DK163174B - Vandig koncentreret parenteral oploesning af vaevs-plasminogenaktivater (t-pa) og fremgangsmaade til fremstilling heraf - Google Patents

Description

DK 163174 B

Den foreliggende opfindelse angår en koncentreret vandig opløsning af en vævs-plasminogen-aktivator (t-PA)-opløsning til anvendelse i human og veterinærmedicinen, og dennes fremstilling.

5 · Det formodes, at der er en dynamisk ligevægt mellem det enzymsystem, der er i stand til at danne størknet blod, koagulationssystemet, og det enzymsystem, der er i stand til at opløse størknet blod, det fibronolytiske system, som bevarer et intakt åbent 10 blodkarvæv. Til begrænsning af blodtabet fra læsioner dannes størknet blod i de læderede kar. Efter naturlig heling af læsionen opløses det overflødige størknede blod ved indvirkning af det fibrinolytiske system. Af og til dannes størknet blod uden traumatiske læsioner.

15 Dette kan afsættes i større blodkar, hvilket resulterer i delvis eller endog total blokering af blodstrømningen. Når dette sker i hjertet, lungerne eller hjernen, kan resultatet være en myokardial infarkt, pulmonær emboli eller slagtilfælde. Disse anfald er sammen hoved-20 årsagen til sygelighed og dødelighed i de industrialiserede lande.

Størknet blod består af et fibrøst netværk, der kan opløses ved hjælp af det proteolytiske enzym, plas-min. Enzymet opnås ud fra det inaktive proenzym, plas-25 minogen, der er en komponent af blodplasma, ved indvirkning af en plasminogen-aktivator. Der findes to immunologisk forskellige plasminogen-aktivatorer hos pattedyr eller mennesker. Intrinsic plasminogen-aktivator, der også er kendt som urokinase, er et enzym, 30 der dannes i nyrerne og kan isoleres fra urinen. Det kan også fremstilles ud fra en række vævskulturkilder. Ekstrinsic plasminogen-aktivator, der også er kendt som vaskulær plasminogen-aktivator og som vævs-plasminogen-aktivator (t-PA), kan isoleres fra mange vævshomogena-35 ter (især human uterus), blodkarcellevæggene og fra nogle cellekulturer. Foruden disse to slags plasmino-

DK 163174B

2 gen-aktivatorer, findes der også et bakterielt produkt, . streptokinase, fremstillet ud fra β-hæmolytiske streptokokker. En hovedulempe ved både urokinase og streptokinase er, at de er aktive gennem hele kredsløbet og 5 ikke kun på stedet for størknet blod. De kan f.eks. ødelægge andre blodproteiner, såsom fibrinogen, prothrombin, faktor V og faktor VIII og således reducere blodets størkningsevne og forøge risikoen for blødninger. Derimod er den biologiske aktivitet af t-PA af-10 hængig af tilstedeværelsen af fibrin, hvortil det bindes, og hvor det aktiveres. Den maksimale aktivitet udvikles således kun på stedet for størknet blod, dvs. i tilstedeværelse af fibrinnetværket, der skal opløses, og herved undgås risikoen for blødning i stor udstræk-15 ning.

Hovedadministreringsvejen for t-PA er intrava-skulær infusion, hvortil der kræves formulering af t-PA som en parenteral opløsning. Det er i almindelighed ønskeligt, at en parenteral opløsning indeholder medi-20 kamentet i en høj koncentration, fordi lægen eller dyrlægen således er i stand til at opnå den krævede koncentration af medikamentet i enhver given siutation, blot ved at fortynde præparatet i yderligere opløsningsmiddel eller medium. Det er desuden ikke tilråde-25 ligt at administrere et stort volumen af en opløsning til en patient med en hjerte- eller nyrelidelse, idet det vil bringe hjertet eller nyrerne under endnu større belastning. Volumenet skal derfor holdes på et minimum ved anvendelse af et mere koncentreret præparat. Sam-30 tidig skal enhver sådan parenteral opløsning være stabil i den betydning, at medikamentet ikke har nogen væsentlig tendens til at fælde ud af opløsningen, hverken ved opbevaring eller under fortynding.

