SE462016B - Foerfarande foer iordningsstaellande av en lyofiliserad farmaceutisk sammansaettning med vaevnadsplasminogen-aktivator, t-pa - Google Patents

Description

462 016 10 15 20 25 30 35 2 minogenaktivator, i det följande t-PA, kan isoleras ur många vävnadshomogenater (främst människans livmoder), den vaskulära cellväggen och ur vissa cellkulturer.

Förutom dessa två typer av plasminogenaktivatorer finns också en bakteriell produkt, streptokinas, som framställs från beta-hemolytiska streptokocker. En huvudnackdel med såväl urokinas och streptokinas är att de är aktiva över hela cirkulationskretsen och icke endast vid stället för ett blodkoagel. De kan exempelvis förstöra andra blodproteiner, såsom fib- rinogen, protrombin, faktor V och faktor VIII, var- igenom blodlevringsförmàgan reduceras och risken för blödning ökar. I motsats härtill är den biologiska aktiviteten av t-PA i beroende av närvaron av fibrin, till vilket den binds och där den aktiveras. Maximal aktivitet framkallas sålunda endast vid stället för ett blodkoagel, dvs i närvaro av fibrinnätverket som skall lösas upp, varigenom risken för blödning väsent- ligt minskas.

Huvudsättet att administrera t-PA är intravaskulär infusion, vilket alltså kräver en parenteral lösning med t-PA. När det gäller ett protein är det föredraget att presentera läkemedlet för läkaren eller veterinären som en lyofiliserad farmaceutisk sammansättning pá grund av dennas väsentliga transport- och lagringsfördelar framför en vätskeformig sammansättning. Det är emellertid viktigt att varje sådan lyofiliserad sammansättning pro- blemfritt och lätt kan koncentreras till den önskade parenterala lösningen och att läkaren eller veterinären kan få den önskade 1äkemedelskoncentrationen i varje situtation helt enkelt genom att rekonstituera samman- sättningen i den korrekta mängden lösningsmedel. Det är exempelvis otillrådligt att administrera en stor volym av lösning till en patient som har hjärt- eller njur- defekter, eftersom detta skulle sätta hjärtat eller njurarna under en ännu större pàkänning. Volymen bör därför i sådana fall hållas så liten som möjligt. Det 10 15 20 25 30 35 462 016 3 är sålunda önskvärt att en parenteral lösning kan erhållas icke endast med en relativt låg koncentration utan också_med en hög koncentration av läkemedlet.

Flera lyofiliserade farmaceutiska sammansättningar med t-PA har beskrivits tidigare, t ex i EP-A-113 319 och EP-A-123 304. Sammansättningarna iordningsställes av vattenhaltiga saltlösningar av t-PA, där pH är ungefär neutral, och är förknippade med nackdelen att lösligheten av t-PA i sådana lösningar är låg i frånvaro av en ökning i jonkoncentrationen. Följakt- ligen har de från sådana lyofiliserade sammansättningar erhållna parenterala lösningarna antingen låg koncentra- tion med avseende på t-PA, vilket i vissa situationer kräver administrering av oönskvärt stora lösningsvolymer till en patient, eller hypertonisk karaktär, något som vid administrering kan vara förödande för de röda blodkropparna.

Det har nu visat sig att lösligheten av t-PA i en vattenhaltig lösning kan förbättras om lösningens pH ligger inom ett surt område, att en lyofiliserad farmaceutisk sammansättning kan iordningsställas av en sur lösning av t-PA och att sammansättningen är kapabel till att ge en parenteral lösning som vid administrering icke skapar några väsentliga fysiologiska problem. Följaktligen skapar föreliggande uppfinning ett förfarande för iordningställande av en lyofiliserad farmaceutisk sammansättning med t-PA, vilket förfarande innefattar vakuumtorkning av en fryst vattenhaltig lösning av t-PA, vari pH är från 2 till 5.

