AT391812B

AT391812B - Verfahren zur herstellung einer parenteralen t-pa-loesung

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Publication number: AT391812B
Application number: AT0141186A
Authority: AT
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1985-05-28
Filing date: 1986-05-27
Publication date: 1990-12-10
Also published as: LU86445A1; ATA141186A; DK246886D0; IT8648064A0; SE462893B; DK163174B; IL78937A0; FI862226L; NO862095L; AU569429B2; GR861365B; DK246886A; FI862226A0; GB8612781D0; IL78937A; IT1191925B; PT82647A; NO171344B; AU5796586A; HUT42330A

Description

Nr. 391 812

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebeplasminogenaktivators und insbesondere auf die Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen, die den Gewebeplasminogenaktivator enthalten, welche Formulierungen in der Human- und Veterinärmedizin Anwendung finden.

Es wird angenommen, daß zwischen dem Enzymsystem, das Blutklümpchen zu bilden imstande ist - dem Koagulationssystem - und dem Enzymsystem, das Blutklümpchen zu lösen imstande ist - dem Fibrinolysesystem - ein dynamisches Gleichgewicht besteht, welches ein intaktes geschütztes Gefäßbett aufrechterhält. Um den Verlust von Blut aus Verletzungen zu beschränken, werden in den verletzten Gefäßen Blutklümpchen gebildet. Nach der natürlichen Heilung der Verletzung werden die überflüssigen Blutklümpchen durch die Wirkung des Fibrinolysesystems gelöst. Gelegentlich bilden sich Blutklümpchen ohne traumatische Verletzung und können sich in Hauptblutgefäßen festsetzen, was zu einer teilweisen oder sogar totalen Behinderung des Blutstromes führt. Wenn dies im Herz, in der Lunge oder im Gehirn stattfindet, kann das Ergebnis ein Myokardinfarkt, eine Lungenembolie oder ein Schlaganfall sein. Diese Zustände kombiniert sind der Hauptgrund von Erkrankung und Sterblichkeit in den Industrienationen.

Blutklümpchen bestehen aus einem Fasemetz, das durch das proteolytische Enzym Plasmin gelöst werden kann. Das Enzym wird vom inaktiven Proenzym Plasminogen, einer Komponente von Blutplasma, durch die Wirkung eines Plasminogenaktivators hergeleitet. Es gibt zwei immunologisch verschiedene Säugerplasminogenaktivatoren. Der intrinsische Plasminogenaktivator, auch als Urokinase bekannt, ist ein Enzym, das von der Niere gebildet wird und aus dem Ham isoliert werden kann. Er kann auch aus einer Reihe von Gewebekulturquellen hergestellt werden. Der extrinsische Plasminogenaktivator, auch als vaskulärer Plasminogenaktivator und als Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) bekannt, kann aus vielen Gewebehomogenaten (insbesondere menschlichem Uterus), der Gefäßzellwand und aus einigen Zellkulturen isoliert werden. Außer diesen beiden Arten von Plasminogenaktivator gibt es auch ein bakterielles Produkt, Streptokinase, hergestellt aus ß-hämolytischen Streptokokken. Ein Hauptnachteil sowohl von Urokinase als auch von Streptokinase ist, daß sie über den Kreislauf aktiv sind und nicht gerade an der Stelle eines Blutklümpchens. Sie können beispielsweise andere Blutproteine, wie Fibrinogen, Prothrombin, Faktor V und Faktor VIII, zerstören und somit die Fähigkeit der Blutgerinnung vermindern und die Gefahr von Hämorrhagie erhöhen. Im Gegensatz dazu hängt die biologische Wirksamkeit von t-PA von der Anwesenheit von Fibrin ab, an welches er sich bindet und wo er aktiviert wird. So wird maximale Wirksamkeit nur an der Stelle des Blutklümpchens entwickelt, d. h. in Anwesenheit des zu lösenden Fibrinnetzes, und dies vermeidet stark die Gefahr von Hämorrhagie.

