HU195733B

HU195733B - Process for preparing a pharmaceutical composition containing tissue plasminogen activator

Info

Publication number: HU195733B
Application number: HU862234A
Authority: HU
Inventors: Denis M Johnston; Henry Berger
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1985-05-28
Filing date: 1986-05-27
Publication date: 1988-07-28
Also published as: FR2583984A1; DK163173C; US4968617A; CH665356A5; GB8612780D0; ES8800601A1; SE8602405L; AU567236B2; DE3617752C2; ES555353A0; ES8802439A1; GB2176702B; IL78938A; CA1300008C; IL78938A0; DK246786D0; PT82646A; FI862227A0; NZ216307A; HUT41638A

Description

A találmány tárgya új eljárás szövet plazminogén aktivátort tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására.

Ismert, hogy dinamikus egyensúly áll fenn a vérrög képzésére alkalmas enzim rendszer - a koagulációs rendszer - és a vérrög feloldására alkalmas enzim rendszer a fibrinolitikus rendszer - között, ami sértetlen nyitott érrendszert tart fenn. Sérülés esetén a vérveszteség csökkentésére vérrógők képződnek a sérült véredényben. A sérülés természetes gyógyulása után a felesleges vérrögöket a fibrinolitikus rendszer feloldja. Előfordulhat azonban, hogy vérrögök képződnek traumás sérülések nélkül is, amelyek a fontosabb véredényekben helyezkednek el és így részlegesen vagy teljes egészében gátolják a vér áramlását. Ha ez a szívben, tüdőben vagy az agyban jelentkezik, úgy miokardiális infarktust, tüdöembóliát vagy szélütést eredményezhet. Iparilag fejlett népeknél az elhalálozás egyik legfontosabb okát ezek a jelenségek képzik.

A vérrőgök olyan rostos hálót tartalmaznak, amely a proteolitikus enzimek és plazminok hatására oldódik. Az enzimek a plazminogén aktivátor hatására inaktív proenzimekből és plazminogénekből képződnek, amelyek a vérplazmában fordulnak elő. Két immunológiailag különböző emlős plazminogén aktivátor létezik. A belső plazminogén aktivátor, amit urokinéznak is neveznek, a vese termeli és a vizeletből izolálható. Előállítható azonban egy sor szővettenyészetből is. A külső plazminogén aktivátor, amit vaszkuláris plazminogén aktivátornak vagy szövet plazminogén aktivátornak (t-PA) is neveznek, homogenizált szövetből (elsősorban emberi méhből), az érsejtek falából és más sejttenyészetekből állítható elő. A fenti két plazminogén aktivátor mellett említhető még a baktériumok által termelt streptokináz, ami a /3-heniolitikus streptococcus-ból izolálható.

Az urokináz és a streptokináz, közös hátránya, hogy nemcsak a vérrögök környezetére, hanem a teljes keringési rendszerre hatnak. Elroncsolják például a többi, vérben lévő fehérjét is, így a fibrinogént, a rrotrombint, az V és Vili faktort, és így a véralvadás lehetőségének csökkentésével növelik a vérzékenység veszélyét. Ezzel ellentétben, a t-PA biológiai aktivitása függ a fibrin jelenlététől, amihez kapcsolódik és amin aktiválódik. így a maximális aktivitás csak a vérrőg környezetében, vagyis a feloldandó fibrin háló jelenlétében érhető el, ami jelentős mértékben csökkenti a vérzékenység veszélyét.

A t-PA-t általában intravaszkuláris infúzióval adagolják, amihez a t-PA-t parenterális oldattá kell alakítani. Fehérje esetén az orvos vagy állatorvos szamára előnyösebb egy liofilizált gyógyszerkészítmény, mivel az a folyékony készítményhez viszonyítva könynyebben szállítható és tárolható. Fontos továbbá, hogy a liofilizált készítmény könnyen átalakítható a kívánt parenterális készítménnyé, és az orvos az oldószer mennyiségének változtatásával könnyen beállíthatja az éppen kívánt koncentrációt. Így például szív- vagy vesebetegségben szenvedőknek nem adható nagy térfogatú oldat, mivel az tovább terhelné a szivet vagy a vesét. Ilyen esetben a térfogatot a minimális értéken kell tartani. Parenterális készítmények esetén tehet az alacsony koncentrációjú készítmények mellett nagy koncentrációjú készítményekre is szükség van.

