DK163173B - Fremgangsmaade til fremstilling af et lyofiliseret farmaceutisk praeparat af vaevs-plasminogenaktivator (t-pa) - Google Patents

Description

DK 163173B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et lyofiliseret farmaceutisk præparat indeholdende vævs-plasminogen-aktivator (t-PA).

Det formodes, at der er en dynamisk ligevægt mel-5 lem det enzymsystem, der er i stand til at danne størknet blod, koagulationssystemet, og det enzymsystem, der er i stand til at opløse størknet blod, det fibronolyti-ske system, som bevarer et intakt åbent blodkarvæv. Til begrænsning af blodtabet fra læsioner dannes størknet 10 blod i de læderede kar. Efter naturlig heling af læsionen opløses det overflødige størknede blod ved indvirkning af det fibrinolytiske system. Af og til dannes størknet blod uden traumatiske læsioner. Dette kan afsættes i større blodkar, hvilket resulterer i delvis 15 eller endog total blokering af blodstrømningen. Når dette sker i hjertet, lungerne eller hjernen, kan resultatet være en myokardial infarkt, pulmonær emboli eller slagtilfælde. Disse anfald er sammen hovedårsagen til sygelighed og dødelighed i de industrialiserede lande.

20 Størknet blod består af et fibrøst netværk, der kan opløses ved hjælp af det proteolytiske enzym, plas-min. Enzymet opnås ud fra det inaktive proenzym, plasminogen, der er en komponent af blodplasma, ved indvirkning af en plasminogen-aktivator. Der findes to immuno-25 logisk forskellige plasminogen-aktivatorer hos pattedyr eller mennesker. Intrinsic plasminogen-aktivator, der også er kendt som urokinase, er et enzym, der dannes af nyrerne og kan isoleres fra urinen. Det kan også fremstilles ud fra en række vævskulturkilder. Ekstrinsic 30 plasminogen-aktivator, der også er kendt som vaskulær plasminogen-aktivator og som vævs-plasminogen-aktivator (t-PA), kan isoleres fra mange vævshomogenater (især human uterus), blodkarcellevæggene og fra nogle cellekulturer. Foruden disse to slags plasminogen-aktivatorer, 35 findes der også et bakterielt produkt, streptokinase, fremstillet ud fra β-hæmolytiske streptokker. En hoved- 2

DK 163173 B

ulempe ved både urokinase og streptokinase er, at de er aktive gennem hele kredsløbet og ikke kun på stedet for størknet blod. De kan f.eks. ødelægge andre blodproteiner, såsom fibrinogen, prothrombin, faktor V og faktor 5 VIII og således reducere blodets størkningsevne og forøge risikoen for blødninger. Derimod er den biologiske aktivitet af t-PA afhængig af tilstedeværelsen af fibrin, hvortil det bindes, og hvor det aktiveres. Den maksimale aktivitet udvikles således kun på stedet for 10 størknet blod, dvs. i tilstedeværelse af fibrinnetvær-ket, der skal opløses, og herved undgås risikoen for blødning i stor udstrækning.

Hovedadministreringsvejen for t-PA er intravasku-lær infusion, hvortil der kræves formulering af t-PA som 15 en parenteral opløsning. Når et medikament er et protein, foretrækkes det, at præsentere det for lægen eller dyrlægen som et lyofiliseret farmaceutisk præparat, på grund af de væsentlige transport- og opbevaringsfordele i forhold til et flydende præparat. Det er imidlertid 20 vigtigt, at alle sådanne lyofiliserede præparater let kan omdannes til den ønskede parenterale opløsning uden unødvendige vanskeligheder, og at lægen eller dyrlægen er i stand til at opnå den krævede koncentration af medikamentet i enhver given situation, blot ved at genop-25 løse præparatet i den rette mængde opløsningsmiddel. Det er f.eks. ikke tilrådeligt at administrere et stort volumen af en opløsning til en patient med en hjerteeller nyrelidelse, idet det vil bringe hjertet eller nyrerne under endnu større belastning. Volumenet skal der-30 for holdes på et minimum ved sådanne omstændigheder. Det er således ønskeligt, at der kan opnås parenterale opløsninger, ikke kun med relativt lave koncentrationer, men også med høje koncentrationer af medikamentet.