Die Hauptroute der Verabreichung des t-PA ist durch intravaskuläre Infusion, was somit die Formulierung von t-PA als eine parenterale Lösung erfordert. Es ist im allgemeinen erwünscht, daß eine parenterale Lösung eine hohe Konzentration an Arzneimittel enthält. Dies, da der Arzt oder Veterinär dann die erforderliche Konzentration in jeder bestimmten Situation einfach durch Verdünnung der Lösung mit zusätzlichem Lösungsmittel oder Medium erhalten kann. Weiterhin ist es nicht ratsam, ein großes Volumen an Lösung einem Patienten mit einer Herz- oder Nierenerkrankung zu verabreichen, da dies das Herz oder die Nieren einer noch größeren Belastung aussetzen würde. Das Volumen soll daher durch Verwendung einer konzentrierteren Formulierung minimal gehalten werden. Gleichzeitig soll jede derartige parenterale Lösung in dem Sinn stabil sein, daß es keine signifikante Tendenz gibt, daß das Arzneimittel entweder bei Lagerung und während eines Verdünnungsvorganges aus der Lösung ausgefällt wird.

Eine Reihe von parenteralen Lösungen von t-PA wurde allgemein in EP-A-41 766, EP-A-93 619, EP-A-112122, EP-A-113 319, EP-A-123 304, JP-PatentveröffenÜichung 57-120523 (Anmeldung 56-6936) und JP-Patentveröffentlichung 58-65218 (Anmeldung 56-163145) beschrieben. Die Formulierungen sind wässerige Kochsalzlösungen von t-PA, in welchen der pH etwa neutral ist, und sie leiden unter dem Nachteil, daß die Löslichkeit von t-PA in derartigen Lösungen bei Fehlen einer Zunahme der Ionenkonzentration niedrig ist. Demgemäß enthalten die Formulierungen entweder niedrige Konzentrationen an t-PA, was in manchen Fällen die Verabreichung unerwünscht großer Lösungsvolumina an einen Patienten erfordert, oder sie sind hypertonisch, was bei Verabreichung für rote Blutkörperchen schädlich sein kann.

Es wurde nun gefunden, daß die Löslichkeit von t-PA in einer wässerigen parenteralen Lösung verbessert werden kann, wenn der pH der Lösung in einem sauren Bereich liegt, und daß bei Verabreichung die Azidität einer derartigen Lösung keine signifikanten physiologischen Probleme aufwirft. Demgemäß sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer wässerigen parenteralen Lösung von t-PA vor, worin der pH 2 bis 5 beträgt.

Als Folge der verbesserten Löslichkeit von t-PA ist die erfindungsgemäß erhältliche parenterale Lösung imstande, hohe Konzentrationen an t-PA zu erzielen, ohne daß irgendein wesentliches Risiko besteht, daß t-PA aus der Lösung ausgefallt wird. Weiterhin wurde gefunden, daß die Konzentration an t-PA in einer derartigen Lösung leicht durch Verdünnen mit Wasser auf neutralen oder sauren pH vermindert werden kann, wieder ohne daß irgendein wesentliches Risiko besteht, daß der t-PA ausgefällt wird. Erfindungsgemäß ist daher eine stabile parenterale Lösung erhältlich, die eine größere Flexibilität in ihrer Handhabung und Verwendung durch Arzte und Veterinäre ermöglicht.

Der erfindungsgemäß verwendete t-PA kann jedes bioaktive Protein sein, das im wesentlichen dem Säuger- -2-

Nr. 391 812 und insbesondere dem menschlichen t-PA entspricht und Formen mit und ohne Glykosylierung inkludiert. Es kann sich um einen ein- oder zweikettigen t-PA oder eine Mischung hievon handeln, wie in EP-A-112 122 beschrieben, und im Fall von voll glykosyliertem menschlichen t-PA weist er eine offensichtliche Molmasse an Polyacrylamidgelen von etwa 70 000 und einen isoelektrischen Punkt zwischen 7,5 und 8,0 auf. Vorzugsweise weist der t-PA eine spezifische Wirksamkeit von etwa 500 000 IE/mg (internationale Einheiten/mg, wobei die internationale Einheit eine Aktivitätseinheit ist, wie sie von WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, London NW3 6RP, Großbritannien, definiert ist) auf.

