CH665356A5

CH665356A5 - Pharmazeutische formulierung.

Info

Publication number: CH665356A5
Application number: CH2126/86A
Authority: CH
Inventors: Michael Denis Johnston; Henry Berger
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1985-05-28
Filing date: 1986-05-27
Publication date: 1988-05-13
Also published as: FR2583984A1; DK163173C; US4968617A; GB8612780D0; ES8800601A1; SE8602405L; AU567236B2; DE3617752C2; ES555353A0; ES8802439A1; GB2176702B; IL78938A; CA1300008C; IL78938A0; DK246786D0; PT82646A; FI862227A0; NZ216307A; HUT41638A; GR861366B

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten pharmazeutischen, einen Gewebeplasminogenaktivator, t-PA abgekürzt, enthaltende Formulierung.

Es wird angenommen, dass ein dynamisches Gleichgewicht zwischen dem Enzymsystem, das in der Lage ist, Blutgerinnsel zu bilden — das Koagulationssystem — und dem Enzymsystem, das in der Lage ist, Blutgerinnselbildung aufzulösen — das fibrinolytische System — besteht, das ein offenes Gefassbett intakt hält. Um den Blutverlust bei Verletzungen in Grenzen zu halten, werden Blutgerinnsel in den verletzten Gefässen gebildet. Nach der natürlichen Reparatur der Verletzung werden die überflüssigen Blutgerinnsel durch Einwirkung des fibrinolytischen Systems aufgelöst. Gelegentlich werden Blutgerinnsel gebildet, ohne dass eine traumatische Verletzung vorhanden ist, und können sich in den Hauptblutgefassen festsetzen, was eine teilweise oder sogar völlige Blutflussbehinderung zur Folge hat. Kommt dies im Herzen, der Lunge oder im Gehirn vor, kann dies zu einem Myokardinfarkt, einer Lungenembolie oder einem Schlaganfall führen. Diese Bedingungen zusammen sind die primären Ursachen für die Mortalität und Morbidität in den Industrienationen.

Blutgerinnsel bestehen aus einem Gewebenetz, das durch das proteolytische Enzym, Plasmin, aufgelöst werden kann. Das Enzym wird dem inaktiven Proenzym, dem Plasminogen, einem Bestandteil des Blutplasmas, unter Einwirkung eines Plasminogenaktivators entnommen. Es gibt zwei immunologisch unterschiedliche Plasminogenaktivatoren bei Säugetieren. Der intrinsische Plasminogenaktivator, auch als Urokinase bekannt, ist ein Enzym, das von der Niere erzeugt wird und aus dem Urin isoliert werden kann. Es kann eben5

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falls aus verschiedenen Gewebekulturen hergestellt werden. Der extrinsische Plasminogenaktivator, auch als Gefassplas-minogenaktivator und als Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) bekannt, kann aus vielen Gewebehomogenaten (besonders dem menschlichen Uterus), aus den Gefässzellwänden und einigen Zellkulturen isoliert werden. Ausser diesen beiden Arten von Plasminogenaktivatoren gibt es noch ein bakterielles Produkt, die Streptokinase, die aus beta-hämolyti-schen Streptokokken hergestellt wird. Ein Hauptnachteil sowohl der Urokinase als auch der Streptokinase besteht darin, dass sie innerhalb des ganzen Blutkreislaufs und nicht nur an der Stelle des Blutgerinnsels wirksam sind. Sie können zum Beispiel auch andere Blutproteine, wie zum Beispiele Fibrinogen, Prothrombin, Faktor V und Faktor VIII, zerstören und dadurch die Fähigkeit der Blutgerinnselbildung verringern und das Risiko der Hämorrhagie erhöhen. Dagegen hängt die biologische Aktivität des t-PA vom Vorhandensein des Fibrins ab, an das es sich bindet und wo es aktiviert wird. Die maximale Aktivität entwickelt sich daher nur an der Stelle eines Blutgerinnsels, d.h. bei Vorhandensein eines Fibrinnetzes, das aufgelöst werden soll, und dies verhütet grösstenteils das Risiko von Hämorrhagien.

Der Hauptverabreichungsweg für t-PA ist durch intravaskuläre Infusion, was voraussetzt, dass das t-PA als parenterale Lösung formuliert wird. Im Falle eines Proteins ist es wünschenswert, das Arzneimittel dem Arzt oder Tierarzt in Form einer gefriergetrockneten, pharmazeutischen Formulierung anzubieten, aufgrund ihres wesentlichen Transport-und Lagervorteils gegenüber einer flüssigen Formulierung. Es ist jedoch wichtig, dass eine jede solche gefriergetrocknete Formulierung leicht in die gewünschte, parenterale Lösung ohne übermässige Unannehmlichkeiten oder Schwierigkeiten umgewandelt werden kann, so dass der Arzt oder Tierarzt dann die gewünschte Konzentration des Arzneimittels einfach durch Rekonstitution der Formulierung in einer angebrachten Menge des Lösungsmittels in jeder Situation erhalten kann. Es ist zum Beispiel nicht empfehlenswert, einem Patienten mit Herz- oder Nierenstörungen eine grosse Menge einer Lösung zu verabreichen, da diese das Herz oder die Nieren nur noch mehr belasten würde. Das Volumen sollte deshalb unter diesen Umständen auf einem Minimum gehalten werden. Es ist daher wünschenswert, dass eine parenterale Lösung nicht nur mit einer relativ niedrigen Konzentration, sondern auch mit einer hohen Konzentration des Arzneimittels erhalten werden kann.

