HU200695B

HU200695B - Process for producing stable pharmaceutical compositions comprising tissural plasminogene activator

Info

Publication number: HU200695B
Application number: HU862239A
Authority: HU
Inventors: Henry Berger; Michael Denis Johnston
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1985-05-28
Filing date: 1986-05-27
Publication date: 1990-08-28
Also published as: ES8706443A1; IT1191925B; CA1297008C; SE8602404L; DE3617753C2; GB8612781D0; AU5796586A; NO862095L; ES555352A0; SE8602404D0; FR2593393A1; GB2176703B; FR2593393B1; DK163174B; HUT42330A; GR861365B; DE3617753A1; GB2176703A; SE462893B; BE904831A

Description

A találmány tárgya eljárás szöveti plazminogén aktivátort tartalmazó nagy töménységű, stabil, parenterális gyógyászati készítmények előállítására, amelyek a humán- és állatgyógyászat területén alkalmazhatók.

A véralvadék kialakítására képes enzimrendszer - azaz a koagulációs rendszer—és az ép, szabad vérpályát biztosító, véralvadékot oldó enzimrendszer— azaz a fibrinolitikus rendszer között feltehetően dinamikus egyensúly áll fenn. A sérüléseknél a vérveszteség megakadályozására a sérült véredényekben véralvadék képződik. A sérülés természetes gyógyulása után a felesleges véralvadék a fibrinolitikus enzimrendszer működése következtében feloldódik. Előfordulhat azonban, hogy külső sérülés nélkül is keletkezik véralvadék, amely a fő véredényekbe kerülhet, és ezáltal részben vagy teljesen elzárhatja a véráramlást Ha ez a szívben, tüdőben vagy agyban következik be, szív-infarktus, tüdő-embólia vagy gutaütés lehet a következménye. A fenti okok együttesen a legfőbb betegséget és halált okozó tényezők az iparilag fejlett országokban.

A vérrögök fibrin-hálóból állnak, amelyet a plazmin nevű proteolitikus enzim képes oldani. Az enzim az inaktív proenzimből, a vérplazma egyik komponensét alkotó plazminogénből keletkezik, egy plazminogén-aktivátor hatására. Két, immunológiáikig megkülönböztethető emlős plazminogén-aktivátor van. A belső (inherens) plazminogén aktivátor — amely urokináz néven is ismert — a vesében termelődik és a vizeletből izolálható. A külső (exogén) plazminogén aktivátor, más néven vaszkuláris plazminogén aktivátor vagy szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) számos szövet-homogenizátumból — például emberi méhszövetből — ér-sejtfalból és bizonyos sejttenyészetekből izolálható. A fenti kétfajta plazminogén aktivátoron kívül egy bakteriális eredetű termék, a streptokináz is létezik, amelyet β-hemolizáló streptococcusokból izoláltak. A fenti két urokináz és a streptokináz közös nagy hátránya, hogy az egész keringésben, és nemcsak a vérrög kialakulásának helyén fejtik ki hatásukat így például más vérproteineket - fibrinogént, protrombint, V. faktort és

VIII. faktort is tönkretehetnek, ezáltal csökken a vér alvadási képessége és nő a vérzékenység veszélye. Ezzel szemben a t-PA biológiai aktivitása a fibrin jelenlététől függ, amelyhez kötődik, és ott aktiválódik. A maximális aktivitás így csak a véralvadás helyén, azaz a feloldandó fibrinháló jelenlétében jön létre, és így a vérzékenység veszélye nem áll fenn.

A t-PA-t főleg intravaszkuláris infúzió formájában alkalmazzák, így a t-PA-t parenterális oldattá kell formálni. Általában kívánatos, hogy a parenterális oldatok a hatóanyagot nagy koncentrációban tartalmazzák. Ennek ráta az, hogy az ilyen oldatból bármely adott helyzetben további oldószer vagy közeg hozzáadásával egyszerű hígítással elkészítheti az orvos vagy az állatorvos a kívánt koncentrációjú oldatot. Másrészről nem tanácsos szív- vagy vese-betegségben szenvedő betegnek nagy oldat-térfogatokat adagolni, mivel ezzel a szivet vagy vesét még nagyobb igénybevételnek tennénk ki. Ezért a koncentreáltabb oldatok alkalmazásával az infúziós oldat térfogatát a lehető legkisebbre kell csökkenteni. Ugyanakkor a parenterális oldatnak stabilnak is kell lennie, vagyis a hatóanyagnak nem szabad kicsapódni az oldatból sem raktározás közben, se a hígítást művelet során.

