DD255477A5

DD255477A5 - Verfahren zur herstellung von stabilisierten menschlichen gewebe-plasminogen-aktivator-zusammensetzungen

Info

Publication number: DD255477A5
Application number: DD86297695A
Authority: DD
Inventors: William F Bennett; Stuart E Builder; Larry A Gatlin
Original assignee: Kkk
Priority date: 1985-12-17
Filing date: 1986-12-16
Publication date: 1988-04-06
Also published as: ATE79273T1; ES2044840T3; US4908205A; PH24716A; GB2184354A; IL80904A0; AU6661086A; KR950010322B1; IE59060B1; NO168988B; EP0228862B1; NO865079L; PT83933B; NO865079D0; FR2591485B1; PT83933A; ZA869457B; KR870005647A; GB2184354B; DE3686410D1

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch vertraeglichen Zusammensetzungen, die menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivator und als weitere Komponente einen Argininium-Puffer enthalten, beschrieben. Derartige Zusammensetzungen koennen in verschiedenen Formen, z. B. lyophilisiert oder eingefroren, hergestellt werden.

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt im Bereich der Arzneimittel.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Instabilität von vaskulärem Plasminogen-Aktivator der aus den vaskulären Verzweigungen von menschlichen Kadavern extrahiert wurde, wird im Biol.Chem. (Tokyo) 75,731 (1974) beschrieben. Es wurde gefunden, daß der Aktivator nur durch hohe Natriumchlorid-Konzentrationen, die über ungefähr 0,5 M lagen, stabilisiert wurde.

In J. Biol.Chem. 254,1998 (1979) ist die Verwendung von hohe Salz-und Argininkonzentrationen enthaltenden Puffern während eines mehrstufigen Reinigungsverfahrens als essentiell für die Aufrechterhaltung der Aktivität des aus menschlichen Kadaverperfusaten gewonnenen vaskulären Plasminogen-Aktivators beschrieben. Die Reinigungsstufen wurden in Anwesenheit von 0,3 bis 1,0M NaCI und 0,1 M Arginin durchgeführt.

In Arch, of Biochem. & Biophy. 189,185 (1978) wird die Abtrennung von Plasminogen-Aktivator aus menschlichem Plasma durch Chromatographie an Lysin-Sepharose beschrieben. In einem Experiment wurde roher Plasminogen-Aktivator aus stabilisiertem Plasma von Lysin-Sepharose unter Verwendung eines Gradienten von OM bis 0,5M Arginin in 0,6M NaCI eluiert.

Aus natürlichen Gewebequellen gewonnener menschlicher Gewebe-Plasminogen-Aktivator ist in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nummer 0041766 beschrieben. Die Autoren verwendeten ein Reinigungsschema das einen Gewebe-Plasminogen-Aktivator in relativ hoher Reinheit liefert. Die Stabilität von Präparaten des gereinigten Gewebe-Plasminogen-Aktivators sowohl im flüssigen als auch im lyophilisierten Zustand wurde untersucht und es wurde gefunden, daß die lyophilisierten Formen wiederholt instabil waren, sogar wenn sie aus Lösungen, die 0,3 M NaCI enthielten, hergestellt worden waren.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die das Protein menschlicher Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA), der verbesserte Stabilität und Löslichkeitseigenschaften aufweist, enthalten und die eine einfache Lyophilisierung erlauben, bereitzustellen. , -

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen bereitzustellen, die menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA), der verbesserte Stabilität und Löslichkeitseigenschaften aufweist, enthalten. Auch sollen diese pharmazeutischen Zusammensetzungen leicht lyophilisierbar sein, um die Herstellung von stabilen, lyophilisierten Formen von t-PA für die sichere, effektive, therapeutische Verabreichung an Menschen zu ermöglichen.

Die Erfindung bertrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von menschlichem Gewebe-Plasminogen-Aktivator und einen pharmazeutisch verträglichen, Argininiumionen enthaltenden Puffer, wobei die Zusammensetzung eine Chloridionen-Konzentration von weniger als ungefähr 0,3 M aufweist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Gewebe-Plasminogen-Aktivator und den Argininiumionen enthaltenden Puffer zusammengibt.

