DE68906153T2

DE68906153T2 - Humanes relaxinpräparat.

Info

Publication number: DE68906153T2
Application number: DE89902688T
Authority: DE
Inventors: C Cipolla; H Nguyen; J Shire
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1988-02-26
Filing date: 1989-02-08
Publication date: 1993-10-28
Anticipated expiration: 2009-02-09
Also published as: ES2013394A6; IL89276A; IL89276A0; IE890452L; EP0407401B1; DE68906153D1; CN1035619A; PT89835A; US5451572A; US5945402A; NZ228012A; CA1336403C; ATE88352T1; JPH03502794A; AU3183389A; WO1989007945A1; AU626840B2; PT89835B; JP2815649B2; CN1052655C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile, homogene, biologisch aktive menschliche Relaxinformulierung, die zum Modulieren der Fortpflanzungsphysiologie von Säugetieren während Geburtsvorgang und Schwangerschaft verwendet werden kann.
Reifes menschliches Relaxin ist ein Eierstockhormonpeptid mit etwa 6000 Dalton, von dem bekannt ist, daß es für das Umformen des Fortpflanzungstraktes vor der Geburt verantwortlich ist, wodurch der Geburtsvorgang erleichtert wird. Hisaw, F.L., "Pros.Soc.Exp.Biol.Med.", 23, 661-663 (1926); Schwabe, C. et al., "Biochem.Biophys.Res.Comm.", 75; 503-570 (1977); James, R. et al., "Nature", 267:544-546 (1977). Dieses Protein scheint die Umstrukturierung von Bindegeweben in Zielorganen zu modulieren, um die erforderlichen Veränderungen in der Organstruktur während Schwangerschaft und Geburt zu erzielen. Einige der wichtigen Funktionen von Relaxin als ein Schwangerschaftshormon umfassen das Hemmen vorzeitiger Wehen und Zervixreifung bei der Geburt.
Während es hauptsächlich ein Schwangerschaftshormon ist, ist Relaxin auch bei nicht schwangeren Frauen sowie bei Männern festgestellt worden. Bryant-Greenwood, G.D., "Endocrine Reviews", 3: 62-90 (1982) und Weiss, G., "Ann.Rev.Physiol." 46: 43-52 (1984).
Relaxin ist von einer Vielzahl von Spezies einschließlich Schwein, Maus, Pferd, Hai, Tiger, Ratte, Hundshai und dem Menschen stammend gereinigt worden, und zeigt zumindest primäre und sekundäre strukturelle Homologie mit Insulin und dem insulinartigen Wachstumsfaktor. Beim Menschen wird Relaxin in der größten Menge in den Schwangerschaftsgelbkörpern (CL) gefunden.
Unter Verwendung von Sonden vom Schweine-Relaxingen sind zwei menschliche Genformen durch genomisches Klonen identifiziert worden (Hudson, P. et al., "Nature", 301: 628-631 [1984] und Hudson, P. et al , "The EMBO Journal", 3: 2333-2339 [1984]), obwohl nur bei einer dieser Genformen (H2) festgestellt wurde, daß sie in CL transkribiert wird. Es ist unklar, ob das andere Gen an einer anderen Gewebestelle exprimiert wird, oder ob es ein Pseudogen darstellt. Die beiden menschlichen Relaxingene weisen beträchtliche Nukleotid- und Aminosäurehomologie zueinander auf, besonders in den B- und C-Peptiden. Jedoch gibt es einige bemerkenswerte Bereiche mit Sequenzdivergenz, insbesondere im aminoterminalen Bereich sowohl der A- als auch der B-Ketten.
Ähnlich allen untersuchten Spezies ist das primäre Translationsprodukt von H2-Relaxin ein Präprorelaxin, das aus einer Signalsequenz mit 24 Aminosäuren, gefolgt von einer B-Kette mit etwa 29 Aminosäuren, einem Verbindungspeptid mit 104-107 Aminosäuren und einer A-Kette mit etwa 24 Aminosäuren besteht.
Die Tatsache, daß H2-Relaxin im Eierstock synthetisiert und exprimiert wird, deutet darauf hin, daß es sich dabei um eine Sequenz handelt, die an der Schwangerschaftsphysiologie beteiligt ist. Wenn synthetisches menschliches Relaxin (H2) und bestimmte menschliche Relaxinanaloge auf biologische Wirksamkeit untersucht wurden, zeigten die Tests einen für biologische Wirksamkeit notwendigen Relaxinkern sowie bestimmte Aminosäuresubstitutionen für Methionin, die die biologische Wirksamkeit nicht beeinflußten. Johnston et al., in "Peptides: Structure and Function", "Proc. Ninth American Peptide Symposium", Deber C.M. et al., (Hrsg) (Pierce Chem. Co. 1985).
Verschiedene Verfahren zum Anwenden oder Einführen von Schweine-Relaxin als ein Arzneimittel sind veröffentlicht worden, einschließlich intravenöser oder intramuskulärer Verabreichung. Birnberg und Abitol, "Obstet. & Gynecol." 10: 366-370 (1957); Eichner et al., "Am.J.Obstet.Gyn." 71: 1035-1048 (1956). Außerdem ist Schweine-Relaxin örtlich bei klinischen Versuchen an Menschen zum Reifen der Zervix und Einleiten der Wehen verwendet worden. Mac Lennan et al., "Obstetrics & Gynecology", 68: 598-601 (1986); Mac Lennan et al., "The Lancet", i: 220-223 (1980); Mac Lennan et al., "Obstetrics & Gynecology" 58: 601-604 (1981); Mac Lennan et al., "Aust. NZ J. Obstet. Gynaec." 25: 68-71 (1985). In diesen Untersuchungen wurde das Schweine-Relaxin in destilliertem Wasser mit wasserlöslichem Methylzellulosegranulat gemischt, um ein viskoses Gel herzustellen. Es wurde festgestellt, daß eine 2 mg-Dosis das Zervix-Ergebnis verbessert. Mac Lennan et al., (1981), oben.
Außerdem ist Schweine-Relaxin in aus Polyäthylenglykol hergestellte Pellets geformt und zum Reifen der menschlichen Zervix verwendet worden. Evans et al., "Am.J.Obstet.Gynecol." 147: 410-414 (1983). Schweine-Relaxin ist auch durch Suspension in einem sterilen K-Y-Gel und phosphatgepufferter Salzlösung formuliert und mit einer sterilen Befruchtungspipette in den Muttermund infundiert worden. Die Erweiterung der Zervix nahm innerhalb von 8 Stunden nach der Infusidn von 3000 Einheiten Relaxin in den Muttermund zu. Perezgrovas und Anderson, "Biology of Reproduction". 26: 765-776 (1982).
Die am 24. August 1983 veröffentlichte EP-A Nr. 86,649 offenbart die Herstellung von Schweine-Präprorelaxin, Schweine-Prorelaxin und Schweine-Relaxin. Das Australische Patent Nr. 561,670 vom 26. August 1987, die EP-A Nr. 68,375 vom 5. Januar 1983 und Haley et al., "DNA" 1: 155-162 (1982), offenbaren die Herstellung von Schweine-Relaxin.
Die EP-A Nr. 101,309 vom 22. Febraur 1984 und die US-PS-4,758,516 vom 19. Juli 1988 offenbaren jeweils das Molekularkloning und die Charakterisierung einer Gensequenz, die für menschliches H1-Relaxin und menschliches H2-Relaxin und Analoge davon kodieren. Die EP-A Nr. 260,149 vom 16. März 1988 offenbart Formulierungen von menschlichem Prorelaxin. Die US-PS-4,267,101 vom 12. Mai 1981 offenbart ein Verfahren zum Erhalt von menschlichem Relaxin aus fötalen Membranen. Die EP-A Nr. 251,615 vom 7. Januar 1988 offenbart, wie man reduzierte menschliche Relaxin-A-Kette oder Analog und reduzierte menschliche Relaxin-B-Kette oder Analog unter Bedingungen kombiniert, die einen pH-Wert über etwa 7,0 einschließen.
Ein Verfahren zum Erhalt von menschlichem Relaxin aus fötalen Membranen wird in der US-PS-4,267,101 geoffenbart. Sherwood, in "The Physiology of Reproduction", herausgegeben von Knobil und Neill (New York, Raven Press, 1988) S.585-673 offenbart auf Seite 587, daß beinahe alle Verfahren zur Extraktion und Isolation von Relaxin die Stabilität von Relaxin in sauren Lösungsmitteln ausnutzen. Außerdem wird auf Seite 588 festgestellt, daß stark saures Medium zur Extraktion von Relaxin die Proteolyse sowohl durch den niedrigen pH-Wert an sich als auch durch die Ausfällung von Proteasen mit hohem Molekulargewicht minimiert. Eldridge und Fields, "Endocrinology" 117: 2512-2519 (1985) haben berichtet, daß Kaninchen-Relaxin einen isoelektrischen Punkt von etwa 6,5, wie durch Isoelektrofokussieren bestimmt, aufweist. Das steht im Gegensatz zu den Ergebnissen von Fields et al. "Ann. NY Acad. Sci" 380: 75 (1982), die für Kaninchen-Relaxin einen viel höheren isoelektrischen Punkt ermittelten.
Darüberhinaus offenbart die US-PS-2,964,448 vom 13. Dezember 1960 injizierbare Relaxinzusammensetzungen, die Relaxin in einem injizierbaren Öl, vorzugsweise mit geringem Säuregrad, gemeinsam mit einem Fettsäuresalz von Aluminium umfassen.
Die EP-A 107782 und EP-A 107045 beschreiben die Reinigung von Relaxin aus natürlichen Quellen, in deren Verlauf eine gepufferte Lösung zur Chromatographie verwendet wird. Jedoch ist das Endprodukt eine entsalzte und lyophilisierte Form von Relaxin.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine biologisch aktive, stabile, homogene Formulierung von menschlichem Relaxin zur Verwendung in therapeutischen, d.h. lokalen oder parenteralen Anwendungen zu schaffen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine Formulierung zu schaffen, die die Lagerung für einen langen Zeitraum in flüssigem Zustand ermöglicht, wodurch die Lagerung und der Transport vor der Verabreichung erleichtert wird. Wieder ein anderes Ziel besteht darin, die Aggregation und den Abbau von menschlichem Relaxin zu verringern und eine Formulierung davon zu schaffen, die gegen aus Temperaturschwankungen resultierenden Abbau widerstandsfähig ist. Wieder ein anderes Ziel ist die Formulierung von menschlichem Relaxin als Gel för zervikale Anwendungen. Ein weiteres Ziel ist die Schaffung einer Formulierung aus menschlichem Relaxin, die zusätzliche therapeutische und physikalische/chemische Vorteile aufweist.
Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden durch die Betrachtung der vorliegenden Beschreibung als Ganzes deutlich.
Demgemäß schafft die vorliegende Erfindung eine biologisch wirksame pharmazeutische Zusammensetzung, die zum Modulieren der Fortpflanzungsphysiologie von Säugetieren nützlich ist und eine wirksame Menge von menschlichem Relaxin in einem Puffer enthält, der den pH-Wert der genannten Zusammensetzung bei etwa 4 bis weniger als etwa 7, mehr vorzuziehen 4,5 bis 5,5 hält. Außerdem ist die Formulierung vorzugsweise isotonisch.
Die Zusammensetzung kann in Form einer Flüssigkeit, Lyophilisat, gefrorenen Flüssigkeit oder Gel vorliegen. Wenn die Zusammensetzung in Form eines Gels vorliegt, umfaßt es vorzugsweise weiters ein wasserlösliches Polysaccharid oder Polyäthylenglykol, am meisten vorzuziehen Methylzellulose.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann bei einem Verfahren zum Modulieren der Fortpflanzungsphysiologie von Säugetieren verwendet werden, welches das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Zusammensetzung an das Säugetier umfaßt.
Bis zur vorliegenden Erfindung ist nicht anerkannt worden, daß die Abbauraten von menschlichem Relaxin unter sauren Bedingungen, wie durch HPLC festgestellt, langsamer bei einem optimalen Wert sind. Daher kann die Immunogenität der Formulierung verringert und ihre Sicherheit verbessert werden. Als Ergebnis dieser Feststellung kann eine Formulierung von menschlichem Relaxin hergestellt werden, die biologische Aktivität beibehält, eine lange Lagerbeständigkeit aufweist und mit oder ohne Lyophilisierung therapeutisch verabreicht werden kann. Vorzugsweise ist das Relaxin mit einem pH-Wert von etwa 5 mit einer Lagerbeständigkeit (unter Annahme einer annehmbaren Verringung von 10% im HPLC-Hauptpeakbereich) bei 5ºC von zumindest 2 Jahren formuliert.
Die Figuren 1a bis 1e stellen graph. Darstellungen der Fraktion des Haupt-Umkehrphasen-HPLC-Peaks für menschliches Relaxin als Zeitfunktion für fünf verschiedene Formulierungen im Bereich von pH 3 bis 7,5 bei drei verschiedenen Temperaturen dar.
Figur 2 stellt eine graphische Darstellung der Abbaurate von menschlichen Relaxinformulierungen als Funktion des pH-Werts der Formulierung dar, wie durch Umkehrphasen-HPLC bei drei verschiedenen Temperaturen gemessen.
Die Figuren 3a bis 3e stellen graphische Darstellungen der Wirksamkeit von menschlichem Relaxin als Zeitfunktion für fünf verschiedene Formulierungen im Bereich von pH 3 bis 7,5 bei drei verschiedenen Temperaturen dar.
Figur 4 stellt ein Balkendiagramm der Abbaurate bei 25ºC des Haupt-Umkehrphasen-HPLC-Peaks in einer Zitratformulierung mit pH 5 dar, die verschiedene Stabilisierungsmittel hinzugefügt aufweist.
Figur 5 stellt eine graphische Darstellung der Serumkonzentration gegenüber der Zeit für kurzes Relaxin in trächtigen Kaninchen nach intravenöser, subkutaner und intravaginaler Verabreichung dar.
Figur 6 stellt eine graphische Darstellung der Serumkonzentration gegenüber der Zeit für kurzes Relaxin in trächtigen Kaninchen nach subkutaner Verabreichung mit und ohne Benzopurpurin dar.
Wie hierin verwendet bezeichnet menschliches Relaxin ein funktionelles Protein, das spezifische hormonale Funktionen aufweist, wie beispielsweise die Modulierung der Fortpflanzungsphysiologie von Menschen und möglicherweise anderen Säugetieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Aufrechterhaltung der Schwangerschaft, Bewirken des Geburtsvorgangs und Erhöhen der Samenmotilität als Hilfe bei der Befruchtung. Als spezifische Beispiele für derartige Verwendungen sind die Durchführung zahlreicher Fortpflanzungsfunktionen, die sich auf die Schwangerschaft beziehen, sowie anderer biologischer Funktionen wie die Vorbereitung des Geburtskanals durch, beispielsweise, Wirkungen auf die Schamfuge oder das pubische Ligament, und die Neuordnung kollagenöser Fasern, wodurch die Geburt bewirkt wird; Depressorwirkung auf die Uterusmuskulatur; Vorbereitung der Gebärmutterschleimhaut für Implantation; Rolle bei der Luteolyse, Wachstum und Differenzierung der Milchdrüsen; Erhöhung der Samenmotilität; und mögliche Erhöhung der Fähigkeit von Sperma, in die menschliche Zervix einzudringen. Die Funktionalität von menschlichem Relaxin oder Varianten davon wird dadurch bestimmt, ob es eine positive Wirkung auf die Mäuse-Schamfuge in einem Bioassay in vitro oder eine Zunahme der cAMP-Werte bei einem in vitro-Assay unter Verwendung einer Uteruszell-Linie gibt. Der Begriff "biologisch aktiv" zum Definieren pharmazeutischer Zusammensetzungen wird hierin im oben für menschliches Relaxin dargelegten Kontext verwendet.
Menschliches Relaxin und die Verfahren zu seiner Herstellung, einschließlich der Synthese in rekombinanter Zellkultur, sind bekannt (z.B. EP-A 101,309 und 112,149, oben).
