DE3686684T2

DE3686684T2 - Mittel zur absorptionsverbesserung von proteinen.

Info

Publication number: DE3686684T2
Application number: DE8686902132T
Authority: DE
Inventors: Jay Sarnoff; E Sobel
Original assignee: Survival Technology Inc
Current assignee: Meridian Medical Technologies Inc
Priority date: 1985-03-06
Filing date: 1986-03-06
Publication date: 1993-01-28
Anticipated expiration: 2006-03-07
Also published as: FI864480A; DK528386D0; DE3686684D1; HUT41632A; ATE80306T1; EP0214281B1; WO1986005096A1; EP0214281A1; AU5581186A; EP0214281A4; FI864480A0; AU593794B2; NO864382D0; NO864382L; DK528386A

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft eine Packung, die ein Protein mit therapeutischen Eigenschaften und ein Mittel betrifft, welches in der Lage ist, die Absorption des Proteins zu verbessern.
Erfindungsgemäß ist eine Packung entwickelt worden zur Verbesserung der Absorption von Proteinen mit medikamentösen Eigenschaften, die durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden, um schnell hohe Konzentrationen des injizierten Proteins im zirkulierenden Blutplasma zu erreichen, wodurch therapeutische Effekte schnell verwirklicht werden können, ohne eine intravenöse Injektion oder Infusion vornehmen zu müssen. In einer beispielhaften Ausführungsform wird ein Vehikel bereitgestellt, wobei das Protein in einem Vehikel verabreicht wird, welches eine die Absorption verbessernde Verbindung umfaßt, die die Permeation von untersuchten Proteinen in den Gefäßraum deutlich verbessert und in den nachfolgend ausgeführten Untersuchungen innerhalb von 2 Minuten nach Injektion zu hohen Blutwerten führt.
Die Erfindung wird im Zusammenhang mit der Behandlung von Individuen, deren Koronarbereich anfällig ist und die Schmerzen haben, die auf einen Herzinfarkt hinweisen, in der Weise dargelegt, daß die Schädigung des Herzmuskels verringert wird und insbesondere, daß derartige Behandlungen verbessert werden, die es ermöglichen, diese zum schnellstmöglichen Zeitpunkt, sogar bevor eine direkte qualifizierte persönliche Betreuung des Individiums geschaffen ist, zu beginnen.
Wenn sich in einem Blutgefäß ein Gerinnsel bildet, wird das Körperorgan, welches über das Blutgefäß mit Blut versorgt wird, beeinträchtigt oder vollständig von der Blutversorgung abgeschnitten. Es hängt von dem Blutgefäß ab, in welchem dieses auftritt, ob die Bedrohung für das Leben des Individiums klein oder, wie unter den unten aufgeführten Umständen, d.h. bestimmten lebensbedrohenden Umständen, sehr groß ist. Die Bildung eines Gerinnsels in einem Gefäß wird als Thrombose bezeichnet.
Substanzen, die Thromben auflösen, werden thrombolytische Substanzen genannt. Wenn ein Gerinnsel einer Koronararterie auf gelöst ist, wird die damit einhergehende Wiederherstellung des Blutflusses zum Herzen als Reperfusion bezeichnet.
Beispiele für lebensbedrohende oder sehr schwerwiegende Bildungen von Gerinnseln in arteriellen Gefäßen sind zerebrale Thrombose, renale Thrombose, Thrombose der Augenarterie, und - in bedeutender Weise - Thrombose einer Koronararterie. In etwa 85 % bis 90 % der Fälle eines akuten Herzinfarkts (koronärer Herzanfall) wird ein Thrombus in der Koronararterie gefunden, welcher das Blut daran hindert, zum Herzmuskel (Myocardium) zu fließen und ihn mit lebensnotwendigem Sauerstoff und anderen Nährstoffen zu versorgen. Eine Folge der Bildung eines Thrombus oder Gerinnsels in einer Koronararterie ist die Gefährdung des Myocardiums (Herzmuskelgewebe, das das Pumpen des Blutes ausführt). Ein von seiner Blutversorgung abgeschnittener Herzmuskel stirbt nicht sofort ab, aber der Prozeß des Absterbens beginnt sofort. Das Ausmaß der Schädigung des Herzmuskels ist daher eine Funktion der Zeit, in der die Blutzufuhr in den Infarktbereich durch den verschließenden Thrombus beschränkt wird.
Bis jetzt sind die Verfahren, die zur Reperfusion des Infarktbereichs angewendet werden, im wesentlichen im Krankenhaus oder einer vergleichbaren Umgebung vorgenommen worden. Die sogenannte "prähospitale" Behandlung war im allgemeinen darauf gerichtet, den Patienten am Leben zu erhalten und den Patienten so schnell wie möglich in das Krankenhaus zu bringen, so daß eine Behandlung zur Verringerung des Herzmuskelschadens vorgenommen werden konnte.
Die in einem Krankenhaus vorgenommene Behandlung erfordert bestimmte Vorgehensweisen zum Erreichen der Reperfusion des Infarktbereichs im Herzen des Patienten. Wenn eine sofortige Operation nicht klar angezeigt war, wurde die Reperfusion durch Vorgehensweisen erreicht, deren Wirkung den Verschluß beseitigten. Die zur Verfügung stehenden Verfahren schließen mechanisches Katheterisieren und das Verabreichen von Thrombolytika ein. Bekannte Thrombolytika wie Streptokinase oder Urokinase erforderten intrakoronare Infusion oder das langsame Einführen des Mittels in das Gefäß an der Stelle des Verschlusses mittels eines Katheters. In den letzten Jahren hat sich das intravenöse Infundieren von Streptokinase als wirksam erwiesen.