Die Aminosäuresequenz von t-PA entspricht vorzugsweise im wesentlichen der in Fig. 1 gezeigten. Die Sequenz ist somit identisch Fig. 1 oder enthält eine oder mehrere Aminosäurestreichungen, -Substitutionen, -einfügungen, -Inversionen oder -additionen allelomorphen oder sonstigen Ursprungs, wobei die resultierende Sequenz zumindest 80 %, vorzugsweise 90 %, Homologie mit der Sequenz in Fig. 1 aufweist und im wesentlichen die gleichen biologischen und immunologischen Eigenschaften des Proteins beibehält. Insbesondere ist die t-PA-Sequenz jener in Fig. 1 identisch oder hat die gleiche Sequenz, wobei aber die Aminosäure in Stellung 245 vom Serin N-Terminus Valin anstelle von Methionin ist, wobei jede Sequenz gegebenenfalls ohne irgendeine der ersten drei Aminosäuren ist oder gegebenenfalls eine zusätzliche Polypeptid N-endständige Präsequenz von Gly-Ala-Arg aufweist.

Die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz weist 35 Cysteinreste auf und weist somit das Potential zum Bilden von 17 Disulfldbriicken auf. Basierend auf der Analogie mit anderen Proteinen, deren Struktur detaillierter bestimmt wurde, ist die postulierte Struktur für die Sequenz (von der Disulfidbindungsbildung herrührend) zwischen der Aminosäure in Stellung 90 und dem Prolin C-Terminus in Fig. 2 angegeben. Die Struktur der N-endständigen Region ist weniger gewiß, obwohl einige Vorschläge gemacht wurden (Progress in Fibrinolysis, 1983, £, 269-273; und Proc. Natl. Acad. Sei., 1984, £1, 5355-5359). Die wichtigsten Merkmale der Struktur von t-PA sind die beiden Kringelregionen (zwischen der 92. und der 173. Aminosäure und zwischen der 180. und 261. Aminosäure), die für die Bindung des Proteins an Fibrin verantwortlich sind, und die Serin-Proteaseregion, die den Hauptteil der B-Kette umfaßt und die für die Aktivierung von Plasminogen verantwortlich ist. Die Aminosäuren von spezieller Signifikanz in Serinproteasen sind die katalytische Dreiergruppe His/Asp/Ser. Bei t-PA kommen diese in Stellung 322, 371 und 463 vor. Die Disulfidbrücke zwischen dem 264. und 395. Cysteinaminosäurerest ist ebenfalls insofern wichtig, als sie die A- und die B-Kette in der Zweikettenform von t-PA zusammenhält

In den Fig. 1 und 2 wurden die herkömmlichen Ein- und Dreibuchstabenkodes für die Aminosäurereste wie folgt verwendet:

Asp D Asparagin säure Thr T Threonin Ser S Serin Glu E Glutaminsäure Pro P Prolin Gly G Glycin Ala A Alanin Cys C Cystein Val V Valin Met M Methionin

Ile I Isoleucin Leu L Leucin Tyr Y Tyrosin Phe F Phenylalanin His H Histidin Lys K Lysin Arg R Arginin Tip W Tryptophan Gin Q Glutamin Asn N Asparagin

Der t-PA kann nach jedem der im Stand der Technik beschriebenen oder bekannten Verfahren erhalten werden. Beispielsweise kann er aus einer normalen oder neoplastischen Zellinie der in Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580. 140-153; EP-A-41 766 oder EP-A-113 319 beschriebenen Art erhalten werden. Es wird aber bevorzugt, daß t-PA aus einer gezüchteten transformierten oder transfizierten Zellinie erhalten wird, die unter Anwendung der Rekombinations-DNA-Technologie, wie beispielsweise in EP-A-93 619; EP-A-117 059 oder EP-A-117 060 beschrieben, abgeleitet wurde. Es wird besonders bevorzugt, daß chinesische Hamsterovarium (CHO)-Zellen für die Bildung von t-PA verwendet werden und auf die in Molecular und Cellular Biology, 1985, 5(7). 1750-1759, beschriebene Weise abgeleitet werden. Auf diese Weise wird das Monierte Gen mit dem Gen, das Dihydrofolat-Reduktase (dhfr) in dhfr'CHO-Zellen chiffriert, cotransfiziert. Transformanten, die dhfr zur Expression bringen, werden auf Medien, denen Nukleoside fehlen, selektiert und zunehmenden Konzentrationen an Methotrexat ausgesetzt. Die dhfr- und t-PA-Gene werden so gemeinsam verstärkt, was zu einer stabilen Zellinie führt, die imstande ist, hohe Spiegel an t-PA zur Expression zu bringen.

