PREPARACIÓN ESTABILIZADA DE FACTOR VIII RECOMBINA TE. LIBRE DE ALBÚMINA. QUE TIENE UN BAJO CONTENIDO DE AZUCARES Antecedentes de la Invención Campo de la invención: La solicitud en general se relaciona con formulaciones farmacéuticas y en particular con una formulación liofilizada para rFVIII estabilizada sin albúmina (libre de albúmina) . Técnica anterior: El Factor VIII es una proteina de plasma bien conocida que es esencial para el proceso de coagulación de la sangre. A pesar de que el Factor VIII se puede obtener y de hecho actualmente se obtiene de plasma humano, en años recientes se han hecho esfuerzos para producir el Factor VIII a partir de fuentes recombinantes (rFVIII) para evitar las contaminaciones potenciales que se asocian con los productos sanguíneos. Además, una fuente recombinante para el Factor VIII proporciona una provisión vir ualmente ilimitada del factor de coagulación, evitándose de esta manera las limitaciones en el suministro asociadas al uso de plasma de sangre donada como material de origen. Puesto que una de las ventajas de un producto rfVIII (factor VIII recombinante) reside en que no se deriva de plasma humano, y por lo tanto evita la contaminación potencial de una fuente de plasma humano, una REF: 25090 de las metas en la producción del rFVIII ha sido la de desarrollar una formulación estable de rFVIII cuya descripción satisfaga el requisito de ser totalmente libre de cualesquiera materias primas de origen humano. Desafortunadamente, sin embargo, el rFVIII es una proteína inestable y, al igual que muchas otras proteínas terapéuticas, se puede volver inestable durante el almacenamiento. Ha venido siendo práctica común el incluir albúmina de suero humano en el producto en calidad de estabilizador, para sobreponerse a tal inestabilidad. La alb mina ha resultado ser un buen estabilizador para el rFVIII, y se emplea en numerosos productos comerciales que se distribuyen en el ramo. Sin embargo, se pierde una de las ventajas buscadas en primer lugar con un producto recombinante (o sea, evitar cualesquiera materias primas de origen humano) . Existen algunas formulaciones libres de albúmina para el Factor VIII que han sido descritas recientemente, tanto en medios de potencia iónica baja como en medios de potencia iónica elevada, que utilizan cloruro de sodio, cloruro de calcio e histidina como ion amortiguador. Adicionalmente se han utilizado amino ácidos básicos tales como lisina, y azúcares tales como manitol, sucrosa o maltosa. Para lograr la estabilidad en una formulación de Factor VIII libre de albúmina, reteniendo al mismo tiempo la isotonicidad necesaria que se requiere para el empleo terapéutico, se ha incluido aproximadamente 10% de azúcar en tales formulaciones libres de albúmina. Remitimos por ejemplo a la patente U.S. 4,877,608 (formulación de baja potencia iónica) . La patente europea 0 314 095 revela otra formulación libre de albúmina que tiene una potencia iónica elevada e histidina como agente amortiguador. La patente '608 se aboca a una solución líquida y no a un producto liofilizado que tiene que tener la capacidad de poder someterse a ciclos de secado por congelamiento necesarios para preparar el producto. La patente europea 314 095 incluye una cantidad relativamente elevada de cloruro de sodio y se utiliza principalmente en una formulación líquida. Otras patentes que se ocupan de formulaciones para el Factor VIII incluyen la patente U.S. 5,399,670, la cual describe el empleo de arginina en una formulación secada por congelamiento (liofilizada) que contiene albúmina. Remitimos también a la WO 95/01804 que describe una formulación que no incluye sucrosa o glicina, y a las U.S. 4,440,679 y U.S. 4,623,717 (ambas otorgadas a Fernandes et al . ) , que enseñan el empleo de cuando menos 30% en peso de azúcares en combinación con amino ácidos para estabilizar el FVIII en estado líquido bajo condiciones de pasteurización (60°C durante cuando menos 10 horas) . Además de las formulaciones de Factor VIII precedentemente mencionadas existen varias otras patentes relacionadas con la purificación y/o estabilización del Factor VIII. Entre éstas se incluye la patente U.S. 5,288,853 que cubre un proceso de producción de múltiples etapas que incluye el empleo de una columna acoplada con heparina, seguido ésto de la adición de