DK171827B1 - Dobbeltstrenget DNA-fragment, der koder for human-H1-præprorelaxin, human-H1-prorelaxin eller A- og B-kæderne i human-H1-relaxin, samt DNA-transfervektor, der indeholder en cDNA-deoxynukleotidsekvens, som svarer til et sådant DNA-fragment, celle transformeret med en sådan DNA-transfervektor, og fremgangsmåde til fremstilling af human-H1-prorelaxin eller -H1-relaxin ved dyrkning af en sådan celle - Google Patents

Description

DK 171827 B1

Opfindelsen angår et dobbeltstrenget DNA-fragment, der koder for human-Hl-præprorelaxin, human-Hl-prorelaxin eller A- og B-kæderne i human-Hl-relaxin, samt DNA-transfervektor, der indeholder en cDNA-deoxynukleotidsekvens, som 5 svarer til et sådant DNA-fragment, celle transformeret med en sådan DNA-transfervektor, og fremgangsmåde til fremstilling af human-Hl-prorelaxin eller -Hl-relaxin ved dyrkning af en sådan celle.

10 Litteraturreferencer, som der med et tal henvises til i den efterfølgende beskrivelse, er samlet omtalt i slutningen af beskrivelsen.

Pionerarbejde af Hisaw (1) tydede på en vigtig rolle for 15 peptidhormonet relaxin i pattedyr på grund af dets evne til at udvide symphysis pubis (skambensfugen eller -sammenføjningen) og derved lette fødselsprocessen. Relaxin syntetiseres og opbevares i corpus luteum i ovarierne (æggestokkene) under graviditet (drægtighed) og frigøres i 20 blodstrømmen forud for fødslen. Rådighed over ovarier har muliggjort isolering og aminosyresekvensbestemmelse af relaxin fra grise (2,3), rotter (4) og hajer (5). Det biologisk aktive hormon består af to peptidkæder (kendt som A- og B-kæderne), der er sammenholdt ved disulfidbindinger, 25 nemlig 2 inter-kæde bindinger og 1 intra-kæde binding.

Strukturen ligner således meget insulin med hensyn til placeringen af disulfidbindingerne, hvilket har ført til spekulation om et fælles stamgen for disse hormoner (2,3).

30 Rekombinant-DNA-metoder er blevet anvendt til isolering af cDNA-kloner for både rotte- og svinerelaxin (6), jvf. også DK patentansøgning nr. 615/83. Syntetiske, undecamere nukleotider fremstillet på basis af aminosyresekvensinfor-mation blev anvendt som primere til syntese af cDNA-prober 35 (-prøvemidler), som var stærkt beriget med relaxin-sekven- ser, og som identificerede relaxin-cDNA-kloner i gen-"biblioteker" hidrørende fra ovarievæv. Relaxinstrukturge-net fandtes at kode for en enkeltkæde-precursor, som ligner 2 DK 171827 B1 præproinsulin med hensyn til den overordnede konfiguration, dvs. signalpeptid/B-kæde/C-peptin/A-kæde.

Svine- og rottepræprorelaxin indeholder et uventet stort 5 forbindelsespeptid med 105 henholdsvis 104 enheder (eng: residues) i sammenligning med rotteinsulin, der har et C-peptid med ca. 30 aminosyreenheder. En høj grad af sekvens-homologi i C-peptidet i rotte- og svinerelaxin tyder på en rolle ud over simpel sikring af den korrekte dannelse af 10 disulfidbinding af A- og B-kæderne. Opfinderne forudså, at strukturelle begrænsninger af sekvensafvigelse, der har været gældende under evolutionen, ville have resulteret i et C-peptidområde med tilsvarende høj grad af sekvenshomo-logi i det humane relaxingen. Opfinderne har følgelig, som 15 beskrevet i det følgende, benyttet prober baseret på C- peptidområdet i svinerelaxin i stedet for rotterelaxin ved udvælgelse af det humane relaxingen, fordi de samlede proteinsekvensdata indicerede, at humane proteiner generelt afviger mindre fra svineproteiner end fra rotteproteiner 20 (8) .

Skønt det for adskillige forskningsgrupper har været et langtidsmål at bestemme strukturen af humanrelaxin og at etablere en mulighed for klinisk intervention i vanskelige 25 fødselstilfælde har den begrænsede rådighed over humane

ovarier hidrørende fra graviditetsperioden forhindret en direkte aminosyresekvensbestemmelse. Opfindernes fremgangsmåde var at søge (eng: screen) direkte efter det humane relaxingen i et genbibliotek (samling af arveanlæg eller 30 gener) under anvendelse af et område af porcinrelaxin-cDNA

som probe (prøvemiddel). Denne fremgangsmåde resulterede i den heldige identifikation af en genomisk klon, ud fra hvilken strukturen af hele kodeområdet for præprorelaxin er blevet bestemt.

Det antages nu, at enten det hermed beskrevne gen, som er blevet betegnet "Hl", eller "H2"-genet, der er beskrevet i den samtidige DK patentansøgning nr. 5737/83, eller begge 35 3 DK 171827 B1 forekommer i humant reproduktivt væv, f.eks. ovarie- og placentavæv og/eller andre væv, der omfatter men ikke er begrænset til fordøjelseskanalen, hjernen og huden, eftersom begge gener koder for peptider med relaxinlignende 5 aktivitet.

Corpus luteum i ovarier såvel som decidual- (moderhinde-) og placentavæv er de mest sandsynlige steder for eks-pressionering (manifestation) af relaxinbeslægtede gener.