Till följd av den ökade lösligheten av t-PA kan en sådan lyofiliserad sammansättning ordningsställas enligt uppfinningen som är i stånd att ge en parenteral lösning med en hög koncentration med avseende på t-PA utan någon väsentlig risk för att t-PA faller ut ur lösningen. Vidare har det visat sig att koncentratio- nen av t-PA i en sådan lösning lätt kan minskas genom utspädning med vatten med neutralt eller surt pH, 462 016 10 15 20 25 30 35 4 även här utan någon väsentlig risk för att t-PA faller ut. Föreliggande uppfinning skapar därför en stabil lyofiliserad farmaceutisk sammansättning som medger större flexibilitet i hantering och användning av läka- re och veterinärer samt som ett bekvämare medel för transport och lagning. t-PA som används i föreliggande uppfinning kan vara ett godtyckligt, bioaktivt protein som väsentligen motsvarar mammalisk, och i synnerhet human, t-PA och innefattar former med och utan glykosylering. Den kan vara en- eller tvåkedjig t-PA, eller en blandning härav, såsom beskrivs i EP-A-ll2 122 och, när det gäller fullständigt glykosylerad human t-PA, den har en skenbar molekylvikt på polyakrylamidgeler på ca 70 000 och en isoelektrisk punkt på mellan 7,5 och 8,0.

Företrädesvis har t-PA:n en specifik aktivitet på ca 500 000 IU/mg (International Units/mg, där International Unit är en enhet för aktivitet definierad av WHO, "National Institute for Biological Standars and Control, Holly Hill, Hampstead, London, NW2 6RB, U.K).

Aminosyrasekvensen av t-PA motsvarar, företrädesvis, väsentligen sekvensen i fig 1. Sekvensen är sålunda identisk med den i fig 1 eller innehåller en eller fler aminosyradeletioner, -substitutioner, -insertioner, - inversioner eller -additioner av alleliskt ursprung eller annat, varvid den resulterande sekvensen har åt- minstone 80% och företrädesvis 90% homologi med sekven- sen i fig 1 och kvarhåller väsentligen proteinets bio- logiska och immunologiska egenskaper. I synnerhet är t-PA sekvensen identisk med sekvensen i fig l eller har samma sekvens men med aminosyran i position 245 från serinets N-terminal varande valin i stället för metionin, varvid varje sekvens valfritt kan sakna någon av de första tre aminosyrorna eller valfritt har en ytterligare polypeptid N-terminal presekvens av Gly-Ala-Arg.

Aminosyrasekvensen i fig l har trettiofem cystein- rester och sålunda potential för bildning av sjutton 10 15 20 25 30 35 * 462 016 5 disulfidbryggor. Baserat på analogi med andra proteiner vars struktur har bestämts mera i detalj, visas i fig 2 den postulerade strukturen för sekvensen (härrörande från disulfidbindningen) mellan aminosyran i position 90 och prolinets C-terminal. Strukturen av det N-ter- minala området är mindre säker, ehuru vissa förslag har blivit framlagda (Progress in Fibrinolysis, 1983, Q, 269-273; och Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, gl, 5355-5359). De viktigaste särdragen hos strukturen av t-PA är de två kringelområdena (mellan 92:a och 173:e aminosyrorna och mellan de l80:a och 26l:a amino- syrorna) som sörjer för bindningen av proteinet till fibrin, och serinproteasområdet, som innehåller huvud- delen av B-kedjan och som ansvarar för aktiveringen av plasminogen. Aminosyrorna av speciell betydelse i serinproteaser är den katalytiska triaden, His/Asp/Ser.

I t-PA uppträder dessa i positionerna 322, 371 och 463. Disulfidbryggan mellan 264:e och 395:e cystein- aminosyraresterna är också viktig, i det att den hop- håller A och B-kedjorna i den tvåkedjiga formen av t-PA.

I fig 1 och 2 har de konventionella en- och tre- bokstavskoderna använts för aminosyraresterna enligt följande: _ Asp D Asparaginsyra Ile I Isoleucin Thr T Treonin Leu L Leucin Ser S Serin Tyr Y Tyrosin Glu E Glutaminsyra Phe F Fenylalanin Pro P Prolin His H Histidin Gly G Glycin Lys K Lysin Ala A Alanin Arg R Arginin Cys C Cystein Trp W Tryptofan Val V Valin Gln Q Glutamin Met M Metionin Asn N Asparagin t-PA:n kan erhållas enligt vilken som helst av de procedurer som beskrivs eller är kända inom området.

