JP2537477B2 - ヒト−レラキシン遺伝子 - Google Patents
ヒト−レラキシン遺伝子Info
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- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
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Description
【発明の詳細な説明】 （発明の分野） この発明は、分子クローニング及びヒトーレラキシン
をコードする遺伝子配列の特徴付けに関する。この発明
はさらに、ヒト−レラキシン、プロレラキシン及びプレ
プロレラキシンを製造するための組換DNA技法に関す
る。
をコードする遺伝子配列の特徴付けに関する。この発明
はさらに、ヒト−レラキシン、プロレラキシン及びプレ
プロレラキシンを製造するための組換DNA技法に関す
る。
さらに詳しくは、この発明は、分離されそして精製さ
れた（クローン化された）、プロレラキシン、プレプロ
レラキシン、及びヒト−レラキシンのＡ及び／又はＢ及
び／又はＣペプチド鎖をコードするヒト−遺伝子、該遺
伝子の分離及び精製方法、並びに該遺伝子を宿主細胞に
移入しそして該宿主細胞中で複製せしめる方法に関す
る。クローン化された遺伝子は、宿主−発現性の原核性
又は真核性遺伝子と融合した場合、宿主細胞により発現
される。従って、この遺伝子は、治療用ヒト−レラキシ
ンの製造に有用である。
れた（クローン化された）、プロレラキシン、プレプロ
レラキシン、及びヒト−レラキシンのＡ及び／又はＢ及
び／又はＣペプチド鎖をコードするヒト−遺伝子、該遺
伝子の分離及び精製方法、並びに該遺伝子を宿主細胞に
移入しそして該宿主細胞中で複製せしめる方法に関す
る。クローン化された遺伝子は、宿主−発現性の原核性
又は真核性遺伝子と融合した場合、宿主細胞により発現
される。従って、この遺伝子は、治療用ヒト−レラキシ
ンの製造に有用である。
この発明はさらに、ペプチドたるヒト−レラキシン、
プロレラキシン及びプレプロレラキシン、これらの配列
を構成する個々のペプチド鎖、並びにこれらのペプチド
の変形に関する。
プロレラキシン及びプレプロレラキシン、これらの配列
を構成する個々のペプチド鎖、並びにこれらのペプチド
の変形に関する。
この発明はさらに、個々のレラキシン鎖及び上記のそ
の変形をコードする変形された遺伝子に関する。
の変形をコードする変形された遺伝子に関する。
この明細書において（番号）により引用した文献は後
にまとめて記載してある。
にまとめて記載してある。
（従来技術） ヒサウ（Hisaw）（１）の先駆的な研究により、哺乳
動物のペプチドホルモンであるレラキシンの重要な役割
が、その恥骨結合弛緩作用及びこの作用に基く分娩促進
作用により示唆された。レラキシンは、妊娠中に卵巣の
黄体中で合成されここに貯蔵され、そして分娩に先立っ
て血流中に放出される。卵巣を得ることにより、豚（2,
3）、ラット（４）、及びサメ（５）のレラキシンの分
離及びアミノ酸配列の決定が可能となった。生物学的に
活性なホルモンは、ジスルフィド結合により結合された
２つのペプチド鎖（Ａ鎖及びＢ鎖）から成り、このジス
ルフィド結合は、２つの鎖間結合と１つの鎖内結合から
成る。従って、この構造はジスルフィドの配置において
インスリンに非常に類似しており、このことからこれら
のホルモンの遺伝子は先祖を共通にすると推定される。
動物のペプチドホルモンであるレラキシンの重要な役割
が、その恥骨結合弛緩作用及びこの作用に基く分娩促進
作用により示唆された。レラキシンは、妊娠中に卵巣の
黄体中で合成されここに貯蔵され、そして分娩に先立っ
て血流中に放出される。卵巣を得ることにより、豚（2,
3）、ラット（４）、及びサメ（５）のレラキシンの分
離及びアミノ酸配列の決定が可能となった。生物学的に
活性なホルモンは、ジスルフィド結合により結合された
２つのペプチド鎖（Ａ鎖及びＢ鎖）から成り、このジス
ルフィド結合は、２つの鎖間結合と１つの鎖内結合から
成る。従って、この構造はジスルフィドの配置において
インスリンに非常に類似しており、このことからこれら
のホルモンの遺伝子は先祖を共通にすると推定される。
ラットレラキシン及び豚レラキシンのいずれについて
もcDNAクローンの分離に組換DNA技法が適用された
（６）。なお、オーストリリア特許出願第11834.83（PF
2696/82）を参照のこと。アミノ酸配列情報を基礎にし
て調製された合成11連ヌクレオチドが、卵巣組織から誘
導されたライブラリー中のレラキシンcDNAクローンを同
定するためのcDNAプローブを合成するためのプライマー
として使用された。該プローブはレラキシンcDNA配列に
関し非常に濃縮されたものである。レラキシン構造遺伝
子は、全体構造においてプレプロインスリンに類似する
単鎖前駆体、すなわちシグナルペプチド/B鎖/Cペプチド
/A鎖をコードすることが見出された。
もcDNAクローンの分離に組換DNA技法が適用された
（６）。なお、オーストリリア特許出願第11834.83（PF
2696/82）を参照のこと。アミノ酸配列情報を基礎にし
て調製された合成11連ヌクレオチドが、卵巣組織から誘
導されたライブラリー中のレラキシンcDNAクローンを同
定するためのcDNAプローブを合成するためのプライマー
として使用された。該プローブはレラキシンcDNA配列に
関し非常に濃縮されたものである。レラキシン構造遺伝
子は、全体構造においてプレプロインスリンに類似する
単鎖前駆体、すなわちシグナルペプチド/B鎖/Cペプチド
/A鎖をコードすることが見出された。
豚及びラットのプレプロレラキシンは、約30残基のＣ
ペプチドを有するラットのインスリンと比較して、それ
ぞれ105残基及び104残基の予想外に大きな連結ペプチド
を含有する。ラット及び豚のレラキシンのＣ−ペプチド
における配列の高度な相同性により、単にＡ鎖及びＢ鎖
の正しいジスルフィド結合の形成を確保するのみならず
他の機能が存在することが示唆される。発明者等は、進
化の過程における配列構造の変化に対して制約が加えら
れた結果、ヒトのレラキシン遺伝子においても同様に、
Ｃ−ペプチド領域が高度な配列の相同性を有すると予想
した。後記のごとく、発明者等は、ヒトのレラキシン遺
伝子の選択においてはラットのレラキシンのＣ−ペプチ
ド領域ではなく豚のレラキシンのＣ−ペプチド領域を基
礎にしたプローブを使用した。これは、蓄積された蛋白
質の配列データにより、一般にヒト蛋白質はラットの蛋
白質よりも豚のそれに近いことが示されている（８）か
らである。
ペプチドを有するラットのインスリンと比較して、それ
ぞれ105残基及び104残基の予想外に大きな連結ペプチド
を含有する。ラット及び豚のレラキシンのＣ−ペプチド
における配列の高度な相同性により、単にＡ鎖及びＢ鎖
の正しいジスルフィド結合の形成を確保するのみならず
他の機能が存在することが示唆される。発明者等は、進
化の過程における配列構造の変化に対して制約が加えら
れた結果、ヒトのレラキシン遺伝子においても同様に、
Ｃ−ペプチド領域が高度な配列の相同性を有すると予想
した。後記のごとく、発明者等は、ヒトのレラキシン遺
伝子の選択においてはラットのレラキシンのＣ−ペプチ
ド領域ではなく豚のレラキシンのＣ−ペプチド領域を基
礎にしたプローブを使用した。これは、蓄積された蛋白
質の配列データにより、一般にヒト蛋白質はラットの蛋
白質よりも豚のそれに近いことが示されている（８）か
らである。
幾つかのグループが、ヒト−レラキシンの構造を決定
し、そしてこれを難産の症例において臨床的に使用する
途を確立することを長期目標としてきたが、妊娠中のヒ
トの卵巣を入手するのに限界があるためアミノ酸配列を
直接決定することができなかった。発明者等の研究方法
は、プローブとして豚のレラキシンcDNAの領域を用いて
ゲノムライブラリーから直接的にヒト−レラキシン遺伝
子を選択することであった。この方法によりゲノムクロ
ーンの同定に成功し、このクローンからプレプロレラキ
シン全コード領域の構造が決定された。
し、そしてこれを難産の症例において臨床的に使用する
途を確立することを長期目標としてきたが、妊娠中のヒ
トの卵巣を入手するのに限界があるためアミノ酸配列を
直接決定することができなかった。発明者等の研究方法
は、プローブとして豚のレラキシンcDNAの領域を用いて
ゲノムライブラリーから直接的にヒト−レラキシン遺伝
子を選択することであった。この方法によりゲノムクロ
ーンの同定に成功し、このクローンからプレプロレラキ
シン全コード領域の構造が決定された。
発明者等が「H1」と称してこの明細書に記載する遺伝
子及び発明者等の係属中の出願第PF7247/82号に記載さ
れている「H2」遺伝子はいずれもレラキシン様活性を有
するペプチドを発現するから、これらの一方又は両者は
ヒトの生殖組織、例えば卵巣及び胎盤、及び／又は腸、
脳及び皮膚を含む他の組織（これらに限定されない）中
で発現されると信じられる。
子及び発明者等の係属中の出願第PF7247/82号に記載さ
れている「H2」遺伝子はいずれもレラキシン様活性を有
するペプチドを発現するから、これらの一方又は両者は
ヒトの生殖組織、例えば卵巣及び胎盤、及び／又は腸、
脳及び皮膚を含む他の組織（これらに限定されない）中
で発現されると信じられる。
卵巣の黄体、並びに脱落膜組織及び胎盤組織が、レラ
キシン関連遺伝子が発現する可能性が最も高い部位であ
る。しかしながら、多くのペプチドホルモンが広い範囲
に分布していることから考えて、レラキシン遺伝子が脳
及び胃腸管を含む非生殖組織においても発現する可能性
が強い。レラキシンは生長因子としての一般的性質を有
し、そして結合組織の性質を変え、平滑筋の収縮に影響
を与えることができる。発明者等は、この明細書に記載
する遺伝子構造及び係属中の特許出願第PF7247/82号に
記載されている遺伝子構造の両者又は一方が体内に広く
分布しているものと信ずる。発明者等は、これらの遺伝
子により発現されるレラキシンペプチドが、生殖中のよ
く知られているホルモン機能のほかに重要な生理的役割
を演ずることを示唆する。
キシン関連遺伝子が発現する可能性が最も高い部位であ
る。しかしながら、多くのペプチドホルモンが広い範囲
に分布していることから考えて、レラキシン遺伝子が脳
及び胃腸管を含む非生殖組織においても発現する可能性
が強い。レラキシンは生長因子としての一般的性質を有
