NO168988B - Anvendelse av en argininiumholdig buffer til formulering av stabile farmasoeytiske preparater inneholdende humanvevplasminogenaktivator - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en farma-søytisk akseptable argininiumholdig buffer til formulering av stabile farmasøytiske preparater inneholdene humanvev-plasminogenaktivator (t-PA).

Disse farmasøytiske preparatene har forøkede stabilitets- og oppløselighetsegenskaper for t-PA komponenten, og gir lett lyofiliserbarhet, hvilket muliggjør evnen til å danne stabile, lyofiliserte former derav for sikker, effektiv terapeutisk administrasjon til mennesker.

Ustabiliteten til vaskulaer plasminogenaktivator ekstrahert fra de vaskulære forgreningene i døde mennesker er beskrevet av Aoki, J. Biol. Chem., (Tokyo), 75, 731 (1974). Aoki fant at aktivatoren ble stabilisert bare av høye natriumklorid-konsentrasjoner, over ca. 0,5 M.

Binder et al., J. Biol. Chem. 254, 1998 (1979) beskriver buffere med høyt salt- og arginininnhold ved en flertrinns renseprosess som vesentlig for opprettholdelse av aktiviteten til vaskulær plasminogenaktivator oppnådd fra perfusater fra døde mennesker. Rensetrinnene ble utført i nærvær av 0,3-1,0 M NaCl og 0,1 M arginin.

Radcliffe et al., Arch. of Biochem. & Biophy. 189, 185 (1978) beskriver separering av plasminogenaktivator fra humanplasma ved kromatografi på lysin-sefarose. I et forsøk ble plasminogenaktivator-råmaterialet fra stabilisert plasma eluert fra lysin-sepharose ved anvendelse av en gradient fra 0 M til 0,5 M arginin i 0,6 M NaCl.

Humanvev-plasminogenaktivator oppnådd fra naturlig vevskilde er beskrevet av Coilen et al., i publisert EP-patentsøknad, publ. nr. 041766. Her benyttet man et rensesystem som gir vev-plasminogenaktivator ved relativt høye renhetsnivåer. Coilen et al. studerte stabiliteten til preparater av deres rensede vev-plasminogenaktivator både i flytende og lyofilisert tilstand, og fant at de lyofiliserte formene stadig var ustabile selv når de ble fremstilt fra oppløsninger inneholdende 0,3 M NaCl.

For at materialer slik som vev-plasminogenaktivator skal kunne brukes i forbindelse med pleie av personell og pasien-ter må disse materialene fremstilles som farmasøytiske preparater. Slike preparater må være stabile i hensikts-messige tidsperioder, må være akseptable som de er for administrasjon til mennesker, og må være lette å fremstille. Et eksempel på et slikt preparat ville være en oppløsning beregnet for parenteral administrasjon. Selv om farmasøy-tiske oppløsningspreparater i mange tilfeller tilveiebringes i flytende form, klare for umiddelbar bruk, kan slike parenterale preparater også tilveiebringes i frossen eller i lyofilisert form. I sistnevnte tilfelle må preparatet tines før bruk. Den sistnevnte formen benyttes ofte for å forbedre stabiliteten til legemiddelet som inneholdes i preparatet under en rekke forskjellige lagringsbetingelser, siden det er erkjent av fagfolk på området at lyofiliserte preparater i alminnelighet er mer stabile enn deres flytende motstykker. Slike lyofiliserte preparater rekonstitueres før bruk ved tilsetning av egnet farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel(er), slik som sterilt vann for injeksjon eller steril fysiologisk saltoppløsning, o.l.

Det er et formål med foreliggende oppfinnelse å anvende en farmasøytisk akseptabel argininiumholdig buffer til formulering av stabile preparater av humanvev-plasminogenaktivator, særlig de i stabil, lyofilisert form.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den oppdagelse at inn-befatningen av arginin (som argininiumion) i et farmsasøytisk akseptabelt preparat av vev-plasminogenaktivator (t-PA) betydelig øker stabiliteten og oppløseligheten til t-PA, og videre, sammen med et utvalg av egnede motioner, muliggjør fremstilling av stabile, lyofiliserte, former derav. Opp-finnelsen er således rettet mot anvendelse av argininiumholdig buffer for effektiv fremstilling av farmasøytiske preparater inneholdende humanvev-plasminogenaktivator.

Ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes således en farma-søytisk akseptabel argininiumholdig buffer til formulering av stabile farmasøytiske preparater inneholdende humanvev-plasminogenaktivator, hvor preparatene har en kloridionkonsentrasjon på mindre enn 0,3 M, og en pE-verdi fra 4 til 9, og hvor den farmasøytisk effektive mengde av t-PA er i området 0,1-50 mg/ml og argininiumionet har en konsentrasjon i området 0,02-1 M, idet preparatet eventuelt fortynnes med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel.

Generelt kan preparatene inneholde andre komponenter i mengder som fortrinnsvis ikke svekker fremstillingen av stabile, lyofiliserbare former og i mengder som er egnet for effektiv, sikker farmasøytisk administrasjon.

pH-områder for fremstilling av preparatene er fra 4 til 9, fortrinnsvis, siden disse preparatene er beregnet for farmasøytika, i det fysiologiske pH-området, dvs. omkring det nøytrale området. I dette pH-området forekommer arginin primært som et protonert kation med netto ladning +1 som kan betegnes "argininiumion". Betegnelsen "arginin" er i foreliggende sammenheng benyttet ensbetydende med "argininiumion", fordi "argininiumion" p.g.a. systemets pE-verdi er en ekvivalent beskrivelse. For å bibeholde elektrisk nøy-tralitet må argininiumionet balanseres med en ekvivalent mengde av motsatt ladede (dvs. negativt ladede) ioniske elementer som kan betegnes "motioner". Kombinasjonen av argininiumion, andre kationiske elementer, og de forskjellige motionene, kan betegnes som et "argininiumion-holdig buffersystem". Akseptable motioner innbefatter de som er farmasøytisk akseptable og i tillegg de som kan justere preparatets tilsynelatende eutektiske temperatur eller kollaps-temperatur slik at preparatet er spesielt egnet for

lett lyofiliserlng. Eksempler på slike motioner er acetat, fosfat, citrat, suksinat, sulfat, tartrat, malat, maleat, karbonat o.l., samt funksjonelle ekvivalenter derav. Et eksempel på et motion som ikke er godt egnet, «r kloridion.

Som angitt ovenfor har man i foreliggende sammenheng funnet at innbefatning av arginin (som argininiumion) i farmasøy-tiske prepareter av t-PA betydelig øker oppløseligheten og stabiliteten til t-PA materialet i disse preparatene. Argininkonsentrasjoner kan variere fra 0,02 M til 1 M, fortrinnsvis fra 0,05 M til 1,0 M, og mer foretrukket fra 0,1 M til 0,5 M i den administrerte oppløsning, og/eller, i tilfelle for et lyofilisert preparat, i prelyofiliserings-oppløsningen.

I tillegg kan de tilveiebragte forbedrede preparatene eventuelt innbefatte ett eller flere ikke-ioniske detergenter, slik som polysorbat 20 og polysorbat 80 og lignende, i mengder fra 0,001 til l£, for å forbedre stabiliteten av t-PA materialet ytterligere. I tillegg kan andre farmasøytiske akseptable eksipienser som er velkjent for fagmannen på området, også utgjøre en del av slike preparater. Disse kan f.eks. innbefatte forskjellige svellemidler, ytterligere buffer-midler, chelateringsmidler, antioksydasjonsmidler, preserva-tiver, kooppløsningsmidler og lignende; spesifikke eksempler på disse kan være mannitol, trometaminsalter ("Tris-buffer"), dinatriumedetat, gelatin, humanserumalbumin eller andre polypeptider, forskjellige små peptider slik som glycyl-glycin, osv.

t-PA preparatene i foreliggende oppfinnelse krever over-raskende ikke bruk av høye konsentrasjoner av natriumklorid, dvs. 0,3 M eller over. Høye konsentrasjoner av kloridioner er f.eks. ugunstig for lyofiliserbarheten for disse forbedrede preparatene. Selv om en viss mengde kloridion kan tolereres, er lavere konsentrasjoner foretrukne, dvs. mindre enn 0,3 M og er fortrinnsvis ikke over de normale fysio-

logiske nivåene, dvs. 0,12 M NaCl. Mest foretrukket er kloridionet ekskludert fra preparatet.