Hatóanyagként t-PA-t tartalmazó liofilizélt gyógyszerkészítményeket ismertet például a 113 319. és a 123 304. számú európai közrebocsátási irat. A készítményeket a t-PA vizes sóoldatából állítják elő, amelyek pHértéke közel semleges. Ezek hátránya, hogy a t-PA oldékonysága ilyen oldatokban alacsony, és az ionkoncentráció fokozása nélkül nem növelhető. Ennek következménye, hogy az ilyen liofilizált készítményekből nyert parenterális oldatok vagy alacsony t-PA-koncentrációval rendelkeznek, és Így bizonyos esetben kellemetlenül nagy térfogatú oldatot kell a betegeknek beadni, vagy hipertónikusak, ami károsítja a vörös vérsejteket.

Azt találtuk, hogy a t-PA vizes oldatokban mutatott oldékonysága növelhető, ha az óidat pH-értéke a savas tartományban van, hogy a t-PA savas oldatából liofilizált gyógyszerkészítmény állítható elő, és hogy a készítményből olyan parenterális oldat nyerhető, amely nem okoz fiziológiai problémákat.

A találmány tárgya tehát eljárás hatóanyagként t-PA-t tartalmazó liofilizált gyógyszerkészítmény előállítására, amelynek során a t-PA fagyasztott vizes oldatát, amelynek pH-értéke 2-5, vákumban szárítjuk.

A t-PA oldékonységának növelése lehetővé teszi olyan liofilizált gyógyszerkészítmény előállítását, amelyből a t-PA-t nagy koncentrációban tartalmazó parenterális oldat nyerhető a t-PA kiválásénak veszélye nélkül. A liofilizált készítmény a felhasználás előtt a kívánt mértékig hígítható például semleges vagy savas ρΗ-jú vízzel. A találmány szerinti eljárással tehát olyan stabil liofilizált gyógyszerkészítmény nyerhető, amely a felhasználási igényekhez igazodva alkalmazható a humán és állatgyógyászat területén, valamint k önnyen szállítható és tárolható.

A találmány keretein belül bármely bioaktív fehérje alkalmazható, amely lényegében azonos az emlős, előnyösen humán, t-PA fehérjével, beleértve annak glikolizált vagy glikolizálatlan formáit is. Felhasználható mind az egyláncú, mind a kettős láncú t-PA vagy ezek keveréke (112 122. számú európai kőzrebocsátási irat), valamint a teljesen gikoli;ált humán t-PA, amelynek poliakrilamid gélen mért mólsúlya mintegy 70.000 és izoelektromos pontja 7,5-8,0. Előnyösen alkalmazható a mintegy 500.000 NE/mg fajlagos aktivitású t-PA (NE: nemzetközi egység, amelyet a WHO, National Institute fór Biological Standards and Control, London állapított meg).

Az előnyösen alkalmazható t-PA aminosav szekvenciája lényegében azonos az 1. ábrán adott szekvenciával, de felhasználhatók az egy vagy több aminosav elhagyásával, helyettesítésével, beépítésével, felcserélésével vagy hozzáadásával, amikoris a kapott szekvencia legalább 80%-ban, előnyösen 90%-ban azonos az 1. ábrán adott szekvenciával, és lényegében megtartja a fehérje eredeti biológiai és immunológiai tulajdonságait. Ezen belül előnyös az 1. ábrán megadott szekvenciájú t-PA, vagy az N-terminális szerintól számított 245. pozícióban metionin helyett valint tartalmazó szekvencia, valamint a fenti két szekvenciának olyan változata, amelyben az első három aminosav valamelyike hiányzik vagy az N-terminális véghez egy Gly-Arg pr eszek ve ncia kapcsolódik.

