FI88873C

FI88873C - Foerfarande foer framstaellning av kompositioner som innehaoller stabiliserad human vaevnadsplasminogenaktivator

Info

Publication number: FI88873C
Application number: FI865159A
Authority: FI
Inventors: William Franklin Bennett; Stuart Elliot Builder; Larry Alan Gatlin
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1985-12-17
Filing date: 1986-12-17
Publication date: 1993-07-26
Also published as: AU600246B2; EP0228862A3; EP0228862A2; ATE79273T1; IL80904A; NO865079L; FI865159A; FR2591485B1; AU6661086A; NO168988C; US4908205A; PT83933B; ZA869457B; JPH07173076A; EP0228862B1; PT83933A; DE3686410D1; KR870005647A; FR2591485A1; JPH0714886B2

Description

Menetelmä stabiloitujen Ihmisen kudosplasminogeenln akti- vaattorla sisältävien koostumusten valmistamiseksi 1 8887.5 Tämä keksintö koskee menetelmää farmaseuttisen 5 koostumuksen valmistamiseksi, joka sisältää farmaseuttisesti vaikuttavan määrän ihmisen kudosplasminogeenln akti-vaattoria (t-PA).

Keksinnön mukaisesti valmistetuilla farmaseuttisilla koostumuksilla on parannetut t-PA-komponentin stabiili-10 suus- ja liuko!suusominaisuudet, jotka mahdollistavat helpon kylmäkuivaamisen, joka antaa mahdollisuuden muodostaa stabiileja, kylmäkuivattuja muotoja koostumuksesta annettaviksi turvallisesti ja tehokkaasti ihmlskohteille terapeuttiseen tarkoitukseen.

15 Ihmisruumiiden verisuonihaarautumista uutetun veri suonien plasminogeenin aktivaattorin epästabiilisuutta kuvataan kirjallisuudessa [Aoki, J. Biol. Chem. (Tokyo) 75 (1974) 731]. Aoki on havainnut, että vain suuret natrium-kloridipitoisuudet, yli noin 0,5 mol/1, stabiloivat akti-20 vaattorin.

Binderin et ai. [J. Biol. Chem. 254 (1979) 1998] mukaan paljon suolaa ja arginiinia sisältävien puskureiden käyttö on välttämätöntä monivaiheisen puhdistusmenettelyn aikana, jotta ihmisruumisperfusaateista saadun verisuonten 25 plasminogeenin aktivaattorin aktiivisuus säilyisi. Puhdis- tusvaiheet toteutettiin NaCl-pitoisuudessa 1,0 mol/1 ja arginiinipitoisuudessa 0,1 mol/1.

Radcliffe et ai. [Arch, of Biochem. & Biophy. 189 (1978) 189] kuvaavat plasminogeenin aktivaattorin erotta-30 mistä ihmisen plasmasta lysiini-Sepharosella tehdyn kroma- tografian avulla. Eräässä kokeessa eluoitiin stabiloidusta plasmasta peräisin oleva epäpuhdas plasminogeenin akti-vaattori lysiini-Sepharosesta käyttämällä gradienttia 0 -» 0,5 mol/1 arginiinia 0,6 M NaClrssa.

2 8 8 8 7 5

Collen et ai. kuvaavat luonnon kudoslähteestä peräisin olevaa ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattoria EP-hakemusjulkaisussa 041 766 (julkaistu 16. joulukuuta 1981, hakemus jätetty ensimmäisen kerran 11. kesäkuuta 5 1980). Julkaisun tekijät ovat käyttäneet puhdistusohjel maa, joka saadaan puhtausasteeltaan suhteellisen hyvää kudosplasminogeenin aktivaattoria. Collen et ai. ovat tutkineet puhdistamaansa kudosplasminogeenin aktivaattoria sisältävien valmisteiden stabiilisuutta sekä neste- että 10 kylmäkuivatussa tilassa ja havainneet, että kylmäkuivatut muodot olivat toistuvasti epästabiileja, jopa valmistettuina liuoksista, jotka sisälsivät 0,3 mol/1 NaCl:a.