Exempelvis kan den erhållas ur en normal eller neoplas- tisk cellinje av den typ som beskrivs i Biochimica 462 016 10 15 20 25 30 35 6 et Biophysica Acta, 1979, ägg, 140-153; EP-A-41 766 eller EP-A-113 319. Det föredrages emellertid att t-PA erhålles ur en odlad transformerad eller transfekterad cellinje, under användning av rekombinant DNA-teknologi såsom denna har beskrivits t ex i EP-A-93 619; EP-A-117 059 eller EP-A-117 060. Särskilt föredrages att äggstocksceller från kinesisk hamster (CHO) an- vänds för produktionen av t-PA och framtages på det sätt som beskrivs i Molecular and Cellular Biology, 1985, 5111, 1750-1759. På detta sätt samtransfekteras den klonade genen med genen som kodar dihydrofolatre- duktas (dhfr) till dhfr-CHO-celler. Transformanter som uttrycker dhfr utväljes på media som saknar nukleo- sider och utsättes för ökande metotrexatkoncentrationer. dhfr och t-PA-generna samförstärkes på så sätt, vilket leder till en stabil cellinje i stånd att uttrycka höga t-PA-nivåer.

Företrädesvis renas t-PA under användning av någon beskriven eller känd teknik, såsom de som beskrivs i Biochimica et Biophysica Acta, 1979, âåg, 140-153; J. 3101. chem., 1979, 254(6), 1998-2003, ¿g¿g, 1981, 256(13), 7035-7041; Eur, J. Biochem., 1983, låg, 681-686; EP-A-41 766; EP-A-113 319 eller GB-A-2 122 219.

Det synes icke föreligga någon övre gräns för lösligheten av t-PA i den parenterala lösningen. Vid mycket höga koncentrationer, såsom högre än 150.000.000 IU/ml (International Units/ml), blir lösningen blott viskös utan någon väsentlig utfällning av t-PA. t-PA- koncentrationen i den vattenhaltiga lösningen kan därför variera inom vida gränser, exempelvis från 50.000 till 50.000.000 IU/ml. För att vinna den maximala fördelen av föreliggande uppfinning, föredrages det att t-PA- koncentrationen är högre än 100.000 IU/ml, helst högre än 500.000 IU/ml och mest föredraget högre än 1.000.000 IU/ml. Allra helst föredrages att t-PA- koncentrationen är ca 5.000.000 IU/ml.

Den övre gränsen för den vattenhaltiga lösningens 10 15 20 25 30 35 462 016 7 pH är företrädesvis 4,5. Företrädesvis ligger pH inom området från 2,5 till 4,0 hellre än 2,8 till 3,5 och är helst ca 3,0. Den vattenhaltiga lösningens önskade pH uppnås lämpligen genom användning av en fysiolo- giskt acceptabel oorganisk eller organisk syra. Exem- pel på en sådan syra innefattar saltsyra, svavelsyra och saltpetersyra, och citronsyra, tartarsyra och bensensulfonsyra. Av dessa exempel föredrages saltsyra.

Ehuru något fysiologiskt acceptabelt sam-lösnings- medel kan valfritt föreligga jämte vatten, är det före- draget att mediet för den vattenhaltiga lösningen helt eller väsentligen är vattenhaltig.