En række lyofiliserede farmaceutiske præparater 35 af t-PA har været beskrevet tidligere, f.eks. i EP-pa-tentansøgning nr. 113.319 og EP-patentansøgning nr.

DK 163173 B

3 123.304. Præparaterne fremstilles ud fra vandige saltopløsninger af t-PA, som har omtrent neutral pH-værdi, og har den ulempe, at opløseligheden af t-PA i sådanne opløsninger er lav uden en forøgelse af ionkoncentratio-5 nen. Følgelig indeholder de parenterale opløsninger, opnået ud fra sådanne lyofiliserede præparater, enten t-PA i lave koncentrationer, hvilket i nogle af tilfaldene nødvendiggør administrering af uhensigtsmæssigt store volumener opløsning til en patient, eller de er hyperto-10 niske, hvilket kan være skadeligt for de røde blodlegemer ved administrering.

Det har nu vist sig, at opløseligheden af t-PA i en vandig opløsning kan forøges, hvis opløsningens pH-værdi er i det sure område, at et lyofiliseret farma-15 ceutisk præparat kan fremstilles ud fra en sur opløsning af t-PA, og at præparatet kan give en parenteral opløsning, som ikke udviser nogle væsentlige fysiologiske problemer ved administrering. Følgelig tilvejebringes der ifølge den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde 20 til fremstilling af et lyofiliseret farmaceutisk præparat af t-PA, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter lyofilisering af en vandig opløsning af t-PA, hvori pH-værdien er fra 2 til 5.

Som et resultat af den forøgede opløselighed af 25 t-PA, kan man ifølge den foreliggende opfindelse fremstille et lyofiliseret farmaceutisk præparat, der kan give en parenteral opløsning med en høj koncentration af t-PA uden nogen væsentlig risiko for, at t-PA'et fældes ud af opløsningen. Det lyofiliserede præparat kan derfor 30 præsenteres for læger eller dyrlæger, som kan opløse præparatet, som og når det kræves, til den ønskede koncentration, f.eks. ved anvendelse af surt eller neutralt vand. Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der derfor et stabilt lyofiliseret farmaceutisk præpa-35 rat, der muliggør større fleksibilitet ved dets håndtering og anvendelse af læger og dyrlæger og giver en mere hensigtsmæssig transport og opbevaring.

4

DK 163173 B

t-PA'en, der anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, kan være et hvilket som helst biologisk aktivt protein, der i det væsentlige svarer til t-PA fra pattedyr og især mennesker, herunder former med og uden gly-5 cosylering. Det kan være en- eller to-kædet t-PA eller en blanding deraf, som beskrevet i EP-patentansøgning nr. 112.122, og i tilfælde af helt glycosyleret humant t-PA har det en tilsyneladende molekylvægt på polyacryl-amidgeler på ca. 70.000 og et isoelektrisk punkt på mel-10 lem 7,5 og 8,0. t-PA'en har fortrinsvis en specifik aktivitet på ca. 500.000 IU/mg (Internationale enheder/mg, den internationale enhed er en aktivitetsenhed, som defineret af WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, London, NW3 15 6RB, G.B).

Aminosyresekvensen af t-PA svarer fortrinsvis i det væsentlige til den der er angivet i figur 1. Sekvensen er således identisk med sekvensen i figur 1 eller omfatter en eller flere aminosyreudeladelser, -substitu-20 tioner, -indføjelser, inverteringer eller tilføjelser af allel oprindelse, eller med andre ord har den resulterende sekvens mindst 80%'s, fortrinsvis 90%'s homologi med sekvensen i figur 1, og den bibeholder i det væsentlige de samme biologiske og immunologiske egenskaber for 25 proteinet. Især er t-PA-sekvensen identisk med sekvensen i figur 1, eller den har samme sekvens, men med aminosyren valin i 245-stilling fra den serin-N-terminale ende i stedet for methionin, idet hver sekvens eventuelt kan være uden en hvilken som helst af de første tre amino-30 syrer eller eventuelt have en yderligere polypeptid-N-terminal presekvens af Gly-Ala-Arg.