Jotta sellaisia materiaaleja kuin kudosplasminogeenin aktivaattori voitaisiin toimittaa terveydenhuolto-15 henkilöstölle ja potilaille, tulee niistä valmistaa farmaseuttisia koostumuksia. Tällaisten koostumusten tulee olla stabiileja riittävän pitkiä aikoja, hyväksyttäviä ihmisille annettaviksi ja helposti valmistettavissa. Eräs esimerkki tällaisesta koostumuksesta on parenteraalisesti 20 annettavaksi suunniteltu liuos. Vaikka farmaseuttiset liuosformulat monissa tapauksissa toimitetaan heti käyttövalmiissa nestemuodossa, voidaan tällaisia parenteraalisia formuloita toimittaa myös pakastettuina tai kylmäkuivattuina. Ensin mainitussa tapauksessa koostumus täytyy su-25 lattaa ennen käyttöä. Viimeksi mainittua muotoa käytetään usein koostumuksen sisältämän lääkeaineen stabiilisuuden parantamiseksi vaihtelevammissa säilytysolosuhteissa, koska alan ammattimiehet tietävät, että kylmäkuivatut valmisteet ovat yleensä stabiilimpia kuin vastaavat nestemuodos-30 sa olevat tuotteet. Tällaiset kylmäkuivatut valmisteet saatetaan ennen käyttöä takaisin sopivaan muotoon lisäämällä yhtä tai useampaa sopivaa farmaseuttisesti hyväksyttävää laimennusainetta, kuten steriiliä injektioihin tarkoitettua vettä, steriiliä fysiologista suolaliuosta tms.

3 88873 Tämän keksinnön päämääränä on valmistaa stabiileja, ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattoria sisältäviä koostumuksia, erityisesti stabiilissa kylmäkuivatussa muodossa olevia koostumuksia.

5 Tämä keksintö perustuu siihen havaintoon, että ar- giniinin (argininiumionin muodossa) sisällyttäminen kudosplasminogeenin aktivaattoria (t-PA) sisältävään, farmaseuttisesti hyväksyttävään koostumukseen parantaa merkittävästi t-PA:n stabiilisuutta ja liukoisuutta ja yhdessä 10 soveltuvien vastaionien valinnan kanssa mahdollistaa stabiilien, kylmäkuivattujen muotojen valmistamisen. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että sekoitetaan keskenään mainittu t-PA ja farmaseuttisesti hyväksyttävää argininiumionipitoista puskuria, 0,001 - 1 % 15 ionitonta, pinta-aktiivista ainetta ja mahdollisesti kloridi-ionia pitoisuutena, joka on pienempi kuin 0,3 mol/1.

Yleisesti ilmaistuna koostumukset voivat sisältää muita komponentteja edullisesti sellaisina määrinä, jotka eivät haittaa stabiilien, kylmäkuivattavissa olevien muo-20 tojen valmistusta, ja lääkkeen tehokkaaseen, turvalliseen antamiseen soveltuvina määrinä.

Tämän keksinnön mukaisten koostumusten valmistuksen kannalta sopiva pH-alue on noin 4-9; pH on edullisesti fysiologisella alueella, ts. noin neutraali, koska nämä 25 koostumukset on suunniteltu lääkkeiksi. Arginiini on tällä pH-alueella pääasiassa protonin sisältävänä kationina, jonka nettovaraus on +1 ja jota voidaan kutsua "argini-niumioniksi". Termiä "arginiini" käytetään tässä yhteydessä vaihtoehtoisesti "argininiumionin" kanssa, koska "argi-- 30 niniumioni" on systeemin pH:sta riippuen vastaava ilmaus.

Sähköisen neutraaliuden ylläpitämiseksi argininiumioni täytyy tasapainottaa ekvivalenttisella määrällä vastakkaismerkkistä (ts. negatiivisesti varautunutta) ionia, jota voidaan kutsua "vastaioniksi". Argininiumionin, mui-35 den kationisten spesiesten ja erilaisten vastaionien yh- 4 88875 distelmää voidaan kutsua "arginlniumionla sisältäväksi puskurisysteemiksi”. Hyväksyttäviin vastaioneihin kuuluvat sellaiset, jotka ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä ja lisäksi kykeneviä säätämään koostumuksen näennäistä 5 eutektista eli luhistumlslämpötilaa sillä tavalla, että koostumus soveltuu erityisen hyvin kylmäkuivattavaksi. Esimerkkejä tällaisista vastaioneista ovat asetaatti-, fosfaatti-, sitraatti-, sukkinaatti-, sulfaatti-, tart-raatti-, malaatti-, maleaatti-, karbonaatti- tms. ionit 10 samoin kuin niitä funktionaalisesti vastaavat ionit. Esimerkki vastaionista, joka ei ole hyvin soveltuva, on kloridi-ioni.

Kuten edellä mainittiin, tämän keksinnön tekijät ovat havainneet, että arginiinin sisällyttäminen (argini-15 niumionina) t-PA:ta sisältäviin farmaseuttisiin koostumuksiin parantaa merkittävästi t-PA:n liukoisuutta ja stabii-lisuutta näissä koostumuksissa. Arginiinipitoisuus voi olla noin 0,02 - 1 mol/1, edullisesti noin 0,05 - 1,0 mol/1 ja edullisemmin noin 0,1 - 0,5 mol/1 annettavassa 20 liuoksessa ja/tai kylmäkuivatun valmisteen ollessa kyseessä, liuoksessa ennen kylmäkuivausta.

