DE69432179T3

DE69432179T3 - Eine formulierung des gerinnungsfaktors viii

Info

Publication number: DE69432179T3
Application number: DE69432179T
Authority: DE
Inventors: Jack Spira; Lars Widlund; Thomas ÖSTERBERG
Original assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1993-07-05
Filing date: 1994-03-31
Publication date: 2012-01-19
Anticipated expiration: 2014-04-01
Also published as: ES2193159T3; DK0710114T4; JP3827713B2; DE69432179D1; SE9401105D0; SE504074C2; US5972885A; DE69432179T2; CA2163112C; ES2193159T5; ZA942035B; EP0710114B2; DK0710114T3; SE9302308L; SE9302308D0; AU6762794A; ATE233099T1; PT710114E; MX9402339A; JPH09500624A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Formulierung zur subkutanen, intramuskulären oder intradermalen Verabreichung, welche rekombinanten Gerinnungsfaktor VIII umfasst, und die Verwendung von dieser zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Hämophilie. Die Formulierung, welche ein Volumen von 0,1 bis 2 ml aufweist, umfasst einen hochgereinigten rekombinanten Gerinnungsfaktor VIII in einer Konzentration von wenigstens 1000 IU/ml, was im Blutstrom nach subkutaner, intramuskulärer oder intradermaler Verabreichung überraschend hohe Spiegel des aktiven Faktors VIII ergibt. Die Formulierung ist gedacht zur Behandlung der Hämophilie durch subkutane, intramuskuläre oder intradermale Verabreichung. Der rekombinante Faktor VIII ist vorzugsweise ein Deletionsderivat von diesem, welches zur Herstellung eines Medikaments zur subkutanen Verabreichung verwendet werden kann.
Hintergrund der Erfindung
Hämophilie ist eine Erbkrankheit, welche seit Jahrhunderten bekannt ist; es wurde aber erst während der letzten drei Dekaden möglich, zwischen den verschiedenen Formen Hämophilie A, Hämophilie B und Hämophilie C zu differenzieren. Hämophilie A ist die häufigste Form. Sie betrifft nur männliche Personen, mit einem Auftreten von ein oder zwei Individuen pro 10 000 lebend geborenen männlichen Personen. Die Krankheit wird verursacht durch einen stark verminderten Spiegel oder ein Fehlen von biologisch aktivem Gerinnungsfaktor VIII (antihämophilem Faktor), welcher ein Protein ist, das normalerweise im Plasma vorliegt. Die klinische Manifestation von Hämophilie A ist eine starke Blutungsneigung, und bevor die Behandlung mit Faktor VIII-Konzentraten eingeführt wurde, betrug das mittlere Alter dieser Patienten weniger als 20 Jahre. Konzentrate von Faktor VIII, der aus dem Plasma erhalten wurde, stehen seit ca. drei Dekaden zur Verfügung. Dieses hat die Situation zur Behandlung von Hämophiliepatienten beträchtlich verbessert und diesen die Möglichkeit gegeben, ein normales Leben zu leben.
Therapeutische Faktor VIII-Konzentrate wurden bis heute durch Fraktionierung von Plasma hergestellt. Jedoch stehen heute Verfahren zur Herstellung von Faktor VIII in Zellkultur unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken zur Verfügung, wie beispielsweise in J. Gitschier et al., Nature 312, Seiten 330–37, 1984 und der EP-A-160 457 berichtet wird.
Faktor VIII-Konzentrate, die von menschlichem Plasma abgeleitet sind, enthalten mehrere fragmentierte voll aktive Faktor VIII-Formen (Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 83, Seiten 2979–83, Mai 1986). Die kleinste aktive Form weist ein Molekulargewicht von 170 kDa auf und besteht aus zwei Ketten mit 90 kDa und 80 kDa, welche durch eine Metallionenbrücke zusammengehalten werden. Hier wird auf die EP-A-197 901 Bezug genommen.
Kabi Pharmacia hat ein rekombinantes Faktor VIII-Produkt entwickelt, welches der Form des Plasmafaktors VIII mit 170 kDa in therapeutischen Faktor VIII-Konzentraten entspricht. Das trunkierte rekombinante Faktor VIII-Molekül wird r-VIII SQ genannt und wird durch Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO) in einem Zellkulturverfahren in serumfreiem Medium hergestellt.
Die Struktur und Biochemie der rekombinanten Faktor VIII-Produkte wurden im allgemelnen von Kaufman in Tibtech, Band 9, 1991 und Hematology, 63, Seiten 155–65, 1991 beschrieben. Die Struktur und Biochemie von r-VIII SQ wurden in der WO-A-91/09122 beschrieben.
Große Proteine werden normalerweise intravenös gegeben, so dass das Medikament direkt im Blutstrom verfügbar ist. Es wäre jedoch vorteilhaft, wenn ein Medikament subkutan, intramuskulär oder intradermal gegeben werden könnte, da diese Verabreichungsformen für den Patienten viel leichter zu handhaben sind. Insbesondere gilt dieses, wenn das Medikament regelmäßig während des ganzen Lebens genommen werden muss und die Behandlung früh beginnen soll, schon wenn der Patient ein Kind ist.