Aminosyresekvensen angivet i figur 1 indeholder 35 cysteingrupper, og der er således mulighed for dannelse af 17 disulfid broer. På basis af analogi med an-35 dre proteiner, hvis struktur er bestemt mere detaljeret, er den postulerede struktur (der fremkommer ved dannelse

DK 163173 B

5 af disulfidbindinger) for sekvensen mellem aminosyren i 90-stilling og den prolin-C-terminale ende angivet i figur 2. Strukturen af den N-terminale region er mindre sikker, skønt nogle forslag har været fremsat (Progress 5 in Fibrinolysis, 1983, 6, 269-273; og Proc. Natl. Acad.

Sci., 1984, 81, 5355,5359). De vigtigste træk ved strukturen af t-PA er de to kringleregioner (mellem aminosyre nr. 92 og nr. 173 og mellem aminosyre nr. 180 og 261), som er ansvarlige for bindingen af proteinet til fibrin, 10 og serinproteaseregionen, der omfatter hovedparten af B-kæden, og som er ansvarlig for aktiveringen af plasminogen. Aminosyrerne af særlig vigtighed i serinpro-teaserne er den katalytiske triade, His/Asp/Ser. I t-PA forekommer denne ved 322-, 371- og 463-stillingerne.

15 Disulfidbroen mellem cysteinaminosyrerne med nr. 264 og 395 er også vigtig, idet den holder A- og B-kæderne sammen i den to-kædede form af t-PA.

I figur 1 og 2 er de sædvanlige en- og tre-bogstavkoder anvendt for aminosyrer-grupperne som følger: 20

Asp D Asparaginsyre Ile I Isoleucin

Thr T Threonin Leu L Leucin

Ser S Serin Tyr Y Tyrosin

Glu E Glutaminsyre Phe F Phenylalanin 25 Pro P Prolin His H Histidin

Gly G Glycin Lys K Lysin

Ala A Alanin Arg R Arginin

Cys C Cystein Trp w Tryptohan

Val V Valin Gin Q Glutamin 30 Met M Methionin Asn N Asparagin t-PA'en kan opnås ved en hvilken som helst af de kendte eller beskrevne fremgangsmåder. F.eks. kan det opnås ud fra en normal eller neoplastisk cellelinie af 35 den art, der er beskrevet i Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; EP-patentansøgning nr. 41.766 6

DK 163173 B

eller EP-patentansøgning nr. 113.319. Det foretrækkes imidlertid, at t-PA'en opnås ud fra en dyrket, transformeret eller transficeret cellelinie, der er frembragt ved anvendelse af rekombinant-DNA-teknologi, f.eks. som 5 beskrevet i EP-patentansøgning nr. 93.619, EP-patentansøgning nr. 117.059 eller EP-patentansøgning nr. 117.060. Det foretrækkes især at anvende kinesiske ham-sterovarieceller (CHO-celler) til fremstilling af t-PA, hvilke celler opnås på den måde, der er beskrevet i Mo-10 lekular og Cellular Biologi, 1985, 5(7), 1750-1759. På denne måde transficeres det klonede gen sammen med genet, der koder for dihydrofolatreduktase (dhfr) til dhfr~CHO-celler. Transformanter, der eksprimerer dhfr udvælges på medier, der mangler nucleosider og udsættes 15 for stigende koncentrationer af methotrexat. dhfr- og t-PA-generne forstærkes således sammen til en stabil cellelinie, der kan eksprimere store mængder t-PA.

t-PA'en renses fortrinsvis ved anvendelse af en hvilken som helst af de beskrevne eller kendte frem-20 gangsmåder indenfor teknikken, såsom fremgangsmåderne beskrevet i Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J. Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid, 1981, 256(13), 7035-7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-patentansøgning nr. 41.766; EP-patentansøg-25 ning nr. 113.319 eller GB-patentansøgning nr. 2.122.219.

Der synes ikke at være nogen øvre grænse for opløseligheden af t-PA i den vandige opløsning, der anvendes ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindel-30 se. Ved meget høje koncentrationer, som f.eks. større end 150.000.000 IU/ml (internationale enheder/ml) bliver opløsningen blot viskos uden nogen væsentlig udfældning af t-PA. Koncentrationen af t-PA i den vandige opløsning kan derfor variere indenfor vide grænser, f.eks. fra 35 50.000 til 50.000.000 IU/ml. Til sikring af den maksimale fordel ved den foreliggende opfindelse, foretrækkes

DK 163173 B

7 det, at koncentrationen af t-PA er større end 100.000 IU/ml, fortrinsvis større end 500.000 IU/ml, helst større end 1.000.000 IU/ml. Det mest foretrukne er, at koncentrationen af t-PA er større end 5.000.000 IU/ml.