A t-PA-t hatóanyagként tartalmazó parenterális oldatok általában az A-41.766., A-93.619., A112.122., A-113.319., A-123.304. számú európai szabadalmi leírások, továbbá az 65-6936 és 56163145. számú, 57-120523., illetve 58-65218. számon közrebocsátott japán szabadalmi leírásrác ismertetik. A fenti készítmények a t-PA vizes sóoldattal készült oldatai, amelyek pH-ja közel semleges, és hátrányuk, hogy a t-PA oldhatósága ilyen körülmények között alacsony, ion-erősséget növelő anyagrác távollétében. Ennek következtében a fenti ismert készítmények vagy alacsony koncentrációban tartalmazzák a t-PA-t, ezért bizonyos esetekben nagy térfogatban kell azokat adagolni a betegnek, vagy hipertóniások, ami a vörös-vértestekre káros lehet az alkalmazáskor.

Találmányunk azon a felismerésen alapul, hogy a t-PAoldhatósága vizes parenterális oldatban növelhető, ha az oldat pH-ja a savas tartományba esik, és hogy alkalmazáskor az oldat savassága nem okoz jelentős fiziológiai problémákat. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárással előállított vizes parenterális t-PA-oldat pH-ja 2 és 5 közötti pH-tartományban van.

A találmány szerinti eljárással előállított parenterális oldatban a t-PA fokozott rádékonysága következtében a t-PA nagy koncentrációban van jelen, annak veszélye nélkül, hogy a t-PA az oldatból kicsapódna. Ezenkívül azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított, a t-PA-t nagy koncentrációban tartalmazó oldatot semleges vagy savas pH-jú vízzel is hígíthatjuk, ha a t-PA koncentrációját csökkenteni kívánjuk anélkül, hogy azzrá a t-PA kicsapódását idéznénk elő. A találmány szerinti eljárással előállított parenterális oldat tehát stabil, amely az orvosok vagy állatorvosok számára könnyebben kezelhető, mint az ismert készítmények.

A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítményben a t-PA bármely, lényegében emlős, különösen humán t-PA-nak megfelelő biológiailag aktív protein lehet, akár glükozilált, akár glükozilálaílan formában. Lehet egy- vagy kétláncú t-PA, vagy ezek elegye, amint azt az A-l 12.122. számú európai szabadalmi leírásban ismertették, és teljesen glükozilált humán t-PA esetén látszólagos mrátőmege prái(akril-amid) gélen 70.000, és izoelektromos pontja 7,5-8,0. A t-PA specifikus aktivitása közel előnyös 500.000NE/mg [NE, azaz nemzetközi egység, amelyet a WHO National Institute fór Biological Standards and Control (Holly Hitt, Hampstead, London, NW3 6RB, Nagy-Britannia) definiált],

A t-PA aminosav-szekvenciája lényegében az 1. ábra szerinti szekvenciának felel meg, azaz vagy az

l.ábra szerinti, vagy egy vagy több allél-eredetű vagy egyéb aminosav-kiesést, -szubsztitúciót, -beillesztést, -inverziót vagy -addíciót tartalmaz oly módon, hogy a kapott szekvencia legalább 80%-ban, előnyösen 90%-ban homológ az 1. ábra szerinti szekvenciával, és lényegében megtartja a protein biológiai és immunológiai tulajdonságait. Közelebbről, a t-PA szekvenciája azonos az 1. ábrán látható szekvenciával, vagy attól annyiban tér el, hogy az N-terminális szerintól a 24S. aminosav medonin helyett valin, mimelleit adott esetből a szekvenciából az első három aminosav bármelyike hiányozhat, vagy az N-termi-2HU 200695 Β nálison egy Gly-Ala-Arg többlet-szekvenciát is tartalmazhat a peptid.