し、そして結合組織の性質を変え、平滑筋の収縮に影響
を与えることができる。発明者等は、この明細書に記載
する遺伝子構造及び係属中の特許出願第PF7247/82号に
記載されている遺伝子構造の両者又は一方が体内に広く
分布しているものと信ずる。発明者等は、これらの遺伝
子により発現されるレラキシンペプチドが、生殖中のよ
く知られているホルモン機能のほかに重要な生理的役割
を演ずることを示唆する。
（発明の具体的な説明） この明細書においては次の略号を用いる。
H1 :この明細書に記載するレラキシン遺伝子であっ
て、ゲノムクローンに由来する。
て、ゲノムクローンに由来する。
H2 :係属中の出願第PF7247/82号に記載されているレラ
キシン遺伝子であって、cDNAに由来する。
キシン遺伝子であって、cDNAに由来する。
DNA :デオキシリボ核酸 RNA :リボ核酸 cDNA:相補的（コンプレメンタリー）DNA（mRNA配列から
酵素的に合成される。） mRNA:メッセンジャーRNA A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン U :ウラシル DNA中のヌクレオチド配列と蛋白質中のアミノ酸配列
とのコード関係は遺伝コードとして全面的に知られてお
り、次にこれを示す。
酵素的に合成される。） mRNA:メッセンジャーRNA A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン U :ウラシル DNA中のヌクレオチド配列と蛋白質中のアミノ酸配列
とのコード関係は遺伝コードとして全面的に知られてお
り、次にこれを示す。
上の表中に使用するアミノ酸の略号は次の意味を有す
る。
る。
フェニルアラニン（Phe） ヒスチジン （His） ロイシン （Leu） グルタミン （Gln） イソロイシン （Ile） アスパラギン （Asn） メチオニン （Met） リジン （Lys） バリン（Val） アスパラギン酸 （Asp） セリン（Ser） グルタミン酸 （Glu） プロリン（Pro） システイン （Cys） スレオニン（Thr） トリプトファン （Try） アラニン（Ala） アルギニン （Arg） チロシン（Tyr） グリシン （Gly） 表中に示した各３文字コードン、例えばAUG、CAU（デ
オキシヌクレオチドトリプレット又はヌクレオチドトリ
プレットとしても知られている）は、mRNAのトリヌクレ
オチドに対応し、左側に５′末端を有し、右側に３′末
端を有する。文字は、ヌクレオチド配列を形成するプリ
ン塩基又はピリミジン塩基を示す。この明細書に記載す
るすべてのDNA配列は鎖状を成しており、その配列はmRN
A配列に対応し、但し、ウラシル（Ｕ）の代りにチミン
（Ｔ）を含んでいる。
オキシヌクレオチドトリプレット又はヌクレオチドトリ
プレットとしても知られている）は、mRNAのトリヌクレ
オチドに対応し、左側に５′末端を有し、右側に３′末
端を有する。文字は、ヌクレオチド配列を形成するプリ
ン塩基又はピリミジン塩基を示す。この明細書に記載す
るすべてのDNA配列は鎖状を成しており、その配列はmRN
A配列に対応し、但し、ウラシル（Ｕ）の代りにチミン
（Ｔ）を含んでいる。
遺伝子材料の採取源はヒト−ゲノムクローンのライブ
ラリーである。豚のレラキシンcDNAプローブを用いるこ
のライブラリーのスクリーニングによりヒト−レラキシ
ンのコード配列を含有する２つのクローンが得られた。
ラリーである。豚のレラキシンcDNAプローブを用いるこ
のライブラリーのスクリーニングによりヒト−レラキシ
ンのコード配列を含有する２つのクローンが得られた。
第２図及び第３図に示すmRNA配列は後に記載する方法
により決定された。3.4kbの１個のイントロンが連結
（Ｃ）ペプチドのコード領域を中断していることが明ら
かであろう。ヒト−プレプロレラキシンの構造を、豚及
びラットのレラキシンの相同構造と比較することにより
ゲノム配列から推定した。Ａ及びＢペプチド鎖の構造
を、合成、及び子宮収縮試験において生物学的に活性で
ある物質を生成する鎖連結（試験管内）により確認し
た。
により決定された。3.4kbの１個のイントロンが連結
（Ｃ）ペプチドのコード領域を中断していることが明ら
かであろう。ヒト−プレプロレラキシンの構造を、豚及
びラットのレラキシンの相同構造と比較することにより
ゲノム配列から推定した。Ａ及びＢペプチド鎖の構造
を、合成、及び子宮収縮試験において生物学的に活性で
ある物質を生成する鎖連結（試験管内）により確認し
た。
プレプロレラキシンの生体内プロセシングの態様は十
分には解明されていないが、豚レラキシンのシグナルペ
プチドの切断から類推して、Ala-1−Lys1結合において
生ずると予想される。同様に、Ｃペプチドの切り離しは
Leu32−Ser33、及びArg136−Arg137において生じ、これ
により、それぞれ32残基及び24残基のＢ鎖及びＡ鎖が生
ずると予想される。
分には解明されていないが、豚レラキシンのシグナルペ
プチドの切断から類推して、Ala-1−Lys1結合において
生ずると予想される。同様に、Ｃペプチドの切り離しは
Leu32−Ser33、及びArg136−Arg137において生じ、これ
により、それぞれ32残基及び24残基のＢ鎖及びＡ鎖が生
ずると予想される。
豚レラキシンについての発明者等の研究によれば、豚
レラキシンＢ鎖及びＡ鎖中に、生物学的活性のために必
須のすべての要素を含有するコア−配列が存在する。ヒ
ト−レラキシン鎖についての発明者等の合成研究におい
ても同様の結果が得れた。これは、後に詳細に記載す
る。
レラキシンＢ鎖及びＡ鎖中に、生物学的活性のために必
須のすべての要素を含有するコア−配列が存在する。ヒ
ト−レラキシン鎖についての発明者等の合成研究におい
ても同様の結果が得れた。これは、後に詳細に記載す
る。
この発明の１つの観点に従えばヒト−プレプロレラキ
シン発現遺伝子が提供される。
シン発現遺伝子が提供される。
さらに詳しくは、この発明のこの観点に従えば、第２
図に示す完全mRNA（コードン−25〜160）配列に対応す
るコード鎖及び相補鎖を含んで成る、ヒト−プレプロレ
ラキシンの発現のための二重鎖DNA断片が提供される。
図に示す完全mRNA（コードン−25〜160）配列に対応す
るコード鎖及び相補鎖を含んで成る、ヒト−プレプロレ
ラキシンの発現のための二重鎖DNA断片が提供される。
この発明はさらに、この明細書に記載するプレプロレ
ラキシン遺伝子配列の任意のサブユニット、又は該配列
もしくはそのサブユニットの同等物を含む。これらのサ
ブユニットの中には、非コード領域を含まない遺伝子、
例えば第３図に示す遺伝子、シグナルペプチド、及びヒ
ト−プレプロレラキシンのＡ、Ｂ、及びＣ鎖（第３図）
をコードする個々の構造遺伝子を含む遺伝子、並びにこ
れらの鎖の任意の組合わせをコードする遺伝子、例えば
Ａ及びＢペプチド鎖を別個に発現する遺伝子、又は（Ｃ
鎖と共に）プロレラキシンとして発現する遺伝子が含ま
れる。
ラキシン遺伝子配列の任意のサブユニット、又は該配列
もしくはそのサブユニットの同等物を含む。これらのサ
ブユニットの中には、非コード領域を含まない遺伝子、
例えば第３図に示す遺伝子、シグナルペプチド、及びヒ
ト−プレプロレラキシンのＡ、Ｂ、及びＣ鎖（第３図）
をコードする個々の構造遺伝子を含む遺伝子、並びにこ
れらの鎖の任意の組合わせをコードする遺伝子、例えば
Ａ及びＢペプチド鎖を別個に発現する遺伝子、又は（Ｃ
鎖と共に）プロレラキシンとして発現する遺伝子が含ま
れる。
この発明の他の観点に従えば、ヒト−プロレラキシン
を発現する遺伝子が提供される。
を発現する遺伝子が提供される。
さらに詳しくは、この発明の上記の観点に従えば、第
２図に示すmRNA配列の１〜160のコードンに対応するコ
ード鎖及び相補鎖を含んで成るヒト−プロレラキシンを
発現する二重鎖DNA断片が提供される。
２図に示すmRNA配列の１〜160のコードンに対応するコ
ード鎖及び相補鎖を含んで成るヒト−プロレラキシンを
発現する二重鎖DNA断片が提供される。
この発明の他の観点に従えば、ヒト−レラキシンの
Ａ、Ｂ及びＣ鎖、又はこれらの鎖の２以上の任意の組合
わせを個別に発現する遺伝子が提供される。
Ａ、Ｂ及びＣ鎖、又はこれらの鎖の２以上の任意の組合
わせを個別に発現する遺伝子が提供される。
さらに詳しくは、この発明の上記の観点に従えば、第
２図に示すmRNA配列の１〜32、33〜136、及び137〜160
のコードンに対応するコード配列及び相補配列を含んで
成り、ヒト−レラキシンのＡ鎖及び／又はＢ鎖及び／又
はＣ鎖を個別に発現する二重鎖DNA断片が提供される。
２図に示すmRNA配列の１〜32、33〜136、及び137〜160
のコードンに対応するコード配列及び相補配列を含んで
成り、ヒト−レラキシンのＡ鎖及び／又はＢ鎖及び／又
はＣ鎖を個別に発現する二重鎖DNA断片が提供される。
上記の遺伝子は、特定されたコードンのほかに適当な
「開始」コードン及び「停止」コードン、すなわち、そ
れぞれAUG及びUGA（第２図における−26及び161のコー
ドン）を含むであろう。
「開始」コードン及び「停止」コードン、すなわち、そ
れぞれAUG及びUGA（第２図における−26及び161のコー
ドン）を含むであろう。
当業者はこれらの遺伝子の多形（polymorphicforms）
が存在することを認めるであろう。このような多形もこ
の発明に含まれる。
が存在することを認めるであろう。このような多形もこ
の発明に含まれる。
この発明はさらに、前記の配列、サブユニット又は同
等物、及び対応するRNA配列、サブユニット又は同等物
の相補体をも包含する。
等物、及び対応するRNA配列、サブユニット又は同等物
の相補体をも包含する。
この発明の他の観点に従えば、前記の遺伝子に対応す
るデオキシヌクレオチド配列を含んで成るDNA移転ベク
ターが提供される。
るデオキシヌクレオチド配列を含んで成るDNA移転ベク
ターが提供される。
前記のごとく、遺伝コードは重複性を有する。すなわ
ち、あるアミノ酸は複数のコードンによりコードされ
る。従って、この発明は、図に示したコードンが同じア
ミノ酸をコードする他のコードンによって置き換えられ
ているデオキシヌクレオチド配列を包含する。
ち、あるアミノ酸は複数のコードンによりコードされ
る。従って、この発明は、図に示したコードンが同じア
ミノ酸をコードする他のコードンによって置き換えられ
ているデオキシヌクレオチド配列を包含する。
さらに、すでに記載したごとく、天然レラキシンのＢ