En række parenterale opløsninger af t-PA har væ-35 ret beskrevet generelt f.eks. i de offentliggjorte EP-patentansøgninger nr. 41.766, nr. 93.619, nr. 112.122,

DK 163174 B

3 nr. 113.319 og nr. 123.304 og japansk patentskrift nr. 57-120.523 (ansøgning nr. 56-6936) og nr. 58-65.218 (ansøgning nr. 56-163.145). Præparaterne er vandige saltopløsninger af t-PA, som har omtrent neutral pH-5 værdi og har den ulempe, at opløseligheden af t-PA i sådanne opløsninger er lav uden en forøgelse af ionkoncentrationen. Følgelig indeholder præparaterne enten t-PA i lave koncentrationer, hvilket i nogle tilfælde nødvendiggør administrering af uhensigtsmæssigt store 10 volumener opløsning til en patient, eller de er hyper-toniske, hvilket kan være skadeligt for de røde blodlegemer ved administrering. Fra EP 23.860 kendes en fremgangsmåde til at oprense t-PA, ved at binde t-PA specifikt til fibrinfragmenter, og herefter udvaske 15 t-PA ved et pH på 4,2. Dette skrift angår imidlertid ikke parenterale opløsninger, og vaskevandet indeholdende t-PA, bliver indstillet til pH 7,4 inden det lyo-filiseres.

Det har nu vist sig, at opløseligheden af t-PA i 20 en vandig parenteral opløsning kan forøges, hvis opløsningens pH-værdi er i det sure område, og at den sure pH-værdi af en sådan opløsning, ikke giver nogle væsentlige fysiologiske problemer ved administrering. Følgelig tilvejebringes der ifølge den foreliggende op-25 findelse en vandig koncentreret parenteral opløsning af t-PA, der er ejendommelig ved, at den har en pH-værdi fra 2 til 5.

Som et resultat af den forøgede opløselighed af t-PA, kan den parenterale opløsning ifølge den forelig-30 gende opfindelse opnå høje koncentrationer af t-PA uden nogen væsentlig risiko for udfældning af t-PA'en fra opløsningen. Desuden har det vist sig, at koncentrationen af t-PA i sådanne opløsninger let kan reduceres ved genfortynding med surt eller neutralt vand uden no-35 gen væsentlig risiko for udfældning af t-PA'en. Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der derfor

DK 163174 B

4 en stabil parenteral opløsning, der muliggør større fleksibilitet ved dens håndtering og anvendelse af læger og dyrlæger.

t-PA'en, der anvendes ifølge den foreliggende 5 opfindelse, kan være et hvilket som helst biologisk aktivt protein, der i det væsentlige svarer til t-PA fra pattedyr og især mennesker, herunder former med og uden glycosylering. Det kan være en- eller to-kædet t-PA eller en blanding deraf, som beskrevet i den offentlig-10 gjorte EP-patentansøgning nr. 112.122, og i tilfælde af helt glycosyleret humant t-PA har det en molekylvægt på polyacrylamidgeler på ca. 70.000 og et isoelektrisk punkt på mellem 7,5 og 8,0. t-PA'en har fortrinsvis en specifik aktivitet på ca. 500.000 IU/mg (Internationale 15 enheder/mg, den internationale enhed er en aktivitetsenhed, som defineret af WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, London, NW3 6RB, G.B).

Aminosyresekvensen af t-PA svarer fortrinsvis i 20 det væsentlige til den der er angivet i figur 1. Sekvensen er således identisk med sekvensen i figur 1 eller omfatter en eller flere aminosyreudeladelser, -substitutioner, -indføjelser, inverteringer eller tilføjelser af allel oprindelse, eller med andre ord har den 25 resulterende sekvens mindst 80%'s, fortrinsvis 90%'s homologi med sekvensen i figur 1, og den bibeholder i det væsentlige de samme biologiske og immunologiske egenskaber for proteinet. Især er t-PA-sekvensen identisk med sekvensen i figur 1, eller den har samme se-30 kvens, men med aminosyren valin i 245-stilling fra den serin-N-terminale ende i stedet for methionin, idet hver sekvens eventuelt kan være uden en hvilken som helst af de første tre aminosyrer eller eventuelt have en yderligere polypeptid-N-terminal presekvens af Gly-35 Ala-Arg.

