FI85334C - Foerfarande foer framstaellning av en vattenbaserad, vaevnadsplasminogenaktivator (t-pa) innehaollande, koncentrerad parenterad loesning. - Google Patents

Description

1 35334

Menetelmä vesipohjaisen, kudosplasminogeeni-aktivaattoria (t-PA) sisältävän, väkevän parenteraalisen liuoksen valmistamiseksi 5 Keksintö koskee menetelmää kudosplasminogeeni- aktivaattorin (t-PA) vesipohjaisen, väkevän, parenteraalisen liuoksen valmistamiseksi.

Otaksutaan, että esiintyy dynaaminen tasapaino ve-rihyytymiä muodostavan entsyymisysteemin - koagulaatio-10 systeemin - ja verihyytymiä hajoittavan entsyymisysteemin - fibrinolyyttisen systeemin - välillä, joka ylläpitää pysyvän ehjän verisuonten ympäristön. Vahingoittuneeseen suoneen muodostuu verihyytymiä verenhukan rajoittamiseksi. Vaurion luonnollisen korjaantumisen jälkeen, tarpeet-15 tomat verihyytymät hajoitetaan fibrinolyyttisen systeemin vaikutuksesta. Silloin tällöin muodostuu verihyytymiä ilman traumaattista vauriota, jotka voivat jäädä tärkeisiin suoniin aiheuttaen osittaisen tai jopa täydellisen verenkierron tukkeutumisen. Kun tämä tapahtuu sydämessä, keuh-20 koissa tai aivoissa, tuloksena voi olla sydänlihaksen salpaus, keuhkotulppa tai halvaus. Nämä taudin tilat ovat yhdessä teollistuneiden maiden johtavia sairautta ja kuolemaa aiheuttavia tekijöitä.

Verihyytymät muodostuvat säikeisestä verkostosta, 25 jota proteolyyttinen entsyymi, plasmiini, voi hajoittaa.

Entsyymi muodostuu inaktiivisesta proentsyymistä, plasmi-nogeenista, joka on veren plasman osatekijä, plasmino-geeniaktivaattorin vaikutuksestä. On olemassa kaksi im-munologisesti erilaista nisäkäsplasminogeeniaktivaatto-30 ria. Sisäinen plasminogeeniaktivaattori, joka myös tunnetaan urokinaasina, on munuaisissa muodostuva entsyymi, ja sitä voidaan eristää virtsasta. Sitä voidaan myös valmistaa useista kudosviljelmälähteistä. Ulkosyntyinen plasminogeeniaktivaattori, joka myös tunnetaan sekä vas-35 kulaarisena plasminogeeniaktivaattorina että kudosplasmi- 2 85334 nogeeniaktivaattorina (t-PA), voidaan eristää monista ku-doshomogenaateista (varsinkin ihmisen kohdusta), verisuonten soluseinämistä ja joistakin soluviljelmistä. Näiden kahden plasminogeeniaktivaattorilajin lisäksi on 5 myös olemassa bakteerituote, streptokinaasi, jota valmistetaan beta-hemolyyttisistä streptokokeista. Sekä uro-kinaasin että streptokinaasin huomattavana haittana on, että ne ovat aktiivisia koko verenkierrossa eikä vain ve-rihyytymien kohdalla. Ne voivat esimerkiksi tuhota muita 10 veren proteiineja, kuten fibrinogeenia, protrombiinia, tekijää V ja tekijää VIII, vähentäen täten veren hyyty-miskykyä ja lisäten verenvuodon riskiä. Tätä vastoin t-PA:n biologinen aktiivisuus on riippuvainen fibriinin läsnäolosta, johon se sitoutuu, ja kohdasta, jossa se ak-15 tivoituu. Maksimaalinen aktiivisuus kehittyy siten vain verihyytymän kohdalla, so. liuotettavan fibriiniverkoston läsnäollessa, jolloin käytännöllisesti katsoen kokonaan vältetään verenvuodon riski.