Kürzlich ist eine Substanz, die Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator oder t-PA genannt wird, experimentell eingesetzt worden. (The New England Journal of Medicine, 8. März 1984, Band 310, Nr. 10, Seiten 609-613). Im Gegensatz zu anderen Plasminogenaktivatoren wie Streptokinase oder Urokinase wirkt t-PA, welches lediglich in geringen Mengen im Körper gefunden wird, spezifisch an Gerinnseln und nicht an anderen relevanten Proteinen im Blut, sofern sich dessen Werte im angemessenen und wirksamen Bereich bewegen.
Ein in Biochemical Pharmacology, Band 33, Nr. 12, auf den Seiten 1831-1838 gefundener Kommentar von 1984 mit der Überschrift "Coronary Thrombolysis: Pharmacological Considerations With Emphasis On Tissue-Type Plasminogen Activator (t-PA)" enthält die folgende Schlußfolgerung:
"Selection of pharmacological agents for induction of coronary thrombolysis has been determined largely by availability. Unfortunately, both streptokinase and urokinase induce a systemic lytic state with depletion of circulating fibrinogen, plasminogen, and α 2- antiplasmin, and accumulation of fibrin degradation products. All of these factors conspire to set the stage for hemorrhage with a risk of serious bleeding. Intravenous administration of these agents is limited by a lower success rate, in part because the upper bound of dose is constrained by the risk of inducing a severe systemic lytic state.
The probability that progress in recombinant DNA technology will lead to widespread availability of tissue-type plasminogen activiator is particularly exciting because of the clot specific properties of t-PA. For coronary thrombolysis its potential advantages include: safety and efficacy of intravenous administration of high doses; effective clot lysis without induction of a systemic lytic state; prompt implementation without the need for extensive characterization of the coagulation and fibrinolytic systems in each patient prior to and during therapy; avoidance of frank allergic reactions or variations in dose-response relation due to immune complex formation; ease of minute-by-minute adjustment of dosage and prompt termination of fibrinolysis when needed because of the short biologicai half-like of t-PA and the lack of induction of a systemic lytic state."
["Die Auswahl pharmakologischer Mittel zur Auslösung von Koronar-Thrombolyse ist weitgehend durch deren Verfügbarkeit bestimmt gewesen. Unglücklicherweise lösen sowohl Streptokinase als auch Urokinase einen systemischen lytischen Zustand aus, welcher mit einer Verarmung an zirkulierendem Fibrinogen, Plasminogen und α-2-Antiplasmin sowie der Anreicherung von Fibrinabbauprodukten einhergeht. Alle diese Faktoren wirken zusammen in Richtung Ausbildung einer Hämorrhagie mit der Gefahr schwerwiegend der Blutungen. Das intravenöse Verabreichen dieser Mittel ist wegen einer geringen Erfolgsrate beschränkt, zum Teil deshalb, weil die obere Grenze der Dosis durch das Risiko der Auslösung eines Schwerwiegenden systemischen lytischen Zustands zwingend vorgegeben ist.
Die Wahrscheinlichkeit, daß Fortschritte in rekombinanter DNA-Technologie zu weitreichender Verfügbarkeit des Gewebetyp-Plasminogen-Aktivators führen wird, ist insbesondere wegen der Gerinnsel-spezifischen Eigenschaften von t- PA interessant. Im Falle von Koronar-Thrombolyse schließen dessen mögliche Vorteile ein: Sicherheit und Wirksamkeit bei der intravenösen Verabreichung hoher Dosen, wirksame Auflösung des Gerinnsels ohne Auslösung eines systemischen lytischen Zustands, sofortige Realisierung ohne das Erfordernis einer intensiven Charakterisierung des Gerinnungs- und fibrinolytischen Systems eines jeden Patienten vor und während der Therapie, Vermeidung von offenen allergischen Reaktionen oder Variationen im Dosis-Wirkungs-Verhältnis aufgrund der Bildung von Immunkomplexen, einfaches minutenweises Einstellen der Dosierung und nötigenfalls sofortige Beendigung der Fibrinolyse aufgrund der kurzen biologischen Halbwertszeit von t- PA und der fehlenden Auslösung eines systemischen lytischen Zustandes."]
Die der Verabreichung von t-PA zuzuschreibende Verheißung wurde im Rahmen einer Konferenz bei einem Treffen der American Heart Association diskutiert und in den New York Times am 16. November 1983 berichtet in einem Artikel mit der Überschrift "Protein Of Cancer Cells Used To Halt Coronaries".
Der Artikel betrifft mit der folgenden Aussage das Injizieren von t-PA:
"The protein t-PA can simply be injected into the vein in the art of the patient seized by a myocardial infarction or heart attack, and it travels through the blood to dissolve a clot, in much the same way as Draino clearsup stopped plumbing."
["Das Protein t-PA kann auf einfache Weise in die Herzvene des Patienten, der einen Herzinfarkt oder eine Herzattacke erlitten hat, injiziert werden, und es wandert durch das Blut, um ein Gerinnsel in einer Weise aufzulösen, die derjenigen weitgehend gleicht, die von Klempnern beim Freimachen verstopfter Rohrleitungen angewendet wird."]
