HU197350B

HU197350B - Process for the molecular cloning and characterization of gene encoding human relaxin and for the production of human h1 relaxin

Info

Publication number: HU197350B
Application number: HU832842A
Authority: HU
Inventors: Peter J Hudson; John Shine; Hugh D Niall; Geoffrey W Tregear
Original assignee: Florey Howard Inst
Priority date: 1982-08-12
Filing date: 1983-08-12
Publication date: 1989-03-28
Also published as: ES8603579A1; EP0101309A2; CA1340542C; DK156592A; JPS5985292A; ES550943A0; IL69469A0; ES557505A0; JP2537477B2; ES540886A0; ES524885A0; EP0287820A1; IL69469A; ES8801671A1; EP0287820B1; JP2670001B2; DK156592D0; DK366483A; IE831909L; EP0101309A3

Description

A találmány tárgya egy humán relaxint kódoló gén szekvencia molekuláris klónozása és jellemzése. A találmány tárgya a humán -ti relaxin, prorelaxin és preprorelaxin előállítása.

Részletesebben: a találmány tárgya egy izolált és tisztított (.klónozott’) humán gén, amely prorelaxint, prepi-orelaxint, valamint a humán relaxin A és/vagy B és/vagy C peptid láncát kódolja, valamint eljárások a gének izolálására és tisztítására, eljárások a gének átvitelére a gazdasejtbe és azok replikálására a gazdasejtben. A klónozott géneket a gazdasejt akkor fejezi ki, amikor azok egyesültek a gazdasejt kifejeződni képes prokarióta vagy eukarióta sejtjeivel. A gének igy felhasználhatók a gyógyászati célokra alkalmas humán relaxin előállításához.

A találmány tárgyához tartoznak a humán relaxin, prorelaxin peptidek, valamint egyes peptid láncok, amelyek tartalmazzák ezeket a szekvenciákat és ezeknek a peptideknek módosított formáit.

A találmány tárgyához tartoznak még azok a módosított gének, amelyek az egyes relaxin-láncokat és a fent említett módosított formájú peptideket kódolják.

Hisaw, F. L. úttörő munkája [Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 23, 661-663 (1926)] vetette fel a relaxin peptid fontos szerepét az emlősökben, amely az ágyéktáji szimfízis tágító hatása révén jelentkezik, ilyen módon könnyítve meg a szülési folyamatot. A relaxin a petefészek sárgatestjében képződik és tárolódik a terhesség folyamán, és a véráramba a szülés előtt kerül. A rendelkezésre álló petefészkek lehetővé tették a relaxin izolálását és aminosav-összetételének megállapítását sertésben [Schwabe, C., McDonald, J. K. és Steinetz, B. C.: Biochem, Biophys. Rés. Commun. 75, 503-510 (1977); James, R., Niall, H„ Kwok, S. és Bryant-Greenwood, G.: Natúré, 267, 544-546 (1977)], patkányban [John, M. J., Walsh, J. R., Borjesson, B. W. és Niall, II. D.: Endocrinology 108, 726-729 (1981)], és cápában [Schwabe, C., Gowan, L. K, és Reinig, J. W.: Ann. N. Y. Acad. Sci. 380, 6-12 (1982)]. A biológiailag aktív hormon két peptidláncból áll, amelyeket A és B láncként ismerünk, és amelyeket diszulfid hidak kötnek össze, kettő a láncok között és egy a láncon belül. A szerkezet igy rendkívül hasonlít az inzulinra a diszulfid kötések elhelyezkedésében, amely ezeknek a hormonoknak a közös ős-génjére utaló feltételezésekhez vezet (lásd Schwabe ill. James, fentebb idézett irodalmi helyek).

A rekombináns DNS technikát alkalmaztuk a cDNS kiónok izolálására mind a patkány, mind a sertés relaxinhoz [Iludson. P., Haley, J., Cronk, M., Shine, J. és Niall, IL: Natúré, 291, 127-131 (1981); 11834/83 (PF 2696/82) ausztrál szabadalmi közrebocsátási irat. Szintetikus undekamer (11 tagú) nukleotidokat - amelyeket a rendelkezésre álló aminosav-szekvenciák alapján készítettünk alkalmaztuk primer mintaként a relaxin cDNS szekvenciákban erősen feldúsított cDNs minták szintéziséhez, amelyek azonosnak tekinthetők azokkal a relaxin cDNS kiónokkal, amelyek a petefészek-szövetből származó gén .könyvtár’-bun találhatók.

A relaxin struktúrgénről úgy találtuk, hogy egy egyedi láncból álló prekurzort kódol, amely hasonlít a preproinzulinra általános konfigurációjában, azaz: szignál-peptid(B-lánc/C-peptid)A-lánc.

A sertés és patkány preprorelaxinok egy meglepően nagy összekapcsoló peptidet tartalmaznak (105 ill. 104 gyök), összehasonlítva a patkány inzulinnal, amely mintegy 30 gyökös C pepiiddel rendelkezik. A patkány és sertés relaxin C peptidjének nagy mértékű szekvencia-homológiája feltételezi, hogy szerepük több, mint egyszerűen biztosítani a korrekt diszulfid kötés képzést az A és B láncok között. Az a véleményünk alakult ki, hogy a szerkezeti mozgás a szekvencia-eltérésben, amely az evolúció során alakult ki, a C-peptid részben eredményezett változást, amely C pepiid hasonlóképpen nagy mértékű szekvencia homológjával bír a humán relaxin génben. Következésképpen, amint ezt korábban már leírtuk, mi olyan mintákat alkalmaztunk a humán relaxin gén kiválasztásában, amely inkább a sertés, mint a patkány Cpeptid területen alapszik, mivel a fehérje szekvencia adatok összegyűjtése azt jelezte, hogy a humán fehérjék általában kevésbé térnek el a sertés, mint a patkány fehérjékből [Dayhoff, M. 0., Schwartz, R. M., Chen, H. R., Hunt, L. T., Barker, W. C. és Orcutt, B. C.: DNA 1, 51-58 (1981)].

Bár számtalan csoportnak hosszütávú célja volt meghatározni a humán relaxin szerkezetét és így megállapítani a klinikai beavatkozás útját nehéz szülés esetén, a terhesség időszakából származó emberi petefészkek korlátozott hozzáférhetősége megakadályozta a közvetlen aminosav szekvencia meghatározását. A mi megközelítésünk az volt, hogy sorozatvizsgálatokat végeztünk közvetlen emberi relaxin génre egy genom-.könyvtár’-ban, a sertés relaxin cDNS egyegy területét alkalmazva mintaként. Ez a megközelítés azt eredményezte, hogy sikeresen azonosítottuk azt a genom-klónt, amelyből a preprorelaxin teljes kódoló területének szerkezetét meghatároztuk.

Úgy véljük, hogy az itt leírt gének egyike vagy mindkettő, amelyeket ,H1‘ és .H2’ gén jelzéssel láttunk el, és amelyeket a PF 7247/82 számú ausztrál szabadalmi bejelentésben leírtunk, fejeződik ki a humán reproduktív szövetekben, pl. a petefészekben vagy a méhlepényben és/vagy más szövetekben, beleértve (de nem korlátozva ezekre) a beleket, agyat, bőrt, mivel mindkét gén kifejez relaxin-szerű aktivitást mutató peptideket.

A petefészkek sárgatestje, valamint a petefészkek és placenta szövetek a legvalószínűbb helyei a relaxinnal kapcsolatos gének kifejeződésének. A legtöbb peptid-hormon széleskörű elterjedésére való tekintettel azonban nagyon valószínű, hogy a relaxin-gén kifejeződik a nem-reproduktiv szövetekben, pl. az agyban és az eniésztőtraktusban is. A relaxin egy növekedési faktor általános tulajdonságaival bír és képes megváltoztatni a kötőszövetek természetét és befolyásolni a simaizom összehúzódást. Úgy hisszük, hogy a jelen szabadalmi bejelentésben és a PF 7247/82. sz. ausztrál szabadalmi bejelentésben leírt génszerkezetek egyike vagy mindkettő széles körben elterjedt a testben. Az a véleményünk, hogy az ezekből a génekből kifejezett relaxin-peptidek fontos fiziológiai szerepet játszanak a reprodukció sorén végzett jól dokumentált hormon-funkciójukon túl is.