Eine Anzahl von gefriergetrockneten, pharmazeutischen t-PA-Formulierung sind in der Technik bereits beschrieben worden, und zwar zum Beispiel in EP-A-113 319 und EP-A-123 304. Die Formulierungen sind wässrige Salzlösungen des t-PA, deren pH-Wert ungefähr neutral ist, und die den Nachteil haben, dass die Löslichkeit des t-PA in solchen Lösungen niedrig ist, wenn kein Ansteigen der ionischen Konzentration vorhanden ist. Folglich enthalten diese parenteralen Lösungen, die aus solchen gefriergetrockneten Formulierungen erhalten wurden, entweder niedrige Konzentrationen an t-PA, die in einigen Fällen die Verabreichung an den Patienten von unwünschenswert grossen Volumen der Lösung verlangen, oder sie sind hypertonisch, was bedeutet, dass eine Verabreichung für die roten Blützellen schädlich sein kann.

Es ist nun festgestellt worden, dass die Löslichkeit des t-PA in einer wässrigen Lösung verbessert werden kann, wenn der pH-Wert der Lösung innerhalb dem Säurebereich liegt, dass eine gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung aus einer solchen sauren t-PA-Lösung hergestellt werden kann, und dass die Formulierung eine parenterale Lösung bietet, die bei der Verabreichung keine physiologischen Probleme zeigt. Folglich sieht die vorliegende Erfindung ein

Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten, pharmazeutischen Formulierung von t-PA, das Vakuumtrocknen einer gefrorenen, wässrigen t-PA-Lösung umfasst und einen pH-Wert im Bereich von 2 bis 5 aufweist. '

Ein Ergebnis der verbesserten Löslichkeit des t-PA besteht darin, dass eine gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung gemäss der vorliegenden Erfindung hergestellt werden kann, die in der Lage ist, eine parenterale Lösung mit einer hohen t-PA-Konzentration bereitzustellen, ohne dass im wesentlichen das Risiko besteht, dass das t-PA aus der Lösung ausfällt. Die gefriergetrocknete Formulierung kann daher Ärzten oder Tierärzten angeboten werden, die die Formulierung wann immer nötig auf die gewünschte Konzentration, zum Beispiel mit Wasser mit einem neutralen pH-Wert oder ein wässriges Medium mit saurem pH-Wert zu verdünnen. Die vorliegende Erfindung sieht daher eine stabile, gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung vor, die eine grössere Flexibilität bei der Verwendung und beim Gebrauch durch Ärzte und Tierärzte als auch für bessere Transport- und Lagermöglichkeiten bietet.

Das in der vorliegenden Erfindung verwendete t-PA kann irgendein bioaktives Protein sein, das im wesentlichen t-PA von Säugetieren, und besonders von Menschen, entspricht und Formen mit und ohne Glykosylierung umfasst. Es kann ein- oder zweikettiges t-PA oder eine Mischung der beiden sein, wie es im EP-A-112 122 beschrieben ist, und im Falle von vollständig glykosyliertem, menschlichen t-PA besitzt es ein scheinbares Molekulargewicht auf Polyacrylamiden Gels von ungefähr 70 000 und einen isoelektrischen Punkt zwischen 7,5 und 8,0. Vorzugsweise hat das t-PA eine spezifische Aktivität von ungefähr 500 000 IE/mg (Internationale Einheiten/mg, wobei die Internationale Einheit eine Aktivitätseinheit ist, die von der Weltgesundheitsorganisation WHO näher bestimmt ist und zwar von deren Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hamp-stead, London NW3 6RB, Grossbritannien.

Die Aminosäuresequenz des t-PA entspricht vorzugsweise im wesentlichen dem in Figur 1 dargestellten. Die Sequenz ist daher mit jener von Figur 1 identisch oder enthält eine oder mehrere Aminosäureauslöschungen, -ersetzungen, -ein-fügungen, umkehrungen oder -zusätze von allelischem oder anderen Ursprungs, wobei die daraus resultierende Sequenz mindestens 80% und vorzugsweise 90% Homologie mit der Sequenz von Figur 1 aufweist und im wesentlichen dieselben biologischen und immunologischen Eigenschaften des Proteins umfasst. Die t-PA-Sequenz ist im besonderen mit der aus Figur 1 identisch oder hat dieselbe Sequenz, wobei jedoch die Aminosäure in der 245-ten Position ausgehend von dem Serin-N-Terminus, Valin anstelle von Methionin ist, wobei jede Sequenz wahlweise ohne irgendeine der drei ersten Aminosäuren oder wahlweise einen zusätzlichen Poly-peptid-N-Terminus, eine Vorsequenz des Gly-Ala-Arg, aufweist.