In dem Artikel wird ferner unter "Hoffnungen auf zukünftige Anwendungen" ausgeführt, daß viele Arzte ihre Begeisterung zum Ausdruck gebracht haben bezüglich der Erforschung der Verwendung von t-PA zur Behandlung von Herzanfällen, da sie annehmen, daß es eines Tages in Notfallräumen und Krankenwagen eingesetzt werden kann, um Herzanfälle frühestmöglich zu stoppen, bevor sie zum Tod führen oder dauerhaften Schaden anrichten. Unter der Überschrift "Hoffnungen auf zukünftige Anwendungen" ist ferner der folgende Absatz abgedruckt:
"Dr. Burton E. Sobel Of Washington University, one of the researchers, speculated that patients might some day carry a vial with them so that the drug could be injected immediately after they felt chest pain and other early symptoms of a heart attack."
["Dr. Burton E. Sobel von der Washington University äußerte als einer der Forscher seine theoretische Betrachtung, daß Patienten eines Tages ein Röhrchen mit sich tragen könnten, so daß das Medikament sofort injiziert werden könnte, nachdem sie Brustschmerzen oder andere frühe Symptome eines Herzanfalls spüren"].
Medizinisch gesprochen ist ein Röhrchen ein Behältnis für eine Menge einer flüssigen Medizin oder eines Verdünnungsmittels mit einem Gummistopfen, welcher mittels einer subkutanen Nadel einer Spritze durchbohrt werden kann, um es der Person, die die Spritze betätigt, zu ermöglichen, eine vorbestimmte Dosierung der Flüssigkeit aus dem Röhrchen abzuziehen. Im Falle des derzeit verwendeten t-PA's könnte die Dosierung anschließend in den Stammlösungsbehälter einer Infusionsanordnung injiziert werden. Die Notwendigkeit, das Arzneimittel mittels intravenöser Infusion oder intravenöser Injektion zu verabreichen, stellt aus praktischer Sicht eine bedeutende Schranke für eine Eigenverabreichung dar, insbesondere, wenn man die schwierigen Umstände betrachtet, in denen sich das Individium befindet, welches die Symptome eines Herzinfarktes verspürt.
Die Entwicklung einer Packung zur Verwendung bei einer wirksamen Eigenverabreichung von t-PA, die von einem Individium, welches einen anfälligen Koronorbereich aufweist, sofort nach Beginn der Symptome verwendet werden kann, würde die mögliche Wirksamkeit von t-PA als Thrombolytikum durch Sicherstellen der Verwendung zum frühestmöglichen Zeitpunkt und häufig bevor irreversible Herzmuskelschädigungen aufgetreten sind, wesentlich vergrößern, und gleichzeitig eine Behandlung vor Einlieferung in ein Krankenhaus oder vor dem Eintreffen eines Notarztwagens ermöglichen, was erstmalig direkt die bei einem Herzinfarkt begleitend auftretenden Herzmuskelschädigungen verringern würde. Es ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, eine derartige Packung bereitzustellen.
Derzeit muß eine Reihe von Proteinen mit lebensrettenden, therapeutischen Eigenschaften ausschließlich intravaskulär verabreicht werden, um therapeutische Blutspiegel zu erreichen. Beispiele schließen Aktivatoren des Gerinnsel auflösenden, fibrinolytischen Systems einschließlich Streptokinase und Urokinase, die zur Unterbrechung von Herzanfällen verwendet werden, sowie Komponenten des Gerinnungssystems wie das antihämophile Globulin (Faktor VIII)zum Stoppen der Blutung bei Hämophilen ein. Vielfach müssen andere Proteine wie Insulin, welches eingesetzt wird, um diabetisches Koma zu behandeln, intravenös verabreicht werden, um Konzentrationen zu erreichen, die hoch genug sind, um die gewünschten therapeutischen Effekte im Rahmen der bei einem medizinischen Notfall auftretende Zeitnot schnell genug herbeizuführen. Wie oben ausgeführt, ist kürzlich die Auflösung von Gerinnseln in den Koronararterien, die zu Herzanfällen führen, in Versuchstieren und Patienten erreicht worden durch intravenöses Verabreichen von Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator (t-PA), einem Protein, welches in der Lage ist, das fibrinolytische System an der Oberfläche des Gerinnsels zu aktivieren, ohne die Patienten der Gefahr einer Blutung auszusetzen. Aufgrund der so kurzen Halbwertszeit von t-PA im Kreislauf sind kontinuierliche intravenöse Infusionen erforderlich gewesen, um ein schnelles Verschwinden des Proteins aus dem Kreislauf und damit einhergehende Sub-therapeutische Konzentrationen zu verhindern. Zusätzlich ist das intravenöse Verabreichen aufgrund des raschen Bedarfs an schneller Auflösung des Gerinnsels für notwendig erachtet worden, um den voranschreitenden Herzanfall zu unterbrechen, bevor eine wesentliche Menge des Herzmuskels abgestorben ist.