Parannetut koostumukset sisältävät lisäksi yhtä tai useampaa ionitonta pinta-aktiivista ainetta, kuten Poly-sorbate 20:ä ja Polysorbate 80:ä tms., noin 0,001 - 1 % t-25 PA:n stabiilisuuden parantamiseksi edelleen. Lisäksi voi vat alan ammattimiesten hyvin tuntemat muut farmaseuttisesti hyväksyttävät jatkeaineet muodostaa osan tällaisista koostumuksista. Näihin voivat kuulua esimerkiksi erilaiset massaa lisäävät aineet, lisäpuskuriaineet, kelatoivat ai-30 neet, hapettumisenestoaineet, säilöntäaineet, rinnakkais- liuottimet tms.; erityisesimerkkeinä tällaisista aineista voisivat olla mannitoli, trometamiinisuolat ("Tris-pusku-ri"), dinatriumedetaatti, gelatiini, ihmisen seerumialbu-miini tai muut polypeptidit, erilaiset pienet peptidit, 35 kuten glysyyliglysiini, jne.

5 £8873

Keksinnön mukaisesti valmistetut t-PA-koostumukset eivät yllättävää kyllä vaadi suurten natriumkloridipitoi-suuksien, ts. vähintään 0,3 mol/1, käyttöä. Suuret kloridi -ionipitoisuudet ovat itse asiassa haitallisia näiden 5 parannettujen koostumusten kylmäkuivattavuuden kannalta. Vaikka jonkinasteiset kloridipitoisuudet ovat siedettäviä, ovat pienet pitoisuudet, ts. alle 0,3 mol/1, edullisia, eikä pitoisuus ole edullisesti suurempi kuin normaali fysiologinen pitoisuus, ts. noin 0,12 mol/1 NaCl:a. Edulli-10 sinta on, ettei koostumus sisällä kloridi-ioneja.

"Farmaseuttisesti tehokas määrä" t-PA:ta on määrä, joka antaa terapeuttisen vaikutuksen erilaisissa anto-ohjelmissa. Voidaan valmistaa tämän keksinnön mukaisia koostumuksia, jotka sisältävät vähintään noin 0,1 ja korkein-15 taan noin 50 mg/ml, edullisesti noin 0,4 - 5 mg/ml, t-PA:ta. Kun näitä koostumuksia annetaan esimerkiksi sydäninfarktipotilaille, ne voivat sisältää noin 0,4-3 mg/ml t-PA:ta, joka vastaa tällaiseen hoitoon nykyisin sopivana pidettävää annostusta.

20 Tämän keksinnön mukaiset koostumukset, kylmäkuiva tut muodot mukaan luettuina, valmistetaan yleensä yhdistämällä komponentit yleisesti käytettävissä olevia, sinänsä tunnettuja lääkkeiden sekoittamismenetelmiä käyttämällä. Samoin käytetään alalla hyvin tunnettuja tavanomaisia kyl-25 mäkuivausmenettelyjä ja -laitteita. Eräs erityismenetelmä t-PA:ta sisältävän farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi on (millä tahansa tavanomaisella proteiinien puhdistusohjelmalla) puhdistetun t-PA:n käyttö missä tahansa monista tunnetuista puskurinvaihtomenetelmistä, kuten gee-30 lisuodatuksessa. Tällä edullisella menetelmällä eristettiin ja puhdistettiin t-PA, jota käytettiin lähtöaineena seuraavissa stabiilisuus- ja liukoisuustutkimuksissa. Edullisessa menetelmässä käytetty t-PA saatiin yhdistelmä-DNA-menetelmin muutetuista kiinanhamsterin munasarjaso-- 35 luista (CHO-soluista), joilla on kyky erittää t-PA-ilmen-tymistuotetta CHO-solujen kasvualustaan.

6 b B B 7 ό Tämän hakemuksen jättäjät ovat keksineet sen selvästi osoitettavissa olevan vaikutuksen, että t-PA:ta sisältävien farmaseuttisten koostumusten biologinen aktiivisuus stabiloituu merkittävästi, kun koostumusten yhtenä 5 komponenttina on argininiumioneja sisältävä puskuri, ja että tällaiset formulat eivät vaadi natriumkloridia ollakseen stabiileja, vaikka pienempiä suolapitoisuuksia kuin 0,3 mol/1 voidaan käyttää. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa kloridi-ionipitoisuus on korkeintaan 0,1 mol/1. 10 Neutraalilla pH-alueella, esimerkiksi pH-alueella noin 6-8, argininiumionin läsnäolo parantaa t-PA:n liukoisuutta siinä määrin, että siitä voidaan valmistaa formuloita, joissa pitoisuudet ovat suhteellisen suuria, jopa ilman suuria stabiloivia suolamääriä, joita on alalla pidetty 15 välttämättöminä.