Az 1. ábrán megadott aminosav szekvencia 35 cisztein maradékot tartalmaz és Így 17 diszulfid-híd képzésére képes. Szerkezetileg

részletesebben felderített fehérjék alapján
Asp	D	aszparaginsav
Thr	T	treonin
Ser	S	szerin
Glu	E	glutaminsav
Pro	P	prolin
Gly	G	glicin
Alá	A	alanin
Cys	C	cisztein
Val	V	valin
Met	M	metion

A t-PA bármely ismert eljárással előállítható. Előállítható például a Biochmica et Biophysica Acta 580, 140-153,(1979), irodalomban vagy a 41 766. vagy 113 319. számú európai közrebocsátási iratokban ismertetett normál vagy daganatos sejtvonalakból. Előnyösebb azonban, ha a t-PA-t rekombináns DNS technológia segítségével nyert transzformáit sejtvonalak tenyészetéből nyerjük (például 93 619., 117 059. vagy 117 060. számú európai közrebocsátási iratokból). Különösen előnyösen alkalmazhatók kínai hörcsög petefészkéből (CHO) származó sejtek, amelyek a Molecular and Cellular Biology 5(7), 17501759 (1985) által ismertetett módon nyerhetők ki. Ennek során a klónozott gént a dihídrofolát reduktázt (dhfr) kódoló génnel együtt dhfr-CHO sejtbe viszik be. A dhfr-t kifejező származékokat nukleozidmentes közegben elválasztják és a metotrexát koncentrációjának növelésére használják. A kai>ott dhfr és t-PA génekből stabil sejtvonal nyerhető, amelyen intenzív t-PA kifejezés érhető el.

A t-PA előnyösen tisztítható bármely ismert módszerrel (Biochimica et Biophysica

90. pozícióban lévő aminosav és a C-terminális prolin közötti (diszulfid-hidak alapján) feltételezett szerkezetet a 2. ábra mutatja. Az N-terminális szakasz szerkezete kevésbé felderített, annak ellenére, hogy néhány javaslat már ismert [Progress in Fibrinolysis, 6, 269-273 (1983); Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 5355-5359 (1984)]. A t-PA szerkezetének legfontosabb része a két gyűrűvé záródó hurok (kringle) a 92. és 173, aminosav, valamint a 180. és 261. aminosav között, amely szakasz felelős a fehérje és a fibrin összekapcsolódásáért, valamint a szerin proteáz szakasz, amely magába foglalja a B lánc legnagyobb részét és amely felelős a plazminogén aktiválásáért. A szerin proteáz legfontosabb sav -komponensei a katalitikus hatású His/Asp/Ser hármas csoport. A t-PA-ban ez a 322., 371. és 463. pozícióban jelenik meg. A 264. és 395. cisztein savmaradék közötti diszulfid-híd szintén nagyon fontos, mivel a t-PA kettős láncú szerkezetében ez tartja össze az A- és B-láncot.

Az 1. és 2. ábrán az alábbi ismert egy és három betűs kóddal jelöltük az aminosav-maradékokat:

He	I	izoleucin
Leu	L	leucin
Tyr	Y	tirozin
Phe	F	fenilalanin
His	H	hisztidin
Lys	K	lizin
Arg	R	arginin
Trp	W	triptofán
Gin	Q	glutamin
Asn	N	aszparagin
Acta,	580, 140-153	(1979); J.Biol. Chem,
254(6),	1998-2003	(1979); J. Bioi. Chem,

256(13), 7035-7041 (1981); Eur. J. Biochem.

132, 681-686 (1983); 41 766. és 113 319.

számú európai közrebocsátási iratok, valamint 2 122 219. számú angol közzétételi irat).

A találmány szerinti eljárással a t-PA felső oldódási határ nélkül oldható vízben. Nagy koncentrációk esetén, így 150 000 NE/ml feletti koncentrációknál erősen viszkózus oldatot kapunk t-PA kiválás nélkül. A t-PA koncentrációja tehát a vizes oldatban széles, határok között, például 50 000-50 000 000 NE/ml között változtatható. A találmány nyújtotta előnyök kihasználásához célszerű, ha a t-PA koncentrációja nagyobb mint 100 000 NE/ml, előnyösen 500 000 NE/ml, különösen előnyösen nagyobb mint 1 000 000 NE/ml. A legelőnyösebb, ha a t-PA koncentrációja mintegy 5 000 000 NE/ml. A legelőnyösebb, ha a t-PA koncentrációja mintegy 5 000 000 NE/ml.