Damit Materialien wie der Gewebe-Plasminogen-Aktivator mit der Gesundheitspflege befaßten Personen und Patienten zur Verfügung gestellt werden kann, müssen diese Materialien als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden. Solche Zusammensetzungen müssen über eine geeignete Zeitspanne hinweg stabil sein, müssen aus sich selbst heraus für die Verabreichung an Menschen geeignet sein und müssen leicht herstellbar sein. Ein Beispiel für eine solche Zusammensetzung ist eine Lösung für die parenterale Verabreichung. Obwohl in vielen Fällen pharmazeutische Lösungsformulierungen in flüssiger Form, geeignet für die sofortige Verwendung, bereitgestellt werden, können solche parenteralen Formulierungen auch in eingefrorener oder lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt werden. Im ersten Fall muß die Zusammensetzung vor der Verwendung aufgetaut werden. Die letztere Form wird oft verwendet, um die Stabilität des medizinischen Mittels, das in der Zusammensetzung enthalten ist, unter einer großen Vielzahl von Lagerbedingungen zu erhöhen, da die Fachleute wissen, daß lyophilisierte Präparate im allgemeinen stabiler sind als ihre flüssigen Gegenstücke. Solche lyophilisierten Präparate werden vor der Verwendung durch die Zugabe eines oder mehrerer pharmazeutisch verträglicher Verdünnungsmittel, wie z. B. sterilem Wasser für die Injektion oder steriler physiologischer Kochsalzlösung und dgl., rekonstituiert. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß die Verwendung von Arginin (als Argininiumion) in einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung aus Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) die Stabilität und Löslichkeit von t-PA merklich erhöht und daß sie weiter, zusammen mit der Auswahl geeigneter Gegenionen, die Herstellung von stabilen, lyophilisierten Formen von t-Pa ermöglicht. Deshalb ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung derartiger Zusammensetzungen und aller damit verbundenen Äquivalente gerichtet.

Im allgemeinen können die Zusammensetzungen andere Komponenten in Mengen enthalten, die die Herstellung von stabilen, lyophilisierbaren Formen nicht erschweren und in Mengen, die für eine wirksame, sichere pharmazeutische Verabreichung geeignet sind.

Geeignete pH-Bereiche für die Herstellung dieser Zusammensetzungen sind von ungefähr 4 bis ungefähr 9; da diese Zusammensetzungen für Pharmazeutika verwendet werden sollen, ist der physiologische pH-Bereich, d. h. ungefähr neutral, bevorzugt. In diesem pH-Bereich existiert Arginin hauptsächlich als protoniertes Kation mit einer Gesamtladung von +1, das als „Argininiumion" bezeichnet werden kann. Die Bezeichnung „Arginin" wird hier gleich bedeutend mit „Argininiumion" verwendet, da aufgrund des pH-Wertes des Systems „Argininiumion" eine äquivalente Beschreibung ist. Um die elektrische Neutralität aufrecht zu erhalten, muß das Argininiumion durch eine äquivalente Menge an entgegengesetzt geladenen (d.h. negativ geladenen) ionischen Spezies, die als „Gegenionen" bezeichnet werden können, ausgeglichen werden. Die Kombination von Argininiumionen, anderen kationischen Spezies und den verschiedenen Gegenionen kann als „Argininiumion enthaltendes Puffersystem" bezeichnet werden. Annehmbare Gegenionen sind solche, die pharmazeutisch verträglich sind und zusätzlich solche, mit denen man die offensichtliche eutektische oder Umwandlungstemperatur der Zusammensetzung so einstellen kann, daß die Zusammensetzung insbesondere für die leichte Lyophilisierung geeignet ist. Beispiele für solche Gegenionen sind Acetat, Phosphat, Citrat, Succinat, Sulfat, Tartrat, Malat, Maleat, Carbonat und dgl. sowie funktioneile Äquivalente davon. Ein Beispiel für ein Gegenion, das nicht gut geeignet ist, ist das Chloridion.

Wie oben festgestellt, wurde gefunden, daß die Verwendung von Arginin (als Argininiumion) in pharmazeutischen Zusammensetzungen des t-PA die Löslichkeit und Stabilität des t-PA in diesen Zusammensetzungen merklich erhöht. Die Arginin-Konzentration kann im Bereich von ungefähr 0,02 M bis 1 M, vorzugsweise von ungefähr 0,05M bis ungefähr 1,0M und insbesondere von ungefähr 0,1 M bis ungefähr 0,5 M in der verabreichten Lösung und/oder, im Falle eines lyophilisierten Präparats, in der vor der Lyophilisierung vorhandenen Lösung liegen.