Den parenterala lösning som erhålles utifrån den lyofiliserade farmaceutiska sammansättningen kan vara hypertonisk, hypotonisk eller isotonisk med patientens blodserum. För att undvika oönskade sidoeffekter är emellertid den parenterala lösningen företrädesvis isotonisk, ehuru smärre avvikelser icke har någon större fysiologisk betydelse. En väsentligen isotonisk parenteral lösning kan erhållas genom införlivande av ett fysiologiskt acceptabelt medel som är i stånd att höja lösningens tonicitet till den erforderliga nivån. Medlet kan införlivas i den vattenhaltiga lös- ningen som skall frystorkas så att det redan är närvaran- de i den lyofiliserade farmaceutiska sammansättningen eller den kan införlivas i vattnet med neutralt eller surt pH som används för upplösning av sammansättningen i och för erhållande av den önskade parenterala lös- ningen. Exempel på sådana medel är välkända inom omrâdet och innefattar dextros (i vattenfri eller monohydrat- form) och natriumklorid och blandningar därav. Medlets koncentration i den vattenhaltiga lösningen eller i vattnet för upplösning varieras naturligtvis från medel till medel. Vad gäller natriumklorid, är koncent- rationen företrädesvis 7-10 mg/ml och helst ca 8,5 mg/ml, dvs den koncentration som ofta kallas fysiologisk saltlösning eller blott fysiologiskt salt. När det 462 016 10 15 20 25 30 35 8 gäller vattenfri dextros, är koncentrationen företrädes- vis frán 30 till 70 mg/ml, och helst ca 50 mg/ml.

Den vattenhaltiga lösningen kan valfritt innehålla tillsatser som normalt är förknippade med lyofiliserade farmaceutiska kompositioner av denna typ. Exemplen inkluderar albumin från människoserum, och bindemedel och fyllmedel, såsom mannitol, laktos och glykos.

Eftersom t-PA har en tendens att adsorberas på glas- och plastytor, kan det vara önskvärt att inkludera ett ytaktivt medel i den vattenhaltiga lösnsingen, så att sådan adsorption inte sker eller nedbringas till et minimum. Exempel på sådana medel innefattar polyoxietylenderivater av fettsyrapartialestrar av sorbitolanhydrider, t ex den som saluföres under han- delsnamnet "Tween 80".

En av de förvånande fördelarna med föreliggande uppfinning, frånsett den väsentligt ökade lösligheten av t-PA, är att användningen av en sur parenteral lösning, erhållen genom rekonstituering av den lyofili- serade farmaceutiska sammansättningen, icke synes ha några väsentliga ofördelaktiga fysiologiska effekter på administrationen till patienten. Det förefaller att blodströmmen generellt är i stånd att höja lös- ningens pH till neutralt nästan så snart som kontakt föreligger, varvid t-PA snabbt distribueras i blod- strömmen. Det är emellertid föredraget att denna process icke väsentligt hindras på något sätt och att den parenterala lösningen och sålunda den vattenhaltiga lösningen som skall frystorkas och vattnet för rekonsti- tuering icke innehåller något starkt buffermedel.

Ett svagt buffermedel som icke väsentligt hämmar denna process kan emellertid inkluderas och i själva verket verkar vid surt pH t-PA själv som sitt eget svaga buffermedel. Därutöver är albumin i människoserum i stånd att verka som svagt buffermedel.

Tack vare den väsentligt ökade lösligheten av t-PA i en vattenhaltig lösning, vari pH är 2-5, finns 5 10 15 462 016 9 det inget behov av att i den parenterala lösningen, erhållen genom rekonstitutering av den lyofiliserade sammansättningen, inkludera något ytterligare material, såsom lysin eller ornitin eller ett salt därav, för ökning av lösligheten av t-PA.

Den vattenhaltiga lösningen av t-PA kan prepare- ras genom att det framtages en lösning av renad t-PA och mediet utbytes mot ett vattenhaltigt medium med pH 2-5; eller att renad t-PA upplöses i ett vattenhal- tigt medium med pH 2-5.

Reningen av t-PA kan inbegripa, som ett slutsteg, eluering av proteinet från en kromatografkolonn som en lösning som innehåller ett starkt buffermedel.