Termeillä "ihmisen kudosplasminogeenin aktivaat-tori", "ihmisen t-PA" tai "t-PA" tarkoitetaan ihmisen ulkosyntyistä (kudostyyppistä) plasminogeenin aktivaatto-ria, jota saadaan esimerkiksi luonnon lähteistä uuttamalla 20 ja puhdistamalla (katso Collen et ai., supra) ja yhdistel-mäsoluviljelmämenetelmin tässä kuvattavalla tavalla. Sen sekvenssi ja ominaispiirteet esitetään esimerkiksi EP-ha-kemusjulkaisussa 93 619 (julkaistu 9. marraskuuta 1983), joka perustuu 5. toukokuuta 1982 ensimmäisen kerran jätet-25 tyyn hakemukseen ja mainitaan tässä viitteenä. Katso myös EP-hakemusjulkaisu 41 766 (julkaistu 16. joulukuuta 1981), joka perustuu 11. kesäkuuta 1980 ensimmäisen kerran jätettyyn hakemukseen, ja Rijken et ai., Journal of Biol. Chem. 256 (1981) 7035, jotka julkaisut mainitaan tässä myös 30 viitteinä. Näiden termien piiriin kuuluvat myös biologisesti aktiiviset ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattoria vastaavat sekvenssit, joilla on yksi tai useampi erilainen aminohappo kokonaissekvenssissään tai erilainen glykosy-loitumismalli, jonka otaksutaan riippuvan kulloinkin käy-35 tetyistä viljelyolosuhteista ja kudosplasminogeenin aktivaattoria tuottavan isännän luonteesta.

7 t 8 8 7 S

A. Kuviot

Kuvio 1 esittää t-PA:n stabiilisuutta erilaisissa formuloissa.

Kuvio 2 esittää arginiinipitoisuuden vaikutusta 5 t-PA:n liukoisuuteen.

Kuvio 3 esitttää t-PA:n liukoisuusrajoja erilaisten argininiumfosfaattipuskuripitoisuuksien vallitessa pH:n ollessa 6, lämpötilassa 4 'C.

B. Kylmäkuivaus 10 Koostumuksen kylmäkuivaus eli lyofilisointi tehdään käyttämällä alan ammattimiesten hyvin tuntemia menetelmiä ja laitteita. Koostumus jäädytetään tyypillisesti ensin lämpötilaan, joka on sen eutektisen eli luhistumislämpöti-lan alapuolella. Sitten kylmäkuivaimeen imetään alipaine 15 ja sen hyllyille johdetaan lämpöä jään poistamiseksi sublimoi tumisen kautta; hyllyjen lämpötila ja kammiossa vallitseva paine säädetään sellaisiksi, että jäätyneen massan lämpötila pysyy näennäisen eutektisen eli luhistumis-lämpötilan alapuolella, kunnes jää on poistunut suurin 20 piirtein kokonaan. Tämän "primaarikuivausvaiheen" jälkeen hyllyjen lämpötilaa voidaan korottaa edelleen (muuttaen tai muuttamatta kammiossa vallitsevaa painetta), ja kylmäkuivatun kakun jäännöskosteus poistetaan.

C. S-2288-koe 25 Synteettinen peptidisubstraatti, S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilidi x 2HC1) hydrolysoidaan t-PA:lla, jolloin muodostuu värillistä p-nitroaniliinia ja tripeptidiä. Suurin absorbanssiero substraatin ja tuotteen (p-nitroaniliinin) välillä esiintyy aallonpituu-30 della 405 nm. p-nitroaniliininmuodostumista seurataan spektrofotometrisesti mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 405 nm ajan funktiona. Tuloksena oleva käyrä, joka esittää absorbanssia ajan funktiona, on verrannollinen t-PA-aktiivisuuteen. Tämä koe tehdään lämpötilassa 37 ± 35 0,2 °C.

