DE3642960A1

DE3642960A1 - Stabilisierte zusammensetzungen des menschlichen gewebe-plasminogen-aktivators

Info

Publication number: DE3642960A1
Application number: DE19863642960
Authority: DE
Inventors: William Franklin Bennett; Stuart Elliot Builder; Larry Alan Gatlin
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1985-12-17
Filing date: 1986-12-16
Publication date: 1987-06-19
Also published as: FI88873C; KR950010322B1; AU6661086A; GB2184354A; HUT42955A; IE863279L; ES2044840T3; PT83933B; ZA869457B; PT83933A; NO168988B; DD255477A5; GR3006078T3; DK605786A; DE3686410D1; EP0228862A2; DK605786D0; NO168988C; JPS62164632A; FR2591485B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die menschlichen Gewebe-Plasminogen- Aktivator (t-PA) enthalten, und auf Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf solche phamazeutischen Zusammensetzungen, die eine erhöhte Stabilität und bessere Löslichkeitseigenschaften des t-Pa aufweisen, und auf solche Zusammensetzungen, die einfach zu lyophilisieren sind und dadurch die Schaffung stabiler, lyophilisierter Formen des t-PA zu sicheren, effektiven therapeutischen Verabreichung an Menschen ermöglichen.

Die Instabilität von vaskulärem Plasminogen-Aktivator der aus den vaskulären Verzweigungen von menschlichen Kadavern extrahiert wurde, wird im Biol. Chem. (Tokyo) 75, 731 (1974) beschrieben. Es wurde gefunden, daß der Aktivator nur durch hohe Natriumchlorid-Konzentrationen, die über ungefähr 0,5M lagen, stabilisiert wurde.

In J. Biol. Chem. 254, 1998 (1979) ist die Verwendung von hohe Salz- und Argininkonzentrationen enthaltenden Puffern während eines mehrstufigen Reinigungsverfahrens als essentiell für die Aufrechterhaltung der Aktivität des aus menschlichen Kadaverperfusaten gewonnenen vaskulären Plasminogen-Aktivators beschrieben. Die Reinigungsstufen wurden in Anwesenheit von 0,3 bis 1,0M NaCl und 0,1M Arginin durchgeführt.

In Arch. of Biochem. & Biophy. 189, 185 (1978) wird die Abtrennung von Plasminogen-Aktivator aus menschlichem Plasma durch Chromatographie an Lysin-Sepharose beschrieben. In einem Experiment wurde roher Plasminogen-Aktivator aus stabilisiertem Plasma von Lysin-Separose unter Verwendung eines Gradienten von 0M bis 0,5M Arginin in 0,6M NaCl eluiert.

Aus natürlichen Gewebequellen gewonnener menschlicher Gewebe- Plasinogen-Aktivator ist in derEuropäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nummer 00 41 766 beschrieben. Die Autoren verwendeten ein Reinigungsschema das einen Gewebe-Plasminogen-Aktivator in relativ hoher Reinheit liefert. Die Stabilität von Präparaten des gereinigten Gewebe-Plasminogen-Aktivators sowohl im flüssigen als auch im lyophilisierten Zustand wurde untersucht und es wurde gefunden, daß die lyophilisierten Formen wiederholt instabil waren, sogar wenn sie aus Lösungen, die 0,3M NaCl enthielten, hergestellt worden waren.

Damit Materialien wie der Gewebe-Plasminogen-Aktivator mit der Gesundheitspflege befaßten Personen und Patienten zur Verfügung gestellt werden kann, müssen diese Materialien als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden. Solche Zusammensetzungen müssen über eine geeignete Zeitspanne hinweg stabil sein, müssen aus sich selbst heraus für die Verabreichung an Menschen geeignet sein und müssen leicht herstellbar sein. Ein Beispiel für eine solche Zusammensetzung ist eine Lösung für die parenterale Verabreichung. Obwohl in vielen Fällen pharmazeutische Lösungsformulierungen in flüssiger Form, geeignet für die sofortige Verwendung, bereitgestellt werden, können solche parenteralen Formulierungen auch in eingefrorener oder lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt werden. Im ersten Fall muß die Zusammensetzung vor der Verwendung aufgetaut werden. Die letztere Form wird oft verwendet, um die Stabilität des medizinischen Mittels, das in der Zusammensetzung enthalten ist, unter einer großen Vielzahl von Lagerbedingungen zu erhöhen, da die Fachleute wissen, daß lyophilisierte Präparate im allgemeinen stabiler sind als ihre flüssigen Gegenstücke. Solche lyophilisierten Präparate werden vor der Verwendung durch die Zugabe eines oder mehrerer pharmazeutisch verträglicher Verdünnungsmittel, wie z. B. sterilem Wasser für die Injektion oder steriler physiologischer Kochsalzlösung und dgl., rekonstituiert.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, stabile Zusammensetzungen des menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivators zur Verfügung zu stellen, insbesondere solche in stabiler, lyophilisierter Form,