10 I betragtning af den udbredte distribuering af mange peptidhormoner er det imidlertid højst sandsynligt, at relaxinget også er manifesteret i ikke-reproduktive væv, herunder hjernen og mavetarmkanalen. Relaxin har generelt egenskaber som vækstfaktor og er i stand til at ændre 15 bindevævs natur og påvirke glatte musklers kontraktion. Det formodes, at enten den ene eller den anden eller begge de genstrukturer, der er beskrevet i nærværende beskrivelse og i den samtidige DK patentansøgning 5737/83, i vid udstrækning er fordelt i legemet. Det antages, at de relaxin-20 peptider, der ekspressioneres af sådanne gener, spiller en vigtig fysiologisk rolle ud over deres veldokumenterede hormonale funktion under reproduktionen.

Med den foreliggende opfindelse er der blevet tilvejebragt 25 hidtil ukendte dobbeltstrengede DNA-fragmenter, der giver mulighed for fremstilling af hidtil ukendt, naturligt human-præprorelaxin, human-prorelaxin og human-relaxin.

Naturligt human-relaxin har vist sig at være yderst 30 fordelagtigt som fødselsforberedende hjælpemiddel, idet det fremmer blødgøring og udvidelse af livmoderhalsen hos fødende kvinder og nedsætter dermed fødselsubehaget og -smerterne hos disse, mindsker risikoen for behov for kejsersnit og nedsætter barnets/fosterets stressbelastning 35 under fødslen. På grund af sin artsnaturlige beskaffenhed må human-relaxin endvidere antages at være mere hensigtsmæssigt, mere effektivt og give anledning til færre bivirkninger, herunder allergier og overfølsomhedssyndro- 4 DK 171827 B1 mer, end hvad der vil være tilfældet ved anvendelse af ikke-artsspecifikt relaxin, såsom eksempelvis svine- eller rotterelaxin.

5 Den foreliggende opfindelse angår således et dobbeltstren get DNA-fragment, der koder for human-Hl-præprorelaxin, og som omfatter en kodende streng og en komplementær streng, der svarer til den mRNA-sekvens, som er vist i tegningens figur 2.

10

Opfindelsen angår også et dobbeltstrenget DNA-f ragment, der koder for human-Hl-prorelaxin, og som omfatter en kodende streng og en komplementær streng, der svarer til de som 1-160 nummererede codoner i den i tegningens figur 2 viste 15 mRNA-sekvens.

Opfindelsen angår endvidere et DNA-fragment, der koder for A- og B-kæderne i human-Hl-relaxin, og som omfatter en kodende streng og en komplementær streng, der svarer til de 20 som 1-32 henholdsvis 136-160 nummererede codoner i den i tegningens figur 2 viste mRNA-sekvens.

Følgende forkortelser anvendes i beskrivelsen: 25 Hl: det heri beskrevne relaxingen, som er afledt fra en genomisk klon,

H2: relaxingenet, der er beskrevet i den samtidige DK

patentansøgning nr. 5737/83, og som er afledt fra en cDNA-30 klon, DNA : deoxyribonukleinsyre A : adenin RNA : ribonukleinsyre T : thymin cDNA : komplementært DNA G : guanin 35 (syntetiseret enzymatisk ud C : cytosin fra en mRNA-sekvens) U : uracil mRNA : meddeler-RNA (messenger-RNA) 5 DK 171827 B1 5

Koderelationerne mellem nukleotidsekvensen i DNA og aminosyresekvensen i protein er alment kendt som den genetiske kode og er anført nedenfor.

Første Tredie base base (5' ende) _Anden base_ (3'endenl 11 £ A £

Phe Ser Tyr Cys U

U Phe Ser Tyr Cys C

Leu Ser Stop Stop A

Leu Ser Stop Trp G

Leu Pro His Arg U

ς Leu Pro His Arg C

Leu Pro Gin Arg A

Leu Pro Gin Arg G

Ile Thr Asn Ser U

^ Ile Thr Asn Ser C

Ile Thr Lys Arg A

Met Thr Lys Arg G

Val Ala Asp Gly U

g Val Ala Asp Gly C

Val Ala GIu Gly A

Val Ala GIu Gly G

6 DK 171827 B1

De forkortelser, der anvendes for aminosyrerne i tabellen, Identificeres som følger: 5 Phenylalanin (Phe) Histidin (His)

Leucin (Leu) Glutamin (Gin)

Isoleucin (Ile) Asparagin (Asn)

Methionin (Met) Lysin (Lys)

Valin (Val) Asparaginsyre (Asp) 10 Serin (Ser) Glutaminsyre (Glu)

Prolin (Pro) Cystein (Cys)

Threonin (Thr) Tryptophan (Trp)

Alanin (Ala) Arginin (Arg)

Tyrosin (Tyr) Glycin (Gly) 15

Hver 3-bogstavkode (kaldet en codon) i tabellen, f.eks.

AUG, CAU (også kendt som en deoxynukleotidtriplet eller nukleotidtriplet) svarer til et trinukleotid i mRNA med en 5'-ende til venstre og en 3'-ende til højre. Bogstaverne 20 står for de purin- eller pyrimidinbaser, der udgør nukleo- tidsekvensen. Alle de DNA-sekvenser, der refereres til heri, er sekvenser på den streng, hvis sekvens svarer til mRNA-sekvensen med thymin (T) i stedet for uracil (U).