8 18 8 /’ .¾ Tämän määrityksen tekemiseksi lisättiin 20 - 100 μΐ kyseessä olevaa t-PA-näytettä reaktioseokseen (1,2 ml), joka sisälsi 0,33 mmol/1 S-2288:a, 0,067 mol/1 Tris-pusku-ria (pH 7,4) ja 0,07 mol/1 NaCl:a, ja inkuboitiin lämpö-5 tilassa 37 °C 10 min. Absorbanssin muuttumista seurattiin 1 min:n ajan, ja aktiivisuus laskettiin aallonpituudella 405 nm mitatusta absorbanssista käyttämällä seuraavaa, valmistajan standardisoimaa yhtälöä: 10 AOD x 793,65 (laimennustekijä) Aktiivisuus (ky, kansainvälistä yksikköä) = - inkubointiaika x näytteen tilavuus 15 D. Esimerkit

Esimerkki 1

Puhdistettu t-PA laimennettiin loppupitoisuuteen 0,2 mg/ml, jaettiin yhtä suuriksi näytteiksi ja dialysoi-tiin taulukossa 1 esitettyjä puskureita vastaan.

20 Taulukko 1

Dialyysipuskuri, joka sisältää Pitoisuus dialyysissä 0. 01.% Polysorbate 80:a NaCl Arginiini _(hydrokloridlna) 1. 0,01 mol/1 natrium- 25 fosfaattia pH 6 2. 0,01 mol/1 natrium- fosfaattia pH 6 0,12 mol/1 0,2 mol/1 3. 0,01 mol/1 natrium- fosfaattia pH 6 - 0,2 mol/1 30 4. 0,01 mol/1 natrium- asetaattia pH 5 5. 0,01 mol/1 natrium- asetaattia pH 5 0,12 mol/1 0,2 mol/1 6. 0,01 mol/1 natrium- 35 asetaattia pH 5 0,2 mol/1 g

Dialyysin jälkeen näytteet sentrifugoitiin, ja su-pernatantti kylmäkuivattiin 1 ml:n annoksina. Kylmäkuivatut näytteet sekoitettiin takaisin veteen, ja tutkittiin niiden t-PA-aktiivisuus S-2288-määrityksellä. Kukin uudel-5 leenliuotettu näyte laitettiin sitten lämpötilaan 37 'C ja tutkittiin eri pituisten aikojen kuluttua.

Tämän kokeen tulokset esitetään kuviossa 1. Kuten on havaittavissa, arginiinia sisältämättömät systeemit eivät estä t-PA-aktiivisuuden häviämistä ajan mittaan. 10 Näytteissä, jotka sisältävät 0,2 mol/1 arginiinia tai 0,2 mol/1 arginiinia sekä fysiologisia määriä kloridia, säilyy t-PA-alkuaktiivisuus miltei kokonaan inkuboitaessa 4 vrk 37 °C:ssa. Nämä tulokset osoittavat, että arginiini pitoisuutena 0,2 mol/1 NaCl:n kera tai ilman sitä stabiloi mer-15 kittävästi t-PA:ta.

Esimerkki 2 t-PA:n stabiilisuus arginiinipitoisuuden funktiona määritettiin mittaamalla t-PA-aktiivisuuden häviämisnopeus eri lämpötiloissa.

20 Formulat: 1. 0,355 mg/ml t-PA:ta 0,05 mol/1 Na-fosfaattia, pH 6,2 0,05 mol/1 arginiinia hydrokloridina 2. 0,498 mg/ml t-PA:ta 0,03 mol/1 Na-fosfaattia, pH 6,2 25 0,2 mol/1 arginiinia hydrokloridina 0,5 ml:n annoksia edellä mainittujen formuloiden mukaisia liuoksia pakattiin aseptisesti 2 ml:n lasipulloihin, ja suljettiin pullot. Pullot sijoitettiin lämpötiloihin 25, 37 Ja 45 eC. Kutakin liuosta sisältävästä kahdesta 30 pullosta otettiin näytteet päivinä 0, 20, 55 Ja 160, ja mitattiin t-PA-aktiivisuus käyttämällä S-2288-määritystä. Piirrettiin käyrä, joka esittää jäännösaktiivisuuden (%) luonnollista logaritmia ajan funktiona (vrk) kussakin lämpötilassa ja josta laskettiin nopeusvakio käyttämällä li-35 neaarista regressioanalyysiä.

ίο 8 8 8 7 < t-PA-aktiivisuuden häviämisen nopeusvakiot (k) kahdella eri arginiinipitoisuudella ja erilaisissa lämpötiloissa esitetään taulukossa 2.

Taulukko 2 5

Arginiinin vaikutus t-PA:n stabiilisuuteen k (vrk*1)

Formula_Arginiinl 25 aC 37 *C 45 °C

0,05 mol/1 0,05 mol/1 0,00137 0,0102 0,0167 10 Na-fosfaattia, pH 6,2 0,03 mol/1 0,20 mol/1 0,00043 0,00569 0,01272

Na-fosfaattia, pH 6,2 15 Kuten on havaittavissa, nopeusvakiot ovat pienempiä arginiinipitoisuuden ollessa 0,2 mol/1 kuin arginiinipitoisuudella 0,05 mol/1 kussakin lämpötilassa, mikä osoittaa, että arginiinipitoisuuden kasvu parantaa t-PA:n sta-biilisuutta.