glicina para formar un producto de Factor VIII pirificado. La patente U.S. 5,399,670 cubre un proceso para producir una preparación de Factor VIII liofilizado que posee solubilidad realzada, proceso éste que requiere la adición de arginina a la solución del Factor VIII antes de la liofilización. La patente U.S. 5,259,951 cubre un método de múltiples etapas para purificar Factor VIII (proveniente) de plasma utilizando columnas intercambiadoras de iones. La patente U.S. 4,758,657 cubre un proceso de múltiples etapas para separar el Factor VIII :C del plasma, en el cual cuando menos una de las etapas requiere la adsorción del Factor VIII :C en una matriz de interacción hidrofóbica. Adicionalmente a las patentes precedentes existe una formulación para el Factor IX (FIX) que apareció muy recientemente, la cual parece similar a la formulación para el rFVIII (Factor VIII recombinante) revelada en la presente memoria descriptiva. Remitimos al Resumen 244 por L. Bush et al., Hemophilia, Vol. 2, suplemento 1, pág. 64 (Junio, 1996) . FIX es una pro-enzima que se convierte en una enzima proteolítica activa. El FVIII, en cambio, sirve como co-factor (factor adicional entre otros) junto con otros componentes de coagulación para efectuar la coagulación de la sangre. El peso molecular del FVIII es de aproximadamente 340,000 Daltons, en tanto que el FIX tiene un peso molecular de aproximadamente 56,000 a 57,000. El FVIII es muy sensible al procesamiento proteolítico con una pérdida concomitante de su actividad coagulante. Se sabe muy bien que el Factor VIII es inherentemente más inestable que el FIX, y los concentrados de cada factor secados por congelamiento (liofilizados) muestran una diferencia marcada en estabilidad al almacenaje a varias temperaturas. Al contrario del FVIII, el FIX incluye una carboxilación gama única de residuos de ácido glutámico de terminal 12 N, proporcionando de esta manera una posible base para estabilidad diferencial. Por lo tanto, una formulación para el FIX no necesariamente sugeriría una formulación para el FVIII. En Pharmaceutical Research, Volumen 12, No. 6, páginas 831-837, 1995, también se revela una formulación para el antagonista receptor interleucina-1 recombinante humano estabilizado, similar a la que se revela en lo que sigue . A pesar de los esfuerzos anteriores y recientes para desarrollar una preparación rFVIII estable que se pueda liofilizar con éxito y posteriormente reconstituir rápidamente con agua, hasta la fecha ha resultado difícil proporcionar una formulación que no solo evite el empleo de productos humanos tales como la albúmina, sino que también satisfaga los requisitos de una liofilización exacta y una rápida reconstitución e isotonicidad, proporcionando al mismo tiempo un rFVIII que tenga estabilidad a largo plazo cuya duración permita un almacenamiento adecuadamente prolongado farmacéuticamente. Para nuestra sorpresa hemos descubierto ahora que si es posible hacer una preparación así. En el transcurso del desrrollo de ésta formulación hemos encontrado que la histidina, la cual en la técnica anterior ha sido enseñada y utilizada como agente amortiguador, en realidad ejerce un efecto desestabilizador sobre las formulaciones liofilizadas libres de albúmina. Sin embargo, hemos descubierto que es posible sobreponerse a los efectos desestabilizadores de la histidina mediante una novedosa formulación de sales, glicina y sucrosa, cuya comobinación resulta tener un efecto beneficioso para estabilizar el rFVIII. Esta mezcla asimismo protege al rFVIII a través de los múltiples ciclos de congelamiento-descongelamiento durante el proceso de liofilización, y proporciona una rápida reconstitución del producto liofilizado con agua. A diferencia de la mayoría de las formulaciones de la técnica anterior, las cuales son esencialmente amorfas, la formulación incluye tanto componentes cristalinos como también componentes amorfos . La formulación de nuestra invención permanece estable en el estado líquido durante cuando menos veinticuatro horas a temperatura ambiente. Los detalles de nuestra formulación y su empleo se describen a continuación. Sumario de la invención: Nuestra formulación de rFVIII perfeccionada es un producto liofilizado libre de albúmina farmacéuticamente aceptable que se puede reconstituir rápidamente con agua