Die in Figur 1 dargestellte Aminosäurensequenz hat fünfunddreissig Cysteinreste und daher ein Potential zur Bildung von siebzehn Disulfidbrücken. Basierend auf der Analogie mit anderen Proteinen, deren Struktur ausführlicher dargelegt worden ist, ist die angenommene Sequenzstruktur (die sich aus der Bildung der Disulfidbindung ergibt) zwischen der Aminosäure in der 90sten Position und dem Pro-lin-C-Terminus in Figur 2 dargestellt. Die Struktur der N-Terminus-Gegend ist weniger sicher, obwohl einige Vorschläge ausgearbeitet worden sind (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 269—273; und Proc. Nati. Acad. Sei., 1984, 81, 5355 — 5359). Die wichtigsten Merkmale der t-PA-Struktur sind zwei Kringel-Bereiche (zwischen der 92sten und der 173sten Aminosäure und der 180sten und der 261sten Aminosäure), die für die Bindung des Proteins an das Fibrin ver5

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antwortlich sind, und der Serinproteasebereich, der den Hauptteil der B-Kette umfasst, und die für die Aktivierung des Plaminogen verantwortlich ist. Die Aminosäuren, die von besonderer Bedeutung für die Serinprotease sind, ist das katalytische Trias, His/Asp/Ser. Im t-PA treten diese drei in der 322sten, der 371 sten und der 463sten Position auf. Die Disulfidbrücke zwischen den 264sten und den 395sten Cy-stein-Aminosäureresten ist ebenfalls wichtig, da sie die A-und B-Ketten bei der zweikettigen Form des t-PA zusammenhält.

In Figur 1 und 2 sind die üblichen ein und dreistelligen Buchstabenkodes für die Aminosäurereste wie folgt verwendet:

Asp

D

Asparaginsäure

Thr

T

Threonin

Ser

S

Serin

Glu

E

Glutaminsäure

Pro

P

Prolin

Gly

G

Glycin

Ala

A

Alanin

Cys

C

Cystein

Val

V

Valin

Met

M

Methionin

Ile

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Isoleucin

Leu

L

Leucin

Tyr

Y

Tyrosin

Phe

F

Phenylalanin

His

H

Histidin

Lys

K

Lysin

Arg

R

Arginin

Trp

W

Tryptophan

Gin

Q

Glutamin

Asn

N

Asparagin

Man erhält das t-PA durch irgendein beschriebenes oder in der Technik bekanntes Verfahren. Es kann zum Beispiel aus einer normalen oder neoplastischen Zellinie erhalten werden, wie in Biochimica et Biphysica Acta, 1979, 580, 140—153; EP-A-41 766 oder EP-A-113 319 beschrieben. Vorzugsweise jedoch sollte das t-PA aus einer kulivierten, transformierten oder transflzierten (transfected) Zellinie erhalten werden, die mit Hilfe der rekombinierten DNS-Tech-nologie verwendet wird, so wie es zum Beispiel in EP-A-93 619, EP-A-117 059 oder in EP-A-117 060 beschrieben worden ist. Es ist vor allem vorzusehen, dass die Zellen der Eierstöcke von chinesischen Hamstern (CHO) zur Herstellung von t-PA verwendet und derart entnommen werden wie es in Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750—1759 beschrieben ist. Auf diese Art und Weise wird das klonierte Gel mit dem Gen kotransfiziert, indem das Gen die Dihy-drofolatreduktase (dhfr) in dhfr-CHO-Zellen aufschlüsselt. Transformaten, die das dhfr exprimieren, werden auf nu-kleosidenlosett Medien ausgewählt und einer steigenden Konzentration von Methotrexaten ausgesetzt. Die dhfr und die t-PA-Gene werden so koamplifiziert und führen zu einer stabilen Zellinie, die in der Lage ist, die hohen Niveaus des t-PA zu exprimieren.

Das t-PA wird vorzugsweise gereinigt, indem man irgendeines der beschriebenen oder in der Technik bekannten Verfahren verwendet, wie zum Beispiel die Verfahren, die in Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140 — 153; J. Biol. Chem.. 1979 254(6), 1998-2003; ibid 1981, 256(13), 7053-7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41 766; EP-A-113 319 oder GB-A-2 122 219 beschrieben sind.