20 Esimerkki 3 t-PA:n stabiilisuus riippuu myös ionittomien pinta-aktiivisten aineiden pitoisuudesta. Tulokset esitetään taulukossa 3.

t-PA saostettiin dialysoimalla 0,01 M Na-sukkinaat-25 tipuskuria (pH 6,0) vastaan. t-PA-sakka otettiin talteen dialysoidusta näytteestä sentrifugoimalla. Tämä sakka liuotettiin takaisin alla esitettävään formulaan, joka sisältää Polysorbate 80:ä vaihtelevina pitoisuuksina. Formula: 0,2 mol/1 arginiinia hydrokloridina 30 0,02 mol/1 Na-fosfaattia, pH 7,2

Polysorbate 80:ä (0,0005 - 0,10 %)

Liuokset pakattiin aseptisesti pulloihin, jotka sijoitettiin lämpötiloihin 35 ja 40 °C. Kullakin ajanhet-kellä otettiin kahdesta pullosta näyte, ja mitattiin ent-35 syymiaktiivisuus käyttämällä S-2288-määritystä.

11 £887 5

Nopeusvakiot laskettiin tekemällä lineaarinen regressioanalyysi kumpaakin lämpötilaa vastaavalle käyrälle, Joka esittää t-PA-aktiivisuuden logaritmia ajan funktiona, ja tulokset esitetään taulukossa 3.

5 Taulukko 3

Polysorbate 80:n vaikutus t-PA:n stabiilisuuteen k (vrk-1)

Polysorbate 80

10 (%) 35 °C 40 eC

0,0005 0,0055 0,0106 0,005 0,0049 0,0091 0,01 0,0043 0,0088 15 0,025 0,0040 0,0081 0,05 0,0041 0,0077 0,10 0,0037 0,0075 Tämä taulukko osoittaa, että nopeusvaklo (k) piene-20 nenee Polysorbate 80 -pitoisuuden kasvaessa. Tämä osoittaa, että stabiilisuus paranee Polysorbate 80:n pitoisuutta nostettaessa.

Esimerkki 4 t-PA-liuokset valmistettiin dialysoimalla puhdis-25 tettua t-PA:ta alla esitettävää argininiumfosfaattiformulaa vastaan ja laimentamalla sitten samalla puskurilla haluttuun t-PA:n loppupitoisuuteen.

Formulolntipuskuri: 0,20 mol/1 arginiinia 0,18 mol/1 fosforihappoa .30 0,01 % Polysorbate 80:ä pH 6 Näytteitä kustakin valmisteesta pakattiin 5 tai 10 ml: n pulloihin, kylmäkuivattiin, ja suljettiin pullot. Pullot laitettiin erilaisiin lämpötiloihin. Kullakin ajan-35 hetkellä otettiin näyte kahdesta pullosta formulaa kohden.

12 8 8 8 7 4 ja määritettiin t-PA-aktiivisuus S-2288-määrityksellä. Tulokset esitetään taulukossa 4.

Taulukko 4 5 t-PA:n stabiilisuus kylmäkuivatussa formulassa Jäljellä oleva (%, 2 määrityksen keskiarvo +_ standardipoik- t:-PA * keama

(mg/ml) pH fjfff 5°C_25°C 30°C 35°C 40°C

1.0 6,0 2,0 102 5+0,0 103.3±2,5 - 102.6+3,0 - 10 2.0 6,0 2.0 111 13+0,7 111.1+0,1 - 114,6+2.2 - 5.0 6,0 2,0 112,0+0,3 112,7+0,6 - 112,3+1,4 - 1.0 6,0 3,5 98,2+1,3 — 96,0±1,7 97,7+00,] *

Liuoksen t-PA-pitoisuus ennen kylmäkuivatusta 15 Nämä tulokset osoittavat, että t-PA on stabiili kylmäkuivatussa muodossa.

Esimerkki 5

Liuosta, joka sisälsi t-PA:ta suunnilleen pitoisuutena 0,3 - 0,5 mg/ml, dialysoitiin liuosta vastaan, joka 20 sisälsi 10 mmol/1 natriumfosfaattia, pH 7,5, 0,01 % Poly-sorbate 80:ä ja vaihtelevia pitoisuuksia arginlinia hydro-kloridina. Liukenematon materiaali poistettiin sentrifu-goimalla 2 min Eppendorf-mikrosentrifugissa. Liuoksessa jäljellä oleva t-PA mitattiin S-2288-määrityksellä. Tulok-25 set esitetään kuviossa 2.