鎖及び／又はＡ鎖と構造を異にし、レラキシン活性を有
するペプチドを製造することができる。この構造の差異
には、天然鎖中の１個又は複数個のアミノ酸の除去及び
／又は付加及び／又は置換が含まれる。
鎖及び／又はＡ鎖と構造を異にし、レラキシン活性を有
するペプチドを製造することができる。この構造の差異
には、天然鎖中の１個又は複数個のアミノ酸の除去及び
／又は付加及び／又は置換が含まれる。
従って、この発明はさらに、天然コードンが除去され
ておりそして／又は天然コードンによってコードされる
アミノ酸と異るアミノ酸をコードするコードンにより置
き換えられておりそして／又は天然配列に追加のコード
ンが付加されている前記の遺伝子及びDNA移転ベクター
をも包含する。
ておりそして／又は天然コードンによってコードされる
アミノ酸と異るアミノ酸をコードするコードンにより置
き換えられておりそして／又は天然配列に追加のコード
ンが付加されている前記の遺伝子及びDNA移転ベクター
をも包含する。
この発明の移転ベクターはさらに、特に、宿主細胞に
移入された場合に自己の複製を保障する遺伝情報を含有
する。この宿主細胞には、例えば原核微生物の細胞及び
真核細胞、例えば細菌、酵母、糸状菌の細胞、哺乳動物
の細胞、及びセルラインが含まれる。
移入された場合に自己の複製を保障する遺伝情報を含有
する。この宿主細胞には、例えば原核微生物の細胞及び
真核細胞、例えば細菌、酵母、糸状菌の細胞、哺乳動物
の細胞、及びセルラインが含まれる。
細菌遺伝学において一般に使用される移転ベクターの
例にはプラスミド及びある種のバクテリオファージのDN
Aが含まれる。この発明においてはファージDNA及び細菌
プラスミドの両者を使用した。しかしながら他のタイプ
の移転ベクターを使用することができることが理解でき
よう。このような移転ベクターを形成し、そしてこれを
微生物に導入する一般的な方法はよく知られている。
例にはプラスミド及びある種のバクテリオファージのDN
Aが含まれる。この発明においてはファージDNA及び細菌
プラスミドの両者を使用した。しかしながら他のタイプ
の移転ベクターを使用することができることが理解でき
よう。このような移転ベクターを形成し、そしてこれを
微生物に導入する一般的な方法はよく知られている。
この発明はさらに前記の移転ベクターのいずれかによ
り形質転換された原核細胞及び真核細胞を包含する。
り形質転換された原核細胞及び真核細胞を包含する。
非常に親しまれているエッセリヒア・コリ（Escherichia col
i）が好ましい微生物の１つであるが、他の任意の適当
な微生物を使用することもできる。
i）が好ましい微生物の１つであるが、他の任意の適当
な微生物を使用することもできる。
この発明の他の観点に従えば、ヒト−プレプロレラキ
シンをコードするデオキシヌクレオチド配列を、制限酵
素によって移転ベクターを切断することにより調製され
たDNA分子と連結することを特徴とする、ヒト−プレプ
ロレラキシンをコードするデオキシヌクレオチド配列を
維持しそして複製するために使用するDNA移転ベクター
の製造方法が提供される。
シンをコードするデオキシヌクレオチド配列を、制限酵
素によって移転ベクターを切断することにより調製され
たDNA分子と連結することを特徴とする、ヒト−プレプ
ロレラキシンをコードするデオキシヌクレオチド配列を
維持しそして複製するために使用するDNA移転ベクター
の製造方法が提供される。
同様にして、適当なデオキシヌクレオチドから、ヒト
−プロレラキシンをコードするデオキシヌクレオチド配
列、並びにヒト−レラキシンのＡ鎖及びＢ鎖をコードす
るデオキシヌクレオチド配列を維持し、そして複製する
ために使用するDNA移転ベクターを調製することができ
る。
−プロレラキシンをコードするデオキシヌクレオチド配
列、並びにヒト−レラキシンのＡ鎖及びＢ鎖をコードす
るデオキシヌクレオチド配列を維持し、そして複製する
ために使用するDNA移転ベクターを調製することができ
る。
Ａペプチド鎖及びＢペプチド鎖、並びにプロレラキシ
ン及びプレプロレラキシンは、通常の遺伝子発現方法に
より、すなわち適切に導入された移転ベクターを含有す
る細胞を増殖せしめ、そして該細胞により生産された目
的ペプチドを分離し、そして精製することにより製造す
ることができる。
ン及びプレプロレラキシンは、通常の遺伝子発現方法に
より、すなわち適切に導入された移転ベクターを含有す
る細胞を増殖せしめ、そして該細胞により生産された目
的ペプチドを分離し、そして精製することにより製造す
ることができる。
この発明はさらに、上記の方法により調製された、ヒ
ト−プレプロレラキシンをコードするデオキシヌクレオ
チドを含んで成る発現移転ベクターにより形質転換され
た細胞を培養することを特徴とする、Ｃ末端配列として
ヒト−プレプロレラキシンのアミノ酸配列を含みそして
Ｎ末端配列として真核性又は原核性蛋白質の一部分を含
んで成る融合蛋白質の製造方法を包含する。
ト−プレプロレラキシンをコードするデオキシヌクレオ
チドを含んで成る発現移転ベクターにより形質転換され
た細胞を培養することを特徴とする、Ｃ末端配列として
ヒト−プレプロレラキシンのアミノ酸配列を含みそして
Ｎ末端配列として真核性又は原核性蛋白質の一部分を含
んで成る融合蛋白質の製造方法を包含する。
同様にして、ヒト−プロレラキシン、並びにヒト−レ
ラキシンのＡ鎖及びＢ鎖を含んで成る融合蛋白質を製造
することができる。
ラキシンのＡ鎖及びＢ鎖を含んで成る融合蛋白質を製造
することができる。
こうして得られた融合ペプチド生成物は、所望のペプ
チドが宿主に特異的な原核性又は真核性蛋白質の一部に
連結された融合蛋白質の形で存在するであろう。このよ
うな融合蛋白質も又この発明を構成する。
チドが宿主に特異的な原核性又は真核性蛋白質の一部に
連結された融合蛋白質の形で存在するであろう。このよ
うな融合蛋白質も又この発明を構成する。
この発明はさらに、前記の方法により調製された前記
のヒト−プロレラキシンをコードするデオキシヌクレオ
チド配列を含んで成る発現移転ベクターにより形成転換
された細胞を、ヒト−プロレラキシンをコードする前記
の配列の発現に適する条件下で培養し、そして前記細胞
の分解物又は培養液からヒト−プロレラキシンを精製す
ることを特徴とする、Ｃペプチドにより相互に分離され
たＡペプチド及びＢペプチドを含んで成るヒト−プロレ
ラキシンの合成方法も包含する。
のヒト−プロレラキシンをコードするデオキシヌクレオ
チド配列を含んで成る発現移転ベクターにより形成転換
された細胞を、ヒト−プロレラキシンをコードする前記
の配列の発現に適する条件下で培養し、そして前記細胞
の分解物又は培養液からヒト−プロレラキシンを精製す
ることを特徴とする、Ｃペプチドにより相互に分離され
たＡペプチド及びＢペプチドを含んで成るヒト−プロレ
ラキシンの合成方法も包含する。
任意の適当な公知の切断法により、融合生成物から目
的ペプチドを回収することができる。
的ペプチドを回収することができる。
すでに記載したごとく、コードンの除去／置換／付加
により移転ベクターを変形することができ、このような
変形により変形された融合ペプチドが生ずる。このよう
にして適当な変形を行うことにり、融合ペプチドの切
断、例えばB/CもしくはC/A鎖結合部における切断を促進
し、又は次に行う化学的もしくは生物学的処理の間にお
けるペプチド鎖の挙動を変えることができる。
により移転ベクターを変形することができ、このような
変形により変形された融合ペプチドが生ずる。このよう
にして適当な変形を行うことにり、融合ペプチドの切
断、例えばB/CもしくはC/A鎖結合部における切断を促進
し、又は次に行う化学的もしくは生物学的処理の間にお
けるペプチド鎖の挙動を変えることができる。
前記のごとく、この発明はさらにヒト−レラキシン、
プロレラキシン及びプレプロレラキシンを提供する。
プロレラキシン及びプレプロレラキシンを提供する。
レラキシンは、インスリンの製造のために現在知られ
ている任意の方法により別々のＡ鎖及びＢ鎖を直接結合
することにより製造することができる。
ている任意の方法により別々のＡ鎖及びＢ鎖を直接結合
することにより製造することができる。
又、インスリンの場合と同様に、前記のようにして製
造されたレラキシンのＡペプチド及びＢペプチド上のス
ルヒドリル基を酸化するか、又は他の方法で転換して該
Ａペプチド及びＢペプチド間にジスルフィド架橋を形成
させ、そして次にＣペプチドを除去することにより、例
えばＣペプチドとＡ及びＢペプチドとの間の結合に特異
的な酵素的加水分解により除去することにより、プロレ
ラキシンからレラキシンを製造することができる。
造されたレラキシンのＡペプチド及びＢペプチド上のス
ルヒドリル基を酸化するか、又は他の方法で転換して該
Ａペプチド及びＢペプチド間にジスルフィド架橋を形成
させ、そして次にＣペプチドを除去することにより、例
えばＣペプチドとＡ及びＢペプチドとの間の結合に特異
的な酵素的加水分解により除去することにより、プロレ
ラキシンからレラキシンを製造することができる。
従って、この発明はさらに、レラキシンのＡ鎖及びＢ
鎖（完全な長さにおいて、又は短縮されたもしくは変形
された長さにおいて）を、ヒト−インスリンのＡ鎖及び
Ｂ鎖の結合のために知られている方法によって結合せし
めることから成るヒト−レラキシンの合成方法を提供す
る。
鎖（完全な長さにおいて、又は短縮されたもしくは変形
された長さにおいて）を、ヒト−インスリンのＡ鎖及び
Ｂ鎖の結合のために知られている方法によって結合せし
めることから成るヒト−レラキシンの合成方法を提供す
る。
この方法の１つは、Ｓ−スルホン化されたＡ鎖及びＢ
鎖の混合物を還元し、そして次にこの混合物を空気中で
酸化することから成る。
鎖の混合物を還元し、そして次にこの混合物を空気中で
酸化することから成る。
発明者等はさらに、Ａ鎖及びＢ鎖の一方又は両方がＳ
−スルホ形ではなくＳ−チオエチル−cys誘導体の形で
ある場合に上記方法の効率が改良されることを見出し
た。
−スルホ形ではなくＳ−チオエチル−cys誘導体の形で
ある場合に上記方法の効率が改良されることを見出し
た。
発明者等は、オーストラリア特許出願第15413/83号
（PF 4385/82）において、生物学的活性の有意な喪失を
伴わないレラキシンのＡ鎖及びＢ鎖の一方又は両者のア
ミノ末端及び／又はカルボキシ末端を短縮することがで
き、これにより結合収率を改良することができることを
示した。