En "farmasøytisk effektiv mengde" av t-PÅ refererer til den nengde som gir terapeutisk effekt i forskjellige administrasjonsmåter. Preparatene kan fremstilles inneholdende mengder av t-PA på minst 0,1 mg ml, over 50 mg/ml, fortrinnsvis fra 0,4 mg/ml til 5 mg/ml. For bruk av disse preparatene ved administrasjon til mennesker som har myokardialt infarkt, f.eks., kan disse preparatene inneholde fra 0,4 mg/ml til 3 mg/ml t-PA, tilsvarende den for tiden aktuelle doseringsmegde for slik behandling.

De aktuelle preparatene innbefattende lyofiliserte former, fremstilles generelt ved sammenblanding av komponentene under anvendelse av generelt tilgjengelige, i og for seg kjente farmasøytiske sammenblandingsteknikker. Likeledes benyttes standard lyofiliseringsmetoder og utstyr som er velkjent på området. En spesiell metode for fremstilling av et farmasøy-tisk preparat av t-PA omfatter anvendelse av renset (ifølge hvilket som helst standard proteinrensesystem) t-PA i en hvilken som helst av flere kjente buffer-utvekslingsmetoder slik som gelfiltrering. Denne foretrukne metode ble benyttet for å isolere og rense t-PA materialet benyttet som utgangs-materiale i nedenstående stabil itets- og oppløselighets-studier. t-PA materialet benyttet i den foretrukne metoden ble oppnådd fra rekombinant endrede eggstokkceller (CH0-celler) fra kinesisk hamster, hvilke kan uttrykke t-PA som et utskilt produkt i CHO-cellekulturmediet.

Man har oppdaget den demonstrative effekt at farmasøytiske preparater av t-PA har betydelig stabilisert biologisk aktivitet når argininiumion-holdig buffer er en komponent, og at slike preparater ikke krever natriumklorid for stabilitet, skjønt saltkonsentrasjoner under 0,3 M kan benyttes. I en foretrukken utførelse er kloridion-konsentrasjonen 0,1 M eller mindre. I det nøytrale pH-området, f.eks. fra pH 6 til 8, økes oppløseligheten av t-PA ved tilstedeværelse av argininiumion slik at det utsettes formulering i relativt høye konsentrasjoner, selv uten tilstedeværelsen av det som innen teknikken har vært ansett som nødvendig-, høye stabili-serende mengder av salt.

Som her benyttet betegner uttrykkene "humanvev-plasminogenaktivator", "human t-PA" eller "t-PA" human ekstrinsik (vevs-type) plasminogenaktivator, fremstilt f.eks. fra ekstraksjon og rensing av en naturlig kilde (se Coilen et al., supra), og ved hjelp av rekombinante cellekultursystemer som beskrevet heri. Dens sekvens og egenskaper er angitt f.eks. i publisert EP-patentsøknad publ. nr. 93.619. Det vises også til EP-patentsøknad publ. nr. 41.766, og Rijken et al., Journal of Biol. Chem. 256, 7035 (1981). Uttrykkene dekker likeledes biologisk aktive humanvev-plasminogenaktivator-ekvivalenter, som adskiller seg med hensyn til en eller flere aminosyrer i den totale sekvensen, eller med hensyn til glukosyleringsmønsteret, som antas å være avhengig av de spesifikke kulturbetingelsene som benyttes, og typen av hvert fra hvilken vev-plasminogenaktivatoren er oppnådd.

A. Figurer

Fig. 1 viser stabiliteten til t-PA i forskjellige preparater. Fig. 2 viser effekten av argininkonsentrasjon på oppløselig-heten av t-PA. Fig. 3 viser oppløselighetsgrensene for t-PA i forskjellige konsentrasjoner av argininiumfosfat-buffere ved pH 6, 4,0°C.