Jopa niinkin pieni arginiinipitoisuus kuin 50 mmol/1 parantaa merkittävästi t-PA:n liukoisuutta. (Pienempi näennäisliukoisuuden kasvu suuremmilla arginiinipi-toisuuksilla on keinotekoista ja johtuu siitä, että t-PA:n 30 alkuperäinen pitoisuus lähtöaineessa oli vain 0,3 - 0,5 mg/ml eikä rajaliukoisuutta siten saavutettu milloinkaan).

Esimerkki 6 t-PA seostettiin dialysoimalla 0,001 M natriumsuk-kinaattipuskuria (pH 6) vastaan. Saatu sakka eristettiin 35 sentrifugoimalla, ja tasapainotettiin sitten mitattu mää- 13 8887:^ rä tätä materiaalia 1 ml:ssa haluttua puskurisysteemiä 20 tunnin ajan lämpötilassa 5 °C sekoittaen. Tutkitut pusku-risysteemit valmistettiin titraamalla arginiini fosforiha-polla, jolloin saatiin argininiumfosfaattisysteemi, jonka 5 pH oli 6. Varastoliuokset laimennettiin vedellä lopullisiksi puskuriliuoksiksi, jotka sisälsivät 0,10 - 0,20 mol/1 arginiinia (argininiumionina). Kun tasapainotus halutun puskurisysteemin kanssa oli tehty, t-PA-valmiste sentrifugoitiin mahdollisen liukenemattoman materiaalin 10 poistamiseksi, ja tutkittiin sitten supernatanteista liukoinen t-PA S-2288-määrityksellä.

Tulokset esitetään kuviossa 3. Jos t-PA on täysin liukeneva alunperin lisättynä t-PA-pitoisuutena, pitäisi liuenneen t-PA:n pitoisuuden olla sama kuin lisätyn. Ellei 15 t-PA sen sijaan liukene täysin alunperin lisättynä pitoisuutena, on liuenneen t-PA:n pitoisuus pienempi kuin lisätty. Kuvio 3 osoittaa, että t-PA liukenee 100 mM argi-niinifosfaattiin (pH 6,0) pitoisuuteen noin 2 mg/ml asti ja että liukoisuus paranee huomattavasti arginiinifosfaat-20 tipitoisuuden kasvaessa. t-PA liukenee täydellisesti 200 mM arginiinifosfaattiin (pH 6,0) vielä jopa pitoisuutena 54 mg/ml, ja rajaliukoisuus on huomattavasti tätä suurempi.

Esimerkki 7 25 Valmistettiin kylmäkuivattavaksi liuokseksi seuraa- va argininiumfosfaattisysteemi.

Kylmäkuivattava liuos mg/ml t-PA:ta 2,5 30 L-arginiinia 87,1

Fosforihappoa 26,8

Polysorbate 80:ä 0,1 PH 7.2

Steriilisuodatuksen jälkeen pakattiin noin 20 ml:n 35 annokset 50 ml:n pulloihin. Kylmäkulvaus tehtiin seuraavasti: 14 K 8 h / i a) Pullot laitettiin kylmäkuivaimeen ja pakastettiin -50 ®C:ssa (hyllyn lämpötila) normaalipaineessa 10 tuntia.

b) Kuivaimeen imettiin alipaine (paine kammiossa 5 100 pmHg), ja hyllyn lämpötila nostettiin nopeudella 10 °C/h + 7 eC:seen ja pidettiin sitten tässä arvossa 41 tuntia.

c) Sitten hyllyn lämpötila nostettiin +35 °C:seen, kammiossa vallitseva paine alennettiin 50 pmHg:iin, ja pi- 10 dettiin systeemi näissä olosuhteissa 14 tuntia.

Sitten pullot suljettiin, annettiin paineen palautua normaaliksi, ja poistettiin pullot kylmäkuivaimesta.

Esimerkki 8

Tutkittiin natriumkloridin vaikutusta kylmäkuivat-15 tujen arginiinifosfaattikakkujen laatuun. Valmistettiin näytteitä, jotka sisälsivät 0,8 mol/1 arginiinia (pH 7) ja 0,2 mol/1 arginiinia (pH 6) fosfaattisuoloina sekä nat-riumkloridia pitoisuuksina 0,01 - 500 mmol/1. 2 ml:n annoksia kustakin liuoksesta laitettiin 10 ml:n pulloihin ja 20 kylmäkuivattiin seuraavalla ohjelmalla:

Kylmäkuivaus- Hyllyn lämpötila Paine kammiossa Aika valhe_ _(°C)_ (pm Hg) (tuntia) Jäädytys -45 Ympäristön paine 10

Primaarinen Nosto 20 °C/h 50 24 25 kuivaus -35 °C:een,sitten 3 °C/h + 35 °C: seen

Sekundaarinen +35 40 26 kuivaus

Saatujen kakkujen laatu esitetään taulukossa 5. Tu-30 lokset osoittavat, että farmaseuttisesti hyväksyttäviä kakkuja saadaan vain koostumuksista, jotka sisältävät natrium-kloridia pieninä pitoisuuksina, ja että siedettävä pieni natriumkloridipitoisuus riippuu arginiinipitoisuu-desta.

is 8 8 8 7¾

•H

I 3 s s 8 3 8 .