Im Bedeutungsumfang des Begriffs "Relaxin" eingeschlossen sind menschliche Relaxine von rekombinanten und nativen Quellen sowie Relaxinvarianten wie Aminosäuresequenzvarianten. Durch massenspektroskopische Ionisierung unter Einsatz von Schnell-Atom-Beschuß ist herausgefunden worden, daß die vorherrschende Spezies von menschlichem Relaxin im Gelbkörper und Serum die H2-Relaxinform mit einer abgestumpften B-Kette ist, d.h. Relaxin H2(B29 A24), worin die vier C-terminalen Aminosäuren der B-Kette abwesend sind, sodaß die B-Kette mit einem Serin an Position 29 endet. Diese vorherrschende Form, (die hierin als "kurzes Relaxin" bezeichnet wird, im Gegensatz zu dem "langen Relaxin", das eine B-Kette mit 33 Aminosäuren enthält) wird zur Verwendung hierin bevorzugt.
Auch im Bedeutungsumfang des Begriffs "menschliches Relaxin" eingeschlossen sind andere Einfügungen, Substitutionen oder Löschungen eines oder mehrerer Aminosäurereste, Glykosylierungsvarianten, nicht glykosyliertes menschliches Relaxin, organische und anorganische Salze, kovalent modifizierte Derivate von menschlichem Relaxin, menschliches Präprorelaxin und menschliches Prorelaxin. Durch die Verwendung rekombinanter DNA-Technologie können Relaxinvarianten hergestellt werden, indem die zugrundeliegende DNA geändert wird. Alle derartige Variationen oder Veränderungen in der Struktur des Relaxinmolekuls, das zu Varianten führt, sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung enthalten, solange die funktionelle (biologische) Aktivität des menschlichen Relaxins beibehalten wird. Diese Varianten von menschlichem Relaxin haben die beschriebene funktionelle Wirksamkeit und können unter Verwendung der obengenannten in vitro-Assays leicht identifiziert werden.
Aus für Relaxin kodierenden Sequenzen können Varianten hergestellt werden, die auf eine oder mehrere Arten verändert sind, um für Asparaginsäure kodierende Kodone an einer oder mehreren spezifischen Position(en) innerhalb des ausgewählten Gens einzufügen. Die resultierenden Proteinvarianten können mit verdünnter Säure behandelt werden, um ein gewünschtes Protein oder Peptid freizusetzen, wodurch das Protein leichter isolierbar und reinigbar wird.
Relaxin kann auch durch Erzeugung eines Fusionsproteins aus einer Relaxinkette und Ubiquitin und Verwendung einer Ubiquitinhydrolase zum Spalten des Proteins hergestellt werden. Außerdem kann ein Hefeexpressionssystem für Prorelaxin unter Verwendung eines Vektors eingesetzt werden, der für transaktivierendes Protein kodiert.
Das erfindungsgemäße Relaxin kann durch die Synthese der A- und der B-Kette und deren Reinigung und Zusammenfügung hergestellt werden, wie in der EP-A 251,615 vom 7. Januar 1988 beschrieben. Für synthetisches Relaxin wird im allgemeinen ein Molverhältnis von 4:1 zwischen A- und B-Kette eingesetzt.
Das resultierende Produkt wird dann durch eine dem Fachmann üblicherweise bekannte Einrichtung gereinigt, einschließlich beispielsweise Umkehrphasen-HPLC, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Dialyse oder ähnliches, oder jegliche Kombination derartiger Verfahren.
Die in der Zusammensetzung zu formulierende wirksame Menge an Relaxin wird auf Basis verschiedener Variablen ausgewählt, einschließlich des im speziellen zu behandelnden Zustands, der Krankengeschichte des Patienten, und des verwendeten therapeutischen Wegs und Plans. Zu behandelnde Zustände umfassen die schwierige Entbindung eines voll ausgereiften Fötus, die Hemmung vorzeitiger Wehen und die Behandlung bestimmter Bindegewebsstörungen wie Sklerodermie. Der therapeutische Weg umfaßt parenterale Verabreichung wie z.B. subkutane, intraperitoneale, intravenöse und intramuskuläre Verabreichung.
Die durchschnittliche gegenwärtige Dosis für die Behandlung einer Problemschwangerschaft variiert in Abhängigkeit von zahlreichen Indizien, die dem Arzt mit allgemeinem Wissensstand bekannt sind, einschließlich des Verabreichungswegs und -plans, des Schwangerschaftsstadiums, der Relaxinart, des Zustandes des zu behandelnden Patienten, der Form der Zusammensetzungen und anderere Überlegungen, die dem Arzt bekannt sind. Als ein Beispiel aus der Klinik beträgt die wirksame Menge zur lokalen Verabreichung geeigneterweise etwa 5 bis 10 ml Gel, das etwa 1 bis 3 mg menschliches Relaxin enthält. Die durchschnittlichen Dosen für intravenöse Verabreichung liegen im Bereich von etwa 0,1 ug pro Kilogramm bis 1500 mg pro Kilogramm, um Fortpflanzungsfunktionen wie die Vorbereitung des Geburtskanals zu bewirken.
Der pH-Wert der Formulierung wird bei etwa 4 bis weniger als etwa 7, mehr vorzuziehen etwa 4 bis 6, noch mehr vorzuziehen etwa 4,5 bis 5,5 und am meisten vorzuziehen etwa 5 gehalten. Der optimale pH-Wert hängt wiederum von der Ionenstärke und Lagertemperatur der Formulierung ab. Die Formulierung ist vorzugsweise isotonisch, und vorzugsweise beträgt die Ionenstärke u der Formulierung zumindest etwa 0,1, mehr vorzuziehen etwa 0,1 bis 0,2, am meisten vorzuziehen etwa 0,15 molar, und die Osmolalität der Formulierung beträgt vorzugsweise etwa 200 bis 300 mmol/kg, mehr vorzuziehen etwa 240-260 mmol/kg. Wenn die Lagertemperatur etwa 40ºC beträgt, liegt der pH-Wert vorzugsweise bei etwa 4 bis weniger als etwa 7. Wenn die Lagertemperatur etwa 25ºC beträgt, ist der pH-Wert vorzugsweise etwa 4 bis 5.
Vorzugsweise wird der pH-Wert der Formulierung gemäß vorliegender Erfindung unter Verwendung eines Puffers aufrechterhalten, der geeignet ist, den pH-Wert innerhalb des gewünschten Bereichs zu halten. Ob ein bestimmter Puffer verwendet werden kann, hängt von seiner Pufferkapazität ab, genauer gesagt von seinem pK-Wert. Beispiele umfassen bestimmte organische Säurepuffer und Histidin. Geeignete organische Säurepuffer (Puffer aus organischen Säuren und Salzen davon) umfassen z.B. Zitratpuffer (z.B. Mononatriumzitrat-Dinatriumzitrat-Mischung, Zitronensäure- Trinatriumzitrat-Mischung, Zitronensäure-Mononatriumzitrat-Mischung usw.), Succinatpuffer (z.B. Bernsteinsäure-Mononatriumsuccinat-Mischung, Bernsteinsäure-Natriumhydroxid-Mischung, Bernsteinsäure- Dinatriumsuccinatmischung usw.), Tartratpuffer (z.B. Weinsäure-Natriumtartrat-Mischung, Weinsäure-Kaliumtartrat-Mischung, Weinsäure-Natriumhydroxid-Mischung usw.) Malatpuffer, Glukonatpuffer (z.B. Glukonsäure-Natriumglukonat-Mischung, Glukonsäure-Natriumhydroxidmischung, Glukonsäure-Kaliumglukonatmischung usw.), Boratpuffer, Imidazolpuffer, Laktatpuffer (z.B. Milchsäure-Natriumlaktatmischung, Milchsäure-Natriumhydroxidmischung, Milchsäure-Kaliumlaktatmischung usw.) und Acetatpuffer (z.B. Essigsäure-Natriumacetatmischung, Essigsäure-Natriumhydroxid-Mischung usw.). Die erfindungsgemäß am meisten bevorzugten Puffer sind Zitrat- und Acetatpuffer, am meisten bevorzugt Zitrat. Es ist festzuhalten, daß Puffer wie Phosphat- und Tris-Puffer, die traditionellerweise verwendet worden sind, den pH-Wert der Formulierung nicht auf der gewünschten Höhe halten.
Die erfindungsgemäße Formulierung weist vorzugsweise die richtige Isotonität und Osmolalität auf, um für parenterale Anwendungen, insbesondere intravenöse, nützlich zu sein. Wenn die Ionenstärke und Osmolalität nicht in den obengenannten bevorzugten Bereichen liegen, und es wünschenswert ist, sie auf diese Bereiche einzustellen, kann ein Agens zur Formulierung hinzugefügt werden, das die Osmolalität auf geeignete Weise einstellt. Derartige Agenzien umfassen beispielsweise Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze wie Halogenide, beispeilsweise Natrium- und Kaliumchlorid, Magnesiumbromid usw., und neutrale mehrwertige Zuckeralkohole wie Mannit. Das am meisten bevorzugte Agens ist Natriumchlorid.
Ein pharmazeutisch verträgliches Agens zum Stabilisieren und Lyophilisieren der Formulirung kann zu der Formulierung ebenfalls hinzugefügt werden. Beispiele umfassen mehrwertige Zuckeralkohole wie dreiwertige oder höhere Alkohole, am meisten vorzuziehen, Glycerin, Erythrit, Glycerol, Arabit, Xylit, Sorbit und Mannit, sowie geradkettige Alkohole wie z.B. Äthanol und Propylenglykol. Diese Agenzien können alleine oder in einer Kombination davon verwendet werden. Vorzugsweise ist das Agens unter Berücksichtung der Mengen der anderen Ingredienzien in einer Menge von etwa 1 bis 25 Gew.-%, und vorzugsweise 2 bis 10 Gew.-% formuliert.
Außerdem enthält die erfindungsgemäße Zusammensetzung geeigneterweise ein Agens, um die Absorption durch die Zervix oder Vagina zu erhöhen, wenn das Präparat der lokalen Anwendung dient. Beispiele für derartige Absorptionsverstärker umfassen Moleküle, die eine der von Cholesterin ähnliche Struktur aufweisen, wie Glykocholat, z.B. Natriumglykocholat, Cholat, z.B. Natriumcholat und Fusidinsäure und seine Derivate, einschließlich Salze und Ester wie 24,25-Tourodihydrofusidat; nicht-ionische Tenside; Derivate von Fettsäuren mit etwa 7 bis 25 C-Atomen, wie Ölsäure; Niacinamid; Nikotin- oder Salicylsäure oder ihre Salze oder Ester; und Azon.
Die bevorzugte flüssige Zusammensetzung gemäß vorliegender Erfindung ist menschliches Relaxin in einem 10 mM Zitratpuffer mit pH 5, wobei Natriumchlorid bis zu einer gesamten Ionenstärke von etwa 0,15 molar vorhanden ist, was die richtige Osmolalität darstellt.
Die erfindungsgemäße Formulierung kann in flüssiger, gefrorener oder Gelform vorliegen oder kann lyophilisiert und rekonstituiert sein. Ein Fachmann wird fähig sein, die Art und Menge eines zusätzlichen Exzipienten, wie Zuckeralkohol zu bestimmen, der notwendig sein könnte, um die Lyophilisierung zu optimieren. Mannit ist ein derartiges bevorzugtes Additiv. Die erfindungsgemäße Formulierung ist für längere Zeiträume stabil kann in einem flüssigen Zustand bei verschiedenen Temperaturen gelagert werden. Vorzugsweise wird die flüssige Formulierung in Glas und nicht in Kunststoff gelagert. Außerdem kann die Formulierung ohne negative Wirkungen eingefroren, aufgetaut, wieder eingefroren und wieder aufgetaut werden. Eine bevorzugte Lagertemperatur liegt im Bereich von -20 bis 30ºC, wobei die am meisten bevorzugte Lagertemperatur im Bereich von etwa 2 bis 8ºC liegt. Die Formulierung gemäß vorliegender Erfindung in flüssiger Form behält ihre biologische Wirksamkeit für zumindest 30 Tage und physikalische Stabilität für zumindest 2 Jahre bei, wie von den Daten eines Jahres extrapoliert.
Um eine Gelformulierung zu erhalten, wird die flüssige Zusammensetzung typischerweise mit einer wirksamen Menge eines wasserlöslichen Polysaccharids oder Polyäthylenglykols gemischt, um ein Gel mit der richtigen Viskosität für lokale Anwendung zu bilden. Das Polysaccharid, das verwendet werden kann, umfaßt beispielsweise Zellulosederivate wie verätherte Zellulosederivate, einschließlich Alkylzellulosen, Hydroxyalkylzellulosen und Alkylhydroxyalkylzellulosen, beispielsweise Methylzellulose, Hydroxyäthylzellulose, Carboxymethylzellulose, Hydroxypropylmethylzelullose und Hydroxypropylzellulose; Stärke und fraktionierte Stärke; Agar, Alginsäure und Alginate; Gummiarabikum; Pullullan; Agarose; Carrageenan; Dextrane; Dextrine; Fruktane; Inulin; Mannane; Xylane; Arabinane; Chitosane; Glykogene; Glukane; und synthetische Biopolymere; sowie Gummi wie Xanthangummi; Guargummi; Karobengummi; Gummiarabikum; Tragacanthgummi; und Karayagummi; und Derivate und Mischungen davon. Das bevorzugte erfindungsgemäße Gelierungsmittel ist eines, das für biologische Systeme inert, nicht toxisch, einfach herzustellen und nicht zu flüssig oder viskos ist, und das darin gehaltene Relaxin nicht destabilisiert.
Vorzugsweise ist das Polysaccharid ein veräthertes Zellulosederivat, mehr vorzuziehen ein solches, das gut definiert, gereinigt und in USP aufgelistet ist, z.B. Methylzellulose und die Hydroxyalkylzellulosederivate, wie Hydroxypropylzellulose, Hydroxyäthylzellulose und Hydroxypropylmethylzellulose. Am meisten hierin bevorzugt wird Methylzellulose.
Das zum Gelieren bevorzugte Polyäthylenglykol ist typischerweise eine Mischung aus Polyäthylenglykolen mit geringem und hohem Molekulargewicht, um die richtige Viskosität zu erzielen. Beispielsweise wäre eine Mischung aus einem Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 400-600 mit einem Molekulargewicht von 1500 für diesen Zweck wirksam, wenn sie im richtigen Verhältnis gemischt werden, um eine Paste zu erhalten.
Der Begriff "wasserlöslich" wie auf Polysaccharide und Polyäthylenglykole angewandt, soll kolloidale Lösungen und Dispersionen einschließen. Im allgemeinen wird die Solubilität der Zellulosederivate durch das Ausmaß der Substitution von Äthergruppen bestimmt, und stabilisierende Derivate, die gemäß vorliegender Erfindung nützlich sind, sollten eine ausreichende Menge an derartigen Äthergruppen pro Anhydroglucoseeinheit in der Zellulosekette aufweisen, um die Derivate wasserlöslich zu machen. Ein Ausmaß an Äthersubstitution von zumindest 0,35 Äthergruppen pro Anhydroglukoseeinheit ist im allgemeinen ausreichend. Außerdem können die Zellulosederivate in der Form von Alkalimetallsalzen, beispielsweise als Li-, Na-, K- oder Cs-Salze vorliegen.
Wenn Methylzellulose im Gel verwendet wird, umfaßt es vorzugsweise etwa 2-5% des Gels, und das Relaxin ist in einer Menge von etwa 100 bis 1000 ug pro ml Gel vorhanden. Mehr vorzuziehen umfaßt die Methylzellulose etwa 3% des Gels, und die Menge an Relaxin beträgt etwa 300 bis 1000 ug pro ml Gel.
Auch enthält die Formulierung, wenn sie ein lichtempfindliches Gel ist, ein oder mehrere Agenzien wie Oxidationshemmer, vorzugsweise Ascorbinsäure (vorzugsweise zumindest 0,5%) und/oder Co-Lösungsmittel, vorzugsweise Glycerin und/oder Äthanol (vorzugsweise mit etwa 20%), am meisten vorzuziehen Glycerin, um Photooxidation zu hemmen oder zu verhindern, wenn das Gel Licht ausgesetzt wird. Beispielsweise wird das Methylzellulosegel in einer mit Folie abgedeckten oder gefärbten Phiole gelagert, um das Eintreten von Licht zu verhindern.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, sollen aber den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränken.