B. Lyofllisering

Lyofilisering, eller frysetørking, av preparatet utføres ved bruk av metoder og utstyr som er velkjent for fagmannen på området. Typisk blir et preparat først frosset til en temperatur under dens tilsynelatende eutektiske temperatur eller kollaps-temperatur. Vakuum blir deretter påsatt, og varme tilføres til lyofilisator-hyllene, for å avdrive isen ved sublimering, idet hylletemperatur og kammertrykk justeres slik at temperaturen på den frosne massen forblir under den tilsynelatende eutektiske temperatur eller kollaps-temperatur inntil vesentlig all isen er fjernet. Etter denne "primære tørke"-fase kan hylletemperaturen heves ytterligere (med eller uten en endring i kammertrykk), og resterende fuktighet i den frysetørkede kaken avdrives.

C- S- 2288- analvse

Et syntetisk peptidsubstrat, S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid.2HCl) hydrolyseres av t-PA under dannelse av farget p-nitroanilin og tripeptid. Den maksimale differensi-elle absorbans mellom substrat og produkt (p-nitroanilin) forekommer ved 405 nm. Fremstilling av p-nitroanilin over-våkes spektrofotometrisk ved å følge absorbans ved 405 nm som en funksjon av tiden. Den resulterende absorbans-kurve-skråning mot tid er proporsjonal med p-TA aktivitet. Denne analyse foretas ved 37 ± 0,2°C.

For denne analysen ble 20-100 mikroliter av en gitt t-PA prøve tilsatt til en 1,2 ml reaksjonsblanding inneholdende 0,33 mM S-2288, 0,067 M Tris-buffer (pH 7,4), 0,07 M NaCl og inkubert ved 37°C i 10 minutter.

Endringen i absorbans ble overvåket i 1 min., og aktiviteten ble beregnet fra absorbansen ved 405 nm under anvendelse av følgende ligning, standardisert av produsenten:

Aktivitet (IU; Internasjonale enheter:

D. Eksempler

Eksempel 1

Renset t-PA hie fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 0,2 mg/ml, aliquotert og dialysert mot bufrene vist i tabell 1.

Etter dialyse ble prøvene sentrifugert og supernatanten lyofilisert i 1 ml aliquoter. Lyofiliserte prøver ble rekonsti-tuert med vann og analysert for t-PA aktivitet i S-2288 analysen. Hver rekonstituerte prøve ble deretter plassert ved 37°C og analysert ved forskjellige tidspunkter.

Resultatene fra dette forsøket er vist på fig. 1. Som det fremgår herfra, hindrer de systemer som ikke inneholder arginin, ikke tapet av t-PA aktivitet med tid. t-PA aktiviteten i de prøver som inneholder 0,2 M arginin eller 0,2 M arginin pluss fysiologiske mengder klorid, hiheholder nesten all innledende t-PA aktivitet etter inkubasjon 1 4 dager ved 37°C. Disse resultatene demonstrerer at 0,2- M arginin med eller uten NaCl i betydelig grad stabiliserer t-PA.

Eksempel 2

Stabiliteten til t-PA som en funksjon av argininkonsentrasjon ble bestemt ved å måle hastigheten for tap av t-PA aktivitet ved forskjellige temperaturer.

Formulering: 1. 0,355 mg/ml t-PA

0,05 M Na-fosfat pE 6,2

0,05 M arginin som hydrokloridet

2. 0,498 mg/ml t-PA

0,03 M Na-fosfat pH 6,2

0,2 M arginin som hydrokloridet

0,5 ml aliquoter oppløsning med de ovenfor angitte formu-leringer ble fylt på aseptisk måte i 2 ml glassampuller og forseglet. Ampullene ble anbragt ved 25°, 27°, 45°C. To ampuller av hver oppløsning ble utsatt for prøvetagning ved 0, 20, 55 og 160 dager; og t-PA aktivitet ble målt under anvendelse av S-2288 analyse. Den naturlige logaritmen til den prosentvise gjenværende aktivitet ble plottet mot tid (dager) for hver temperatur, hvorfra hastighetskonstanten ble beregnet under anvendelse av lineær regresjonsanalyse.

Hastighetskonstantene (k) for tap av t-PA stabilitet ved to forskjellige argininkonsentrasjoner og ved forskjellige temperaturer er vist i tabell 2.

Som det fremgår fra det ovenstående gir 0,2 M arginin hastighetskonstanter som er mindre enn de som oppnås i 0,05 M arginin ved hver av de angitte temperaturene, hvilket indikerer at en økning i argininkonsentrasjon øker stabiliteten t-PA.