25 I den efterfølgende beskrivelse vil der blive henvist til den tilhørende tegning, hvor: fig.l er et forkortet restriktionsenzymkort over de to genomiske kloner, der er nævnt nedenfor, 30 fig.2 viser mRNA-sekvensen for kodeområdet i humanrelaxin-genet og aminosyresekvensen i humanpræprorelaxin, og fig.3 viser en sammenligning af humanpræprorelaxin- og 35 mRNA- sekvenser med tilsvarende sekvenser i porcinpræprore- laxin.

Den originale kilde til genetisk materiale var et bibliotek DK 171827 B1 7 af humane genomiske kloner. Screen-søgning i dette "bibliotek" under anvendelse af svinerelaxin-cDNA-prober gav to kloner indeholdende kodningssekvenser for human-præprore-laxin.

5

Den i figurerne 2 og 3 viste mRNA-sekvens blev bestemt ved de i det følgende beskrevne metoder. Det vil ses, at et enkelt intron på 3,4 kb afbryder kodeområdet i forbindel-sespeptidet (C). Strukturen for humanpræprorelaxin blev 10 udledt ud fra den genomiske sekvens ved sammenligning med homologe strukturer i svine- og rotterelaxin. Bekræftelse af A- og B-peptidkædestrukturerne er blevet tilvejebragt ved syntese og kæderekombination in vitro, hvilket frembringer et materiale, der er biologisk aktivt ved uteru-15 skontraktionsforsøg.

In vitro fremstillingsmåden for præprorelaxinet er endnu ikke fuldt ud kendt, men ved analogislutning ud fra svinerelaxin ville man forvente spaltning af signalpeptidet 20 ved Ala”^'-Lys1-bindingen. Tilsvarende forudsiges udskæring 32 33 13 6 af C-peptidet at forekomme ved Leu -Ser og Arg 137

Arg , hvorved der fremkommer B- og A-kæder på 32 henholdsvis 24 enheder.

25 Som det er anført i opfindernes redegørelse over studier af svinerelaxin findes der kernesekvenser i svinerelaxinets B-og A-kæder, som indeholder alle væsentlige elementer for biologisk aktivitet. Opfindernes synteseundersøgelser af humanrelaxinkæden viser tilsvarende resultater, som omtalt 30 mere detaljeret i det følgende.

Mere specielt tilvejebringer dette aspekt ved opfindelsen et dobbeltstrenget DNA-fragment, der koder for humanpræprorelaxin, hvilket dobbeltstrenget DNA omfatter en kodende 35 streng og en komplementær streng, der svarer til den fuldstændige mRNA-sekvens (codon'erne -25 til 160) vist i figur 2 på den tilhørende tegning.

DK 171827 B1 8

Opfindelsen omfatter ligeledes enhver underenhed af den heri beskrevne præprorelaxingensekvens samt et hvilket som helst ækvivalent til denne sekvens eller underenhed heraf. Blandt de underenheder, der er indbefattet i dette udsagn, 5 er gener, som ekskluderer ikke- kodende områder, såsom dem, der er vist i figur 3, gener, som indeholder de individuelle strukturgener, der koder for signalpeptidkæden og A, B-og C-kæderne i humanpræprorelaxin (se figur 3), og enhver kombination af disse kæder, f.eks. de gener, der koder for 10 A- og B-peptidkæderne, separat eller som prorelaxin (med C- kæden).

Ifølge et andet aspekt ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes der således et gen, der koder for human-15 prorelaxin.

Mere specielt tilvejebringer dette aspekt ved opfindelsen et dobbeltstrenget DNA-fragment, der koder for humanprore-laxin, hvilket dobbeltstrenget DNA omfatter en kodende 20 streng og en komplementær streng, der svarer til de codon, der er nummereret som 1 til 160 af mSNA-sekvensen vist i figur 2 på den tilhørende tegning.

Ifølge et andet aspekt ved den foreliggende opfindelse 25 tilvejebringes der gener, der særskilt koder for A-, B- og C-kæderne i humanrelaxin eller enhver kombination af to eller flere af disse kæder.

Nærmere bestemt tilvejebringer dette aspekt ved opfindelsen 30 dobbeltstrengede DNA-fragmenter, som særskilt koder for A- og/eller B- og/eller C-kæderne i humanrelaxin, hvilke dobbeltstrengede DNA-fragmenter omfatter en kodende streng og en komplementær streng svarende til codon'erne med numrene 1-32, 33-136 og 137-160 af mRNA-sekvensen, der er 35 vist i fig.2 på den tilhørende tegning.

De ovenfor beskrevne gener kan ud over de specificerede codon'erne også inkludere passende "start"- og "stop"- DK 171827 B1 9 codon'erne, dvs. AUG henholdsvis UGA (codon -26 og 161 i figur 2).

: En fagmand vil forstå, at polymorfe former af generne kan 5 forekomme. Sådanne former er inkluderet i den foreliggende opfindelse.

Opfindelsen omfatter ligeledes komplementerne til de ovenfor nævnte sekvenser, underenheder eller ækvivalenter 10 samt de tilsvarende RNA-sekvenser, underenheder eller ækvivalenter.

Ifølge et andet aspekt ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en DNA-transfervektor omfattende 15 deoxynucleotidsekvenserne, der svarer til de ovenfor definerede gener.

Som vist ovenfor indeholder den genetiske kode redundancer, det vil sige, at visse aminosyrer kodes med mere end en 20 codon. Opfindelsen omfatter således de deoxynucleotids ekvenser i hvilke de de codon'er, der er afbildet på tegningen, eller deres cDNA-ækvivalenter er erstattet med andre codon'er, som koder for samme aminosyre.