Zusätzlich können die verbesserten Zusammensetzungen gegebenenfalls ein oder mehrere nicht-ionische Detergentien wie z. B. Polysorbate 20 und Polysorbate 80 und dgl., in Mengen von ungefähr 0,001 bis ungefähr 1 % enthalten, um die Stabilität des t-PA weiter zu erhöhen. Zusätzlich können andere pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe, die dem Fachmann wohlbekannt sind, einen Teil solcher Zusammensetzungen bilden. Diese beinhalten z. B. veschiedene Streckmittel, zusätzliche Puffermittel, Chelatisierungsmittel, Antioxidantien, Konservierungsmittel, Co-Lösungsmittel und dgl.; spezifische Beispiele dafür sind Mannitol, Tomethaminsalze („Tris-Puffer"), Dinatriumedetat, Gelatine, menschliche Serumalbumin oder andere Polypeptide, verschiedene kleine Peptide, wie z. B. Glycylglycin, usw. '

Überraschenderweise erfordern die erfindungsgemäß hergestellten t-PA-Zusammensetzungen nicht die Verwendung von hohen Konzentrationen, d.h. ungefähr 0,3 M oder darüber, an Natriumchlorid. Tatsächlich sind hohe Konzentrationen an Chloridionen für die Lyophilisierbarkeit dieser verbesserten Zusammensetzungen sehr schädlich. Obwohl eine gewisse Menge an Chloridionen toleriert wird, sind niedrige Konzentrationen bevorzugt, d.h. weniger als ungefähr 0,3 M und vorzugsweise nicht größer als normale physiologische Konzentrationen, d.h. ungefähr 0,12M NaCI. Am meisten bevorzugt ist es, wenn die Zusammensetzung keine Chloridionen enthält.

Unter „pharmazeutisch wirksame Menge" von t-PA ist die Menge zu verstehen, die zu einem theratpeutischen Effekt in verschiedenen Verabreichungsgebieten führt. Vorliegend können Zusammensetzungen hergestellt werden, die Mengen an t-PA von wenigstens ungefähr 0,1 mg/ml, bis hinauf zu ungefähr 50 mg/ml, vorzugsweise von ungefähr 0,4mg/ml bis ungefähr 5 mg/ml enthalten. Bei der Verwendung dieser Zusammensetzungen zur Verabreichung an Menschen, die an Herzinfarkt leiden, können diese Zusammensetzungen z. B. ungefähr 0,4mg/ml bisungefähr 3 mg/ml t-PA enthalten, was der momentan für eine solche Behandlung eingesetzten Dosierung entspricht.

Die vorliegenden Zusammensetzungen, die lyophilisierte Formen einschließen, werden ganz allgemein hergestellt, indem man die Komponenten zusammengibt, wobei man sich allgemein zugänglicher pharmazeutischer Mischungsverfahren, die als solche bekannt sind, bedient. Genauso werden auf diesem Gebiet wohlbekannte Standard-Lyophilisierungsverfahren und Ausrüstung dafür verwendet. Ein spezielles Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung von t-PA umfaßt die Verwendung von gereinigtem (gemäß irgendeinem Standard-Proteinreinigungsschema) t-PA in irgendeinem der vielen bekannten Pufferaustauschverfahren, wie z. B. der Gelfiltration. Dieses bevorzugte Verfahren wurde zur Isolierung und Reinigung des t-PA, der als Ausgangsmaterial in den folgenden Untersuchungen zur Stabilität und Löslichkeit eingesetzt wurde, verwendet. Der t-PA, der bei dem bevorzugten Verfahren eingesetzt wurde, wurde aus durch Rekombination veränderten Eierstockzellen von chinesischen Hamstern (CHO-Zellen), die t-PA als abgesondertes Produkt in dem CHO-Zellkulturmedium expremieren können, erhalten.

