HU200101B

HU200101B - Process for producing stabilized pharmaceutical compositions containing human tissue plasminogene activator

Info

Publication number: HU200101B
Application number: HU865225A
Authority: HU
Inventors: William F Bennett; Stuart E Builder; Larry A Gatlin
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1985-12-17
Filing date: 1986-12-16
Publication date: 1990-04-28
Also published as: PH24716A; NO865079D0; FI865159A; ES2044840T3; NZ218612A; MY102185A; DK605786A; KR870005647A; FR2591485B1; IL80904A; ATE79273T1; JPH07173076A; AU600246B2; DE3686410D1; PT83933A; HUT42955A; IE863279L; EP0228862A2; GB8629981D0; FI865159A0

Description

A találmány tárgya eljárás olyan új gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek a humán 6zővet plazminogén aktivátor (t-PA) proteint tartalmazzák. Közelebbről, a találmány tárgya eljárás a .t-PA komponens szempontjából javított stabilitású és oldhatósági tulajdonságú gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek könnyű liofilizálást, és ezen keresztül olyan stabil, liofilizált formák előállítását teszik lehetővé, amelyek hatékonyan használhatók humán terápiás célokra.

A humán hullák érrendszeréből extrahált vaszkuláris plazminogén aktivátor instabilitását Aoki [J. Bioi. Chem. (Tokió), 75, 731 (1974)) irta le. Aoki azt találta, hogy az aktivátort csak nagy nátrium-klorid koncentrációk, közelebbről, körülbelül 0,5 mólnál nagyobb nátrium-klorid koncentrációk stabilizálták.

Binder és munkatársai [J. Bioi. Chem. 254, 1998 (1979)] leírták, hogy egy többlépéses tisztítási eljárás során magas só- és arginin-tartalmú pufferek alkalmazása alapvető az emberi hullák perfuzátjaiból származó vaszkuláris plazminogén aktivátor aktivitásának fenntartásához. A tisztítási lépéseket 0,3 - 1,0 mól nátrium-klorid és 0,1 mól arginin jelenlétében hajtották végre.

Radcliff és munkatársai [Arch. of Biochem. and Biophy. 189, 185 (1978)] a plazminogén aktivátor humán plazmából történő elkülönítését írták le lizin-Sepharose-on végzett kromatografálással. Egy kísérletben a stabilizált plazmából nyert nyers plazminogén aktivátort lizin-Sepharose-zal eluálták, 0 - 0,5 mól, 0,6 mólos nátrium-kloridban jelenlévő arginin gradienst alkalmazva.

Természetes szövet forrásból származó humán szövet plazminogén aktivátort ismertetnek Collen és munkatársai az 1981. december 16-án nyilvánosságra hozott, 1980. június 11—i elsőbbséget igénylő 041766. számú európai szabadalmi bejelentésben. A szerzők olyan tisztítási rendszert alkalmaztak, amely a szövet plazminogén aktivátort viszonylag nagy tisztaságban bocsátja rendelkezésre. Collen és munkatársai tanulmányozták tisztított szövet plazminogén aktivátor készítményeik stabilitását is, mind folyékony, mind liofilizált állapotban, és azt találták, hogy a liofilizált formák reprodukálhatván labilisak voltak, még akkor is, ha 0,3 mól nátrium-kloridot tartalmazó oldatokból kerültek előállításra.

Annak érdekében, hogy a szövet plazminogén aktivátorhoz hasonló anyagokat az egészségügyi dolgozók illetve a betegek rendelkezésére lehessen bocsátani, ezeket gyógyszerkészítmények formájában kell kiszerelni. Az ilyen készítményeknek alkalmas ideig stabilaknak kell lenniük, alkalmasaknak kell lenniük humán alkalmazásra, és könnyen előállithatóknak kell lenniük. Ilyen készítmény lehetne például egy parenterális adagolásra alkalmas oldat. Bár sok esetben az oldatos gyógyszerkészítményeket folyadék formában, közvetlen adagolásra alkalmas módon szerelik ki, előállihatók fagyasztott vagy liofilizált formában is. Az előbbi esetben a készítményt használat előtt fel kell olvasztani. Az utóbbi megoldást gyakran azzal a céllal használják, hogy a készítmény hatóanyagának stabilitását változó tárolási körülmények között javítsák, miután szakember számára ismeretes, hogy a liofilizált készítmények általában stabilabbak, mint folyékony megfelelőik. Az ilyen liofilizált készítményeket alkalmazás előtt alkalmas, gyógyászatiig elfogadható higitóanyag(ok), például injekciók esetében steril viz vagy steril fiziológiás sóoldat hozzáadásával vissza lehet alakítani eredeti formájukba.