（PF 4385/82）において、生物学的活性の有意な喪失を
伴わないレラキシンのＡ鎖及びＢ鎖の一方又は両者のア
ミノ末端及び／又はカルボキシ末端を短縮することがで
き、これにより結合収率を改良することができることを
示した。
この発明の他の観点に従えば、短縮されそして／又は
変形された天然Ｂペプチド鎖及びＡペプチド鎖により本
質上構成されるヒト−レラキシン類似体が提供される。
変形された天然Ｂペプチド鎖及びＡペプチド鎖により本
質上構成されるヒト−レラキシン類似体が提供される。
この発明の上記の観点に従えば、短縮されそして／又
は変形されたＢペプチド鎖及び／又はＡペプチド鎖を形
成し、そして次に上記の任意の方法によって前記のペプ
チド鎖を結合せしめる段階を含んで成るヒト−レラキシ
ン類似体の製造方法が提供される。
は変形されたＢペプチド鎖及び／又はＡペプチド鎖を形
成し、そして次に上記の任意の方法によって前記のペプ
チド鎖を結合せしめる段階を含んで成るヒト−レラキシ
ン類似体の製造方法が提供される。
発明者等の研究により、レラキシン活性はＡ（10〜2
4）から成る短いＡ鎖及びＢ（10〜22）からなる短いＢ
鎖により生ずることが示された。もっとも、実際的に予
想される最小鎖はＡ（４〜24）及びＢ（４〜23）であ
る。
4）から成る短いＡ鎖及びＢ（10〜22）からなる短いＢ
鎖により生ずることが示された。もっとも、実際的に予
想される最小鎖はＡ（４〜24）及びＢ（４〜23）であ
る。
一般に、Ａ鎖はＡ（１〜24）ないしＡ（10〜24）の範
囲で変化することができ、Ｂ鎖はＢ（１〜32）ないしＢ
（10〜22）の範囲で変化することができる。
囲で変化することができ、Ｂ鎖はＢ（１〜32）ないしＢ
（10〜22）の範囲で変化することができる。
好ましい組合わせは、 から誘導される。
この発明におけるＢ鎖及び／又はＡ鎖の変形は、前記
の「遺伝的」変形、及びこの発明の結合に先立つＢ鎖及
び／又はＡ鎖の化学的変形（完全な長さにおける又は短
縮された形における）が含まれる。２つのタイプの変形
を単独で又は組合わせて用いることができる。
の「遺伝的」変形、及びこの発明の結合に先立つＢ鎖及
び／又はＡ鎖の化学的変形（完全な長さにおける又は短
縮された形における）が含まれる。２つのタイプの変形
を単独で又は組合わせて用いることができる。
第１のタイプの変形は、天然の又は短縮されたＢ鎖及
び／又はＡ鎖における１個又は複数個のアミノ酸の変形
に関する。一般にこのような変形にはそれ自体公知の方
法による１個又は複数個のアミノ酸上の活性基の保護が
含まれ、そして所望により、保護基は（変形された）Ａ
鎖及びＢ鎖の結合の後除去される。
び／又はＡ鎖における１個又は複数個のアミノ酸の変形
に関する。一般にこのような変形にはそれ自体公知の方
法による１個又は複数個のアミノ酸上の活性基の保護が
含まれ、そして所望により、保護基は（変形された）Ａ
鎖及びＢ鎖の結合の後除去される。
このようなタイプの変形の例には、Ｎ末端アミノ基を
含む遊離アミノ基のアセチル化、ホルミル化もしくはこ
れらと同様の保護、Ｃ末端基のアミド化、又はヒドロキ
シル基もしくはカルボキシル基のエステル形成が含まれ
る。ホルミル基が容易に除去しうる保護基の代表例であ
る。
含む遊離アミノ基のアセチル化、ホルミル化もしくはこ
れらと同様の保護、Ｃ末端基のアミド化、又はヒドロキ
シル基もしくはカルボキシル基のエステル形成が含まれ
る。ホルミル基が容易に除去しうる保護基の代表例であ
る。
第２のタイプの変形には、Ｂ鎖及び／又はＡ鎖中の１
個又は複数個の天然アミノ酸の他のアミノ酸（Ｄ−型の
天然アミノ酸を含む）による置換が含まれる。また、こ
のタイプの変形には鎖からの天然アミノ酸の除去、又は
鎖への１個もしくは複数個の余分のアミノ酸の付加が含
まれる。
個又は複数個の天然アミノ酸の他のアミノ酸（Ｄ−型の
天然アミノ酸を含む）による置換が含まれる。また、こ
のタイプの変形には鎖からの天然アミノ酸の除去、又は
鎖への１個もしくは複数個の余分のアミノ酸の付加が含
まれる。
このような変形の目的は、生成物、すなわちレラキシ
ンもしくはその類似体の活性を維持しながらＡ鎖及びＢ
鎖の結合収率を上昇せしめること、又は所定の結合収率
において生成物の活性を上昇せしめ又は変えることにあ
る。このような変化は、レラキシン遮断効果又はレラキ
シン拮抗効果を有する合成類似体の製造にも適用するこ
とができよう。
ンもしくはその類似体の活性を維持しながらＡ鎖及びＢ
鎖の結合収率を上昇せしめること、又は所定の結合収率
において生成物の活性を上昇せしめ又は変えることにあ
る。このような変化は、レラキシン遮断効果又はレラキ
シン拮抗効果を有する合成類似体の製造にも適用するこ
とができよう。
第１のタイプの変形の特定の例はホルミル基の付加に
よるB2のトリプトファン残基の変形である。
よるB2のトリプトファン残基の変形である。
第２のタイプの変形の特性の例は、B24のメチオニン
のノルロイシン（Nle）、バリン（Val）、アラニン（Al
a）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）又はホモセリン
（Homo Ser）による置換である。
のノルロイシン（Nle）、バリン（Val）、アラニン（Al
a）、グリシン（Gly）、セリン（Ser）又はホモセリン
（Homo Ser）による置換である。
上記の観点において、この発明は、この発明に従って
上記のごとく変形された天然の又は短縮されたＢ鎖及び
／又はＡ鎖から形成されるヒト−レラキシンを包含す
る。
上記のごとく変形された天然の又は短縮されたＢ鎖及び
／又はＡ鎖から形成されるヒト−レラキシンを包含す
る。
Ａペプチド鎖及びＢペプチド鎖、並びにさらにプロレ
ラキシン及びプレプロレラキシンは通常の遺伝子発現法
により、すなわち適当に形成された移転ベクターを含有
する微生物を増殖せしめ、そして該微生物により生産さ
れた目的ペプチドを分離しそして精製することにより製
造することができる。
ラキシン及びプレプロレラキシンは通常の遺伝子発現法
により、すなわち適当に形成された移転ベクターを含有
する微生物を増殖せしめ、そして該微生物により生産さ
れた目的ペプチドを分離しそして精製することにより製
造することができる。
こうして得られたペプチド生成物は、目的ペプチドが
原核性蛋白質の一部と連結されている融合蛋白質の形で
存在することができる。
原核性蛋白質の一部と連結されている融合蛋白質の形で
存在することができる。
次に、実験方法及びそれにより得られた結果を記載す
ることによりこの発明をさらに具体的に説明する。
ることによりこの発明をさらに具体的に説明する。
A.実験方法 （ｉ）細菌及びファージの株 すでに記載されている（７）ように、豚−レラキシン
cDNA挿入部を含有する組換プラスミド（pBR322）の細菌
宿主としてE. コリ RR1を使用した。
cDNA挿入部を含有する組換プラスミド（pBR322）の細菌
宿主としてE. コリ RR1を使用した。
ヒト−ゲノムクローンのライブラリーはT.マニアチス
（Maniatis）氏から入手した。ヒト−DNAのHae III/Alu
I部分分解により得られた約15〜20kbのゲノムDNA断片
（９）をリンカーによりλファージCharon 4 A（10）に
クローニングし、そしてE. コリ LE392細胞中で増加せし
めた。
（Maniatis）氏から入手した。ヒト−DNAのHae III/Alu
I部分分解により得られた約15〜20kbのゲノムDNA断片
（９）をリンカーによりλファージCharon 4 A（10）に
クローニングし、そしてE. コリ LE392細胞中で増加せし
めた。
ファージDNA（クローン選択の後）は、１の培養液
中E. コリ DP50 supFの溶菌の後に調製した。
中E. コリ DP50 supFの溶菌の後に調製した。
DNA小断片（ファージDNAの分解により得られたもの）
を、配列分析のためにM13バクテリアオファージベクタ
ーmp7.1、mp8及びmp9〔J.メッシング（Messing）教授か
ら入手〕にサブクローニングし、そしてE. コリ JM101細
胞に導入して形質転換した。
を、配列分析のためにM13バクテリアオファージベクタ
ーmp7.1、mp8及びmp9〔J.メッシング（Messing）教授か
ら入手〕にサブクローニングし、そしてE. コリ JM101細
胞に導入して形質転換した。
（ii）ハイブリド形成ブローブ（豚DNA）の調製 牛胸腺DNAの変性されたランダムプライマー（３又は
４塩基）を用いて種々のDNA断片上でプライム合成を行
うことにより放射性標識プローブを調製した（11）。豚
−DNAテンプレート（100〜200ng）をランダムプライー
と共に20μｌの水中で２分間煮沸することにより変性し
た。50mMトリス−HCl（pH8.0）、50mM NaCl、1mM DTT、
10mM Mg Cl2、５ユニット（Ｕ）のE. コリ DNAポリメラ
ーゼ１、それぞれ500μＭずつのdCTP、dGTP、dTTP、及
び0.3μM α−〔32P〕−dATP〔約3000Ci/mmol、アマー
シャム（Amersham）〕を含有する反応混合物30μｌを加
えることにより合成を開始した。37℃にて30分間インキ
ュベートした後、0.3M NaCl、10mMトリス−HCl（pH8.
0）、1mM EDTAを含有する緩衝液300μｌにより稀釈する
ことにより反応を停止し、そして同じ緩衝液中セファデ
ックス−G50カラム（1cm×5cm）を通過せしめる。放射
性標識プローブをボイドボリウム（void volume）にお
けるピーク分画から集め、そして担体としてtRNA（10μ
ｇ）を用いながら２容量のエタノールにより、−20℃に
て２時間沈澱せしめた。
４塩基）を用いて種々のDNA断片上でプライム合成を行
うことにより放射性標識プローブを調製した（11）。豚
−DNAテンプレート（100〜200ng）をランダムプライー
と共に20μｌの水中で２分間煮沸することにより変性し
た。50mMトリス−HCl（pH8.0）、50mM NaCl、1mM DTT、
10mM Mg Cl2、５ユニット（Ｕ）のE. コリ DNAポリメラ
ーゼ１、それぞれ500μＭずつのdCTP、dGTP、dTTP、及
び0.3μM α−〔32P〕−dATP〔約3000Ci/mmol、アマー
シャム（Amersham）〕を含有する反応混合物30μｌを加
えることにより合成を開始した。37℃にて30分間インキ
ュベートした後、0.3M NaCl、10mMトリス−HCl（pH8.