Detaillierte Beschreibung

Es wurde gefunden, daß pharmazeutische Zusammensetzungen des t-PA eine merklich stabilisierte biologische Aktivität zeigen, wenn eine Komponente ein Argbininiumion-enthaltender Puffer ist und daß solche Formulierungen kein Natriumchlorid für die Stabilität benötigen, obwohl Salzkonzentrationen von weniger als 0,3 M verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Chloridionen-Konzentration 0,1 M oder niedriger. Im neutralen pH-Bereich, z. B. ungefähr pH 6 bis 8, wird die Löslichkeit des t-PA durch die Anwesenheit von Argininiumionen so erhöht, daß er in relativ hohen Konzentrationen formuliert werden kann, sogar ohne Anwesenheit dessen, was die Fachwelt für notwendig hielt, nämlich großen stabilisierenden Salzmengen.

Die Bezeichnungen „menschlicher Gewebe-Plasminogen-Aktivator", „menschlicher t-PA" oder „t-PA", die hier verwendet werden, beziehen sich auf menschlichen extrinsischen (vom Gewebe-Typ) Plasminogen-Aktivator der z. B. durch Extraktion aus natürlichen Quellen und Reinigung (siehe europäische'Patentanmeldung 041766 oben) und durch rekombinante Zellkultursysteme, wie sie hier beschrieben sind, hergestellt wird. Seine Sequenz und Eigenschaften werden z. B. in der Europäischen Patentanmeldung 93619 (die durch Bezugnahme hier aufgenommen wird), beschrieben. Vergleiche auch Europäische Patentanmeldung Nr.41766 und Journal of Biol.Chem. 256,7035 (1981), die ebenfalls durch Bezugnahme hier aufgenommen werden. Die obigen Bezeichnungen beziehen sich auch auf Äquivalente von biologisch aktivem menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivator, die sich in einer oder mehreren Aminosäuren der Gesamtsequenz oder im Glycosylierungsmuster unterscheiden, wobei man davon ausgeht, daß diese Unterschiede von den spezifischen Bedingungen bei der Kultur und der Natur des Wirts, aus dem der Gewebe-Plasminogen-Aktivator erhalten wird, abhängen.

A.Figuren

Figur 1 stellt die Stabilität von t-PA in verschiedenen Formulierungen dar.

Figur 2 ist eine Darstellung des Effekts der Arginin-Konzentration hinsichtlich der Löslichkeit von t-PA.

Figur 3 zeigt die Löslichkeitsgrenzen von t-PA in verschiedenen Konzentrationen von Argininiumphosphat-Puffern bei pH 6 und

B.Lyophilisierung

Die Lyphilisierung oder Gefriertrocknung der Zusammensetzungen wird unter Verwendung von Verfahren und Ausrüstungen, die dem Fachmann wohlbekannt sind, durchgeführt. Typischerweise wird eine Zusammensetzung zuerst eingefroren auf eine Temperatur unter ihrer offensichtlichen eutektischen oder Umwandlungstemperatur. Daraufhin wird Vakuum angelegt und die Regale des Gefriertrockners werden erwärmt, um das Eis durch Sublimation abzutreiben, wobei die Regaltemperatur und der Kammerdruck so eingestellt werden, daß die Temperatur der gefrorenen Masse unter der offensichtlichen eutektischen oder Umwandlungstemperatur bleibt, bis praktisch alles Eis entfernt worden ist. Nach dieser „ersten Trocknungsphase" kann die Regaltemperatur weiter erhöht werden (mit oder ohne Veränderung des Kammerdrucks) und die restliche Feuchtigkeit im gefriergetrockneten Kuchen wird abgezogen

C.S-2288-Bestimmung

Ein synthetisches Peptid-Substrat, S-2288 (H-D-Me-Pro-Arg-p-Nitroanilid^HCL) wird durch t-PA unter Bildung von farbigem p-Nitroanilin undTripeptid hydrolysiert. Der maximale Unterschied in der Absorption von Substrat und Produkt (p-Nitroanilin) liegt bei 405 nm. Die Bildutig von p-Nitroanilin wird spektrophotometrisch durch Verfolgung der Absorption bei 405 nm als Funktion der Zeit aufgenommen. Die resultierende Steigung der Absorption gegen die Zeit ist proportional zur Aktivität von t-PA. Diese Bestimmung wird bei 37 + 0,2⁰C durchgeführt.