Az 1. étet szerinti polipeptidben 35 cisztein-maradék van, igy 17 diszulfid-híd kialakítására van lehetőség. Más, részletesen felderített szerkezetű proteinek analógiájára alapozva a diszulfid-kötés kialakulásából kiindulva a 90-es helyzetű aminosav és a C-terminális prolin közötti szekvencia feltételezett szerkezete a 2 ábra szerinti. Az N-terminális rész szerkezete kevbésbé világos, noha már arról is ismertettek néhány elképzelést [Progress in Fibrinolysis, ó, 269-273 (1983); és Proc. Naü. Acad. Sci. SÍ, 53555359 (1984)]. A t-PA szerkezetének legfontosabb jellemzője az a két Jtringle régió (a 92 és a 173. aminosav, és a 180. és 261. aminosavak között), amely a protein fibrinhez kötődéséért felelős, és a szerin-proteáz régió, amely a B-lánc legnagyobb részét magában foglalja, és amely a plazminogén aktiválásért felelős. A szerin-proteázokban különleges fontosságú aminosavak a His/Asp/Ser katalitikus triád, amelyek a t-PA-ban a 322,371. és 463. helyzetben fordulnak elő. A 264. és 395. cisztein aminosav-maradékok közötti diszulfid-híd is fontos, mert ez tartja össze a tPA A- és B-láncát a t-PA kétláncú formájában.

Az 1. és 2 ábrán az aminosav-maradékok jelölésére a szokásos egy, illetve hárombetűs kódokat használjuk, az alábbiak szerint

Asp	D	azsparaginsav	Cys	C	cisztein
Thr	T	treonin	Val	V	valin
Ser	S	szerin	Met	M	metionin
Ghi	E	glutamin	He	I	izoleucin
Pro	P	prolin	Tyr	Y	tirozin
Gly	G	glicin	Phe	F	fenilalanin
Ala	A	alanin	His	H	hisztidin
Lys	K	lizin	Trp	W	triptofán
Leu	L	leucin	Gin	Q	glutamin
Arg	R	argnin	-Asn N	aszparagin

A t-PA-t az ismert eljárások bármelyikével előállíthatjuk. például kinyerhetjük normál vagy rákos sejttenyésrétekből [Biochim et Biophys. Acta 580. 140-153 (1979); A-41.766., vagy A-l 13.319. számú európai szabadalmi leírások]. A t-PA-t előnyösen rekombináns DNS-technika alkalmazásával nyert transzformált vagy transzferált sejtvonal tenyészetéből állítjuk elő, például az A-93.619., A-117.059. vagy A-l17.060. számú európai szabadalmi leírásokban ismertetett módon. Különösen előnyös, ha a t-PA termelésére kínai hörcsög ovárium (CHO) sejteket használunk, amelyet a [Molecular and Cellular Biology 5(7), 1750-kl759 (1985)] szerint állítunk elő. Ekkor a klónozott gént a dihidrofolát-reduktázt kódoló génnel (dhfr) kontranszfektálva visszük a dhfr' CHO sejtekbe. A dhfr-t expresszáló transzformált sejteket nukleozidoktól mentes táptalajon szelektáljuk, és növekvő koncentrációjú metotrexáttal kezeljük. A dhfr és t-PA gének igy egyesülnek és olyan stabil sejtvonalat eredményeznek, amelynek t-PA termelő képessége igen magas.

At-PA-telőhyösen ismert módon tisztítjuk [például Biochim. et Biophys. Acta 52Q, 140-153 (1979); J. Bioi. Chem. 254(6), 1998-2003 (1979); J. Bioi. Chem. 256(13), 7035-7041 (1981); Eur. J. Biochem. 122681-686 (1983); A-41.766., A-113.319. számú európai vagy A-2.122219. számú nagy-britanniai szabadalmi leírások].

Úgy tűnik, hogy a t-PAoldékonyságának nincs felső határa a parenterális oldatban. Igen nagy koncentrációkban —150.000.000NE/ml-nél magasabb koncentrációban—az oldat csak viszkózussá válik, anélkül, hogy a t-PA jelentős mértékben kicsapódna. A tPA koncentrációját a parenterális oldatban így széles határok között változtathatjuk, például az 50.00050.000.000 NE/ml lehet A találmány szerinti eljárás előnyének maximális kihasználására a t-PA koncentrációját 100.000 NE/ml-nél nagyobbra, közelebbről 500.000 NE/ml-nél nagyobbra, legelőnyösebben 1.000.000 NE/mnl-nél nagyobbra választjuk. A legelőnyösebb, ha a t-PA koncentrációja közel 5.000.000 NE/ml.