Aminosyresekvensen angivet i figur 1 indeholder

DK 163174 B

5 35 cysteingrupper, og der er således mulighed for dannelse af 17 disulfid broer. På basis af analogi med andre proteiner, hvis struktur er bestemt mere detaljeret, er den postulerede struktur (der fremkommer ved 5 dannelse af disulfidbindinger) for sekvensen mellem aminosyren i 9O-stilling og den prolin-C-terminale ende angivet i figur 2. Strukturen af den N-terminale region er mindre sikker, skønt nogle forslag har været fremsat (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 269-273; og 10 Proc. Natl. Acad._ Sci., 1984, £1, 5355,5359). De vigtigste træk ved strukturen af t-PA er de to kringleregioner (mellem aminosyre nr. 92 og nr. 17 3 og mellem aminosyre nr. 180 og 261), som er ansvarlige for bindingen af proteinet til fibrin, og serinproteaseregio-15 nen, der omfatter hovedparten af B-kæden, og som er ansvarlig for aktiveringen af plasminogen. Aminosyrerne af særlig vigtighed i serinproteaserne er den katalytiske triade, His/Asp/Ser. I t-PA forekommer denne ved 322-, 371- og 463-stillingerne. Disulfidbroen mellem 20 cysteinaminosyrerne med nr. 264 og 395 er også vigtig, idet den holder A- og B-kæderne sammen i den to-kædede form af t-PA.

I figur 1 og 2 er de sædvanlige en- og tre-bogstavkoder anvendt for aminosyrer-grupperne som følger: 25

Asp D Asparaginsyre Ile I Isoleucin

Thr T Threonin Leu L Leucin

Ser S Serin Tyr Y Tyrosin

Glu E Glutaminsyre Phe F Phenylalanin 30 Pro P Prolin His H Histidin

Gly G Glycin Lys K Ly s in

Ala A Alanin Arg R Arginin

Cys C Cystein Trp W Tryptohan

Val V Valin Gin Q Glutamin 35 Met M Methionin Asn N Asparagin

DK 163174 B

6 t-PA'en kan. opnås ved en hvilken som helst af de kendte eller beskrevne fremgangsmåder. For eksempel kan det opnås ud fra en normal eller neoplastisk cellelinie af den art, der er beskrevet i Biochimica et 5 Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; offentliggjorte EP-patentansøgning nr. 41.766 eller EP-patentansøgning nr. 113.319. Det foretrækkes imidlertid, at t-PA'en opnås ud fra en dyrket, transformeret eller transfice-ret cellelinie, der er frembragt ved anvendelse af re-10 kombinant-DNA-teknologi, f.eks. som beskrevet i offent liggjorte EP-patentansøgning nr. 93.619, EP-patentan-søgning nr. 117.059 eller EP-patentansøgning nr. 117.060. Det foretrækkes især at anvende kinesiske hamsterovarieceller (CHO-celler) til fremstilling af 15 t-PA, hvilke celler opnås på den måde, der er beskrevet i Molekular og Cellular Biologi, 1985, 5(7), 1750-1759.

På denne måde transficeres det klonede gen sammen med genet, der koder for dihydrofolatreduktase (dhfr) til dhfr”CHO-celler. Transformanter, der eksprimerer dhfr, 20 udvælges på medier, der mangler nucleosider og udsættes for stigende koncentrationer af methotrexat. dhfr- og t-PA-generne forstærkes således sammen til en stabil cellelinie, der kan eksprimere store mængder t-PA.

t-PA'en renses fortrinsvis ved anvendelse af en 25 hvilken som helst af de beskrevne eller kendte fremgangsmåder indenfor teknikken, såsom fremgangsmåderne beskrevet i Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J. Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid, 1981, 256(13), 7035-7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 30 681-686; offentliggjorte EP-patentansøgning nr. 41.766; offentliggjorte EP-patentansøgning nr. 113.319 eller offentliggjorte GB-patentansøgning nr. 2.122.219.

Der synes ikke at være nogen øvre grænse for opløseligheden af t-PA i den parenterale opløsning. Ved 35 meget høje koncentrationer, som f.eks. større end 150.000.000 IU/ml (internationale enheder/ml) bliver

DK 163174 B

7 opløsningen blot viskos uden nogen væsentlig udfældning af t-PA. Koncentrationen af t-PA i den vandige opløsning kan derfor variere indenfor vide grænser, f.eks. fra 50.000 til 50.000.000 IU/ml. Til sikring af den 5 maksimale fordel ved den foreliggende opfindelse, foretrækkes det, at koncentrationen af t-PA er større end 100.000 IU/ml, fortrinsvis større end 500.000 IU/ml, helst større end 1.000.000 IU/ml. Det mest foretrukne er, at koncentrationen af t-PA er større end 5.000.000 10 IU/ml.