A vizes oldat pH-értékének felső határa előnyösen 4,5. A pH-érték előnyösen 2,5-4,0, ezen belül 2,8-3,5, elsősorban mintegy 3,0. A vizes oldat könnyen beállítható a kívánt pH-értékre fiziológiailag alkalmazható szervetlen vagy szerves savak segítségével. Előnyösen alkalmazható savak a hidrogénklorid, kénsav és salétromsav, valamint a citromsav, borkősav és benzolszulfonsav, elsősorban a hidrogénklorid.

A víz mellett egyéb oldószerek és adalékok is felhasználhatók, előnyösebb azonban, ha a közeg teljes egészében vagy legalább főtömegében víz.

A liofilizált gyógyszerkészítményekből nyert parenterális oldat a beteg vérszérumához képest lehet hipertónikus, hipotónikus vagy izotónikus. Nemkívánatos mellékhatások elkerülése érdekében célszerű, ha a parenterális oldat izotónikus, bár csekély eltérések nem okoznak fiziológiai következményeket. Lényegében izotónikus parenterális oldat nyerhető olyan, fiziológiailag alkalmazható szel^- segítségével, amely a kívánt szintre növeli az oldat tónikusságát. Ez a szer már a fagyasztva szárított vizes oldatba betehető, és így a liofilizált gyógyszer készítményben már benne van, vagy hozzáadható a semleges vagy savas ρΗ-jú vízhez, amelyet a kívánt parenterális oldat előállításához használunk. Ebből a célból bármely ismert szer felhasználható, így a dextróz (vízmentes vagy monohidrát formában), a ' nátriumklorid vagy ezek keveréke. A szer koncentrációját a vizes oldatban vagy a feloldáshoz alkalmazott vízben, a felhasznált szer fajtája határozza meg. Nátriumklorid esetében a koncentráció általában 7-10 mg/ml, előnyösen mintegy 8,5 mg/ml, amit általában fiziológiás só koncentrációnak neveznek. Vízmentes dextróz esetében a koncentráció általában 30-70 mg/ml, előnyösen mintegy 50 mg/ml.

A vizes oldat bármely olyan adalékanyagot tartalmazhat, amelyek hasonló liofilizált gyógyszerkészítményekben szokásosak. Példaként említhető a humán szérum albumin, valamint kötőanyagok, töltőanyagok, így mannitol, laktóz és glükóz. Mivel a t-PA hajlamos arra, hogy üveg és műanyag felületeket abszorbeáljon, célszerű olyan felületaktív anyag alkalmazása, amely gátolja vagy csökkenti ezt az adszorpciót. Előnyösen alkalmazható felületaktív anyagok a zsirsav-szorbitánészterek polioxietilénszármazékai, például Tween 80.

A találmány szerinti eljárás egyik meglepő hatása a t-PA oldékonyságának növelése inellett, hogy a liofilizált gyógyszerkészítmény feloldásával nyert savas parenterális oldat alkalmazása a betegnél nem vált ki fiziológiai hatást. Úgy tűnik, hogy a véráram képes arra, hogy az oldat pH-ját szinte az adagolással egyidejűleg semlegesítse, és a t-PA-t az áramban eloszlassa. Előnyös, ha ezt a folyamatot nem gátoljuk, vagyis ha a parenterális oldat, a fagyasztva szárított vizes oldat vagy a liofilizátum feloldására használt oldat nem tartalmaz erős puffer anyagot.

Gyenge puffer anyag azonban, amely nem lassítja lényegesen a fenti folyamatot, felhasználható, sőt a savas pH-jú t-PA is saját gyenge pufferjeként működik még a humán szérum albumin is.