Eksempel 3

Stabiliteten til t-PA er også avhengig av konsentrasjonen av ikke-ioniske overflateaktive midler. Dataene er angitt i tabell 3.

t-PA ble utfelt ved dialyse mot 0,01 M Na-suksinatbuffer ved pH 6,0. t-PA bunnfallet ble oppsamlet fra den dialyserte prøven ved sentrifugering. Dette bunnfall ble oppløst på nytt i formuleringen nedenfor inneholdende varierende konsentrasjoner av polysorbat 80.

Formulering: 0,2 M arginin som hydrokloridet

0,02 M Na-fosfat pE 7,2

Polysorbat 80 (0,0005 til 0,1056)

Oppløsningene ble fylt på aseptisk måte i ampuller og anbragt ved 35°C og 40°C. To ampuller ble underkastet prøvetagning ved hvert tidspunkt, og enzymatisk aktivitet ble analysert under anvendelse av S-2288 analysen.

Hastighetskonstantene ble beregnet ved lineære regresjons-analyser av kurven for 10 g (t-PÅ aktivitet) mot tid for hver temperatur, og er vist i tabell 3.

Denne tabellen viser at etter hvert som konsentrasjonen av polysorbat 80 økes, avtar hastighetskonstanten (k). Dette indikerer at mer stabilitet oppnås med mer polysorbat 80.

Eksempel 4

t-PA oppløsninger ble fremstilt ved dialyse av renset t-PA mot argininiumfosfat-formuleringsbufferen nedenfor, fulgt av fortynning med ytterligere buffer til den ønskede sluttkonsentrasjon av t-PA.

Formuleringsbuffer:

0,20 M arginin

0,18 M fosforsyre

0,01$ polysorbat 80

pH 6

Aliquoter av hvert preparat ble fylt på aseptisk måte i 5 eller 10 ml ampuller, lyofilisert og forseglet. Ampullene ble anbragt ved flere temperaturer. To ampuller pr. formulering ble underkastet prøvetagning ved hvert tidspunkt, og t-PA aktivitet bestemt ved hjelp av S-2288 analysen. Resultatene er gitt i tabell 4.

Disse data viser at t-PA er stabil i den lyofiliserte formen.

Eksempel 5

En oppløsning Inneholdende t-PA ved ca. 0,3-0,5 mg/ml ble dialysert mot 10 mM natriumfosfat, pH 7,5, 0-, 01% polysorbat 80 inneholdende forskjellige konsentrasjoner av arginin som hydrokloridet. Uoppløselig materiale ble fjernet ved sentri-fuger ing i 2 min. i en Eppendorf-mikrofuge. Mengden av t-PA som forble i oppløsning, ble analysert i S-2288 analysen. Resultatene er vist i fig. 2.

Så lite som 50 mM arginin øker signifikant oppløseligheten av t-PA. (Den lille økningen i tilsynelatende oppløselighet ved høyere argininkonsentrasjoner er et artefakt, som skyldes det faktum at den opprinnelige konsentrasjon av t-PA i utgangs-materialet bare var 0,3-0,5 mg/ml, og således ble en begrensende oppløselighet aldri nådd. )

Eksempel 6

t-PA ble utfelt ved dialyse mot 0,001 M natriumsuksinatbuffer ved pH 6. Det resulterende bunnfall ble isolert ved sentrifugering, deretter ble en målt mengde av dette materiale ekvilibrert i 1 ml av det ønskede buffersystem i 20 timer ved 5°C under omrøring. De studerte buffersystemene ble fremstilt ved titrering av arginin med fosforsyre for dannelse av et argininiumfosfat-system ved pH 6,0. Forrådsoppløsninger ble fortynnet med vann for oppnåelse av sluttlige buffer-oppløsninger inneholdende 0,10-0,20 M arginin (som argininiumion). Etter ekvilibrering med det ønskede buffer-systemet ble det resulterende t-PA preparat sentrifugert for å fjerne eventuelt ikke-oppløselig materiale, og deretter ble supernatantene analysert med henblikk på oppløselig t-PA via S-2288 analysen.