BEISPIEL I

Untersuchungen über die Stabilität von menschlichem Relaxin wurden in mehreren 10 mM-Puffern mit einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 10 durchgeführt (Untersuchung 1). Die Wirkungen der zunehmenden Ionenstärke auf die Stabilität der Formulierungen wurden ebenfalls untersucht (Untersuchung 2).

Probenherstellung

Für die Untersuchungen 1 und 2 wurde menschliches langes Relaxin (H2-Form mit B-Kette aus 33 Aminosäuren) durch Synthetisieren der A- und der B-Kette (geoffenbart in EP-A 112,149, oben) unter Verwendung der synthetischen Festphasenmethodik von Barany, G. und Merrifield et al., (1980) in "The Peptides" 2: 1-284, Gross, E. und Meienhofer, J. Hrsg., Academic Press, New York, erhalten. Die Ketten wurden HPLC-gereinigt (Trifluoressigsäure (TFA)/Acetonitrilgradient), und in einem Gewichtsverhältnis von 4:1 der A:B-Kette bei einem pH-Wert von etwa 10,2 in 0.2-1M CAPS-Puffer (3-[Zyklohexylamino]propansulfonsäure, Calbiochem), 0,75 M Guanidinhydrochlorid, 10 Vol-% Methanol (Burdick und Jackson) und einem Gesamtproteinbereich von 0,25 bis 2,0 mg/ml zusammengestellt. Die Lösung wurde gründlich mit Stickstoff gespült, und über Nacht (12-18 Stunden) bei 20ºC gerührt. Die Probe wird dann in einen geeigneten Puffer (phosphatgepufferte Salzlösung, 0,01% Tween 20, oder 0,1% Essigsäure) dialysiert und unter Verwendung eines TFA/Acetonitrilgradienten auf eine Vydac C-4-HPLC-Säule aufgebracht. Die Relaxinfraktion wurde auf HPLC identifiziert und in einem TFA-Puffer gesammelt, der durch Unterdruck aus der Probe entfernt wurde. Das so erhaltene Relaxin wurde lyophilisiert.
124 mg (etwa 80 Gew.-% als Peptid) des langen Relaxins wurden für Untersuchung 1 verwendet, und 20 mg (etwa 67 Gew.-% Peptid) für Untersuchung 2. Beide Proben waren weiße lyophilisierte Pulver mit bis zu 15 Gew.-% Trifluoressigsäure (TFA). Ausreichend Milli-Q-Wasser (entionisiertes Wasser, das durch ein Wasserreinigungssystem geschikt worden war, das aus Aktivkohle und Ionenaustauschern bestand, hergestellt von Millipore, Inc.) wurde hinzugefügt, um eine Konzentration von etwa 1 mg/ml Peptid zu erhalten.
Das lange Relaxin in Milli-Q-Wasser wurde durch Dialyse bei 5ºC unter Verwendung der Spectrapor 7 (3500 MW-Cutoff) Dialyseröhre in das geeignete Formulierungspuffersystem ausgetauscht. Diese Röhre wurde in 2 l Milli-Q-Wasser vorgereinigt, das 1 ml β-Mercaptoäthanol, 3,36 g EDTA und 4,2 g NaHCO&sub3; enthielt, gefolgt von 4 Wäschen in 2 l Milli-Q-Wasser bei 60 bis 70ºC. Die Röhre wurde daraufhin in 50 % (Gew./mol) Äthanol bei 5ºC gelagert, und vor der Dialyse ausgiebig gewaschen.
Die Konzentrationen aller Proben unmittelbar nach der Dialyse wurden bestimmt durch Ultraviolettabsorptionsspektroskopie unter Einsatz eines Extinktionskoeffizienten von 2,18 (mg/ml)&supmin;¹cm&supmin;¹, wie durch quantitative Aminosäureanalyse an einem Analog von Relaxin bestimmt, wobei die Methioninreste durch Lysinreste ersetzt wurden, wobei die Konzentrationen für die Wirkungen von Lichtstreuung korrigiert wurden. Jede Probe wurde in einer Laminarströmungshaube durch 0,2 um Millex-GV-4 (Oberfläche 6,45 mm²)-Filter in sterile 100uL, 300uL oder 1,5 ml-Borsilikatglasphiolen (Wheaton) mit Schraubkappen mit Teflon ausgekleideten Schraubkappen sterilgefiltert und bei 5, 25 und 40ºC gelagert. Die Konzentrationen sind genaue Indikatoren dafür, was in die Phiolen gefiltert wurde, weil getrennte Versuche zeigten, daß Filtration bei 1 mg/ml zu keiner wesentlichen Verringerung der Proteinkonzentration führt.
In Untersuchung 1 wurden je drei Phiolen für jeden Puffer bei jeder Temperatur gelagert, um Fehlerschätzungen zu erhalten und um zu bestimmen, ob Proben bei wiederholter Probeentnahme aus der gleichen Phiole verschmutzt wurden.
Für Untersuchung 3 wurde das Relaxin H2(B33 A24) Apyro-Glu¹ verwendet, worin H2 sich auf das im menschlichen Eierstock exprimierte menschliche Gen bezieht, A und B sich auf die jeweiligen Ketten von menschlichem Relaxin beziehen, die A oder B folgenden Zahlen sich auf die Länge der Kette beziehen, d.h. Anzahl an Aminosäuren, aus denen die A- oder B-Kette besteht, und die tiefstehenden Buchstaben, die der Aminosäure vorangehen, die A- oder B-Kette bezeichnen, in der die Aminosäure angeordnet ist, und der der Aminosäure folgende Index sich auf die Position in der Kette bezieht. Die Herstellung dieses Analogs und die Rekombination der Ketten werden allgemein in der EP-A Nr. 251,615, oben, beschrieben. Das Protein wurde wie oben für die Untersuchungen 1 und 2 beschrieben gereinigt.
Etwa 36 ml menschliches pyroglu-Relaxin mit etwa 4,65 mg/ml wurde in 10 mM Zitrat bei pH 5,0 wie oben beschrieben formuliert und durch Hinzufügen von NaCl isotonisch gemacht. Dieses Protein wurde auf 1 mg/ml verdünnt (spektrophotometrisch unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 2,18 bestimmt). Insgesamt 1,4 ml einer jeden Formulierung wurden in einer Laminarströmungshaube in autoklavierte 1,5 ml-Glasphiolen, die mit Teflonstöpsel versehen waren, sterilgefiltert. Bei einer Untersuchung der Gefrier- und Gefrier-Auftau-Wirkungen, wurde das Protein auch auf 2 mg/ml verdünnt und eingefroren, und dann wurden Untersuchungen durchgeführt.