Es gibt anscheinend keine Grenze nach oben für die Löslichkeit des t-PA in der wässrigen Lösung. Bei sehr hohen Konzentrationen, wie beispielsweise grösser als 150 000 000 IE ml (Internationale Einheiten/ml), wird die Lösung lediglich viskos, ohne jedoch irgendwelche bedeutenden Ausfälle von t-PA. Die Konzentration des t-PA in der wässrigen Lösung kann daher innerhalb weiter gesteckten Grenzen variieren, zum Beispiel zwischen 50 000 und 50 000 000 IE/ml. Um den grösstmöglichen Vorteil der vorliegenden Erfindung zu sichern, wird eine t-PA-Konzentration von mehr als 100 000 IE/ml vorgezogen, ganz besonders grösser als 500 000 IE/ml und am meisten bevorzugt grösser als 1 000 000 IE/ml. Es wird eine t-PA-Konzentration von ungefähr 5 000 000 IE/ml am meisten bevorzugt.

Die oberste Grenze des pH-Werts der wässrigen Lösung ist vorzugsweise 4,5. Vorzugsweise liegt der pH-Wert in einem Bereich zwischen 2,5 und 4,0, noch bevorzugter wird ein Bereich zwischen 2,8 und 3,5 und am meisten bevorzugt wird ein Wert von ungefähr 3,0. Der gewünschte pH-Wert der wässrigen Lösung wird vorteilhafterweise erhalten, indem man eine physiologisch akzeptable, anorganische oder organische Säure verwendet. Beispiele solcher Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure und Salpetersäure, Zitronensäure, Weinsteinsäure und Benzolsulfonsäure. Von diesen Beispielen wird die Salzsäure bevorzugt.

Obwohl einige physiologisch akzeptable Ko-Lösungsmit-tel wahlweise zusätzlich zum Wasser vorhanden sein können, ist es vorzuziehen, dass das Medium für die wässrige Lösung vollständig oder im wesentlichen wässrig ist.

Die parenterale Lösung, die aus der gefriergetrockneten, pharmazeutischen Formulierung erhalten wurde, kann zusammen mit dem Blutserum des Patienten hypertonisch, hypotonisch oder isotonisch sein. Um unerwünschte Nebenwirkungen zu vermeiden, soll die parenterale Lösung vorzugsweise isotonisch sein, obwohl geringe Abweichungen nicht von grosser, physiologischer Bedeutung sind. Eine im wesentlichen isotonische, parenterale Lösung kann durch Einschluss eines physiologisch akzeptablen Mittels erhalten werden, das in der Lage ist, der Tonus der Lösung auf das gewünschte Niveau zu bringen. Das Mittel kann schon in der wässrigen Lösung, die gefriergetrocknet werden soll, enthalten sein, sodass sie bereits in der gefriergetrockneten, pharmazeutischen Formulierung vorhanden ist, oder es kann im Wasser mit neutralem oder saurem pH-Wert enthalten sein, das verwendet wird, um die Formulierung zu verdünnen, und dadurch die parentereale Lösung zu erhalten. Beispiele eines solchen Mittels sind allgemein in der Technik bekannt und enthalten Dextrose (in wasserfreier oder monohydratischer Form) und Natriumchlorid und Mischungen davon. Die Konzentration des Mittels in der wässrigen Lösung wird natürlich von Mittel zu Mittel variieren. Im Fall von Natriumchlorid liegt die Konzentration vorzugsweise in einem Bereich von 7 bis 10 mg/ml und am meisten bevorzugt ist eine Konzentration von ungefähr 8,5 mg/ ml, wobei man diese Konzentration oft als physiologische Kochsalzlösung bezeichnet. Im Falle der wasserfreien Dextrose liegt die Konzentration vorzugsweise in einem Bereich von 30 bis 70 mg/ml und am meisten bevorzugt ist ein Wert von ungefähr 50 mg/ml.

Die wässrige Lösung kann wahlweise Zusätze enthalten, die normalerweise in gefriergetrockneten, pharmazeutischen Formulierungen dieser Art vorhanden sind. Beispiele umfassen das Albumin des menschlichen Serums und Binde- und Füllmittel, wie zum Beispiel Mannitol, Laktose und Glukose. Zusätzlich hat das t-PA die Neigung, an Glas und Plastikoberflächen zu adsorbieren, und es kann daher wünschenswert sein, einen oberflächenaktiven Stoff in der wässrigen Lösung zu haben, um ein solches Adsorbieren zu verhindern oder auf das Mindestmass zu verringern. Beispiele eines solchen Mittels sind Polyoxyethylen-Derivate von Fettsäureteilestern der Sorbit-Anhydriden, die im Handel unter dem Handelsnamen «Tween 80» erhältlich sind.