Den øvre grænse for den parenterale opløsnings pH-værdi er fortrinsvis 4,5. pH-værdien er faktisk fortrinsvis i området fra 2,5 til 4,0, mere foretrukket fra 2,5 til 3,8 og helst ca. 3,0. Den parenterale op-15 løsnings ønskede pH-værdi opnås hensigtsmæssigt ved anvendelse af en fysiologisk acceptabel uorganisk eller organisk syre. Eksempler på sådanne syrer omfatter saltsyre, svovlsyre og salpetersyre, og citronsyre, vinsyre og benzensulfonsyre. Af disse foretrækkes 20 saltsyre.

Skønt nogle fysiologisk acceptable opløsningsmidler eventuelt kan være tilstede sammen med vandet, foretrækkes det, at mediet for den vandige opløsning er helt eller i det væsentlige vandigt.

25 Den parenterale opløsning kan være hypertonisk, hypotonisk eller isotonisk med patientens blodserum.

Til undgåelse af uønskede bivirkninger er den parenterale opløsning imidlertid fortrinsvis isotonisk, skønt mindre afvigelser ikke er af stor fysiologisk betyd-30 ning. En i det væsentlige isotonisk parenteral opløsning kan opnås ved inkorporering af et fysiologisk acceptabelt middel, der er i stand til at øge opløsningens saltspænding til det ønskede niveau. Eksempler på et sådant middel er velkendte indenfor fagområdet, og 35 omfatter dextrose (i en vandfri eller monohydratform) og natriumchlorid og blandinger deraf. Koncentrationen

DK 163174 B

8 af midlet i den parenterale opløsning vil selvfølgelig variere fra middel til middel. For natriumchlorid er koncentrationen fortrinsvis fra 7 til 10 mg/ml, helst ca. 8,5 mg/ml, ved hvilken koncentration opløsningen 5 ofte betegnes som fysiologisk saltopløsning eller fysiologisk saltvand. For vandfri dextrose er koncentrationen fortrinsvis fra 30 til 70 mg/ml, helst ca. 50 mg/ml. I det tilfælde, t-PA-koncentrationen i en i det væsentlige isotonisk parenteral opløsning skal reduce-10 res, foretrækkes det at udføre denne fortynding med en vandig opløsning af samme middel i samme koncentration for at bevare opløsningen isotonisk.

Den parenterale opløsning kan eventuelt indeholde sådanne additiver, der normalt er knyttet til præpa-15 rater af denne type. Eksempler omfatter humant serumalbumin. Desuden har t-PA en tendens til at adsorbere til glas-og plastoverflader, hvorfor det kan være ønskeligt, at inkorporere et overfladeaktivt middel i den parenterale opløsning til hindring eller minimering af 20 en sådan adsorption. Eksempler på et sådant middel omfatter polyoxyethylenderivater af partielle fedtsyreestere af sorbitolanhydrider, som dem der markedsføres under varemærket "TweeiiD 80" .

En af de overraskende fordele ved den forelig-25 gende opfindelse, bortset fra den væsentligt forøgede opløselighed af t-PA, er at anvendelsen af en sur parenteral opløsning, med en pH-værdi indenfor grænserne defineret heri, ikke synes at give nogle væsentlige negative fysiologiske virkninger ved administrering til 30 patienten. Det ser ud til at blodstrømmen i almindelighed er i stand til at øge opløsningens pH-værdi til neutral værdi, næsten så hurtigt, der er skabt kontakt, og at t-PA'en hurtigt fordeles i blodstrømmen. Det foretrækkes imidlertid, at denne proces i det væsentlige 35 ikke hæmmes på nogen måde, og at den parenterale opløsning ikke indeholder en stærk puffer. En svag puffer,

DK 163174 B

9 der ikke væsentlig hæmmer denne proces, kan imidlertid inkorporeres, og i det sure område virker t-PA faktisk selv som en svag puffer. Desuden er humant serumalbumin i stand til at virke som en svag puffer.