25 Opfindelsen omfatter således gener og DNA-transfervektorer, som beskrevet ovenfor, hvori en eller flere af de naturlige codon'er er udeladt og/eller er erstattet med codon'er, som koder for andre aminosyrer end den, der kodes for med den naturlige codon, og/eller der er tilføjet yderligere 30 codon'er til den naturlige sekvens.

Transfervektorerne ifølge opfindelsen kan også omfatte bl.a. genetisk information, som sikrer deres replikation, når de er overført til en værtscelle. Disse celler kan 35 f.eks. omfatte celler af procaryotiske mikroorganismer, såsom bakterier, og også eukaryotiske celler, såsom gær og svampe foruden også celler såsom pattedyrceller og -cellelinier.

DK 171827 B1 10

Eksempler på transfervektorer, der er almindeligt benyttet ved bakteriel genetisk arbejde er plasmider og DNA fra visse bakteriofager. Både fag-DNA og bakterielle plasmider er blevet anvendt som transfervektorer ved det foreliggende 5 arbejde. Det må imidlertid forstås, at andre transfervek- tortyper kan anvendes. De generelle metoder til frembringelse af sådanne transfervektorer og overføringen af dem til mikroorganismer er velkendt indenfor det faglige felt.

10

Opfindelsen omfatter også en prokaryotisk eller eukaryotisk celle, der er transformeret med en hvilken som helst af de ovenfor beskrevne transfervektorer.

15 En foretrukken mikroorganisme er det særdeles velkendte

Escherichia coli. men en hvilken som helst anden egnet mikroorganisme kan benyttes.

Ifølge yderligere et aspekt ved den foreliggende opfindelse 20 tilvejebringes der en fremgangsmåde til fremstilling af en DNA-transfervektor til brug ved bevaring og replikering af en deoxynukleotidsekvens, der koder for human præprore-laxin, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en deoxynukleotidsekvens, der koder for human præprorelaxin, 25 forbindes med et DNA-molekyle, der er fremstillet ved spaltning af en transfervektor med et restriktionsenzym.

DNA-transfervektorer til brug ved bevaring og replicering af deoxynukleotidsekvenser som koder for human præprore-30 laxin og for A- og B-kæderne i humanrelaxin, kan til svarende fremstilles ud fra de behørige deoxynukleotider.

A- og B-peptidkæderne og også prorelaxin og præprorelaxin kan fremstilles ved de sædvanlige fremgangsmåder til 35 genekspression, dvs. dyrkning af celler, der indeholder den behørigt transformerede transfervektor, og isolering og oprensning af det (de) ønskede peptid(er), der er produceret af cellerne.

DK 171827 B1 11

Opfindelsen omfatter således endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af human-Hl-prorelaxin eller human-Hl-relaxin, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at 5 - at et DNA-fragment ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7 bringes til ekspression i en værtscelle til frembringelse af det hermed kodede proteinprodukt, og - at human-Hl-prorelaxinet eller human-Hl-relaxinet 10 herefter indvindes, hvorefter human-Hl-prorelaxinet eventuelt spaltes ved B/C- og C/A-kæderne til dannelse af Hl-relaxin.

Som det allerede er anført ovenfor kan transfervektoren 15 være modificeret ved codon-substitution/-udeladelse/- tilføjelse, og sådanne modifikationer vil give anledning til modificerede fusionspeptider. På denne måde kan der fremstilles behørige modifikationer til fremme af spaltningen af fusionspeptiderne, f.eks. ved forbindelsen mellem 20 B/C- eller C/A-kæder, eller til ændring af peptidkædead- færen under efterfølgende kemisk eller biologisk behandling.

Som anført ovenfor tilvejebringer opfindelsen også human-25 relaxin, -prorelaxin og -præprorelaxin.

Relaxin kan fremstilles ved direkte kombination af separate A- og B-kæder ved en hvilken som helst af de fremgangsmåder, der for tiden kendes og bruges til fremstilling af 30 insulin.

På tilsvarende måde som insulin kan relaxin fremstilles ud fra prorelaxin ved oxidation eller anden omdannelse af sulfhydrylgrupperne på A- og B-peptiderne i relaxin, der er 35 fremstillet som beskrevet heri, til dannelse af disulfidt værbindinger mellem A- og B-peptiderne, og derpå udskære C-peptiderne, f.eks. ved en enzymkatalyseret hydrolyse, som er specifik for bindingerne, som sammenbinder C-peptidet DK 171827 B1 12 med A- og B-peptiderne.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer følgelig yderligere en fremgangsmåde til syntese af humanrelaxin, 5 ved hvilken fremgangsmåde A- og B-kæderne i relaxin forenes (i deres fulde længde, eller i forkortede eller modificerede udgaver) ved i sig selv kendte metoder til forening af A- og B-kæder i humaninsulin.

10 Ved en sådan fremgangsmåde reduceres en blanding af de S- sulfonerede A- og B-kæder, hvorpå blandingen overlades til oxidation i luft.

Det er også med opfindelsen blevet opdaget, at nyttevirk-15 ningen ved den ovenanførte fremgangsmåde forbedres, når den ene af eller både A- og B-kæderne foreligger i form af et S-thioethyl-cys-derivat i stedet for på S-sulfoformen.

I beskrivelsen til Australsk patent nr. 561.670 er det også 20 vist, at den ene af eller både A- og B-kæderne i relaxinet kan forkortes ved amino- og/eller carboxyterminalerne uden væsentligt tab af biologisk aktivitet og under opnåelse af bedre kombinationsudbytter. Disse metoder er ligeså anvendelige til fremstilling af humanrelaxin.