Såsom nämnts tidigare föredrages det att den parentera- la lösningen, och sålunda den lyofiliserade farmaceu- tiska sammansättningen och vattenhaltiga lösningen, icke innehåller något starkt buffermedel, varför ett lämpligt medel för utförande av dess borttagande under i _mediumbytet är att dialysera. Detta kan utföras genom 20 25 30 35 användning av en dialysslang eller en konstgjord njure, i vilken den renade lösningen dialyseras mot ett vatten- haltigt medium vars pH är 2-5. Det kan vara önskvärt, i synnerhet om koncentrationen av t-PA i den renade lösningen är hög, att först inställa lösningens pH så, att det är 2-5. Ett annat medel för uppnående av borttagandet av ett starkt buffermedel under medium- byte är att underkasta den renade lösningen en gelfilt- rering och att framkalla kolonnen med ett vattenhaltigt medium vars pH är 2-5. t-PA i form av ett utfällt fast ämne kan, före- trädesvis, uppnås med utgångspunkt i en renad lösning genom att pH inställes på ca 5,5, lösningen kyles till strax över dess fryspunkt, och proteinet utvinnes, exempelvis genom centrifugering. Det utfällda fasta ämnet kan sedan på konventionellt sätt upplösas i ett vattenhaltigt medium vars pH är 2-5.

Det föredrages att den resulterande vattenhaltiga 462 016 10 15 20 25 30 35 10 lösningen steriliseras konventionellt, exempelvis genom filtersterilisering, och att den sedan ifylles sterila plast- eller glasbehållare, t ex ampuller eller provrör med volymer pà, exempelvis, 0,5-20 ml.

Den vattenhaltiga lösningen av t-PA fryses före- trädesvis vid en temperatur på från -10 till -40°C.

Den frysta vattenhaltiga lösningen hálles sedan före- trädesvis vid denna temperatur till dess att vakuumtork- ningen inleds.

Vakuumtorkning av den frysta vattenhaltiga lös- ningen kan utföras på konventionellt sätt och innefattar torkning under ett partiellt eller komplett vakuum, exempelvis vid från 0,01 till 0,1 torr, under tillräck- ligt lång tid för att väsentligen all fryst vätska skall avalägsnas.

Den temperatur vid vilken vakuumtorkningen utföres är vanligen från -30 till -40°C i början av processen, så att den vattenhaltiga lösningen vidmakthålles i en väsentligen eller komplett fryst form. Allt eftersom processen fortskrider och vattnet avlägsnas kan tempe- raturen gradvis ökas, till dess att den när rumstempe- ratur. Det föredrages, i slutet av processen, att vakuumtorkningen vid rumstemperatur eller strax däröver sker under ett väsentligt vakuum pä ca 0,01 torr, så att så mycket som möjligt avlägsnas av de sista spåren av vatten. Fuktinnehállet i den resulterande, lyofiliserade farmaceutiska sammansättningen är före- trädesvis mindre än 2,5%. Sedan vakuumtorkningen har avslutats förseglar man lämpligen den sterila plast- eller glasbehâllaren, som innehåller den lyofiliserade farmaceutiska sammansättningen.

Under vakuumtorkningen av den frysta vattenhaltiga f lösningen kvarlämnar vattnets bortförande t-PA i form av ett fysiologiskt acceptabelt salt. Följaktligen C ger föreliggande uppfinning också ett fysiologiskt acceptabelt salt, i synnerhet ett fysiologiskt accepta- belt syraadditionssalt, såsom klorvätesaltet av t-PA. 10 15 20 25 30 35 462 016 ll Användningen av föreliggande vppfinning medger för första gången erhållande av es lyofiliserad farma- ceutisk sammansättning som är i stånd att ge en paren- teral lösning med tillräckligt hög koncentration av t-PA. Följaktligen ger föreliggande uppfinning också en lyofiliserad farmaceutisk sammansättning av t-PA, som vid upplösning i vatten är i stånd att ge en kon- centration av t-PA på högre än 100.000 IU/ml, närmare bestämt högre än 500.000 IU/ml och i synnerhet högre än 1.000.000 IU/ml.