5 På grund af den væsentlig forøgede opløselighed af t-PA i den parenterale opløsning ifølge opfindelsen er der ikke behov for at inkorporere yderligere materiale, såsom lysin eller ornithin eller et salt deraf, til forøgelse af t-PA'ens opløselighed.

10 Den parenterale opløsning kan fremstilles ifølge sædvanlige farmaceutiske formuleringsmetoder under anvendelse af t-PA i form af en renset opløsning eller et renset fast stof. Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der derfor en fremgangsmåde til frem-15 stilling af en vandig koncentreret parenteral opløsning af t-PA, som er ejendommelig ved, at man: (i) opnår en renset opløsning af t-PA og udbytter mediet med et vandigt medium med en pH-værdi fra 2 til 5, eller 20 {ii) opløser t-PA i et vandigt medium med en pH-værdi fra 2 til 5, og steriliserer den opnåede opløsning.

Rensningen af t-PA kan som et sluttrin omfatte eluering af proteinet fra en chromatografisk kolonne 25 som en opløsning indeholdende en stærk puffer. Som nævnt tidligere foretrækkes det, at den parenterale opløsning ikke indeholder en stærk puffer. En hensigtsmæssig metode til at fremkalde dens fjernelse under udskiftning af mediet er derfor at anvende dialyse. Den-30 ne kan udføres ved anvendelse af dialyserør eller en kunstig nyre, i hvilket den rensede opløsning dialyseres mod et vandigt medium, hvori pH-værdien er fra 2 til 5. Det kan være ønskeligt, især hvis t-PA koncentrationen i den rensede opløsning er høj, først at ind-35 stille opløsningens pH-værdi, således at den er fra 2 til 5. Andre metoder til fremkaldelse er fjernelse af

DK 163174 B

10 en stærk puffer under udskiftning af mediet er at udsætte den rensede opløsning for gelfiltrering og eluere kolonnen med et vandigt medium, hvori pH-værdien er fra 2 til 5.

5 t-PA i form af et udfældet fast stof, kan for trinsvis opnås ud fra en renset opløsning ved indstilling af pH til ca. 5,5, afkøling af opløsningen til lige over dens frysepunkt og udvinding af proteinet, f. eks. ved centrifugering. Det udfældede faste stof kan 10 dernæst opløses i et vandigt medium med en pH-værdi fra 2 til 5 på sædvanlig måde.

Sterilisationen af den opnåede opløsning kan udføres på sædvanlig måde, f.eks. ved steril-filtrering.

Den parenterale opløsning foreligger normalt i 15 lukkede, sterile plast- eller glasbeholdere. Den kan også foreligge i enhedsdosisformer, såsom ampuller, hætteglas eller engangsinjectionsanordninger, eller multidosisformer, såsom infusionsposer eller -flasker. Volumenet af opløsningen, der foreligger i sådanne be-20 holdere, kan variere i vid udstrækning, men er hen sigtsmæssigt fra 0,5 til 20 ml.

Til stabilisering af t-PA'en fryser man fortrinsvis den parenterale opløsning og holder den ved -10 til -30°C.

25 Den biologiske virkning af t-PA til opløsning af fibrinnetværket i størknet blod har ført til dets anvendelse ved behandling af thrombotiske lidelser (The Lancet, 7. November, 1981, 1018-1020; ibid., 13. April 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 30 1984, 310(10), 609-613; og ibid., 1985, 312(14), 932- 936). Der tilvejebringes ved opfindelsen derfor en vandig, parenteral opløsning af t-PA, som defineret tidligere, til anvendelse indenfor human- eller veterinær-medicin, især til anvendelse ved behandling af en 35 thrombotisk lidelse.

Specifikke eksempler på en thrombotisk lidelse

DK 163174B

11 er kendte for fagfolk, men omfatter myokardiel infarkt, dyb venethrombose, pulmonær emboli og slagtilfælde.

Hovedadministreringsvejen for t-PA er intrava-skulær, især intravenøs, infusion, skønt andre mulige 5 administreringsveje, såsom intramuskulær administre ring, kan anvendes. Intravaskulære infusioner udføres normalt med den parenterale opløsning indeholdt i en infusionspose eller -flaske eller i en elektrisk drevet infusionssprøjte. Opløsningen kan tilføres til patien-10 ten fra infusionsposen eller -flasken ved hjælp af gra-vitetstilførsel eller ved anvendelse af en infusionspumpe. Anvendelsen af gravitetstilførsels-infusionssystemer giver ikke tilstrækkelig kontrol over administreringshastigheden for den parenterale opløsning, 15 hvorfor det foretrækkes at anvende en infusionspumpe, især ved opløsninger indeholdende relativt høje t-PA-koncentrationer. Det mest foretrukne er imidlertid at anvende en elektrisk drevet infusionssprøjte, som giver endnu større kontrol over administreringshastigheden.