25

Ved et andet aspekt ifølge opfindelsen tilvejebringes en humanrelaxin-analog, som i det væsentlige består af forkortede og/eller modificerede former af de naturlige B-og/eller A-peptidkæder.

30

Dette aspekt ved opfindelsen tilvejebringer også en fremgangsmåde til fremstilling af en humanrelaxinanalog, hvilken fremgangsmåde omfatter dannelse af de forkortede og/eller modificerede B- og/eller A-peptidkæder og forening 35 af dem ved en hvilken som helst af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder.

Undersøgelser af både svine- og menneskerelaxin har vist, DK 171827 B1 13 at relaxinaktiviteten kan være til stede ved A-kæder så korte som A(10-24) og B-kæder så korte som B(10-22), selv om de praktiske minima forventes at være A(4-24) henholdsvis B(4-23).

5

Generelt kan A-kæden varieres fra A(l-24) til A(10-24) og B-kæden fra B(l-32) til B(10-22).

De foretrukne kombinationer afledes fra: 10

A B

En hvilken (1-24) med en hvilken (1-23) som helst af (2-24) som helst af (op til) (3-24) (1-32) 15

Modifikatoner af B- og/eller A-kæderne sker ved "genetisk” modifikation, som beskrevet ovenfor.

A- og B-peptidkæderne og også prorelaxin og præprorelaxin 20 kan fremstilles ved sædvanlige genekspressionsfremgangs måder, det vil sige dyrkning af en mikroorganisme, som indeholder den behørige, transformerede transfervektor, og isolering og rensning af det ønskede peptid (eller peptider) , der er produceret af mikroorganismen.

25

Opfindelsen beskrives og illustreres yderligere ved den efterfølgende beskrivelse og de benyttede eksperimentelle procedurer og de herved opnåede resultater.

30 A. Eksperimentelle procedurer (i) Bakterie- øg fag-stammer E.coli RR1 blev benyttet som den bakterielle vært for 35 rekombinantplasmider (pBR322) indeholdende porcinrelaxin- cDNA-indsatser som beskrevet tidligere (7).

Biblioteket (samlingen) af humane genomiske kloner blev DK 171827 B1 14 venligst stillet til rådighed af T. Maniatis. Genomiske DNA-fragmenter på ca. 15-20 kb fra den partielle Hae 111/Alu 1 fragmentation af human-DNA (9) blev klonet ved koblinger i lambdafagvektoren Charon 4A (10) og opformeret 5 i E.coli LE392 -celler.

Fag-DNA (efter klonselektion) blev fremstillet efter lysering af E.coli DP50supF -celler i en 1 liter kultur (10).

10

Små DNA-fragmenter (fra fragmentationen af fag-DNA) blev subklonet til sekvensanalyse i M13 bakteriofagvektorerne mp7,l, mp8 og mp9 (venligst stillet til rådighed af Dr.

J.Messing) og overført til E.coli JM101 -celler.

15 fii) Fremstilling af hybridiseringsprober (porcin-DNA)

Radioaktivt mærkede prober blev fremstillet ved primede synteser på forskellige DNA-fragmenter under anvendelse af 20 denaturerede, statistisk vilkårlige primere (3 eller 4 baser) af kalvethymus-DNA (11). Porcin-DNA-skabelonen (100-200 ng) blev denatureret med de statistisk vilkårlige primere (lMg) ved kogning i 20 μΐ H20 i 2 minutter. Syntese blev indledt ved tilsætning af 30 ml reaktionsblanding 25 indeholdende 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 10 mM MgCl_, 5 enheder E.coli DNA-Polymerase 1, 500 M af . * 32 respektivt dCTP, dGTP, dTTP og 0,3 mM a-[ P]-dATP (ca.

3000 Ci/mmol, Amersham). Efter inkubering ved 37°C i 30 minutter blev reaktionen bragt til afslutning ved for- 30 tynding i 300 ml af en puffer indeholdende 0,3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, ImM EDTA, og reaktionsblandingen blev passeret gennem en Sephadex-G50-søjle (1 cm x 5cm) i samme puffer. Den radioaktivt mærkede probe blev indsamlet fra topfraktionerne ved udtømt rumfang og præcipiteret med 2 35 rumfang ethanol ved -20°C i 2 timer under anvendelse af tRNA (10 μg) som bærer (carrier).

DK 171827 B1 15 riil) Screeningsprocedurer

Lambda-fag (λ) indeholdende genomiske DNA-fragmenter blev 5 dyrket på blød agar med ca. 10 fag/plade med 13 cm 5 diameter og overført til nitrocellulosefiltre (Schleicher & Schull ΒΆ85) som beskrevet af Benton og Davis (12). Filtre blev hybridiseret med den radioaktivt mærkede probe ved 40°C i 18 timer i modificeret Denhart's opløsning (13) indeholdende 5 x SSC og 25% formamid. Filtrene blev vasket 10 i 2 x SSC ved 30°C i 1 time inden eksponering af rønt genfilm (Kodak XS-5) i 24 timer. Områder af pladen, som udviste positiv hybridisering blev subkultiveret og screenet igen successivt indtil en enkelt positiv plaque kunne udvælges. Fag blev indhøstet efter lysering af 1 15 liter kultur af E.coli I DP50supF -celler, og DNA blev fremstillet ved fremgangsmåderne, der er beskrevet af Maniatis (10) og Yamamoto og Alberts (14).