Der t-PA wird vorzugsweise unter Verwendung irgendeines der im Stand der Technik beschriebenen oder bekannten Verfahren, wie der in Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580. 140-153; J. Biol. Chem., 1979, 254f6L 1998-2003; ibid., 1981, 256C13L 7035-7041; Eur. J. Biochem., 1983,122, 681-686; EP-A-41 776; EP-A-113 319 oder GB-A-2122 219 beschriebenen Verfahren, gereinigt

Es scheint keine obere Grenze bezüglich der Löslichkeit des t-PA in der parenteralen Lösung zu geben. Bei sehr hohen Konzentrationen, wie höher als 150 000 000 IE/ml (internationale Einheiten/ml) wird die Lösung -3-

Nr. 391 812 lediglich viskos ohne irgendeine signifikante Ausfüllung des t-PA. Die Konzentration des t-PA in der parenteralen Lösung kann daher innerhalb weiter Grenzen variieren, beispielsweise von 50 000 bis 50 000 000 IE/ml. Um den aus dem erfindungsgemäßen Verfahren resultierenden maximalen Vorteil zu gewährleisten, wird es bevorzugt, daß die Konzentration an t-PA höher als 100 000 IE/ml, insbesondere höher als 500 000 IE/ml, ganz besonders höher als 1 000 000 IE/ml, ist. Am meisten bevorzugt beträgt die Konzentration des t-PA etwa 5 000 000 IE/ml.

Die obere Grenze des pH der parenteralen Lösung beträgt vorzugsweise 4,5. Tatsächlich liegt der pH vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 2,5 bis 4,0, mehr bevorzugt von 2,8 bis 3,5, und ist am meisten bevorzugt etwa 3,0. Der erwünschte pH der parenteralen Lösung wird zweckmäßigerweise unter Verwendung einer physiologisch annehmbaren anorganischen oder organischen Säure erhalten. Beispiele derartiger Säuren sind Salz-, Schwefel- und Salpetersäure sowie Citronen-, Wein- und Benzolsulfonsäure. Von diesen Beispielen wird Salzsäure bevorzugt

Obwohl etwas physiologisch annehmbares Colösungsmittel gegebenenfalls zusätzlich zu Wasser vorhanden sein kann, wird es bevorzugt, daß das Medium für die parenterale Lösung zur Gänze oder im wesentlichen wässerig ist.

Die parenterale Lösung kann mit dem Blutserum des Patienten hypertonisch, hypotonisch oder isotonisch sein. Um unerwünschte Nebenwirkungen zu vermeiden, ist aber die parenterale Lösung vorzugsweise isotonisch, obwohl geringe Abweichungen keine große physiologische Bedeutung haben. Eine im wesentlichen isotonische parenterale Lösung kann durch Einverleiben eines physiologisch annehmbaren Mittels erzielt werden, das imstande ist, die Tonizität der Lösung auf das erforderliche Ausmaß zu steigern. Beispiele derartiger Mittel sind wohlbekannt und sind Dextrose (in wasserfreier oder Monohydratform) und Natriumchlorid und Mischungen hievon. Die Konzentration des Mittels in der parenteralen Lösung variiert selbstverständlich von Mittel zu Mittel. Im Falle von Natriumchlorid beträgt die Konzentration vorzugsweise 7 bis 10 mg/ml und am meisten bevorzugt etwa 8,5 mg/ml, wobei die Konzentration oft als physiologische Kochsalzlösung oder nur physiologisches Kochsalz bezeichnet wird. Im Fall von wasserfreier Dextrose beträgt die Konzentration vorzugsweise 30 bis 70 mg/ml, am meisten bevorzugt etwa 50 mg/ml. Im Falle, daß die Konzentration von t-PA in einer im wesentlichen isotonischen parenteralen Lösung vermindert werden soll, wird es bevorzugt, die Verdünnung mit einer wässerigen Lösung des gleichen Mittels bei der gleichen Konzentration durchzuführen, um eine im wesentlichen isotonische Lösung aufrechtzuerhalten.