t-PA:n pääasiallinen antomuoto on suonensisäisenä 20 tiputuksena, joten t-PA:a tulee valmistaa parenteraalise-na liuoksena. Yleensä on toivottavaa, että parenteraali-liuos sisältää lääkeainetta korkeassa konsentraatiossa. Tällöin lääkäri tai eläinlääkäri voi saavuttaa vaadittavan konsentraation joka tilanteessa yksinkertaisesti 25 laimentamalla liuosta, siis lisäämällä liuotinta tai väliainetta. Ei ole myöskään suotavaa antaa suurta liuos-määrää sydän- tai munuaissairautta potevalle potilaalle, koska entisestään rasittaisi sydäntä ja munuaisia. Lääkkeen tilavuus pitäisi siksi pitää mahdollisimman pienenä. 30 Samanaikaisesti jokaisen tämänkaltaisen parenteraalisen liuoksen tulisi olla stabiili sen suhteen, ettei esiinny merkittävää taipumusta lääkkeen saostumiselle liuoksesta säilytyksen tai laimentumisen aikana.

Useita t-PA:n parenteraalisia liuoksia on ylimal-35 kaisesti kuvattu Eurooppa-patenttijulkaisuissa 41 766, il 3 85334 93 619, 112 122, 113 319, 123 304, sekä japanilaisessa patenttijulkaisussa 58-65218 (hakemus 56-163145). Nämä valmisteet ovat t-PA:n vesipohjaisia suolaliuoksia, jotka ovat lähes neutraalit, ja niillä on se haittapuoli, että 5 tPA:n liukoisuus tällaisissa liuoksissa on alhainen ioni-konsentraatiolisän puuttuessa. Tästä johtuen formulaatiot joko ovat t-PA:n suhteen kovin laimeat, eli joissain tilanteissa joudutaan potilaalle antamaan ei-toivotun suuri liuosmäärä, tai ne ovat hypertonisia, jolloin niiden an-10 taminen voi olla haitallinen veren punasoluille.

Nyt on havaittu, että t-PA:n liukoisuutta vesipohjaiseen parenteraaliliuokseen voidaan parantaa, mikäli liuoksen pH on happamalla alueella, ja ettei tämänkaltaisen happaman liuoksen antaminen tuota merkittäviä fysio-15 logisia ongelmia. Täten esillä oleva keksintö antaa vesipohjaisen t-PA:n parenteraaliliuoksen, jonka pH on 2-5.

Parannetun t-PA:n liukoisuuden ansiosta esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettu parenteraalinen liuos voi sisältää suuria t-PA:n konsentraatioita ilman 20 olennaista t-PA:n saostumisen riskiä. Lisäksi on havaittu, että t-PA:n konsentraatio tämänkaltaisessa liuoksessa voidaan helposti alentaa laimentamalla neutraalilla tai happamalla vedellä aiheuttamatta mitään olennaista t-PA:n saostumisen riskiä. Siksi esillä olevan keksinnön mukai-25 sesti saadaan stabiili parenteraalinen liuos, joka suo lääkäreille ja eläinlääkäreille suurempaa joustavuutta sen käsittelyssä ja käytössä.

t-PA, jota käytetään esillä olevassa keksinnössä, voi olla mikä tahansa bioaktiivinen proteiini, joka olen-30 naisesti vastaa nisäkäs-, ja erityisesti ihmisen t-PA:ta, mukaan luettuna glykosyloituja ja ei-glykosyloituja muotoja. Se voi olla yksi- tai kaksiketjuinen t-PA, tai näiden seos, kuten on esitetty Euroopan patenttijulkaisussa 112 122, ja, kuten täydellisesti glykosyloidun ih-35 misen t-PA:n tapauksessa, sen näennäinen molekyylipaino 4 85334 polyakryyliamidigeeleissä on noin 70 000, ja sen isoelek-trinen piste 7,5-8,0. Edullisesti t-PA:n spesifinen aktiivisuus on noin 500 000 IU/mg (kansainvälistä yksik-köä/mg, kansainvälisen yksikön (IV) ollessa aktiivisuuden 5 yksikkö (WHO; National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, Lontoo NW3 6RB, Englanti) .