Für diese Bestimmung wurden 20-100 Mikroliter einer gegebenen t-PA-Probe zu einer 1,2ml-Reaktionsmischung, die 0,33mM S-2288,0,067 M Tris-Puffer (pH 7,4) und 0,07 M NaCI enthielt gegeben und bei 37⁰C10 Minuten inkubiert. Die Veränderung in der Absorption wurde 1 Minute lang aufgezeichnet und die Aktivität wurde aus der Absorption bei 405 nm unter Verwendung der folgenden, vom Hersteller standardisierten Gleichung berechnet:

.,.....,,.. . . ... , . . AOD χ 793,65 (Verdünnungsfaktor)

Aktivität (IU; internationale Einheiten) = ² -

Inkubationszeit χ Probenvolumen

D. Beispiele Beispiel 1

Gereinigter t-PA wurde auf eine Endkonzentration von 0,2 mg/ml verdünnt, in Aliquote aufgeteilt und gegen die in Tabelle 1 genannten Puffer dyalisiert.

Tabelle 1

Dialyse-Puffer, enthaltend 0,01% Polysorbate 80

Dialyse-Konzentration

NaCI Arginin (als Hydrochloric))

1. 0,01 MNatriumphosphatpH6, — · —

2. 0,01 M NatriumphosphatpH6, 0,12 M 0,2 M

3. 0,01 M Natriumphosphat pH6, — 0,2 M

4. 0,01 M Natriumacetat pH5, — —

5. 0,01 MNatriumacetatpH5, 0,12M 0,2M

6. 0,01 M Natriumacetat pH5, 0,2 M

Nach der Dialyse wurden die Proben zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit in 1 ml Aliquoten lyophilisiert. Die lyophilisierten Proben wurden mit Wasser rekonstituiert und zur Bestimmung der t-PA-Aktivität der S-2288-Bestimmung unterzogen. Jede rekonstituierte Probe wurde danach bei 37°C gehalten und mehrere Male einer Bestimmung unterzogen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Figur 1 gezeigt. Wie daraus ersichtlich, verhindern die Systeme, die kein Arginin enthalten, den Verlust der t-PA-Aktivität mit der Zeit nicht. Diejenigen Proben, die 0,2 M Arginin oder 0,2 M Arginin plus physiologische Mengen an Chlorid enthalten, behalten nach 4tägiger Inkubation bei 37°C fast die ganze ursprüngliche t-PA-Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, daß 0,2 M Arginin mit oder ohne NaCI t-PA merklich stabilisiert.

Beispiel 2

Die Stabilität von t-PA als Funktion der Arginin-Konzentration wurde durch Messung der Geschwindigkeit der Abnahme der t-PA-Aktivität bei verschiedenen Temperaturen bestimmt.

Formulierung: 1. 0,355mg/ml t-PA

0,05 M Na-PhosphatpH 6,2 0,05M Arginin als Hydrochlorid 2. 0,498mg/ml t-PA

0,03 M Na-Phosphat pH 6,2 0,2 M Arginin als Hydrochlorid

O,5ml-Aliquote der Lösung mit den obigen Formulierungen wurden aseptisch in 2 ml Glasfläschchen gefüllt und verschlosssn. Die Glasfläschchen wurden bei 25°, 37° und 45°C gehalten. Von zwei Glasfläschchen von jeder Lösung wurden nach 0,20,55 und 160 Tagen Proben gezogen und die t-PA-Aktivität wurde unter Verwendung der S-2288-Bestimmung gemessen. Der natürliche Logarithmus der % verbleibender Aktivität wurde gegen die Zeit (Tage) für jede Temperatur aufgetragen und daraus Geschwindigkeitskonstanten unter Verwendung der linearen Regressionsanalyse berechnet.

Die Geschwindigkeitskonstanten (k) des Verlusts dert-PA-Stabilität bei zwei verschiedenen Arginin-Konzentrationen und bei verschiedenen Temperaturen sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Wirkung von Arginin auf die Stabilität von t-PA

Formulierung	Arginin	kfTage¹) 25⁰C	37 ⁰C	45⁰C
0,05 M Na-Phosphat, pH 6,2 0,03 M Na-Phosphat, pH 6,2	0,05 M - 0,2OM	0,00137 0,00043	0,0102 0,00569	0,0167 0,01272

Wie ersichtlich, erzeugt 0,2 M Arginin Geschwindigkeitskonstanten, die kleiner sind als diejenigen, die man in 0,05 M Arginin bei jeder der aufgeführten Temperaturen erhält, was ein Zeichen dafür ist, daß eine Zunahme der Arginin-Konzentration die Stabilität von t-PA erhöht.