Die parenterale Lösung kann gegebenenfalls Additive enthalten, die gewöhnlich mit Formulierungen dieser Art verbunden sind. Ein Beispiel hievon ist menschliches Serumalbumin. Weiterhin hat t-PA die Neigung, an Glas- und Kunststoffoberflächen zu adsorbieren und es kann daher erwünscht sein, der parenteralen Lösung ein oberflächenaktives Mittel einzuverleiben, um eine derartige Adsorption zu vermindern oder minimal zu halten. Beispiele eines derartigen Mittels sind Polyoxyäthylenderivate von Fettsäurepartialestem von Sorbitanhydriden, wie sie unter dem Markennamen "Tween 80" verkauft werden.

Einer der überraschenden Vorteile der vorliegenden Erfindung ist, abgesehen von der wesentlich erhöhten Löslichkeit des t-PA, daß die Verwendung einer sauren parenteralen Lösung mit einem pH innerhalb der hier definierten Grenzen keinerlei Signifikate schädliche physiologische Wirkungen bei Verabreichung an den Patienten zu haben scheint. Es scheint, daß der Blutstrom im allgemeinen imstande ist, den pH der Lösung fast sofort, wenn der Kontakt hergestellt ist, auf neutral zu erhöhen, wobei der t-PA rasch im Blutstrom verteilt wird. Es wird aber bevorzugt, daß dieser Prozeß in keiner Weise wesentlich behindert wird und daß die parenterale Lösung kein starkes Puffermittel enthält. Ein schwaches Puffermittel aber, daß diesen Prozeß nicht signifikant hemmt, kann einverleibt werden und tatsächlich wirkt bei saurem pH t-PA selbst als sein eigenes schwaches Puffermittel. Weiterhin ist menschliches Serumalbumin imstande, als schwaches Puffermittel zu wirken.

Wegen der wesentlich erhöhten Löslichkeit des t-PA in der erfindungsgemäß erhältlichen parenteralen Lösung besteht keine Notwendigkeit, irgendwelches zusätzliche Material, wie Lysin oder Ornithin oder ein Salz hievon, zum Erhöhen der Löslichkeit des t-PA zuzusetzen.

Die parenterale Lösung kann gemäß herkömmlichen pharmazeutischen Formulierungsverfahren und -techniken unter Verwendung von t-PA in Form einer gereinigten Lösung oder eines Feststoffes hergestellt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen der wässerigen parenteralen Lösung von t-PA ist somit dadurch gekennzeichnet, daß (1) eine gereinigte Lösung von t-PA erhalten und das Medium durch ein wässeriges Medium mit einem pH von 2 bis 5 ausgetauscht wird oder (2) der t-PA in einem wässerigen Medium mit einem pH von 2 bis 5 gelöst wird, worauf die resultierende Lösung sterilisiert wird.

Die Reinigung des t-Pa kann als Endstufe die Elution des Proteins von einer chromatographischen Säule als eine Lösung, die ein starkes Puffermittel enthält, beinhalten. Wie oben erwähnt, wird es bevorzugt, daß die parenterale Lösung kein starkes Puffermittel enthält, und daher ist ein zweckmäßiges Mittel zum Bewirken der Entfernung desselben die Anwendung von Dialyse, wobei das Medium ausgetauscht wird. Dies kann unter Verwendung eines Dialyserohres oder einer künstlichen Niere durchgeführt werden, worin die gereinigte Lösung gegen ein wässeriges Medium dialysiert wird, in dem der pH 2 bis 5 beträgt. Es kann erwünscht sein, insbesondere wenn die Konzentration des t-PA in der gereinigten Lösung hoch ist, zuerst den pH der Lösung -4-

Nr. 391 812 einzustellen, so daß der pH 2 bis 5 beträgt. Ein anderes Mittel zum Bewirken der Entfernung eines starken Puffermittels, während das Medium ausgetauscht wird, ist es, die gereinigte Lösung Gelfiltration zu unterziehen und die Säule mit einem wässerigen Medium, in dem der pH 2 bis 5 beträgt, zu entwickeln. t-PA in Form eines ausgefällten Feststoffes kann vorzugsweise aus einer gereinigten Lösung durch Einstellen des pH auf etwa 5,5, Kühlen der Lösung unmittelbar über deren Gefrierpunkt und Gewinnen des Proteins, beispielsweise durch Zentrifugieren, erhalten werden. Der ausgefällte Feststoff kann dann in einem wässerigen Medium mit einem pH von 2 bis 5 in herkömmlicher Weise gelöst werden.