A találmány stabil humán szövet plazminogén aktivátor készítmények, különösen liofilizált formában stabil készítmények előállítására vonatkozik.

Találmányunk azon a felismerésen alapul, hogy az arginin (argininium ionként történő) bevitele a szövet plazminogén aktivétor (t-PA) egy gyógyászatiig elfogadható készítményébe szignifikánsan növeli a t-PA stabilitását és oldhatóságát, és - alkalmas ellenionokkal társítva - stabil, liofilizált kiszerelési formák előállítását teszi lehetővé.

Általában a készítmények más komponenseket is tartalmazhatnak előnyösen olyan mennyiségben, amely nem akadálya stabil, liofilizált formák előállításának, és olyan, mennyiségben, amely alkalmas hatásos, biztonságos gyógyszerkészítmények előállítására.

A találmány szerinti készítményekben a pH körülbelül 4 és 9 között kell, hogy legyen, előnyösen azonban - miután a készítményeket gyógyászati alkalmazásra szánjuk a fiziológiás tartományban van, tehát közel semleges. Ebben a pH tartományban az arginin elsődlegesen +1 töltésű protonált kation formájában van jelen, amely .argininium ion’-nak nevezhető. Az .arginin' kifejezést az .argininium ion kifejezéssel azonos értelemben használjuk, mert a rendszer pH-jának következtében az .argininium ion* ekvivalens megjelölés.

Az elektromos semlegesség megtartása érdekében az argininium iont ekvivalens mennyiségű, ellentétes töltésű (azaz negatív) ionnal kell semlegesíteni. Az ilyen ionokat .ellenionok’-nak nevezzük. Az argininium ion, más kationos speciesek és ezek különböző ellenionjai kombinációját .argininium iont tartalmazó puffer rendszer'-ként jelöljük. Ellenionként olyan gyógyászatiig elfogadható ionok alkalmazhatók, amelyek a készítmény euteptikus és összeesési (collapse) hőmérsékletét úgy tudják beállítani, hogy a készítmény különösen alkalmassá váljon liofilizálásra. Ilyen ellenionok például az acetát, foszfát, citrát, szukcinát, szulfát, tartarát, maiéit, karbonát ionok, és ezek funkcionális megfelelői. A nem megfelelő ellenionok közül példaképpen a klorid iont említjük meg.

Mint már említettük, a feltalálók azt találták, hogy az arginin (argininium ionként történő) beépítése t-PA-t tartalmazó gyógyszerkészítményekbe jelentősen növeli a t-PA oldhatóságát és stabilitását ezekben a készítményekben. Az arginin-koncentrációk körülbelül 0,02 mól és 1 mól, előnyösen körülbelül 0,05 - 1,0 mól, még előnyösebben körülbelül 0,1 mól és 0,5 mól között változnak az adagolásra használt oldatban és/vagy a liofilizált vagy liofilizálás előtti oldatokban.

Ezen felül a javított készítmények adott esetben tartalmazhatnak még egy vagy több nem-ionos detergenst, igy polysorbate 20-t vagy polysorbate 80-at vagy hasonlókat, körülbelül 0,001 - 1 % mennyiségben, a t-PA stabilitásának további javítása érdekében. Ezenkívül egyéb, gyógyászatilag elfogadható, szakember számára jól ismert vivőanyagok is részei lehetnek a készítményeknek. Ezek közé tartozhatnak például különböző töltőanyagok, további pufferek, kelatáló szerek, antioxidónsok, tartósítószerek, társoldószerek és hasonlók, amelyek közül példaképpen a következőket említjük: mannitol, trometamin sók (.Tris puffer), dinátrium-edetát, zselatin, humán szérum albumin vagy más polipeptidek, különböző oligopeptidek, így glicil-glicin.