Mivel a t-PA oldékonysága a pH = 2-5 taitományban jelentős mértékben megnő, elkerülhető, hogy a liofilizált gyógyszerkészítményből nyert parenterális oldat különböző segédanyagokat, igy lizint, ornitint vagy ezek sóját tartalmazza a t-PA oldékonyságának fokozására.

A t-PA vizes oldata előállítható úgy, hogy a tisztított t-PA-t feloldjuk, majd az olcósz^rt 2-5 pH-értékű vízre cseréljük, vagy a tisztított t-PA-t 2-5 pH-értékű vizes közegben oldjuk.

A t-PA tisztítása megvalósítható úgy is, hogy a fehérjét kromatográfiás oszlopon elu2θ áljuk erős puffért tartalmazó oldat formájában. Mint említettük, előnyös, ha a parenterális oldat, a liofilizált gyógyszerkészítmény és a vizes oldat nem tartalmaz erős puffer anyagot, így elválasztásának egyik előnyös módja, ha a közeget dialízis segítségével lecseréljük. Ez megvalósítható dialízis csővel vagy művesével amelyben a tisztított oldatot pH = 2-5 vizes közeggel dializáljuk. Előnyös, ha a tisztított oldat t-PA koncentrációja olyan magas, hogy a pH-érték 2-5 közé essen. Az erős puffer anyag a közeg lecserélésével eltávolítható úgy is, hogy a tisztított oldatot gélszűrés után pH = 2-5 vizes Közeggel oszlopra visszük fel.

₃₅ A tisztított oldatból szilárd formában kicsapható a t-PA, ha a pH-értéket 5,5-re állítjuk, az oldatot fagyásponthoz közeli hőmérsékletig hűtjük, majd a fehérjét például centrifugálással eltávolítjuk. A kicsapott szi4q Iáid anyag ezután pH = 2-5 vizes közegben szokásos módon oldható.

A kapott vizes oldatot a szokásos módon, igy szűréssel sterilizáljuk, és mintegy 0,5-20 ml térfogatú steril műanyag vagy üveg edényekbe, így ampullákba vagy fiolákba töltjük.

A t-PA vizes oldatét előnyösen -10 °C és -40 °C között fagyasztjuk. A fagyasztott vizes oldatot ezen a hőmérsékleten tartjuk a vákuum szárítás megkezdéséig.

A fagyasztott vizes oldat vákuum szárítását a szokásos módon, teljes vagy részleges vákuum alatt végezzük, például 0,01-0,1 Tcrr nyomáson a fagyasztott folyadék lénye55 gében teljes eltávolításához szükséges ideig.

A vákuum szárítás hőmérséklete a folyamét kezdetén általában -30 °C és -40 °C között van, vagyis a vizes oldat lényegében vagy teljesen fagyott állapotban van. A fo60 lyamat előrehaladtával és a víz eltávolításával a hőmérséklet fokozatosan szobahőmérsékletig emelhető. A viz utolsó nyomainak eltávolításához a szárítást előnyösen szobahómérsékle65 ten vagy annál valamivel magasabb hőmérsékleten és 0,01 torr nyomáson fejezzük be. A kapott liofilizált gyógyszerkészítmény nedvességtartalma általában kisebb, mint 2,5%. A vákuum szárítás befejeztével a liofilizált gyógyszerkészítményt tartalmazó műanyagvagy üvegedényt lezárjuk.

A fagyasztott vizes oldat vákuumszáritás közben a víz eltávoztával a t-PA fiziológiailag elfogadható só formájában marad vissza. A találmány oltalmi köre tahát kiterjed a t-PA fiziológiailag elfogadható sóira, előnyösen savaddiciós sóira, ezen belül elsősorban hidrokloridsójára.

A találmány szerinti eljárás első ízben teszi lehetővé olyan liofilizált gyógyszerkészítmény előállítását, amelyből nagy t-PA koncentrációjú parenterális oldat nyerhető. Ez a t-PA koncentráció nagyobb mint 100 000 Ne/ml, előnyösen nagyobb mint 500 000 NE/M1, különösen előnyösen nagyobb mint 1 000 000 NE/ml.