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß die Verwendung von Arginin (als Argininiumion) in einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung aus Gewebe- Plasminogen-Aktivator (t-PA) die Stabilität und Löslichkeit von t-PA merklich erhöht und daß sie weiter, zusammen mit der Auswahl geeigneter Gegenionen, die Herstellung von stabilen, lyophilisierten Formen von t-PA ermöglicht. Deshalb ist die vorliegende Erfindung auf solche Zusammensetzungen und alle damit verbundenen Äquivalente und Mittel zur effektiven Herstellung solcher Zusammensetzungen und derer Äquivalente gerichtet.

Im allgemeinen können die Zusammensetzungen andere Komponenten in Mengen enthalten, die die Herstellung von stabilen, lyophilisierbaren Formen nicht erschweren und in Mengen, die für eine wirksame, sichere pharmazeutische Verabreichung geeignet sind.

Geeignete pH-Bereiche für die Herstellung dieser Zusammensetzungen sind von ungefähr 4 bis ungefähr 9; da diese Zusammensetzungen für Pharmazeutika verwendet werden sollen, ist der physiologische pH-Bereich, d. h. ungefähr neutral, bevorzugt. In diesem pH-Bereich existiert Arginin hauptsächlich als protoniertes Kation mit einer Gesamtladung von +1, das als "Argininiumion" bezeichnet werden kann. Die Bezeichnung "Arginin" wird hier gleichbedeutend mit "Argininiumion" verwendet, da aufgrund des ph-Wertes des Systems "Argininiumion" eine äquivalente Beschreibung ist. Um die elektrische Neutralität aufrecht zu erhalten, muß das Argininiumion durch eine äquivalente Menge an entgegengesetzt geladenen (d. h. negativ geladenen) ionischen Spezies, die als "Gegenionen" bezeichnet werden können, ausgeglichen werden. Die Kombination von Argininiumionen, anderen kationischen Spezies und den verschiedenen Gegenionen kann als "Argininiumion enthaltendes Puffersystem" bezeichnet werden. Annehmbare Gegenionen sind solche, die pharmazeutisch verträglich sind und zusätzlich solche, mit denen man die offensichtliche eutektische oder Umwandlungstemperatur der Zusammensetzung so einstellen kann, daß die Zusammensetzung insbesondere für die leichte Lyophilisierung geeignet ist. Beispiele für solche Gegenionen sind Acetat, Phosphat, Citrat, Succinat, Sulfat, Tartrat, Malat, Maleat, Carbonat und dgl. sowie funktionelle Äquivalente davon. Ein Beispiel für ein Gegenion, das nicht gut geeignet ist, ist das Chloridion.

Wie oben festgestellt, wurde gefunden, daß die Verwendung von Arginin (als Argininiumion) in pharmazeutischen Zusammensetzungen des t-PA die Löslichkeit und Stabilität des t-PA in diesen Zusammensetzungen merklich erhöht. Die Arginin-Konzentration kann im Bereich von ungefähr 0,02M bis 1M, vorzugsweise von ungefähr 0,05M bis ungefähr 1,0M und insbesondere von ungefähr 0,1M bis ungefähr 0,5M in der verabreichten Lösung und/oder, im Falle eines lyophilisierten Präparats, in der vor der Lyophilisierung vorhandenen Lösung liegen.