0）、1mM EDTAを含有する緩衝液300μｌにより稀釈する
ことにより反応を停止し、そして同じ緩衝液中セファデ
ックス−G50カラム（1cm×5cm）を通過せしめる。放射
性標識プローブをボイドボリウム（void volume）にお
けるピーク分画から集め、そして担体としてtRNA（10μ
ｇ）を用いながら２容量のエタノールにより、−20℃に
て２時間沈澱せしめた。
（iii）スクリーニング法 ゲノムDNA断片を含有するλファージをソフトアガー
上、直径13cmのプレート当り約105ファージの密度で増
殖せしめ、そしてベントン（Benton）及びデービス（Da
vis）の方法（12）によりニトロセルロース紙〔シュ
ライカーアンドシュル（Schleicher ＆ Schull）BA85〕
に移した（12）。紙を、５×SSC及び25％ホルムアミ
ドを含有する改変されたデンハート（Denhart）の溶液
中で40℃にて18時間、放射性標識プローブと共にハイブ
リド形成せしめた（13）。紙を、２×SSC中で30℃に
て１時間洗浄し、その後で24時間にわたりＸ−線フィル
ム（コダックXS−５）を露光せしめた。プレートのハイ
ブリド形成陽性の領域を培養し、そして単一の陽性プラ
グが得られるまで再スクリーニングを行った。１の培
養液中のE.コリIDP50sup F細胞が溶菌した後にファージを
回収し、そしてマニアチス（10）、及びヤマモト及びア
ルバート（Alberts）（14）の方法に従ってDNAを調製し
た。
上、直径13cmのプレート当り約105ファージの密度で増
殖せしめ、そしてベントン（Benton）及びデービス（Da
vis）の方法（12）によりニトロセルロース紙〔シュ
ライカーアンドシュル（Schleicher ＆ Schull）BA85〕
に移した（12）。紙を、５×SSC及び25％ホルムアミ
ドを含有する改変されたデンハート（Denhart）の溶液
中で40℃にて18時間、放射性標識プローブと共にハイブ
リド形成せしめた（13）。紙を、２×SSC中で30℃に
て１時間洗浄し、その後で24時間にわたりＸ−線フィル
ム（コダックXS−５）を露光せしめた。プレートのハイ
ブリド形成陽性の領域を培養し、そして単一の陽性プラ
グが得られるまで再スクリーニングを行った。１の培
養液中のE.コリIDP50sup F細胞が溶菌した後にファージを
回収し、そしてマニアチス（10）、及びヤマモト及びア
ルバート（Alberts）（14）の方法に従ってDNAを調製し
た。
（iv）DNA配列分析 選択された組換ファージの制限断片を、ファージM13m
p8のEcoRI、PstI又はSma I部位に直接サブクローニング
した。10mMトリス−HCl（pH8.0）、10mM MgCl2、1mM DT
T、1mM ATP、1UのT4 DNA リガーゼ、DNA（100ng）及びM
13ファージベクター（50ng）を含有する反応液20μｌ中
で連結を行った。40℃にて一夜インキュベートした後、
組換DNAをE.コリ JM101細胞に形質転換した（15）。ゲノ
ムスクリーニングについて前記したのと同様にしてコー
ド領域を含有するプラグを選択した。但し、M13ファー
ジを低い密度（103ファージ/9cm直径のプレート）でプ
レートした。陽性プラグを増殖せしめ、単鎖テンプレー
ト形又は複製可能な二重鎖形（rf）を調製した（15）。
単鎖テンプレートの配列を、M13−特異的プライマー
（コラボラティブリザーチ）又はコード領域の種種の配
列に相補的な合成プライマーを用いてサンガー（Sange
r）等の方法（16）に従って直接決定した。サブクロー
ンの完全配列分析は、種々の制限酵素を用いてrf形を複
数の部位で切断し、次に平滑末端連結によりM13にサブ
クローニングし（15）、あるいは断片を直接に末端標識
し、そしてマクサム及びジルバートの方法（17）により
配列決定することにより行った。DNA配列を分析し、そ
してコンピュータを用いて豚及びラットのレラキシン配
列と比較した（18）。
p8のEcoRI、PstI又はSma I部位に直接サブクローニング
した。10mMトリス−HCl（pH8.0）、10mM MgCl2、1mM DT
T、1mM ATP、1UのT4 DNA リガーゼ、DNA（100ng）及びM
13ファージベクター（50ng）を含有する反応液20μｌ中
で連結を行った。40℃にて一夜インキュベートした後、
組換DNAをE.コリ JM101細胞に形質転換した（15）。ゲノ
ムスクリーニングについて前記したのと同様にしてコー
ド領域を含有するプラグを選択した。但し、M13ファー
ジを低い密度（103ファージ/9cm直径のプレート）でプ
レートした。陽性プラグを増殖せしめ、単鎖テンプレー
ト形又は複製可能な二重鎖形（rf）を調製した（15）。
単鎖テンプレートの配列を、M13−特異的プライマー
（コラボラティブリザーチ）又はコード領域の種種の配
列に相補的な合成プライマーを用いてサンガー（Sange
r）等の方法（16）に従って直接決定した。サブクロー
ンの完全配列分析は、種々の制限酵素を用いてrf形を複
数の部位で切断し、次に平滑末端連結によりM13にサブ
クローニングし（15）、あるいは断片を直接に末端標識
し、そしてマクサム及びジルバートの方法（17）により
配列決定することにより行った。DNA配列を分析し、そ
してコンピュータを用いて豚及びラットのレラキシン配
列と比較した（18）。
B.結果 次に、図面を用いて検討する。
第１図はゲノムクローンの制限酵素地図の概略を示
す。
す。
大きさをキロ・塩基対（kb）で示し、そして切断部位
をEcoRI（Ｒ）、PstI（Ｐ）、及びHpaII（Ｈ）として示
す。ゲノムクローンλH5はＣペプチド（エクソンII）中
のAluI部位（第１図中の＊）に付加されたEcoRIリンカ
ーに末端を有する。コード領域を含む最終的なヌクレオ
チド配列は、ゲノムクローンλH7から次のようにして編
集した。すなわち、Eco RI及びPst I断片をM13mp8にサ
ブクローニングし、そして次に （１）M13テンプレート上で直接配列決定する〔第１図
中破線（−−−−）で示されている〕、 （２）合成ヌクレオチドプライマーを用いて直接配列決
定する〔点線（……）で示されている〕、 （３）DNA断片を末端標識し、そして化学的分解により
配列決定する〔実線（−）で示されている〕、 のいずれかを行う。配列決定に使用したプライマーは
（ａ）５′TTCGCAATAGGCA及び（ｂ）５′GCACAATTAGCT
である。
をEcoRI（Ｒ）、PstI（Ｐ）、及びHpaII（Ｈ）として示
す。ゲノムクローンλH5はＣペプチド（エクソンII）中
のAluI部位（第１図中の＊）に付加されたEcoRIリンカ
ーに末端を有する。コード領域を含む最終的なヌクレオ
チド配列は、ゲノムクローンλH7から次のようにして編
集した。すなわち、Eco RI及びPst I断片をM13mp8にサ
ブクローニングし、そして次に （１）M13テンプレート上で直接配列決定する〔第１図
中破線（−−−−）で示されている〕、 （２）合成ヌクレオチドプライマーを用いて直接配列決
定する〔点線（……）で示されている〕、 （３）DNA断片を末端標識し、そして化学的分解により
配列決定する〔実線（−）で示されている〕、 のいずれかを行う。配列決定に使用したプライマーは
（ａ）５′TTCGCAATAGGCA及び（ｂ）５′GCACAATTAGCT
である。
第２図はヒト−レラキシン遺伝子のコード領域を示
す。
す。
ヒト−プレプロレラキシンのアミノ酸配列及びmRNA配
列（上段）と豚−レラキシンの配列（下段）との比較を
第３図に示す。同一部分が最大になるように配列を配置
してあり、ヌクレオチドが同一である部分がスター印に
より示されており、そしてアミノ酸が同一である部分が
箱で囲んである。アミノ酸にはＢ鎖の出発部位から番号
が付してある。エクソン／イントロン／エクソン境堺に
おけるイントロン配列は小文字でDNA表記されている。
列（上段）と豚−レラキシンの配列（下段）との比較を
第３図に示す。同一部分が最大になるように配列を配置
してあり、ヌクレオチドが同一である部分がスター印に
より示されており、そしてアミノ酸が同一である部分が
箱で囲んである。アミノ酸にはＢ鎖の出発部位から番号
が付してある。エクソン／イントロン／エクソン境堺に
おけるイントロン配列は小文字でDNA表記されている。
（ｉ）ゲノムクローンの分離及び特色付け 第３図に示すＣペプチド中のアミノ酸45〜95に対応す
る豚レラキシンcDNAクローンの短い（150bp）断片から
作られたプローブ（７）によりライブラリーをスクリー
ニングすることによりヒト−ゲノムクローンを同定し
た。この断片を、HpaII及びHinf Iによる分解によって
クローンから切り出し、そしてラット及び豚のレラキシ
ン配列の間で最大の相同性のある領域（ヌクレオチドレ
ベルにおいて71％）と対応した。ゲノムクローンバンク
からλH5及びλH7と称する強い陽性を示すファージを分
離した。これらの陽性クローンを、それぞれ５′及び
３′エクソン領域（エクソンＩ及びエクソンIIと称す
る）に特異的な２つの別々の豚−レラキシンcDNAの断片
をプローブとして使用して制限酵素分析によりさらに特
徴付けを行った。２つの断片は、相同のラット−レラキ
シン遺伝子（６）におけるイントロン領域に対応する
（数塩基以内）単一のHpaII部位において豚レラキシンc
DNAクローンを切断することにより生じた。λH5及びλH
7のサザン・ブロット分析により、ヒト−レラキシン遺
伝子のコード領域は3.4kbの単一のイントロンにより中
断されていることが示された（第１図参照）。
る豚レラキシンcDNAクローンの短い（150bp）断片から
作られたプローブ（７）によりライブラリーをスクリー
ニングすることによりヒト−ゲノムクローンを同定し
た。この断片を、HpaII及びHinf Iによる分解によって
クローンから切り出し、そしてラット及び豚のレラキシ
ン配列の間で最大の相同性のある領域（ヌクレオチドレ
ベルにおいて71％）と対応した。ゲノムクローンバンク
からλH5及びλH7と称する強い陽性を示すファージを分
離した。これらの陽性クローンを、それぞれ５′及び
３′エクソン領域（エクソンＩ及びエクソンIIと称す
る）に特異的な２つの別々の豚−レラキシンcDNAの断片
をプローブとして使用して制限酵素分析によりさらに特
徴付けを行った。２つの断片は、相同のラット−レラキ
シン遺伝子（６）におけるイントロン領域に対応する
（数塩基以内）単一のHpaII部位において豚レラキシンc
DNAクローンを切断することにより生じた。λH5及びλH
7のサザン・ブロット分析により、ヒト−レラキシン遺
伝子のコード領域は3.4kbの単一のイントロンにより中
断されていることが示された（第１図参照）。
（ii）ゲノムクローンの配列分析 λH5及びλH7の完全制限分解物をM13ベクターにサブ
クローンし、そしてエクソンＩ及びエクソンIIに特異的
な豚−レラキシンプローブを用いてスクリーニングし
た。陽性のサブクローンの配列を、方法の部〔前記Ａ
（iv）〕に記載した技法を組合わせて用いることにより
決定した。
クローンし、そしてエクソンＩ及びエクソンIIに特異的
な豚−レラキシンプローブを用いてスクリーニングし
た。陽性のサブクローンの配列を、方法の部〔前記Ａ
（iv）〕に記載した技法を組合わせて用いることにより
決定した。
λH7クローンのエクソンII領域は、ＣペプチドのEcoR
I部位から始まりＡ鎖の全コード領域を通って停止コー
ドンに続く2.0kbEcoRI断片に含まれていた（第１図参