För iordningsställande av en parenteral lösning av t-PA för administrering rekonstitueras den lyofili- serade farmaceutiska sammansättningen, erhállen enligt förfarandet enligt uppfinningen, i vatten med neutralt eller surt pH. Om den vattenhaltiga lösningen, av vilken den lyofiliserade farmaceutiska sammansättningen erhålles, är väsentligen isotonisk, föredrages det att rekonstitueringsvattnet också är väsentligen iso- toniskt. _ t-PA:s biologiska aktivitet under upplösning av fibrinnätverket i blodkoagel har lett till dess användbarhet för behandling av trombotiska störningar (The Lancet, 7 november 1981, 1018-1020; iQi§¿, 13 april 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 1984, 310(l0), 609-613; och i§id¿, 1985, 3l2(14), 932-936). Föreliggande uppfinning erbjuder därför ett förfarande för behandling av trombotiska störningar i ett däggdjur, vilket förfarande innefattar administre- ring till däggdjuret av en vattenhaltig parenteral lösning av t-PA, erhállen från en lyofiliserad farma- ceutisk sammansättning, såsom denna definieras här.

Alternativt erbjuds också en lyofiliserad farmaceutisk sammansättning med t-PA, såsom denna definieras här, för användning i human eller veterinär medicin, i synnerhet för användning för behandling av en trombotisk störning.

Speciella exempel på en trombosstörning är kända 462 016 10 15 20 25 30 35 12 inom området men innefattar myokardial infarkt, djup- ventrombos, lugnemboli och slaganfall.

Huvudvägen för administrering av den parenterala lösningen är intravaskulär, i synnerhet intravenös, infusion, ehuru även andra administrationsvägar, såsom intramuskulär administrering, kan användas. Intravasku- lära infusioner utföres normalt med den parenterala lösningen upptagen i en infusionspáse eller -flaska eller i en elektriskt styrd infusionsspruta. Lösningen kan matas från infusionspåsen eller -flaskan till patienten genom gravitetsmatning eller genom använd- ning av en infusionspump. Användningen av gravitets- infusionssystem ger icke tillräcklig kontroll över hastigheten av den parenterala lösningens administra- tion, varför användningen av en infusionspump föredrages, i synnerhet vid lösningar som innehåller relativt höga koncentrationer av t-PA. Helst används emellertid en elektriskt styrd infusionsspruta, som ger en ännu bättre kontroll över administreringens hastighet.

En effektiv mängd av t-PA för behandling av dägg- djur med trombotiska störningar är naturligtvis i beroende av flera faktorer, innefattande exempelvis däggdjurets ålder och vikt, det exakta tillståndet som kräver behandling och hur allvarligt tillståndet är, administreringsvägen, och fastställes i slutänden av läkaren eller veterinären. Det är emellertid sanno- likt att en effektiv mängd för lysering av koronär-ar- tärtromb, exempelvis generellt ligger inom området från 150.000 - 450.000 IU/kg patientkroppsvikt per timme. För en 70 kg tung vuxen människa är sålunda en effektiv mängd per timme generellt från l0.000.000 - 30.000.000 IU, i synnerhet ca 20.000.000 IU, och denna mängd kan administreras med eller utan en startdos. Det är också sannolikt att dosen är mindre för vissa trombotiska tillstånd, såsom djupventrombos och akut slaganfall, eller helt enkelt för bibehållande av patens hos en redan reperfuserad koronär artär. 10 15 20 25 30 35 462 016 13 I dessa situationer är en effektiv mängd från 7000 till 36.000 IU/kg patientkroppsvikt per timme.

Följande exempel ges för belysande av föreliggande uppfinning, vilka dock inte bör anses vara begränsande för uppfinningstanken.