Zusätzlich können die verbesserten Zusammensetzungen gegebenenfalls ein oder mehrere nicht-ionische Detergentien wie z. B. Polysorbate 20 und Polysorbate 80 und dgl., in Mengen von ungefähr 0,001 bis ungefähr 1% enthalten, um die Stabilität des t-PA weiter zu erhöhen. Zusätzlich können andere pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe, die dem Fachmann wohlbekannt sind, einen Teil solcher Zusammensetzungen bilden. Diese beinhalten z. B. verschiedene Streckmittel, zusätzliche Puffermittel, Chelatisierungsmittel, Antioxidantien, Konservierungsmittel, Co-Lösungsmittel und dgl.; spezifische Beispiele dafür sind Mannitol, Tromethaminsalze ("Tris-Puffer"), Dinatriumdetat, Geatine, menschliches Serumalbumin oder andere Polypeptide, verschiedene kleine Peptide, wie z. B. Glycylglycin, usw.

Überraschenderweise erfordern die erfindungsgemäßen t-PA-Zusammensetzungen nicht die Verwendung von hohen Konzentrationen, d. h. ungefähr 0,3M oder darüber, an Natriumchlorid. Tatsächlich sind hohe Konzentrationen an Chloridionen für die Lyophilisierbarkeit dieser verbesserten Zusammensetzungen sehr schädlich. Obwohl eine gewisse Menge an Chloridionen toleriert wird, sind niedrige Konzentrationen bevorzugt, d. h. weniger als ungefähr 0,3M und vorzugsweise nicht größer als normale physiologische Konzentrationen, d. h. ungefähr 0,12M NaCl. Am meisten bevorzugt ist es, wenn die Zusammensetzung keine Chloridionen enthält.

Unter "pharmazeutisch wirksame Menge" von t-PA ist die Menge zu verstehen, die zu einem therapeutischen Effekt in verschiedenen Verabreichungebieten führt. Vorliegend können Zusammensetzungen hergestellt werden, die Mengen an t-PA von wenigstens ungefähr 0,1 mg/ml, bis hinauf zu ungefähr 50 mg/ml, vorzugsweise von ungefähr 0,4 mg/ml bis ungefähr 5 mg/ml enthalten. Bei der Verwendung dieser Zusammensetzungen zur Verabreichung an Menschen, die an Herzinfakt leiden, können diese Zusammensetzungen z. B. ungefähr 0,4 mg/ml bis ungefähr 3 mg/ml t-PA enthalten, was der momentan für eine solche Behandlung eingesetzten Dosierung entspricht.

Die vorliegenden Zusammensetzungen, die lyophilisierte Formen einschließen, werden ganz allgemein hergestellt, indem man die Komponenten zusammengibt, wobei man sich allgemein zugänglicher pharmazeutischer Mischungsverfahren, die als solche bekannt sind, bedient. Genauso werden auf diesem Gebiet wohlbekannte Standard-Lyophilisierungsverfahren und Ausrüstung dafür verwendet. Ein spezielles Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung von t-PA umfaßt die Verwendung von gereinigtem (gemäß irgendeinem Standard-Proteinreinigungsschema) t-PA in irgendeinem der vielen bekannten Pufferaustauschverfahren, wie z. B. der Gelfiltration. Dieses bevorzugte Verfahren wurde zur Isolierung und Reinigung des t-PA, der als Ausgangsmaterial in den folgenden Untersuchungen zur Stabilität und Löslichkeit eingesetzt wurde, verwendet. Der t-PA, der bei dem bevorzugten Verfahren eingesetzt wurde, wurde aus durch Rekombination veränderten Eierstockzellen vom chinesischen Hamstern (CHO-Zellen), die t-PA als abgesondertes Produkt in dem CHO-Zellkulturmedium expremieren können, erhalten.

Es wurde gefunden, daß pharmazeutische Zusammensetzungen des t-PA eine merklich stabilisierte biologische Aktivität zeigen, wenn eine Komponente ein Argininiumion-enthaltender Puffer ist und daß solche Formulierungen kein Natriumchlorid für die Stabilität benötigen, obwohl Salzkonzentrationen von weniger als 0,3M verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Chloridionen-Konzentration 0,1M oder niedriger. Im neutralen pH-Bereich, z. B. ungefähr pH 6 bis 8, wird die Löslichkeit des t-PA durch die Anwesenheit von Argininiumionen so erhöht, daß er in relativ hohen Konzentrationen formuliert werden kann, sogar ohne Anwesenheit dessen, was die Fachwelt für notwendig hielt, nämlich großen stabilisierenden Salzmengen.