Ebben a leírásban a következő rövidítéseket használjuk:

Hl = az itt leírt relaxin gén, amely a genom-klónból van visszavezetve

H2 = a PF 7247/82. sz. szabadalmi bejelentésben leírt relaxin-gén, amely a cDNS klónból van visszavezetve

DNS = dezoxiribonukleinsav

RNS = ribonukleinsav cDNS = komplementer DNS (enzimatikusan szintetizálva egy mRNS szekvenciából) mRNS = messenger (hírvivő) RNS A = adenin

T = timin

G = guanin

C = citozin

U = uracil

A kódoló kapcsolatok a DNS nukleotid szekvencia és a fehérje aminosav szekvencia között együttesen mint .genetikai kód' is-

mertek, amelyet az alábbiakban ismertetünk.
Első helyzet (5* vég)	U	C	Második helyzet A	G	Harmadik helyzet (3’ vég)
	Phe	Ser	Tyr	Cys	U
	Phe	Ser	Tyr	Cys	C
U	Leu	Ser	Stop	Stop A
	Leu	Ser	Stop	Trp	G
	Leu	Pro	His	Arg	U
	Leu	Pro	His	Arg	C
	Leu	Pro	Gin	Arg	A
C	Leu	Pro	Gin	Arg	G

A	Ile Ile Ile Met	Thr Thr Thr Thr	Asn Asn Lys Lys	Ser Ser Arg Arg	U C A G
	Val	Ala	Asp	Gly	U
	Val	Ala	Asp	Gly	C
G	Val	Ala	Glu	Gly	A
	Val	Ala	Glu	Gly	G

Az egyes aminosavakra használt rövidítések a következő táblázatban láthatók:

Fenilalanin (Phe) Leucin (Leu) Izoleucin (Ile) Metionin (Met) Valin (Val)

Szerin (Ser) Prolin (Pro) Treonin (Thr) Alanin (Ala) Tirozin (Tyr) Minden három

Hisztidin (His) Glutamin (Gin) Aszparagin (Asn) Lizin (Lys) Aszparaginsav (Asp) Glutamin sav (Glu) Cisztein (Cys) Triptofán (Trp) Arginin (Arg)

Glicin (Gly) betűs kódon (más néven dezoxinukleot.ied triplet vagy nukleotid triplet), amely a táblázatban megtalálható (pl. AUG, CAU), egy niRNS trinukleotidnak felel meg, az 5’ véggel a bal és 3' véggel a jobb oldalon. A betűk purin vagy pirimidin bázisokat jelentenek, amelyek nukleotid szekvenciát alkotják. Minden itt megadott DNS szekvencia a szálnak az a DNS szekvenciája, amely megfelel az mRNS szekvenciának, csak éppen timinnel (T) helyettesítve az uracilt (U).

Az ezt követő részletes tárgyalásban utalások lesznek nz ábrákra, az ábrák a következők:

Az 1. ábra a két alább említendő genom-klón restrikciós enzim-térképe;

a 2. ábra a humán relaxin gén kódoló területének mRNS szekvenciáját és a humán preprorelaxin aminosav szekvenciáját mutatja be; és a 3. ábra mutatja be a humán preprorelaxin és a hozzá tartozó mRNS szekvenciák összehasonlítását a megfelelő sertés preprorelaxin szekvenciákkal.

A genetikai anyag eredeti forrása a humán genom kiónok .könyvtár'-a volt. A .könyvtár' szűrővizsgálata sertés relaxin cDNS mintákkal két olyan kiónt adott ki, amely humán relaxint kódoló szekvenciákat tartalmazott.

A 2. és 3. ábrában bemutatott mRNS szekvenciákat a később leirt módszerrel határoztuk meg. Az látható az ábrából, hogy egy egyedi, 3,4 kb-s intron szakítja nieg a c kapcsoló pepiid kódoló területét. A humán preprorelaxin szerkezetét a genom-szekvenciából következtettük ki, összehasonlítva a sertés és patkány relaxin homológ szerkezetével. Az A és B peptid lánc szerkezetének bizonyítására szintézissel és in vitro lánc- rekombinációval olyan anyagot termeltünk, amely biológiailag aktív a méh-összehúzódási vizsgálatokban.

A preprorelaxin in vitro termelésének módja még nem teljesen ismert, de a sertés relaxinról a szignál peptid lehasításénak analógiája alapján az a valószínű, hogy ez a hasítás az Alá'¹ Lys'¹ kötésnél történik. Hasonlóképpen valószínűsíthető, hogy a C peptid hasítása a Leu³²-Ser^M és Arg¹³⁶-Arg¹³⁷helyen történik, igy adódik ki a B lánc 32 és az A lánc 24 gyökkel.

Amint a sertés relaxinnal kapcsolatos tanulmányainkban megjegyeztük, a sertés relaxin B és A láncainak vannak olyan lényeges belső szekvenciái, amelyek a biológiai aktivitás összes lényeges elemét tartalmazzák. A humán relaxin láncokkal kapcsolatos szintetikus tanulmányaink hasonló eredményeket mutatnak, amint ez későbbi részletes ismertetésünkből kiderül.

A jelen találmány egyik tárgya tehát egy gén előálitása, amely a humán preprorelaxint fejezi ki.

Részletesebben a jelen találmány egyik tárgya egy kettős szálú DNS fragmens előállítása, amely humán preprorelaxint fejez ki, és amely egy kódoló szálból és egy komplementer szálból áll, amely annak teljes a mRNS szekvenciának (-25-től 160-ig terjedő kodonok) felel meg, amely a 2. ábrában látható.

A találmány magába foglalja a preprorelaxin gén szekvencia bármilyen alegységét, vagy az említett szekvencia vagy alegység bármilyen ekvivalensét. Az ebben a megállapításban említett alegységek között lehetnek olyan gének, amelyekben nem szerepelnek olyan nem-kódoló területek, amelyek a 3. ábra szerint láthatók, vagy olyan gének, amelyek a humán preprorelaxin A, B és C láncait vagy szignál peptid láncát (lásd 3. ábra) vagy ezek bármilyen kombinációját kódoló egyedi struktúrgéneket tartalmaznak. Ilyen kombináció lehet pl. egy A és B peptid láncot elkülönítve vagy preprorelaxin-szerűen (vagyis C lánccal összekapcsoltan) kifejező gén.

A jelen találmány egy másik tárgya egy gén előállítása, amely a humán prorelaxint fejezi ki.

Részletesebben, a jelen találmány egyik tárgya egy kettős szálú DNS fragmens előállítása, amely humán prorelaxint fejez ki, és amely egy kódoló szálból és egy komplementer szálból áll, amely annak a kodonnak felel meg, amely 1-160 számmal látható a 2. ábra szerinti mRNS szekvenciában.

A jelen találmány további tárgya olyan gének előállítása, amelyek elkülönítetten ki tudják fejezni a humán relaxin A, B és C láncait, vagy az említett láncokból kettőnek vagy többnek a kombinációját.

Részletesebben a jelen találmány tárgya olyan kettős szálú DNS fragmensek előállítása, amelyek elkülönítetten tudják kifejezni a humán relaxin A és/vagy B és/vagy C láncait, és amelyek a 2. ábrán látható mRNS szekvenciák 1-32, 33-136 és 137-160 számai közti kodonjainak megfelelő kódoló szálat és egy komplementer szálat tartalmaznak.

A fentebb leírt gének a fajlagos kodonon kívül magukba foglalhatják a megfelelő .start és .stop kodonokat is, vagyis AUG-t és UGA-t (-26 és 161 kodonok a 2. ábrán).

A szakmában járatosak tisztában vannak azzal, hogy a géneknek polimorf módosulatai is lehetnek. Az ilyen módosulatok is beletartoznak a találmány körébe.

A találmány magába foglalja a fenti szekvenciák komplementjeit és az alegységeket vagy ekvivalenseket is.

