記載さ
れたＳ−スルホ形(前記)ではなくＳ−チオエチル−Ｓys
誘導体として使用することにより、生物学的に活性なレ
ラキシンを生成せしめるための鎖結合反応を効果的に行
うことができることを見出した。Ｓ−チオエチルＣysペ
プチドの使用により、ペプチドをＳ−スルホ誘導体に転
換するのに必要な反応及び精製段階が必要でなくなる。
発明者等の経験によれば、レラキシンペプチドのＳ−ス
ルホン化反応にはＳ−スルホペプチドの精製を困難にす
る傾向を有する副反応が伴い、これにより収量が低下す
る。 【００８３】上記の条件を使用すれば、ウイックビスト
(Ｗiqvist)及びパウル(Ｐaul)(ActaEndocrinol., 29, 1
35-136, 1958)のラット子宮収縮測定における生物学的
活性により測定した場合０.２４〜３.１％の鎖結合収率
が達成された。 【００８４】鎖結合反応の例 ヒト−レラキシン[Ｓ−チオエチルＣys¹⁰,¹¹,¹⁵]Ａ(１
〜２４)(乾燥重量３.６０mg、アミノ酸分析によるペプ
チド量２.０mg、０.６８μモル)を、３mlのプラスチッ
ク製蓋付き遠心チューブ中で２００μlの０.１Ｍグリシ
ン緩衝液(pＨ１０.５)に溶解した。ヒト−レラキシン
[Ｓ−スルホＣys¹⁰,¹¹]Ｂ(１〜２５)(１.８９mg、アミ
ノ酸分析によるペプチド量１.０mg、０.３３μモル)を
１００μlの０.１Ｍグリシン緩衝液(pＨ１０.５)中に溶
解し、そしてこれを前記の溶液に加え、そして混合物を
撹拌した。０.１Ｍグリシン緩衝液(pＨ１０.５)中に調
製したジチオスレイトール(ＤＴＴ)のストック溶液(１
０ml中１.１５μモルＤＴＴ)のアリコート(１５.２μ
l、１.７３μモルＤＴＴ)をペプチド溶液に加え、そし
て短時間撹拌した後、反応混合物を空気に開放して４℃
にて２４時間静置した。次に混合物を遠心分離し、そし
て上澄液のアリコートのレラキシン生物学的活性をラッ
ト子宮収縮測定により測定した。反応混合物のアリコー
トは、投与量に依存してラットの子宮の自発収縮を阻害
した。７５μlのアリコートにより子宮収縮が完全に阻
害され、これは、天然豚−レラキシンＡ２２Ｂ３１標準
と比較した場合０.７０％の鎖結合収率に相当する。 【００８５】ＨＩ−遺伝子配列に基づく他の合成ヒトレ
ラキシンペプチド 次表中に掲げた合成レラキシンペプチドを、図２〜図３
に示したＨＩヒトレラキシン遺伝子配列から誘導される
Ａ鎖およびＢ鎖に対するアミノ酸配列から調製した。別
々のペプチド鎖を調製し次いでＡ(１−２４)およびＢ
(１−２５)ペプチドに対し先に説明した手順に従って精
製した。Ｂ(３−２５)アミドおよびＢ(１−２５)アミド
ペプチドに対し、これらの手順の変法を用いたが、この
際ＰＡＭ樹脂結合をベンズヒドリルアミン(ＢＨＡ)ポリ
スチレン樹脂に置き代えた。ＢＨＡ樹脂を用いると、遊
離カルボキシ形よりもむしろアミド形のＣ−末端を有す
るペプチドが形成する。特に言及しない限り、鎖結合反
応はＳ−チオエチルＣys誘導体としてのＡ−鎖及びＳ−
スルホＣys誘導体としてのＢ−鎖を用いて先に説明した
如く行った。 【００８６】次表中の全ての合成同族体は、ラットの子
宮収縮測定においてレラキシン−様生物学的作用を示し
た。別々のペプチド鎖の結合収率は、基準として天然の
豚レラキシンＡ(１−２２)−Ｂ(１−３１)を用いるバイ
オアッセイの結果から計算した。 【表３】 結合収率 合成ＨＩヒトレラキシン同族体 (Ｂ−鎖量基準) Ａ(１−２４)＋Ｂ(１−２３) ０.２４％ Ａ(１−２４)＋Ｂ(１−２５) ０.７０％ Ａ(１−２４)＋[Ａla²⁴]Ｂ(１−２６) ０.９２％ Ａ(１−２４)＋Ｂ(１−３２) ２.００％ Ａ(１−２４)＋Ｂ(１−２５)アミド ０.８０％ 鎖結合反応のために両鎖がＳ−チオエチル形 を有するＡ(１−２４)＋Ｂ(１−２５)アミド ３.１０％ Ａ(１−２４)＋Ｂ(３−２５)アミド ０.６８％ Ａ(１−２４)＋[Ｎ−ホルミルＴＲＰ²]Ｂ(２−２５) ０.４３％ 【００８７】文 献 １．Hisaw,F.L., Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 23, 661-663
(1926)。 ２．Schwabe,C., McDonald,J.K.及びSteinetz,B.C., Bi
ochem.Biophys.Res.Commun. 75, 503-510 (1977)。 ３．James,R., Niall,H., Kwok,S.及びBryant-Greenwoo
d,G., Nature, 267, 544-546 (1977)。 ４．John,M.J., Walsh,J.R., Borjesson,B.W.及びNial
l,H.D., Endocrinology108, 726-729 (1981)。 ５．Schwabe,C., Gowan,L.K.及びReinig,J.W., Ann.N.