fiv) DNA-sekvensanalvse 20

Restriktionsfragmenter af den udvalgte rekombinant-fag blev subklonet direkte i Eco RI, Pst 1 eller Sma 1-spaltnings-stedet i fag M13mp8. Koblinger (ligationer) blev frembragt i 20 μΐ reaktionsblandinger indeholdende 10 mM Tris-HCl, pH 25 8,0, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, ImM ATP, 1 enhed T4-DNA-ligase, DNA (100 ng) og M13-fagvektoren (50 ng). Efter inkubering ved 40° natten over blev rekombinant-DNA overført til E.coli JMlOlceller (15). Plaque indeholdende kodeområdet blev udvalgt (selekteret) ved en tilsvarende metode, som 30 den ovenfor beskrevne med hensyn til genomisk screening, bortset fra, at M13-fagen blev udpladet med mindre tæthed 3 (10 fag/plade med 9 cm diameter). Positive plaque blev dyrket til opnåelse af et preparativt udbytte af enten en enkeltstrenget skabelon eller en replikativ dobbeltstrenget 35 (rf) form (15) . Enkeltstrengede skabeloner blev sekvenssor teret direkte ved metoden af Sanger et al. (16) under anvendelse af enten en M13-specifik primer (Collaborative Research) eller syntetiske primere, der var komplementære DK 171827 B1 16 til forskellige sekvenser i kodeområdet. Komplet sekvensanalyse af subklonerne blev opnået ved spaltning af rf-formen på forskellige steder med forskellige restriktionsenzymer og derpå subklonet i M13 ved stump-endekobling (15) 5 eller ved direkte endemærkning af fragmenter og sekvensbe stemmelse ved metoden ifølge Maxam og Gilbert (17). DNA-sekvens blev analyseret og sammenlignet med svine- og rotterelaxinsekvenser under anvendelse af computerprogrammer (18).

10 B. Resultater I den efterfølgende diskussion vil der blive henvist til tegningen.

15

Fig.l viser et forkortet restriktionsenzymkort over de genomiske kloner.

Størrelserne er angivet i kilobasepar (kb) og spaltnings-20 steder er betegnet EcoRl (R), Pst 1 (P) og Hpa 11 (H). Den genomiske klon ΛΗ5 ender ved en Eco Rl-kobling, der er knyttet til Alu 1-positionen i c-peptidet (exon II) (A i fig.l). Den definitive nucleotidsekvens over kodeområdet blev opstillet ud fra den genomiske klon λΗ7 ved subkloning 25 af Eco RI og Pst 1 fragmenter i M13mp8 og derpå enten: (1) direkte sekvensbestemmelse på M13-skabeloner, hvilket i fig.l er vist med stiplede linier (----------), 30 (2) direkte sekvensbestemmelse under anvendelse af synteti ske nukleotidprimere, hvilket er vist med prikkede linier (.......), eller (3) endemærkning af DNA-fragmenter og sekvensbestemmelse 35 ved kemisk nedbrydning, vist med fuldt optrukne linier ( - ).

De til sekvensbestemmelsen benyttede primere var: DK 171827 B1 17

a: 5'TTCGCAATAGGCA og b: 5'GCACAATTAGCT

Fig.2 viser kodeområdet i det humane relaxingen.

5 En sammenligning af humanpræprorelaxinaminosyre- og mRNA- sekvens (øvre) med den tilsvarende svinerelaxinsekvens (nedre) er vist i fig.3. Sekvenserne er blevet opstillet på linie, således at der fremkommer størst mulig homologi med identiske nucleotider angivet ved stjerner og aminosyreho-10 mologier med indrammede områder. Aminosyrerne er nummereret fra starten af B-kæden. Intronsekvensen ved exon/intron/en-xon-grænserne er præsenteret ved den nedre DNA-notation.

liL Isolering oa karakterisering af qenomiske kloner 15

Humane genomiske kloner blev identificeret ved screening af "biblioteket" med prober fremstillet ud fra et kort (150 bp) fragment af den svinerelaxin-cDNA-klon, der svarer til aminosyrerne 45-95 i C-peptidet (7), som opstillet i fig.3 20 på den tilhørende tegning. Dette fragment blev udskåret fra klonen ved "fordøjelse" med Hpa II og Hinf 1 og svarende til området med maximal homologi (71% på nucleotidniveauet) mellem rotte- og svinerelaxinsekvenserne. Fra den genomiske klonsamling blev der isoleret to stærkt positive fager 25 betegnet AH5 og AH7. Disse positive kloner blev yderligere karakteriseret ved restriktionsenzymanalyse under anvendelse af to separate fragmenter fra svinerelaxin-cDNA, der er specifik for 5'- henholdsvis 3'-exon-områderne (i det følgende kaldt "exon I" og "exon II"), som prober. De 30 to fragmenter blev frembragt ved spaltning af svinerelaxin- cDNA-klonen i et enkelt Hpa Il-spaltningssted, der (indenfor nogle få baser) svarer til en intronposition i det homologe rotterelaxingen (6). "Southern blot"-analyse af AH5- og λΗ7-klonerne afslørede, at kodeområdet i human-35 relaxingenet er afbrudt af en enkelt intron på 3,4 kb (se fig. 1).

DK 171827 B1 18 (il) Sekvensanalvse af de .genomiske Kloner

Den benyttede strategi gik ud på at subklone komplette restriktions fordøj el ser af λΗ5 og λΗ7 i M13-vektorer og derpå 5 foretage screening under anvendelse af svinerelaxinprober, der var specifikke for exon I og II. De positive subkloner blev sekvensbestemt ved en kombination af metoder, der er beskrevet i metodeafsnittet A(iv) ovenfor.