ί I II U all! C 3 1S S H 1 s 6^-3-5 Itjla I I i * • lli^e Isilfl I I I d § =®-S13 23^2 8 a ί *) si a I o'S’8 3 a an a a § s a 3 3 > g * 3 a -X , E 3 £ 5 a a a a a M x% - jJ -ri nj m to to m to to to m to id to <fl to c J 00 2 § 3 §3 E 3 I 3 I 3 E 3 E 3

tfd 1) » -8 Η Η to iH (3 Η to Ή ιΠιΗ to rH fO

> ό o tP M 9) to to ifl ui ui to tn ro to td to td ld ;nj τ· b

4j CM O

0 <H

-¾ :f0 , , 1 » 8 l g 11 ί § ~o « I § S3*JJ3 S3 ilsSISillill « Ι g 36333¾ as *16*ia*ia*ta

3 « N ä -SllS^pS^p SeSSc^q^SqS

I "· »ll-illill filllMMs 3 g cu-p<i>>-p.x>hj.x >43i2>x3-U>Ä4->>x:-t-> •": 4J to •H 3 , , a 2 to ι ι ί α> ι ι ι

”* φ tO 3 -W -p >, | >il >1 I

(0 -M -H -H HO 33 £o c -2 ^ d 2 3 6 ä ä £ 3 *.ίβ 3 w o 3 3 p 3 Ιο 3 3 33 33 3 3r 3 Si i3 3=8 1=¾ 1:8 ή o-rHGfl jx 13 tu ,χ -P -h ,χ p ,x>hj,x>4J,x>-p i -jiSii^iil^iS i-!rii-i o <0 3s3d:'3 3'^lQ,'r,'3tn RCioicfflHdw to 3 roj 3 3 3 3 :$ nj JJ Η -Η ω rt :¾ 3 -H -H tö ·Η ·Η td -p ‘i -rH H-> J-0.X>>jX>tOrHC>> >>+J>>4J>>H-l 'ϋ to .

•rH tO 2 : .·. Hr* r£

O *H

H c M

JX -H O

b e 3 _ 3 0) -g ^ rl IP § s »— '.: MU ·Η Η T- o --- IrtsL ]j S 2 o o o o o to >1 ni E o o m r- Z to § 3 ‘P T- 16 8 8 874

Alaa kohtalaisesti hallitseville on selvää, että esitettyjä suoritusmuotoja voidaan muuntaa eri tavoin ja että tällaiset muuntamiset on tarkoitettu kuuluviksi tämän keksinnön piiriin.

Claims

17 8 8 8 f S

1. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka sisältää farmaseuttisesti vaikuttavan määrän 5 ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattoria (t-PA), tunnettu siitä, että sekoitetaan keskenään mainittu t-PA ja farmaseuttisesti hyväksyttävää argininiumionipitois-ta puskuria, 0,001 - 1 % ionitonta, pinta-aktiivista ainetta ja mahdollisesti kloridi-ionia pitoisuutena, joka on 10 pienempi kuin 0,3 mol/1.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan koostumus, jonka kloridi-ionipitoisuus ei ole suurempi kuin 0,12 mol/1.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että valmistetaan koostumus, jossa ei ole kloridi-ioneja.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koostumus pakastetaan.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että koostumus kylmäkuivataan.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että argininiumpuskuri on muu kuin argininiumkloridi.

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 6 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että puskuri saadaan aikaan argi- niniumionilla ja vastaionilla, jolla on kyky säätää koostumuksen luhistumislämpötila sellaiseksi, että koostumus on helposti kylmäkuivattavissa.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että vastaioni on fosfaatti- tai sukkinaatti-ioni.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattorin pitoisuus on vähintään noin 0,1 mg/ml ja 35 argininiumionin pitoisuus on noin 0,05 - 1,0 mol/1.

18. R 8 7 R

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattorin pitoisuus on noin 0,4 - 5,0 mg/ml ja argini-niumionin pitoisuus on noin 0,1 -0,5 mol/1.

11. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai nen menetelmä, tunnettu siitä, että koostumuksen pH on noin 4-9. 19 8 8 8 73