Beispiel 3

Die Stabilität von t-PA hängt auch von der Konzentration nicht-ionischer Tenside ab. Die Ergebnisse können der Tabelle 3 entnommen werden.

t-PA wurde durch Dialyse gegen 0,01 M Natriumsuccinat-Puffer bei pH 6,0 ausgefällt. Das t-PA-Präzipitat wurde aus der dialysierten Probe durch Zentrifugieren abgetrennt. Dieses Präzipitat wurde in der unten angegebenen Formulierung, die variierende Konzentrationen von Polysorbate 80 enthielt, wiederaufgelöst.

Formulierung: 0,2M Arginin als Hydrochlorid 0,02 M Natriumphosphat pH 7,2 Polysorbate 80 (0,0005 bis 0,10%) " ' .

Die Lösungen wurden aseptisch in Glasfläschchen gefüllt und diese wurden bei 35⁰C und 4O⁰C gehalten. Aus zwei Glasfläschchen wurden zu jedem Zeitpunkt Proben entnommen und die enzymatische Aktivität wurde unter Verwendung der S-2288-Bestimmung gemessen.

Die Geschwindigkeitskonstanten wurden durch lineare Regressionsanalysen des log (t-PA-Aktivität) gegen die Zeitkurve bei jeder Temperatur berechnet und sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Wirkung von Polysorbate 80 auf die Stabilität von t-PA

Polysorbate 80	MTage"¹)	40⁰C
%	35⁰C	0,0106
0,0005	0,0055	0,0091
0,005	0,0049	0,0088
0,01	0,0043	0,0081
0,025	0,0040	0,0077
0,05	0,0041	0,0075
0,10	0,0037

Diese Tabelle zeigt, daß mit zunehmender Konzentration von Polysorbate 80 die Geschwindigkeitskonstante (k) abnimmt. Dies ist ein Zeichen dafür, daß mit mehr Polysorbate 80 eine höhere Stabilität erreicht werden kann.

Beispiel 4

t-PA-Lösungen wurden durch Dialyse von gereinigtem t-PA gegen die folgende Argininiumphosphat-Pufferformulierung hergestellt, gefolgt von einer Verdünnung mit weiterem Puffer auf die gewünschte Endkonzentration von t-PA.

Pufferformulierung: 0,2OM Arginin

0,18M Phosphorsäure 0,01 % Polysorbate 80 pH 6

Aliquote eines jeden Präparats wurden aseptisch in 5- oder 10-ml-Glasfläschchen ingefüllt, lyophilisiert und verschlossen. Die Glasfläschchen wurden bei mehreren Temperaturen gehalten. Aus zwei Glasfläschchen pro Formulierung wurden zu jedem Zeitmeßpunkt Proben entnommen und die t-PA-Aktivität wurde durch die S-2288-Bestimmung gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4

Stabilität von t-PA in lyophilisierter Formulierung

% verbleibend (Mittel aus 2

t-PA	pH	Zeit	5 ⁰C	25⁰C	Bestimmungen	± Standard-
(mg/		(mo)			Abweichung)
ml)*	6,0		102,5 ±0,0	103,3 ±2,5	30°C	35 °C
1,0	6,0	2,0	111,3 + 0,7	111,1 +0,1	—	102,6 + 3,0
2,0	6,0	2,0	112,0 ±0,3	112,7 ±0,6	—	114,6 + 2,2
5,0	6,0	2,0	98,2 ±1,3	_	-	112,3+1,4
1,0	3,5		96,0+1,7

* Konzentration von t-PA in Lösung vor der Lyophilisierung

Diese Ergebnisse zeigen, daß t-PA in der lyophilisierten Form stabil ist.

Beispiel 5

Eine ungefähr 0,3 bis 0,5 mg/ml t-PA enthaltende Lösung wurde gegen 1OmM Natriumphosphat, pH 7,5,0,01 % Polysorbate 80, enthaltend verschiedene Konzentrationen von Arginin als Hydrochlorid, dialysiert. Unlösliches Material wurde durch 2minütiges Zentrifugieren in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge entfernt. Die Menge an t-PA, die in der Lösung verblieb, wurde durch die S-2288-Bestimmung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig.2 gezeigt.