Stabilitätsprotokoll

Untersuchung 1: 20 ml-Teilmengen langes Relaxin mit etwa 1 mg/ml in Wasser wurden durch Dialyse in 10 mM Glycin (pH 3), 10 mM Zitrat (pH 5), 10 mM Acetat (pH 5), 10 mM Histidin (pH 6) und 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5) dialysiert, wobei die genauen Zusammensetzungen in Tabelle 1 angeführt sind, wobei die Zitratpufferingredienzien so berechnet sind, daß sie einen pH-Wert von 5,0 ergeben. Alle Puffer wurden durch das Hinzufügen von NaCl bis zur Isotonität (0,154 Mol) gebracht. Die Konzentrationen wurden wie zuvor beschrieben bestimmt, die Proben sterilgefiltert und Phiolen nach der in Tabelle II gezeigten Vorschrift gefüllt. Die resultierenden 135 100- u-Mikrophiolen und 90 1,5-ml-Phiolen wurden Stabilitätstests bei 5, 25 und 40ºC unterworfen. Proben wurden an Tag 0, 7, 21 und 30 durch Umkehrphasen-HPLC, ELISA- und zyklische AMP-Assays bestimmt. Zusätzlich zu diesen Assays wurden die Proben auch durch zirkularen Dichroismus im nahen UV-Bereich (nah-UV-CD) und analytisches Ultrazentrifugieren (UC) an den Tagen 0 und 30 bestimmt. Außerdem wurde die Zitratformulierung 5 Monate lang durch Umkehrphasen-HPLC bei 5ºC und sechzig Tage lang durch Umkehrphasen-HPLC bei -20ºC analysiert.
Untersuchung 2: 1 ml-Teilmengen des langen Relaxins mit etwa 1 mg/ml in Wasser wurden durch Dialyse in 10 mM Acetat-, Zitrat- und Succinatpuffer bei pH 5 ohne zusätzliches Salz, 0,1 M oder 0,5 M NaCl (Pufferzusammensetzungen in Tabelle I angegeben) ausgetauscht. Die resultierenden neun Proben wurden jede sterilgefiltert, in drei gleiche Volumina geteilt und in sterile 300 uL Glasmikrophiolen geladen. Die resultierenden 27 Phiolen, die etwa 9 mg enthielten, wurden bei 5, 25 und 40ºC für bis zu 40 Tage Stabilitätstests unterzogen. Proben wurde durch ein ELISA-Assay und ein C4-Umkehrphasen-HPLC-Assay an den Tagen 0, 7, 14, 28 und 40 bestimmt. Die verbleibenden 3 mg Relaxin wurden in Milli-Q-Wasser bei 5ºC gehalten und als das Bezugsmaterial verwendet. Die Ergebnisse in Untersuchung 1 und den darauffolgenden Stabilitätsuntersuchungen zeigten, daß dieses Relaxin in Wasser durch Umkehrphasen-HPCL zumindest 5 Monate lang bei 5ºC stabil ist. Diese Beobachtungen wurden an Bezugsproben wiederholt, die in darauffolgenden Stabilitätsuntersuchungen verwendet wurden. TABELLE I PROTOTYP FLÜSSIGKEITSFORMULIERUNGEN FÜR RELAXIN MIT 1,0 mg/ml FORMULIERUNGEN FÜR UNTERSUCHUNG 1 Formulierung Zusammensetzung pro ml Glycin Acetat Zitrat Histidin Tris Natriumacetat Essigsäure Zitronensäuremonohydrat Natriumzitratdihydrat Tris-HCl Tris-Base * Alle Formulierungen sind isotonisch (0,154 molar, die verbleibende Ionenstärke durch Hinzufügung von NaCl ausgeglichen) FORMULIERUNGEN FÜR UNTERSUCHUNG 2 Formulierung Zusammensetzung pro ml Acetat Succinat Zitrat Alle 3 Puffer + 0,1 M NaCl Natriumacetat Essigsäure Bernsteinsäure Dinatriumsuccinathexahydrat Zitronensäure Natriumzitratdihydrat TABELLE II FÜR JEDES ASSAY FÜR RELAXIN-STABILITÄTSUNTERSUCHUNG 1 ERFORDERLICHES VOLUMEN (ul) AN FORMULIERUNG Zeit ELISA Zyklisches AMP Nahes Tage Monate
100 ul formuliertes Protein für ELISA- HPLC- und zyklische AMP-Assays an Tag 7&supmin;, 14&supmin; imd 21&supmin;wurden in sterile 100 ul Mikrophiolen gegeben(3 Phiolen/Assay x 5 Formulierungen x 3 Temperaturen = 45 Phiolen).Die 1-, 2- und 3-Monate-Proben wurden auf ähnliche Weise gruppiert (45 Phiolen), und die 4-, 5- und 6-Monate-Proben wurden fuhr weitere 45 Phiolen auf ähnliche Weise gruppiert, was 135 100 ul Phiolen für diese drei Assays ergibt. Das verbleibende formulierte Protein wurde in 1,5 ml Phiolen dispergiert, sodaß jede Phiole 0,9 ml enthielt, was ein ausreichendes Volumen für die CD-, UV- und UC-Assays darstellte. Das ergab insgesamt 90 1,5 ml-Phiolen (5 Formulierungen x 3 Temperaturen x 6 Zeitpunkte).
Untersuchung 3: Die Formulierungen mit dem zu bewertenden Relaxinanalog waren folgende:
1. 10 mM Zitratpuffer, mit NaCl isotonisch gemacht
2. 10 mM Zitratpuffer, mit NaCl isotonisch gemacht, gegen einen frisch hergestellten isotonischen Zitratpuffer dialysiert (Das dient als eine Kontrolle.)
3. 10 mM Zitratpuffer, mit Mannit (5,07%) isotonisch gemacht, dialysiert gegen einen 10 mM Zitrat-, 5,07% Mannitpuffer (kein NaCl)
4. 10 mM Zitratpuffer, mit NaCl isotonisch gemacht, zu dem 5% absoluter Äthanol hinzugefügt wurde
5. 10 mM Zitratpuffer, mit NaCl isotonisch gemacht, zu dem 10% absoluter Äthanol hinzugefügt wurde
6. 10 mM Zitratpuffer, mit NaCl isotonisch gemacht, zu dem 5% Glycerin hinzugefügt wurde
7. 10 mM Zitratpuffer, mit NaCl isotonisch gemacht, zu dem 10% Glycerin hinzugefügt wurde
8. 10 mM Zitratpuffer, der mit NaCl isotonisch gemacht wurde, dem 5% Propylenglykol hinzugefügt wurde
9. 10 mM Zitratpuffer, mit NaCl isotonisch gemacht, dem 10% Propylenglykol hinzugefügt wurde
10. 10 mM Zitratpuffer, mit NaCl isotonisch gemacht, dem 0,02% EDTA hinzugefügt wurde (Dinatriumsalz)
11. 10 mM Zitratpuffer, mit NaCl isotonisch gemacht, dem 5% Mannit hinzugefügt wurde
Diese Formulierungen wurden jeweils dreifach hergestellt und 5, 25 und 40ºC unterworfen.
Außerdem wurde 1 ml Relaxin mit 2 mg/ml in originalem isotonischem (NaCl)-Zitratpuffer in jede von 27 1,5 ml-Phiolen sterilgefiltert und bei -20ºC gefroren. An Tag 0 wurden 3 Phiolen aufgetaut und bestimmt; auf den darauffolgenden Tagen wurden drei Phiolen aufgetaut und bestimmt.

Assayverfahren

HPLC-Assay: Chromatogramme wurden auf einer Vydac C4-Umkehrphasensäule unter Verwendung der folgenden Säulenbedingungen erhalten: Fließrate 1 ml/min, Lösung A: 0,1% TFA, Lösung B: 0,1% TFA, 90% Acetonitril, Gradient von 20% A zu 50% B mit 1%/Minute.
In Untersuchung 1 blieben die Gesamtflächen der Chromatogramme innerhalb des Fehlers der Messungen konstant, d.h. für die Abnahme in der Fläche des Hauptpeaks war die Zunahme in den Flächen der Nebenpeaks verantwortlich. Darauffolgende Regeneration der HPLC-Säule zeigte, daß das meiste Relaxin unter den Bedingungen des Gradienten eluierte. Dieses Verhalten steht im Gegensatz zu dem, was in Untersuchung 2 beobachtet wurde, wo die durch HPLC-Assay bestimmte Gesamtfläche nicht über die Zeit konstant war. Wenn das Material in einem größeren Ausmaß gereinigt war, verbesserte sich die Stabilität wie durch HPLC gemessen.
ELISA Assay: Proben wurden in den Verdünnungspuffer für ELISA-Assays verdünnt, sodaß die erwartete Konzentration in den Mittelbereich des linearen Abschnitts der Standardkurve fallen würde. Der primäre Antikörper für das ELISA-Assay ist ein affinitätsgereinigter polyklonaler Kaninchenantikörper, der gegen das synthetische menschliche Relaxinpeptid gezüchtet wurde, worin die menschliche Relaxin-A-Kette an Position 1 der Kette ein pyro-Glu aufweist.
Die Konzentrationen wie durch ELISA bestimmt wurden durch einen Bezug normiert, der gemeinsam mit den Stabilitätsproben behandelt wurde. Die durch das ELISA-Assay bestimmten Werte waren üblicherweise größer als die Werte, die ausgehend von der UV-Spektroskopie erwartet wurden, aber nach dem Normieren waren sie etwa 20% niedriger als die erwarteten Werte. In Untersuchung 1 wurden dreifache Proben für jeden Zeitpunkt behandelt, indem Proben von jeder der drei Phiolen verdünnt wurden.
Zyklisches AMP-Assay: Proben wurden in einem Zellassaypuffer verdünnt und wurden mit Rhesusaffen-Uteruszellen inkubiert. Die resultierende Zellsuspension wurde unter Verwendung des Assayverfahrens des Herstellers DuPont de Nemours, Inc., Wilmington, Del. auf zyklisches AMP hin untersucht. Eine Standardkurve wurde verwendet, um zyklische AMP-Konzentration mit der Relaxinkonzentration in Beziehung zu setzten. Diese Konzentration ist, im Gegensatz zu ELISA, das eine "immunreaktive" Konzentration mißt, theoretisch eine "bioaktive" Konzentration. Eine Bezugsprobe mit bekannter Konzentration wurde gemeinsam mit Stabilitätsproben behandelt und verwendet, um die festgestellten Relaxinkonzentrationen zu normieren.
Mäuseschambeinfugen-Assay:Das Bioassay in vivo der Mäuseschambeinfuge mißt die Umgestaltungswirkung von Relaxin auf Bindegewebe. Siehe Steinetz, B.G. et al. (1060) "Endocrinology" 67:102.
Circularer Dichroismus im nahen UV: Relaxinproben mit etwa 1 mg/ml wurden 1:1 mit Dialysat verdünnt und Spektren in einer zylindrischen Küvette mit Thermostat und 0,5 cm Weglänge bei 20ºC von 320 bis 240 nm in einem Aviv modifizierten Cary 60-Spektropolarimeter erhalten. Nach dem Sammeln der CD-Daten wurde die Probe von der CD-Zelle entfernt und fünffach in phosphatgepufferte Salzlösung verdünnt. Die Konzentration wurde dann wie zuvor unter Verwendung von UV-Absorptionsspektroskopie bestimmt. Das CD-Signal in Elliptizität (Milligrad) wurde auf die von Adler et al., "Meth.Enzym.", 27: 675 (1973) beschriebene Weise unter Verwendung eines mittleren Restgewichts von 112,9 g für menschliches Relaxin in mittlere Restgewichtselliptizität umgewandelt.
Analytisches Ultrazentrifugieren: Relaxinstabilitätsproben wurden vierfach mit dem geeigneten Dialysat verdünnt und in Doppelsektor-Ultrazentrifugenzellen geladen, die in einen analytischen An-F-4-Loch-Rotor gegeben wurden. Zentrifugieren wurde in einer analytischen Beckman-Ultrazentrifuge Modell E bei 32000 UpM bei 20,0ºC 18 Stunden lang durchgeführt. Bei getrennten Versuchen wurde bestimmt, daß 18 Stunden aureichende Zeit darstellte, um Sedimentationsgleichgewicht zu erzielen. Der Konzentrationsgradient in der Zelle wurde durch UV-Absorption bei 280 nm unter Verwendung eines photoelektrischen optischen Scanners bestimmt. Die Kurvenbahnen wurden unter Verwendung eines Macintizer -Tracingpads in einen Macintosh-Computer eingegeben. Das Gewichtsdurchschnitt-Molekulargewicht steht mit dem Konzentrationsgradienten in der Zelle unter Verwendung der folgenden Gleichung (Teller "Meth.Enzym." 27: 346[1972]) in Beziehung:
Mw - 2RT/[w²(1-vp)] dlnc/dr²,
worin Mw das Gewichtsdurchschnitt-Molekulargewicht ist, T die Temperatur ist, R die Gaskonstante ist, w die Winkelgeschwindigkeit in Radian ist, v das partielle spezifische Volumen des Proteins ist, p die Lösungsdichte ist, c die Proteinkonzentration ist und r der Radialabstand vom Rotationsmittelpunkt ist. Die Gleichung geht von einer idealen Lösung aus und scheint für Relaxinsedimentation unter den gewählten Pufferbedingungen geeignet zu sein. Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate des lnc gegenüber r² ergibt das Gewichtsdurchschnitt-Molekulargewicht als einen Durchschnitt über den Konzentrationsbereich in der Zelle. Die Daten wurden auch mit einem Polynom dritter Ordnung geebnet, und die bei jeder Konzentration erhaltenen Werte für dlnc/dr² in der Zentrifugenzelle gemessen. Das partielle spezifische Volumen von 0,731 ml/g für Relaxin wurde aus der Aminosäurezusammensetzung berechnet, wobei Werte für die einzelnen Aminosäurereste in Übereinstimmung mit Cohn und Edsall, "Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions" (Hafner: New York, 1965), S.157-175 verwendet werden.