t-PA:n aminohapposekvenssi vastaa edullisesti olennaisesti kuvion 1 esittämää. Sekvenssi on täten 10 identtinen kuvion 1 esittämän sekvenssin kanssa tai se sisältää alleellista tai muuta alkuperää olevaa yhden tai useamman aminohapon deleetion, substituution, insertion, inversion tai addition, jolloin tuloksena olevalla sekvenssillä on vähintään 80 %:n, ja edullisesti 90 %:n, ho-15 mologia kuvion 1 esittämään sekvenssiin nähden ja säilyttää pääosiltaan samoja proteiinin biologisia ja immunologisia ominaisuuksia. Erityisesti t-PA:n sekvenssi on kuvion 1 esittämän sekvenssin kanssa identtinen tai sillä on sama sekvenssi mutta aminohappo, joka on sekvenssin 20 kohdassa 245 N-terminaalisesta seriinista, on vallini me-tioniinen sijasta, jolloin kummastakin sekvenssistä vaihtoehtoisesti puuttuu jokin ensimmäisestä kolmesta aminohaposta tai kummassakin on vaihtoehtoisesti ylimääräinen polypeptidisekvenssi Gly-Ala-Arg ennen N-terminaalia.

25 Kuvion 1 esittämässä aminohapposekvenssissä on 35 kysteiinijäännöstä ja täten mahdollisuus muodostaa 17 di-sulfidisiltaa. Analogiassa muihin proteiineihin, joiden rakenne (johtuen disulfidisidoksien muodostumisesta) sekvenssin kohdassa 90 olevan aminohapon ja C-terminaalisen 30 proliinin välissä on esitetty kuviossa 2. N-terminaalin rakenne on vähemmän varma vaikka joitakin ehdotuksia on esitetty (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 269-273; ja Proc. Natl. Acad. Sei., 1984, 81, 5355-5359). T-Pa:n rakenteen tärkeimmät ominaisuudet ovat kaksi rinkelimäistä 35 aluetta (92:n ja 173:n aminohapon sekä 180:n ja 261:n ϋ 5 85334 aminohapon välissä), jotka vastaavat proteiinin sitoutumisesta fibriiniin, sekä seriiniproteaasialue, joka muodostaa B-ketjun suurimman osan vastaten plaminogeenin aktivaatiota. Erityisen merkittäviä seriiniproteaasin ami-5 nohappoja ovat katalyyttinen triadi, Hos/Asp/Ser.

t-PA:ssa nämä esiintyvät kohdissa 322, 371 ja 463. Kohtien 264 ja 395 cysteiini-aminohappojäänteiden välinen disulfiidisilta on myös tärkeä, koska se pitää A- ja B-ketjut yhdessä t-PA:n kaksiketjuisessa muodossa.

10 Kuvioissa 1 ja 2 on käytetty tavanomaisia yksi- ja kolmikirjain-koodeja aminohappojäännöksille seuraavasti: Asp D Asparagiinihappo Ile I Isoleusiini