10 Exon II -området i λΗ7-klonen var indeholdt i et 2,0 kb

EcoRl- fragment begyndende med et EcoRl-spaltningssted i C-peptidet og fortsættende gennem hele kodesekvensen af A-kæden til den afsluttende kodon (se fig.l). Sekvensbestemmelsen af dette fragment blev lettet betragteligt ved 15 syntesen af nucleotidprimere, der er specifikke for områder omkring A-kæden, og som blev benyttet til direkte primning på M13-skabelonen, der indeholdt hele 2,0 kb fragmentet.

Det subklonede Eco RI—fragment indeholdende de øvrige 53 bp af C-peptidet i exon II kunne ikke identificeres med svine-20 cDNA som probe. Sekvensen over dette område blev opnået med et subklonet Pst 1 fragment fra λΗ7, som indeholdt hele exon II -området.

Sekvensbestemmelse af exon II -området af λΗ5 afslørede et 25 yderst kort 70 bp fragment begyndende i samme Eco Rl-spalt- ningssted i C-peptidet som λΗ7 (se fig.l), men afsluttende med en Eco Rl-kobling, som var blevet knyttet til et Alu 1-spaltningssted i det oprindelige genomiske DNA under frembringelsen af det genomiske bibliotek. λΗ5 blev derfor 30 betegnet som en ufuldstændig klon af relaxingenet og blev ikke analyseret yderligere.

Sekvensanalyse af exon I -området blev lettere kompliceret af et Eco Rl-spaltningssted i signalpeptidet, hvilket 35 nødvendiggjorde en uafhængig sekvensbestemmelse af to

Eco Rl-fragment-subkloner. Overlapningen over Eco Rl-positionen blev understøttet af en identificering af en Alu I -subklon fra AH7, som indeholdt den overlappende DK 171827 B1 19 sekvens.

LITTERATURFERENCER

5 1. Hisaw, F.L. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 22, 661-663 (1926).

2. Schwabe, C., McDonald, J.K. og Steinetz, B.C. Bi-ochem.Biophys.Res. Commun, 22., 503-510, (1977).

10 3. James, R., Niall, H., Kwok, S. og Bryant-Greenwood, G.

Nature 267. 544-546, (1977).

4. John, M.J., Walsh, J.R., Borjesson, B.W. og Niall, H.D. Endocrinology 108. 726-729, (1981).

15 5. Schwabe, C., Gowan, L.K. og Reinig, J.W., Ann.N.Y.A-cad.Sci. 380. 6-12, (1982).

6. Hudson, P., Haley, J., Cronk, M., Shine, J. og Niall, 20 H. Nature 291. 127-131, (1981).

7. Haley, J., Hudson, P., Scanlon, D., John, M., Cronk, M., Shine, J., Tregear, G. og Niall, H. DNA 1, 155-162 (1982) .

25 8. Dayhoff, M.O., Schwartz, R.M., Chen, H.R., Hunt, L.T., Barker, W.C. og Orcutt, B.C. DNA 1, 51-58 (1981).

9. Lawn, R.M., Fritsch, E.F., Parker, R.C., Blake, G. og 30 Maniatis, T., Cell 15, 1157-1174 (1978).

10. Maniatis, T., Hardison, R.E., Lacy, E., Lauer, J., O'Connell, C. og Quon, D. Cell 15, 687-701 (1978).

35 11. Taylor, J.M., Illmersee, R. og Summers, J. Biochim.-

Biophys. Acta Ml, 324-330 (1976).

12. Benton, W.D. og Davis, R. Science 196. 180-183 (1977).

DK 171827 B1 20 13. Denhardt, D.T., Biochem.Biophys.Res.Commun. 22# 641-646 (1966).

14. Yamamoto, K.R. og Alberts, B.M. Virology 42, 734-744 5 (1970).

15. Sanger, F., Coulson, A.R., Barreli, B.G., Smith, A.J.A. og Roe, B.A. (1980): J.Mol.Biol. 142, 161-178, (1980).

10 16. Sanger, F., Nicklen, S. og Coulson, A.R. Proc.Natn-•Acad.Sci. 24, 5463-5467 (1977).

17. Maxam, A.M. og Gilbert, W. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74.

15 560-564, (1977).

18. Staden, R. Nucl.Acids, Res. 2, 2601-2610 (1979).

Claims (14)

1. Dobbeltstrenget DNA-fragment, kendetegnet ved, at det koder for human-Hl-præprorelaxin eller der- 5 ivater heraf med samme biologiske virkning, og som omfatter en kodende streng og en komplementær streng, der svarer til den mRNA-sekvens, som er vist i tegningens figur 2.

2. Dobbeltstrenget DNA-fragment ifølge krav 1, k e n - 10 detegnet ved, at det koder for human-Hl-prorelaxin, og som omfatter en kodende streng og en komplementær streng, der svarer til de som 1-160 nummererede codoner i den i tegningens figur 2 viste mRNA-sekvens.

3. Dobbeltstrenget DNA-fragment ifølge krav 1, ken detegnet ved, at det koder for A- og B-kæderne i human-Hl-relaxin, og som omfatter en kodende streng og en komplementær streng, der svarer til de som 1-32 henholdsvis 136-160 nummererede codoner i den i tegningens figur 2 20 viste mRNA-sekvens.