A találmány szerinti t-PA készítményekben meglepő módon nincs szükség nagy koncentrációjú, azaz 0,3 mól vagy e feletti nátrium-klorid alkalmazására. Sőt, a klorid ion nagy koncentrációban való jelenléte hátrányosan befolyásolja a javított készítmények liofilizálhatóságát. Bár bizonyos mennyiségű klorid ion jelenléte megengedhető, előnyben részesítjük a kis, azaz körülbelül 0,3 mólnál kisebb és előnyösen a normál fiziológiai szintet, azaz körülbelül 0,12 mólt meg nem haladó nátrium-klorid koncentrációkat. Legelőnyösebben a találmány szerinti készítmények egyáltalán nem tartalmaznak klorid iont.

A t-PA .gyógyászatilag hatásos mennyisége' kifejezést olyan mennyiség jelölésére alkalmazzuk, amely különböző adagolási tartományokban gyógyhatást eredményez. A készítmények ennek megfelelően körülbelül legalább 0,1 mg/ml-tól egészen körülbelül 50 mg/ml t-PA-t tartalmazó formákban kerülhetnek kiszerelésre. Az előnyös t-PA koncentráció körülbelül 0,4 mg/ml és 5 mg/ml között van. Ha a készítményeket például miokardiális infarktusban szenvedő humán pácienseknek kívánjuk adagolni, ezek körülbelül 0,4 mg/ml és 3 mg/ml közötti t-PA mennyiséget tartalmazhatnak, az ilyen kezelések esetében jelenleg alkalmazott dózis értékének megfelelően.

A találmány szerinti készítmények kiterjednek a liofilizált formákra. A készítmények előállítása a komponensekből általánosan ismert gyógyszerkészítmény előállítási eljórá4 sokkal, önmagukban ismert módon történik. Hasonlóképpen, standard liofilizáiási eljárásokat és az irodalomból jól ismert liofilizáló berendezéseket alkalmazunk. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények előállítására alkalmazott egyik konkrét eljárás során (a standard protein-tisztítási rendszerben) a számos ismert puffer cserélő eljárás egyikével, például gél szűréssel tisztított t-PA-t alkalmazunk. Ezt az előnyös eljárást használtuk a következő stabilitási és oldhatósági vizsgálatokhoz felhasznált t-PA izolálására és tisztítására. Az előnyös módszer alkalmazása során felhasznált t-PA-t rekombináns úton módosított Chinese Hamster Ovary (CHO) sejtekből állítottuk elő, amelyek a CHO sejt tenyészet táptalajén képesek a t-PA kiválasztott termékként történő termelésére.

Felismertük azt a meglepő jelenséget, hogy a t-PA-t tartalmazó gyógyszerkészítmények szignifikánsan stabilabb biológiai hatást mutatnak, ha egyik komponensük argininium iont tartalmazó puffer, és az ilyen készítményekben nem szükséges a nátrium-klorid je25 lenléte a stabilitás biztosításához, bár 0,3 mól alatt só-koncentráció megengedett. Egy előnyös megvalósítási mód esetében a klorid ion koncentráció 0,1 mól vagy ennél kevesebb. A természetes pH-tartományban, azaz körülbelül pH 6 és 8 között a t-PA oldhatósága úgy megnő az argininium ion jelenlétében, hogy viszonylag magas koncentrációjú készítmények állíthatók elő belőle, az irodalomban eddig erre a célra egyértelműen megkívánt nagy mennyiségű stabilizáló só jelenléte nélkül is.

A találmány ismertetésében használt .humán szövet plazminogén aktivátor’, .humán t-PA' vagy .t-PA’ kifejezések humán extrinsic (Bzövet-típusú) plazminogén aktivátort jelölnek, amelynek előállítása például természetes forrásból extrakcióval és tisztítással (lásd Collen és munkatársai korábban idézett közleményét) történik, és rekombi45 náns szövet tenyésztési rendszerekben, az itt ismertetett módon. Szekvenciája és jellemzői szerepelnek például a 93619 számon, 1983. november 9-én publikált európai szabadalmi bejelentésben, melynek elsőbbsége 1982. mó50 jus 5. Lásd még a 41766 számon, 1981. december 16-án közrebocsátott, 1980. június 11—i elsőbbségű európai szabadalmi bejelentést és Rijken és munkatársai, Journal of Bioi. Chem., 7035 (1981) közleményét. A kife55 jezések hasonlóképpen a biológiailag aktív humán szövet plazminogén aktivátor ekvivalenseket is felölelik, amelyek egy vagy több aminosavban különböznek az általános szekvenciától, vagy a glikozilezés mértékében.