Jedoch weist ein Medikament mit einem sehr großen und labilen Molekül, wie z. B. Gerinnungsfaktor VIII mit 170 bis 300 kDa, normalerweise eine sehr niedrige Bioverfügbarkeit auf, wenn es subkutan, intramuskulär oder intradermal gegeben wird, da die Aufnahme nicht ausreicht und der Abbau gravierend ist. Nach unserer Kenntnis ist das einzige Gerinnungsfaktorprotein, das durch subkutane Injektion verabreicht wurde, Faktor IX (90 kDa).
Alle derzeit verfügbaren Faktor VIII-Präparationen auf dem Markt sind als eine Formulierung zur intravenösen Verabreichung hergestellt und sind mit menschlichem Serumalbumin stabilisiert.
Beschreibung der Erfindung
Zu unserer großen Überraschung haben wir gefunden, dass Faktor VIII, welcher ein sehr empfindliches Protein ist, subkutan gegeben werden kann und, im Gegensatz zu allen früheren Erfahrungen, haben wir eine annehmbare Absorption und einen hohen Spiegel von aktivem Faktor VIII-Protein im Blut erhalten.
Wir haben somit eine Formulierung entwickelt, die es möglich macht, Faktor VIII subkutan, intramuskulär oder intradermal zu verabreichen, und welche einen großen Vorteil für alle Patienten ergibt, die Faktor VIII benötigen.
Rekombinanter Faktor VIII SQ ist für die Behandlung der klassischen Hämophilie indiziert.
Die Halbwertszeit für r-VIII SQ beträgt für Menschen ungefähr 12 Stunden, wenn es intravenös injiziert wird.
Zur prophylaktischen Behandlung werden dreimal pro Woche 15 bis 25 IU/kg Körpergewicht Faktor VIII gegeben. Eine intravenöse Injektion enthält normalerweise 5 bis 10 ml.
Eine Injektion, die subkutan gegeben wird, enthält normalerweise zwischen 0,05 und 1 ml, und die Konzentration von Faktor VIII muss daher in einer solchen Formulierung sehr hoch sein.
Dieses kann beispielsweise mit unserem hochgereinigten rekombinanten Faktor VIII erreicht werden.
Die erfinderische Idee ist somit eine Kombination des Fundes, dass Faktor VIII in den Blutstrom absorbiert werden kann, wenn er als eine subkutane, intramuskuläre oder intradermale pharmazeutische Formulierung gegeben wird, und dass es möglich ist, eine Formulierung herzustellen, welche die benötigte hohe Konzentration von Faktor VIII zu diesem Zweck umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Formulierung, welche ein Volumen von 0,1 bis 2 ml aufweist, zur subkutanen, intramuskulären oder intradermalen Verabreichung, welche hochgereinigten rekombinanten Gerinnungsfaktor VIII in einer Konzentration von wenigstens 1000 IU/ml umfasst, wobei die Formulierung nach der Verabreichung im Blut einen therapeutischen Spiegel an Faktor VIII-Aktivität ergibt.
Die Zusammensetzung wird vorzugsweise subkutan gegeben.
Die Faktor VIII-Aktivität in der Formulierung beträgt wenigstens 1000 IU/ml, vorzugsweise mehr als 1500 IU/ml und am meisten bevorzugt von 5000 bis 100 000 IU/ml.
Das abgegebene Volumen beträgt vorzugsweise 0,25 bis 1,5 ml und noch bevorzugter 0,5 bis 1 ml. Das Volumen kann ebenfalls 0,1 bis 1 ml sein.
Faktor VIII ist rekombinant und kann entweder in Form seiner vollen Länge oder vorzugsweise als ein Deletionsderivat davon vorliegen. Insbesondere ist das Deletionsderivat der rekombinante Faktor VIII SQ (r-VIII SQ). Unter Deletionsderivat ist hier der Gerinnungsfaktor VIII gemeint, bei welchem die gesamte oder ein Teil der B-Domäne fehlt. Zusätzlich kann das r-VIII SQ-Molekül chemisch modifiziert sein, z. B. durch Pegylierung, kovalent mit Kohlenhydraten oder Polypeptiden verknüpft sein, um die Stabilität des Maleküls in vivo zu verbessern.
Unser verwendeter Faktor VIII ist hochgereinigt, d. h. weist eine spezifische Aktivität von mehr als 5000 IU/mg Protein, sogar mehr als 12 000 IU/mg auf und wird vorzugsweise ohne die Zugabe von Albumin stabilisiert.
Die Formulierung kann ebenfalls Natrium- oder Kaliumchlorid, vorzugsweise in einer Menge von mehr als 0,1 M, umfassen.
Calcium (oder andere zweiwertige Metallionen) ist notwendig, um die Assoziation der schweren und leichten Kette von Faktor VIII aufrechtzuerhalten. Es wird hier als Calciumchlorid (CaCl₂) zugegeben, aber andere Salze wie z. B. Calciumgluconat, Calciumglubionat oder Calciumgluceptat können ebenfalls verwendet werden. Die Zusammensetzung umfasst vorzugsweise Calciumchlorid oder Calciumgluconat in einer Menge von mehr als 0,5 mM.
Eine Aminosäure wird vorzugsweise verwendet, um das System abzupuffern, und sie schützt ebenfalls das Protein in der amorphen Phase, wenn die Formulierung gefriergetrocknet wird. Ein geeigneter Puffer wäre L-Histidin, Lysin und/oder Arginin.
L-Histidin wurde hauptsächlich aufgrund der guten Pufferkapazität von L-Histidin um pH 7 herum ausgewählt.
Die Formulierung, welche ein Volumen von 0,1 bis 2 ml aufweist, könnte umfassen