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Einer der überraschenden Vorteile der vorliegenden Erfindung ist, neben der im wesentlichen erhöhten Löslichkeit des t-PA, dass die Verwendung einer sauren, parenteralen Lösung, die durch Rekonstitution der gefriergetrockneten, pharmazeutischen Formulierung erhalten wurde, keine bedeutende, gegenteilige, physiologische Wirkung bei der Verabreichung an den Patienten zu zeigen scheint. Es scheint, dass die Blutbahn allgemein in der Lage ist, den pH-Wert einer Lösung auf beinahe neutral zu erhöhen, sobald sie damit in Verbindung kommt und dadurch das t-PA schnell innerhalb der Blutbahn verteilt wird. Es wird jedoch vorgezogen, dass dieser Vorgang nicht wesentlich auf irgendeine Art und Weise behindert wird, und dass die parenterale Lösung und ebenfalls die wässrige Lösung, die gefriergetrocknet werden soll, und das Wasser zur Rekonstitution kein starkes Puffermittel enthalten. Ein schwaches Puffermittel, das diesen Vorgang nicht wesentlich hemmt, kann jedoch enthalten sein, und das t-PA handelt bei einem sauren pH-Wert tatsächlich als sein eigenes schwaches Puffermittel. Zusätzlich kann das menschliche Serum Albumin als schwaches Puffermittel wirken.

Aufgrund der wesentlich erhöhten Löslichkeit des t-PA in einer wässrigen Lösung, bei der der pH-Wert im Bereich von 2 bis 5 liegt, ist es nicht nötig, in der parenteralen Lösung, die durch Rückbildung aus der gefriergetrockneten Formulierung erhalten wurde, Zusatzstoffe, wie Lysin oder Ornithin oder ein Salz davon, hinzuzufügen, um die Löslichkeit des t-PA zu erhöhen.

Die wässrige Lösung kann hergestellt werden, indem man eine Lösung des gereinigten t-PA erhält und das Medium durch ein wässriges Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 austauscht oder das gereinigte t-PA in einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 verdünnt.

Die Reinigung des t-PA kann in einem Endstadium die Eluierung des Proteins von einer chromatographischen Säule wie zum Beispiel einer Lösung, die ein starkes Puffermittel enthält, umfassen. Wie schon zuvor erwähnt, ist es vorzuziehen, dass die parenterale Lösung, und daher auch nicht die gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung und die wässrige Lösung, kein starkes Puffermittel enthalten, und daher ist als vernünftiges Mittel zur Durchführung dessen Entfernung und während dem Auswechseln des Mediums, die Dialyse zu verwenden. Dies kann durchgeführt werden, indem man eine Dialyseröhre oder eine künstliche Niere verwendet, in der eine gereinigte Lösung gegen eine wässrige Lösung mit einem pH-Wert im Bereich von 2 bis 5 dialysiert wird. Es kann wünschenswert sein, zuerst den pH-Wert der Lösung auf einen Wert in einem Bereich von 2 bis 5 anzugleichen, besonders wenn die t-PA-Konzentration in der gereinigten Lösung hoch ist. Ein anderes Mittel zur Durchführung des Entfernens eines starken Puffermittels während dem Auswechseln des Mediums besteht darin, die gereinigte Lösung einer Gelfiltrierung zu unterwerfen und eine Säule mit einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 zu entwickeln.

t-PA in Form eines festen Niederschlags kann vorzugsweise aus einer gereinigten Lösung erhalten werden, indem man den pH-Wert auf ungefähr 5,5 angleicht, die Lösung abkühlt, um sie gerade über ihrem Gefrierpunkt zu halten, und das Protein, z. B. durch Zentrifugierung wieder zu erhalten. Der feste Niederschlag kann dann in einem wässrigen Medium mit einem pH-Wert von 2 bis 5 auf die übliche Art und Weise aufgelöst werden.

Es ist vorzuziehen, dass die so erhaltene wässrige Lösung auf konventionelle Art und Weise, zum Beispiel durch Fil-tersterilisierung sterilisiert wird, und dass sie dann in sterile Plastik- oder Glasbehälter, wie zum Beispiel Ampullen oder

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Fläschchen, in Volumen in einem Bereich von beispielsweise 0,5 bis 20 ml abgefüllt werden.

Die wässrige t-PA-Lösung wird vorzugsweise bei einer Temperatur von —10 bis —40 °C gefroren. Die gefrorene, wässrige Lösung wird dann vorzugsweise bei dieser Temperatur aufbewahrt, bis man mit dem Vakuumtrocknen beginnt.

Das Vakuumtrocknen der gefrorenen, wässrigen Lösung kann auf konentionelle Art und Weise durchgeführt werden und umfasst Trocknen unter teilweisem oder vollständigem Vakuum, beispielsweise bei 0,02 bis 0,1 Torr, über eine ausreichende Zeitdauer, um die im wesentlichen vollständige Entnahme der gefrorenen Flüssigkeit zu erwirken.