Vor dem Hintergrund des Vorhergehenden ist eine Packung entwikkelt worden, die ein Mittel enthält, welches in der Lage ist, die Absorption eines Proteins wie zum Beispiel t-PA und andere große intramuskulär injizierte Proteine in das Blut zu verbessern. Die Packung nutzt die Löslichmachung des Proteins in einem Vehikel, welches mit einem Mittel angereichert ist, das die Absorption des Proteins in das Blut verbessert und ein sofortiges Eintreten des Proteins in den Blutkreislauf auslöst. Ein zusätzlicher Aspekt der entwickelten Packung ist die Retention der pharmakologischen und therapeutischen Eigenschaften des Proteins, so daß der gewünschte therapeutische Effekt mittels intramuskulärer Injektion mit verbesserter Absorption ausgelöst werden kann. Ein weiterer Aspekt ist das Erleichtern der Absorption über 30 bis 60 Minuten, so daß therapeutische Blutwerte unter Notfallbedingungen aufrechterhalten werden können. Die Permeation der untersuchten Proteine in die Gefäßräume führte innerhalb von 2 Minuten nach Injektion zu hohen Blutwerten. Das entwickelte Vehikel erleichtert die Absorption von allen vier in den nachfolgend dargelegten Untersuchungen verwendeten Proteinen und übt keinen schädigenden Einfluß auf die funktionellen Eigenschaften der beiden untersuchten Proteine mit Gerinnsel auflösenden Eigenschaften aus. Die Erfindung ist nicht auf die in den Beispielen eingesetzten Proteine beschränkt, sondern läßt sich auf andere Proteine - wie auf die oben genannten, z.B. Insulin -ebenfalls übertragen.
Die erfindungsgemäße Packung enthält (1) ein Protein mit therapeutischen Eigenschaften und (2) ein die Absorption des Proteins in das Blut verbeserndes Mittel in einer Menge, die wirksam ist, die Absorption des Proteins bei intramuskulärer Injektion zu verbessern, wobei das die Absorption verbessernde Mittel ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamin, ein C&sub1;&submin;&sub3;-Dialkylamin, Phenylethylamin, Epinephrin, Tyramin, Mono-, Di- oder Triethanolamin, Propanolamin, Methoxyamin, Ethylendiamin, Diethylentriamin, oder ein nicht-toxisches Salz davon ist. Insbesondere ist das die Absorption verbessernde Mittel (1) ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamin, (2) ein C&sub1;&submin;&sub3;-Dialkylamin, (3) ein nicht-toxisches Salz eines C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamins oder (4) ein nichttoxisches Salz eines C&sub1;&submin;&sub3;-Dialkylamins.
Bevorzugte, die Absorption verbessernde Mittel sind (a) Methylamin, (b) Dimethylamin, (c) ein nicht-toxisches Salz von Methylamin, oder (d) ein nicht-toxisches Salz von Dimethylamin. Das am meisten bevorzugte Mittel zur Verbesserung der Absorption ist Methyaminhydrochlorid. Es ist bevorzugt, daß es sich bei dem Protein mit therapeutischen Eigenschaften um t-PA handelt.
Die Bestandteile der erfindungsgemäßen Packung können beispielsweise mit einem bekannten Notfall-Injektionsapparat verabreicht werden, wobei das Vorgehen das Injizieren der beiden Medikamente in das Muskelgewebe umfaßt, beispielsweise, nachdem eine diesbezügliche Weisung aus qualifizierter Quelle erfolgt ist und bevor direkte qualifizierte persönliche Betreuung gewährleistet ist.
t-PA ist ein großes Protein. Es konnte nicht davon ausgegangen werden, daß es von dem Blutfluß in nachweisbaren Mengen aufgenommen werden würde. Die Mengen an außerhalb der Gefäße vorhandenem Protein betragen etwa 1/10 der Mengen an intravaskulärem Protein. Es wird angenommen, daß dieses auf die im Verhältnis zur molekularen Größe des Proteins kleinen kapillaren Poren, durch die der Transport von Protein ablaufen kann, und den begrenzten Proteintransport aufgrund der elektrischen Ladung zurückzuführen ist. Es war daher höchst zweifelhaft, ob ein großes Protein wie t-PA, sofern es intramuskulär, d.h. außerhalb der Blutgefäße verabreicht wird, rasch und in erkennbaren Mengen seinen Weg in den Blutfluß finden würde. Anwendungstests haben tatsächlich gezeigt, daß t-PA selbst nicht in der Lage ist, in therapeutisch bedeutenden Mengen seinen Weg in den Blutfluß nach intramuskulärer Injektion rasch zu finden.
Die eigentliche Behandlung des Systems muß daher das intramuskuläre Injizieren eines die Absorption verbessernden Mittels gleichzeitig oder im wesentlichen gleichzeitig mit dem intramuskulären Injizieren des Proteins wie z.B. t-PA einschließen.
Die Vermehrung der Absorption von niedermolekularen Substanzen, die topisch, subkutan oder intramuskulär verabreicht worden sind, ist mit Trägerstoffen wie Dimethylsulfoxid (DMSO) und durch Verbesserung des Blutflusses der Skelettmuskulatur und des Lymphflusses erreicht worden.
Jedoch hat sich DMSO als ein die Absorption von t-PA und anderen Proteinmolekülen verbesserndes Mittel als unwirksam erwiesen.
In Übereinstimmung mit den Grundzügen der vorliegenden Erfindung wird die Absorptionsgeschwindigkeit von t-PA und anderen Proteinen in das Blut verbessert, indem mit dem t-PA oder einer anderen Proteindosierung eine Dosierung eines die Absorption von t- PA oder anderen Proteinen verbessernden Mittels eingesetzt wird.
Vorzugsweise wird das die Absorption verbessernde Mittel in das t-PA oder die Dosierung eines anderen Proteins eingemischt, um eine einzelne vermischte Dosierung zu bilden, welche anschließend intramuskulär (i.m.) injiziert wird. Es liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß die Absorption verbessernde Mittel als separate Dosierung in dieselbe Stelle zu injizieren, wie die separate Dosierung von t-PA oder einem anderen Protein (z.B. US-Patent 4 394 863).