A jelen találmány egy további tárgya egy DNS transzfer vektor előállítása, amely a fentebb meghatározott génnek megfelelő dezoxinukleotid szekvenciát tartalmazza.

Amint fentebb láttuk, a genetikai kód tartalmaz redundanciákat, vagyis bizonyos aminosavakat több, mint egy kodon kódol. Ennek megfelelően a találmány magába foglalja azokat a dezoxinukleotid szekvenciákat is, amelyekben az ábrákban bemutatott kodonok vagy cDNS ekvivalensei más kodonokkal vannak helyettesítve, olyan kodonokkal, amelyek szintén tudják kódolni ugyanazt az aminosavat..

Továbbnienve, amint ezt korábban jeleztük, relaxin aktivitással rendelkező peptideket lehet előállítani, amelyek a B és/vagy A lánc szerkezetében különböznek a természetes relaxinlól. Az ilyen eltérések maguk után vonhatják egy vagy több aminosav törlését (delécióját) és/vagy további aminosavak hozzátételét és/vagy különböző aminosavak helyettesítését a természetes láncban.

így a találmány magában foglal olyan géneket és DNS transzfer vektorokat is, amelyekben - ahogyan ezt korábban leírtuk - egy vagy több természetes kodon törölve van és/vagy helyettesítve van olyan kodonnal, amely más aminosavat kódol, mint amilyent a természetes kodon kódol és/vagy további kodonok vannak hozzáadva a természetes szekvenciához.

A találmány szerinti transzfer vektorok magukban foglalhatnak többek között olyan genetikai információkat is, amelyek biztosítják azok replikációját, amikor átkerülnek egy gazdasejtbe. Ilyen sejtek lehetnek pl. prokarióta mikroorganizmus sejtek, mint pl. baktériumok, élesztők és gombák, valamint eukarióta sejtek, beleértve az emlős sejteket és sejtvonalakat is.

A baktérium-genetikában leginkább használt transzfer vektorra jó példa a plazmid és bizonyos bakteriofágok DNS-ei. Mind a fág DNS-t, mind a bakteriális plazmidokat használjuk transzfer vektorként a jelen munkában. Meg kell érteni azonban, hogy más típusú transzfer vektorokat is lehet alkalmazni. Az ilyen transzfer vektorok képzé5 sének és a mikroorganizmusba transzformálásának általános technikája jól ismert a szakirodalomban.

A találmány kiterjed azokra a prokarióta vagy eukarióta sejtekre is, amelyek a fentebb leírt transzfer vektorok bármelyikével transzformálva vannak.

Egy előnyös mikroorganizmus a jól ismert Escherichia coli, de bármilyen más alkalmas mikroorganizmust is lehet használni.

A jelen találmány egy további tárgya eljárás egy DNS transzfer vektor előállítására, amely vektort a humán preprorelaxint kódoló dezoxinukleotid szekvenciák replikálásában és fenntartásában alkalmazunk, és amelyre az jellemző, hogy egy humán preprorelaxint kódoló dezoxinukleotid szekvenciának és egy restrikciós enzimes hasítással készített DNS molekulának összekapcsolásával készül.

A humán prorelaxint, valamint a humán relaxin A és B láncait kódoló dezoxinukleotid-szekvenciák replikálására és fenntartására alkalmas DNS transzfer vektorokat hasonlóképpen készíthetjük el megfelelő dezoxinukleotidokból.

Az A és B peptid láncokat, valamint a prorelaxint és preprorelaxint a gén kifejeződés szokásos módszereivel készíthetjük el, azaz a megfelelően transzformált transzfer vektort tartalmazó sejt növesztésével és a sejt által termelt kívánt peptid(ck) kinyerésével és tisztításával.

így a találmány magában foglalja azt. az eljárást is, amelyben egy kapcsolt fehérjét állítunk elő, amely a humán preprorelaxin aminosav-szekvenciáját tartalmazza, mint. C-terminális szekvenciát és a prokarióta vagy eukarióta fehérje egy részét, mint N-terminális szekvenciát; az eljárást az jellemzi, hogy egy humán preprorelaxint kódoló dezoxinukleotid szekvenciát tartalmazó kifejeződni képes transzfer vektorral transzformált sejt tenyészetét inkubáljuk, mindezekben a műveletekben a fentebb leírt eljárást követve.

A humán relaxin A és B láncainak, valamint a humán prorelaxinriak az aminosav-szekvenciát tartalmazó kapcsolt fehérjéket hasonló módon lehet előállítani.

Az igy előállított kapcsolt peptid termék egy olyan kapcsolt fehérje formájában van jelen, amelyben a kívánt peptid kapcsolva van a gazdasejtre jellemző prokarióta vagy eukarióta fehérje egy részletével. Az ilyen fehérjék szintén részei ennek a találmánynak.

A találmány magában foglalja az egymástól C pepiiddel elválasztott A és B peptidet tartalmazó humán prorelaxint szintetizáló eljárást, az eljárás azzal jellemezhető, hogy az említett emberi prorelaxint kódoló, a fentebb jellemzett eljárással előállított dezoxinukleotid szekvenciát tartalmazó, kifejeződni képes transzfer vektorral transzformált sejtek tenyészetét inkubáljuk az említett humán 6 prorelaxint kódoló szekvencia kifejeződéséhez alkalmas körülmények között, és az említett sejtek tenyószlevéből vagy lizátumából a humán prorelaxint elválasztjuk és megtisztítjuk.

A számunkra érdekes peptidet a kapcsolt termékből bármilyen alkalmas, ismert hasítási eljárással ki lehet nyerni.

Amint ezt már fentebb jeleztük, a transzfer vektort lehet módosítani kodon helyettesítéssel, törléssel (delécióval) és hozzáadással, és az ilyen módosítások módosított kapcsolt peplidekhez is vezethetnek. Ilyen módon megfelelő módosításokkal el lehet érni a kapcsolt peptidek hasításának megkönnyítését pl. a B/C vagy C/A láncnak elágazásánál, vagy a peptid lánc viselkedésének módosítását az ez után következő kémiai vagy biológiai műveleteknél.

Amint fentebb jeleztük, a találmány szerinti módszerrel elő lehet állítani humán relaxint, prorelaxint. és preprorelaxint.

A relaxint az egyedi A és B láncok közvetlen kombinációjával elő lehet állítani, bármely olyan módszert alkalmazva, amely jelenleg ismeretes és alkalmazott az inzulin készítésénél.

Az inzulinhoz hasonló módon relaxint lehet. készíteni prorelaxinból oxidációval vagy bármilyen módszerrel, amely a relaxin fentebb ismertetett módszerekkel előállított A és B peplidjeinek merkapto-csoportjait diszulfid keresztkötéssé alakítja az A és B peptidek között, majd a C peptid lehasításával, pl. olyan erizini-katalizált hidrolízissel, amely fajlagos a C peptidet az A és B peptidekkel összekötő kötésekre.

Következésképpen a jelen találmány humán relaxin szintéziséhez olyan módszert szolgáltat, amely a teljes hosszúságú, rövidített vagy módosított formájú relaxin A és B láncainak kombinálásából áll; a módszer a humán inzulin esetében az A és B láncok kombinációjánál önmagában ismeretes.

Egy ilyen módszer az S-szulfonált A és B láncok keverékének redukciójából, majd a keveréknek oxidáció céljából levegőn tartásából áll.

Úgy találtuk, hogy a fenti eljárás hatékonysága javul, ha az A és B láncok egyike vagy mindkettő S-tioetil-cisztein származék formájában van jelen S-szulfo forma helyett.

Az általunk benyújtott 15413/83 (PF 4385/82) számú ausztrál közrebocsátási iratban bemutattuk, hogy a relaxin A és B láncok egyikét vagy mindkettőt le lehet rövidíteni az amino- vagy karboxi-végnél anélkül, hogy a biológiai aktivitás jelentősen csökkenne, ugyanakkor a kombináció kitermelése nő. Ezek a technikák ugyanúgy használhatók a humán relaxin előállításához.

A találmány egy további tárgya egy olyan humán rclaxinanalóg előállítása, amely lényegében a termesztés B és/vagy A peptid láncok rövidített, vagy módosított formáit tartalmazzák.