Exempel l En klarnad skörd av t-PA, erhållen från en odlad, transformerad CHO-cellinje, som skapades under använd- ningen av proceduren enligt Molecular and Cellular Biology, 1985, 5111, 1750-1759, renades kromatografiskt och t-PA hopsamlades som en vattenhaltig lösning inne- hållande 0,l7M natriumcitrat och 0,01% (w/v) Tween 80 med pH 5,5. Lösningens pH inställdes på 3,0 med salt- syra och den resulterande lösningen koncentrerades genom ultrafiltrering, under användning av en H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England). Den koncentrerade vatten- haltiga lösningen renades ytterligare genom att den tillfördes en gelfiltreringskolonn (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Sweden) och eluerades med 0,85% saltlösning, innehållande 0,01% (w/v) Tween 80 med pH på 3,0. En högrenad vattenhaltig lösning av t-PA erhölls på så sätt, vilken koncentrerades ännu en gång under användning av en engångsnjure. t-PA utfälldes ur lösningen genom ökning av pH till 5,5 med natriumhydroxid och vidmakthållande av suspensionen vid 4°C i 2 h. t-PA utvanns genom centrifugering vid 4000 x g i 30 min vid 4°C. t-PA pelleten återupplöstes i en vattenlösning av natriumklorid (0,85% (w/v)), innehållande 0,01% (w/v) Tween 80 och inställd på pH på 3,0 med saltsyra. Volymen av den använda salt- lösningen var den som erfordrades för att ge en kon- centration av t-PA på mellan 7.500.000 IU/ml och l0.000.000 IU/ml. Denna lösning av t-PA utspäddes med ytterligare vattenlösning av natriumklorid (0,85% (w/v)) innehållande 0,01% (w/v) Tween 80 och inställt på pH 3,0 med saltsyra, och även med tillräcklig mängd 462 016 10 15 20 25 30 14 av en lösning av 10% (w/v) mannitol i samma sura salt- lösning, så att den gav slutkoncentrationer på 5.000.000 IU/ml av t-PA och 25 mg/ml mannitol. Den resulterande lösningen filtersteriliserades och dose- rades i volymer pá 1 ml i glasampuller, som frystes vid -35°C. Ett vakuum applicerades vid 0,05 torr.

Efter ca 24 h ökades temperaturen gradvis till 5°C och hölls pà detta värde i 16 h. Den höjdes sedan till 25°C och vakuumet ökades till 0,02 torr i ytter- ligare 24 h, varpå ampullerna förseglades ett partiellt vakuum av 600 torr torrt kväve.

Exempel 2 Den trombolytiska effektiviteten av den parente- rala lösningen erhállen från den lyofiliserade samman- sättningen med t-PA enligt exempel l utvärderades i en in vivo-modell av jugular-ventrombos. (a) Procedur: Den experimentella proceduren följde väsentligen den procedur som beskrivs av Collen et al (J. Clin.

Invest., 1983, Zl, 368-376).

Den lyofiliserade sammansättningen enligt exempel l upplöstes fullständigt och snabbt i en steril iso- tonisk saltlösning, inställd pá pH 3,0 och innehållan- de 0,01% Tween 80. En parenteral lösning erhölls på så sätt för en 2 h infusion av 500.000 IU/kg t-PA.

Infusion utfördes via en kanyl i den högra femorala venen. Fyra vitkaniner från Nya Zealand användes i studiet. Efter infusion uppskattades graden av trom- bolys. (b) Resultat: Trombolysprocenten var 28,9 t 4,1, vilket klargör den trombolytiska effekten av den parenterala lösningen enligt exempel 1. Därutöver observerades inga ofördel- aktiga reaktioner med denna lösning.

Claims (6)

10 15 462 Û16 15 PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av en lyofiliserad farmaceutisk sammansättning av t-PA, k ä n n e t e c k - n a t därav, att man lyofiliserar en vattenhaltig lösning av t-PA, vars pH har inställts på 2-5.

2. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att lösningens koncentration av t-PA är ca 5.000.000 IU/ml.

3. Förfarande enligt kravet 1 eller 2, k ä n n e - t e c k n a t därav, att pH är ca 3,0.

4. Förfarande enligt något av de föregående kra- ven, k ä n n e t e c k n a t därav, att den vatten- haltiga lösningen innehåller ett ytaktivt medel.

5. Förfarande enligt något av de föregående kra- ven, k ä n n e t e c k n a t därav, att den vatten- haltiga lösningen är väsentligen obuffrad.

6. Förfarande enligt något av kraven 1 - 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att den vattenhaltiga lösningen innehåller natriumklorid i väsentligen iso- ton koncentration.