i) wenigstens 1500 IU/ml eines Deletionsderivats des rekombinanten Faktors VIII,
ii) wenigstens 0,01 mg/ml eines Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureesters,
iii) Natriumchlorid, vorzugsweise in einer Menge von mehr als 0,1 M,
iv) Calciumsalz, wie beispielsweise Calciumchlorid oder Calciumgluconat, vorzugsweise in einer Menge von mehr als 0,5 mM,
v) eine Aminosäure wie z. B. L-Histidin in einer Menge von mehr als 1 mM.

Ein nichtionisches Tensid kann ebenfalls in der Formulierung vorliegen und wird dann vorzugsweise ausgewählt aus Blockcopolymeren, wie beispielsweise einem Poloxamer, oder einem Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester, wie z. B. Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonolaurat oder Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat. Das nichtionische Tensid sollte, wenn es verwendet wird, vorzugsweise in einer Menge über der kritischen Mizellenkonzentration (CMC) vorliegen. Siehe Wan und Lee, Journal of Pharm Sci, 63, Seite 136, 1974.
Der Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester wird vorzugsweise in einer Menge von wenigstens 0,01 mg/ml verwendet.
Zu dieser Formulierung könnten Mono- oder Disaccharide oder Zuckeralkohole, vorzugsweise Sucrose, zugegeben werden. Ebenso könnten Antioxidantien wie z. B. Glutathion, Acetylcystein, Tocopherol, Methionin, EDTA, Zitronensäure, Butylhydroxytoluol und/oder Butylhydroxyanisol zugegeben werden. Weiterhin könnten Konservierungsmittel wie z. B. Benzylalkohol, Phenol, Sorbinsäure, Parabene und Chlorcresol zugegeben werden.
Die Formulierung umfasst vorzugsweise L-Histidin und Sucrose. Das Verhältnis von Natriumchlorid zu L-Histidin und Sucrose in der Zusammensetzung zum Gefriertrocknen beträgt geeigneterweise mehr als 1:1 (w:w), vorzugsweise mehr als 2:1 (w:w).
Die Formulierung könnte in einer getrockneten Form, vorzugsweise gefriergetrocknet, vorliegen. Das getrocknete Produkt wird mit sterilem Wasser zur Injektion oder einer pharmazeutisch verträglichen Pufferlösung rekonstituiert oder mit einer wässrigen Lösung, die Absorptionsverstärker oder Proteaseinhibitoren enthält, vor der Verabreichung gemischt oder rekonstituiert zu einem Volumen von 0,1 bis 2 ml.
Die beanspruchte Formulierung kann ebenfalls eine stabile wässrige Lösung sein, die zur Verabreichung bereit ist. Es kann ebenfalls eine Dispersion, z. B. eine Suspension, eine liposomale Formulierung oder eine Emulsion sein, aufweisend ein Volumen von 0,1 bis 2 ml.
Die Formulierung könnte in einer Umgebung mit verringertem Sauerstoff gelagert werden, wie in der parallelen Patentanmeldung PCT/SE94/00265 offenbart wird.
Absorptionsverstärker oder Proteaseinhibitoren könnten zugegeben werden. Beispiele für geeignete Absorptionsverstärker sind Phospholipide, Fettsäuren, Gallensalze, Salicylate und EDTA. Beispiele für geeignete Proteaseinhibitoren sind Aprotinin und EDTA.
Die beanspruchte Formulierung kann hergestellt werden, indem Faktor VIII mit einem nichtionischen Tensid in einer wässrigen Lösung, vorzugsweise zusammen mit einer Aminosäure wie z. B. L-Histidin, Natriumsalz, Sucrose und einem Calciumsalz gemischt wird oder indem Faktor VIII aus dem letzten Reinigungsschritt mit einem Puffer eluiert wird, welcher ein nichtionisches Tensid in einer wässrigen Lösung, vorzugsweise zusammen mit Natriumsalz, Sucrose, Calciumsalz und einer Aminosäure wie z. B. L-Histidin, enthält.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der beanspruchten Formulierung zur Herstellung eines Medikaments zur subkutanen, intramuskulären oder intradermalen Verabreichung zur Behandlung der Hämophilie, vorzugsweise die Verwendung eines Deletionderivats des rekombinanten Faktors VIII zur Herstellung eines Medikaments zur subkutanen Verabreichung. Das Medikament kann in einer stabilen wässrigen Lösung oder Dispersion oder gefriergetrocknet vorliegen. Sie betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung der Hämophilie durch subkutane, intramuskuläre oder intradermale Verabreichung der beanspruchten Formulierung.