Thr T Treoniini Leu L Leusiini

Ser S Seriini Tyr Y Tyrosiini 15 Glu E Glutamiinihappo Phe F Fenyylialaniini

Pro P Proliini His H Histidiini

Gly G Glysiini Lys K Lusiini

Ala A Alaniini Arg R Arginiini

Cys C Kysteiini Trp W Tryptofani 20 Vai V Väliini Gin Q Glutamiini

Met M Metioniini Asn N Asparagiini t-PA voidaan tuottaa millä tahansa kuvatulla tai sinänsä tunnetulla tavalla. Se voidaan tuottaa esimerkiksi julkaisuissa Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 25 140-153, EP-A-41766 tai EP-A-113319 kuvatusta normaali- tai neoplastisesta solulinjasta. On kuitenkin edullista tuottaa t-PA viljellystä transformoiduista tai tranfek-toidusta solulinjasta, joka on tuotettu yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttäen, kuten esimerkiksi Eurooppa-patentti-30 julkaisuissa 93619, 227059 ja 117060 on kuvattu. On erityisen edullista käyttää julkaisussa Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759 kuvatulla tavalla tuotettuja kiinalaisen hamsterin munasarjasoluja (CHO) t-PA:n tuotantoon. Täten kloonattu geeni kotransfek-35 toidaan yhdessä dihydrofolaattireduktaasia (dhfr) koodit- 6 85334 tavan geenin kanssa dhfr" CHO-soluihin. Transformantit, jotka ilmentävät dhfr, valikoidaan nukleosidivapaalta a-lustalta ja altistetaan kasvaville metotreksaattikon-sentraatioille. Tällöin dhfr ja t-PA-geenit amplifioitu-5 vat yhdessä johtaen stabiiliin solulinjaan, joka pystyy ilmentämään korkeita t-PA-tasoja.

t-PA puhdistetaan edullisesti millä tahansa kuva-menetelmillä, kuten julkaituilla tai sinänsä tunnetuilla suissa Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; 10 J. Biol. Chem. 1979, 254(6), 1998-2003; ibid, 1981, 156 (13), 7035-7041; Eur. J. Biochem, 1983, 132, 681-686; EP-A-41766; EP-A-113 319 tai GB-A-2 122 219 kuvatuilla menetelmillä.

Ei tunnu olevan ylärajaa t-PA:n liukoisuudelle pa-15 renteraalisessa liuoksessa. Erittäin korkeissa kon- sentraatioissa (yli 150 000 000 IU/ml) liuos vain muuttuu viskoosiksi ilman merkittävää t-PA:n saostumista. t-PA:n konsentraatio parenteraalisessa liuoksessa voi siksi vaihdella laajasti, esimerkiksi 50 000-50 000 000 IU/ml. 20 Esillä olevan keksinnön maksimaalisen edun varmistamiseksi on edullista, että t-PA:n konsentraatio on suurempi kuin 100 000 IU/ml, erityisesti suurempi kuin 500 000 IU/ml, ja aivan erityisesti korkeampi kuin 1 000 000 IU/ml. On erityisen edullista, että t-PA:n konsentraatio 25 on noin 5 000 000 IU/ml.

Parenteraalisen liuoksen pH:n yläraja on edullisesti 4,5. Itse asiassa pH on edullisesti 2,5-4,0, edullisemmin 2,8-3,5 ja edullisimmin noin 3,0. Parenteraalisen liuoksen toivottu pH saavutetaan yksinkertaisesti käyttämällä 30 fysiologisesti hyväksyttävää epäorgaanista tai orgaanista happoa. Esimerkkeinä tämänkaltaisista hapoista ovat suolahappo, rikkihappo ja typpihappo, sekä sitruunahappo, viinihappo ja bentseenisulfonihappo. Näistä edullisin on suolahappo.

35 Vaikka jotkut fysiologisesti hyväksyttävät liuot- I: 7 85334 timet voivat vaihtoehtoisesti esiintyä veden lisäksi, on edullista, että parenteraalisen liuoksen väliaine on kokonaisuudessaan tai olennaisesti vesipohjainen.

Parenteraalinen liuos voi olla hypertoninen, hypoto-5 ninen tai isotoninen potilaan veren seerumiin nähden. Ei-toivottujen sivuvaikutuksien välttämiseksi parenteraalinen liuos on edullisesti isotoninen, vaikkakaan pienet poikkeamat eivät tuota suurempaa fysiologista haittaa. Olennaisesti isotoninen parenteraalinen liuos saavutetaan 10 sisällyttämällä fysiologisesti hyväksyttävä aine, joka pystyy nostamaan liuoksen tonisuutta vaadittavalle tasolle. Esimerkit tämänkaltaisista aineista ovat sinänsä hyvin tunnettuja; näitä ovat dekstroosi (anhydridi- tai mo-nohydraattimuodossa) ja natriumkloridi sekä näiden seok-15 set. Aineen konsentraatio parenteraalisessa liuoksessa vaihtelee luonnollisesti ainekohtaisesti. Natriumkloridin tapauksessa konsentraatio on edullisesti 7-10 mg/ml, ja erityisen edullisesti noin 8,5 mg/ml (fysiologinen suolaliuos) . Anhydrididekstroosin tapauksessa konsentraatio on 20 edullisesti 30-70 mg/ml ja erityisen edullisesti noin 50 mg/ml. Jos t-PA:n konsentraatiota olennaisesti isotonisessa parenteraalisessa liuoksessa pitää alentaa, on edullista suorittaa laimennus saman aineen saman kon-sentraation omaavalla vesiliuoksella, jotta saadaan olen-25 naisesti isotoninen liuos.