Die Temperatur, bei der das Vakuumtrocknen durchgeführt wird, hegt gewöhnlich bei —30 bis —40 °C zu Beginn des Verfahren, damit die wässrige Lösung im wesentlichen oder vollständig in gefrorener Form aufbewahrt wird. Im Verlauf des Verfahrens, wenn das Wasser entnommen worden ist, kann die Temperatur allmählich angehoben werden, bis sie auf Zimmertemperatur ist. Es wird vorgezogen, dass am Ende des Verfahrens das Vakuumtrocknen bei Zimmertemperatur oder etwas darüber bei einem wesentlichen Vakuum von 0,01 Torr durchgeführt wird, um so viel wie möglich der letzten Reste des Wassers zu entfernen. Der Feuchtigkeitsgrad der so erhaltenen, tiefgefrorenen, pharmazeutischen Formulierung liegt vorzugsweise unter 2,5%. Ist der Vakuumtrockenvorgang beendet, wird der sterile Plastikoder Glasbehälter, der die gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung enthält, dann in angebrachter Art und Weise versiegelt.

Während des Vakuumtrocknens der gefrorenen, wässrigen Lösung wird das Wasser entnommen und das t-PA bleibt teilweise in Form eines physiologisch akzeptablen Salzes zurück. Folglich sieht die vorliegende Erfindung ebenfalls ein physiologisch akzeptables Salz, besonders ein physiologisch akzeptables Säureadditionssalz wie Hydrochlorid-salz, jeweils des t-PA vor.

Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung ist es zum ersten Mal möglich, eine gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung zu erhalten, die in der Lage ist, eine parenterale Lösung mit einer hohen t-PA-Konzentration zu bilden. Folglich sieht die vorliegende Erfindung ebenfalls eine gefriergetrocknete, pharmazeutische t-PA-Formulie-rung vor, die, bei der Verdünnung mit Wasser, in der Lage ist, eine t-PA-Konzentration von mehr als 100 000 IE/ml, im besonderen mehr als 500 000 IE/ml und am meisten besonders mehr als 1 000 000 IE/ml aufzuweisen.

Um eine parenterale t-PA-Lösung zur Verabreichung herzustellen, wird die gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung, die gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, in Wasser mit einem neutralen oder sauren pH-Wert rückgebildet. Ist die wässrige Lösung, aus der die gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung hergestellt wurde, im wesentlichen isotonisch, so wird vorgezogen, dass das Wasser zur Rekonstitution ebenfalls im wesentlichen isotonisch ist.

Die biologische Aktivität des t-PA zur Auflösung des Fibrinnetzes bei Blutgerinnseln hat dazu geführt, dass es zur Behandlung von thrombotischen Störungen verwendet wird (The Lancet, 7. November 1981,1018—1020; ibid., 13. April 1985, 842—847; The New England Journal of Medicine, 1984, 310(10), 609-613; ibid., 1985, 312(14), 932-936).

Eine Methode zur Behandlung einer thrombotischen Störung bei Säugetieren besteht aus der Verabreichung einer parenteralen t-PA-Lösung, die aus einer gefriergetrockneten, pharmazeutischen Formulierung wie hierin beschrieben erhalten wurde. Als Alternative ist auch eine gefriergetrocknete, pharmazeutische t-PA-Formulierung wie hierin beschrie-

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ben zur Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin, besonders zur Verwendung bei der Behandlung einer thrombotischen Störung vorgesehen.

Spezielle Beispiele einer thrombotischen Störung sind in der Technik bekannt und umfassen Myokardinfarkt, Thrombose in tiefliegenden Venen, Lungenembolien und Schlaganfall.

Der Hauptverabreichungsweg der parenteralen Lösung ist mittels einer intravaskulären, besonders intravenösen Infusion, obwohl auch andere Verabreichungswege wie intramuskuläre Verabreichung verwendet werden können. Intravaskuläre Infusionen werden normalerweise mit einer parenteralen Lösung in einem Infusionsbeutel oder einer Infusionsflasche oder in einer elektrisch betriebenen Spritze durchgeführt. Die Lösung kann von dem Infusionsbeutel oder der Infusionsflasche mit Hilfe der Schwerkraft oder unter Verwendung einer Infusionspumpe dem Patienten verabreicht werden. Die Verwendung eines mit Schwerkraft betriebenen Infusionssystems bietet nicht genügend Kontrolle über die Verabreichungsgeschwindigkeit der parenteralen Lösung, und die Verwendung einer Infusionspumpe wird daher vorgezogen, besonders wenn es sich um Lösungen mit relativ hoher t-PA-Konzentration handelt. Es wird jedoch eine elektrisch betriebene Infusionsspritze eher vorgezogen, da dies sogar noch grössere Kontrolle über die Verabreichungsgeschwindigkeit bietet.