Ergebnisse

Untersuchung 1: Der Abbau von Relaxin als eine Zeitfunktion wurde durch Umkehrphasen-HPLC überwacht. Da die Gesamtfläche aller HPLC-Peaks über die Zeit konstant blieb, wurde der Prozentsatz der Gesamtfläche verwendet, um die Kinetik des Relaxinabbaus zu untersuchen. Die Fraktion des verbleibenden Hauptpeaks wurde aus dreifachen Proben (wenn verfügbar) berechnet, und Plots erster Ordnung der Abbaukinetik des Haupt-HPLC-Peaks für die fünf in Tabelle I gezeigten Formulierungen (im Bereich von 3,0 bis 7,5) wurden bestimmt. Die Kinetik wurde durch Messen der Rate des Verschwindens von Relaxinhauptpeak durch Umkehrphasen-HPLC verfolgt. Die Figuren 1a bis 1e sind Schaubilder der Fraktion des Haupt-HPLC-Peaks gegenüber der Zeit für die fünf Formulierungen bei diesen drei Temperaturen, die die Abbaurate angeben. Figur 1 ist Relaxin in 10 mM Glyzin (pH 3,0), Figur 1b ist Relaxin in 10 mM Zitrat (pH 5,0), Figur 1c ist Relaxin in 10 mM Histidin (pH 6,0), Figur 1d ist Relaxin in 10 mM Acetat (pH 5,0), und Figur 1e ist Relaxin in 10 mM Tris (pH 7,5). In jedem Schaubild geben die Dreiecke 5ºC, die Kreise 25ºC und die Quadrate 40ºC an. Diese Figuren zeigen, daß Relaxinabbau durch kinetische Analyse der Rate erster Ordnung analysiert werden kann. Figur 2 zeigt das Plot der bestimmten Ratenkonstanten erster Ordnung für den Abbau des Hauptpeaks gegenüber dem pH-Wert für die fünf Formulierungen bei 5 (offene Quadrate), 25 (Rhomben) und 40ºC (durchgehende Quadrate). Die Daten in Figur 2 zeigen, daß menschliches Relaxin am stabilsten bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 6, und insbesondere bei pH 5 ist.
Untersuchung 2: In den Succinat-, Acetat- und Zitratformulierungen wird die Stabilität von Relaxin wie durch Umkehrphasen-HPLC und ELISA gemessen nicht wesentlich durch Variationen der Ionenstärke wie durch die Verwendung von 0,0 M, 0,1 M und 0,5 M NaCl erhalten, beeinflußt. Das Protein wurde mit einer Ionenstärke von etwa 0,15 Mol bei einer Osmolalität von etwa 250 mmol/kg formuliert, um die Formulierung für intravenöse wie auch intramuskuläre Injektion verwenden zu können.
Untersuchung 3: Die Tabellen III und IV zeigen jeweils die Umkehrphasen-HPLC-Daten bezüglich der Zitratformulierung bei pH 5,0, bei 5ºC gelagert, für 1 Jahr (bei einer Relaxinkonzentration von 1 mg/ml) und bei -20ºC für 60 Tage (bei einer Relaxinkonzentration von 2 mg/ml). Die Daten in Tabelle III können extrapoliert werden, um die Stabilität bei 5ºC für zumindest 2,0 Jahre zu schätzen (d.h. nicht mehr als etwa 10% Abbau), wobei Kinetik erster Ordnung angenommen wird. Beide Tabellen zeigen, daß die Formulierungen bei den jeweiligen Temperaturen stabil sind. TABELLE III UMKEHRPHASEN-HPLC STABILITÄT VON BEI 5ºC GELAGERTER ZITRATFORMULIERUNG Zeit (Tage) Retentionszeit (min) Fläche (Hauptpeak) x 10 Gesamtfläche x 10 Anteil Hauptpeak durchschn.
Ratenkonstanten erster Ordnung für den Abbau von Haupt-RP-HPLC-Peak von menschlichem Relaxin nach einem Jahr bei 5ºC. Aus den dreifachen (wenn verfügbar) Daten zu jedem Zeitpunkt wurde der Durchschnitt gebildet und verwendet, um zu entsprechen: In ( Anteil Hauptpeak) = A-kt Intercept k(Tage-) t1/2(Jahr) Jahre TABELLE IV UMKEHRPHASEN-HPLC STABILITÄT VON BEI -20ºC GELAGERTER ZITRATFORMULIERUNG Zeit (Tage) Retentionszeit (min) Fläche (Hauptpeak) x 10 Gesamtfläche x 10 Anteil Hauptpeak durchschn.
Die Stabilität von Relaxin bezogen auf seine Bioaktivität wurde unter Verwendung eines Assays verfolgt, das die Produktion von zyklischem AMP durch die Wechselwirkung von Relaxin mit den Rhesusaffenuteruszellen vermittelte. Die zyklischen AMP-Bioassayplots von Konzentration gegenüber Zeit werden in den Figuren 3a bis 3e gezeigt, wobei Figur 3a Relaxin in Glycin-HCl (pH 3,0) ist, Figur 3b Relaxin in Zitrat (pH 5,0) ist, Figur 3c Relaxin in Acetat (pH 5,0) ist, Figur 3d Relaxin in Histidin (pH 6,0) ist und Figur 3e Relaxin in Tris-Puffer (pH 7,5) ist. In allen Figuren sind die offenen Quadrate 5ºC, die vollen Kreise 25ºC und die offenen Dreiecke 40ºC, und die gerade Linie ist der erwartete Wert. Innerhalb der Fehler des Versuchs erscheint es, daß alle Proben (pH von 3 bis 7,5) nach 40-tägiger Lagerung gleiche Bioaktivität aufwiesen.
Die Stabilität von Relaxin bezüglich seiner Bioaktivität wurde auch unter Verwendung des Mäuseschambeinfugenassays bestimmt. Ein Vergleich der Bioaktivität von nicht abgebautem Relaxin in Zitratpuffer bei pH 5 mit einer in hohem Maße abgebauten Probe in Tris-Puffer bei pH 7,5 zeigte, daß es innerhalb der Fehler des Assays keine Unterschiede in der Bioaktivität gab.
Ein ELISA-Assay und ein Zirkular-Dichroismus-Assay wurden verwendet, um die Proteinkonformation der Formulierungen zu bestimmen. Die Daten zeigen, daß die tertiäre Struktur des Relaxins nach 1 oder 2 Monaten Lagerung unverändert ist.
Die potentielle Änderung bei der Protein-Selbstassoziation wurde unter Verwendung der analytischen Sedimentationsgleichgewichts-Ultrazentrifugationstechnik untersucht. Relaxin in 10 mM Acetat, 0,1 M NaCl bei pH 5 wurde durch analytisches Ultrazentrifugieren bei Beladungskonzentrationen von 0,1, 0,2 und 0,4 mg/ml analysiert. Das Gewichtsdurchschnitt-Molekulargewicht aller drei Beladungskonzentrationen beträgt etwa 10 000, was zeigt, daß Relaxin unter diesen Bedingungen Dimere bildet.
Verschiedene pharmazeutisch verträgliche Exzipienten wurden der 10 mM Zitrat-Formulierung mit pH 5 hinzugefügt, um ihre Wirkung auf die Stabilität der Formulierung zu untersuchen. Figur 4 ist ein Schaubild, das die Abbaurate des Umkehrphasen-HPLC-Relaxin-Haupt-Peaks für die verschiedenen Formulierungen bei den drei Temperaturen zeigt. Von links nach rechts wurden ultrafiltrierte (volle) und dialysierte (dicht schraffierte) Proben mit Proben mit hinzugefügten Exzipienten wie folgt verglichen: eine isotonische Menge (kreuzweise schraffiert) oder 5 Gew.-% (mittlere Schraffierung) Mannit, 5 Gew.-% (offen) oder 10 Gew.-% (voll) Glycerin, 5 Gew.-% (horizontal) oder 10 Gew.-% (gepunktet) Äthanol, 5 Gew.-% (leicht schraffiert) oder 10 Gew.-% (offen) Propylenglykol und 0,02 Gew.-% (voll) EDTA. Jedes wurde bei 5, 25 oder 40ºC gelagert. Wie zu sehen ist, hatten die Exzipienten innerhalb Versuchsfehler im Vergleich zu den ultragefilterten und dialysierten Kontrollen eine vernachlässigbare Wirkung auf die Stabilität. Die dialysierten und ultragefilterten Proben wiesen innerhalb des Versuchsfehlers ebenfalls keine Unterschiede zueinander auf.
Außerdem können lyophilisierte Formulierungen hergestellt werden, worin das Relaxin als eine saure Lösung rekonstutiert würde. Im spezielleren wurde langes Relaxin in 10 mM Zitrat, 0,507% Mannit, pH 5,0 dialysiert, nachdem es zu Beginn im Zitratformulierungspuffer vorhanden ist. Das Präparat wurde dann mit einem Volumen von jeweils 1 ml in neun 3 ml-Phiolen sterilgefiltert. Diese Phiolen wurden auf ein Tablett in einem Lyovac GT 20 Lyophilsator gegeben. Die Relaxinproben wurden auf -50ºC gekühlt und dann einem 25-stündigen primären Trocknungszyklus bei 0ºC unterworfen. Dem folgte ein sekundärer Trocknungszyklus von 17,5 h bei 25ºC. Am Ende der Lyophilisierung wurde eine Phiole mit 1 ml Milli-Q-Wasser rekonstituiert und erschien recht klar, frei von Trübung, was eine erfolgreiche Rekonstituierung anzeigte. So wurden die verbleibenden Phiolen bei 5ºC und 25ºC auf Stabilität gebracht.
Langes Relaxin, das vor dem Lyophilisieren in den Lyophilisierungspuffer ausgetauscht wurde, wurde als eine Prä-Lyophilisierungskontrolle verwendet. Zusätzlich zur Nullzeit-rekonstituierten Probe wurden Proben nach 2 Wochen, einem Monat und 3 Monaten Lagerung sowohl bei 5ºC als auch 25ºC rekonstituiert. Alle Proben wurden durch RP-HPLC wie zuvor beschrieben auf Abbauprodukte hin analysiert. Der Durchschnitt aus dreifachen Injektionen wurde gebildet, wann immer das möglich war. Der prozentuelle Hauptpeak war bei allen Proben unverändert (siehe Tabelle IVa), unabhängig von der lyophilisiert gelagerten Zeitspanne, was keinen Stabilitätsverlust nach 3 Monaten bei 25ºC angab. Außerdem zeigte die spektrophotometrische Analyse aller Proben keine Zunahme der prozentuellen Lichtstreuung bei bis zu 3monatiger Lagerung bei 25ºC in lyophilisierter Form. Tabelle IVa Probe % Hauptpeak Prä-Lyophilisierungskontrolle Nullzeit-Rekonstituierung Wochen Monat
Vorbereitende Einfrier-Auftau-Untersuchungen zeigen, daß das Protein in einer flüssigen Formulierung bei -20 und -60ºC mit einer Konzentration von 2 mg/ml bei pH 5 ohne jegliche beobachtete Veränderung beim HPLC-Assay eingefroren werden kann. Außerdem schafft Tabelle V die Umkehrphasen-HPLC-Stabilitätsdaten für die Zitratformulierung, pH 5,0, eingefroren, dann aufgetaut, wobei eine Probe entnommen wird, dann sofort eingefroren und 30 Tage lang eingefroren gelassen, dann 5 Stunden bei Raumtemperatur aufgetaut. Keine Veränderung der HPLC-Daten wurde bei Tauen beobachtet. TABELLE V UMKEHRPHASEN-HPLC (EINFRIEREN-AUFTAUEN) STABILITÄT VON BEI -20ºC GELAGERTER ZITRATFORMULIERUNG Zeit (Tage) Retentionszeit (min) Fläche (Hauptpeak) x 10 Gesamtfläche x 10 Anteil Hauptpeak WIEDER EINGEFRÜRENE NULLZEITPROBE durcschn. 5 STUNDEN BEI RAUMTEMPERATUR* durchschn. *: 60-Tage-Probe in gefrorenem Zustand bei -20ºC wurde 5 Stunden lang bei Raumtemperatur gelagert und erneut untersucht.
Als Schlußfolgerung wird die strukturelle Integrität von menschlichem Relaxin wie durch Umkehrphasen-HPLC gemessen durch den pH-Wert beeinflußt, bei dem es formuliert wird, und Abbau tritt bei pH 7 oder mehr auf. Das HPLC-Assay zeigt, daß von den fünf untersuchten Formulierungen in einem Acetat- oder Zitratpuffer bei pH 5 stabiler ist als in anderen Puffern, und daß der Zitratpuffer bei pH 5 am stabilsten bei 5 und -20ºC für bis zu fünf Monate ist. Die Bioaktivität wird nicht beeinflußt.

BEISPIEL II

Bei einem Vergleich von H2-Relaxin von Schwein und Mensch zeigten die Gewichtsdurchschnitt-Molekulargewichtsdaten, daß menschliches Relaxin sich in Lösung bei pH 5 in einem weit größeren Ausmaß assoziiert als Schweine-Relaxin. Die für menschliches Relaxin bei verschiedenen Beladungskonzentrationen erhaltenen Daten waren ähnlich, was darauf hindeutet, daß die Aggregation eine reversible Selbstassoziation ist. Die Daten zeigen auch, daß die Selbstassoziierung von menschlichem Relaxin bei pH 3 weniger ausgeprägt ist als bei pH 5.