Die Bezeichnungen "menschlicher Gewebe-Plasminogen-Aktivator", "meschlicher t-PA", oder "t-PA", die hier verwendet werden, beziehen sich auf menschlichen extrinsischen (vom Gewebe-Typ) Plasminogen-Aktivator der z. B. durch Extraktion aus natürlichen Quellen und Reinigung (siehe europäische Patentanmeldung 0 41 766 oben) und durch rekombinante Zellkultursysteme, wie sie hier beschrieben sind, hergestellt wird. Seine Sequenz und Eigenschaften werden z. B. in der Europäischen Patentanmeldung 93 619 (die durch Bezugnahme hier aufgenommen wird), beschrieben. Vergleiche auch Europäische Patentanmeldung Nr. 41 766 und Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981), die ebenfalls durch Bezugnahme hier aufgenommen werden. Die obigen Bezeichnungen beziehen sich auch auf Äquivalente von biologisch aktivem menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivator, die sich in einer oder mehreren Aminosäuren der Gesamtsequenz oder im Glycosylierungsmuster unterscheiden, wobei man davon ausgeht, daß diese Unterschiede von den spezifischen Bedingungen bei der Kultur und der Natur des Wirts, aus dem der Gewebe-Plasminogen-Aktivator erhalten wird, abhängen.

A. Figuren

Fig. 1 stellt die Stabilität von t-PA in verschiedenen Formulierungen dar.

Fig. 2 ist eine Darstellung des Effekts der Arginin-Konzentration hinsichtlich der Löslichkeit von t-PA.

Fig. 3 zeigt die Löslichkeitsgrenzen von t-PA in verschiedenen Konzentrationen von Argininiumphosphat-Puffern bei pH 6 und 4°C.

B. Lyophilisierung

Die Lyophilisierung oder Gefriertrocknung der Zusammensetzungen wird unter Verwendung von Verfahren und Ausrüstungen, die dem Fachmann wohlbekannt sind, durchgeführt.

Typischerweise wird eine Zusammensetzung zuerst eingefroren auf eine Temperatur unter ihrer offensichtlichen eutektischen oder Umwandlungstemperatur. Daraufhin wird Vakuum angelegt und die Regale des Gefriertrockners werden erwärmt, um das Eis durch Sublimation abzutreiben, wobei die Regaltemperatur und der Kammerdruck so eingestellt werden, daß die Temperatur der gefrorenen Masse unter der offensichtlichen eutektischen oder Umwandlungstemperatur bleibt, bis praktisch alles Eis entfernt worden ist. Nach dieser "ersten Trocknungsphase" kann die Regaltemperatur weiter erhöht werden (mit oder ohne Veränderung des Kammerdrucks) und die restliche Feuchtigkeit im gefriergetrockneten Kuchen wird abgezogen.

C. S-2288-Bestimmung

Ein synthetisches Peptid-Substrat, S-2288 (H-D-Ile-Pro- Arg-p-Nitroanilid.2HCl) wird durch t-PA unter Bildung von farbigem p-Nitroanilin und Tripeptid hydrolisiert. Der maximale Unterschied in der Absorption von Substrat und Produkt (p-Nitroanilin) liegt bei 405 nm. Die Bildung von p-Nitroanilin wird spektrophotometrisch durch Verfolgung der Absorption bei 405 nm als Funktion der Zeit aufgenommen. Die resultierende Steigung der Absorption gegen die Zeit ist proportional zur Aktivität von t-PA. Diese Bestimmung wird bei 37 ± 0,2°C durchgeführt.

Für diese Bestimmung wurden 20-100 Mikroliter einer gegebenen t-PA-Probe zu einer 1,2 ml-Reaktionsmischung, die 0,33 mM S-2288, 0,067M Tris-Puffer (pH 7,4) und 0,07M NaCl enthielt, gegeben und bei 37°C 10 Minuten inkubiert. Die Veränderung in der Absorption wurde 1 Minute lang aufgezeichnet und die Aktivität wurde aus der Absorption bei 405 nm unter Verwendung der folgenden, vom Hersteller standardisierten Gleichung berechnet:

D. Beispiele Beispiel 1

Gereinigter t-PA wurde auf eine Endkonzentration von 0,2 mg/ml verdünnt, in Aliquote aufgeteilt und gegen die in Tabelle 1 genannten Puffer dyalisiert.