Ezek a tulajdonságok függnek az alkalmazott, konkrét tenyésztési körülményektől, és attól a gazdától, amelyből a szövet plazminogén aktivótort kinyerjük.

A. Ábra ismertetés

Az 1. ábra a t-PA különböző készítményekben mutatott stabilitását szemlélteti.

A 2. ábrán az arginin-koncentrációnak a t-PA oldhatóságára mutatott hatása szerepel.

A 3. ábra a t-PA oldhatósági határait mutatja be az argininium foszfát pufferek koncentrációi esetében, 6 pH-értéken, 4 °C-on.

B. Liofilizál&s

A készítmény liofilizálását vagy fagyasztva szárítását a szakember számára jól ismert eljárások és berendezések felhasználásával végezzük. Jellegzetesen a készítményt először nyilvánvaló eutektikus vagy összeesési hőmérséklete alá fagyasztjuk. Ezután vákuumot alkalmazunk, és a liofilizáló polcokat melegítjük, hogy a jeget szublimálással eltávolítsuk, a polc hőmérsékletet és a kamra nyomást úgy választva meg, hogy a fagyott massza hőmérséklete az eutektikus vagy öszszeesési hőmérséklet alatt maradjon mindaddig, míg lényegében a jég teljes mennyiségét eltávolitottuk. Ezt az .elsődleges szárítási fázist követően a polcok hőmérséklete tovább emelhető (kamra nyomás egyidejű megváltoztatásával vagy anélkül), és a fagyasztva szárítással kapott pogácsa maradék nedvességtartalmát elhajtjuk.

C. S-2288 vizsgálat

Az S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitro-anilid · 2HC1) szintetikus polipeptid szubsztrátot

0,01 % Polysorbate 80-at tartalmazó dialízis puffer t-PA-val hidrolizáljuk, és igy szives p-nitro-anilint és tripeptidet állítunk elő. A szubsztrát és a termék (p-nitro-anilin) közötti maximális differenciális abszorpció

405 nm-nél mutatkozik. A p-nitro-anilin keletkezését spektrofotometriásán követjük, a 405 nm-en észlelt abszorpciót az idő függvényében vizsgálva. A kapott abszorpció - idő görbe meredeksége arányos a t-PA aktivitással. A vizsgálatot 37 ± 0,2 °C-on végezzük.

A vizsgálat sorén 20 - 100 mikroliter t-PA mintát adtunk 1,2 ml reakcióelegyhez, amely 0,33 mmól S-2288-at, 0,067 mól Tris15 -puffért (pH 7,4) és 0,07 mól nátrium-kloridot tartalmazott, és amelyet 37 °C-on 10 percig inkubáltunk. Az abszorpcióban észlelt változást 1 percig követtük, és az aktivitást a 405 nm-en észlelt abszorpcióból a keletke20 zó, a gyártó által standardizált egyenlet felhasználásával:

Aktivitás (IE, nemzetközi egység) = _ OD x 793,65 (higitási faktor) inkubálási idő x minta térfogat

D. Példák

1. példa

Tisztított t-PA-t 0,2 mg/ml végső koncentrációig hígítottuk, majd egy alikvot mintát az 1. táblázatban felsorolt pufferekkel szemben dializáltunk.