(dentro de 30 segundos) y adecuado para tratar la hemofilia. El preparado liofilizado comprende una novedosa mezcla de sales, amino ácidos y sucrosa. El producto es estable a temperatura ambiente y, a diferencia de las formulaciones de la técnica anterior, comprende un nivel relativamente bajo de azúcar. La formulación comprende, después de haberse reconstituido con agua, los siguientes ingredientes: glicina: aproximadamente de 65 a 400 mM, de preferencia 290 mM, histidina: hasta aproximadamente 50 mM, de preferencia 1 mM a 50 mM, muy preferiblemente 20 mM, sucrosa: aproximadamente 15 a 60 mM, de preferencia 30 mM, NaCl : hasta aproximadamente 50 mM, de preferencia 1 mM a 50 mM, muy preferiblemente 30 mM, CaCl-, : hasta aproximadamente 5 mM, de preferencia 0.1 a
mM, muy preferiblemente 2.5 mM, y rFVIII : aproximadamente 50 a 1500 IU/ml . En una formulación liofilizada preferida, la cantidad de agua residual debería ser de 1 a 3% en peso, de preferencia de 1% en peso. Breve descripción del dibujo: La figura es una gráfica que compara la potencia a través del tiempo, a 40°C, de la formulación de ésta revelación que tiene un contenido de azúcar relativamente bajo (curva superior) con una formulación enseñada por la técnica anterior que tiene un contenido de azúcar relativamente elevado (curva inferior) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El objetivo que condujo a ésta invención fué el de identificar una formulación libre de albúmina que ofreciera estabilidad al rFVIII (pérdida de potencia mínima o menor que del' 20% aproximadamente) a través de varias etapas de proceso tales como ultrafiltración/diafiltración, almacenamiento del granel congelado, efectos debidos a congelamiento-descongelamiento y liofilización. Adicionalmente se deseaba un producto que se disolviera con rapidez y tuviera estabilidad en el estado líquido reconstituido. Finalmente se deseaba un producto liofilizado farmacéuticamente aceptable cuyo período de vida útil en estantería antes de la caducidad fuera apropiado y que pudiera ser liofilizado con un ciclo de corta duración de secado por congelamiento. Las proteínas no se cristalizan durante la liofilización. La meta de un proceso de secado debería ser la de convertir una solución acuosa de proteínas en una fase amorfa para proteger a las proteínas de una inestabilidad química y/o de conformación ocasionada por un ambiente cristalino (o falta absoluta de agua) . Por lo tanto, es común incluir cantidades importantes de albúmina (hasta un 1%) para proporcionar (un componente de) fase amorfa para estabilizar las proteínas. En base a los objetivos generales o globales se desarrolló una formulación que contiene tanto un componente cristalino para permitir una liofilización rápida, como así también un componente amorfo para estabilizar el rFVIII desarrollado. Tal y como se empela en la presente memoria descriptiva, el término cristalino con un componente amorfo significa que la formulación comprende dos o más fases distintas, de las cuales cuando menos una es cristalina y una es amorfa. Los sólidos pueden existir en forma cristalina o amorfa. Los materiales cristalinos se caracterizan por tener una estructura definida, composiciones estequiométricas y puntos de fusión. Por el contrario, los materiales amorfos no poseen una estructura molecular claramente definida y se pueden describir como que son un líquido super-enfriado con una viscosidad extremadamente elevada, tal como un "hule o goma" viscoelástico o un vidrio quebradizo más rígido. Se piensa que se pueden incluir otros azúcares, tales como maltosa, trehalosa y matotriosa, para contribuir al componente amorfo. Se puede incluir manitol para contribuir al componente cristalino de la formulación. La estrategia que se empleo para identificar una formulación de rFVIII libre de albúmina farmacéuticamente aceptable fue la siguiente: (a) El material de partida fué rFVIII altamente purificado, el cual fué purificado utilizando cromatografías ortogonales . Estas se definen como procesos cromatograficos que operan bajo distintos modos y principios y que se usan típicamente en sucesión. Como resultado de ésto, la proteina se puede purificar rápidamente mediante la aplicación de métodos diferentes de purificación más efectivos. Esto dió por resultado un Factor VIII con una pureza mínima