Die Daten, welche in den Beispielen angegeben werden, zeigen, dass r-VIII SQ subkutan injiziert werden kann und in einer aktiven Form intravenös in vivo zurückgewonnen werden kann. Dieses ist ein sehr überraschender Fund, da früher keine solchen Formulierungen bekannt waren.
Der Schutz ist nicht auf eine Zusammensetzung, die unter diese Beispiele fällt, beschränkt.
EXPERIMENTELLES
Materialien und Methoden
Die Herstellung des rekombinanten Faktors VIII SQ (r-VIII SQ) wurde im wesentlichen wie in dem Patent WO-A-91/09122 , Beispiel 1–3, beschrieben durchgeführt. Eine DHFR-defiziente CHO-Zelllinie (DG44N.Y.) wurde einer Elektroporation mit einem Expressionsvektor, welcher das r-VIII SQ-Gen enthielt, und einem Expressionsvektor, welcher das Dihydrofolatreduktasegen enthielt, unterzogen. Nach Selektion auf selektiven Medien wurden überlebende Kolonien durch Kultivieren in schrittweise ansteigenden Mengen an Methotrexat amplifiziert. Der Überstand aus den resultierenden Kolonien wurde einzeln im Hinblick auf Faktor VIII-Aktivität gescreent. Ein Klon aus der Herstellung wurde ausgewählt, und dieser wurde anschließend an ein Wachstum in einer serumfreien Suspension in einem definierten Medium angepasst, und schließlich wurde ein Fermentationsprozess in großem Maßstab entwickelt. Überstand wird nach gewissen Zeiträumen gesammelt und weiter gereinigt, wie nachstehend beschrieben wird.
Der pH des aufgeklarten konditionierten Mediums wurde eingestellt, und dieses wurde auf eine S-Sepharose FF-Säule aufgetragen. Nach einem Waschen wurde Faktor VIII mit einem Salzpuffer, der 5 mM CaCl₂ enthielt, eluiert.
Eine Immunadsorption wurde auf einem Immunaffinitätsharz durchgeführt, wobei der Ligand ein monoklonaler Antikörper (8A4) war, der gegen die schwere Kette von Faktor VIII gerichtet war. Vor dem Laden auf die Säule wurde das S-Eluat mit 0,3% TNBP und 1% Octoxynol 9 behandelt.
Die Säule wurde äquilibriert, gewaschen, und Faktor VIII wurde mit einem Puffer eluiert, der 0,05 M CaCl₂ und 50% Ethylenglycol enthielt.
Das mAb-Eluat wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule geladen, die mit dem Elutionspuffer aus dem Immunaffinitätsschritt äquilibriert war. Nach einem Waschen wurde Faktor VIII mit 0,05 M L-Histidin, 0,6 M Natriumchlorid, 4 mM Calciumchlorid und pH 6,8 eluiert.
Das Q-Eluat wurde auf eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200 p. g.) aufgetragen. Äquilibrierung und Elution wurden mit einem Puffer durchgeführt, welcher L-Histidin, Natriumchlorid und Calciumchlorid enthielt. Der Proteinpeak wurde gesammelt, und die Lösung wurde vor dem Gefriertrocknen formuliert.
Das Material von r-VIII SQ wurde aus dem letzten Reinigungsschritt erhalten. Die Faktor VIII-Aktivität und die Konzentration der inaktiven Komponenten wurden eingestellt, indem mit einem geeigneten Puffer verdünnt wurde, der Polyethylenglycol (PEG) enthielt. Die Lösung wurde dann sterilfiltriert (0,22 μm), aufgeteilt und gefriergetrocknet.
BEISPIEL 1
Rekombinanter Faktor VIII wurde gemäß dem Verfahren hergestellt, das unter Experimentelles beschrieben ist.