Die erfindungsgemäß eingesetzten die Absorption verbessernden Mittel sind Alkylamine und Dialkylamine wie niedere Alkylamine und Dialkylamine, z.B. Methylamin, Dimethylamin, Ethylamin, Diethylamin, Isopropylamin, sekundäres Butylamin, Diisopropylamin, Propylamin, n-Butylamin, Aralkylamine, z.B. Phenylethylamin, Hydroxyaralkylamine, z.B. Epinephrin und Tyramin, Hydroxyalkylamine, z.B. Ethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Propanolamin, und andere Amine wie Methoxyamin, Polyalkylenamine, z.B. Ethylendiamin und Diethylentriamin. Diese Amine können ferner als Salze nicht-toxischer Säuren wie als Salze der zuvor genannten Säuren, z.B. als die Hydrochloride verwendet werden. Ferner kann Glucoseoxim verwendet werden.
Methylamin und Dimethylamin weisen ferner den Vorteil auf, daß sie nicht Methämoglobinämie induzieren. Dies wurde gezeigt, indem Kaninchen (a) 0,63 molar Methylaminhydrochlorid und (b) 0,63 molar Methylaminhydrochlorid zusammen mit t-PA in einer Menge von 1 mg/kg Körpergewicht injiziert wurde. In jedem Fall wurde 1 ml des Injektats eingesetzt und die Lösungen wiesen einen pH-Wert von 6,5 auf. Bei Verwendung von Methylamin (als Hydrochlorid) lagen die t-PA-Werte im Bereich von 220 bis 230 ng/ml. Mit Dimethylamin lagen die t-PA-Werte etwas niedriger aber im Vergleich zu dem Fall, wo t-PA ohne ein die Absorption verbesserndes Mittel verabreicht wurde, immer noch erhöht. Methoxyamin (als Hydrochlorid) führte unter denselben Bedingungen ebenfalls zur Verbesserung der t-PA-Werte, aber verursachte Methämoglobinämie. Die Zeitspanne der Anhebung der t-PA-Werte über 30 Minuten war mit Methylaminhydrochlorid dieselbe wie mit Hydroxylaminhydrochlorid. Die Werte betrugen mehr als das 10-fache der t-PA-Werte im Plasma in Abwesenheit des die Absorption verbessernden Mittels.
Obgleich das gleichzeitige Verabreichen von t-PA oder anderen Proteinen und die Absorption verbessernden Mitteln hauptsächlich für Humanzwecke vorgesehen ist, liegt es im Bereich der Erfindung, daß sie anderen Säugetieren, z.B. Hunden, Katzen, Rindern und Pferden verabreicht werden können. In Übereinstimmung mit den früheren Lehren kann elektrisches Stimulieren des Muskels an der Injektionsstelle zusammen mit dem Einschluß eines die Absorption verbessernden Mittels in das Injektat in einer Reihe der nachfolgenden Beispiele unter Einsatz intramuskulärer Injektion verwendet werden. Elektrisches Stimulieren eröffnet und verbessert die Absorption des erfindungsgemäßen die Absorption verbessernden Mittels.
Wie in der ältesten Stammanmeldung ausgeführt, kann eine automatische Injektionsvorrichtung eingesetzt werden, die geeignet ist zur intramuskulären Eigenverabreichung von t-PA oder einem anderen Protein. Die in den Beispielen der EP 191 814 beschriebenen Materialien und Methoden sind bezüglich der Verwendung der erfindungsgemäßen die Absorption von Proteinen verbessernden Mittel ebenfalls relevant.
Bis heute sind t-PA und andere Aktivatoren des fibrinolytischen Systems lediglich mittels direkter Injektion in den Blutfluß verabreicht worden. Die erfindungsgemäße Packung ermöglicht es, die Verabreichung von t-PA in einer alternativen Weise vorzunehmen, die zur sofortigen Anwendung durch Angehörige eines medizinischen Assistenzberufs oder durch telefonisch angeleitete Risikopatienten, die zuvor über die Vorgehensweise der Eigenmedikation unterrichtet worden sind, möglicherweise verändert werden können.
Methylamin wurde als Hydrochlorid eingesetzt, um die Absorption von t-PA bei Kaninchen zu verbessern. Die Absorption wurde gemessen nach intermuskulären Injektionen von 2 bis 3 mg konzentriertem t-PA (50 mg/ml). Methylaminhydrochlorid (0,63 molar) führte gemeinsam mit elektrischer Stimulierung innerhalb von 5 Minuten nach intramuskulärer Injektion von rt-PA zu erhöhten rt-PA-Werten im Blut, wobei die funktionelle und immunologische Aktivität der mit Hydroxylamin (als Hydrochlorid) erreichten glich (speziell 129 gg. 137 mg/ml/mg rt-PA). Bei Verwendung von Methylaminhydrochlorid traten weder Methämoglobinämie noch hämodynamische Veränderungen auf, die Sättigung mit Sauerstoff war unverändert und lediglich eine mäßige lokale Entzündung und interstitielle Hämorrhagie waren nach 48 Stunden in den Injektionsstellen mikroskopisch sichtbar. Vasodilatoren, hypertonische Medien, eine verringerte Menge an Hydroxylaminhydrochlorid oder rt-PA allein führten zu sehr viel niedrigeren rt-PA-Werten im Blut (14, 65, 46 bzw. 4 ng/ml/mg rt-PA).
Blutwerte an t-PA, die mit denen der vorliegenden Untersuchung vergleichbar sind, induzieren Koronarthrombolyse bei Versuchstieren und Patienten, ohne einen systemischen lytischen Zustand zu induzieren, welcher Blutungen verursacht. Die Zeitspanne der Steigerung der t-PA-Werte im Plasma nach erleichteter intramuskulärer Absorption ist aufgrund seines scharfen Spitzenwertes besonders günstig. Mit der in Aussicht genommenen Anwendung eines geeigneten Therapieplans würden Personen direkt nach Eigenmedikation mit einem automatischen Injektionsapparat oder der Behandlung durch pera medizinisches Personal unter direkter ärztlicher Versorgung stehen. Somit könnten, sobald die Blutwerte direkt nach intramuskulärer Verabreichung von t-PA abfallen, intravenöse Infusionen veranlaßt werden zusammen mit gerinnungshemmenden Mitteln oder anderen Maßnahmen, um einem erneuten Verschluß vorzubeugen, bis definitive diagnostische Informationen erhalten sind.