A kezeléshez szükséges parenterális oldat előállításához a találmány szerint előállított liofilizált gyógyszerkészítményt semleges vagy savas pH-jú vízzel hígítjuk. Ha a liofilizált gyógyszerkészítményt lényegében izotónilcus vizes oldatból nyertük, úgy a hígításhoz is lényegében izotónikus vizet használunk.

A t-PA biológiai aktivitást mutat a vérrögök fibrin hálójának feloldásában, és így előnyösen alkalmazható trombotikus rendellenességek kezelésére [The Láncét, 1018-1020, 1981. november 7.; The Láncét, 842-847, 1985. április 13.; The New England Journal of Medicine 310(10), 609-613 (1984); és 312(14)

932-936 (1985)]. A találmány szerint előállított liofilizált gyógyszerkészítmény felhasználható tehát a humán- és állat-gyógyászat területén, elsősorban trombotikus rendellenességek kezelésére.

A különböző trombotikus megbetegedésekre számos példa ismert a szakirodalomból, ezek közül kiemelhető a szivizominfarktus, a súlyos vénatrombózis, a tüdőembólia és a szélütés.

A t-PA adagolásának módja általában intravaszkuláris, előnyösen intravénás infúzió, bár egyéb adagolási mód, így intramuszkuláris adagolás is alkalmazható. Az intravaszkuláris infúziót általában infúziós tartályban vagy üvegben vagy elektromosan működtetett infúziós fecskendőben lévő parenterális oldattal valósítjuk meg. Az oldat az infúziós edényből a betegbe juttatható gravitáció vagy infúziós pumpa segítségével. A gravitáció hatására működő infúziós rendszer nem engedi meg az adagolás ellenőrzését, ezért, elsősorban nagy koncentrációjú oldatok esetében, előnyösen infúziós pumpát alkalmazunk. Legelőnyösebb azonban az elektromosan működtetett infekciós fecskendő alkalmazása, mivel ez teszi lehetővé az adagolás legpontosabb ellenőrzését.

A trombótikus rendellenességben szenvedő emlős beteg kezelésére szükséges t-PA mennyiséget természetesen egy sor faktor határozza meg, igy a beteg kora és súlya, az igényelt kezelés pontos feltételei és súlyossága, az adagolás módja, amelynek megállapítása az orvos vagy állatorvos feladata. Koszorúér elzáródás feloldásához szükséges mennyiség általában 150 000-450 000 NE/kg testsúly óránként. így 70 kg súlyú felnőtt beteg kezeléséhez óránként 10 000 000-30 000 000 NE, előnyösen mintegy 20 000 000 NE mennyiség szükséges. Előfordulhat természetesen, hogy súlyosabb megbetegedés esetén, így akut szélütés kezeléséhez nagyobb dózis szükséges. Ebben az esetben a hatásos mennyiség általában 7 000-36 000 NE/kg testsúly óránként.

A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példákkal világítjuk meg, anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna.

1. példa

A Molecular and Cellular Biology, 5(7), L750-1759 (1985) szerint előállított transzformáit CHO sejtvonalból nyert t-PA-t kromatográfiás úton tisztítjuk, majd a t-PA-t 0,17 M nátriumcitrátot és 0,01 vegyes% Tween 80-t tartalmazó pH = 5,5 vizes oldat formájában összegyűjtjük. Az oldatot sósavval pH = 3,0-ra állítjuk és H-10 szűrön (Amicon Ltd, Anglia) ultraszűrés segítségévei besűrítjük. A koncentrált vizes oldatot gélszűrő oszlopon (Sephadex G-150) 0,01 vegyes % Tween 80-t tartalmazó pH = 3,00,85 törneg%-os sóoldattal eluláljuk. A t-PA tisztított vizes oldatát egyszer felhasználható művesével besűrítjük. Az oldatot nátriumhidroxiddal pH = 5,5-re állítjuk és a szuszpenziót 2 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A kicsapott t-PA-t 4 °C- hőmérsékleten 30 percen keresztül 4000 g fordulattal centifugáljuk. A t-PA szemcséket 0,85 vegyes % nátriumkloridot és 0,01 vegyes% Tween 80-t tartalmazó vizes oldatban feloldjuk és sósavval pH = 3,0-ra állítjuk. A feloldáshoz annyi sóoldatot haszná-’ lünk, hogy a t-PA koncentrációja 7 500 000-10 000 000 NE/ml legyen. Ezt az oldatot a fenti sóoldattal tovább hígítjuk, sósavval pH = 3,0-ra állítjuk és a fenti sóoldat 10 vegyest mannitolt tartalmazó oldatával hígítjuk 5 000 000 NE/ml t-PA és 25 mg/ml mannitol koncentráció eléréséig. A kapott oldatot sterilre szűrjük és 1 ml-enként üvegfiolába töltve -35 °C hőmérsékletre hűtjük. A vákuum szárítást 0,05 Torr nyomáson végezzük. Mintegy 24 óra elteltével a hőmérsékletet fokozatosan 5 °C-ra emeljük és ezen az értéken tartjuk 16 órán keresztül. Ezután a hőmérsékleten 25 °C-ra emeljük és a nyomást 0,02 Torr-ra csökkentjük és további 24 órán keresztül ezen az értéken tartjuk. Ezután a fiolákat 600 Torr nyomású nitrogén atmoszféra alatt lezárjuk.