Resultatene er vist på fig. 3. Dersom t-PA materialet er fullstendig oppløselig ved konsentrasjonen for opprinmelig tilsatt t-PA, så! skulle konsentrasjonen av oppløselig t-PA være den samme som den som ble tilsatt. Omvendt, dersom t-PA ikke er fullstendig oppløselig ved den opprinnelig tilsatte konsentrasjon, så vil konsentrasjonen av oppløselig t-PA være mindre enn den som ble tilsatt. Fig. 3 viser at t-PSA er oppløselig i 100 mM argininfosfat, pH 6,0 opptil ca. 2 mg/ml, og at ved høyere argininfosfat-konsentrasjon blir oppløselig-heten betydelig forøket. Spesielt, ved 200 mM argininfosfat pH 6,0 er t-PA materialet fremdeles fullstendig oppløselig selv ved ca. 54 mg/ml, og den begrensende oppløseligheten er klart betydelig høyere enn dette.

Eksempel 7

Argininiumfosfatsystemet nedenfor ble fremstilt som en prelyofiliseringsoppløsning.

Prelvofiliserlngsoppløsning

Etter steril filtrering ble ca. 20 ml aliquoter fylt i 50 cm<3 >ampuller. Lyofilisering ble deretter utført som følger: a) Ampullene ble anbragt i lyofiliseringsanordningen og frosset ved —50°C (hylletemperatur) under omgivelsestrykk i 10 timer. b) Vakuum ble påsatt (kammertrykk på 100 pm Hg) og hylletemperaturen ble hevet ved 10°/time til +7°C, deretter holdt ved denne temperaturen 1 41 timer.

c) Hylletemperaturen ble deretter hevet- til +35°C og kammertrykket senket til 50 ym, og systemet holdt i

denne tilstand i 14 timer.

Ampullene ble deretter korket, trykket fikk vende tilbake til omgivelsestrykk, og ampullene fjernet fra lyofiliseringsanordningen.

Eksempel 8

Effekten av natriumklorid på kvaliteten av lyofiliserte argininfosfatkaker ble undersøkt. Prøver av 0,8 M arginin (pH 7) og 0,2 M arginin (pH 6) som fosfatsaltene ble fremstilt slik at de inneholdt konsentrasjoner av natriumklorid varierende fra 0,01 til 500 mM. 2 ml aliquoter av hver oppløsning ble anbragt i 10 cm<3> ampuller og lyofilisert under anvendelse av følgende sykel.

Kvaliteten på de resulterende kaker er gitt i tabell 5. Dataene viser dannelsen av farmasøytisk akseptable kaker bare med de preparater som inneholder lave nivåer av natriumklorid, og at det tolererte lave nivå av natriumklorid er avhengig av argininkonsentrasjonen.

Claims (9)

1. Anvendelse av en farmasøytisk akseptabel argin-iniumion-holdig buffer til formulering av stabile farmasøytiske preparater inneholdende humanvev-plasminogenaktivator, hvor preparatene har en kloridionkonsentrasjon på mindre enn 0,3 M, og en pH-verdl fra 4 til 9, og hvor den farmasøytisk effektive mengde av t-PA er i området 0,1-50 mg/ml og argininiumionet har en konsentrasjon i området 0,02-1 M, idet preparatet eventuelt fortynnes med et farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor preparatet er frosset.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvor preparatet omdannes til lyofilisert form.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor den lyofiliserte formen rekonstitueres.

5. Anvendelse ifølge krav 1, hvor bufferen er tilveiebragt av argininiumion og et motion som kan justere preparatets kollapstemperatur til en lett lyofiliserbar tilstand.

6. Anvendelse ifølge krav 1, hvor motionet velges fra citrat, fosfat, tartrat, sulfat, malat, maleat og suksinat.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvor motionet velges fra citrat og fosfat. IO

8 . Anvendelse ifølge krav 1 hvor humanvev-plasminogenaktivatoren har en konsentrasjon på minst 0,1 mg/ml og argininiumionet har en konsentrasjon i området 0,05-1,0 M.

9. Anvendelse ifølge krav 1 hvor humanvev-plasminogenaktivatoren har en konsentrasjon fra minst 0,4 til 5,0 mg/ml og argininiumionet har en konsentrasjon i området 0,1 til 0,5 M.