4. Dobbeltstrenget DNA-fragment ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at én eller flere af codonerne i den nukleotidsekvens, der koder 25 for A-kæden i human-Hl-relaxin, og/eller én eller flere af codonerne i den nukleotidsekvens, der koder for B-kæden i human-Hl-relaxin, er udeladt, således at det dobbeltstrengede DNA-fragment koder for: 30 en human-Hl-relaxin A-kæde, der er udvalgt fra gruppen bestående af A(l-24) til A(5-24), hvorhos human-Hl-relaxin A-kædens aminosyrer 1-24 har følgende rækkefølge: 35 1 5 10 Arg Pro Tyr Val Ala Leu Phe Glu Lys Cys Cys Leu 15 20 24 Ile Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Lys Tyr Cys, og DK 171827 B1 en human-Hl-relaxin B-kædef der er udvalgt fra gruppen bestående af B(l-32) til B(4-23), hvorhos human-Hl-relaxin B-kædens aminosyrer 1-32 har følgende rækkefølge: 5 15 10 Lys Trp Lys Asp Asp Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg 15 20 Glu Leu Val Arg Ala Gin Ile Ala Ile Cys Gly Met 10 25 30 32 Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu.

5 Lys Trp Lys Asp Asp Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg 15 20 Glu Leu Val Arg Ala Gin Ile Ala Ile Cys Gly Met 25 30 32 Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu, og 10 (iii) en human-Hl-prorelaxin C-kæde, som har den i tegningens figur 2 angivne aminosyresekvens, hvorhos C-kædens aminosyresekvens er modificeret i forbindelsen mellem B/C- og C/A-kæderne, 15 således at spaltning ved B/C- og C/A-forbindel- serne og efterfølgende udskæring af C-kæden lettes.

5. Dobbeltstrenget DNA-fragment ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den koder for en human-Hl-relaxin

15 A-kæde, som er udvalgt blandt A-kædens aminosyrer A(1-24) til A(3-24), og en human-Hl-relaxin B-kæde, som er udvalgt blandt B-kædens aminosyrer B(l-32) til B(l-23).

6. DNA-fragment ifølge krav 1 eller 2, kendeteg- 20 net ved, at en eller flere codoner i den nukeotids- ekvens, der koder for A-kæden i human-Hl-relaxin, og/eller en eller flere codoner i den nukleotidsekvens, der koder for B-kæden i human-Hl-relaxin, er udeladt, og at en eller flere codoner, der koder for forbindelsen mellem B/C- og 25 C/A-k*derne i human-Hl-præprorelaxin eller Hl-prorelaxin, er modificerede, således at dette DNA-fragment koder for et polypeptid, som omfatter: (i) en human-Hl-relaxin A-kæde, der er udvalgt fra gruppen 30 bestående af A(l-24) til A(5-24), hvorhos A-kædens aminosyrer 1-24 har følgende rækkefølge: 15 10 Arg Pro Tyr Val Ala Leu Phe Glu Lys Cys Cys Leu 35 15 20 24 Ile Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Lys Tyr Cys (ii) en human-Hl-relaxin B-kæde, der er udvalgt fra gruppen DK 171827 B1 bestående af B(l-32) til B(4-23), hvorhos B-kædens aminosyrer 1-32 har følgende rækkefølge: 15 10

7. Dobbeltstrenget DNA-fragment ifølge et hvilket som 20 helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at én eller flere codoner er erstattet med andre codoner, som koder for den samme aminosyre.

8. DNA-transfervektor, kendetegnet ved, at den 25 indeholder en cDNA-deoxynukleotidsekvens, som svarer til et DNA-fragment ifølge et af kravene 1-7.

9. DNA-transfervektor ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den er et bakterielt plasmid. 30

10. DNA-transfervektor ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den er et bakteriofag-DNA.

11. Celle, som er transformeret med en DNA-transfervektor 35 ifølge et af kravene 8-10.

12. Fremgangsmåde til fremstilling af human-Hl-prorelaxin eller human-Hl-relaxin, kendetegnet ved, DK 171827 B1 - at et DNA-fragment ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7 bringes til ekspression i en værtscelle til frembringelse af det hermed kodede proteinprodukt, og 5 at human-Hl-prorelaxinet eller human-Hl-relaxinet herefter indvindes, hvorefter human-Hl-prorelaxinet eventuelt spaltes ved B/C- og C/A-kæderne til dannelse af Hl-relaxin.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at der fremstilles human-Hl-relaxin, som omfatter: (i) en human-Hl-relaxin A-kæde, der er udvalgt fra gruppen bestående af A(l-24) til A(5-24), hvorhos A-kædens 15 aminosyrer 1-24 har følgende rækkefølge: 15 10 Arg Pro Tyr Val Ala Leu Phe Glu Lys Cys Cys Leu 15 20 24

20 Ile Gly Cys Thr Lys Arg Ser Leu Ala Lys Tyr Cys (ii) en human-Hl-relaxin B-kæde, der er udvalgt fra gruppen bestående af B(l-32) til B(4-23), hvorhos B-kædens aminosyrer 1-32 har følgende rækkefølge: 25 15 10 Lys Trp Lys Asp Asp Val Ile Lys Leu Cys Gly Arg 15 20 Glu Leu Val Arg Ala Gin Ile Ala Ile Cys Gly Met 30 25 30 32 Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, 35 at human-Hl-relaxinets A-kædepolypeptid er udvalgt fra gruppen bestående af A(l-24) til A(3-24), og - at human-Hl-relaxinets B-kæde er udvalgt fra gruppen 5 DK 171827 B1 bestående af B(l-32) til B(l-23).