Dialízis koncentráció

NaCl arginin (HC1)

1. 0,01 mól nátrium-foszfát pH 6

2. 0,01 mól nátrium-foszfát pH 6

3. 0,01 mól nátrium-foszfát pH 6

4. 0,01 mól nátrium-acetát pH 5

5. 0,01 mól nátrium-acetát pH 5

6. 0,01 mól nártium-acetát pH 5

0,12 mól 0,2 mól

0,2 mól

0,12 mól 0,2 mól

0,2 mól

Dialízis után a mintákat centrifugáltuk, és a felülúszót 1 ml-es alikvotokban liofilizáltuk. A lofilizált mintákat vízzel visszahigitottuk, és a t-PA aktivitást az S-2288 teszttel vizsgáltuk. Minden visszahígított mintát 37 °C hőmérsékleten tartottunk és különböző időpontokban vizsgáltunk.

A kísérlet eredményeit az 1. ábrán mutatjuk be. Mint látható, az arginint nem tartalmazó rendszerek nem gátolják meg a t-PA aktivitás csökkenését az idővel. Azokban a mintákban, amelyek 0,2 mól arginint vagy 0,2 mól arginint és fiziológiás mennyiségű kloridot tartalmaznak, 4 napos 37 °C-on végzett inkubálás után a kezdeti t-PA aktivitás csaknem teljes mértékben fennmarad. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy 0,2 mól arginin - nátrium-kloriddal együtt vagy anélkül - szignifikánsan stabilizálja a t-PA-t.

2. példa

A t-PA stabilitálást az arginin-koncentráció függvényében úgy határoztuk meg, hogy mértük a t-PA aktivitás csökkenésének mértékét különböző hőmérsékleteken.

HU 200101 Β

Készítmény: 1. 1,355 mg/ml t-PA

0,05 mól nátrium-foszfát pH 6,2

0,05 mól arginin-hidroklorid

2. 0,498 mg/ml t-PA

0,03 mól nátrium-foszfát pH 6,2

0,2 mól arginin-hidroklorid

A fenti összetételű készítmények 0,5 ml-es alikvot mintáit aszeptikus körülmények között 2 ml-es üveg ampullákba töltöttük, melyeket lezártunk. Az ampullákat 25 °C-on, 37 °C-on és 45 °C-on tartottuk. Minden oldatból két-két ampullából mintát vettünk a 0., 20., 55. és 160. napon, és a t-PA aktivi5 tást az S-2288 módszerrel vizsgáltuk. A fennmaradó %-os aktivitás természetes logaritmusát feltüntettük az idő függvényében (napok) minden egyes hőmérsékleten, majd kiszámoltuk a sebességi állandót a lineáris regressziós analízis alkalmazásával.

A t-PA stabilitás csökkenésének sebességi állandóját (k) két különböző arginin-koncentréció esetében és különböző hőmérsékleteken a 2. táblázatban tüntetjük fel.

2. táblázat

Az arginin hatása a t-PA stabilitására

Készítmény	Arginin	25 °C	k (nap'¹) 37 °C	45 °C
0,05 mól
Na-foszfát pH 6,2	0,05 mól	0,00137	0,0102	0,0167
0,03 mól
Na-foszfát pH 6,2	0,20 mól	0,00043	0,00569	0,01272

Mint látható, 0,2 mól arginin olyan sebességi állandót eredményez, amely kisebb, mint a 0,05 mól arginin esetében kapott, mindegyik vizsgált hőmérsékleten, ami azt mutatja, hogy az arginin-koncentráció növekedése növeli a t-PA stabilitását.

3. példa

A t-PA stabilitása a nem-ionos felületaktív anyagok koncentrációjának is függvénye. A megfelelő adatokat a 3. táblázat tartalmazza.

A t-PA-t 0,01 mólos Na-szukcinát pufferrel, pH 6,0-on végzett dialízissel csaptuk ki. A t-PA precipitátumot centrifugálással gyűjtöttük össze a dializált mintából.

Ezt a csapadékot újból feloldottuk az alábbi készítményben, amely változó koncentrációban tartalmazta a polysorbate 80-at. Készítmény: 0,2 mól arginin-hidroklorid

0,02 mól nátrium-foszfát pH 7,2

Polysorbate 80 (0,0005-0,10 %)

Az oldatokat aszeptikus körülmények között ampullákba töltöttük, és 35 °C-on illetve 40 °C-on tartottuk. Minden időpontban két-két kémcsőből mintát vettünk, és az enzimatikus aktivitást az S-2288 vizsgálattal vizsgáltuk.