-510

A találmánynak célja az is, hogy módszert szolgáltasson humán relaxin analógok előállításához, amely módszer a B és/vagy A láncok rövidített vagy módosított formájának kialakítási lépéséből és azok bármely fentebb említett módszerrel történő összekapcsolásából áll.

Vizsgálataink mind sertés, mind humán relaxinnal megmutatták, hogy a relaxin-aktivitás még jelen lehet az A láncnál az A (10-24) lerövidítésig és a B láncnál a B (10-22) lerövidítésig, bár a várható gyakorlati minimum A (4-24) illetve B (4-23).

Általában az A lánc variálható A (1—24)— -tői A (10-24)-ig és a B lánc B (l-32)-től B (10-22)-ig.

Az előnyös kombinációk a következő összeállításokból származnak:

A B (1-24) (1—23)—tői az (2-24) bármelyike a (l-32)-ig terjedő (3-24) peptidek bármelyikével.

A B és/vagy A láncok módosítása a jelen találmány értelmében .genetikai' módosítást, amint ezt a fentiekben leírtuk, vagy a B és/vagy A láncok (vagy teljes hosszban, vagy rövidített formában) a találmány szerinti módszerrel történő kombinációja előtti kémiai módosítását jelentheti. Két típusú módosítást alkalmazhatunk: egyedi vagy a kombinált módosítást.

Az első típus magában foglalja egy vagy több aminosav módosítását, azok közül, amelyek a természetes vagy rövidített B és/vagy A láncban előfordulnak. Az ilyen módosítások lehetnek pl.: az aktív csoportok védelme egy vagy több aminosavon önmagában ismert módszerrel, és szükség esetén a védőcsoport eltávolítása a (módosított) A és B láncok kombinálása után.

Az ilyen típusú módosítások jelenthetnek acetilezést, formilezést vagy a szabad aminocsoportok beleértve az N-terminálist is másfajta védelmét; a C terminális csoport amidálását, vagy a hidroxil- vagy karboxil-csoportokon az észterképzést. A fornill-csoport egy jellemzó példa egy könnyen eltávolítható védöcsoportra.

A módosítások második csoportja az A vagy B lácban egy vagy több természetes aminosav más aminosavak kai (beleértve a természetes aminosavak D-formáit is) történő helyettesítését jelenti. A módosításnak ez az általános típusa magában foglalhatja egy természetes aminosav törlését a láncból vagy egy vagy több többlet-aminosav hozzáadását a láncba.

Az ilyen módosítások célja az A és B lánc kombináció kitermelését növelni úgy, hogy a terméknek, vagyis a relaxinnak vagy analógjának az aktivitása megmaradjon, vagy növelni, illetve módosítani a termék aktivitásét az adott kombináció-kitermeléshez. Az ilyen módosítás kiterjedhet azokra a szintetikus analógokra is, amelyeknek relaxin-blokkoló vagy -antagonista hatása van.

Az első típusú módosításnak jellegzetes példája a triptofán (Trp) gyök módosítása a B 2 helyen formil-csoport bevezetésével.

Λ második típusú módosításra példák: a Met rész helyettesítése a B 24-nél norleucinnal (Nle), valinnal (Val), alaninnal (Alá), glicir.nel (Gly), szerinnel (Ser) vagy homoszerinnel (HoinoSer).

A találmány tehát kiterjed azokra a humán relaxin analógokra, amelyek a találmány szerint fentebb leírt módon módosított természetes vagy rövidített B és/vagy A láncokból képződnek.

Az A és B peptid láncokat, valamint a prorelaxint és prcprorelaxint a gén kifejeződés szokásos módszerével lehet előállítani, vagyis a megfelelő transzformált transzfer vektort tartalmazó mikroorganizmus növesztésével és a mikroorganizmus által termelt kívánt peptid(ek) kinyerésével és tisztításával.

Az igy előállított peptid termék lehet kapcsolt fehérje formájában, amelyben a kívánt peptid egy prokarióta fehérje egy részével van összekapcsolva.

A találmányt a továbbiakban az alkalmazott kísérleti eljárások és az ilyen módon elért eredmények leírásával illusztráljuk.

A.) KÍSÉRLETI ELJÁRÁSOK

1.) Baktérium- és fág törzsek

E. coli RRl-et használunk, mint baktérium gazdasejt.et, a rekombináns plazmidokhoz (pBR 322), amelyek sertés relaxin cDNS beiktatott részt (inzertet) tartalmaznak, amint ezt korábban leírtuk [Haley, J., Hudson, H.: DNA 1, 155-162 (1982)].

A humán genom kiónok .könyvtár'-át T. Maniatis szívesen bocsátotta rendelkezésünkre. A humán DNS részleges Hae 111/Alu 1 fragmentációjából eredő, mintegy 15-20 kb-s genom DNS fragmensek [Lawn, R. M., Fritsch, E. F., Parker, R. C., Blake, G. és Maniatis, T.: Cell, 15, 1157-1174 (1978)] kapcsolókkal vannak klónozva a Charon 4 A lambda fág vektorba [Maniatis, T., Hardison, R. E., Lacy, Ε., Lauer, J., O’Connell, C. és Quon, D.: Cell 15, 687-701 (1978)] és szaporítva E. coli LE 392 sejtekben.

A fág DNS-t (a klón-szelekció után) az 1 liter E. coli DP 50 sup F sejttenyészetének lizisét követően állítjuk elő.

A fág DNS fragmentációjából eredő kis DNS fragmenseket szubklónozzuk a szekvencia analízishez az M 13 bakteriofág vektorokba (itip 7,1 mp 8 és mp 9), amelyeket Dr. J. Messing bocsátott szívesen rendelkezésünkre, és transzformáljuk JM 101 sejtekbe.

-612

2. ) Λ hibridizációs vizsgálati minták (sertés DNS) előállítása

Radioaktívan jelzett vizsgálati mintákat készítünk primer-képző szintézissel különböző DNS fragmensekre, n borjú Limusz DNS denaturált véletlenszerű primer mintáit használva (3 vagy 4 bázis) [Taylor, J. M., Illmersee, R. és Summers, J.: Biochim. Biophys. Acta 442, 324-330 (1976)]. A sertés DNS templátot (100-200 ng) denaturáljuk a véletlenszerű primer mintákkal együtt, 20 pl vízben forralva 2 percen át. A szintézist 30 jul reakciókeverék hozzáadásával indítjuk be, a reakciókeverék összetétele: 50 mmól/liter Tris-HCl (pli 8,0), 50 mmól/liter NaCI, 1 mmól/liter ditiotreitol (DTT), 10 mmól/liter MgClz, 5 egység E, coli DNS polimeráz 1, 500 pmól/1 dCTP, dGTP, dTTP mindegyikéből, és 0,3 mól/liter oC[32_P]dATP-ből (kb. 3000 Ci/mmól, Amershani gyártmány). 37 C° hőmérsékleten 30 percen át inkubálunk, majd a reakciót 300 pl pufferral történő hígítással leállítjuk; a puffer összetétele: 0,3 mól/liter NaCI, 10 mmól/liter Tris-HCl (pH 8,0), 1 mmól/liter EDTA. A keveréket Sephadex G50 oszlopon visszük át, ugyanazt a puffért, használva. A radioaktívan jelzett vizsgálati mintát összegyűjtjük a csúcsfrakciókból üres térfogatnál, és két térfogat etanollal kicsapjuk -20 C° hőmérsékleten, tRNS-t (10 pg) használva hordozóként.