BEISPIEL III

Es ist festgestellt worden, daß die natürliche Form von Relaxin eine ist, die eine B-Kette mit 29 Aminosäuren (kurzes Relaxin) und nicht mit 33 Aminosäuren (langes Relaxin) aufweist. Der Zweck dieser Untersuchung bestand darin, zu bestimmen, ob das kurze Relaxin im Vergleich mit der langen Form ähnliche Stabilitäts- und Adsorptionseigenschaften aufweist. Außerdem wurden die beiden Reläxinformen bezüglich ihrer UV-Extinktionskoeffizienten bei 280 nm und Sekundärstruktur unter Verwendung von Fernes-UV CD verglichen.
Das bei diesen Versuchen verwendete kurze Relaxin wurde durch beschränkte Proteolyse des langen Relaxins (in Beispiel I synthetisiert) erhalten, um 29 Aminosäuren in der B-Kette zu erhalten. Nach der Synthese des langen Relaxins wurde es auf eine HPLC-Säule unter Verwendung eines TFA-Gradienten und dann Mono-S-Ionenaustauschsäule aufgebracht. Die Relaxin enthaltenden Fragmente wurden dann in einen Formulierungspuffer diagefiltert. Dem Puffer (der 200 mg Relaxin enthielt) wurde 1 Teil Trypsin auf 2000 Gew.-Teile Relaxin hinzugefügt, und die Proteolyse für etwa 40 Minuten durchgeführt. Dann wurden 50 ul einer 16,9 mg/ml Lösung aus Carboxypeptidase B (70 E/mg) dem Digest hinzugefügt. Die resultierende Lösung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehengelassen, dann unter Verwendung von Zitronensäure ungesäuert, und durch HPLC- und Mono-S-Säulen gereinigt. Das so gereinigte Relaxin wurde in 10 mM isotonisches Zitrat mit Natriumchlorid pH 5 bei 1,0 mg/ml diagefiltert, und bei -60ºC gefroren gespeichert (1 ml in 3 ml-Typ I Glasphiolen). Eine Teilmenge dieser Charge wurde auch als Flüssigkeit zugeführt und als eine nicht gefrorene Probe bezeichnet.
Temperaturstabilität: Die Stabilität von Relaxin in 10 mM isotonischem Zitrat bei pH 5 wurde durch Folgen der Ratenkinetik erster Ordnung der Reduktion des Haupt-Umkehrphasen-HPLC-Peaks bestimmt. Chromatogramme wurden auf einer SynChropak C4-Umkehrphasensäule unter Verwendung der folgenden Bedingungen erhalten: 1 ml/min. Fließrate, Gradient von 20%-Lösung A zu 50% Lösung B über 30 Minuten (Lösung A ist 0,1 % Trifluoressigsäure und Lösung B ist 0,1% Trifluoressigsäure, 90% Acetonitril).
Tabelle VI zeigt einen Vergleich der Kinetik zwischen langem Relaxin und kurzem Relaxin. Die Ratenkonstanten erster Ordnung für langes Relaxin wurden aus 1-Jahres-Stabilitätsdaten und jene der kurzen Form aus 6-Monats-Daten für eingefrorene-aufgetaute Proben und 2 Monats-Daten für nicht geforene Proben bestimmt. Eingeschlossen in die bestimmten Ratenkonstanten erster Ordnung sind Werte für t.9 und t1/2. Die Stabilität der kurzen Form ist zumindest so gut wie die des langen Relaxins, und kann besser sein, da es für die eingefrorene-aufgetaute Probe bei 25ºC eine Stabilität von mehr als 2 Jahren gibt. Wie zuvor für langes Relaxin beobachtet, beeinflußt das Einfrieren und Auftauen die Stäbilität des kurzen Relaxins nicht. TABELLE VI Ratenkonstanten erster Ordnung für den Abbau von Haupt-RP-HPLC-Peak für langes und kurzes Relaxin Durchschnittswerte aus drei Proben wurden verwendet, um zu entsprechen: In(Anteil Hauptpeak)=A-kt Puffer Intercept k(Tage¹) t.9 (Tage) t1/2 (Tage) Lange Form Jahre Kurze Form (nicht eingefroren) Kurze Form (eingefroren-aufgetaut)
Lichtstabilität: Zwei Phiolen mit kurzem Relaxin wurden sieben Tage lang in eine Lichtbox mit einer Leistung von 1600 Footcandle gegeben. Eine der Phiolen wurde mit Aluminiumfolie vom Licht abgeschirmt und diente als Kontrolle. Die Retentionszeiten (Rt) der Hauptrelaxinpeaks des langen Relaxins wurden zu dem der kurzen Form normalisiert und werden in Tabelle VII gezeigt. Alle Retentionszeiten der Abbaupeaks wurden dann auf diesen normalisierten Wert bezogen. Wie zu sehen ist, sind die normalisierten Retentionszeiten für sowohl kurzes als auch langes Relaxin in hervorragender Übereinstimmung, was darauf hindeutet, daß in beiden Proteinen ähnliche Abbauwege auftreten. Jedoch scheint die Abbaurate des langen Relaxins etwas größer als die des kurzen Relaxins zu sein. TABELLE VII LICHTSTABILITÄT VON KURZEM UND LANGEM RELAXIN Lange Form Kurze Form 7 Tage Belichtung mit 1600 Footcandle Licht % Verbleibender Hauptpeak* KONTROLLE # Die Retentionszeiten des Hauptpeaks werden normiert, sodaß die der kurzen Form und die der Abbaupeaks auf den normierten Wert bezogen sind. * Peaks mit Flächen unter 2% der Gesamtfläche wurden zwecks Klarheit weggelassen.
Stabilität bei Rühren: Eine Phiole mit kurzem Relaxin wurde bei Raumtemperatur 7 Tage lang in einem Glas-Col-Rührer Modell S-500 mit einer Einstellung von 2,5 Einheiten gerührt. Eine Kontrollphiole wurde ungestört bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Stabilität des Relaxins wurde durch Umkehrphasen-HPLC wie oben für das Temperaturstabilitätsassay beschrieben bestimmt.
Tabelle VIII zeigt den Prozentsatz des Hauptrelaxinpeaks, der nach 7-tägigem Rühren bleibt. Diese Daten zeigen, daß es keine durch Umkehrphasen-HPLC nachgewiesene Veränderung in der gerührten Probe im Vergleich zur nicht gerührten Kontrolle weder beim langen, noch beim kurzen Relaxin eine gab. TABELLE VIII STABILITÄT BEI RÜHREN VON KURZEM UND LANGEM RELAXIN Lange Form Kurze Form %verbleibender Hauptpeak Kontrolle GERÜHRT
Adsorptionsuntersuchung: Das Relaxin wurde auf etwa 10 ug/ml, bestimmt durch UV-Spektrophotometrie, in normaler Salzlösung verdünnt. Zwei Fuß Silastic Röhre mit 0,02 Inch Innendurchmesser und 0,037 Inch Außendurchmesser wurde mit einer Harvard-Infusionspumpe verbunden, die mit einer 5 ml-Glasspritze und einer 22G Nadel ausgestattet war. Relaxin wurde mit 100 ul/min durch die Röhre infundiert, wobei während der ersten 10 Minuten jede Minute eine 100 ul-Probe entnommen wurde, gefolgt von einer 100 ul-Probe alle fünf Minuten bis 30 Minuten, in 900 ul des ELISA-Assaypuffers (EAB). Diese 1:10-Verdünnung wurde durch zwei aufeinanderfolgende Verdünnungen in EAB auf 1:4000 verdünnt. Die 1:4000-Verdünnung wurde einer Proteinkonzentrationsbestimmung durch ELISA unterworfen.
Das Relaxin adsorbierte an die Röhre. Jedoch war nach 5-minütiger Infusion durch die Röhre die Relaxinkonzentration nahe der erwarteten Konzentration von 10 ng/ml wie durch die ELISA bestimmt. Das Integrieren der Fläche unter den Kurven zeigte einen Verlust von etwa 5% der Gesamtmasse an Protein aufgrund von Adsorption an die Oberfläche der Röhre. Es scheint zwischen den beiden Relaxinformen keinen wesentlichen Unterschied in der Adsorption an die Silastic -Rohre zu geben.
Bestimmung des Extinktionskoeffizienten: Die Extinktionskoeffizienten für lange und kurze Relaxine wurden durch quantitative Aminosäureanalyse aus zwei getrennten Bestimmungen mit 2,04 oder 2,14 cm²/mg für langes Relaxin und 2,25 oder 2,30 cm²/mg für kurzes Relaxin bestimmt. Die für langes und kurzes Relaxin berechneten molaren Extinktionskoeffizienten waren 13 000 ± 200 M&supmin;¹cm&supmin;¹. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß das Entfernen der vier Aminosäuren vom C-Terminus wenig Wirkung auf die unmittelbare Umgebung der zwei Tryptophane und des einen Tyrosins hat. Das deutet auch darauf hin, daß die Konformationen der beiden Relaxinformen ähnlich sind.
Zirkularer Dichroismus: Die zirkularen Dichroismusspektren von 240 bis 190 nm von langem Relaxin (bei 0,8 mg/ml) und kurzem Relaxin (bei 1 mg/ml) in 10 mM isotonischem Zitrat bei pH 5 wurden mit einem Aviv Cary 6O-Spektropolarimeter bestimmt. Die Proben wurden in zylindrischen Quarzküvetten mit 0,01 cm Weglängen thermostatisiert. Der CD-Output in Milligrad wurde unter Verwendung eines mittleren Restgewichts von 113 und Relaxinkonzentrationen, die unter Verwendung von UV-Absorption bei 278,4 nm erhalten wurden, in mittlere Restgewichtselliptizität umgewandelt. Die Konzentration von Relaxin wurde unter Verwendung von Extinktionskoeffizienten von 2,04 und 2,25 cm²/mg für langes bzw. kurzes Relaxin bestimmt. Schätzungen der Sekundärstruktur wurden nach dem Verfahren von Chang et al ., "Anal.Biochem" 91: 13-31 (1978) bestimmt.
Analyse der fernen UV CD-Spektren nach dem Verfahren von Chang et al., oben, führten zu 50% Alphahelix, 47% Betasheet und 3% Zufallswicklung für das lange Relaxin und 50% Alphahelix und 50% Betasheet für das kurze Relaxin. Die Unterschiede in den Spektren für kurzes und langes Relaxin liegen weit innerhalb des Versuchsfehlers und deuten stark darauf hin, daß die Sekundärstruktur von kurzem und langem Relaxin sehr ähnlich ist.
Schlußfolgerung: Die Wärmestabilität des kurzen Relaxins ist vergleichbar mit der und übersteigt vielleicht die von langem Relaxin in der flüssigen Formulierung. Des weiteren ist auch die Stabilität bei Belichtung und Rühren bei den zwei Proteinen ähnlich. Physikalische Eigenschaften wie molare Extinktion, Sekundärstruktur und Adsorption an Oberflächen scheinen ebenfalls ident.

BEISPIEL IV

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung und Eigenschaften von Relaxingelformulierungen.

Flüssiges Relaxinpräparat

Das wie in Beispiel III beschrieben hergestellte und formulierte kurze Relaxin (mit der B-Kette mit 29 Aminosäuren) wurde für diesen Versuch verwendet. So hatte das Relaxin eine Konzentration von 1,0 mg/ml, 1 ml in 10 mM Zitrat, isotonisch mit NaCl, pH 5,0. Diese Formulierung wurde eingefroren in Phiolen bei -60ºC bis unmittelbar vor der Verwendung gelagert. Relaxin aus diesen Phiolen war durch Zentrifugieren bei 4000 UpM für ein bis zwei Stunden in einem 2 ml Amicon Centricon 10 Mikrokonzentrator auf mehr als 2,4 mg/ml (wie durch UV-Spektroskopie unter der Annahme von e=2,04 ml/mg.cm bestimmt) konzentriert. (Die genaue Zeit hängt vom Anfangsvolumen des Relaxins ab, dessen Konzentrierung erforderlich ist.)

4% Methocel-Gelpräparat

Ein 4%-Methylzellulosegel wurde aus Methocel A 4M Methylzellulosepulver (Dow Chemical) nach der folgenden Vorschrift rekonstituiert:
(a) 10 ml Zitratformulierungspuffer (in Beispiel I beschrieben) wurde bis nahe dem Kochpunkt (90ºC) in einem 40 ml-Becherglas unter Gegenwart eines Rührstabes erwärmt und dann von der Wärme entfernt.
(b) 0,8 g Methocel-Pulver wurde dem Becherglas hinzugefügt und einige Sekunden gewirbelt, um die Teilchen zu dispergieren.
(c) Das Becherglas wurde dann auf einen magnetischen Rührer im kalten Raum bei 5ºC gestellt. Unmittelbar bevor die Flüssigkeit begann, sich einzudicken, wurden weitere 10 ml kalter Zitratformulierungspuffer hinzugefügt, wobei jegliche trockene Teilchen von den Seiten des Becherglases gespült wurden.
(d) Nach 20 Minuten kontinuierlichem Rühren nahm die Viskosität der Flüssigkeit zu, bis ein homogenes 4%iges Methylzellulosegel gebildet wurde.
(e) Für die letzten beiden Stabilitätsuntersuchungen wurde das 4%ige Methylzellulosgel autoklaviert, nicht nur, um das Gel zu sterilisieren, sondern auch, um innerhalb des Gels vorhandenen aufgelösten Sauerstoff zu entfernen. Nach dem Entfernen aus dem Autoklaven, wurde das Gel unter einem Stickstoffkopfraum gerührt, um das Gel erneut zu homogenisieren, ohne jeglichen neuen Sauerstoff einzubringen.

Herstellung von topischem Relaxin

Ein homogenes 3%-Methocelgel mit 600 ug/ml Relaxin wurde nach der folgenden Vorschrift hergestellt:
(a) Zwei sterile 10 ml-Spritzen wurden auf der Waage austariert. Einer Spritze wurden 3 g des 4%-Methocelgels hinzugefügt. Der anderen Spritze wurde die 2,4 mg/ml flüssige Relaxinformulierung mit einem Drittel des Volumens des Gels (1ml) hinzugefügt.
(b) Die Preßkolben wurden wieder in die Spritzen eingesetzt, und die beiden Spritzen wurden mit einem sterilen Rainin 47-FLU-Verbindungsstück verbunden, daß sich auf die Enden der beiden Spritzen aufschrauben läßt.
(c) Die Relaxinlösung wird durch Hineindrücken eines Spritzenpreßkolbens in die Methylzellulose dispergiert, gefolgt vom anderen Spritzenpreßkolben, 20 bis 25mal, an welchem Punkt ein homogenes Gel gebildet ist. (Jedoch wurde das Gel dann bei den letzten beiden Versuchen zwecks einfacher Lagerung und Probenentfernung in 1,5 ml Eppendorf-Röhren transferiert.) Die Endkonzentration von Relaxin im Gel betrug 600 ug/ml. Das Gel enthielt auch 3% Methylzellulose, 10 mM Zitrat, pH 5,0, und isotonisch mit Natriumchlorid.

ELISA-Assay

Proben von Relaxin im Gel wurden mit dem gleichen ELISA-Verdünnungsmittel wie in Beispiel I verwendet in aufeinanderfolgenden zehnfachen Schritten verdünnt, um eine Konzentration von 6 ng/ml Relaxin zu erreichen. Es schien keine Wirkung von bis zu 0,25% Methocelgel auf die Relaxinkonzentration wie durch ELISA bestimmt zu geben. Das oben beschriebene ELISA-Assay zeigte, daß die Relaxinkonzentrationen im Gel 25% niedriger waren als die erwarteten, ausgehend von UV-Spektroskopie (unter Annahme eines Extinktionskoeffizienten von 2,04). Dieses Ergebnis ist darauf zurückzuführen, daß die Assaynorm B-Ketten-Relaxin voller Länge ist und die unterworfenen Proben gekürztes B-Ketten-Relaxin sind.