Die Möglichkeit, daß eine durch die erleichterte Absorption von intramuskulär verabreichtem t-PA induzierte Reperfusion des Herzmuskels zu Reperfusionsarrhythmien führt, ist in der Umgebung des Laboratoriums für Herzkatheterisierung oder der Koronarstation leicht zu handhaben, aber kann beim medizinisch ungebildeten Patienten potentiell gefährlich verlaufen. Daher liegt ein Vorteil in der begleitenden Verabreichung eines anti-fibrillatorischen oder anti-arrhythmischen Mittels wie Lidocain oder eines α-adrenergen Blockers, wie in der Stammanmeldung ausgeführt.
Es ist ferner gefunden worden, daß es zur Verhinderung von erneuten Verschlüssen oder Thrombozytenaggregation wünschenswert ist, entweder
1. die Synthese von Thromboxan A (Thromboxan A&sub2;) mit einem Thromboxan-Synthetase-Inhibitor wie z.B. einem Imidazol wie 4- (2-[1H-imidazol-1-yl]ethoxy)-benzoesäurehydrochlorid (Dazoxiben) zu inhibieren,
2. einen Antagonisten für den Rezeptor des Thromboxans A (Thromboxan A&sub2;) wie [1α,2β(5Z),3β(1E),4α]-7-[3-(3-Cyclohexyl-3-hydroxy-1-propenyl)-7-oxabicyclo[2.2.1]hept-2-yl]-5-heptinsäure) (SQ 27,427) einzuführen,
3. einen anderen Inhibitor der Thrombozytenaggregation, wie z.B. Aspirin , Indomethacin, Naproxin und Sulfinpyrazon einzuführen.
Das Mittel zur Verhinderung erneuter Verschlüsse oder Thrombozytenaggregationen könnte simultan oder sequentiell in jedweder Reihenfolge unter Bezugnahme auf das t-PA und das die Absorption verbessernde Mittel verabreicht werden.
Das Mittel zur Verhinderung erneuter Verschlüsse oder Thrombozytenaggregationen kann in herkömmlicher Weise wie z.B. intramuskulär, intravenös oder auch oral verabreicht werden.
Der Rezeptor-Antagonist oder ein anderes Mittel zur Verhinderung von durch Thrombozyten bedingten erneuten Verschlüssen kann beispielsweise in einer Menge von 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden.
Wie bereits ausgeführt, ist die Erfindung ferner geeignet, die Absorption von anderen Proteinen mit medizinischen Eigenschaften bei intramuskulärer Verabreichung zu verbessern. Derartige Proteine schließen beispielsweise bovines Serumalbumin, humanes Serumalbumin und Insulin ein. Dies wird durch die folgenden Versuche gezeigt:
Zwei Proteine, bovines Serumalbumin (BSA) und humanes Serumalbumin (HSA) wurden mit Jod-125 (¹²&sup5;I) markiert, so daß die Absorption in den Kreislauf durch Analyse der Radioaktivität in Trichloressigsäure-Präzipitaten von Plasma charakterisiert werden konnte.
BSA- und HSA-Proteine wurden radioaktiv mit Jod-125 (¹²&sup5;I) durch die Methode von Bolton und Hunter markiert, um einen radioaktiven Liganden auf Tyrosin-Komponenten zu bilden. Um die Unabhängigkeit der Ergebnisse bezüglich der Beschaffenheit des eingesetzten radioaktiven Liganden zu bestätigen, wurde ein zweites Verfahren angewendet, in welchem ein ¹²&sup5;I-Glycokonjugat zur Bildung eines radioaktiv markierten Proteins hergestellt wurde, indem radioaktiv markiertes Tyramin an Kohlenhydrat gebunden wurde, welches kovalent an das Protein gebunden wurde. Dieser Typ eines radioaktiven Liganden ist ungeachtet des Einwirkens lysosomaler Enzyme oder saurer Bedingungen stabil. Ferner verändert er nicht die funktionalen Eigenschaften des markierten Proteins. Bei dem Markierungsverfahren wurde Dilactitoltyramin (10 nmol in 24 ul, in 0,5 M Kaliumphosphat, pH 7,7) anfänglich mit radioaktivem Jod markiert, indem der Markierungsstoff in ein mit Jod (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois) beschichtetes Röhrchen mit NaI (1 mCi in 10 ul, Amersham) plaziert wurde. Man ließ die Reaktionsmischung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur und gelegentlichem Schütteln stehen. Die Inhaltsstoffe des Röhrchens wurden in ein anderes Röhrchen überführt, welches Galactoseoxidase (4 Einheiten in 2 ul, Sigma) enthielt, und inkubierte weitere 45 Minuten lang bei 37ºC. Dem Röhrchen wurden Natriumcyanborhydrid (3 ul einer 1 M Lösung in Kaliumphosphatpuffer) und 2 mg bovines oder humanes Serumalbumin (Fraktion V, Sigma) in 200 ul physiologischer Kochsalzlösung zugegeben, gefolgt durch zusätzliche Inkubation für 45 Minuten bei 37ºC. Nach der Inkubation wurden dem Röhrchen 50 ul 1 M Ammoniumbicarbonat zugegeben. ¹²&sup5;I-Dilactitoltyramin-Albumin wurde von ¹²&sup5;I-Dilactitoltyramin chromatographisch mittels Sephacryl S300 über eine 0,9 x 30,0 cm Säule getrennt und gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert. Gekoppeltes Protein wurde mit Aquacide konzentriert und mittels Filtration durch ein 0,45 um Membranfilter sterilisiert. Ein Aliquot wurde entnommen zur Bestimmung des Proteingehalts, der Spezifischen Radioaktivität und Fällung mittels Trichloressigsäure.