照）。Ａ鎖付近の領域に特異的なヌクレオチドプライマ
ーを合成することによりこの断片の配列決定は相当に容
易になった。このプライマーは、全2.0kb断片を含有す
るM13テンプレート上に直接プライムするのに使用し
た。エクソンII中の残りの53bpのＣペプチドを含有する
サブクローンされたEcoRI断片はプローブとして豚cDNA
を用いて同定することができなかった。この領域を含む
配列は、完全なエクソンII領域を含むλH7からのサブク
ローンされたPst I断片により決定した。
I部位から始まりＡ鎖の全コード領域を通って停止コー
ドンに続く2.0kbEcoRI断片に含まれていた（第１図参
照）。Ａ鎖付近の領域に特異的なヌクレオチドプライマ
ーを合成することによりこの断片の配列決定は相当に容
易になった。このプライマーは、全2.0kb断片を含有す
るM13テンプレート上に直接プライムするのに使用し
た。エクソンII中の残りの53bpのＣペプチドを含有する
サブクローンされたEcoRI断片はプローブとして豚cDNA
を用いて同定することができなかった。この領域を含む
配列は、完全なエクソンII領域を含むλH7からのサブク
ローンされたPst I断片により決定した。
λH5のエクソンII領域の配列決定により、これが、λ
H7と同一のＣペプチド中のEcoRI部位から始まるが（第
１図参照）、ゲノムライブラリーの作成中にもとのゲノ
ムDNA中のAlu I部位に付加したEco R Iリンカーにおい
て終るきわめて短い70bpの断片であることが判明した。
従ってλH5はレラキシン遺伝子の不完全なクローンであ
ることが明らかとなり、以後分析を行わなかった。
H7と同一のＣペプチド中のEcoRI部位から始まるが（第
１図参照）、ゲノムライブラリーの作成中にもとのゲノ
ムDNA中のAlu I部位に付加したEco R Iリンカーにおい
て終るきわめて短い70bpの断片であることが判明した。
従ってλH5はレラキシン遺伝子の不完全なクローンであ
ることが明らかとなり、以後分析を行わなかった。
エクソンＩの配列分析は、シグナルペプチド中にEcoR
I部位が存在するためわずかに複雑となり、２つのEcoRI
断片のサブクローンの配列を別々に決定する必要があっ
た。EcoRI部位の重複が、重複配列を含むλH7からのAlu
I断片のサブクローンの同定により支持された。
I部位が存在するためわずかに複雑となり、２つのEcoRI
断片のサブクローンの配列を別々に決定する必要があっ
た。EcoRI部位の重複が、重複配列を含むλH7からのAlu
I断片のサブクローンの同定により支持された。
C.変性されたヒト−レラキシン（hRLX）Ａ（１〜24）−
Ｂ（１〜25）の合成 （ｉ）ヒト−レラキシンＡ鎖、hRLX A（１〜24）の合成 前記の遺伝子クローンのヌクレオチド配列から推定さ
れたヒト−レラキシンＡ鎖の１〜24の残基に対応するア
ミノ酸配列を、メリフィールド（Merrifield）〔例え
ば、バラニー（Barany）G.及びメリフィールドR.B.,The
Peptides,E.Gross及びJ.Meienhofer,アカデミック・プ
レス，ニューヨーク,1〜284頁,1980年〕により記載され
た一般的原理による固相法により合成した。
Ｂ（１〜25）の合成 （ｉ）ヒト−レラキシンＡ鎖、hRLX A（１〜24）の合成 前記の遺伝子クローンのヌクレオチド配列から推定さ
れたヒト−レラキシンＡ鎖の１〜24の残基に対応するア
ミノ酸配列を、メリフィールド（Merrifield）〔例え
ば、バラニー（Barany）G.及びメリフィールドR.B.,The
Peptides,E.Gross及びJ.Meienhofer,アカデミック・プ
レス，ニューヨーク,1〜284頁,1980年〕により記載され
た一般的原理による固相法により合成した。
Ｎ−α−tert−ブチルオキシカルボニル*−４−メチ
ルベンジル−Ｌ−システイン（＊BOCと略す）を、タム
（Tam）等の方法（Synthesis 12,955〜957,1979年）を
用いて、フェニルアセトアミドメチル（PAM）結合を介
して１％架橋ポリエチレン樹脂に、0.30ミリモル/g樹脂
のレベルでカップリングせしめた。BOC−Ｌ−CYS−PAM
樹脂（8.0g）を、ベックマンモデル990ペプチドシンセ
タイザーの反応容器に入れ、そしてそれぞれ適当な保護
アミノ酸を段階的に付加することによって残基23から１
までのアミノ酸配列を組み立てた。各アミノ酸のアミノ
末端BOC保護基は、塩化メチレン中35％トリフルオロ酢
酸により30分間樹脂を処理し、そして次に、塩化メチレ
ン中５％ジイソプロピルエチルアミンにより15分間中和
することにより除去した。それぞれの処理の後、塩化メ
チレンにより樹脂を十分に洗浄した。配列中の次のアミ
ノ酸（α−アミノ基がBOC基により適当に保護されてお
り、必要により側鎖官能基が適当に保護されている、）
を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を使用し
ながら樹脂にカップリングせしめた。樹脂を塩化メチレ
ン中アミノ酸と共に10分間攪拌し、その後で塩化メチレ
ンに溶解したDCCを導入した。各カップリングのために
2.5モルの過剰量（6.0ミリモル）のアミノ酸及びDCCを
使用した。１時間攪拌した後、反応混合物から樹脂のサ
ンプルを取り出し、そしてカイゼル（Kaiser）等のニン
ヒドリン法（Anal.Biochem.,34,595〜598,1970年）を用
いて遊離アミノ基の存在を試験した。ニンヒドリン反応
が陰性であってカップリングが完結したことが示されれ
ば、BOC脱保護、中和及び次のアミノ酸のカップリング
によって反応サイクルを継続した。ニンヒドリン試験陽
性の場合には追加のアミノ酸及びDCCを用いてカップリ
ング反応を反復した。
ルベンジル−Ｌ−システイン（＊BOCと略す）を、タム
（Tam）等の方法（Synthesis 12,955〜957,1979年）を
用いて、フェニルアセトアミドメチル（PAM）結合を介
して１％架橋ポリエチレン樹脂に、0.30ミリモル/g樹脂
のレベルでカップリングせしめた。BOC−Ｌ−CYS−PAM
樹脂（8.0g）を、ベックマンモデル990ペプチドシンセ
タイザーの反応容器に入れ、そしてそれぞれ適当な保護
アミノ酸を段階的に付加することによって残基23から１
までのアミノ酸配列を組み立てた。各アミノ酸のアミノ
末端BOC保護基は、塩化メチレン中35％トリフルオロ酢
酸により30分間樹脂を処理し、そして次に、塩化メチレ
ン中５％ジイソプロピルエチルアミンにより15分間中和
することにより除去した。それぞれの処理の後、塩化メ
チレンにより樹脂を十分に洗浄した。配列中の次のアミ
ノ酸（α−アミノ基がBOC基により適当に保護されてお
り、必要により側鎖官能基が適当に保護されている、）
を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を使用し
ながら樹脂にカップリングせしめた。樹脂を塩化メチレ
ン中アミノ酸と共に10分間攪拌し、その後で塩化メチレ
ンに溶解したDCCを導入した。各カップリングのために
2.5モルの過剰量（6.0ミリモル）のアミノ酸及びDCCを
使用した。１時間攪拌した後、反応混合物から樹脂のサ
ンプルを取り出し、そしてカイゼル（Kaiser）等のニン
ヒドリン法（Anal.Biochem.,34,595〜598,1970年）を用
いて遊離アミノ基の存在を試験した。ニンヒドリン反応
が陰性であってカップリングが完結したことが示されれ
ば、BOC脱保護、中和及び次のアミノ酸のカップリング
によって反応サイクルを継続した。ニンヒドリン試験陽
性の場合には追加のアミノ酸及びDCCを用いてカップリ
ング反応を反復した。
側鎖官能基を有するアミノ酸は次の保護誘導体として
使用した。すなわち、Ｎ−α−BOC−2,6−ジクロロベン
ジル−Ｌ−チロシン、Ｎ−α−BOC−ξ−クロロベンジ
ルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、Ｎ−α−BOC−Ｌ−
セリンＯ−ベンジルエステル、Ｎ−α−アミルオキシカ
ルボニル−NG−トシル−Ｌ−アルギニン、Ｎ−α−BOC
−Ｌ−スレオニンＯ−ベンジルエーテル、Ｎ−α−BOC
−Ｓ−エチルメルカプト−Ｌ−システイン（Ａ−鎖配列
位置15、11及び10のシステイン）、Ｎ−α−BOC−Ｌ−
グルタミン酸−γ−ベンジルエステルである。
使用した。すなわち、Ｎ−α−BOC−2,6−ジクロロベン
ジル−Ｌ−チロシン、Ｎ−α−BOC−ξ−クロロベンジ
ルオキシカルボニル−Ｌ−リジン、Ｎ−α−BOC−Ｌ−
セリンＯ−ベンジルエステル、Ｎ−α−アミルオキシカ
ルボニル−NG−トシル−Ｌ−アルギニン、Ｎ−α−BOC
−Ｌ−スレオニンＯ−ベンジルエーテル、Ｎ−α−BOC
−Ｓ−エチルメルカプト−Ｌ−システイン（Ａ−鎖配列
位置15、11及び10のシステイン）、Ｎ−α−BOC−Ｌ−
グルタミン酸−γ−ベンジルエステルである。
１〜24ペプチド配列の組立てに続き、アミノ末端アル
ギニン上の最後のBOC基を、脱保護中和サイクルを用い
て除去し、そして真空中でペプチド樹脂を乾燥した（ペ
プチド−樹脂の重量17.0g）。ペプチド−樹脂の一部分
（2g）を、アニソール（2ml）の存在下で０℃にて30分
間無水弗化水素（HF）により処理した。オイルポンプ真
空下でHFを急速に除去することにより、樹脂−ペプチド
と弗化水素（HF）との合計接触時間を最小（70分以下）
に保持した。次に、樹脂−ペプチドを酢酸エチルにより
数回洗浄することにより過剰のアニソールを除去し、1M
酢酸によりペプチドを抽出し、そして溶液を凍結乾燥し
た。粗ペプチド（10、11及び15位のシステインはなおＳ
−チオエチル誘導体として保護されている）の収量は44
0mgであった。粗ペプチドの最初の精製は0.1M酢酸中バ
イオゲルP10を用いるゲル過により行った。分子量約3
000に対応する位置でカラムから溶出した最大ピークを
示す分画を集め、そして凍結乾燥した。このペプチドの
サンプルのアミノ酸分析により、１〜24配列のすべての
アミノ酸が正しい比率で存在することが示された。
ギニン上の最後のBOC基を、脱保護中和サイクルを用い
て除去し、そして真空中でペプチド樹脂を乾燥した（ペ
プチド−樹脂の重量17.0g）。ペプチド−樹脂の一部分
（2g）を、アニソール（2ml）の存在下で０℃にて30分
間無水弗化水素（HF）により処理した。オイルポンプ真
空下でHFを急速に除去することにより、樹脂−ペプチド
と弗化水素（HF）との合計接触時間を最小（70分以下）
に保持した。次に、樹脂−ペプチドを酢酸エチルにより
数回洗浄することにより過剰のアニソールを除去し、1M
酢酸によりペプチドを抽出し、そして溶液を凍結乾燥し
た。粗ペプチド（10、11及び15位のシステインはなおＳ
−チオエチル誘導体として保護されている）の収量は44
0mgであった。粗ペプチドの最初の精製は0.1M酢酸中バ
イオゲルP10を用いるゲル過により行った。分子量約3
000に対応する位置でカラムから溶出した最大ピークを
示す分画を集め、そして凍結乾燥した。このペプチドの
サンプルのアミノ酸分析により、１〜24配列のすべての
アミノ酸が正しい比率で存在することが示された。
〔Ｓ−チオエチルCys10,11,15〕−hRLX A（１〜24）ペ
プチドの前記以後の精製は、ウオーターズＣ−18ホンダ
パックカラムを用いる調製用逆相HPLCにより、0.1％TFA
−水／アセトニトリル溶剤系を用いて行った。