Eine wirksame Menge an t-PA, um Säugetiere mit thrombotischen Störungen zu behandeln, hängt natürlich von mehreren Faktoren ab, zum Beispiel vom Alter und Gewicht des Säugetieres, des genauen Zustandes, der einer Behandlung bedarf, und seiner Schwere, dem Verabreichungsweg und letztendlich vom Ermessen des jeweiligen behandelnden Arztes oder Tierarztes ab. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass eine wirksame Menge zur Auflösung beispielsweise eines Herzarterienthrombus allgemein sich auf 150 000 bis 450 000 IE/kg Körpergewicht des Patienten pro Stunde beläuft. Daher liegt für einen 70 kg schweren, erwachsenen Menschen die wirksame Menge pro Stunde allgemein in einem Bereich von 10 000 000 bis 30 000 000 IE und insbesondere ung. bei 20 000 000 IE, und diese Menge kann entweder mit oder ohne Vorbereitungsdosierung verabreicht werden. Es ist ebenfalls wahrscheinlich, dass die Dosierung bei einigen thrombotischen Zuständen niedriger ist, zum Beispiel bei Thrombose in tiefliegenden Venen und akutem Schlaganfall oder um einfach nur die Durchgängigkeit einer bereits wieder durchbluteten Koronararterie zu erhalten. In diesen Fällen liegt die wirksame Menge allgemein zwischen 7000 und 36 000 IE/kg Körpergewicht des Patienten pro Stunde.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung und sollen auf keinen Fall als Begrenzung derselben aufgefasst werden.

Beispiel 1

Ein geklärter Ertrag an t-PA, der aus einer kultivierten, transformierten CHO-Zellinie erhalten wurde, die wiederum unter Verwendung des Verfahrens aus Molecular and Cellu-lar Biology, 1985, 5(7), 1750—1759, war, wurde chromatographisch gereinigt und das t-PA wurde als wässrige Lösung, die 0,17 M Natriumeitrat und 0,01% (g/v) Tween 80 enthielt und einen pH-Wert von 5,5 aufweist, gesammelt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit Salzsäure auf 3,0 angeglichen und die so erhaltene Lösung durch Ultrafiltrierung unter Verwendung einer H-10-Patrone (Amicon Ltd., Upper Hill,

Stonehouse, Gloucestershire, England) konzentriert. Die konzentrierte, wässrige Lösung wurde weiter gereinigt, indem es auf eine Gelfiltrierungssäule (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Schweden) anwendet und mit 0,85%iger Salzlösung, die 0,01% (g/v) Tween 80 enthält und einen pH-Wert von 3,0 aufweist, eluiert. Man erhielt so eine stark gereinigte, wässrige t-PA-Lösung, die nochmals unter Verwendung einer künstlichen Einwegniere konzentriert wurde. Das t-PA wurde aus der Lösung ausgefällt, indem man den pH-Wert auf 5,5 mit Natriumhydroxid erhöhte und die Suspension bei 4 °C während 2 Stunden aufbewahrte. Das t-PA wurde durch Zentrifugierung bei 4000 x g während 30 min. bei 4° wiedergewonnen. Die t-PA-Kugel wurde wieder in einer wässrigen Natriumchloridlösung (0,85% (g/v)) verdünnt, die 0,01% (g/v) Tween 80 enthielt und deren pH-Wert mit Salzsäure auf 3,0 angeglichen wurde. Man benötigte ein Salzlösungsvolumen, das erforderlich war, um eine t-PA-Konzentration zwischen 7 500 000 IE/ml und 10 000 000 IE/ml zu erhalten. Diese t-PA-Lösung wurde dann mit einer weiteren wässrigen Natriumchloridlösung (0,85% (g/v)), die 0,01 % (g/v) Tween 80 enthielt und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 angeglichen wurde, verdünnt und ebenfalls mit einer ausreichenden Menge einer 10%igen (g/v) Mannitlösungin derselben sauren Salzlösung verdünnt, um endgültige Konzentrationen von 5 000 000 IE/ ml für t-PA und 25 mg/ml für Mannit zu erhalten. Die so erhaltene Lösung wurde durch einen Filter sterilisiert und in Volumen von 1 ml in Ampullen gefüllt, die dann bei —35 °C gefroren wurden. Man wandte dann ein Vakuum von 0,05 Torr an. Nach ungefähr 24 Stunden wurde die Temperatur allmählich auf 5 °C angehoben und während 16 Stunden bei dieser Temperatur aufbewahrt. Die Temperatur wurde dann auf 25 °C angehoben und das Vakuum auf 0,02 Torr für weitere 24 Stunden erhöht. Danach wurden die Ampullen bei einem Teilvakuum von 600 Torr von trockenem Nitrogen versiegelt.

Beispiel 2

Die Wirksamkeit der parenteralen Lösung aus Beispiel 1, die aus der gefriergetrockneten t-PA-Formulierung erhalten wurde, auf Thrombosen wurde in einem in vivo-Modell von jugularer Venenthrombose ausgewertet.