5 Den øvre grænse af den vandige opløsnings pH-vær- di er fortrinsvis 4,5. pH-værdien er faktisk fortrinsvis i området fra 2,5 til 4,0, mere foretrukket fra 2,5 til 3,8 og helst ca. 3,0. Den vandige opløsnings ønskede pH-værdi opnås hensigtsmæssigt ved anvendelse af en fysio-10 logisk acceptabel uorganisk eller organisk syre. Eksempler på sådanne syrer omfatter saltsyre, svovlsyre og salpetersyre, og citronsyre, vinsyre og benzensulfonsy re. Af disse foretrækkes saltsyre.

Skønt nogle fysiologisk acceptable opløsningsmid-15 ler eventuelt kan være tilstede sammen med vandet, foretrækkes det, at mediet for den vandige opløsning er helt eller i det væsentlige vandigt.

Den parenterale opløsning opnået ud fra det lyo-filiserede farmaceutiske præparat kan være hypertonisk, 20 hypotonisk eller isotonisk med patientens blodserum. Til undgåelse af uønskede bivirkninger er den parenterale opløsning imidlertid fortrinsvis isotonisk, skønt mindre afvigelser ikke er af stor fysiologisk betydning. En i det væsentlige isotonisk parenteral opløsning kan opnås 25 ved inkorporering af et fysiologisk acceptabelt middel, der er i stand til at øge opløsningens saltspænding til det ønskede niveau. Midlet kan være inkorporeret i den vandige opløsning, der skal frysetørres, således at det allerede er tilstede i det lyofiliserede farmaceutiske 30 præparat, eller det kan inkorporeres i vandet med neutral eller sur pH-værdi, der anvendes til opløsning af præparatet til opnåelse af den ønskede parenterale opløsning. Eksempler på et sådant middel er velkendte indenfor fagområdet, og omfatter dextrose (i en vandfri 35 eller monohydratform) og natriumchlorid og blandinger deraf. Koncentrationen af midlet i den vandige opløsning 8

DK 163173 B

eller i vand til opløsningen vil selvfølgelig variere fra middel til middel. For natriumchlorid er koncentrationen fortrinsvis fra 7 til 10 mg/ml, helst ca. 8,5 mg/ml, ved hvilken koncentration opløsningen ofte beteg-5 nes som fysiologisk saltopløsning eller fysiologisk saltvand. For vandfri dextrose er koncentrationen fortrinsvis fra 30 til 70 mg/ml, helst ca. 50 mg/ml.

Den vandige opløsning kan eventuelt indeholde sådanne additiver, der normalt er knyttet til lyofilisere-10 de farmaceutiske præparater af denne type. Eksempler omfatter humant serumalbumin, og bindemidler og fyldstoffer, såsom mannitol, lactose og glucose. Desuden har t-PA en tendens til at adsorbere til glas- og plastoverflader, hvorfor det kan være ønskeligt, at inkorporere 15 et overfladeaktivt middel i den vandige opløsning til hindring eller minimering af en sådan adsorption. Eksempler på et sådant middel omfatter polyoxyethylenderi-vater af partielle fedtsyreestere af sorbitolanhydrider, som dem der markedsføres under varemærket "Tween 8C^D ".

20 En af de overraskende fordele ved den fore liggende opfindelse bortset fra den væsentligt forøgede opløselighed af t-PA, er at anvendelsen af en sur parenteral opløsning, opnået ved genopløsning af det lyofili-serede farmaceutiske præparat, ikke synes at give nogle 25 væsentlige negative fysiologiske virkninger ved administrering til patienten. Det ser ud til at blodstrømmen i almindelighed er i stand til at øge opløsningens pH-værdi til neutral værdi, næsten så hurtigt der er skabt kontakt, og at t-PA'en hurtigt fordeles i blodstrømmen.