Quantifizierung der Absorption von Proteinen nach intramuskulärer Injektion mit dem oder ohne das die Absorption verbessernde Mittel:

Radioaktiv markiertes BSA und HSA in Plasma wurde quantifiziert durch Analyse der Radioaktivität von Aliquots von zu ausgewählten Zeitabständen nach Injektion erhaltenem Plasma und in Niederschlägen, die durch Ansäuerung des Plasmas mit vier Teilen 10 %-iger Trichloressigsäure (TCA) gebildet wurden. Die Verbesserung der Absorption von BSA- und HSA-Proteinen nach intramuskulärer Injektion wurde mit New Zealand-Kaninchen gezeigt. Proteinlösungen wurden manuell durch eine 25er Nadel in den Skelettmuskel des Oberschenkels injiziert, während die Tiere leicht narkotisiert wurden.

Verbesserung der Absorption:

Radioaktiv markiertes Albumin wurde Kaninchen in 1 ml Aliquots mit einer Anzahl von 163,4 bis 289,9 Millionen Counts pro Minute (cpm) zusammen mit Mikrogramm-Mengen von Protein (spezifische Radioaktivität = 1,74 bis 3,02 mCi/mg) verabreicht. Die Proteine wurden entweder in 0,9 %-iger NaCl- Lösung oder einer die Absorption verbessernden Lösung von 0,9 % NaCl, ergänzt mit Hydroxylamin als Hydrochlorid in Konzentratio nen von 43,75 bis 175 mg/ml verabreicht.
Die Verbesserung der Absorption von Protein wurde mit radioaktiv markiertem bovinen Serumalbumin ebenfalls nachweisbar (24 Bestimmungen). Im Durchschnitt lag die Spitzenradioaktivität in TCA-Niederschlägen von Plasma bei einer Anzahl von lediglich 3204 Counts pro Minute pro ml, wenn das Protein den Kaninchen in Kochsalzlösung allein intramuskulär injiziert wurde. Demgegen über lag die mit TCA fällbare Radioaktivität im Durchschnitt bei einer Anzahl von 16 580 Counts pro Minute pro ml Plasma, wobei 80 % der Spitzenwerte 5 Minuten nach intramuskulärer Injektion mit der Absorption anhielten, die durch Hydroxylaminhydrochlorid verbessert war. In ähnlicher Weise lag die mit TCA fällbare Radioaktivität nach Injektion von radioaktiv markiertem humanen Serumalbumin bei einer durchschnittlichen Anzahl von lediglich 4176 Counts pro Minute pro ml Plasma während der ersten 30 Minuten nach intramuskulärer Injektion ohne Verbesserung der Absorption. Demgegenüber lag die mit TCA fällbare Radioaktivität im Durchschnitt bei einer Anzahl von 32 868 Counts pro Minute pro ml Plasma während der ersten 30 Minuten nach intramuskulärer Injektion mit einer durch Einschluß von 43,8 mg Hydroxylamin als Hydrochlorid pro ml Injektat (12 Bestimmungen) verbesserten Absorption. Ferner waren 75 % der Spitzenradioaktivität 5 Minuten nach Injektion offensichtlich. Der nachfolgende Zuwachs an Plasmaradioaktivität nach den ersten 5 Minuten war auf die kontinuierliche Absorption von radioaktiv markiertem Albumin mit einer Geschwindigkeit zurückzuführen, die schneller war als dessen langsame Clearence-Rate aus dem Kreislauf.