Die gefriergetrocknete Zusammensetzung, die r-VIII SQ enthielt, war pro Fläschchen die folgende, welche in 4 ml sterilem Wasser zur Injektion rekonstituiert wurde: Zusammensetzung pro Fläschchen:

L-Histidin, mg	31,0
Natriumchlorid, mg	70,1
Calciumchlorid·(2 H₂O), mg	2,35
Polyethylenglycol (PEG 4000), mg	4,0
Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat
(Tween 80^®), mg	1
VIII:C eingefüllt, IU/Fläschchen	4400
VIII:C in rekonstituierter Lösung, IU/ml	1060

Männlichen Albinomäusen, die ca. 30 g wogen und zu dem Stamm NMRI, SPF gehörten, wurde subkutan in den Nacken die rekonstituierte r-VIII SQ-Lösung injiziert.
Das injizierte Volumen betrug bei dem Dosisniveau von 10 000 IU/kg 9,4 ml/kg und bei dem höheren Dosisniveau von 50 000 IU/kg, 5 mal mehr, 47 ml/kg. Bei der Placebobehandlung wurde Salzlösung, 9,4 ml/kg, verwendet. 3 bis 5 Minuten vor dem Entnehmen von Blutproben wurden die Mäuse intraperitoneal mit Mebumal^® (Pentobarbital) vet. 60 mg/ml betäubt. Das injizierte Volumen betrug 9,4 ml/kg, d. h. ca.
0,3 ml/Maus. Unter Betäubung wurden 0,45 ml Blut aus der Vena cava in Plastikspritzen entnommen, die 0,05 ml 0,13 M Natriumcitrat enthielten. Dann wurde aus dem entnommenen Blut durch Zentrifugation (8800 g für 7 Minuten) Plasma präpariert, und dieses wurde in Cryoflex-Plastikröhrchen bis zu der Zeit der Bestimmung der Faktor VIII-Aktivität bei –70°C eingefroren gelagert.
Ergebnisse:
TABELLE 1

VIII:C im Plasma aus Mäusen, welche r-VIII SQ, 10 000 IU/kg Körpergewicht, subkutan erhielten.

Zeit nach der	VIII:C	n
Verabreichung	(IU/ml)	Anzahl der
(Stunden)	X ± Sd	Beobachtungen
0	0,82 ± 0,43	12
0,33	1,23 ± 0,41	3
1,0	1,38 ± 0,56	4
1,5	1,83 ± 0,60	12
2,0	1,43 ± 0,91	8
4,0	1,34 ± 0,72	6
6,0	1,27 ± 0,42	4
8,0	1,55 ± 0,80	4
16,0	0,62 ± 0,28	4
20,0	0,58 ± 0,12	3
24,0	0,76 ± 0,53	4

TABELLE 2
Dosis-Reaktion bei Mäusen, die subkutan r-VIII SQ erhielten.
Dosis: verabreichte Dosis r-VIII SQ (IU/kg).