A parenterális oldal pH-értékének felső határa előnyösen 43. Az oldat pH-ja előnyösen 23-4,0, még előnyösebben 23-33. legelőnyösebben 3,0. Aparenterális oldat kívánt pH-értékét célszerűen fiziológiailag elfogadható szervetlen vagy szerves savakkal— például hidrogén-kloriddal, kénsavval, salétromsavval; illetve citromsavval, borkősavval vagy benzolszulfonsawal — állítjuk be. A fenti savak közül előnyösen hidrogén-klaridot használunk.

Noha az oldatban bizonyos fiziológiailag elfogadható társ-oldószerek is jelen lehetnek, a parenterális oldat közege előnyösen teljes egészében vagy lényegében víz.

A parenterális oldat a beteg vérszérumával hipertóniás, hipotoniás vagy izotoniás lehet A nemkívánatos mellékhatások elkerülésére az oldat előnyösen izotoniás, noha kis eltéréseknek nincs nagy fiziológiás jelentőségük. Lényegében izotoniás parenterális oldatot egy olyan fiziológiailag elfogadható anyag bevitelével állíthatunk elő, amely képes az oldat tonicitását a kívánt szintre növelni. A fenti anyag ismert módon például dextróz (vízmentes vagy monohidrát formában), nátrium-klorid, vagy ezek elegye lehet Az anyag koncentrációja a parenterális oldatben természetesen az alkalmazott anyag minőségétől függően változik. Nátrium-klorid esetén a koncentráció előnyösen 7-10 mg/ml, legelőnyösebben 83 mg/1, ez utóbbi koncentrációt gyakran a fiziológiás sóoldat koncentrációjának is nevezik. Vízmentes dextróz esetén a koncentráció előnyösen 30-70 mg/ml, legelőnyösebből 50 mg/ml. Abban az esetben, ha a t-PA koncentrációját a lényegében izotoniás parenterális oldatban csöltkentenikell, a hígítást ugyanazon anyag ugyanazon koncentrációjú vizes oldatával végezzük előnyösen, így az oldat izotóniás marad.

A parenterális oldata fenti típusú gyógyszerkészítményekből szokásosan alkalmazott adalékanyagokat is tartalmazhat, példaként a humán szérumalbumint említhetjük. Ezenkívül, mivel a t-PA hajlamos üvegés műanyagfelületekhez adszorbeálódni, az adszorpció csökkentésére vagy elkerülésére a parenterális oldat célszerűen felületaktív szert is tartalmazhat Felületaktív szerként például a szorbit-anhidrid részleges zsírsav-észtereinek poli(oxi-etilén)-származékait használhatjuk, például a Tween 80 néven kereskedelmi forgalomban lévő anyagot

A t-PA lényegesen megnövekedett oldékonyságán kívül a találmány meglepő előnye, hogy a fent megadott pH-értékek közé eső, savas parenterális oldat hasznáata nem okoz semmiféle káros fiziológiai hatást a betegben. Úgy tűnik, hogy a véráram általában 3

-3HU 200695 Β képes az oldat pH-ját semlegesre növelni, szinte azonnal, ahogy azzal érintkezik, mivel a t-PA gyorsan eloszlik a véráramban. Előnyös, ha ezt a folyamatot semmi nem gátolja, így a parenterális oldat nem tartalmaz erős pufferanyagot Gyenge pufferoló hatású anyag — amely ezt a folyamatot nem gátolja jelentősen — lehet a készítményben, valójában savas pH-η a t-PA maga fejt ki gyenge pufferhatásL Ezenkívül a humán szérum-albumin is képes gyenge pufferhatás kifejtésére.

Mivel a t-PA oklékonysága a találmány szerinti eljárással előállított parenterális oldatban igen nagy, nincs szükség egyéb anyagokkal—például lizinnd, omitinnel, vagy ezek sóival — növelni a t-PA oldhatóságát.