30 Det foretrækkes imidlertid, at denne proces i det væsentlige ikke hæmmes på nogen måde, og at den parentera-le opløsning og dermed den vandige opløsning, der skal frysetørres, og vandet til genopløsningen ikke indeholder en stærk puffer. En svag puffer, der ikke væsentlig 35 hæmmer denne proces, kan imidlertid inkorporeres, og i det sure område virker t-PA faktisk selv som en svag 9

DK 163173 B

puffer. Desuden er humant serumalbumin i stand til at virke som en svag puffer.

På grund af den væsentlig forøgede opløselighed af t-PA i den vandige opløsning, hvori pH er fra 2 til 5 5, er der ikke behov for at inkorporere yderligere materiale, såsom lysin eller ornithin eller et salt deraf, til forøgelse af t-PA'ets opløselighed i den parenterale opløsning opnået ved genopløsning af det lyofiliserede præparat.

10 Den vandige opløsning af t-PA kan fremstilles ved opnåelse af en opløsning af renset t-PA og udskiftning af mediet med et vandigt medie med en pH-værdi fra 2 til 5 eller ved opløsning af renset t-PA i et vandigt medium med pH fra 2 til 5.

15 Rensningen af t-PA kan som et sluttrin omfatte eluering af proteinet fra en chromatografisk kolonne som en opløsning indeholdende en stærk puffer. Som nævnt tidligere foretrækkes det, at den parenterale opløsning og således det lyofiliserede farmaceutiske præparat og 20 den vandige opløsning ikke indeholder en stærk puffer.

En hensigtsmæssig metode til at fremkalde dens fjernelse under udskiftning af mediet er at anvende dialyse. Denne kan udføres ved anvendelse af dialyserør eller en kunstig nyre, i hvilket den rensede opløsning dialyseres 25 mod et vandigt medium, hvori pH-værdien er fra 2 til 5.

Det kan være ønskeligt, især hvis t-PA koncentrationen i den rensede opløsning er høj, først at indstille opløsningens pH-værdi, således at den er fra 2 til 5. Andre metoder til fremkaldelse er fjernelse af en stærk puffer 30 under udskiftning af mediet er at udsætte den rensede opløsning for gelfiltrering og eluere kolonnen med et vandigt medium, hvori pH-værdien er fra 2 til 5.

t-PA i form af et udfældet fast stof, kan fortrinsvis opnås ud fra en renset opløsning ved indstil-35 ling af pH til ca. 5,5, afkøling af opløsningen til lige over dens frysepunkt og udvinding af proteinet, f.eks.

10

DK 163173B

ved centrifugering. Det udfældede faste stof kan dernæst opløses i et vandigt medium med en pH-værdi fra 2 til 5 på sædvanlig måde.

Det foretrækkes, at den opnåede vandige opløsning 5 steriliseres på sædvanlig måde, f.eks. ved steril-fil-trering, og at den dernæst fordeles i sterile plast- eller glasbeholdere, såsom ampuller eller hætteglas, i volumener på f.eks. 0,5 til 20 ml.

Den vandige opløsning af t-PA fryses, fortrinsvis 10 ved en temperatur på mellem -10 og -40°C. Den frosne vandige opløsning holdes dernæst fortrinsvis ved denne temperatur indtil vakuumtørringen påbegyndes.

Vakuumtørringen af den frosne, vandige opløsning kan udføres på sædvanlig måde og omfatter tørring under 15 et delvist eller fuldstændigt vakuum, f.eks. fra 0,01 til 0,1 Torr, i tilstrækkelig lang tid til at fremkalde fjernelse af i det væsentlige alt den frosne væske.

Temperaturen, ved hvilken vakuumtørringen udføres, er sædvanligvis fra -30°C til -40°C ved processens 20 begyndelse for således at holde den vandige opløsning på en i det væsentlige eller fuldstændigt frossen form.

Idet processen forløber og vandet fjernes, kan temperaturen gradvist øges indtil den når stuetemperatur. Det foretrækkes, at udføre vakuumtørringen ved eller lige 25 over stuetemperatur, under i det væsentlige vakuum på ca. 0,01 Torr ved processens afslutning, til fjernelse af så meget som muligt af de sidste spor af vand. Fugtindholdet af det opnåede lyofiliserede farmaceutiske præparat er fortrinsvis mindre end 2,5%. Når vakuum tør-30 ringen er afsluttet, lukkes de sterile plast- eller glasbeholdere indeholdende det lyofiliserede farmaceutiske præparat.