A sebességi állandókat a 10 g (t-PA aktivitás) lineáris regressziós analízisével számoltuk az idő függvényében minden hömér6 sékleten. Az eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg.

3. táblázat 35

A Polysorbate 80 hatása a t-PA stabilitására

Polysorbate 80	k (nap*¹)
35°C	40°C
0,0005	0,0055	0,0106
0,05	0,0049	0,0091
0,01	0,0043	0,0088
0,025	0,0040	0,0081
0,05	0,0041	0,0077
0,10	0,0037	0,0075

A táblázat adatai azt mutatják, hogy amint a polysorbate 80 koncentrációja nó, a sebességi állandó (k) csökken. Ezt az jelzi, hogy több polysorbate 80 jobb stabilitást biztosit.

4. példa

Tisztított t-PA-t az alábbi argininium60 -foszfát puffer készítménnyel szemben dializálva t-PA oldatokat készítettünk, amelyeket további pufferrel a kívánt végső t-PA koncentrációra hígítottunk.

HU 200101 Β

Puffer: 0,02 mól arginin

0,18 mól foszforsav

0,01 % Polysorbate 80 pH 6

Minden készítményből alikvot mintákat vettünk, melyeket aszeptikus körülmények között 5 vagy 10 ml-es ampullákba töltöttünk, liofilizáltunk, majd az ampullákat lezártuk. Az ampullákat különböző hőmérsékleteken tároltuk. Minden időpontban készítményenként két-két ampullából mintát vettünk, és a t-PA aktivitást az S-2288 vizsgálattal határoztuk meg. Az eredményeket a 4. táblázatban tüntetjük fel.

4. táblázat

A t-PA stabilitása liofilizált késziményekben

t-PA mg/ml	Idő	1 5 °C	íaradék % (két mérés átlaga ± standard hiba)	40 °C
pH	rao	25 °C	30 “C 35 °C
1,0	6,0	2,0	102,5±0,0	103,3±2,5	102,6±3,0	-
2,0	6,0	2,0	lll,3±0,7	lll,l±0,l	114,6±2,2	-
5,0	6,0	2,0	112,0í0,3	112,7±0,6	112,3±1,4	-
1,0	6,0	3,5	98,2±1,3	-	96,0±l,7	97,7±O,O1

* A t-PA koncentrációja a liofilizslás előtti oldatban.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a t-PA stabil liofilizált formában.

5. példa

Körülbelül 0,3-0,5 mg/ml t-PA-t tartalmazó oldatot 10 mmól nátrium-foszfátot 30 (pH 7,5), 0,01% polysorbate 80-at és arginin -hidrokloridot különböző koncentrációkban tartalmazó oldattal szemben dializáltunk. Az oldhatatlan anyagot 2 perces, Eppendorf mikrocentrifugóval végzett centrifugálóssal el- 35 távolitottuk. Az oldatban maradt t-PA mennyiséget S-2288 vizsgálattal határoztuk meg. Az eredményeket a 2. ábra mutatja.

Már 50 mmól arginin is szignifikánsan növeli a t-PA oldhatóságát. A nagyobb argi- 40 nin-koncentréciók esetében tapasztalt látszólag kisebb oldékonyság növekedés azzal magyarázható, hogy a kiindulási anyagban az eredeti t-PA koncentráció csak 0,3-0,5 mg/ml volt, és így soha nem sikerült elérni a határ 45 oldékonyságot.

oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából, majd a felülúszókban az oldott t-PA-t a S-2288 módszerrel határoztuk meg.

Az eredményeket a 3. ábrán szemléltetjük. Ha a t-PA teljesen oldható az eredetileg hozzáadott t-PA koncentrációnál, az oldható t-PA koncentrációjának a hozzáadott koncentrációval azonosnak kell lennie. Megfordítva, ha a t-PA nem teljesen oldható az eredetileg hozzáadott koncentrációban, a 3. ábra azt mutatja, hogy 6,0 pH-jú 100 mmólos arginin-foszfát pufferben a t-PA körülbelül 2 mg/ml koncentrációig oldható, és nagyobb arginin-foszfát koncentráció esetében az oldhatóság jelentősen megnő. Különösen, 6,0 pH-jü, 200 mmólos arginin-foszfát puffernél a t-PA 54 mg/ml koncentrációban is teljesen oldható, és a határoldékonyság nyilvánvalóan ennél is lényegesen magasabb.