3. ) Szűrővizsgálati eljárások

Genom DNS fragmenseket tartalmazó lambda fágot növesztünk lágy agaron 10⁵fág/13 cm átmérőjű lemez mennyiségben, és nitrocellulóz szűrőkre visszük át (Schleicher és Schüll B A 85), amint ezt Benton és Davis leírták [Benton, W. D. és Davis, R.: Science 196, 180-183 (1977)]. A szűrőket hibridizáljuk radioaktívan jelzett vizsgálati mintákkal 40 C° hőmérsékleten 18 órán át módosított Denhardt oldatban [Denhardt, D. T.: Bíochem. Biophys. Rés. Commun. 23, 641-646 (1966)], amely 5 x SSC-t és 25% formamidot tartalmaz. A szűrőket 2 x SSC-ben mossuk 30 C° hőmérsékleten 1 órán át, majd röntgensugár-filmre exponáljuk (Kodak XS-5) 24 órán ét. A lemeznek azokat a területeit, amelyek pozitív hibridizációt mutatnak, újból tenyésztjük, és újból szűrővizsgálatnak vetjük alá többszőr is ismételve, amíg egyedi pozitív tarfoltokat tudunk szelektálni. A fágokat E. coli I DP 50 sup F sejtek 1 liternyi tenyészetének lizise után kinyerjük és a DNS-t Maniatis [Maniatis, T., Hardison, R. E., Lacy, E., Lauer, J., O'Connel, C., és Quon, D.: Cell, 15, 687-701 (1978)], valamint Yamamoto és Alberts által leírt módszerrel kipreparáljuk [Yamamoto, K. R. és Alberts, Β. M.: Virology 40, 734-744 (1970)].

4.) DNS szekvencia analízis

A kiválasztott rekombinóns fág restrikciós fragmenseit közvetlenül az M 13 mp 8 fág Eco R 1, Pst 1, vagy Sma 1 helyeire szuliklónozzuk. A kapcsolásokat 20 pl reakciókeverékben végezzük, a reakciókeverék 10 mmól/liter Tris-HCl-t (pH 8,0), 10 mmól/liter MgCk-t, 1 mmól/liter DDT-t, 1 mmól/liter ATP-t, 1 egység T« DNS-ligázt, 100 ng DNS-t és az M 13 fág vektorból 50 ng-ot tartalmaz. 40 C° hőmérsékleten egy éjszakán át tartó inkubálás után a rekombináns DNS-t E. coli JM 101 sejtekbe transzformáljuk [Sanger, F., Coulson, A. R. Barrelt,

B. G., Sinith, A. J. A. és Rue, B. A.: J. Mól. Bioi. 143, 161-178 (1980)]. A kódoló területeket tartalmazó tar föl tokát hasonló technikával szelektáljuk, amint ezt fentebb a genom szűrővizsgálatoknál leírtuk, azzal a különbséggel, hogy az M 13 fágot kisebb sűrűségben (10³ fág/9 cm átmérőjű lemez) szélesztjük. A pozitív tarfoltokat vagy egyszálú templát, va/y replikélódó kettős szálú (rf) forma preparatív kitermelése érdekében növesztjük (lásd Sanger és munkatársai, fentebb idézett irodalom). Az egyszálú templátokat közvetlenül vetjük alá szekvencia-analízisnek [Sanger, F., Nicklen, S. és Coulson, A. R.: Proc. Natn. Acad. Sci. 7-1, 5463-5467 (1977)], mégpedig vagy Ml 3 fajlagos primer mintát (Collaborative Research) alkalmazva, vagy olyan szintetikus primereket alkalmazva, amelyek komplementerek a kódoló területen levő különböző szekvenciákra. A szubklónok teljes szekvencia analízisét az rf forma különböző helyeken, különböző restrikciós enzimekkel történő hasításával nyerjük, amelyet tompa végű [Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. A. és Roe, B. A.: J. Mól. Bioi. 143, 161-178 (1980)] vagy közvetlenül vég-jelzett fragmensekkel való kapcsolással történő szubklónozés, valamint a Maxam és Gilbert szerinti [Maxam, A. M. és Gil— bért, N.: Proc. Natn. Acad. Sci. 74, 560-564 (1977)] szekvencia-analízis követ. A DNS szekvenciákat analizáljuk és komputer programok segítségével [Staden, R.: Nucl. Acids. Rés. 6, 2601-2610 (1979)] összehasonlítjuk a sertés és patkány relaxin szekvenciákkal.

B) EREDMÉNYEK

Az itt következő tárgyalásban utalásokat teszünk az ábrákra. Az 1. ábra a genom kiónoknak egy rövidített restrikciós enzimtérképét mutatja.

A méreteket kilo-bázispárban (kb) adjuk meg és a hasítási helyeket Eco R 1-nél (R), Pst 1-nél (P) és Hpa 11-nél (H) jellel jelöljük. A ΛΪ1 5 genom klón egy Eco R 1 kapcso-714 lónál ér véget, amely az Alu 1 helyhez van kapcsolva a C peptidben (exon. II) (A* az 1. ábrában). A meghatározott nukleotid szekvenciát a kódoló területnél a aH 7 genom klönból állítjuk össze az Eco R 1 és Pst 1 fragmensek szubklónozásával M 13 mp 8-ba, majd vagy (1) közvetlenül szekvencia-analízissel, amelyet az 1. ábrában a szaggatott vonal (----, mutat az M 13 templátokon, vagy (2) közvetlen szekvencia-analízissel, szintetikus nukleotid primer mintákat használva, amelyet a pontozott vonalak mutatnak be (....), vagy (3) a DNS fragmensek vég-jelzésével és szekvencia-analízisével a kémiai lebontás módszerével, ezt folytonos vonal ( ) mutatja be.

A szekvencia-analízishez használt primer minták a következők voltak:

a: 5’ TTCGCAATAGGCA és b: 5’ GCACATTAGCT

A 2. ábra mutatja be a humán relaxin gén kódoló területét. A humán preprorelaxin aminosav- és mRNS szekvencia összehasonlítása (lásd fent) a megfelelő sertés relaxin szekvenciákkal (lent) van bemutatva a 3. ábrában. A szekvenciák sorba vannak állítva a homológia kiemelése érdekében a nukleotidazonosságoknál (amelyeket csillagokkal jelölünk) és az aminosav homológiáknál (amelyeket bekeretezett területekkel jelölünk). Az aminosavakat a B-lánc kezdetétől számozzuk. Az inlron szekvenciát az exon(intron)exon határoknál kisbetűs DNS jelöléssel mutatjuk be.

1.) A genom klánok izolálása és jellemzése

A humán genom kiónokat a könyvtárnak a sertés relaxin cDNS klón egy rövid - a C peptidben levő 45-95 aminosavak nak megfelelő [Haley, J., Hudson, P., Scanlon, D., John, M., Cronk, M., Shine, J., Tregear, G. és Niall, H.: DNA 1, 155-162 (1982)] - fragmenséből (150 bp) készült vizsgálati mintákkal végzett szűrővizsgálatával azonosítottuk, amint ez a

3. ábrában látható. Ezt a fragmenst a Hpa

II-vel és Hinf 1-el történó emésztéssel vágjuk ki a kiónból és ez a terület maximális homológiát mutat (71% a nukleotid szinten) a patkány és a sertés relaxin szekvenciák között. A genom klón bankból két erősen pozitív fágot, ΛΗ5 és aH7 jelzésűt, izolálunk. A pozitív kiónokat tovább jellemezzük restrikciós enzim analizissel, vizsgálati mintaként az 5’, illetve a 3’ exon területekre (amelyeket exon I-nek és exon II-nek nevezünk) fajlagos sertés relaxin cDNS két elkülönített fragmensét alkalmazva. A két fragmenst a sertés relaxin cDNS klón hasításával hozzuk létre egy egyedi Hpa II helynél, amely megfelel (néhány bázison belül) egy intron helynek a homológ patkány relaxin génben [Hudson, P., Haley, J., Cronk, M., Shine, J. és Niall, H.: Natúré, 291, 127-131 (1981)]. A aH5 és aH7 klóitok Sonthon folt analízise felfedi, hogy humán relaxin gén kódoló területet egy 3,4 kb-s egyedi intron szakítja meg (lásd 1. ábra).

2.) A genom kiónok szekvencia analízise

Az alkalmazott stratégia szerint a λΗ5 és aII7 teljes, restrikciós enzimekkel emésztett anyagát szubklónozzuk M 13 vektorokba, majd szűrővizsgálatnak vetjük alá, exon I-re és exon ΙΙ-re fajlagos sertés relaxin vizsgálati mintákat alkalmazva. A pozitív szubklónokat az A. rész 4. fejezetében leírt módszereknek egy kombinációjával szekvencia-analizisnek vetjük alá.