Reaktion: VIII:C im Plasma (IU/ml), 1,5 Stunden nach der subkutanen Verabreichung.

Dosis	Reaktion	Reaktion	n
(IU/kg)	(IU/ml)	(IU/ml)	Anzahl der
		(eingestellte	Beobachtungen
		Grundlinie)
Leerwert	0,82 ± 0,43	-	12
(Grundlinie)
Salzlösung	1,21 ± 0,34	0,39	4
10 000	1,83 ± 0,60	1,01	12
50 000	2,47 ± 0,60	1,65	6

Ergebnisse

1. Die Änderung von VIII:C im Plasma mit der Zeit nach einer subkutanen Dosis von r-VIII SQ, 10 000 IU/kg, zeigt das typische Muster für ein Arzneimittel, das aus einem subkutanen Depot absorbiert wird (siehe Tabelle 1). Der maximale VIII:C-Spiegel im Plasma zeigt sich nach ca. 1,5 Stunden nach der Verabreichung (siehe Tabelle 1).
2. Die Absorption von r-VIII SQ aus einem subkutanen Depot wird weiter durch die Zunahme der maximalen Konzentration verifiziert, welche sich zeigt, wenn die Dosis 5fach erhöht wird. Es wurde keine signifikante Wirkung auf den erhaltenen Plasmaspiegel von VIII:C beobachtet, wenn das subkutane Injektionsvolumen von 9,4 auf 47 ml/kg geändert wurde, während die Dosis von r-VIII SQ konstant gehalten wurde. Weiterhin war die VIII:C, die im Plasma erhalten wurde, im wesentlichen nicht von der Osmoialität der verabreichten Lösung abhängig.
3. Die Bioverfügbarkeit von r-VIII SQ nach subkutaner Verabreichung an die Maus betrug ca. 10% der Bioverfügbarkeit nach intravenöser Verabreichung. Die Bioverfügbarkeit wurde aus dem Bereich unter der Aktivitäts (VIII:C)-Zeit-Kurve berechnet.

BEISPIEL 2
Es wurde aus dem Plasma stammender Faktor VIII verwendet.
Die Zusammensetzung der eingefrorenen Lösung, welche aus dem Plasma stammenden Faktor VIII enthielt, war die folgende: Zusammensetzung pro ml:

L-Histidin, mg 7,8

Natriumchlorid, mg 35,1

Calciumchlorid··(2 H₂O), mg 0,59

Polyethylenglycol (PEG 4000), mg 1,0

humanes Albumin, mg 10,0

VIII:C, IU/ml 250
Männlichen Albinomäusen, die ca. 30 g wogen und zu dem Stamm NMRI, SPF gehörten, wurde subkutan in den Nacken die rekonstituierte Lösung des Faktors VIII injiziert.
Das injizierte Volumen bei dem Dosisniveau von 10 000 IU/kg betrug ca. 40 ml/kg. Bei der Placebobehandlung wurde eine Lösung, die 9% (w/v) Natriumchlorid enthielt, verwendet. 3 bis 5 Minuten vor dem Entnehmen von Blutproben wurden die Mäuse intraperitoneal mit Mebumal^® (Pentobarbital) vet. 60 mg/ml betäubt. Das Dosisvolumen betrug ca. 1,2 ml/Maus. Unter Betäubung wurden 0,45 ml Blut aus der Vena cava in Plastikspritzen entnommen, die 0,05 ml Natriumcitrat (0,13 M) enthielten. Aus dem Blut wurde durch Zentrifugation (8800 g für 7 Minuten) Plasma präpariert, und dieses wurde anschließend in Cryoflex-Plastikröhrchen bei –70°C bis zu der Bestimmung der VIII:C gelagert.
Ergebnisse:
TABELLE 3

VIII:C im Plasma aus Mäusen, die subkutan aus Plasma stammenden Faktor VIII, 10 000 IU/kg, erhielten. Die VIII:C in der Verabreichungslösung betrug ca. 250 IU/ml.