Parenteraalinen liuos voi vaihtoehtoisesti sisältää tämänkaltaisissa formulaatioissa tavallisesti käytettyjä lisäaineita. Esimerkkinä on ihmisen seerumialbumiini. Lisäksi t-PA:lla on taipumus tarttua lasi- ja muovipin-30 töihin, ja siksi voi olla toivottavaa sisällyttää pinta-aktiivinen aine parenteraaliseen liuokseen tämänkaltaisen adsorption estämiseksi ja minimoimiseksi. Esimerkkeinä tämänkaltaisesta aineesta ovat sorbitolianhydridin osittaisten rasvahappoestereiden polyoksietyleenijohdannai-35 set, kuten kauppanimellä "Tween 80" markkinoitu aine.

8 85334

Yksi esillä olevan keksinnön yllättävä etu, t-PA:n olennaisesti lisääntyneen liukoisuuden lisäksi on, että hapan parenteraalinen liuos tässä määritettyjen pH-rajo-jen sisällä, ei tunnu tuottavan merkittävää haitallista 5 fysiologista vaikutusta annettaessa potilaalle. Vaikuttaa siltä, että verenkierto yleensä pystyy nostamaan liuoksen pH:n noin 7:ään melkein välittömästi sen antamisen jälkeen, ja siten t-PA nopeasti leviää verenkiertoon. On kuitenkin edullista, ettei tätä tapahtumaa ole olen-10 naisesti estetty millään tavalla, ja että parenteraalinen liuos ei sisällä vahvasti puskuroivaa ainetta. Kuitenkin heikosti puskuroiva aine, joka ei merkittävästi estä tätä tapahtumaa, voidaan sisällyttää, ja happamalla pH:11a t-PA itse toimii heikkona puskuroivana aineena. Lisäksi 15 ihmisen seerumialbumiini voi toimia heikosti puskuroivana aineena.

Olennaisesti lisääntyneen t-PA:n liukoisuuden johdosta ei esillä olevan keksinnön mukaiseen parenteraali-seen liuokseen ole tarvetta sisällyttää lisäaineita, ku-20 ten lysiinia tai ornitiinia tai näiden suolaa, t-PA:n liukoisuuden parantamiseksi.

Parenteraalinen liuos voidaan valmistaa tavanomaisten lääkeformulointimenetelmien ja -tekniikoiden mukaisesti käyttäen t-PA:ta puhdistetun liuoksen muodossa tai 25 kiinteässä muodossa. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että (i) tuotetaan puhdistettu, väkevä t-PA-liuos ja vaihdetaan väliaine vesipohjaiseen, jonka pH on 2-5, tai (ii) liuotetaan t-PA vesipohjaiseen väliaineeseen, 30 jonka pH on 2-5, jonka jälkeen steriloidaan saatu liuos.

t-PA:n puhdistus voi viimeisenä vaiheena käsittää proteiinin eluution kromatografipylväästä vahvasti puskuroivaa ainetta sisältävänä liuoksena. Kuten aikaisemmin 35 mainittiin, on edullista, ettei parenteraalinen liuos si- 9 85334 säliä vahvasti puskuroivaa ainetta; edullinen tapa puskuroivan aineen poistamiseksi väliainetta vaihtaessa on käyttää dialyysiä. Tämä voidaan suorittaa käyttämällä dialyysiletkuja tai keinomunuaista, jossa puhdistettu 5 liuos dialysoidaan vesipohjaista väliainetta vastaan pH-arvossa 2-5. Voi olla toivottavaa, varsinkin jos t-PA:n konsentraatio puhdistetussa liuoksessa on suuri, ensiksi säätää liuoksen pH arvoon 2-5. Toinen tapa vahvasti puskuroivan aineen poistamiseksi vaihtaessa väliainetta on 10 alistaa puhdistettu liuos geelisuodatukseen ja kehittää pylväs vesipohjaisella väliaineella pH-arvossa 2-5.