Umkehrphasen-HPLC-Analyse von topischem Relaxin

Das zum Analysieren der flüssigen Relaxinformulierung verwendete, in Beispiel I beschriebene Umkehrphasen-HPLC-Verfahren wurde zur Verwendung für topische Relaxinproben umgewandelt. Aufgrund der hohen Viskosität des Gels wurden die Proben zehnfach mit Wasser verdünnt, ~5 Minuten starkem Wirbel ausgesetzt, um das Gel zu homogenisieren, und ungestört stehengelassen, um die Blasen aufsteigen zu lassen. Die Analyse dieser Proben wurde durch Injizieren von 250 ul auf eine C4-300 SynChropak (4,6 x 250 mm)-Säule bei Raumtemperatur durchgeführt. Der anfängliche Aquilibrierungspuffer war 18% Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure. Die Eluierung wurde durchgeführt, indem ein 1%/min zunehmender linearer Acetonitrilgradient bis zu einer Endkonzentration von 45% Acetonitril nach 30 Minuten laufen gelassen wurde. Die Fließrate wurde mit 1,0 ml/min konstant gehalten, und die dekadische Extinktion wurde bei 214 nm überwacht. Der "Verlangsamungs"-Schritt (die Zeit, die notwendig ist, um das viskose Gel in die Meßvorrichtung zu ziehen) wurde von 36 auf 270 Minuten erhöht. Es wurde festgestellt, daß vor dem Erhöhen des "Verlangsamungs"-Schritts aufgrund seiner hohen Viskosität wesentlich weniger als 250 ul Gel tatsächlich injiziert wurden.
Während des Verlaufs dieser Versuche begann die SynChropak-Säule, ihre Fähigkeit zu verlieren, Peaks aufzulösen. So wurden die wenigen letzten Injektionen auf einer C4-300 Vydacsäule durchgeführt.
Drei bedeutsame Stabilitätsversuche wurden an der topischen Relaxinformulierung durchgeführt. Der erste bestand darin, die Stabilität dieser Präparate zu messen, nachdem sie 5 Wochen bei Raumtemperatur stehengelassen worden waren. Die Probe verblieb in der ursprünglichen Spritze und war den Temperatur- und Lichtschwankungen ausgesetzt.
Umkehrphasen-HPLC-Analyse zeigte, daß der nicht abgebaute Hauptrelaxinpeak mit der Zeit zunehmenden Ausmaßen an Abbau unterworfen war, wie die Abnahme der prozentuellen Fläche des Hauptpeaks und eine Zunahme in der Anzahl und prozentuellen Fläche der früher eluierenden Abbaupeaks zeigt. Die Abnahme der prozentuellen Fläche des Hauptpeaks wurde quantifiziert und normiert bezogen auf den %-Hauptpeak zur Nullzeit (bevor das Relaxin in das Gel gegeben wird). Ein Logplot des normierten Fraktionshauptpeaks gegenüber der Zeit zeigte, daß das topische Relaxin Abbaukinetik erster Ordnung durchgemacht hatte.
Sowohl der Hauptrelaxinpeak als auch der größte Abbaupeak wurden vom HPLC-Abfluß gesammelt und im Vakuum im Savant Speed-vac für ~1 Stunde lyophilisiert. Diese Proben wurden dann in Thioglycerin und Essigsäure rekonstituiert, auf der Sonde reduziert, um die A- und B-Ketten zu trennen, und durch Massenspektrometrie analysiert. Die Massenspektrometrieanalyse dieser beiden Proben zeigte, daß das Molekularion für die A-Kette von beiden Proben identisch war und mit dem vorherbestimmten Wert von ~2657 übereinstimmte. Jedoch waren die Molekularionen der B-Ketten verschieden. Das Molekularion für die Hauptpeakprobe stimmte mit dem theoretischen Wert von ~3314 überein. Das Molekularion für die B-Kette vom abgebauten Peak betrug ~3330. Diese Zunahme von 16 entspricht exakt dem, was erwartet würde, wenn ein Rest in B-Kette oxidiert worden war.
Schweinerelaxin von Schweineeierstöcken mit 6,6 mg wurde in Zitratformulierungspuffer rekonstituiert, für ~3 Minuten zentrifugiert, um jegliche Teilchen zu pelletieren, und bei 3,19 mg/ml in 0,248 ml Zitratformulierungspuffer mit 4% Methocel gemischt, wie oben beschrieben, um ein 3%-Gel mit 600 ug/ml Schweinerelaxin zu ergeben. Im Gegensatz zum menschlichen Relaxin mit gekürzter B-Kette wurde die Schweine-Relaxinformulierung sehr wenig abgebaut, wenn sie der HPLC-Analyse wie oben beschrieben unterworfen wurde.
Die zweite Untersuchung war eine Messung der Stabilität von topischem Relaxin unter gut kontrollierten Bedingungen bei 5ºC und 25ºC. Außerdem wurde das Methocel Gel für diese Untersuchung autoklaviert, um es zu sterilisieren und jeglichen gelösten Sauerstoff vom Gel zu entfernen, der Oxidation verursachen könnte. Proben des topischen Relaxins wurden zu vier Eppendorf-Röhren transferiert, zwei bei 5ºC gelagert und 2 bei 25ºC gelagert. Nach 144 Stunden begann das topische Relaxin bei 5ºC sich abzubauen, während das Material bei 25ºC relativ unabgebaut war, wie durch HPLC-Analyse bestimmt. Darauffolgende Analyse zeigte, daß die Lichter im 5ºC kalten Raum oft aufgedreht gelassen wurden, während die 25ºC-Box völlig von allen Lichtquellen abgeschirmt war.
Um zu bestimmen, ob dieses Licht für die Bildung der Abbaupeaks bei 5ºC verantwortlich war, wurde eine der beiden Proben in Aluminiumfolie gewickelt, um sie vom Licht abzuschirmen. Nach weiteren 360 Stunden bei 5ºC hatte sich das belichtete Relaxin völlig abgebaut, während das abgeschirmte Relaxin sich weiterhin mit einer viel langsameren Rate abgebaut hatte, wie durch HPLC bestimmt. So schien die Gegenwart von Licht die Stabilität zu beeinflussen, wobei Abschirmung gegen Licht das topische Relaxin völlig schützt, aber Belichtung und Abdeckung einen kontinuierlichen Abbau mit einer viel langsameren Rate verursacht. Massenspektrometrie der Sammlungen der breiten Peaks im für 672 Stunden (sowohl abgedeckt als auch belichtet) gelagerten topischen Relaxin zeigte, daß die A-Kette unbeeinflußt war, aber die B-Kette schien eine erste, dann eine zweite Oxidation durchzumachen.
Der dritte Versuch bestand darin, die Stabilität des topischen Relaxins direkt mit der des als Flüssigkeit formulierten Relaxins zu vergleichen, beide belichtet und von Licht abgeschirmt. Nach 816-stündiger Lagerung bei 5ºC zeigten Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramme, daß topisches Relaxin, wenn es von Licht abgeschirmt war, genauso stabil war wie das als Flüssigkeit formulierte Relaxin, wobei beide 96% Hauptpeak aufwiesen. Bei Belichtung aber war das topische Relaxin wesentlich stärker Abbau unterworfen als das als Flüssigkeit formulierte Relaxin.

Wirksamkeitsuntersuchungen

Der Zweck dieser Untersuchung besteht darin, die Wirksamkeit von kurzem Relaxin auf das Reifen der Kaninchenzervix zu bestimmen. Das Kaninchen wurde ausgewählt, weil Untersuchungen darauf hindeuteten, daß dieses Tier ein einigermaßen gutes Modell für die Untersuchung des mechanischen Verhaltens der Zervix darstellt und weil die Kaninchenzervix in ihren physiologischen Reaktionen mit der menschlichen Zervix vergleichbar zu sein scheint.
Es wurden reife trächtige weibliche New Zealand Kaninchen mit einem Gewicht von 4,5 bis 6,0 kg untersucht. Am Tag 26-27 der Trächtigkeit wurden die Kaninchen (4 pro Gruppe) mit entweder dem kurzen menschlichen Relaxingel oder Schweine-Relaxingel, wie oben beschrieben hergestellt in einem 3% Methylzellulosgel, behandelt. Sowohl kurzes menschliches Relaxin als auch Schweine-Relaxin wurden in Dosierungen von 100, 200, 300, 600 und 1000 ug/ml Relaxin pro Tier formuliert. Beide Hormone wurden intravaginal mit einer Spritze und einem Katheter mit einem Volumen von 0,5 ml angewendet. Kontrolltiere erhielten das Vehikel alleine. Nach 16-18 Stunden wurden die Tiere unter Verwendung einer lethalen Dosis Pentobarbital getötet. Der Uterus, das untere Segment und die Zervix wurden entfernt und zur histologischen Untersuchung in 10% NB Formal in fixiert. Paraffinsektionen wurden abgeschnitten und mit Hematoxylin/Eosin und Alcian Blue PAS gefärbt. Abschnitte wurden bezüglich der allgemeinen Morphologie bewertet, und im speziellen bezüglich des Ausmaßes an Trennung von Muskelgewebe und Kollagenfibrillen in der Submukosa und bezüglich der Gegenwart charakteristischer PAS positiver Riesenzellen, die Multinukleatzellen mit Makrophagenursprung sind, die die Zervix normalerweise während der Wehen infiltrieren. Die Messung von Riesenzellen wird unter Einsatz des von MacLennan et al., "Am J. Obstet. Gynecol." 152: 691-696 (1985) beschriebenen Verfahrens durchgeführt.
Eine einleitende Untersuchung, bei der eine Konzentration von 300 ug/ml menschliches oder Schweine-Relaxin in einer topischen Formulierung verwendet wurde, deutete darauf hin, daß bei dieser Dosis beide Hormone Veränderungen in der Morphologie der trächtigen Zervix herbeiführen, die mit der Reifung in Einklang stehen. 18 Stunden nach Aufbringen auf die Zervix wurden wesentliche Vergrößerung und Zervixreifung beobachtet. Histologische Untersuchungen der gefärbten Zervixabschnitte zeigten eine deutliche Trennung der Muscularis mucosa mit Ansammlung von leicht proteinangereichertem Material in den Zwischenräumen, Trennung der Kollagenfaserbündel (eine Abnahme der Kollagendichte), Zunahme der Bodensubstanz und submukoses Ödem mit Erweiterung der Lymphgefäße. Auch waren charakteristische PAS positive Riesenzellen, die in den Kontrolltieren selten sind, in den relaxinbehandelten Gruppen häufig. Derartige Zellen wurden am häufigsten um die Blutgefäße und in der subepithelialen Schicht beobachtet, obwohl sie in der gesamten Tiefe der Zervix zu finden waren. Darauffolgende Untersuchungen, bei denen versucht wurde, die geringste, und, wenn möglich, die maximale wirksame Dosis von Relaxin zu definieren, standen im Gegensatz zu früheren Ergebnissen, wobei bei 300 oder 600 ug/ml keine Wirksamkeit beobachtet wurde und Wirksamkeit nur bei der Dosis von 1 mg/ml klar beobachtet wurde.

Pharmakokinetische Untersuchungen

Das Ziel der vorliegenden Untersuchung bestand darin, die biologische Verfügbarkeit von kurzem Relaxin in trächtigen Kaninchen nach einzelnen intravenösen, subkutanen und intravaginalen Verabreichungen zu bestimmen.
Die verwendeten Kaninchen waren 16 zeitlich festgelegt trächtige multipare weibliche weiße New Zealand Kaninchen (Elkhorn) mit 4-5 kg. An Tag 26 der Trächtigkeit erhielten vier Tiere (Gruppe I) 100 ug/kg kurzes Relaxin durch intravenösen Bolus (iv) durch einen Abbocath-T-Katheter in eine Ohrenvene. Drei Tiere (Gruppe II) erhielten eine 100 u/kg subkutane (sc) Dosis kurzes Relaxin in steriler Salzlösung in den Schenkel. Drei Tiere (Gruppe 5) erhielten eine 100 ug/kg sc Dosis kurzes Relaxin in 1% Benzopurpurin. Vier Tiere (Gruppe 3) erhielten eine 100 ug/kg intravaginale Dosis kurzes Relaxin in 3-Methylzellulose Die Dosis-Lösungskonzentration iv und sc betrug 500 ug/ml klare Flüssigkeit mit kurzem Relaxin mit 1mg/ml Relaxin. Verdünnungen wurden mit steriler isotonischer Salzlösung oder 1% Benzopurpurin (BPP) in Salzlösung durchgeführt. Das Dosisvolumen betrug etwa 1 ml und wurde einzeln nach folgender Gleichung berechnet:
Dosisvolumen = (100 ug/kg)(kg)/(500 ug/ml).
Zur intravaginalen Verabreichung wurden insgesamt 3 mg Methocel Gel (4%) mit 0,487 ml kurzem Relaxin (oben beschrieben) und 0,513 ml Zitratformulierungspuffer nach der oben beschriebenen Vorschrift gemischt, um ein 600 ug/ml kurzes Relaxin, 3% Methylzellulosegel zu erhalten. Das intravaginale Dosisvolumen betrug 0,5 ml.
Blutproben (1 ml) wurden von einem Viggo Secalon Katheter in der Arterie des Ohres abgezogen. Die Blutprobenentnahmezeiten waren: (iv) 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 40, 60, 80, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600, 660 und 720 min; (sc und intravaginal) 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 480, 540, 600, 660 und 720 min. Man ließ die Blutproben koagulieren, und Serum wurde durch Zentrifugieren geerntet. Proben wurden auf Trockeneis gefroren und bei -70ºC bis zum Assay durch ELISA gelagert. Der Assaybereich betrug 20 bis 1280 pg/ml.
Einzelne iv pharmakokinetische Parameter wurden durch Anpassen der einzelnen Daten für immunrekative Serumkonzentration-Zeit an ein dreiexponentiales Modell unter Verwendung eines nichtlinearen Kurvenanpassungsprogrammes (NONLIN84, Statistical Consultants, Inc.; Lexington, KY) geschätzt. Daten von extravaskulären Verabreichungswegen wurden unter Verwendung des RS-1-Programms (Bolt, Bernak & Newman, Cambridge, MA) angepaßt. Die Fläche unter der Serumkonzentration-Zeit-Kurve (AUC) wurde unter Verwendung des trapezoidalen Verfahrens von t+0 zur letzten meßbaren Serumkonzentration (Ct) berechnet. Die AUC von Ct zur unendlichen Zeit wurde durch Extrapolation geschätzt: Ct wurde durch die Endeliminationsratenkonstante dividiert. Serumclearance (CL) wurde durch die Gleichung: CL=Dosis/AUC(iv) berechnet. Das anfängliche Verteilungsvolumen (Vc) wurde berechnet aus: Vc=Dosis/C(O), worin C(O) die Summe der Koeffizienten der tri-exponentialen Gleichung war, die die Serumkonzentration-Zeit-Daten beschreibt. Das Verteilungsvolumen im stabilen Zustand (Vdss) wurde berechnet als: CL*AUMC/AUC, worin AUMC die Fläche unter der Momentkurve war, d.h. die (Serumkonzentration)*(Zeit) gegenüber Zeit-Kurve. Die Serum-Halbwertszeiten wurden durch Dividieren von 0,693 durch die jeweilige Dispositionsratenkonstante berechnet. Die biologische Verfügbarkeit wurde nach dem Flächenverhältnisverfahren bestimmt:
(AUC(extravaskulär)/AUC(iv))*100.
Die Serumkonzentration-Zeit-Profile für 100 ug/kg kurzes Relaxin bei trächtigen Kaninchen nach iv, sc und intravaginaler Verabreichung werden in Figur 5 gezeigt, worin die geschlossenen Kreise iv, die offenen Quadrate sc und die offenen Kreise intravaginale Verabreichung sind. Figur 6 zeigt einen Vergleich der Serumkonzentration-Zeit-Profile für 100 ug/kg kurzes Relaxin, subkutan an trächtige Kaninchen und (geschlossene Kreise) und ohne (offene Quadrate) BPP verabreicht. Tabelle X gibt die berechneten pharmakokinetischen Parameter für alle Verabreichungswege an. Die Serumclearance (CL) nach iv-Verabreichung betrug 2,95 ± 0,88 ml/min/kg. Die anfänglichen (Vc) und Stabilzustand(Vdss)-Verteilungsvolumina betrugen 89 ± 22 bzw. 209 ± 30 mg/kg. Drei Exponentialterme waren erforderlich, um die iv Serumkonzentration-Zeit-Daten zu beschreiben, sodaß die Halbwertszeiten (tl/2) 8,4 ± 2,7, 59,1 ± 8,7 bzw. 279 ± 128 min betrugen. Subkutane Verabreichung von menschlichem Relaxin führte zu einer Mittelpeakserumkonzentration von 76,20 ± 17,80 ng/ml bei 180 min und einer biologischen Verfügbarkeit von 76,0 ± 20,6 % (wobei iv Relaxin 100% biologische Verfügbarkeit aufweist). Subkutan mit BPP verabreichtes menschliches Relaxin ergab eine Mittelpeakserumkonzentration, die geringer (41,67 ± 16,32 ng/ml) und später (420 min) auftrat, als die mit allein sc verabreichtem menschlichen Relaxin beobachtete. Die sc biologische Verfügbarkeit mit BPP betrug 59,4 ± 6,7%.
Menschliches Relaxin scheint nach intravaginaler Verabreichung schlecht systemisch absorbiert zu werden. Systemische Serumkonzentrationen waren sehr gering (0,34 ± 0,16 ng/ml bei 98 min), und die resultierende biologische Verfügbarkeit betrug nur 1,0 ± 0,8%. TABELLE X Pharmakokinetische Parameter für 100 ug/kg hRlx bei trächtigen Kaninchen nach iv, sc und intravaginaler Verabreichung. Weg Mittel SD = Standardabweichung top = topisch Tabelle X (Fortsetzung) Weg Mittel SD = Standardabweichung top = topisch Tabelle X (Fortsetzung) Weg Mittel a Mittelpeakserumkonzentration * Mittelzeit für Mittelpeakserumkonzentration # biologische Verfügbarkeit @ scheinbarer Terminal t1/2 für extravaskuläre Dosis SD = Standardabweichung top: topisch
Nach dem Abschluß der pharmakokinetischen Versuche (12 h) wurden die Tiere getötet und die Fortpflanzungstrakte wurden entfernt und für die histologische Untersuchung präpariert. Gewebe wurden in 10% NBF fixiert, in Paraffin eingebettet und mit H&E und PAS/Alcian Blue-Farbstoffen gefärbt. Histologische Sektionen von Kaninchenzervices wurden ohne Wissen über die Behandlungsgruppe durchgeführt. Für die Zwecke dieser Untersuchung waren die bewerteten Hauptkriterien (1) relative Kompaktheit der Lamina propria und muscularis, (2) die Gegenwart von Riesenzellen und (3) die Lokalisierung zum Zervixbereich. Die Zervices wurden drei Kategorien zugeordnet: positiv, für lose angeordnete lamina propria und darunterliegende Muskeln mit offensichtlicher Zunahme an Riesenzellen, fraglich, für das Vorhandensein einiger Veränderungen, aber in weniger ausgeprägtem Ausmaß oder nichtzervikaler Anordnung, und negativ, für Zervix ohne Veränderungen.
Die Schlußfolgerung aus den histologischen Untersuchungen ist die, daß es keine klare Verbindung zwischen Behandlung und histologischer Veränderung gab.