6. példa

A t-PA-t 0,001 mól nótrium-szukcinát (pH 6) pufferrel szembeni dialízissel csaptuk ki. A kapott csapadékot centrifugálással izoláltuk, majd az anyag mért mennyiségét a kivánt puffer rendszer 1 ml-ében 20 órán ét 5 °Con, keverés közben egyensúlyba hoztuk. A tanulmányozott puffer rendszereket úgy készítettük, hogy az arginint foszforsavval titrálva 6,0 pH-értékű argininium-foszfát rendszert hoztunk létre. A tőrzsoldatokat vízzel hígítva állítottuk elő a végső, 0,10-0,20 mól arginint argininium ion formájában tartalmazó puffer oldatokat. A kívánt puffer rendszerrel végzett kiegyenlítést követően a kapott t-PA készítményeket centrifugáltuk, az

7. példa

Az alábbi argininium-foszfát	rendszert
preliofilizólt oldatként állítottuk elő. Preliofilizált oldat J	mg/ml
t-PA	2,5
L-arginin	87,1
foszforsav	26,8
Polysorbate 80	0,1
pH 7,2

Steril szűrést követően körülbelül 20 mles alikvot mintákat 50 ml-es ampullákba töltöttünk. A liofilizálást a következőképpen végeztük:

a) Az ampullákat liofilizáló berendezésbe helyeztük, és -50 °C-on (polc hőmérsék-611 let), környezeti nyomáson, 10 órán át fagyasztottuk.

b) Vákuumot hoztunk létre (kamra nyomás 200 Hgum), és a polc hőmérsékletet 10 “/óra sebességgel +7 “C-ra emeltük, majd 41 órán át ezen a hőfokon tartottuk.

c) Ezután a polc hőmérsékletet +35 °C-ra emeltük, és a kamra nyomást 50 um-re csökkentettük, majd a rendszert 14 órán át ebben az állapotban tartottuk.

Ezután az ampullákat ledugaszoltuk, a nyomást hagytuk visszaállni a környezeti nyomás értékre, és az ampullákat eltávolitottuk a liofilizáló berendezésből.

8. példa

Megvizsgáltuk a nátrium-klorid hatását a liofilizált arginin-foszfát pogácsák minőségére.

0,8 mólos arginin (pH 7) és 0,2 mólos arginin (pH 6) mintákat készítettünk foszfát-só formájában, amelyek 0,01-500 mmól koncentrációban tartalmaztak nátrium-klori dót. Minden oldat 2 ml-es alikvot mennyiséget

10 ml-es ampullákba töltöttük, és a következő ciklust követve Iiofílizáltuk:

Liofilizálási lépés	Polchómérséklet (°C)	Kamranyomás (mikron)	Idő (óra)
Fagyasztás	-45	környezeti	10
első szárítás	emelés 20 “/óra sebességgel -35 “C-ra majd 3 “/óra sebességgel +35 “C-ra	50	24
második szárítás	+35	40	26

A kapott anyag minőségét az 5. táblázatban adjuk meg. Az adatok azt mutatják, 30 hogy gyógyászatilag elfogadható anyagot csak olyan összetételből kapunk, amelynek nátrium-klorid koncentrációja alacsony, és a még elfogadható alacsony nátrium-klorid szint az arginin koncentráció függvénye. 35

-713

tó tó	63 tó	MÜ
tö		3
tó	tó	0-

A liofilizált arginin puffer rendszer minősége különböző nátrium-klorid koncentrációk esetén '0 q