Die Sterilisation der erhaltenen Lösung kann in herkömmlicher Weise, beispielsweise durch Filtersterilisation, durchgeführt werden.

Die parenterale Lösung wird gewöhnlich in verschlossenen, sterilen Kunststoff- oder Glasbehältern präsentiert. Sie kann auch in Einheitsdosierungsformen, wie Ampullen, Phiolen oder Einweginjektionseinrichtungen, oder in Mehrfachdosierungsformen, wie in einem Infusionssäckchen oder -fläschchen, präsentiert werden. Das Volumen der in derartigen Behältern enthaltenen Lösung kann weitreichend variieren, beträgt aber zweckmäßigerweise 0,5 bis 20 ml.

Um den t-PA zu stabilisieren, wird die parenterale Lösung vorzugsweise gefroren und bei -10 bis -30 °C gehalten.

Die biologische Wirksamkeit von t-PA beim Lösen des Fibrinnetzes von Blutklümpchen hat zu seiner Verwendbarkeit bei der Behandlung von Thrombosekrankheiten geführt (The Lancet, 7. November 1981,1018-1020; ibid., 13. April 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 1984, 3101101. 609-613; und ibid., 1985,3121141.932-936). Die vorliegende Erfindung sieht daher auch ein Verfahren zur Behandlung einer Thromboseerkrankung bei einem Säuger vor, welches darin besteht, daß man dem Säuger eine wässerige parenterale Lösung von t-PA, wie oben definiert, verabreicht.

Spezielle Beispiele von Thromboseerkrankungen sind bekannt und umfassen Myokardinfarkt, Venenthrombose, Lungenembolie und Schlaganfall.

Die Hauptroute der Verabreichung der parenteralen Lösung ist durch intravaskuläre, insbesondere intravenöse Infusion, obwohl selbstverständlich andere Verabreichungsarten, wie intramuskuläre Verabreichung, angewendet werden können. Intravaskuläre Infusionen werden gewöhnlich mit der parenteralen Lösung durchgeführt, die in einem Infusionssäckchen oder -fläschchen oder in einer elektrisch betriebenen Infusionsspritze enthalten ist. Die Lösung kann von dem Infusionssäckchen oder -fläschchen an den Patienten durch Schwerkraftzufuhr oder durch die Verwendung einer Infusionspumpe abgegeben werden. Die Verwendung von Schwerkraftzufuhrinfusionssystemen bietet keine ausreichende Regulierung der Verabreichungsrate der parenteralen Lösung und daher wird die Verwendung einer Infusionspumpe besonders mit Lösungen, die relativ hohe Konzentrationen an t-PA enthalten, bevorzugt. Am meisten bevorzugt wird aber die Verwendung einer elektrisch betriebenen Infusionsspritze, die eine noch stärkere Regulierung der Verabreichungsrate bietet

Ein wirksamer Anteil an t-PA zur Behandlung eines Säugers mit einer Thromboseerkrankung hängt selbstverständlich von einer Reihe von Faktoren ab einschließlich beispielsweise dem Alter und der Masse des Säugers, dem präzisen Zustand, der einer Behandlung bedarf, und seiner Schwere, der Art der Verabreichung, und wird letzlich der Entscheidung des behandelnden Arztes oder Veterinärs überlassen bleiben. Es ist aber wahrscheinlich, daß ein wirksamer Anteil zum Lösen eines Thrombus in der Koronararterie beispielsweise im allgemeinen im Bereich von 150 000 bis 450 000 IE/kg Körpermasse des Patienten pro h liegen wird. So beträgt für einen 70 kg schweren Erwachsenen ein wirksamer Anteil pro Stunde im allgemeinen 10 000 000 bis 30 000 000 IE, insbesondere etwa 20 000 000 IE, und dieser Anteil kann mit oder ohne Startdosis verabreicht werden. Es ist auch wahrscheinlich, daß die Dosierung für manche thrombotische Zustände niedriger sein wird, wie Venenthrombose und akuter Schlaganfall, oder einfach zum Aufrechterhalten der Durchgängigkeit einer bereits wieder durchströmten Koronararterie. In diesen Situationen beträgt ein wirksamer Anteil im allgemeinen 7000 bis 36 000 IE/kg Körpermasse des Patienten pro Stunde.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie hierauf zu beschränken.