20 Den effektive mængde t-PA til behandling af et pattedyr eller menneske med en thrombotisk lidelse vil selvfølgelig afhænge af en række faktorer, herunder f. eks. menneskets eller pattedyrets alder og vægt, den givne tilstand, der kræver behandling, dens alvorlighed 25 og administreringsvejen, og den vil i den sidste ende være den tjenestgørende læge eller dyrlæges valg. Det er imidlertid sandsynligt, at en effektiv mængde til lyse, f.eks. af en coronararterie-thrombus i almindelighed vil være i området fra 150.000 til 450,000 IU/kg 30 legemsvægt af patienten pr. time. For et voksent menneske på 70 kg. vil en effektiv mængde således pr. time i almindelighed være fra 10.000.000 til 30.000.000 IU, især ca. 20.000.000 IU, og denne mængde kan administreres med eller uden en forbehandlingsdosis, der letter 35 virkningen af t-PA. Det er også sandsynligt, at dosen vil være mindre for nogle thrombotiske lidelser, såsom 12

DK 163174B

dyb venethrombose og akut slagtilfælde, eller for blot at bevare åbenheden af en coronararterie, hvori der allerede igen er blodgennemstrømning. I disse situationer vil en effektiv mængde i almindelighed være fra 5 7.000 til 36.000 iu/kg legemsvægt af patienten pr. ti me.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de følgende eksempler.

10 Eksempel 1

En klaret høst af t-PA opnået ud fra en dyrket, transformeret CHO-cellelinie, som var opnået ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Molekular og Cellular 15 Biology, 1985,5(7), 1750-1759, blev renset chromatogra-fisk, og t-PA'en blev opsamlet som en vandig opløsning indeholdende 0,1M natriumcitrat og 0,01% (vægt/vol)

Tweei^ 80 ved en pH-værdi på 5,5. Opløsningens pH-værdi blev indstillet til 3,0 med saltsyre, og den opnåede 20 opløsning blev opkoncentreret ved ultrafiltrering ved anvendelse af en H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England). Således opnåedes en koncentreret renset vandig opløsning af t-PA (2.500.000 IU/ml), indeholdende 0,1M natriumci-25 trat, 0,23M natriumchlorid (hidrørende fra tilsætning af saltsyre) og 0,01% (vægt/vol) Tweer^ 80 og med en pH-værdi på 3,0. Denne opløsning blev placeret i dialyserør med en molekylvægt-afskæringsværd i på ca.

14.000 og dialyseret ved 4°C mod 4 portioner af 50 vo-30 lumener steril, filtreret fysiologisk saltvand (0,85% (vægt/vol) natriumchlorid) indeholdende 0,01% (vægt/-vol) Tweeri^ 80 og indstillet til pH 3,0 med koncentreret saltsyre. Man lod hvert dialysetrin løbe i 12 timer. Efter udtagelse af den vandige opløsning fra dia-35 lyseposen, blev den steril-filtreret og fortyndet med fysiologisk saltvand til at indeholde 500.000 IU/ml

DK 163174B

13 t-PA. Den opnåede parenterale opløsning blev dernæst filtreret ned i hætteglas, som blev lukket og frosset og opbevaret ved -20°C.

5

Eksempel 2

En klaret høst af t-PA opnået ud fra en dyrket, transformeret CHO-cellelinie, som var opnået ved anven-10 delse af fremgangsmåden ifølge Molekular og Cellular Biology, 1985,5(7), 1750-1759, blev renset chromatogra-fisk, og t-PA'en blev opsamlet som en vandig opløsning indeholdende 0,17M natriumcitrat og 0,01% (vægt/vol)