Zeit nach der	VIII:C	n
Verabreichung	(IU/ml)	Anzahl der
(Stunden)	X ± SD	Beobachtungen
0	1,04 ± 0,30	4
1	1,20 ± 0,53	4
1,5	1,39 ± 0,04	4
2	0,85 ± 0,34	4
4	1,19 ± 0,49	4
6	1,32 ± 0,53	4
8	1,15 ± 0,39	4
16	1,27 ± 0,08	4
20	1,17 ± 0,41	4
24	1,32 ± 0,21	4

Ergebnisse:
1. Die Bioverfügbarkeit des aus Plasma stammenden Faktors VIII ist gemäß den Ergebnissen der in vivo-Studie in Mäusen (Tabelle 3) recht niedrig. Die Bioverfügbarkeit des aus Plasma stammenden Faktors VIII beträgt ungefähr ca. 1/10 der Bioverfügbarkeit von r-VIII SQ. Somit ist die Bioverfügbarkeit von r-VIII SQ wesentlich höher als die Bioverfügbarkeit des Faktors VIII, der aus menschlichem Plasma stammt. Der maximale Plasmaspiegel von VIII:C zeigt sich nach ca. 1,5 Stunden nach der subkutanen Verabreichung.
BEISPIEL 3
Rekombinanter Faktor VIII wurde gemäß dem Verfahren hergestellt, das unter Experimentelles beschrieben wird, mit den folgenden Ausnahmen: (i) Das Material von r-VIII SQ, das aus dem letzten Reinigungsschritt erhalten wurde, wurde mit einem Puffer verdünnt, der kein PEG enthielt, (ii) die r-VIII SQ-Lösung wurde nicht gefriergetrocknet, sie wurde bei –70°C gelagert.

Die r-VIII SQ-Lösung wies die folgende Zusammensetzung auf: Zusammensetzung pro Fläschchen:

L-Histidin, mg	7,5
Sucrose, mg	158
Natriumchlorid, mg	45
Calciumchlorid·(2 H₂O), mg	1,25
Polyoxyethylen-(20)-sorbitanmonooleat
(Tween 80^®), mg	0,50
VIII:C eingefüllt, IU/Fläschchen	6070
VIII:C, IU/ml*	1130

* Verdünnte r-VIII SQ-Lösung (1 Teil r-VIII SQ-Lösung + 1 Teil Wasser, v:v).

Die r-VIII SQ-Lösung wurde vor der Verabreichung mit sterilem Wasser zur Injektion (1 Teil der r-VIII SQ-Lösung + 1 Teil Wasser, v:v) verdünnt, wenn die Dosis von VIII:C unter 3000 IU/kg Körpergewicht lag.
Weiblichen Javaneraffen (Macaca fascicularis), die ca. 3–3,5 kg wogen, wurde die r-VIII SQ-Lösung subkutan in den dorsalen Bereich injiziert. Abhängig von der Dosis variierte das Injektionsvolumen zwischen ungefähr 0,2 bis 2,0 ml/kg Körpergewicht. Subkutane Injektionen mit Einzeldosen von 250, 2500 und 5000 IU/kg wurden verabreicht. Bei jeder Probennahme wurden 1,8 ml Blut in Röhrchen entnommen, die Citrat als Antikoagulans (0,2 ml) enthielten. Nach einer Zentrifugation wurde Plasma abgetrennt und in Aliquots eingefroren (< –60°C).
Ergebnisse:
TABELLE 4

VIII:C im Plasma aus Affen, die r-VIII SQ, 250 IU/kg, subkutan erhielten. Die VIII:C in der Verabreichungslösung betrug ca. 1130 IU/ml.

Affe Nr.	1	2	3
Probennahme	VIII:C	VIII:C	VIII:C
nach Injektion	(IU/ml)	(IU/ml)	(IU/ml)
(Stunden)
0	2,15	1,49	1,76
1	2,32	1,75	1,92
4	2,43	1,52	1,89
8	2,48	1,67	1,92
10	2,41	1,76	2,03
12	2,29	1,70	2,01
14	2,20	1,69	2,00
24	1,76	1,32	1,98
30	2,31	1,46	1,90
48	2,18	1,64	1,96

TABELLE 5

VIII:C im Plasma aus Affen, die r-VIII SQ, 2500 IU/kg, subkutan erhielten. Die VIII:C in der Verabreichungslösung betrug ca. 1130 IU/ml.

Affe Nr.	4	5	6
Probennahme	VIII:C	VIII:C	VIII:C
nach Injektion	(IU/ml)	(IU/ml)	(IU/ml)
(Stunden)
0	1,95	1,35	2,30
2	2,43	1,86	3,05
6	3,51	2,45	3,59
9	3,91	2,47	4,16
11	3,47	2,24	3,68
13	3,11	2,06	3,34
22	2,38	1,55	2,79
40	2,01	1,49	2,38

TABELLE 6

VIII:C im Plasma aus Affen, die r-VIII SQ, 5000 IU/kg, subkutan erhielten. Die VIII:C in der Verabreichungslösung betrug ca. 2470 IU/ml.