t-PA seostetussa kiinteässä muodossa voidaan edullisesti saada puhdistetusta liuoksesta säätämällä pH noin 5,5:een, jäähdyttämällä liuos juuri jäätymispisteen 15 yläpuolelle, ja ottamalla proteiini talteen esimerkiksi sentrifugoimalla. Saostettu kiinteä aine voidaan tämän jälkeen liuottaa vesipohjaiseen väliaineeseen, jonka pH on 2-5, tavanomaisella tavalla.

Saatu liuos voidaan steriloida tavanomaisin menetel-20 min esimerkiksi suodatus-steriloinnin avulla.

Parenteraalinen liuos säilytetään tavallisesti suljetuissa, steriileissä muovi- tai lasisäiliöissä. Se voidaan myös sisällyttää kerta-annosmuotoihin, kuten ampulleihin, pulloihin tai kertakäyttöisiin ruiskuihin, tai 25 moniannosmuotoihin, kuten infuusipusseihin tai -pulloi hin. Liuostilavuus tällaisissa pakkauksissa voi vaihdella suuresti, mutta tarkoituksenmukaista on 0,5-20 ml.

t-PA:n biologinen aktiivisuus liuottaessa verihyyty-mien fibriiniverkostoa on johtanut sen käyttöön tromboot-30 tisten sairauksien hoidossa (The Lancet, 7. marraskuuta 1981, 1018-1020; ibid., 13. huhtikuuta 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 1984, 310(10), 609-613; ja ibid. 1985, 312(14), 932-936).

Esillä olevaa keksintöä voidaan siten käyttää nisäk-35 käiden tromboottisen sairauden hoitoon. Erityiset esimer- 10 8 5334 kit tromboottisesta sairaudesta ovat alalla tunnettuja ja käsittävät esim. sydänlihaksen salpauksen, sydänlaskimo-tromboosin, keuhkoembolian ja halvauksen.

Parenteraalisen liuoksen pääasiallinen antomuoto on 5 suonensisäinen, erityisesti laskimonsisäinen infuusio, vaikka muitakin mahdollisia antomuotoja, kuten lihaksensisäinen antomuoto, voidaan käyttää. Suonensisäiset in-fuusiot suoritetaan normaalisti käyttämällä infuusiopus-siin tai -pulloon säilöttyä parenteraalista liuosta, tai 10 käyttämällä sähkökäyttöistä infuusioruiskua. Liuos voidaan toimittaa infuusiopussista tai -pullosta potilaalle painovoiman avulla tapahtuvalla infuusiolla tai in-fuusiopumppua käyttäen. Painovoiman syötöllä toimivan in-fuusiosysteemin käyttö ei anna riittävää parenteraali-15 sen liuoksen antonopeuden kontrollia, ja siksi on edullista käyttää infuusiopumppua, erityisesti jos käytetään liuoksia, jotka sisältävät suhteellisen korkeita t-PA:n konsentraatioita. Edullisempaa on kuitenkin käyttää sähkökäyttöistä infuusioruiskua, jonka avulla saadaan 20 vieläkin parempi antonopeuden säätö.