Schon 5OmM Arginin erhöhen die Löslichkeit von t-PA merklich. (Die kleinere Zunahme der offensichtlichen Löslichkeit bei höheren Argininkonzentrationen ist ein Artefakt, bedingt durch die Tatsache, daß die ursprüngliche Konzentration von t-PA im Ausgangsmaterial nur 0,3 bis 0,5mg/ml betrug und dadurch eine Grenzlöslichkeit nie erreicht wurde).

Beispiel 6

t-PA wurde durch Dialyse gegen 0,001 M Natriumsuccinat-Puffer bei einem pH von 6 ausgefällt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugieren isoliert, dann wurde eine abgemessene Menge dieses A/Iaterials 20 Stunden bei 5⁰C unter Rühren in 1 ml des gewünschten Puffersystems equilibriert. Die untersuchten Puffersysteme wurden durch Titration von Arginin mit Phosphorsäure zur Bildung eines Argininphosphat-Systems bei einem pH von 6,0 hergestellt. Vorratslösungen wurden mit Wasser verdünnt, so^daß endgültige Pufferlösungen, die 0,10 bis 0,20 M Arginin (als Argininiumion) enthielten, erhalten wurden. Nach der Equilibrierung mit dem gewünschten Puffersystem wurde das resultierende t-PA-Präparat zur Entfernung von irgendwelchem nicht-löslichem Material zentrifugiert und dann wurden die überstehenden Lösungen zwecks Bestimmung des löslichen t-PA der S-2288-Bestimmung unterzogen.

Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Wenn der t-PA bei der Konzentration des ursprünglich zugegebenen t-PA voll löslich ist, dann sollte die Konzentration von löslichem t-PA gleich der zugegebenen sein. Umgekehrt sollte die Konzentration von löslichem t-PA geringer als die zugegebene sein, wenn der t-PA bei der ursprünglich zugegebenen Konzentration nicht vollkommen löslich ist. Die Fig. 3 zeigt, daß t-PA in 10OmM Argininphosphat bei einem pH von 6,0 bis hinauf zu ungefähr 2 mg/ml löslich ist und daß

bei höheren Argininphosphatkonzentrationen die Löslichkeit merklich ansteigt. Insbesondere ist der t-PA bei 20OmM Argininphosphat (pH6,0) noch bei ungefähr 54mg/ml vollkommen löslich und es ist offensichtlich, daß die Grenzlöslichkeit noch wesentlich höher als dieser Wert liegt.

Beispiel 7

Das folgende Argininphosphatsystem wurde als eine Lösung vor der Lyophilisierung hergestellt. Vor-Lyophilisierungslösung

mg/ml

t-PA 2,5

L-Arginin 87,1

Phosphorsäure 26,8

Polysorbat80 0,1

Nach der sterilen Filtration wurden ungefähr 20 ml Aliquotein 50ml-Glasfläschchen eingefüllt. Die Lyophilisierung wurde dann wie folgt durchgeführt:

a) Die Glasfläschchen wurden in den Gefriertrockner gestellt und bei -5O⁰C (Regaltemperatur) 10 Stunden unter Umgebungsdruck eingefroren.

b) Es wurde Vakuum angelegt (Kammerdruck 100μηι Hg) und die Regaltemperatur wurde mit einer Geschwindigkeit von 10⁰C pro Stunde auf +7⁰C erhöht und bei dieser Temperatur 41 Stunden lang gehalten.

c) Die Regaltemperatur wurde dann auf 325°C angehoben und der Kammerdruck wurde auf 50μ,ιη erniedrigt und das System 14 Stunden in diesem Zustand gehalten.

Die Glasfläschchen wurden dann verschlossen/es wurde wieder der Normaldruck eingestellt und die Glasfläschchen wurden aus dem Gefriertrockner entnommen.

Beispiel 8

Der Effekt von Natriumchlorid hinsichtlich der Qualität von lyophilisierten Argininphosphat-Kuchen wurde untersucht. Es wurden Proben von 0,8M Arginin (pH7) und 0,2M Arginin (pH6) als Phosphatsalz hergestellt, die Natriumchlorid-Konzentration im Bereich von 0,01 bis 50OmM aufwiesen. 2 ml-Aliquote einer jeden Lösung wurden in 10 ml-Glasfläschchen gegeben und unter Verwendung des folgenden Zyklus lyophilisieit:

Lyophilisierungs- Regaltemperatur Kammerdruck Zeit

stufe ⁰C (Micron) (h)

Einfrieren -45 Normaldruck 10

Primäres Zunahmemit20°C/h 50 24

Trocknen auf-35 ⁰C, dann3°C/hauf +35⁰C

Sekundäres +35 40 26

Trocknen

Die Qualität der resultierenden Kuchen ist in Tabelle 5 angegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß nur mit denjenigen Zusammensetzungen, die niedrige Konzentrationen von Natriumchlorid enthalten, pharmazeutisch annehmbare Kuchen gebildet werden und daß die noch tolerierte niedrige Natriumchlorid-Konzentration von der Argininkonzentration abhängt.