A parenterális oldatot a gyógyszerkészítésben szokásosan használt formálási eljárásokkal állíthatjuk elő, a t-PA-t tisztított oldata formájában vagy szilárd anyagként használva. A találmány szerinti eljárással a t-PA-t hatóanyagként tartalmazó vizes parenterális oldatot úgy állítjuk elő, hogy (a) az ismert módon előállított t-PA-ból ismert módon készített tisztított oldat közegét pH 2-5 értékű vizes közegre cseréljük; vagy (b) a t-PA-t 2-5 pH-jú vizes közegben oldjuk, majd a kapott oldatot sterilizáljuk.

Vizes közegként előnyösen egy fiziológiásán elfogadható szervetlen só — például nátrium-klorid — vizes oldatát használjuk.

A t-PA tisztítását a protein kromatográfiás oszlopról való eluálásának utolsó fázisaként hajthatjuk végre, amikoris a proteint erős puffért tartalmazó oldat formájában kapjuk. Mint említettük, a parenterális oldat előnyösen nem tartalmaz erős pufferanyagot, ezért azt célszerűen dialízissel távolítjuk el, miközben a közeget is kicseréljük. A dialízist dializáló csőben vagy mesterséges vesében hajthatjuk végre, amelyben a tisztított oldatot 2-5 pH-jú vizes közeggel szemben dializáljuk. Célszerűen úgy járunkl el - különösen akkor, ha a t-PA koncentrációja a tisztított oldatban magas —, hogy először az oldat pH-ját állítjuk 2-5 értékre. Az erős puffer eltávolításának másik módja a közeg egyidejű kicserélésével az, hogy a tisztított oldatot gélszűrésnek vetjük alá, és az oszlopot 2-5 pH-jú vizes közeggel eluáljuk.

A tisztított oldatból úgy állíthatunk elő szilárd formájú t-PA-t, hogy a tisztított oldat pH-ját küzd 5,5re állítjuk, az oldatot fagyáspontja körüli hőmérsékletre hütjük, és a kicsapódott proteint—például centrifugálással—kinyerjük. Akicsapódott sziláid anyagot ezután a szokásos módon feloldhatjuk egy 2-5 pH-jú vizes közegben.

A kapott oldatot ismert módon — például szűréssel —sterilizálhatjuk.

A parenterális oldatot rendszerint leforrasztott, steril műanyag vagy üveg tartóban szereljük ló. A parenterális oldatból egység-dózis formákat — például ampullákat, csöveket vagy egyszer felhasználásra szánt injekciós eszközöket —, vagy többszöri dózist tartalmazó formákat — például infúziós tartályokat vagy üvegeket — is készíthetünk A fend tartókban az oldat térfogata tág határok között változtatható, előnyösen 0,5 és 20 ml között lehet.

A t-PA stabilizálására a parenterális oldatot előnyösen megfagyasztjuk és -10 és -30*C közötti hő4 mérséklete táfpljücA t-PA-t—a vérrögök fibrinhálóját oldó biológiai aktivitása következtében — trombózisos betegségek kezdésére használhatjuk [The Láncét, 1981. november 7., 1018-1020*. ugyanitt 1985. április 13., 842847; The New England Journal of Medicine, 3ΙΏ=10), 609-613 (1984); és ugyanitt, 212(14) 932936(1985)]. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítményt tehát emlősök trombózisos betegségeinek kezdésére használhatjuk oly módon, hogy a kezdendő alanynak a t-PA-t tartalmazó vizes parenterális oldatot adjuk.

A trombózisos betegség például szív-infarktus, mély vénás trombózis, tüdő-embólia vagy gutaütés lehet

A találmány szerinti eljárással előállított parenterális oldatot intravaszkulárisan, különösen intravénásán adagolhatjuk, infúzió formájában, de bármely más módszert—például intramuszkuláris adagolást —is alkalmazhatunk. Az intravaszkuláris infúziót általában infúziós fecskendőben elhelyezett oldattal hajtjuk végre. Az infúziós tartályból vagy üvegből a gravitáció révén vagy infúziós szivattyú alkalmazásával juttathatjuk az oldatot a betegbe. Mivel a gravitáción alapuló adagolás nem teszi lehetővé az adagolás szabályozását, ezért a parenterális oldatot előnyösen infúziós szivattyú segítségével jutatjuk a betegbe, különösen akkor, ha az oldatbnan a t-PA koncentrációja viszonylag magas. Még előnyösebb az elektromosan működtetett infúziós fecskendő használata, amivel az adagolási sebesség még jobban szabályozható.