Beispiel 1:

Ein geklärter Ertrag von t-PA, erhalten von einer gezüchteten transformierten CHO-Zellinie, die unter Anwendung des Verfahrens von Molecular and Cellular Biology, 1985,5171.1750-1759, abgeleitet worden war, wurde chromatographisch gereinigt und der t-PA als eine wässerige Lösung enthaltend 0,17 M Natriumcitrat und 0,01 % (Masse/Vol.) Tween 80 bei einem pH von 5,5 gesammelt Der pH der Lösung wurde mit Salzsäure auf 3,0 eingestellt und die erhaltene Lösung durch Ultrafiltration unter Verwendung eines H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England) konzentriert Eine konzentrierte, gereinigte wässerige Lösung von t-PA (2 500 000 IE/m) enthaltend 0,1 M Natriumcitrat, 0,23 M Natriumchlorid (von der Zugäbe von Salzsäure stammend) und 0,01 % (Masse/Vol.) Tween 80 und mit einem pH von 3,0 wurde auf diese Weise erhalten. Diese Lösung wurde in ein Dialyserohr mit einer Molmassefraktion von etwa 14 000 gegeben und bei 4 °C gegen vier Änderungen von 50 Volumina filtersterilisierter, physiologischer Kochsalzlösung (0,85 % (Masse/Vol.) Natriumchlorid) mit einem Gehalt von 0,01 % (Masse/Vol.) Tween 80 gegeben und mit konz. Salzsäure auf einen pH von 3,0 eingestellt. Jeder Dialyseschritt wurde 12 h lang fortschreiten gelassen. Nach -5-