Affe Nr.	7	8	9
Probennahme	VIII:C	VIII:C	VIII:C
nach Injektion	(IU/ml)	(IU/ml)	(IU/ml)
(Stunden)
0	2,04	1,78	1,54
2	2,99	2,37	2,99
6	4,56	3,33	5,32
9	4,75	3,89	5,70
11	4,72	3,82	5,46
13	4,23	3,06	4,63
22	3,03	2,33	3,46
40	2,76	1,77	2,60

TABELLE 7
Dosis-Reaktion bei Affen, die r-VIII SQ subkutan erhielten.
Dosis: verabreichte Dosis r-VIII SQ (IU/kg Körpergewicht).

Reaktion: VIII:C im Plasma (IU/ml), ca. 9 Stunden nach der Verabreichung.

Dosis	Reaktion	Reaktion	n
(IU/kg) (IU/ml)		(IU/ml)	Anzahl der
		(eingestellte	Beobachtungen
		Grundlinie)
Leerwert	1,8 ± 0,3	-	9
(Grundlinie)
250		0,37 ± 0,05	3
2500		1,70 ± 0,06	3
2500		2,05 ± 0,57	3
5000		3,04 ± 1,20	3

Ergebnis

1. Entsprechend den Ergebnissen (Tabelle 4–6) folgt die Plasmakonzentration als eine Funktion der Zeit dem typischen Muster für ein Arzneimittel, das nach subkutaner Verabreichung absorbiert wird. Die maximale Konzentration von VIII:C sieht man Ca. 9 Stunden nach der Verabreichung.
2. Die erhaltene Dosisreaktionsbeziehung (Tabelle 7) ergibt eine weitere Bestätigung, dass eine Absorption von VIII:C in den Blutstrom, die einer subkutanen Injektion folgt, vorliegt.
3. Die Bioverfügbarkeit von r-VIII SQ nach subkutaner Verabreichung in Affen betrug Ca. 5 bis 10%. Die Bioverfügbarkeit wurde aus der Fläche unter der Aktivitäts (VIII:C)-Zeit-Kurve berechnet. Die Bioverfügbarkeit war im wesentlichen von der Dosis von r-VIII SQ unabhängig.

Claims

Eine pharmazeutische Formulierung, welche ein Volumen von 0,1 bis 2 ml aufweist und die zur subkutanen, intramuskulären oder intradermalen Verabreichung geeignet ist, welche hochgereinigten rekombinanten Gerinnungsfaktor VIII in einer Konzentration von wenigstens 1.000 IU/ml umfasst.
Die Formulierung gemäß Anspruch 1, welche zur subkutanen Verabreichung ausgelegt ist.
Die Formulierung gemäß Anspruch 1 oder 2, in welcher die Aktivität des Faktors VIII mehr als 1.500 IU/ml beträgt.
Die Formulierung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, in welcher der Faktor VIII ein Deletionsderivat des rekombinanten Gerinnungsfaktors VIII ist, bei welchem die gesamte oder ein Teil der B-Domäne fehlt.
Die Formulierung gemäß Anspruch 1, welche umfasst: (i) wenigstens 1.500 IU/ml eines Deletionsderivats des rekombinanten Faktors VIII, bei welchem die gesamte oder ein Teil der B-Domäne fehlt; (ii) wenigstens 0,01 mg/ml eines Polyoxyethylensorbitanfettsäureesters; (iii) Natriumchlorid; (iv) ein Calciumsalz; und (v) eine Aminosäure in einer Menge von mehr als 1 mM.
Die Formulierung gemäß Anspruch 4 oder 5, in welcher das Deletionsderivat des Faktors VIII das Deletionsderivat ist, das als ”Faktor VIII SQ” bezeichnet wird.
Die Formulierung gemäß Anspruch 6, in welcher der Faktor VIII SQ durch Pegylierung oder kovalent verknüpfte Kohlenhydrate oder Polypeptide chemisch modifiziert wurde.
Die Formulierung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, welche eine stabile wässrige Lösung ist, die zur Verabreichung bereit ist.
Die Formulierung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, welche vor der Verabreichung mit einer wässrigen Lösung, die Absorptionsverstärker oder Proteaseinhibitoren enthält, gemischt oder rekonstruiert wird.