プチドの前記以後の精製は、ウオーターズＣ−18ホンダ
パックカラムを用いる調製用逆相HPLCにより、0.1％TFA
−水／アセトニトリル溶剤系を用いて行った。
ケル過により精製したペプチドのサンプル（160m
g）を、ドゥー（Du）等〔Scientia Sinica,10I,84〜104
（1961年）〕に記載された方法に従って、亜硫酸ナトリ
ウム及びナトリウムテトラチオネートの混合物を用いて
（合計反応時間を３時間として）Ｓ−スルホン化した。
Ｓ−スルホン化中に生成した沈澱を過し、そして沈澱
及び上澄液の両者を４℃にて48時間蒸留水に対して透析
した。透析袋の内容物を凍結乾燥することにより、上澄
液から81.4mg、Ｓ−スルホン化反応中に生じた沈澱から
53.2mgのペプチドを得た。「可溶性」〔Ｓ−スルホCys
10,11,15,24〕hRLX A（１〜24）ペプチドのサンプルを
トリス−HCl緩衝液（pH8.3）中DEAE−セルロースを用い
るイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。トリ
ス−HCl緩衝液中NaCl直線勾配（導電率範囲3.0mS〜85.0
mS）によりカラムからペプチドを溶出した。導電率20〜
30mSにおいてイオン交換カラムから溶出する大ピークを
示す分画を透析し、そして凍結乾燥によりペプチドを回
収した。
g）を、ドゥー（Du）等〔Scientia Sinica,10I,84〜104
（1961年）〕に記載された方法に従って、亜硫酸ナトリ
ウム及びナトリウムテトラチオネートの混合物を用いて
（合計反応時間を３時間として）Ｓ−スルホン化した。
Ｓ−スルホン化中に生成した沈澱を過し、そして沈澱
及び上澄液の両者を４℃にて48時間蒸留水に対して透析
した。透析袋の内容物を凍結乾燥することにより、上澄
液から81.4mg、Ｓ−スルホン化反応中に生じた沈澱から
53.2mgのペプチドを得た。「可溶性」〔Ｓ−スルホCys
10,11,15,24〕hRLX A（１〜24）ペプチドのサンプルを
トリス−HCl緩衝液（pH8.3）中DEAE−セルロースを用い
るイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。トリ
ス−HCl緩衝液中NaCl直線勾配（導電率範囲3.0mS〜85.0
mS）によりカラムからペプチドを溶出した。導電率20〜
30mSにおいてイオン交換カラムから溶出する大ピークを
示す分画を透析し、そして凍結乾燥によりペプチドを回
収した。
（ii）短縮されたヒト−レラキシンＢ−鎖、hRLXB（１
〜25）の合成 ヒト−レラキシンＢ−鎖の１〜25の配列に対応するア
ミノ酸配列を前記の方法に従って合成した。この合成
は、0.1ミリモルSer/gの負荷量のＮ−α−tert−ブチル
オキシカルボニル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン−フェニ
ルアセトアミド−メチルポリスチレン樹脂7.0gを用いて
開始した。Ａ鎖の合成において使用した側鎖保護基を、
Ｂ鎖の合成にも使用した。これには10及び22位の両シス
テインのＳ−エチル誘導体が含まれる。４及び５位のア
スパラギン酸はＮ−α−BOC ξ−ベンジルエステル誘導
体として加えた。18位のグルタミンはDMF中のＮ−α−B
OC−Ｌ−グルタミン−ｐ−ニトロフェニルエステルを用
いる活性エステル法によりカップリングせしめた。２位
のトリプトファンのカップリングの後、トリフルオロ酢
酸脱保護剤及びこれに次いて用いる塩化メチレン洗浄液
に0.1％インドールを加えた。
〜25）の合成 ヒト−レラキシンＢ−鎖の１〜25の配列に対応するア
ミノ酸配列を前記の方法に従って合成した。この合成
は、0.1ミリモルSer/gの負荷量のＮ−α−tert−ブチル
オキシカルボニル−Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン−フェニ
ルアセトアミド−メチルポリスチレン樹脂7.0gを用いて
開始した。Ａ鎖の合成において使用した側鎖保護基を、
Ｂ鎖の合成にも使用した。これには10及び22位の両シス
テインのＳ−エチル誘導体が含まれる。４及び５位のア
スパラギン酸はＮ−α−BOC ξ−ベンジルエステル誘導
体として加えた。18位のグルタミンはDMF中のＮ−α−B
OC−Ｌ−グルタミン−ｐ−ニトロフェニルエステルを用
いる活性エステル法によりカップリングせしめた。２位
のトリプトファンのカップリングの後、トリフルオロ酢
酸脱保護剤及びこれに次いて用いる塩化メチレン洗浄液
に0.1％インドールを加えた。
アミノ末端リジン残基からBOC基を除去しそして真空
乾燥した後のペプチド−樹脂の最終重量は12.2gであっ
た。ペプチド−樹脂の一部（5g）を、アニソール（2m
l）の存在下、０℃にて30分間無水弗化水素で処理し、
そしてＡ鎖について前記した方法を用いてＢ鎖ペプチド
を分離した。粗〔Ｓ−チオエチルCys10,22〕hRLXB（１
〜25）（1.40g）を、0.1M酢酸中バイオゲルP10によりゲ
ル過することにより精製し、次に調製用HPLCにより処
理した。
乾燥した後のペプチド−樹脂の最終重量は12.2gであっ
た。ペプチド−樹脂の一部（5g）を、アニソール（2m
l）の存在下、０℃にて30分間無水弗化水素で処理し、
そしてＡ鎖について前記した方法を用いてＢ鎖ペプチド
を分離した。粗〔Ｓ−チオエチルCys10,22〕hRLXB（１
〜25）（1.40g）を、0.1M酢酸中バイオゲルP10によりゲ
ル過することにより精製し、次に調製用HPLCにより処
理した。
ゲル過により精製したペプチドのサンプル（150m
g）を、pH8.3において３時間Ｓ−スルホン化し、反応混
合物を過し、そして沈澱及び上澄液を蒸留水に対して
透析した。凍結乾燥後、92mgの「可溶性」ペプチド及び
55mgの「不溶性」ペプチドが回収された。Ｓ−スルホン
化Ｂ鎖ペプチドを、Ｃ−18逆相カラム及び0.1％TFA−水
−アセトニトリル溶剤系を用いる調製用HPLCによりさら
に精製した。
g）を、pH8.3において３時間Ｓ−スルホン化し、反応混
合物を過し、そして沈澱及び上澄液を蒸留水に対して
透析した。凍結乾燥後、92mgの「可溶性」ペプチド及び
55mgの「不溶性」ペプチドが回収された。Ｓ−スルホン
化Ｂ鎖ペプチドを、Ｃ−18逆相カラム及び0.1％TFA−水
−アセトニトリル溶剤系を用いる調製用HPLCによりさら
に精製した。
（iii）鎖の結合 合成hRLX A（１〜24）及びhRLX B（１〜25）ペプチド
を、チャンス（Chance）及びホフマン（Hoffmann）によ
りインスリンについて記載された方法（オーストラリア
特許出願第68844/81号）を用いて結合せしめた。この方
法においては、Ｓ−スルホン化ペプチドを、A:B＝2:1の
比率で、ペプチドの濃度をグリシン緩衝液（pH10.5）中
10mg/mlとして混合した。次に、グリシン緩衝液中ジチ
オスレイトールを、各Ｓ−スルホ基について合計1.0の
スルヒドリル基が生ずる量において加えた。次に、反応
混合物を開放容器中で24時間攪拌した。
を、チャンス（Chance）及びホフマン（Hoffmann）によ
りインスリンについて記載された方法（オーストラリア
特許出願第68844/81号）を用いて結合せしめた。この方
法においては、Ｓ−スルホン化ペプチドを、A:B＝2:1の
比率で、ペプチドの濃度をグリシン緩衝液（pH10.5）中
10mg/mlとして混合した。次に、グリシン緩衝液中ジチ
オスレイトールを、各Ｓ−スルホ基について合計1.0の
スルヒドリル基が生ずる量において加えた。次に、反応
混合物を開放容器中で24時間攪拌した。
発明者等は、この方法の前記以外の変法として、ペプ
チド鎖の一方又は好ましくは両方を、インスリンの場合
についてチャンス及びホフマンにより記載されたＳ−ス
ルホ形（前記）ではなくＳ−チオエチル−Sys誘導体と
して使用することにより、生物学的に活性なレラキシン
を生成せしめるための鎖結合反応を効果的に行うことが
できることを見出した。Ｓ−チオエチルCysペプチドの
使用により、ペプチドをＳ−スルホ誘導体に転換するの
に必要な反応及び精製段階が必要でなくなる。発明者等
の経験によれば、レラキシンペプチドのＳ−スルホン化
反応にはＳ−スルホペプチドの精製を困難にする傾向を
有する副反応が伴い、これにより収量が低下する。
チド鎖の一方又は好ましくは両方を、インスリンの場合
についてチャンス及びホフマンにより記載されたＳ−ス
ルホ形（前記）ではなくＳ−チオエチル−Sys誘導体と
して使用することにより、生物学的に活性なレラキシン
を生成せしめるための鎖結合反応を効果的に行うことが
できることを見出した。Ｓ−チオエチルCysペプチドの
使用により、ペプチドをＳ−スルホ誘導体に転換するの
に必要な反応及び精製段階が必要でなくなる。発明者等
の経験によれば、レラキシンペプチドのＳ−スルホン化
反応にはＳ−スルホペプチドの精製を困難にする傾向を
有する副反応が伴い、これにより収量が低下する。
上記の条件を使用すれば、ウイックビスト（Wiqvis
t）及びパウル（Paul）（Acta Endocrinol.,29,135〜13
6,1958）のラット子宮収縮測定における生物学的活性に
より測定した場合0.24〜3.1％の鎖結合収率が達成され
た。
t）及びパウル（Paul）（Acta Endocrinol.,29,135〜13
6,1958）のラット子宮収縮測定における生物学的活性に
より測定した場合0.24〜3.1％の鎖結合収率が達成され
た。
鎖結合反応の例 ヒト−レラキシン〔Ｓ−チオエチルCys10,11,15〕Ａ
（１〜24）（乾燥重量3.60mg、アミノ酸分析によるペプ
チド量2.0mg、0.68μモル）を、3mlのプラスチック製蓋
付き遠心チューブ中で200μｌの0.1Mグリシン緩衝液（p
H10.5）に溶解した。ヒト−レラキシン〔Ｓ−スルホCys
10,11〕Ｂ（１〜25）（1.89mg、アミノ酸分析によるペ
プチド量1.0mg、0.33μモル）を100μｌの0.1Mグリシン
緩衝液（pH10.5）中に溶解し、そしてこれを前記の溶液
に加え、そして混合物を攪拌した。0.1Mグリシン緩衝液
（pH10.5）中に調製したジチオスレイトール（DTT）の
ストック溶液（10ml中1.15モルDTT）のアリコート（15.
2μｌ、1.73μモルDTT）をペプチド溶液に加え、そして
短時間攪拌した後、反応混合物を空気に開放して４℃に
て24時間静置した。次に混合物を遠心分離し、そして上
澄液のアリコートのレラキシン生物学的活性をラット子
宮収縮測定により測定した。反応混合物のアリコート
は、投与量に依存してラットの子宮の自発収縮を阻害し
た。75μｌのアリコートにより子宮収縮が完全に阻害さ
れ、これは、天然豚−レラキシンA22B31標準と比較した
場合0.70％の鎖結合収率に相当する。
（１〜24）（乾燥重量3.60mg、アミノ酸分析によるペプ
チド量2.0mg、0.68μモル）を、3mlのプラスチック製蓋
付き遠心チューブ中で200μｌの0.1Mグリシン緩衝液（p
H10.5）に溶解した。ヒト−レラキシン〔Ｓ−スルホCys
10,11〕Ｂ（１〜25）（1.89mg、アミノ酸分析によるペ
プチド量1.0mg、0.33μモル）を100μｌの0.1Mグリシン
緩衝液（pH10.5）中に溶解し、そしてこれを前記の溶液
に加え、そして混合物を攪拌した。0.1Mグリシン緩衝液
（pH10.5）中に調製したジチオスレイトール（DTT）の
ストック溶液（10ml中1.15モルDTT）のアリコート（15.