A aI17 klón exon II. területét egy 2,0 kb-s Eco R 1 fragmens tartalmazza, amely egy Eco R 1 helynél kezdődik a C peptidben és folytatódik az A lánc teljes kódoló területén át a befejező kodonig (lásd 1. ábra). Ennek a fragmensnek a szekvencia-analízisét jelentősen elősegíti az A lánc körüli területekre fajlagos nukleotid primer minták szintézise, amelyeket arra használunk, hogy közvetlenül szolgáljanak mintaként a teljes 2,0 kb fragmenst tartalmazó M 13 templáton. A C peptid megmaradó 53 bp részét tartalmazó szubklónozolt Eco R 1 fragmenst az exon Π-ben nem tudjuk azonosítani a vizsgálati mintaként használt sertés cDNS-el. A szekvenciát erről a területről egy szubklónozott Pst I fragmenssel nyerjük a AH7-ból, amely tartalmazza a teljes exon II területet.

A ΛΗ5 exon II terület szekvencia vizsgálata felfed egy rendkívül rövid 70 bp-s fragmenst, amely ugyanazon az Eco R 1 helyen kezdődik a C peptidben, mint a AH7-nél (lásd 1. ábra), de egy Eco R 1 kapcsolónál végződik, ez a kapcsoló egy Alu 1 helyre van kapcsolva az eredeti genom DNS-ben a genom .könyvtár' kialakulása folyamán. így a aH5-öI a relaxin gén inkomplett kiónjának minősítjük, és nem vizsgáljuk tovább.

Az exon I terület szekvencia analízise egy kicsit komplikáltabb a szignál peptidben egy Eco R 1 hely jelenléte miatt, amely szükségessé teszi a két Eco R 1 fragmens szubklón független szekvencia analízisét. Az átfedés az Eco R 1 helyeken alátámasztja a AlIT-ből származó Alu 1 szubklón azonosítása, amely az átlupoló szekvenciákat tartalmazza.

C.) .4 módosított humán relaxin (hRLX) A (l-2-l}-R(l-25) szintézise

1.) A humán relaxin A-lánc [hRLX A(l-24)í szintézise

A humán relaxin A-lánc 1-24 gyökeinek megfelelő aminosav szekvenciáját, amelyet a 9

-816 fentiekben leírt módon a genom klón nukleotid szekvenciájából következtettünk ki, szilárd fázisú módszerrel szintetizáljuk, a Merrifield által leírt általános elvek szerint, pl. (Bárány, G. és Merrifield, R. B.: .The Peptides, 1-284 oldal, szerkesztettte E. Gross és

J. Meienhofer, Academic Press kiadás, New York).

N-oC-tercier-butil-oxi-karbonil*-4-metil-benzil-L-ciszteint (* a továbbiakban .BOC) 0,30 mmól/g mennyiségben véve kapcsolunk egy 1% keresztkötéssel ellátott polisztirol gyantára, fenil-acetamido-metil (PAM) kötéssel TAM és munkatársai módszere szerint [Synthesis 12, 955-957, (1979)]. A BOC-L-CYS-PAM gyantát (8,0 g) egy Beckman 990 Modell-tipusü peptid-szintetizáló edénybe visszük ét és az aminosav-szekvenciát a 23. gyöktől az 1-ig elkészítjük az egyes megfelelően védett aminosavak lépésenkénti beadagolásával. Az egyes aminosavak amino-végéról a BOC védőcsoportot olyan módon távolitjuk el, hogy a gyantát 30 percen át 35%-os metilén-kloridos trifluor-ecetsav oldattal kezeljük, majd semlegesítjük 15 percen át 5%-os metilén-kloridos diizopropil-etilamin oldattal. A gyantát minden kezelés után alaposan átmossuk metilén-kloriddal. A szekvenciában következő aminosavat (amelynek oí-amino-csoportja BOC csoporttal és ahol szükséges, az oldalláncok funkciós csoportjai is megfelelően védettek) összekapcsoljuk a gyantával, dieiklohexil-karbodiimidet (DCC) alkalmazva. A gyantát és az amino-saval keverjük metilén-kloridban 10 percen át, mielőtt a DCC-t adagoljuk, amelyet szintén metilén-kloridban oldunk. 2,5-szörös moláris aminosav- és DCC felesleget (6,0 mmól) használunk minden egyes kötéshez. 1 órás keverés után a gyantából mintát veszünk és megvizsgáljuk szabad aminosavakra, Kaiser és munkatársainak ninhidrines módszerét alkalmazva (Anal. Biochem., 34, 595-598, 1970). Ha a ninhídrines vizsgálat negatív, ez jelzi, hogy a kapcsolat teljes, és a reakció-ciklus folytatódhat a következő aminosav BOC védőcsoport eltávolításával, semlegesítésével és kapcsolásával. Pozitív ninhidrin reakció esetén a kapcsolási reakciót meg kell ismételni további aminosavval és DCC-vel.

Az oldalláncban funkciós csoportokkal rendelkező aminosavak közül a következő védett termékeket alkalmazzuk:

N-oC-BOC-2,6-diklór-benzil-L-tirozin;

N-oC-BOC-^-klór-benzil-oxi-karbonil-L-lizin;

N-oC-BOC-L-szerin-O-benzil-éter;

N-oC-amil-oxi-karbonil-N^c-tozil-L-arginin

N-oC-BOC-L-treonin O-benzil-éter

N-oC-BOC-S-etil-merkapto-L-cisztein (az

A lánc 15., 11. és 10. szekvencia-helyén levő ciszteinekhez);

N-oC-BOC-L-glutarainsav-'j-benzil-észter.

Az 1-24 peptid elkészítését követően a végső BOC csoportot az amin-terminálison le10 vő arginről eltávolítjuk, a védöcsoport-eltávolitó semleges ciklust használva, majd a peptidet tartalmazó gyantát (17 g) vákuumban szárítjuk. A peptidet tartalmazó gyanta egy részét (2 g) vízmentes hidrogén-fluoriddal kezeljük anizol (2 ml) jelenlétében 0 C° hőmérsékleten 30 percen át. A peptidet tartalmazó gyanta hidrogén-fluoriddal (HF) történő teljes érintkezési idejét a minimumon kell tartani (ne legyen több, mint 70 perc) ezért a HF-ot olajszivattyús vákuum segítségével gyorsan eltávolítjuk. A peptidet tartalmazó gyantát azután többször átmossuk etilacetáttal az anizol eltávolítása érdekében, majd a peptidet 1 mól/literes ecetsavval extraháljuk, és az oldatot liofilezzük. A nyers peptid kezdeti tisztítása gél-szűréssel történik Biogel Ρ-10-en, 0,1 mól/literes ecetsavban. Erről az oszlopról a főcsúcsot reprezentáló frakciókat, amelyeket a kb. 3000 molekulasúlynak megfelelő helynél eluálunk, összegyűjtjük és liofilezzük. Ennek a peptidnek az aniinosav-elemzése jelzi, hogy az 1-24 szekvencia összes aminosavai a helyes arányban vannak jelen.

Az (S-Lioelil-Cys^10,11>^ls)-hRLXA(l-24) peptid további tisztítását preparatív fordított fázisú HPLC-vel (nagynyomású folyadékkromatográfia) végezzük Waters C-18 Bondapak oszloi>on, 0,1% trifluorecetsav (TFA)-(viz)acetonitril oldószer-rendszert alkalmazva.