-510

2. példa

Az 1. példában előállított liofilizált gyógyszerkészítményből kinyerhető jiarenterális oldat trombolitikus hatását nyaki véna 5 trombózis in vivő modelljén vizsgáltuk.

a) A vizsgálatokat Collen et al: J. Clin. Invest. 71, 368-376 /1983/ módszerével végeztük.

Az 1. példa szerinti liofilizált készít- 10 ményt 0,01 vegyes% Tween 80-t tartalmazó és pH = 3,0 steril izotónikus sóoldattal gyorsan és teljesen feloldottuk. A kapott parenterális oldatból 2 órás infúzióval 500 000 NE/kg-t vittünk be. Az infúziót injekciós tűvel a jobb combvénába vezettük. A vizsgálatokat négy darab New Zéland típusú fehér nyulon végeztük. Az infúzió után értékeltük a trombollzis fokát.

b) A százalékos trombolízis 28,9 ± 4,1, ^0 ami mutatja az 1. péla szerinti liofilizált készítményből nyert parenterális oldat trombolitikus hatását. Eközben mellékreakció nem volt megfigyelhető.

Claims

1. Eljárás szövet plazminogén aktivátort tartalmazó liofilizált gyógyszerkészítmény ³θ előállítására szövet plazminogén aktivátor vizes oldatának fagyasztva szárításával, azzal jellemezve, hogy a fagyasztva szárításhoz olyan vizes oldatot használunk, amelynek pHértéke 2-5. ³⁵ (Elsőbbsége: 1985. 05. 28.)

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pH = 2-4,5 vizes oldatot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1985. 05. 28.) ⁴⁰

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pH = 2,5-4,0 vizes oldatot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1985. 05. 28.)

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pH = 2,8-3,5 vites oldatot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1985. 05. 28.)

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintegy pH = 3,0 vizes oldatot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1985. 05. 28.)

6. Eljárás szövet plazminogén aktivátort tartalmazó liofilizált gyógyszerkészítmény előállítására szövet plazminogén aktivátor vizes oldatának fagyasztva szárításával, azzal jellemezve, hogy a fagyasztva szárításhoz clyan vizes oldatot használunk, amely több mint 50 000 NE/ml szövet plazminogén aktivátort tartalmaz és amelynek pH-értéke 2-5. (Elsőbbsége: 1985. 08. 31.)

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy több mint 100 000 NE/ml szövet plazminogén aktivátort tartalmazó vizes oldatot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1985. 08. 31.)

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy több mint 500 000 NE/ml szövet plazminogén aktivátort tartalmazó vizes oldatot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1985. 08. 31.)

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy több mint 1 000 000 NE/ml szövet plazminogén aktivátort tartalmazó vizes oldatot alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1985. 08. 31.)

10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy több mint 5 000 000 NE/ml szövet plazminogén aktivátort tartalmazó vizes oldatot alkalmazunk.