Y.Acad.Sci. 380, 6-12(1982)。 ６．Hudson,P., Haley,J., Cronk,M., Shine,J.及びNia
ll,H., Nature 291, 127-131 (1981)。 ７．Haley,J., Hudson,P., Scanlon,D., John,M., Cron
k,M., Shine,J., Tregear,G. 及びNiall,H., DNA 1, 15
5-162 (1982)。 ８．Dayhoff,M.O., Schwartz,R.M., Chen,H.R., Hunt,
L.T., Barker,W.C.及びOrcutt,B.C., DNA 1, 51-58 (19
81)。 9.Lawn,R.M., Fritsch,E.F., Parker,R.C., Blake,G.及
びManiatis,T., Cell 15, 1157-1174 (1978)。 10．Maniatis,T., Hardison,R.E., Lacy,E., Lauer,J.,
O'Connell,C.,及びQuon,D., Cell 15, 687-701 (197
8)。 11．Taylor,J.M., Illmersee,R.,及びSummers,J., Bioc
him.Biophys.Acta 442, 324-330 (1976)。 12．Benton,W.D.及びDavis,R., Science 196, 180-183
(1977)。 13．Denhardt,D.T., Biochem.Biophys.Res.Commun. 23,
641-646(1966)。 14．Yamamoto,K.R.及びAlberts,B.M., Virology 40, 73
4-744 (1970)。 15．Sanger,F., Coulson,A.R., Barrell,B.G., Smith,
A.J.A.及びRoe,B.A., J.Mol.Biol. 143, 161-178 (198
0)。 16．Sanger,F., Nicklen,S.及びCoulson,A.R., Proc.Na
tn.Acad.Sci. 74, 5463-5467 (1977)。 17．Maxam,A.M.及びGilbert,W., Proc.Natn.Acad.Sci.
74, 560-564 (1977)。 18．Staden,R., Nucl.Acids,Res. 6, 2601-2610 (197
9)。

【図面の簡単な説明】 【図１】 ２つのゲノムクローンの制限酵素地図を示す
模式図である。 【図２】 ヒト−レラキシン遺伝子のコード領域のmＲ
ＮＡ配列及びヒト−プレプロレラキシンのアミノ酸配列
を示す配列図である(その１)。 【図３】 ヒト−レラキシン遺伝子のコード領域のmＲ
ＮＡ配列及びヒト−プレプロレラキシンのアミノ酸配列
を示す配列図である(その２)。 【図４】 ヒト−プレプロレラキシン及びmＲＮＡと豚
−プレプロレラキシンの対応する配列との比較を示す配
列図である(その１)。 【図５】 ヒト−プレプロレラキシン及びmＲＮＡと豚
−プレプロレラキシンの対応する配列との比較を示す配
列図である(その２)。 【図６】 ヒト−プレプロレラキシン及びmＲＮＡと豚
−プレプロレラキシンの対応する配列との比較を示す配
列図である(その３)。 【図７】 ヒト−プレプロレラキシン及びmＲＮＡと豚
−プレプロレラキシンの対応する配列との比較を示す配
列図である(その４)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジョン シーン オーストラリア国，オーストラリアン キャピタル テリトリー，スウィンガー ヒル，バーネット クローズ107 (72)発明者 ヒュー デイビット ナイアル オーストラリア国，ビクトリア，エルウ ッド，ベンディゴ アベニュ３ (72)発明者 ジェフリー ウイリアム トリーガー オーストラリア国，ビクトリア，オース オールン，オースオールン グローブ62 (56)参考文献 特開 昭56−127315（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １． (a)以下の配列を有するヒトＨ１-レラキシンのＡ