Vaikuttava määrä t-PA:ta tromboottista sairautta potevan nisäkkään hoitoon riippuu useista tekijöistä, kuten esimerkiksi nisäkkään iästä ja painosta, vamman laadusta ja sen vaikeusasteesta, ja antomuodosta, ja on viime kä-25 dessä hoitavan lääkärin tai eläinlääkärin harkinnan varassa. On kuitenkin todennäköistä, että vaikuttava määrä esimerkiksi sepelvaltimotulpan liuottamiseen on yleisesti suuruusluokka 150 000 - 450 000 IU/kg potilaan ruumiinpainoa tunnissa. Täten vaikuttava määrä tunnissa 70 kg 30 painavalle ihmiselle on yleisesti 10 000 000 - 30 000 000 IU, erityisesti noin 20 000 000 IU, ja tätä määrää voidaan antaa joko aloitusannoksen jälkeen tai ilman aloitusannosta. On myös todennäköistä, että annos tulee olemaan pienempi joissakin tromboottisissa tiloissa, kuten 35 laskimotromboosin tapauksessa ja akuutissa halvauksessa, 11 85334 tai yksinkertaisesti jo uudelleenavatun sepelvaltimon aukipitämiseen. Näissä tapauksissa vaikuttava määrä on yleensä 7 000 - 36 000 IU/kg (potilaan paino) tunnissa.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä, eikä niitä 5 pidä tulkita keksintöä rajoittavina.

Esimerkki 1

Kirkastettu t-PA:n näyte (eristetty transformoidun CHO-solulinjan viljelmästä, joka tuotettiin käyttämällä julkaisussa Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 10 1750-1759 kuvattua menetelmää) puhdistettiin kromatogra- fisesti ja t-PA kerättiin talteen vesipohjaisena liuoksena, joka sisälsi 0,1 mol/1 natriumsitraattia ja 0,01 % (p/t) Tween 80:a pH-arvossa 5,5. Liuoksen pH säädettiin 3,0:een suolahapolla ja saatu liuos väkevöitiin ultrasuo-15 dattamalla (H-10 Cartridge-väkevöintilaite; Amicon Ltd.,

Upper Mill, Stonehouse, Gloucestershire, Englanti). Täten saatiin väkevöity, puhdistettu t-PA:n vesipohjainen liuos (2 500 ooo IU/ml), joka sisälsi 0,1 mol/1 natriumsitraattia, 0,12 mol/1 natriumkloridia (suolahapon lisäyksen 20 johdosta) sekä 0,01 % (p/t) Tween 80:a, ja jonka pH oli 3,0. Liuos täytettiin dialyysiletkuihin, joiden molekyylipainoraja oli noin 14 000 ja dialysoitiin +4° C:ssa 4 kertaa 50 tilavuutta suodatus-steriloitua fysiologista suolaliuosta vastaan (0,85 % (p/t) natrium-25 kloridia, joka sisälsi 0,01 % Tween 80:a ja jonka pH oli säädetty 3,0:een väkevällä suolahapolla). Jokainen dia-lyysivaihe kesti 12 tuntia. Vesiliuos suodatussteriloi-tiin talteenoton jälkeen ja laimennettiin fysiologisella suolaliuoksella lopulliseen konsentraatioon 500 000 IU/ml 30 t-PA:n suhteen. Saatu parenteraalinen liuos täytettiin lasipulloihin, jotka suljettiin, pakastettiin ja säilytettiin -20° C:ssa.