A t-PA hatásos mennyisége emlősök trombózisos betegségeinek kezelésére természetesen számos tényezőtől függ, például a kezelendő alany korától és tömegétől, a kezelendő betegség tüneteitől és annak súlyosságától, a kezdés módjától, és azt végső soron a kezdő orvos határozza meg. Általában azonban például szívkoszorúér-trombus feloldására a dózis 150.000 és 450.000 NE/kg testtömeg/óra között lehet így 70 kg-οβ felnőtt esetén a hatásos mennyiség óránként általában 1.000.000-3.000.000 NE, közelebbről 2000.000 NE, és ez a mennyiség primer dózissal vagy anélkül adagolható. A dózis valószínűleg kisebb bizonyos trombózisos állapotok — például mélyvénás trombózis vagy heveny gutaütés — esetén, vagy abban az esetben, ha egy már újra átjárható koszorúérben kdl ezt az állapotot fenntartani. Ilyen esetekben a hatásos mennyiség általában 700036000 NE/kg testtömeg/óra.

A találmányt közelebbről — a korlátozás szándéka nélkül — az alábbi példák segítségével kívánjuk ismertetni. Az „ismert módon előállított kifejezés a jelen találmány elsőbbségi napja előtt publikált eljárásokat öleli fd.

1. példa

Transzformált CHO sejtvonal tenyészetéből — melyet a [Molecular and Cellular Biology, 5(7), 1750-1759(1985)] irodalmi helyen leírtak szerint állítunk elő—nyert, t-PA-t tartalmazó, derített oldatot kromatográfiásan tisztítunk, és a t-PA-t 0,1 mól/1 nátrium-citrátot és 0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmazó vizes oldata formájában (pH 53) összegyűjtjük. Az oldat pH-ját sósavval 3,0-ra állítjuk, és a kapott

-4HU 200695 Β olatotH-10Caitridge(AmiconLtd.,UpperMill, Stonebouse, Gloucestershire, Anglia) betétet használva ultraszűréssel koncentráljuk. Ily módon koncentrált tisztított vizes t-PA oldatot kapunk (2.500.000 NE/ml), amely 0,1 mól/1 nátrium-ciírátoUn a sósav hozzáadásából származó 0,23 mólA nátrium-kloridot és k0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmaz, az oldat pH-ja 3,0. A kapott oldatot kb. 14.000 móltömeg áteresztőképességű dializáló csőben dializáljuk, a 4 ’Con, négyszer 50 ml szűréssel sterilizált, 0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmazó fiziológiás sóoldattal (0,85 vegyes%-os nátrium-klorid-oldat) szemben, amelynek pH-ját tömény sósavoldattal 3,0-ra állítottuk. Minden egyes dialízis-lépést 12 órán át folytatunk. A vizes oldatot a dializáló tömlőből kivéve szűréssel sterilizáljuk, majd fiziológiás sóoldattal 500.000 NE/ml t-PA-koncentrációra hígítjuk. A lopott parenterális oldatot ezután üvegcsövekbe töltjük, leforrasztjuk, és -20 ’C-on fagyasztva tároljuk.