del 90% (mediante electroforesis en gel) con actividades específicas mayores de 2000 IU/mg de proteina. La pureza teórica del rFVIII ha sido objeto de controversia, más se estima que es de alrededor de 3500-5000 IU/mg de proteina. (b) La proteina se formulo mediante ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) y se investigo con respecto a su recuperación a través de UF/DF, a su susceptibilidad al congelamiento - descongelamiento, y a su estabilidad líquida a diferentes temperaturas de incubación. (c) Las formulaciones potenciales se caracterizaron además con respecto a su comportamiento térmico mediante DSC (calorimetría de barrido o exploración diferencial) . Se determinaron las temperaturas de transición a vidrio (Tg1), la temperatura de devitrificación (Td') y la temperatura eutéctica de fusión (Te') . Esta información se utilizó para identificar formulaciones que podían liofilizarse con rapidez, las cuales quedaron en la mira para investigaciones adicionales. (d) Las formulaciones que avanzaron se liofilizaron utilizando un ciclo rápido de secado por congelamiento, y se efectuaron análisis a temperaturas de almacenamiento estandard y aceleradas . (e) Las formulaciones estables se identificaron con facilidad de entre las muestras almacenadas a
40°C durante diversos períodos de tiempo. En el proceso de analizar los resultados de numerosos estudios que llevaron a la formulación de conformidad con esta invención, se utilizó una estrategia y programa de diseño experimental multi-variable para someter a una prueba de selección un grupo de ingredientes que se componía de mezclas de **.mino ácidos, sales y azúcares. Los resultados se analizaron utilzando un programa sofisticado para resolver cualquier interacción entre los ingredientes, y se generó un análisis de superficie de respuesta multi-variable de los datos. Para nuestra sorpresa, se encontró que la histidina (comunmente utilizada en la técnica anterior) tiene de hecho un efecto desestabilizador sobre las formulaciones de rFVIII. Esto condujo a la necesidad de examinar críticamente los criterios aplicables a los varios ingredientes de la formulación que finalmente consideramos como aceptable. EJEMPLO 1 El efecto sobre la estabilidad del rFVIII liofilizado se investigó sometiendo a análisis volumétrico varias cantidades de histidina en una mezcla de rFVIII que comprendía 150 mM de NaCl, 2.5 mM de CaCl2 y 165 mM de manitol. Los resultados se muestran a continuación. TABLA Porciento de la potencia inicial después de dos semanas de almacenamiento a 40°C en presencia de la histidina. % de la actividad inicial Histidina (mM) después de 2 semanas a 40°C 20 5.9% 55 6.3% 75 2.5% 100 1.9% Tal y como se puede apreciar por los datos precedentes, el aumento en la cantidad de histidina resultó en un decremento de la potencia del rFVIIl liofilizado reconstituido de manera que se ajustara a las dosis aplicables. Este resultado sugiere que la histidina no entra en juego en la estabilización del rFVIII en estado liofilizado. EJEMPLO 2 Estabilidad del rFVIII en formulaciones con elevado y con bajo contenido de azúcar. El Factor VIII recombinante se preparó en dos formulaciones. La inestabilidad se investigó bajo condiciones de almacenamiento acelerado a 40°C. La formulación de esta revelación con conenido de azúcar elevado era cristalina con un componente amorfo de 1% de sucrosa (30 mM de sucrosa) para estabilizar la proteina. Esta formulación, después de la reconstitución con WFI (agua para inyección) , contenía 30 M de cloruro de sodio, 2.5 mM de cloruro de calcio, 20 mM de histidina, 290 mM de glicina y aproximadamente 200 IU/ml de rFVIII. Esta formulación se compara en la figura con la formulación de la técnica anterior, en donde se puede apreciar que la formulación del rFVIII con bajo contenido de azúcar de conformidad con ésta revelación es considerablemente más estable a lo largo del tiempo que el producto estabilizaod con elevado contenido de azúcar de la técnica anterior. Ya en conocimiento de la revelación precedente, se supone que a la persona versada en el arte se le ocurrirán numerosas variaciones. Por lo mismo, se pretende que los ejemplos anteriores sean considerados únicamente como ilustrativos, y que el alcance de esta invención únicamente sea limitado por las reivindicaciones siguientes .