(a) Verfahren:

Das Testverfahren wurde im wesentlichen gemäss jenem, das bei Collen et al. (J. Clin. Invest., 1983,71, 368—376) beschrieben wird durchgefürt.

Die gefriergetrocknete Formulierung aus Beispiel 1 wurde schnell und vollständig in steriler, isotonischer Salzlösung verdünnt, die auf einen pH-Wert von 3,0 angeglichen wurde und 0,01 % Tween 80 enthielt. Eine parenterale Lösung wurde dann für eine zweistündige Infusion von 500 000 IE/kg von t-PA vorgesehen. Die Infusion wurde durch eine Kanüle in die rechte Oberschenkelvene durchgeführt. Vier weisse, neuseeländische Kaninchen wurden für den Test verwendet. Nach der Infusion wurde der Grad des Thrombuszerfalls ausgewertet.

(b) Ergebnisse:

Der Prozentzsatz des Thrombuszerfalls betrug 28,9 + 4,1 und stellt so die thrombolytische Wirkung der parenteralen Lösung aus Beispiel 1 dar, die aus der gefriergetrockneten Formulierung erhalten wurde. Zusätzlich konnten keine gegenteiligen Wirkungen bei der Infusion dieser Lösung festgestellt werden.

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2 Blatt Zeichnungen

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung einer gefriergetrockneten, pharmazeutischen einen Gewebeplasminogenaktivator, t-PA abgekürzt, enthaltenden Formulierung, dadurch gekennzeichnet, dass eine gefrorene, wässrige t-PA-Lösung unter Vakuum getrocknet wird, deren pH-Wert im Bereich von 2 bis 5 liegt.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das t-PA entweder in ein- oder in zweikettiger Form vorhanden ist.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das t-PA über eine Aminosäurensequenz verfügt, die in Figur 1 dargestellt ist, oder dieselbe Aminosäurensequenz hat, wobei jedoch die Aminosäure in der 245ten Position vom Serin-N-Terminus aus gerechnet, Valin anstelle von Methionin ist, wobei die eine oder andere Sequenz wahlweise ohne irgendeine der drei ersten Aminosäuren ist, oder aber wahlweise eine zusätzliche Polypeptid-N-Terminus-Vorsequenz aus Gly-Ala-Arg aufweist.
4. Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das t-PA aus einer kultivierten, transformierten oder transfizierten Zellinie erhalten wird, die mittels der rekombinierten DNS-Technologie hergestellt wird.
5. Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des t-PA in der wässrigen Lösung grösser als 100 000 IE/ml ist.
6. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des t-PA grösser als 500 000 IE/ ml ist.
7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des t-PA grösser als 1 000 000 IE/ml ist.
8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des t-PA bei etwa 5 000 000 IE/ ml liegt.
9. Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert der wässrigen Lösung im Bereich von 2 bis 4,5 liegt.
10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert im Bereich von 2,5 bis 4,0 liegt.
11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert im Bereich von 2,8 bis 3,5 liegt.
12. Verfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert ungefähr bei 3,0 hegt.
13. Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium der wässrigen Lösung vollständig oder im wesentlichen wässrig ist.
14. Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium für die wässrige Lösung ein physiologisch akzeptables Mittel enthält, das die Lösung im wesentlichen isotonisch mit menschlichem Blutserum macht.
15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das physiologisch akzeptable Mittel Natriumchlorid ist.
16. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das physiologisch akzeptable Mittel Dextrose ist.
17. Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung ein oberflächenaktives Mittel enthält.
18. Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung im wesentlichen ungepuffert ist.
19. Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung im wesentlichen frei von Lysin oder Ornithin oder einem Salz davon ist.
20. Verfahren gemäss einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung sterilisiert wird.
21. Eine gefriergetrocknete, pharmazeutische t-PA enthaltende Formulierung, dadurch gekennzeichnet, dass sie gemäss dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 —20 hergestellt wurde.
22. Eine gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung gemäss Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie bei der Verdünnung in Wasser in der Lage ist, eine t-PA-Konzentration grösser als 100 000 IE/ml zu erbringen.
23. Eine gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Kozentration grösser als 500 000 IE/ml ist.
24. Eine gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration grösser als 1 000 000 IE/ml ist.
25. Eine gefriergetrocknete, pharmazeutische Formulierung gemäss einem der Ansprüche von 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einer für die Behandlung von thrombotischen Störungen geeigneter Form vorliegt.
26. Ein versiegelter Behälter mit einer gefriergetrockneten, pharmazeutischen Formulierung gemäss einem der Ansprüche 21 bis 25.
27. Ein physiologisch akzeptables Salz des t-PA.
28. Ein physiologisch akezptables Säureadditionssalz des t-PA als Verbindung gemäss Anspruch 27.
29. Ein Hydrochloridsalz des t-PA als Verbindung gemäss Anspruch 28.