2. példa

Transzformált CHO sejtvonal tenyészetéből — amelyet a [Molecular and Cellular Biologhy, 2(7), 1750-1759 (1985)] irodalmi helyen leírtak szerint állítunk eló—nyert, t-PA-t tartalmazó derített oldatot kromatográfiásan tisztítunk, és a t-PA-t 0,17 mól/1 nátrium-citrátot és 0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmazó vizes oldat formájában (pH 53) összegyűjtjük. Az oldat pH-ját sósavoldattal 3,0-ra állítjuk, és a kapott oldatot H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Anglia) betétet használva ultraszűréssel koncentráljuk. A koncentrált oldatot gélszűrő-oszlopra víve (Sephadex G-150, Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Svédország) tovább tisztítgjuk, az ehiálást 0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmazó 0,85 vegyes%-os nátriumklorid-oldattal (pH 3,0) végezzük. A t-PA nagy tisztaságú vizes oldatát egyszeri használatra szánt művesével dializálva újra koncentráljuk. Az oldat pH-ját náttium-hidraxid-oldattal 53-re állítva kicsapjuk a tPA-t, és a szuszpenziót 2 órán keresztül 4 ’C-on tartóik. A szuszpenziót4000 g-vel 30 percen át centrifugáljuk 4 ’C-on. A centrifugálással kiülepített t-PA-t 0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmazó 0,85 vegyes%os vizes nátrium-klorid-oldatban újra oldjuk, és pHját sósavval 3,0-ra állítjuk. A sóoldat térfogatát úgy választjuk meg, hogy a t-PA koncentrációja 7300.000 és 10.000.000NE/ml közötti legyen. A kapott t-PA-oldatot 0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmazó 0,85 vegyes%-os nátrium-klorid-oldattal (pH 3,0) és a fenti savas sóddathan 10 vegyes% mannitot tarttdmazó oldattal hígítjuk oly módon, hogy a t-PA végkoncentrációja 5.000 NE/ml, a mannité 25 mg/ml legyen. A lopott oldatot sterilre szüljük és 1 mi-óiként csövekbe töltjük, a csöveket -20 *C-on fagyasztva tároljuk.

3. példa

Az 1. példa szerint előállított parenterális oldat trombolitikus hatását in vivő nyaki véna trombózis modellen határozzuk meg.

A vizsgálatot lényegéből Collen és munkatársai [J. Clin. Invest 21, 368-376 (1983)] módszere szerint végezzük.

Az lí. példa szerint előállított parenterális oldatot hagyjuk felolvadni, majd 0,01 vegyes% Tween 80-at tartalmazó, pH 3,0-ra állított steril izotoniás sóoldattal hígítva a t-PA-ból 500.000 NE/ml dózist biztosító, 2 órás infúzióhoz elegendő mennyiségű oldatot állítunk eló. Az infúziót a jobboldali comb vénába adjuk, kanül segítségével, a feqti vizsgálatot három újzélandi fehér nyúlon végezzük. Az infúzió beadása után kiértékeljük a trombolitikus hatást

Az 1. példa szerűit előállított parenterális oldat trombolitikus hatását az azzal elérhető 223 ± 43% trombdizis bizonyítja. Ezen tőlmenően, semmiféle káros hatást nem tapasztaltunk a parenterális oldat infúziós adagolása sarán.

Claims

1. Eljárás hatóanyagként szöveti plazminogén aktivátort tartalmazó stabil, vizes, parenterális oldat előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) az ismert módon előállított szöveti plazminogén aktivátorból ismert módon készített tisztított oldat közegét pH 2-5 értékű, kívánt esetben egy vagy több ismert adalékanyagot tartalmazó vizes közegre cseréljük; vagy (b) az ismert módon előállított szöveti plazminogén aktivátort pH 2-5 értékű, kívánt esetben egy vagy több ismert adalékanyagot tartalmazó vizes közegben oldjuk; majd a kapott oldatot sterilizáljuk. (Elsőbbsége: 1985.08.31.)

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szöveti plazminogén aktivátorként vagy egyláncú, vagy kétláncú formában lévő szöveti plazminogén aktivátort használunk.

(Elsőbbsége: 1985.08.31.)

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan szöveti plazminogén aktivátort használunk, amelynek ammosav-szekvencfrjja az

1. ábra szerinti, vagy attól annyiban tér el, hogy az Nterminális szerintői a 245. aminosav metionin helyett valin, vagy úgy, hogy a szekvenciából az első három aminosav bármelyike is hiányzik, vagy úgy, hogy az N-terminálison egy Gly-Ala-Arg többlet-szekvenciát is tartalmaz adott esetben.

(Elsőbbsége: 1985.08.31.)

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szöveti plazminogén aktivátorként rekombináns DNS-technikával nyert transzformált vagy transzfektált sejtvonal tenyésztésével előállítón szöveti plazminogén aktivátort használunk.

(Elsőbbsége: 1985.08.31.)

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén aktivátor koncentrációját 100.000 NE/ml-nél nagyobbra állítjuk be.

(Elsőbbsége: 1985.08.31.)

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén áktivátor koncentrációját 500.000 NE/ml-nél nagyobbra állítjuk be. (Elsőbbsége: 1985.08.31.)