A gélszűréssel tisztított peptid egy 160 ing-os mintáját S-szulforiáljuk nátriumszulfit és nátrium-tetrationát. keverékével (teljes reakcióidő: 3 óra), Du és munkatársai módszerével [Scientia Sinica, 101, 84-104 (1961)]. Az S-szulfonálás folyamán képződött csapadékot szűréssel elkülönítjük, és mind a csapadékot, mind a felülúszó oldatot dializáljuk vízzel szemben 4 C° hőmérsékleten 48 órán át. A dializáló cső tartalmát liofilezzük, igy a felülúszó oldatból 81,4 mg, míg az S-szulfonálási reakció során keletkezett csapadékból 53,2 mg peptidet nyerünk. Az .oldható· (S-szulfo Cys^10>1I'¹⁵-²⁴)hRLX A(l-24) peptid egy mintáját ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk DEAE cellulózon Tris-HCl pufferben (pH 8,3). A peptidet az oszlopról Tris-HCl pufferben levő NaCl lineáris gradiensével oldjuk le, 3,0 mS-től 85,0 mS vezetőképességi tartományt alkalmazva. A fő csúcsot jelentő frakciókat, amelyeket 20 és 30 mS között eluálunk az ioncserélő oszlopról, dializáljuk és a peptidet liofilezéssel kinyerjük. Preparatív HPLC-t használunk az S-szulfonáll peptid további tisztításához.

2.) A rövidített humán relaxin B lánc [hRLX B(l-25)] szintézise

A humán relaxin B lánc 1-25 gyökeinek megfelelő aminosav-szekvenciát a fentebb leírt eljárással szintetizáljuk, 7,0 g N-oC-tercier-butil-oxi-karbonil-O-benzil-L-szerin-fenil-acetamido-metil polisztirol gyantával kezdve,

-918

0,1 mól Ser/g terheléssel. Ugyanazokat az oldallánc-védö csoportokat használjuk a B lánchoz, mint amelyeket az A láncnál alkalmaztunk, beleértve a cisztein S-etil származékokat is a 10. és 22. helyeken. A 4. és 5. helyeken levő aszparaginsav gyököket N-cí-BOC- -benzil-észter származékokként adagoljuk. A glutamint a 18. helyen aktív észteres eljárással kapcsoljuk, N-oC-BOC-L-glutamin-p-nitrofenil-észtert használva dimetil-formamidban. A 2. helyzetben levő triptofán kapcsolása után 0,1% indolt adunk a Lrifluor-ecetsav védócsoport-eltávolító reagenshez és az ezt követő metilén-klorid mosófolyadékhoz.

A peptidet tartalmazó gyanta végső súlya 12,2 g, miután a BOC csoportot az amin-terminális lizin-gyökéről eltávolítottuk, ós vákuumszáritást végeztünk. A peptidet tartalmazó gyanta egy részletét (5 g) vízmentes hidrogén-fluoriddal kezeljük 2 ml anizol jelenlétében 0 C° hőmérsékleten 30 percen át, és a B peptid láncot izoláljuk az A láncnál leírt módszer szerint. A nyers (S-tioetil-Cys^10>22)hRLX B(l-25)-öt (1,40 g) gél-szűréssel tisztítjuk Bio-Gel P 10-en 0,1 mól/literes ecetsav oldattak majd preparatív HPLC-vel.

A gél szűréssel tisztított peptid egy 150 mg-os mintáját S-szulfonáljuk 8,3 pH-nál 3 órán át, a reakciókeveréket szűrjük, és mind a csapadékot, mind a felülúszó-oldalot dializáljuk desztillált vízzel szemben. Az .oldható peptid mennyisége liofilezés után 92 mg, az .oldhatatlan peptidé 55 mg.

Az S-szulfonált B-peptid láncokat tovább tisztítjuk preparatív HPCL-vel, C-18 fordított fázisú oszlopot és 0,1% trifluorecetsav-(viz)acetonitril oldószer rendszert alkalmazva.

3.) Lánc-kombináció

A szintetikus hRLX A(l-24) és hRLX B(l-25) peptideket azzal a módszerrel kombináljuk, amelyet Chance és Hoffmann írtak le 68844/81 sz. ausztrál szabadalmi közzétételi iratban az inzulin láncokhoz, ahol az S-szulfonált peptideket A:B 2:1 arányban keverték 10 mg/ml peptid koncentrációnál 10,5 pH-jú glicin pufferben. Glicin pufferben levő ditiotreitolt adunk ez után olyan mennyiségben, hogy összesen 1,0 merkapto-csoport jusson minden egyes S-szulfo-csoportra. A reakciókeveréket ez után nyitott edényben 24 órán át kevertetjük.

Ennek az eljárásnak további módosításaként arra jöttünk rá, hogy a biológiailag aktív relaxin képződéséhez vezető lánc-kombinációs reakciót úgy lehet hatásosan végrehajtani, ha egyik vagy előnyösen mindkét peptid láncot S-tioetil-Cys származékként alkalmazzuk az S-szulfo-származék helyett, amelyet Chance és Hoffmann (lásd fentebb) inzulin esetében előírtak. Az S-tioetil Cys peptidek alkalmazásával kiküszöbölünk egy reakciót és egy tisztítási lépést, amely a peptidcknek az S-szulfo-származékká történő átalakításához szükséges. Tapasztalataink szerint a relaxin peptidek S-szulfonálási reakciója niellékleakciókkal együtt megy végbe, amelyek nehézzé teszik az S-szulfo-peptidek tisztítását, ez pedig alacsony kitermeléshez vezet.

A fenti körülményeket alkalmazva a lánc-kombinációban 0,24-3% kitermelést érünk el, Wiqvist és Paul [Acta Endocrinol., 29, 135-136 (1958)] patkány-méh összehúzódásban jelentkező biológiai aktivitás vizsgálaté·; nak módszerével mérve.

Példa a lánc-kombinációs reakcióra

Humán relaxin (S-tioetil Cys¹⁰·¹¹·¹⁵) A(.l-24)-et [3,60 mg száraz tömeg, 2,0 mg (0,68 mól) peptidtartalom aminosav-elemzés alapján] feloldunk 200 pl 0,1 mól/literes glicin-pufferben (pH 10,5), egy 3 ml-es, dugóval ellátott műanyag centrifuga csőben. 100 pl 0,1 mól/literes glicin pufferben (pH 10,5) oldott humán relaxin (S-szulfo-Cys¹⁰·¹¹) B(l—25)-öt (1,89 mg, 1,0 mg peptidtartalom aminosav-analízis alapján) adunk hozzá és a keveréket keverjük. 0,1 mól/literes glicin-puffcrben (pH 10,5) készített ditiotreitol (DTT) törzsoldat (1,15 pmól DTT 10 ml-ben) egy alikvot részét (15,2 pl, 1,73 pmól DTT) adjuk hozzá a peptid-oldathoz, és rövid keverés után a reakciókeveréket -1 C° hőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk nyílt levegőn. A keveréket ez után centrifugáljuk és a felülúszó oldat egy alikvotját relaxin biológiai aktivitásra mérjük patkány-méh összehúzódási vizsgálattal. A reakciókeverék alikvotjai gátolják a patkány-méh spontán összehúzódását dózis-függő módon. Egy 75 pl-es alikvot, amely teljesen meggátolja a méhösszehúzódást, ekvivalens egy 0,70%-os lánc-kombinációs kitermeléssel, amint ez a természetes sertés relaxin standarddal (A 22-B 31) összehasonlítható.

H 1 gén szekvencián alapuló további szintetikus humán relaxin peptidek

A következő táblázatban felsorolt szintetikus relaxin peptideket a 2. ábrában bemutatott Η 1 humán relaxin gén szekvenciából származó A és B láncokhoz tartozó aminosav-szekvenciából készítjük. Az egyedi peptid láncokat a fentebb A(l—24) és B(l-25) peptidek előállításához leirt módszer szerint állítjuk elő és tisztítjuk. Ezeknek a módszereknek egy módosítását alkalmazzuk a B(3-25) amid és B(l-25)amid peptidekhez, ahol a ΡΛΜ gyantakötést bcnzhidril-amin(BHA)-polisztirol gyantával helyettesítjük. A BHA gyanta használata olyan peptidek keletkezését 11

-1020 eredményezi, amelyeknél a C végződésnél inkább amid, mint karboxi-forma található.

Hacsak másképpen nem jelezzük, a lánc-kombinációs reakciót ugyanúgy végezzük, amint azt korábban leírtuk, vagyis az A lánc 5 S-tio-etil-Cys származékával és a B lánc S-szulfo-Cys származékával.