   鎖： 【化１】 および (b)以下の配列を有するヒトＨ１-レラキシンのＢ鎖： 【化２】において、Ａ鎖がアミノ末端の９個以下のアミノ酸の除
   去により短縮されており、そして／またはＢ鎖がアミノ
   末端の９個以下のアミノ酸および／またはカルボキシ末
   端の９個以下のアミノ酸の除去により短縮されているヒ
   トＨ１−レラキシンのＡ鎖およびＢ鎖を含有する、レラ
   キシン活性を有する実質的に純粋なポリペプチド（Ａ鎖
   およびＢ鎖の両方が短縮されていないものを除く）。 ２．Ａ鎖がアミノ末端の４個以下のアミノ酸の除去によ
   り短縮されており、そして／またはＢ鎖がカルボキシ末
   端の９個以下のアミノ酸の除去により短縮されている請
   求項１に記載のポリペプチド。 ３．遊離のアミノ、カルボキシまたはヒドロキシ基に保
   護基を付加することによりレラキシンのＡ鎖および／ま
   たはＢ鎖が修飾されている請求項１または２に記載のポ
   リペプチド。 ４．被修飾体がレラキシン活性を有するという条件のも
   と、天然アミノ酸の１個以上を別のアミノ酸で置換する
   ことによりヒトＨ１-レラキシンのＡ鎖および／または
   Ｂ鎖が修飾されている請求項１に記載のポリペプチド。 ５．Ｂ(２４)のＭet残基を、バリン、アラニン、グリシ
   ンおよびセリンからなる群から選ばれる残基で置換する
   ことによりＢ鎖が修飾されている請求項１または２に記
   載のポリペプチド。 ６．（１）以下の配列を有するヒトＨ１−レラキシンの
   Ａ鎖： 【化３】 および、以下の配列を有するヒトＨ１−レラキシンのＢ
   鎖： 【化４】 において、Ａ鎖は短縮されず、Ｂ鎖はアミノ酸番号１〜
   ２３のアミノ酸配列に短縮されているヒトＨ１−レラキ
   シンのＡ鎖およびＢ鎖よりなるポリペプチド、 （２）Ａ鎖は短縮されず、Ｂ鎖はアミノ酸番号１〜２５
   のアミノ酸配列に短縮されているヒトＨ１−レラキシン
   のＡ鎖およびＢ鎖よりなるポリペプチド、 （３）Ａ鎖は短縮されず、Ｂ鎖はアミノ酸番号１〜２６
   のアミノ酸配列に短縮され、かつアミノ酸番号２４のメ
   チオニンがアラニンに置換されているヒトＨ１−レラキ
   シンのＡ鎖およびＢ鎖よりなるポリペプチド、 （４）Ａ鎖は短縮されず、Ｂ鎖はアミノ酸番号１〜２５
   のアミノ酸配列に短縮され、かつＣ末端のカルボキシル
   基はアミド化されているヒトＨ１−レラキシンのＡ鎖お
   よびＢ鎖よりなるポリペプチド、 （５）Ａ鎖は短縮されず、Ｂ鎖はアミノ酸番号３〜２５
   のアミノ酸配列に短縮され、かつＣ末端のカルボキシル
   基はアミド化されているヒトＨ１−レラキシンのＡ鎖お
   よびＢ鎖よりなるポリペプチド、 および、 （６）Ａ鎖は短縮されず、Ｂ鎖はアミノ酸番号２〜２５
   のアミノ酸配列に短縮され、かつアミノ酸番号２のトリ
   プトファンはＮ−ホルミル化されているヒトＨ１−レラ
   キシンのＡ鎖およびＢ鎖よりなるポリペプチド、 よりなる群から選択される請求項３〜５のいずれかに記
   載のポリペプチド。 ７． (a)以下の配列を有するヒトＨ１-レラキシンのＡ
   鎖： 【化５】 および (b)以下の配列を有するヒトＨ１-レラキシンのＢ鎖： 【化６】 において、Ａ鎖がアミノ末端の９個以下のアミノ酸の除
   去により短縮されており、そして／またはＢ鎖がアミノ
   末端の９個以下のアミノ酸および／またはカルボキシ末
   端の９個以下のアミノ酸の除去により短縮されているヒ
   トＨ１-レラキシンのＡ鎖およびＢ鎖を含有する、レラ
   キシン活性を有するポリペプチド（Ａ鎖およびＢ鎖の両
   方が短縮されていないものを除く）の製造方法であっ
   て、 Ｓ-スルホン化および／またはＳ-チオアルキル化したＡ
   鎖とＢ鎖の混合物を還元し、該混合物を空気中で酸化
   し、そして得られたポリペプチド産物を回収することか
   らなる方法。