7. A6. igénypont szermti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén áktivátor koncentrációját 1.000.000 NE/ml-nél nagyobbra állítjuk be. (Elsőbbsége: 1985.08.31.)

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén áktivátor koncentráció5

-5HU 200695 Β ját 5.000.000 NE/ml-nél nagyobbra állítjuk be. (Elsőbbsége: 1985.08.31.)

9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pH 2 és 43 közötti értékű vizes közeget használunk.

(Elsőbbsége: 1985.08.31.)

10. Az 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pH 2,4 és 4,0 közötti értékű vizes közeget használunk.

(Elsőbbsége: 1985.08.31.)

11. Az 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pH 2,8 és 3,5 közötti értékű vizes közeget használunk (Elsőbbsége: 1985.08.31.)

12. Az 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pH 3,0 értékű vizes közeget használunk. (Elsőbbsége: 1985.08.31.)

13. Az 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem pufferolt vizes közeget használunk. (Elsőbbsége: 1985.08.31.)

14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes közeghez adalékanyagként olyan fiziológiailag elfogadható anyagot is adunk, amely az oldatot a humán vérszérummal izotoniássá teszi.

(Elsőbbsége: 1985.08.31.)

15. A14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adalékanyagként nátrium-kloridot használunk (Elsőbbsége: 1985.08.31.)

16. A14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adalékanyagként dextrózt használunk (Elsőbbsége: 1985.08.31.)

17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes közeghez adalékanyagként egy felületaktív szert is adunk (Elsőbbsége: 1985.08.31.)

18. Eljárás hatóanyagként szöveti plazminogén aktivátort tartalmazó stabil, vizes, parenterális oldat előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) az ismert módon előállított szöveti plazminogén aktivátorból ismert módon készített tisztított oldat közegét fiziológiásán elfogadható szervetlen só, kívánt esetben egy vagy több ismert adalékanyagot tartalmazó, dl 2-5 értékű vizes oldatára cseréljük, vagy (b) az ismert módon előállított szöveti plazminogén aktivátort fiziológiásán elfogadható szervetlen só, kívánt esetben egy vagy több ismert adalékanyagot tartalmazó, pH 2-5 értékűi oldatában oldjuk; majd a kapott oldatot sterilizáljuk.

(Elsőbbsége: 1985.05.28.)

19. A18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szöveti plazminogén aktivátoricént vagy egyláncú vagy kétláncú formában lévő szöveti plazminogén aktivátort használunk.

(Elsőbbsége: 1985.05.28.)

20. A18. vagy 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan szöveti plazminogén aktivátort használunk amelynek aminosav-szekvenciája az

(Elsőbbsége: 1985.05.28.)

21. A18-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy szöveti plazminogén aktivátoricént rekombináns DNS-technikával nyert transzformált vagy transzfekták sejtvonal tenyésztésével előállított szöveti plazminogén aktivátort használunk (Elsőbbsége: 1985.05.28.)

22. A18-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén aktivátor koncentrációját 100.000 NE/ml-nél nagyobbra állítjuk be.

(Elsőbbsége: 1985.05.28.)

23. A22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén aktivátor koncentrációját SOO.OOO NE/ml-nél nagyobbra állítjuk be. (Elsőbbsége: 1985.05.28.)

24. A23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén aktivátor koncentrációját 1.000.000 NE/ml-nél nagyobbra állítjuk be. (Elsőbbsége: 1985.05.28.)

25. A24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szöveti plazminogén aktivátor koncentrációját 5.000.000 NE/ml-nél nagyobbra állítjuk be. (Elsőbbsége: 1985.05.28.)

26. A18-25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pH 2 és 4,5 közötti értkű vizes sóoldatot használunk (Elsőbbsége: 1985.05.28.)

27. A26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pH 2,4 és 4,0 közötti értékű vizes sóoldatot használunk (Elsőbbsége: 1985.05.28.)

28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pH 2,8 és 33 közötti értékű vizes sóoldatot hasiz nálunk (Elsőbbsége: 1985.05.28.)

29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pH 3,0 értkű vizes sóoldatot használunk. (Elsőbbsége: 1985.05.28.)

30. A 18-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem pufferolt vizes sóoldatot használunk (Elsőbbsége: 1985.05.28.)

31. A 18-30. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes sóoldathoz adalékanyagként egy felületaktív szert is adunk.