A következő táblázatban szereplő összes szintetikus analóg relaxin-szerű biológiai aktivitást mutat a patkány-méh összehúzódási 10 vizsgálatban. Az egyedi peptid láncok kombinációjának kitermelését a biológiai vizsgálatok eredményeiből számítjuk, természetes sertés relaxin A(l-22)-B( 1-31 )-et használva

A(l-24) + B(l-25)amíd 0.80%

A(l-24) + B(l-25)amid, mindkét 3.10% láncban S-tioetil formát alkalmazva a kombinációs reakcióban

A(l-24) + B(3-25)ainid 0.68%

A(l—24) + (N-formil

Trp²) BI2-25) 0.43%

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK standardként.

TÁBLÁZAT

Szintetikus Η 1 humán relaxin analógok

A kombináció kitermelése (a B-lánc menynyisé gére alapozva

1. Eljárás humán Hl preprorelaxint kódoló DNS vagy még relaxin-hatású fehérjét kódoló alegysége előállítására, azzal jellemezve, hogy humán genom klón készletet, vizsgáló mintaként alkalmazott humán relaxin gén vagy sertés relaxin gén alegységgel végzett hibridizációval átvizsgálunk, és az alkalmas hibridizáló DNS szekvenciákat kiválasztjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal

A(l—24) + 13(1—23) 0.24% 05 jellemezve, hogy vizsgáló mintaként a sertés A(l-24) + Bíl-25) 0.70% relaxin C pepiid 45- -95. aminosavának megfe- A{1—24) + (Ala²⁴)B(l-26) 0.92% lelő , alábbi képletű gént alkalmazzuk: A(l-24) + B(l-32) 2.00% GCA GAA ACC ATG CCA TCC TCC ATC ACC AAA GAT GCA GAA ATC TTA AAG ATG ATG TTG GAA TTT GTT CCT AAT TTG CCA CAG GAG CTG AAG GCA ACA TTG TCT GAC AGG CAA CCA TCA CTG AGA GAG CTA CAA CAA TCT GCA TCA AAG GAT TCG. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljá- ból eredő variánsai vagy mindezek még rela- rés az alábbi mRNS szekvenciának megfelelő xin· -hatású fehérjéket kódoló alegységei elő- kettősszálú DNS vagy ennek a DNS szekven- állítására: c iá nak a természetes triplett-degeneraciójá- 40 AUG CCU CGC CUG UUC UUG UUC CAC CUG CUA GAA UUC UGU UUA CUA CUG AAC CAA UUU UCC AGA GCA GUC GCG GCC AAA UGG AAG GAC GAU GUU AUU AAA UUA UGC GGC CGC GAA UUA GUU CGC GCG CAG AUU GCC AUU UGC GGC AUG AGC ACC UGG AGC AAA AGG UCU CUG AGC CAG GAA GAU GCU CCU CAG ACA CCU AGA CCA GUG GCA GAA AUU GUA CCA UCC UUC AUC AAC AAA GAU ACA GAA ACU AUA AUU AUC AUG UUG GAA UUC AUU GCU AAU UUG CCA CCG GAG CUG AAG GCA GCC CUA UCU GAG AGG CAA CCA UCA UUA CCA GAG CUA CAG CAG UAU GUA CCU GCA UUA AAG GAU UCC AAU CUU AGC UUU GAA GAA UUU AAG AAA CUU AUU CGC AAU AGG CAA AGU GAA GCC GCA GAC AGC AAU CCU UCA GAA UUA AAA UAC UUA GGC UUG GAU ACU CAU UCU CAA AAA AAG AGA CGA CCC UAC GUG GCA CUG UUU GAG AAA UGU UGC CUA AUU GGU UGU ACC AAA AGG UCU CUU GCU AAA UAU UGC UGA azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti szálú DNS vagy em nek a DNS szekvenciának

DNS szekvenciákat választjuk ki.

a természetes triplett-degenerációjából eredő

4. A 3. igénypont ezerinti eljárás az 60 variánsai vagy mindezek még relaxin-hatású alábbi mRNS szekvenciának megfelelő kettősfehérjéket kódoló alegységei előállítására:

-1122

AAA UGG AAG GAC GAU GUU AUU AAA UUA UGC GGC CGC GAA UUA GUU CGC GCG CAG AUU GCC. AUU UGC GGC AUG AGC ACC UGG AGC AAA AGG UCU CUG AGC CAG GAA GAU GCU CCU CAG ACA CCU AGA CCA GUG GCA GAA AUU GUA CCA UCC UUC AUC AAC AAA GAU ACA GAA ACU AUA AUU AUC AUG UUG GAA UUC AUU GCU AAU UUG CCA CCG GAG CUG AAG GCA GCC CUA UCU GAG AGG CAA CCA UCA UUA CCA GAG CUA CAG CAG UAU GUA CCU GCA UUA AAG GAU UCC AAU cuu AGC UUU GAA GAA UUU AAG AAA CUU AUU CGC AAU AGG CAA AGU GAA GCC GCA GAC AGC AAU CCU UCA GAA UUA AAA UAC UUA GGC UUG GAU ACU CAU UCU CAA AAA AAG AGA CGA ccc UAC GUG GCA CUG UUU GAG AAA UGU UGC CUA AUU GGU UGU ACC AAA AGG UCU CUU GCU AAA UAU UGC UGA

azzal jellemezve, hogy a tárgyi kör szerinti DNS szekvenciákat választjuk ki.

5. Eljárás humán Hl preprorelaxint vagy alegységét kódoló DNS szekvencia fenntartására és replikáláséra alkalmas transzfer vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított, megfelelő restrikciós enzimmel hasított DNS szakaszt egy, megfelelő restrikciós enzimmel hasított bakteriofágba iktatunk be.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy bakteriofágként λ-fágot használunk.

7. Eljárás humán Hl preprorelaxint vagy alegységét kódoló DNS szakaszt tartalmazó E. coli sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárással előállított bakteriofággal E. coli törzset fertőzünk.

8. Eljárás humán Hl relaxin Arg-Pro-Tyr-Val-Ala-Leu-Phe-Glu-Lys-Cys-Leu-Ile-Gly-Cys-Thr-Lys-Arg-Ser-Leu-Ala-Lys-Tyr-Cys aminosav-sorrendü A láncénak, illetve legalább a 10-24. aminosavat tartalmazó részeinek megfelelő polipeptidek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő, védőcsoportokkal ellátott aminosavakat a peptidkémiában szokásos módszerekkel összekapcsoljuk, majd a védőcsoportokat eltávolítjuk.

9. Eljárás humán Hl relaxin Lys-Trp (vagy N-formil Trp)-Lys-Asp-Asp-Val-Ile15 -Lys-Leu-Cys-Gly-Arg-Glu-Leu-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Ala-Ile-Cys-Gly-Met (vagy Ala)-Ser-Thr-Trp-Ser-Lys-Arg-Ser-Leu aminosav-sorrendű B láncénak, illetve legalább a

3-23. aminosavat tartalmazó részeinek, illetve

20 mindezek variánsainak megfelelő polipeptidek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő, védócsoportokkal ellátott aminosavakat a peptidkémiában szokásos módszerekkel összekapcsoljuk, majd a védőcsoportokát eltávolít25 juk.

10. Eljárás humán Hl relaxin A láncát és humán Hl relaxin B láncét vagy a B lánc alábbi részei vagy variánsai valamelyikét tartalmazó humán Hl relaxin és analógjai elö30 állítására: Bíl—23), B(l-25) vagy ennek amidja, (Ala²⁴)B(l-26), B(3-25) vagy ennek amidja, (N-formil Trp²)B(2-25), azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti eljárással előállított A láncot és a 8. igénypont szerinti el35 járással előállított B láncot vagy a B lánc valamely, tárgyi kör szerinti részét vagy variánsát összekapcsoljuk.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az A lánc és a B lánc

40 vagy annak része vagy variánsa S-szulfonélt és/vagy S-tioalkilezett formáinak keverékét redukáljuk, a redukciós keveréket levegőn állni hagyva oxidáljuk, és a humán Hl relaxirit vagy Hl relaxin analógot az oxidált ke45 verőkből kinyerjük.