Tweer@ 80 ved en pH-værdi på 5,5. Opløsningens pH-vær-15 di blev indstillet til 3,0 med saltsyre, og den opnåede opløsning blev opkoncentreret ved ultrafiltrering ved anvendelse af en H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England). Den koncentrerede vandige opløsning blev renset yderligere ved 20 anbringelse på en gelfiltreringskolonne (Sephadej^ G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Sverige) og eluering med 0,85%'s saltopløsning indeholdende 0,01% (vægt/vol) Tweeii^SO ved en pH-værdi på 3,0. Der opnåedes således en i høj grad renset vandig opløsning af 25 t-PA, som blev opkoncentreret en gang mere ved anvendelse af en kunstig nyre. t-PA'en blev fældet ud af opløsningen ved forøgelse af pH-værdien til 5,5 med natriumhydroxid og opbevaring af suspensionen ved 4°C i 2 timer. t-PA*en blev udvundet ved centrifugering ved 30 4.000 x g i 30 minutter ved 4°C. t-PA-pillen blev gen opløst i en vandig opløsning af natriumchlorid (0,85% (vægt/vol)) indeholdende 0,01% (vægt/ vol) Tweer^ 80 og indstillet til pH 3,0 med saltsyre. Volumenet af den anvendte saltopløsning var det der krævedes til opnåel-35 se af en koncentration af t-PA på mellem 7.500.000 IU/ml og 10.000.000 IU/ml. t-PA opløsningen blev for-

DK 163174B

14 tyndet med yderligere vandig opløsning af natriumchlor-id (0,85% (vægt/vol)) indeholdende 0,01% (vægt/vol)

Tweeri§) so og indstillet til pH 3,0 med saltsyre og med tilstrækkeligt af en opløsning af 10% (vægt/vol) manni-5 tol i den samme sure saltopløsning til opnåelse af endelige koncentrationer på 5.000.000 IU/ml t-PA og 25 mg/ml mannitol. Den opnåede opløsning blev steril-filtreret og fordelt i volumener på 1 ml i hætteglas, som blev frosset ned til og opbevaret ved -20°C.

10

Eksempel 3

Den thrombolytiske effektivitet af den parente-rale opløsning ifølge Eksempel 1 blev bedømt ved en in 15 vivo model af halsvenethrombose.

(a) Fremgangsmåde.

Den eksperimentelle fremgangsmåde fulgte i det 20 væsentlige den fremgangsmåde, der er beskrevet af Collen et al (J. Clin. Invest., 1983, 71, 368-376).

Den parenterale opløsningt ifølge Eksempel 1 25 blev optøet og fortyndet med sterilt isotonisk saltvand, indstillet til pH 3,0 og indeholdende 0,01% Tweeii^ 80. Der tilvejebragtes herved en parenteral opløsning til en 2-timers infusion af 500.000 IU/kg af t-PA. Infusionen skete via en 30 kanyle i den højre femorale vene. Fire New

Zealand hvide kaniner blev anvendt ved denne undersøgelse. Efter infusionen bestemtes thrombo-lysegraden.

DK 163174 B

15 (b) Resultater:

Den procentvise thrombolyse var 22,3 ± 4,2, hvilket således viser den thrombolytiske virk-5 nlng af den parenterale opløsning ifølge Eksem pel 1. Desuden opserveredes ingen skadelige reaktioner med denne opløsning.

Claims (7)

1. Vandig, koncentreret parenteral opløsning af vævs-plasminogenaktivator, t-PA, kendetegnet ved, at den har en pH-værdi på fra 2 til 5.

2. Parenteral opløsning ifølge krav 1, ken detegnet ved, at koncentrationen af t-PA er ca. 5.000.000 iD/ml.

3. Parenteral opløsning ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at den har en pH-værdi på 10 ca. 3,0.

4. Parenteral opløsning ifølge krav 1 til 3, kendetegnet ved, at den indeholder et overfladeaktivt middel.

5. Parenteral opløsning ifølge krav 1 til 4, 15 kendetegnet ved, at den er i det væsentlige fri for puffer.

6. Parenteral opløsning ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at den indeholder natriumchlorid i en i det væsentlige isoto- 20 nisk koncentration.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en koncentreret parenteral opløsning ifølge et vilkårligt af kravene l til 6, kendetegnet ved, at man (i) opnår en renset opløsning af t-PA og udbytter 25 mediet med et vandigt medium med en pH-værdi fra 2 til 5, eller (ii) opløser t-PA i et vandigt medium med en pH-værdi fra 2 til 5, og steriliserer den opnåede opløsning. 30