Tabelle 1

Nach der Dialyse wurden die Proben zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit in 1 ml Aliquoten lyophilisiert. Die lyophilisierten Proben wurden mit Wasser rekonstituiert und zur Bestimmung der t-PA-Aktivität der S-2288- Bestimmung unterzogen. Jede rekonstituierte Probe wurde danach bei 37°C gehalten und mehrere Male einer Bestimmung unterzogen.

Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 1 gezeigt. Wie daraus ersichtlich, verhindern die Systeme, die kein Arginin enthalten, den Verlust der t-PA-Aktivität mit der Zeit nicht. Diejenigen Proben, die 0,2M Arginin oder 0,2M Arginin plus pysiologische Mengen an Chlorid enthalten, behalten nach 4-tägiger Inkubation bei 37°C fast die ganze ursprüngliche t-PA-Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, daß 0,2M Arginin mit oder ohne NaCl t-PA merklich stabilisiert.

Beispiel 2

Die Stabilität von t-PA als Funktion der Arginin-Konzentration wurde durch Messung der Geschwindigkeit der Abnahme der t-PA-Aktivität bei verschiedenen Temperaturen bestimmt.

Formulierung:
1. 0,355 mg/ml t-PA
0,05M Na-Phosphat pH 6,2
0,05M Arginin als Hydrochlorid
2. 0,498 mg/ml t-PA
0,03M Na-Phosphat pH 6,2
0,2M Arginin als Hydrochlorid

0,5 ml-Aliquote der Lösung mit den obigen Formulierungen wurden aseptisch in 2 ml Glasfläschchen gefüllt und verschlossen. Die Glasfläschchen wurden bei 25°, 37° und 45°C gehalten. Von zwei Glasfläschchen von jeder Lösung wurden nach 0, 20, 55 und 160 Tagen Proben gezogen und die t-PA-Aktivität wurde unter Verwendung der S-2288-Bestimmung gemessen. Der natürliche Logarithmus der % verbleibender Aktivität wurde gegen die Zeit (Tage) für jede Temperatur aufgetragen und daraus Geschwindigkeitskonstanten unter Verwendung der linearen Regressionsanalyse berechnet.

Die Geschwindigkeitskonstanten (k) des Verlusts der t-PA- Stabilität bei zwei verschiedenen Arginin-Konzentrationen und bei verschiedenen Temperaturen sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Wirkung von Arginin auf die Stabilität von t-PA

Wie ersichtlich, erzeugt 0,2M Arginin Geschwindigkeitskonstanten, die kleiner sind als diejenigen, die man in 0,05M Arginin bei jeder der aufgeführten Temperaturen erhält, was ein Zeichen dafür ist, daß eine Zunahme der Arginin-Konzentration die Stabilität von t-PA erhöht.

Beispiel 3

Die Stabilität von t-PA hängt auch von der Konzentration nicht-ionischer Tenside ab. Die Ergebnisse können der Tabelle 3 entnommen werden.

t-PA wurde durch Dialyse gegen 0,01M Natriumsuccinat-Puffer bei pH 6,0 ausgefällt. Das t-PA-Präzipitat wurde aus der dialysierten Probe durch Zentrifugieren abgetrennt. Dieses Präzipitat wurde in der unten angegebenen Formulierung, die variierende Konzentrationen von Polysorbate 80 enthielt, wiederaufgelöst.

Formulierung:
0,2M Arginin als Hydrochlorid
0,02M Natriumphosphat pH 7,2
Polysorbate 80 (0,0005 bis 0,10%)

Die Lösungen wurden aseptisch in Glasfläschchen gefüllt und diese wurden bei 35°C und 40°C gehalten. Aus zwei Glasfläschchen wurden zu jedem Zeitmeßpunkt Proben entnommen und die enzymatische Aktivität wurde unter Verwendung der S-2288-Bestimmung gemessen.