Claims

Nr. 391 812 Gewinnen der wässerigen Lösung aus dem Dialysesack wurde sie filtersterilisiert und mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, um 500 000 IE/ml t-PA zu enthalten. Die erhaltene parenterale Lösung wurde dann in Glasphiolen gefüllt, die verschlossen und gefroren sowie bei -20 °C gelagert wurden. Beispiel 2: Ein geklärter Ertrag von t-PA, erhalten von einer gezüchteten transformierten CHO-Zellinie, die unter Anwendung des Verfahrens von Molecular and Cellular Biology, 1985,5(71.1750-1759, abgeleitet worden war, wurde chromatographisch gereinigt und der t-PA als eine wässerige Lösung enthaltend 0,17 M Natriumcitrat und 0,01 % (Masse/Vol.) Tween 80 bei einem pH von 5,5 gesammelt Der pH der Lösung wurde mit Salzsäure auf 3,0 eingestellt und die erhaltene Lösung durch Ultrafiltration unter Anwendung eines H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershiie, England) konzentriert Die konzentrierte wässerige Lösung wurde weiter gereinigt, indem sie auf eine Gelfiltrationssäule (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Schweden) aufgebracht und mit 0,85 %iger Kochsalzlösung enthaltend 0,01 % (Masse/Vol.) Tween 80 bei einem pH von 3,0 eluiert wurde. Es wurde so eine stark gereinigte wässerige Lösung von t-PA erhalten, die noch einmal unter Verwendung einer künstlichen Einwegniere konzentriert wurde. Der t-PA wurde aus der Lösung ausgefällt, indem der pH mit Natriumhydroxid auf 5,5 erhöht wurde und die Suspension 2 h bei 4 °C gehalten wurde. Der t-PA wurde durch Zentrifugieren bei 4000 x g während 30 min bei 4 °C gewonnen. Das t-PA-Pellet wurde in einer wässerigen Lösung von Natriumchlorid (0,85 % (Masse/Vol.)) enthaltend 0,01 % (Masse/Vol.) Tween 80 wieder gelöst und mit Salzsäure auf pH 3,0 eingestellt Das Volumen an verwendeter Kochsalzlösung war jenes, das erforderlich ist um eine Konzentration des t-PA zwischen 7 500 000 IE/ml und 10 000 000 IE/ml zu ergeben. Diese Lösung von t-PA wurde mit weiterer wässeriger Lösung von Natriumchlorid (0,85 % (Masse/Vol.)) enthaltend 0,01 % (Masse/Vol.) Tween 80 verdünnt und mit Salzsäure auf pH 3,0 eingestellt und auch mit einem ausreichenden Anteil einer Lösung von 10 % (Masse/Vol.) Mannit in der gleichen sauren Kochsalzlösung, um Endkonzentrationen von 5 000 000 IE/ml t-PA und 25 mg/ml Mannit zu erhalten. Die erhaltene Lösung wurde filtersterilisiert und in Volumina von 1 ml in Glasphiolen verteilt die gefroren und bei -20 °C gelagert wurden. Die thrombolytische Wirksamkeit der parenteralen Lösung von Beispiel 1 wurde an einem in vivo-Modell von Jugidarvenenthrombose festgestellt (a) Verfahren Das Versuchsverfahren folgte im wesentlichen dem von Collen et al. (J. Clin. Invest, 1983, ü, 368-376) beschriebenen. Die parenterale Lösung von Beispiel 1 wurde auftauen gelassen und mit steriler isotonischer Kochsalzlösung, eingestellt auf einen pH von 3,0 und enthaltend 0,01 % Tween 80, verdünnt, um eine ausreichende Lösung für eine 2 h-Infusion von 500 000 IE/kg t-PA vorzusehen. Die Infusion erfolgte über eine Kanüle in die rechte Oberschenkelvene. Drei weiße Neuseelandkaninchen wurden bei der Untersuchung verwendet. Nach Infusion wurde der Grad an Thrombolyse festgestellt (bl Ergebnisse Die prozentuelle Thrombolyse betrug 22,3 ± 4,2, was den thrombolytischen Effekt der parenteralen Lösung von Beispiel 1 demonstriert. Weiterhin wurden mit der Infusion dieser Lösung keine schädlichen Reaktionen festgestellt. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zum Herstellen einer parenteralen Lösung des Gewebeplasminogenaktivators (t-PA), dadurch gekennzeichnet, daß man (a) eine gereinigte Lösung von t-PA herstellt und das Medium durch ein Medium mit einem pH von 2 bis 5 austauscht oder (b) t-PA in einem wässerigen Medium mit einem pH von 2 bis 5 löst und die erhaltene Lösung sterilisiert
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den t-PA entweder in Einketten- oder in Zweikettenform einsetzt -6- Nr. 391 812
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen t-PA einsetzt, der die in Fig. 1 angegebene Aminosäurefrequenz aufweist oder der die gleiche Aminosäuresequenz hat, wobei aber die Aminosäure in Stellung 245 vom Serin-N-Terminus Valin anstelle von Methionin ist und wobei jede Sequenz gegebenenfalls ohne irgendeine der ersten drei Aminosäuren ist oder gegebenenfalls eine zusätzliche Polypeptid-N-endständige Präsequenz von Gly-Ala-Arg aufweist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen t-PA einsetzt, der aus einer gezüchteten transformierten oder transfizierten Zellinie erhalten wird, die unter Anwendung von Rekombinations-DNA-Technologie abgeleitet wurde.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration des t-PA auf höher als 100 000 IE/ml, vorzugsweise höher als 500 000 IE/ml, insbesondere höher als 1 000 000 IE/ml, und ganz besonders auf etwa 5 000 000 IE/ml einstellt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH auf 2 bis 4,5, vorzugsweise 2,5 bis 4,0, insbesondere 2,8 bis 3,5, am meisten bevorzugt etwa 3,0, einstellt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium einsetzt, das zur Gänze oder im wesentlichen wässerig ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein physiologisch annehmbares Mittel zusetzt, das die Lösung mit menschlichem Blutserum im wesentlichen isotonisch macht.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als physiologisch annehmbares Mittel eine Salzlösung einsetzt.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als physiologisch annehmbares Mittel Natriumchlorid einsetzt.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als physiologisch annehmbares Mittel Dextrose einsetzt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man ein oberflächenaktives Mittel zusetzt. Hiezu 2 Blatt Zeichnungen -7-