Wirkung von Oxidationshemmern und Co-Lösungsmitteln

Diese Untersuchung hat die Aufgabe, die Fähigkeit verschiedener Formulierungshilfsmittel zu bestimmen, Relaxin in Methylzellulosgel zu stabilisieren. Da der Abbau durch Photooxidation auftritt, wurden Oxidationshemmer wie Askorbinsäure und Natriummetabisulfit untersucht. Außerdem wurden, da eine mögliche Quelle von freien Radikalen die Peroxide auf Methylzellulose sind, Co-Lösungsmittel wie Glycerin und Äthanol untersucht, um zu bestimmen, ob sie die Formulierung stabilisieren würden, indem sie die Wechselwirkung zwischen Methylzellulose und Relaxin verringern. Schließlich wurde die Wirkung von Gelaktivierung auf Relaxinoxidation durch Belichten des Gels vor der Verwendung bei der Herstellung der Formulierung untersucht.
Gelherstellung: 4 % (Gew./Vol.) Methylzellulosegel wurden durch Hinzufügen von 4 g Methocel-Pulver (Dow Chemical) zu 100 ml 10 mM Zitrat, pH 5-Puffer (durch NaCl isotonisch gemacht) hergestellt. Nachdem das Pulver in den Puffer bei 85ºC dispergiert worden war, wurde die Lösung bei 121,5ºC 30 Minuten lang autoklaviert. Nach dem Abschluß wurde ein Stickstoffhaube über das Gel gegeben, und es wurde über Nacht im 5ºC Inkubator gelassen, um zu hydratisieren. Bei Formulierungen, die Glycerin und Äthanol enthalten, wurden die Co-Lösungsmittel direkt zum Formulierungspuffer hinzugefügt. Das "aktivierte" Gel wurde hergestellt, indem das autoklavierte 4%-Gel bei 34ºC 24 Stunden lang in die fluoreszierende Lichtbox gegeben wurde, bevor es mit Relaxin gemischt wurde.
Untersuchungsvorschrift: Tabelle XI nennt die Bedingungen, Ingredienzien und Zusammensetzungen bei jeder untersuchten Formulierung. TABELLE XI Zusammensetzung von für diese Untersuchung verwendeten Relaxinformulierungen Formulierung Methylzellulose Andere Ingredienzien Belichtung 0,5% Ascorbinsäure Ascorbinsäurestamm (Aldrich Chem. Co.) 0,2% Metabisulfit (Fisher Scientific Corp) 20% Glycerin (Mallinckrodt) 20% Äthanol (Mallinckrodt) 3% (aktiviert)
Die Relaxinlösung wurde mit 1 mg/ml zugeführt und über eine Amicon Ultrafiltrationseinheit auf 2 mg/ml eingeengt. Die Proben wurden durch Mischen des 2 mg/ml Relaxinkonzentrats in pH 5 10 mM Zitratpuffer und 4% Methocelgel gemäß einem Volumsverhältnis von 1:4 hergestellt. Die Lösung und 4% Gel wurden getrennt in zwei Spritzen abgegeben, und das Mischen wurde durch Drücken des Inhalts durch die Spritzen nach vor und zurück 20mal durch ein Verschlußverbindungsstück wie oben beschrieben erreicht. Ascorbinsäure und Metabisulfit wurden vor dem Mischen mit dem Gel in die Relaxinlösung aufgenommen. Das Endgelpräparat wurde in autoklavierte 1,5 ml Glas-HPLC-Phiolen in etwa 0,25 ml Teilmengen abgegeben. Die Phiolen wurden mit einer Kappe versehen, abgedichtet und aufrecht in den 5ºC kalten Raum unter dem fluoreszierenden Licht gestellt. Proben in den Formulierungen #1 und #8 wurden in Folie gewickelt, während Proben in Formulierung #3 kurz angesaugt und mit Stickstoff aufgefüllt wurden.
Der Abbau von Relaxin wurde durch Umkehrphasen-HPLC quantifiziert. Da die Viskosität des Gels die direkte Anwendung von Proben für HPLC verhindert, wurde es vor dem Injizieren 5fach mit Formulierungspuffer verdünnt. Die Bedingungen des chromatographischen Verfahrens waren folgende:
Instrument: HP 1090L
Säule: Vydac C4-300, 4,6 x 150 mm
Fließrate: 1 ml/min
Wellenlänge: 214 nm
Injektionsvolumen: 200 ul
Temperatur: Umgebungstemperatur
Mobile Phase: (A) 0,1% TFA (B) 90% Acetonitril, 0,1% TFA
Gradientenrate: 20% B gesteigert auf 50% B in 30 Minuten
Ergebnisse: Tabelle XII nennt die anfänglichen Ergebnisse der Untersuchung und zeigt den prozentuellen Hauptpeak der an jeweiligen Zeitpunkten festgestellt wurde. TABELLE XII Relaxinstabilität in verschiedenen Gelformulierungen: % Hauptrelaxinpeak zu verschiedenen Zeitpunkten Formulierung % Hauptpeak Kontrolle - Licht Kontrolle + Licht Kontrolle + Licht mit N&sub2;-Kopfraum Kontrolle + Licht + Ascorbinsäure Kontrolle + Licht + 20% Glycerin Kontrolle + Licht + 20% Äthanol Aktiviertes Gel - Licht
Nach 11 Tagen behielt die vor Licht geschützte Kontrolle 96% ihrer Hauptpeakfläche, während die belichtete Kontrolle vollständig abgebaut worden war. Stickstoffkopfraum verzögerte den Abbau nicht. 0,5% Ascorbinsäure und 20% Äthanol schienen Relaxin in etwa im gleichen Ausmaß zu stabilisieren. An Tag 11 lag der Prozentsatz an verbleibendem Relaxin zwischen 55 und 60 %. Das beste Ergebnis wurde mit der 20% Glycerinformulierung erreicht: 90% des Hauptpeaks wurden nach 11 Tagen Belichtung wiedergewonnen. Die "aktivierte" Gelprobe wies einen 9%igen Verlust an aktivem Protein auf, auch wenn sie vor Licht geschützt war. Verglichen mit der negativen Kontrolle (die leere Gelformulierung, die vor Licht geschützt war) ist klar, daß Gel-"Aktivierung" den Abbau des Proteins beschleunigte. Das bedeutet, daß übermäßige Belichtung während der Herstellung des Gels selbst nicht empfehlenswert ist. Das Ergebnis von der Metabisulfit enthaltenden Formulierung wird nicht gezeigt, da der Relaxinpeak in diesen Proben nicht nachgewiesen werden konnte und sie in der Folge aus der Untersuchung ausgeschlossen wurde. Es ist möglich, daß Metabisulfit mit Relaxin reagiert, was zu vollständigem Proteinverlust führt.
Aus diesen Versuchen ist klar, daß Belichtung eine wesentliche Rolle beim In-Gang-setzen des Abbauvorgangs spielte. Das Einschließen von 20% Glycerin in die Formulierung schützte Relaxin am wirksamsten vor durch Licht herbeigeführter Oxidation. In einem geringeren Ausmaß stabilisierten auch Ascorbinsäure und Äthanol die Formulierung. Die Wirkung von Äthanol in dieser Untersuchung wird möglicherweise unterschätzt, da es sein kann, daß eine beträchtliche hinzugefügte Teilmenge während der Dispersion von Methylzellulosepulver verdampft ist. Kombinationen aus Glycerin, Äthanol und Ascorbinsäure können zusätzliche Stabilisierung schaffen.
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß Photooxidation von Relaxin in Methylzellulosegel durch das Einschließen von Glycerin, Äthanol oder Ascorbinsäure darin wirksam verzögert werden kann. Eine Endformulierung mit annehmbarer Lagerbeständigkeit kann unter Ausnützung dieser Hilfsmittel und Schutz des Produktes vor übermäßiger Belichtung konstruiert werden.

Claims

1. Biologisch wirksame, stabile, homogene pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen Verwendung beim Modulieren der Fortpflanzungsphysiologie von Säugetieren während Schwangerschaft und Geburt, die eine wirksame Menge von menschlichem Relaxin in einem Puffer, der fähig ist, den pH-Wert der Zusammensetzung bei etwa 4 bis unter etwa 7 zu halten und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der pH-Wert im Bereich von etwa 4 bis 6 liegt.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der pH-Wert etwa 5 beträgt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin der Puffer ein organischer Säurepuffer oder Histidinpuffer ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin der Puffer Zitrat- oder Acetatpuffer ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die eine Ionenstärke von zumindest 0,1 molar und eine Osmolalität von etwa 200 bis 300 mmol/kg aufweist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, die eine Ionenstärke im Bereich von 0,1 bis etwa 0,2 molar und eine Osmolalität von etwa 250 mmol/kg aufweist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, die eine Ionenstärke von etwa 0,15 molar aufweist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die isotonisch ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, die weiters ein Agens umfaßt, um die Zusammensetzung isotonisch zu machen.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin das Agens ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz oder ein Zuckeralkohol ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin das Agens ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetallhalogenid oder Mannit ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin das Agens Natriumchlorid ist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin der Puffer Zitrat ist und der pH-Wert etwa 5 beträgt.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die weiters einen mehrwertigen Zuckeralkohol, Äthanol oder Polypropylenglykol umfaßt.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin der mehrwertige Zuckeralkohol aus Glycerin, Erythrit, Glycerol, Arabit, Xylit, Sorbit und Mannit ausgewählt ist.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin der Zuckeralkohol in einer Menge von etwa 1 bis 25 Gew.-%, bezogen auf die Zusammensetzung, hinzugefügt ist.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, worin der Zuckeralkohol in einer Menge von etwa 2 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Zusammensetzung, hinzugefügt ist.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die steril ist.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die in flüssiger Form vorliegt.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die in lyophilisierter Form vorliegt.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 1, die als gefrorene Flüssigkeit vorliegt.

23. Biologisch wirksame pharmazeutische Gelzusammensetzung, die Methylzellulose in einer Menge von etwa 2-5% des Gels und menschliches Relaxin in einer Menge von etwa 100 bis 1000 ug pro ml Gel in einem Puffer umfaßt, der fähig ist, den pH-Wert der Zusammensetzung bei etwa 4 bis unter etwa 7 zu halten.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 23, worin die Methylzellulose etwa 3 bis 4% des Gels umfaßt und die Menge an Relaxin etwa 300 bis 1000 ug pro ml Gel ausmacht.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 23, worin das Gel steril ist.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 23, die weiters ein Agens umfaßt, das die Abgabe des Relaxins an einen Wirt erhöht, der mit der Zusammensetzung behandelt wird.

27. Zusammensetzung nach Anspruch 26, worin das Agens Ölsäure, Niacinamid, Nicotin- oder Salicylsäure oder deren Salze oder Ester, Azon, Glykocholat, Cholat, Fusidsäure oder Salze oder Ester von Fusidsäure ist.

28. Zusammensetzung nach Anspruch 23, die weiters ein Agens umfaßt, um die Photooxidation des Gels zu verhindern.

29. Zusammensetzung nach Anspruch 28, worin das Agens ein Oxidationshemmer oder Co-Lösungsmittel oder eine Mischung davon ist.

30. Zusammensetzung nach Anspruch 29, worin das Agens Ascorbinsäure, Äthanol oder Glycerin oder eine Mischung davon ist.