Die Geschwindigkeitskonstanten wurden durch lineare Regressionsanalysen des log (t-PA-Aktivität) gegen die Zeitkurve bei jeder Temperatur berechnet und sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Wirkung von Polysorbate 80 auf die Stabilität von t-PA

Diese Tabelle zeigt, daß mit zunehmender Konzentration von Polysorbate 80 die Geschwindigkeitskonstante (k) abnimmt. Dies ist ein Zeichen dafür, daß mit mehr Polysorbate 80 eine höhere Stabilität erreicht werden kann.

Beispiel 4

t-PA-Lösungen wurden durch Dialyse von gereinigtem t-PA gegen die folgende Argininiumphosphat-Pufferformulierung hergestellt, gefolgt von einer Verdünnung mit weiterem Puffer auf die gewünschte Endkonzentration von t-PA.

Pufferformulierung:
0,20M Arginin
0,18M Phosphorsäure
0,01% Polysorbate 80
pH 6

Aliquote eines jeden Präparats wurden aseptisch in 5- oder 10-ml-Glasfläschchen eingefüllt, lyophilisiert und verschlossen. Die Glasfläschchen wurden bei mehreren Temperaturen gehalten. Aus zwei Glasfläschchen pro Formulierung wurden zu jedem Zeitpunkt Proben entnommen und die t-PA-Aktivität wurde durch die S-2288-Bestimmung gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4

Stabilität von t-PA in lyophilisierter Formulierung

Diese Ergebnisse zeigen, daß t-PA in der lyophilisierten Form stabil ist.

Beispiel 5

Eine ungefähr 0,3 bis 0,5 mg/ml t-PA enthaltende Lösung wurde gegen 10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 0,01% Polysorbate 80, enthaltend verschiedene Konzentrationen von Arginin als Hydrochlorid, dialysiert. Unlösliches Material wurde durch 2minütiges Zentrifugieren in einer Eppendorf- Mikrozentrifuge entfernt. Die Menge an t-PA, die in der Lösung verblieb, wurde durch die S-2288-Bestimmung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt.

Schon 50 mM Arginin erhöhen die Löslichkeit von t-PA merklich. (Die kleinere Zunahme der offensichtlichen Löslichkeit bei höheren Argininkonzentrationen ist ein Artefakt, bedingt durch die Tatsache, daß die ursprüngliche Konzentration von t-PA im Ausgangsmaterial nur 0,3 bis 0,5 mg/ml betrug und dadurch eine Grenzlöslichkeit nie erreicht wurde).

Beispiel 6

t-PA wurde durch Dialyse gegen 0,001 M Natriumsuccinat- Puffer bei einem pH von 6 ausgefällt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugieren isoliert, dann wurde eine abgemessene Menge dieses Materials 20 Stunden bei 5°C unter Rühren in 1 ml des gewünschten Puffersystems equilibriert. Die untersuchten Puffersysteme wurden durch Titration von Arginin mit Phosphorsäure zur Bildung eines Argininphosphatsystems bei einem pH von 6,0 hergestellt. Vorratslösungen wurden mit Wasser verdünnt, so daß endgültige Pufferlösungen, die 0,10 bis 0,20 M Arginin (als Argininiumion) enthielten, erhalten wurden. Nach der Equilibrierung mit dem gewünschten Puffersystem wurde das resultierende t-PA-Präparat zur Entfernung von irgendwelchem nicht-löslichem Material zentrifugiert und dann wurden die überstehenden Lösungen zwecks Bestimmung des löslichen t-PA der S-2288-Bestimmung unterzogen.

Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Wenn der t-PA bei der Konzentration des ursprünglich zugegebenen t-PA voll löslich ist, dann sollte die Konzentration von löslichem t-PA gleich der zugegebenen sein. Umgekehrt sollte die Konzentration von löslichem t-PA geringer als die zugegebene sein, wenn der t-PA bei der ursprünglich zugegebenen Konzentration nicht vollkommen löslich ist. Die Fig. 3 zeigt, daß t-PA in 100 mM Argininphosphat bei einem pH von 6,0 bis hinauf zu ungefähr 2 mg/ml löslich ist und daß bei höheren Argininphosphatkonzentrationen die Löslichkeit merklich ansteigt. Insbesondere ist der t-PA bei 200 mM Argininphosphat (pH 6,0) noch bei ungefähr 54 mg/ml vollkommen löslich und es ist offensichtlich, daß die Grenzlöslichkeit noch wesentlich höher als dieser Wert liegt.