•o u

•o q

•o •Q q ¹⁰ '3, ³ <0 to q -m to 'tó (Q *0 c

tó tó .£ £

S tö •0 ε

CM

O c

'2 to

S •o e

o to tó

CM

O

G •w c

•r-l to •O ε

oo o

TJ ’C jó

I ε

£ -g ‘tó “ g ε ς φ ^s3 u>

—

G -tó •tó tó '3 o tű 04 . tö ω 03 O (0 tó ε

c

- «3

X φ *3 tl_a **

Q O

Ό Ό

O O μ

O O to to x

X *tó

+-« tó	3	c	1
Ό	P.	’q	tó
63	E		tó
tó	tó		to
X		ε	tó
tó	63 tó	<Μ	> «3

rS > B

XX l χ x •tó -tó -Φ

X 5 > >

S tó o

c o

tö (A

G tó

O

G o

tö tó o

G «5 tó

O

G tó tó tó > > >

•W ·Η ·γΜ

4-» -Ρ 4->

Ό 63 tó Jí	TS 63 tó X	T3 63 tó X	•Ό 63 tó X	Ό 63 tó X	Ό 63 tó X	X? 63 tó X
tó	tó	tó	tó	tó	tó	tó

O

Ό

O

U o

te

G ffl tó

-tó tó

Ü e

φ co υ

•φ to o

a

Ü c

c tű tó tó (Ű te c

tó tö	tó -*“> to
tó
E	ε
w	0) a	tó
tó	(0 e>	10
tö	υ w>	Ü
tó	-a v	“tó
>	to >·	to
^s3	0 =3	o
	ft	04
'tó	S -8	*3
X	tö _c	(0 “tó c

X>

tó

Λ > O 73

O ^Ctó X, tó υ c

I tó >

=3 q -tó tó X tó >>

O G 'tó ©

o o o

O Ο ΙΛ <O 1—1

3		G		□		3
co		GO		tó		tó
63		63		63		63
G		G		G		G
tó	tó	tó	tó	tó	tó	tó	tó
co	CO	(0	CQ	tó	tó	tó	tó
p	υ	^aP	tó	•O	tó	«Ο	tó
ti	'tó	tó	“tó	É-i	-tó	P	-tó
tó	to	tű	tó	to	tó	to
G	a	G	a	G	0 0<	G	0 04
tó		tó		tó		tó
to	-P	tű		to	4->	to	4->
“r^					P		4->

	o .	0		0		0
	2 n	XJ		X5		X3
“tó	p .«	0	•tó	0	•tó	0
X tó	(4 _C s«	S4 0 to	X tó	l·) 0 to	X tó «»4	Í4 0 to

-p G · g s

Ό «· o ~ ⁰ £ to ⁰⁹

G £ tó O W -o ·** o tó o tó tO ü 3 & “ O ^N0- c •tó •-4 O o o

-815

Szakember szamára nyilvánvalói hogy a leírtak különböző módosításaira van lehetőség, és az ilyen módosítások is a találmány tárgykörébe tartoznak.

Claims

1. Eljárás hatóanyagként humán szövet plazminogén aktivótort tartalmazó stabilizált, 10 folyékony gyógyszerkészítmény vagy abból készült szilárd liofilizátum előállítására, azzal jellemezve, hogy 0,1-50 mg/ml humán szövet plazminogén aktivótort vizes oldatban 0,02-1 mól/liter argininium-iont szolgáltató ve- 15 gyületet tartalmazó, 4 és 9 közötti pH-értéket biztosító, gyógyászati szempontból elfogadható pufferrel és kívánt esetben 0,0005-1 tömeg/tf.% gyógyászati szempontból elfogadható, nem-ionos felületaktív szerrel és/- 20 vagy egy- vagy többféle gyógyászati szempontból elfogadható higitószerrel elegyítünk, úgy választva meg az említett anyagokat és az esetleges adalékokat, hogy a készítmény klorid-ion tartalma 0,3 mól/liter alatt legyen, 25 és kívánt esetben az elegyet liofilizóljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás humán szövet plazminogén aktivátort tartalmazó, stabil, száraz gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igény- 30 pont szerint előállított vizes oldatot liofili— záljuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy argininium-iont tartalmazó vegyületként az arginin valamely gyógyászati 35 szempontból elfogadható savaddiciós sóját használjuk, argininium-klorid kivételével.

4. A 3, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ellenion foszfát.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal 40 jellemezve, hogy a humán szövet plazminogén aktivótort 0,4-5,0 mg/ml és az argininiumiont 0,1-0,5 mól/1 koncentrációban alkalmazzuk.