TABELLE5

QUALITÄT EINES LYOPHILISIERTEN ARGININ-PUFFERSYSTEMS, DAS AUSGEWÄHLTE NaCI-KONZENTRATIONEN ENTHÄLT

Natriumchlorid mM

Ursprünglich

0,8 M Arginin

Glasartige, geschrumpfte Masse, kein Kuchen

Weißer Kuchen, Leichtes Schmelzen an den Seiten des Kuchens Weißer Kuchen, glasartige Kanten, leicht geschrumpft Weißer Kuchen, leicht geschrumpft

Weißer Kuchen, leichtgeschrumpft

Weißer Kuchen,

nurganzleicht

geschrumpft

Weißer Kuchen,

nurganzleicht

geschrumpft

Kuchenqualität

Raumtemperatur 0,2 M Arginin

Körnig, geschrumpfte Masse, kein Kuchen

Weißer Kuchen mit glasartigem Aussehen

Weißer Kuchen mit glasartigem Aussehen Weißer Kuchen, sehr stark geschrumpft Weißer Kuchen, sehr stark geschrumpft Weißer Kuchen, sehr stark geschrumpft

Weißer Kuchen, sehr stark geschrumpft

Nach 2 Monaten bei Raumtemperatur

0,8 Μ Arginin

Wie ursprünglich

Wieusprünglich Wie ursprünglich Wie ursprünglich Wie ursprünglich

Wie ursprünglich

0,2 M Arginin

Wie ursprünglich

Glasartiger Film am Fläschchenboden, kein Kuchen Glasartige bis weiße Masse am Fläschchenboden Weiße Masse im Fläschchen

Weiter geschrumpft

Leichte

zusätzliche

Schrumpfung

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von meschlichem Gewebe-Plasminogen-Aktivator und einen pharmazeutisch verträglichen, Argininiumionen enthaltenden Puffer, wobei die Zusammensetzung eine Chloridionen-Konzentration von weniger als ungefähr 0,3 M aufweist, gekennzeichnet dadurch, daß man den Gewebe-Plasmiogen-Aktivator und den Argininiumionen enthaltenden Puffer zusammengibt.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man die Zusammensetzung lyophilisiert.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine eingefrorene Zusammensetzung herstellt.

4. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß man die eingefrorene Zusammensetzung in eine lyophilisierte Form überführt.

5. Verfahren nach Punkt 4, gekennzeichnet dadurch, daß man die lyophilisierte Form rekonstituiert.

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Argininium-Puffer von Argininiumchlorid verschieden ist.

7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Puffer aus dem Argininiumion und einem Gegenion besteht, mit dem man die Umwandlungstemperatur der Zusammensetzung in einem leicht lyophilisierbaren Zustand einstellen kann.

8. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß das Gegenion aus Citrat, Phosphat, Tartrat, Sulfat, Malat, Maleat und Succinat ausgewählt wird.

9. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß das Gegenion aus Citrat und Phosphat ausgewählt wird.

10. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß das Gegenion Phosphat ist.

11. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der menschliche Gewebe-Plasmionogen-Aktivator in einer Konzentration von wenigstens ungefähr 0,1 mg/ml und das Argininiumion in einer Konzentration von ungefähr 0,05 bis ungefähr 1,0 M vorliegt.

12. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der menschliche Gewebe-Plasminogen-Aktivator in einer Konzentration von wenigstens ungefähr 0,4 bis ungefähr 5,0 mg/ml und das Argininiumion in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 0,5M vorliegt.

13. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Zusammensetzung einen pH-Wert von ungefähr 4 bis ungefähr 9 aufweist.

14. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel verdünnt wird.

15. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Zusammensetzung ein nicht-ionisches Detergenz in einer Menge von ungefähr 0,001 bis 1 % der Zusammensetzung enthält.