Claims

1. Packung, die (1) ein Protein mit therapeutischen Eigenschaften und (2) ein die Absorption des Proteins in das Blut verbesserndes Mittel in einer Menge enthält, die wirksam ist, die Absorption des Proteins bei intramuskulärer Injektion zu verbessern, wobei das die Absorption verbessernde Mittel ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamin, ein C&sub1;&submin;&sub3;-Dialkylamin, Phenylethylamin, Epinephrin, Tyramin, Mono-, Di- oder Triethanolamin, Propanolamin, Methoxyamin, Ethylendiamin, Diethylentriamin, oder nicht-toxische Salze davon ist.

2. Packung nach Anspruch 1, in der das die Absorption verbessernde Mittel (1) ein C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamin, (2) ein C&sub1;&submin;&sub3;-Dialkylamin, (3) ein nicht-toxisches Salz eines C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylamins oder (4) ein nicht-toxisches Salz eines C&sub1;&submin;&sub3;-Dialkylamins ist.

3. Packung nach Anspruch 2, in der das die Absorption verbessernde Mittel (a) Methylainin, (b) Dimethylamin, (c) ein nicht-toxisches Salz von Methylamin, oder (d) ein nichttoxisches Salz von Dimethylamin ist.

4. Packung nach Anspruch 3, in der das die Absorption verbessernde Mittel Methylamin oder ein nicht-toxisches Salz von Dimethylamin ist.

5. Packung nach Anspruch 3, in der das die Absorption verbessernde Mittel Methylaminhydrochlorid ist.

6. Packung nach den Ansprüchen 1 bis 5, in der das Protein t-PA ist.