Beispiel 7

Das folgende Argininphosphatsystem wurde als eine Lösung vor der Lyophilisierung hergestellt.

Nach der sterilen Filtration wurden ungefähr 20 ml-Aliquote in 50 ml-Glasfläschchen eingefüllt. Die Lyophilisierung wurde dann wie folgt durchgeführt:
a) Glasfläschchen wurden in den Gefriertrockner gestellt und bei -50°C (Regaltemperatur) 10 Stunden unter Umgebungsdruck eingefroren.
b) Es wurde Vakuum angelegt (Kammerdruck 100 µm Hg) und die Regaltemperatur wurde mit einer Geschwindigkeit von 10°C pro Stunde auf 7°C erhöht und bei dieser Temperatur 41 Stunden lang gehalten.
c) Die Regaltemperatur wurde dann auf 35°C angehoben und der Kammerdruck wurde auf 50 µm erniedrigt und das System 14 Stunden in diesem Zustand gehalten.

Die Glasfläschchen wurden dann verschlossen, es wurde wieder Normaldruck eingestellt und die Glasfläschchen wurden aus dem Gefriertrockner entnommen.

Beispiel 8

Der Effekt von Natriumchlorid hinsichtlich der Qualität von lyophilisierten Argininphosphat-Kuchen wurde untersucht. Es wurden Proben von 0,8 M Arginin (pH 7) und 0,2 M Arginin (pH 6) als Phosphatsalz hergestellt, die Natriumchlorid- Konzentration im Bereich von 0,01 bis 500 mM aufwiesen. 2 ml-Aliquote einer jeden Lösung wurden in 10 ml-Glasfläschchen gegeben und unter Verwendung des folgenden Zyklus lyophilisiert:

Die Qualität der resultierenden Kuchen ist in Tabelle 5 angegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß nur mit denjenigen Zusammensetzungen, die niedrige Konzentrationen von Natriumchlorid enthalten, pharmazeutisch annehmbare Kuchen gebildet werden und daß die tolerierte niedrige Natriumchlorid- Konzentration von der Argininkonzentration abhängt.

Tabelle 5

Qualität eines Lyophilisierten Arginin-Puffersystems, das ausgewählte NaCl-Konzentrationen enthält

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivator und einen pharmazeutisch verträglichen, Argininiumionen enthaltenden Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Chloridionen- Konzentration von weniger als ungefähr 0,3M aufweist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eingefroren ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie in die lyophilisierte Form umgewandelt worden ist.

4. Gefriergetrocknete Zusammensetzung, hergestellt durch Lynophilisierung einer eingefrorenen Zusammensetzung nach Anspruch 2.

5. Zusammensetzung gemäß Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die lyophilisierte Form rekonstituiert worden ist.

6. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß derArgininium-Puffer von Argininiumchlorid verschieden ist.

7. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer aus dem Argininiumion und einem Gegenion besteht, mit dem man die Unwandlungstemperatur der Zusammensetzung in einen leicht lyophilisierbaren Zustand einstellen kann.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Gegenion aus Citrat, Phosphat, Tartrat, Sulfat, Malat, Maleat und Succinat ausgewählt wird.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Gegenion aus Citrat und Phosphat ausgewählt wird.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Gegenion Phosphat ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der menschliche Gewebe-Plasminogen- Aktivator in einer Konzentration von wenigstens ungefähr 0,1 mg/ml und das Argininiumion in einer Konzentration von ungefähr 0,05 bis ungefähr 1,0M vorliegt.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der menschliche Gewebe-Plasminogen- Aktivator in einer Konzentration von wenigstens ungefähr 0,4 bis ungefähr 5,0 mg/ml und das Arginiuniumion in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 0,5M vorliegt.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen pH-Wert von ungefähr 4 bis ungefähr 9 aufweist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel verdünnt ist.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein nicht-ionisches Detergenz in einer Menge von ungefähr 0,001 bis 1% der Zusammensetzung enthält.

16. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man den menschlichen Gewebe-Plasminogen-Aktivator und den Argininiumionen enthaltenden Puffer zusammengibt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung lyophilisiert wird.