Esimerkki 2

Kirkastettu t-PA:n näyte, eristetty viljellystä 35 transformoidusta CHO-solulinjasta, joka tuotettiin käyt- i2 85334 tämällä julkaisussa Molecular and Cellular Biology, 1985,5(7), 1750-1759 kuvattua menetelmää, puhdistettiin kromatografisesti ja t-PA kerättiin talteen vesipohjaisena liuoksena, joka sisälsi 0,1 mol/1 natriumsitraat-5 tia ja 0,01 % (p/t) Tween 80:a pH-arvossa 5,5. Liuoksen pH säädettiin 3,0:een suolahapolla ja saatu liuos väke-vöitiin ultrasuodattamalla (H-10 Cartridge-väkevöintilai-te; Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, Englanti). Väkevöity vesiliuos puhdistettiin lisäksi gee-10 lisuodatuspylväässä (Sephadex G-150: Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Ruotsi) ja eluoitiin 0,85 %:lla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,01 % (p/t) Tween 80:ä ja jonka pH oli 3,0. Täten saatiin erittäin puhdas t-PA:n vesi-liuos, jota vielä kerran väkevöitiin käyttämällä ker-15 takäyttöistä keinotekoista munuaista. t-PA seostettiin liuoksesta nostamalla pH 5,5:een natriumhydroksidilla ja seisottamalla suspensiota +4° C:ssa 2 tuntia. t-PA otettiin talteen sentrifugoimalla 4000 x g 30 minuuttia. t-PA-sakka liuotettiin uudelleen natriurokloridiliuokseen 20 (0,85 %) (p/t), joka sisälsi 0,01 % (p/t) Tween 80:ä, ja pH säädettiin 3,0:een suolahapon avulla. Suolaliuosta käytettiin vaadittava määrä, jolla saavutettiin t-PA:n konsentraatio 7 500 000 - 10 000 000 lU/ml. Tämä t-PA-liuos laimennettiin natriumkloridiliuoksella (0,85 %; 25 p/t), joka sisälsi 0,01 % (p/t) Tween 80:ä, ja pH säädet tiin 3,0:een suolahapon avulla, sekä myös tarvittavalla määrällä 10-% mannitolia samassa happamassa suolaliuoksessa, jotta saatiin lopulliset konsentraatiot 500 000 IU/ml t-PA:ta ja 25 mg/ml mannitolia. Saatu liuos suoda-30 tus-steriloitiin ja jaettiin 1 ml:n määränä lasipulloi hin, jotka pakastettiin ja säilytettiin -20 °C:ssa.

Esimerkki 3

Esimerkin 1 mukaisen parenteraaliliuoksen trombo-lyyttinen vaikutus arvioitiin kaulalaskimon tromboosin in 35 vivo-mallissa.

li i3 8 5 334 (a) Menetelmä

Kokeessa käytetty menetelmä oli olennaisesti sama kuin Collen et ai.:n kuvaaama (J. Clin. Invest., 1983., 71, 368-376).

5 Esimerkin 1 mukainen parenteraalinen liuos sulatet tiin ja laimennettiin steriilillä isotonisella suolaliuoksella, jonka pH-arvo oli 3,0 ja joka sisälsi 0,01 % Tween 80:a, jotta saatiin tarvittava määrä liuosta 2 tunnin 500 000 IU/kg infuusiota varten t-PA:ta. Infuusio talo pahtui kanyylin kautta oikeanpuoleiseen reisilaskimoon. Kokeessa käytettiin kolme Uuden Seelannin valkoista kaniinia. Infuusion jälkeen trombolyysiaste arvioitiin.

(b) Tulokset

Trombolyysiprosentti oli 22,3±4,2 osoittaen täten 15 esimerkin 1 mukaisen parenteraaliliuoksen trombolyyttisen vaikutuksen. Lisäksi mitään vasta-reaktiota ei todettu liuoksen infuusion aikana.

Claims (7)

1. Menetelmä t-PA:n vesipohjaisen, väkevän paren-teraalisen liuoksen valmistamiseksi, tunnettu 5 siitä, että (i) tuotetaan puhdistettu, väkevä t-PA-liuos ja vaihdetaan väliaine vesipohjaiseen, jonka pH on 2-5, tai (ii) liuotetaan t-PA vesipohjaiseen väliaineeseen, jonka pH on 2-5, 10 jonka jälkeen steriloidaan saatu liuos.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että parenteraalisen liuoksen sisältämän t-PA:n konsentraatio on noin 5 000 000 kansainvälistä yksikköä/ml.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että parenteraalisen liuoksen pH on 2-5.

4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että parenteraalisen liuoksen pH 20 on noin 3,0.

5. Patenttivaatimusten 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että parenteraalinen liuos sisältää pinta-aktiivisen aineen.

6. Patenttivaatimusten 1-5 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että parenteraalinen liuos on olennaisesti puskuroimaton.

7. Patenttivaatimusten 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että parenteraalinen liuos sisältää sellaisen määrän natriumkloridia, että se on olen- 30 naisesti isotoninen ihmisen veren seerumin suhteen. i, is 85334