2μｌ、1.73μモルDTT）をペプチド溶液に加え、そして
短時間攪拌した後、反応混合物を空気に開放して４℃に
て24時間静置した。次に混合物を遠心分離し、そして上
澄液のアリコートのレラキシン生物学的活性をラット子
宮収縮測定により測定した。反応混合物のアリコート
は、投与量に依存してラットの子宮の自発収縮を阻害し
た。75μｌのアリコートにより子宮収縮が完全に阻害さ
れ、これは、天然豚−レラキシンA22B31標準と比較した
場合0.70％の鎖結合収率に相当する。
HI−遺伝子配列に基づく他の合成ヒトレラキシンペプチ
ド 次表中に掲げた合成レラキシンペプチドを、第２図に
示したHIヒトレラキシン遺伝子配列から誘導されるＡ鎖
およびＢ鎖に対するアミノ酸配列から調製した。別々の
ペプチド鎖を調製し次いでＡ（１−24）およびＢ（１−
25）ペプチドに対し先に説明した手順に従って精製し
た。Ｂ（３−25）アミドおよびＢ（１−25）アミドペプ
チドに対し、これらの手順の変法を用いたが、この際PA
M樹脂結合をベンズヒドリルアミン（BHA）ポリスチレン
樹脂に置き代えた。BHA樹脂を用いると、遊離カルボキ
シ形よりもむしろアミド形のＣ−末端を有するペプチド
が形成する。
ド 次表中に掲げた合成レラキシンペプチドを、第２図に
示したHIヒトレラキシン遺伝子配列から誘導されるＡ鎖
およびＢ鎖に対するアミノ酸配列から調製した。別々の
ペプチド鎖を調製し次いでＡ（１−24）およびＢ（１−
25）ペプチドに対し先に説明した手順に従って精製し
た。Ｂ（３−25）アミドおよびＢ（１−25）アミドペプ
チドに対し、これらの手順の変法を用いたが、この際PA
M樹脂結合をベンズヒドリルアミン（BHA）ポリスチレン
樹脂に置き代えた。BHA樹脂を用いると、遊離カルボキ
シ形よりもむしろアミド形のＣ−末端を有するペプチド
が形成する。
特に言及しない限り、鎖結合反応はＳ−チオエチルCy
s誘導体としてのＡ−鎖及びＳ−スルホCys誘導体として
のＢ−鎖を用いて先に説明した如く行った。
s誘導体としてのＡ−鎖及びＳ−スルホCys誘導体として
のＢ−鎖を用いて先に説明した如く行った。
次表中の全ての合成同族体は、ラットの子宮収縮測定
においてレラキシン−様生物学的作用を示した。別々の
ペプチド鎖の結合収率は、基準として天然の豚レラキシ
ンＡ（１−22）−Ｂ（１−31）を用いるバイオアッセイ
の結果から計算した。
においてレラキシン−様生物学的作用を示した。別々の
ペプチド鎖の結合収率は、基準として天然の豚レラキシ
ンＡ（１−22）−Ｂ（１−31）を用いるバイオアッセイ
の結果から計算した。
文献 1.Hisaw,F.L.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.23,661−663（196
2）。
2）。
2.Schwabe,C.,McDonald,J.K.及びSteinetz,B.C.Bioche
m.Biophys.Res.Commun.75,503−510（1977）。
m.Biophys.Res.Commun.75,503−510（1977）。
3.James,R.,Niall,H.,Kwok,S.及びBryant−Greenwood,
G.Nature,267,544−546（1977）。
G.Nature,267,544−546（1977）。
4.John,M.J.,Walsh,J.R.,Borjesson,B.W.及びNiall,H.
D.Endocrinology108,726−729（1981）。
D.Endocrinology108,726−729（1981）。
5.Schwabe,C.,Gowan,L.K.及びReinig,J.W.,Ann.N.Y.Aca
d.Sci.380,6−12（1982）。
d.Sci.380,6−12（1982）。
6.Hudson,P.,Haley,J.,Cronk,M.,Shine,J.及びNiall,H.
Nature,291,127−131（1981）。
Nature,291,127−131（1981）。
7.Haley,J.,Hudson,P.,Scanlon,D.,John,M.,Cronk,M.,S
hine,J.,Tregear,G.及びNiall,H.DNA1,155−162（198
2）。
hine,J.,Tregear,G.及びNiall,H.DNA1,155−162（198
2）。
8.Dayhoff,M.O.,Schwartz,R.M.,Chen,H.R.,Hunt,L.T.,B
arker,W.C.及びOrcutt,B.C.DNA151−58（1981）。
arker,W.C.及びOrcutt,B.C.DNA151−58（1981）。
9.Lawn,R.M.,Fritsch,E.F.,Parker,R.C.Blake,G.及びMa
niatis,T.Cell,151157−1174（1978）。
niatis,T.Cell,151157−1174（1978）。
10.Maniatis,T.,Hardison,R.E.,Lacy,E.,Lauer,J.,O′C
onnell,C.,及びQuon,D.Cell15,678−701（1978）。
onnell,C.,及びQuon,D.Cell15,678−701（1978）。
11.Taylor,J.M.Illmersee,R.,及びSummers,J.Biochim.B
iophys.Acta442324−330（1976）。
iophys.Acta442324−330（1976）。
12.Benton,W.D.及びDavis,R.Science196,180−183（197
7）。
7）。
13.Denhardt,D.T.Biochem.Biophys.Res.Commun.23,641
−646（1966）。
−646（1966）。
14.Yamamoto,K.R.及びAlberts,B.M.Virology40,734−74
4（1970）。
4（1970）。
15.Sanger,F.,Coulson,A.R.,Barrell,B.G.,Smith,A.J.
A.及びRoe,B.A.J.Mol.Biol.143,161−178（1980）。
A.及びRoe,B.A.J.Mol.Biol.143,161−178（1980）。
16.Sanger,F.,Nicklen,S.及びCoulson,A.R.Proc.Natn.A
cad.Sci.74,5463−5467（1977）。
cad.Sci.74,5463−5467（1977）。
17.Maxam,A.M.及びGilbert,W.Proc.Natn.Acad.Sci.74,5
60−564（1977）。
60−564（1977）。
18.Staden,R.Nucl.Acids,Res.6,2601−2610（1979）。
第１図は２つのゲノムクローンの制限酵素地図を示し、
第２図はヒト−レラキシン遺伝子のコード領域のmRNA配
列及びヒト−プレプロレラキシンのアミノ酸配列を示
し、そして第３図はヒト−プレプロレラキシン及びmRNA
と豚−プレプロレラキシンの対応する配列との比較を示
す。
第２図はヒト−レラキシン遺伝子のコード領域のmRNA配
列及びヒト−プレプロレラキシンのアミノ酸配列を示
し、そして第３図はヒト−プレプロレラキシン及びmRNA
と豚−プレプロレラキシンの対応する配列との比較を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヒユ−・デイビツト・ナイアル オ−ストラリア国ビクトリア・エルウツ ド・ベンデイゴ・アベニユ３ (72)発明者 ジエフリ−・ウイリアム・トリ−ガ− オ−ストラリア国ビクトリア・オ−スオ −ルン・オ−スオ−ルン・グロ−ブ62
Claims (7)
- 【請求項１】（ａ）以下のアミノ酸配列を有するヒトH1
−レラキシンのＡ鎖 ： または該Ａ鎖のアミノ末端から４個以下のアミノ酸の除
去により短縮された該Ａ鎖の類似体；および （ｂ）以下のアミノ酸配列を有するヒトH1−レラキシン
のＢ鎖 ： または該Ｂ鎖のアミノ末端からの３個以下のアミノ酸の
除去および／またはカルボキシ末端からの９個以下のア
ミノ酸の除去により短縮された該Ｂ鎖の類似体；を含有
する、ヒトH1−レラキシン活性を有するポリペプチドを
コードしている単離されたヌクレオチド 。 - 【請求項２】ヒトH1−レラキシンＡ鎖 を、ヒトH1−レ
ラキシンＢ鎖または該Ｂ鎖のアミノ末端からの３個以下
のアミノ酸の除去および／またはカルボキシ末端からの
９個以下のアミノ酸の除去により短縮された該Ｂ鎖の類
似体のいずれかと共にコードしている請求項１に記載の
単離されたヌクレオチド 。 - 【請求項３】以下のアミノ酸配列を有するヒトH1−レラ
キシンのＣ鎖： または、B/CおよびC/A鎖の連結点での切断およびその後
のＣ鎖の切除を容易にするように該連結点が修飾された
Ｃ鎖の誘導体をさらにコードしている請求項１に記載の
単離されたヌクレオチド 。 - 【請求項４】（ａ）以下のアミノ酸配列を有するヒトH1
−レラキシンのＡ鎖 ： または該Ａ鎖のアミノ末端からの４個以下のアミノ酸の
除去により短縮された該Ａ鎖の類似体；および （ｂ）以下のアミノ酸配列を有するヒトH1−レラキシン
のＢ鎖 ： または該Ｂ鎖のアミノ末端からの３個以下のアミノ酸の
除去および／またはカルボキシ末端からの９個以下のア
ミノ酸の除去により短縮された該Ｂ鎖の類似体；をコー
ドしているヌクレオチド を含有するクローニングベク
ター。 - 【請求項５】以下のアミノ酸配列を有するヒトH1−レラ
キシンのＣ鎖： または、B/CおよびC/A鎖の連結点での切断およびその後
のＣ鎖の切除を容易にするように該連結点が修飾された
Ｃ鎖の誘導体をコードしているヌクレオチド をさらに
含有する請求項４に記載のクローニングベクター。 - 【請求項６】（ａ）以下のアミノ酸配列を有するヒトH1
−レラキシンのＡ鎖 ： または該Ａ鎖のアミノ末端からの４個以下のアミノ酸の
除去により短縮された該Ａ鎖の類似体；および （ｂ）以下のアミノ酸配列を有するヒトH1−レラキシン
のＢ鎖 ： または該Ｂ鎖のアミノ末端からの３個以下のアミノ酸の
除去および／またはカルボキシ末端からの９個以下のア
ミノ酸の除去により短縮された該Ｂ鎖の類似体；をコー
ドしているヌクレオチド を含有するクローニングベク
ターで形質転換された細菌細胞。 - 【請求項７】以下のアミノ酸配列を有するヒトH1−レラ
キシンのＣ鎖： または、B/CおよびC/A鎖の連結点での切断およびその後
のＣ鎖の切除を容易にするように該連結点が修飾された
Ｃ鎖の誘導体をコードしているヌクレオチド をさらに
含有するクローニングベクターで形質転換された請求項
６に記載の細菌細胞。
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|---|---|
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| US5023321A (en) * | 1982-12-13 | 1991-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology & Medicine | Molecular cloning and characterization of a further gene sequence coding for human relaxin |
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| US5478807A (en) * | 1991-08-19 | 1995-12-26 | Genentech, Inc. | Use of relaxin in the treatment of bradycardia |
| US6348327B1 (en) * | 1991-12-06 | 2002-02-19 | Genentech, Inc. | Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells |
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| WO2002085308A2 (en) * | 2001-04-24 | 2002-10-31 | Epigenesis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense and anti-inflammatory based compositions to treat respiratory disorders |
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| WO2005115435A2 (en) * | 2004-04-30 | 2005-12-08 | Bas Medical, Inc. | Methods and compositions for control of fetal growth via modulation of relaxin |
| US20060052304A1 (en) * | 2004-09-02 | 2006-03-09 | Bas Medical, Inc. | Method for remodeling bone and related sutures |
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