Under vakuumtørringen af den frosne, vandige opløsning, fjernes vandet hvorved t-PA'en lades tilbage i 35 form af et fysiologisk acceptabelt salt, såsom hydro-chloridsaltet, af t-PA.

11

DK 163173 B

Anvendelsen af den foreliggende opfindelse gør det muligt for første gang at opnå et lyofiliseret farmaceutisk præparat, der er i stand til at give en parenteral opløsning med en høj koncentration af t-PA som 5 f.eks.· på mere end 100.000 IU/ml, især større end 500.000 IU/ml og helst større end 1.000.000 IU/ml.

Til fremstilling af en parenteral opløsning af t-PA til administrering, genopløses det lyofiliserede farmaceutiske præparat opnået ifølge fremgangsmåden ifølge 10 opfindelsen i neutralt eller surt vand. Hvis den vandige opløsning ud fra hvilket det lyofiliserede farmaceutiske præparat blev opnået, var i det væsentlige isotonisk, foretrækkes det, at vandet til genopløsningen også er i det væsentlige isotonisk.

15 Den biologiske virkning af t-PA til opløsning af fibrinnetværket i størknet blod har ført til dets anvendelse ved behandling af thrombotiske lidelser (The Lancet, 7. November, 1981, 1018-1020; ibid., 13. April 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 20 1984, 310(10), 609-613; og ibid., 1985, 312(14), 932- 936). Med præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der derfor en behandling af en thrombotisk lidelse hos et pattedyr eller menneske, og som omfatter administrering 25 af en parenteral opløsning af t-PA opnået ud fra det lyofiliserede farmaceutiske produkt til dette pattedyr eller menneske.

Specifikke eksempler på en thrombotisk lidelse er kendte for fagfolk, men omfatter myokardiel infarkt, dyb 30 venethrombose, pulmonær emboli og slagtilfælde.

Hovedadminist'reringsvej en for t-PA er intravasku-lær, især intravenøs, infusion, skønt andre mulige administreringsveje, såsom intramuskulær administrering, kan anvendes. Intravaskulære infusioner udføres normalt med 35 den parenterale opløsning indeholdt i en infusionspose eller -flaske eller i en elektrisk drevet infusions-

DK 163173 B

12 sprøjte. Opløsningen kan tilføres til patienten fra infusionsposen eller -flasken ved hjælp af gravitetstil-førsel eller ved anvendelse af en infusionspumpe. Anvendelsen af gravitetstilførsels-infusionssystemer giver 5 ikke tilstrækkelig kontrol over administreringshastigheden for den parenterale opløsning, hvorfor det foretrækkes at anvende en infusionspumpe, især ved opløsninger indeholdende relativt høje t-PA-koncentrationer. Det mest foretrukne er imidlertid at anvende en elektrisk 10 drevet infusionssprøjte, som giver endnu større kontrol over administreringshastigheden.

Den effektive mængde t-PA til behandling af et pattedyr eller menneske med en thrombotisk lidelse vil selvfølgelig afhænge af en række faktorer, herunder 15 f.eks. menneskets eller pattedyrets alder og vægt, den givne tilstand, der kræver behandling, dens alvorlighed og administreringsvejen, og den vil i den sidste ende være den tjenestgørende læge eller dyrlæges valg. Det er imidlertid sandsynligt, at en effektiv mængde til lyse, 20 f.eks. af en coronararterie-thrombus i almindelighed vil være i området fra 150.000 til 450,000 IU/kg legemsvægt af patienten pr. time. Por et voksent menneske på 70 kg. vil en effektiv mængde således pr. time i almindelighed være fra 10.000.000 til 30.000.000 IU, især ca.

25 20.000.000 IU, og denne mængde kan administreres med eller uden en forbehandlingsdosis, der letter virkningen af t-PA. Det er også sandsynligt, at dosen vil være mindre for nogle thrombotiske lidelser, såsom dyb vene-thrombose og akut slagtilfælde, eller for blot at bevare 30 åbenheden af en coronararterie, hvori der allerede igen er blodgennemstrømning. I disse situationer vil en effektiv mængde i almindelighed være fra 7.000 til 36.000 IU/kg legemsvægt af patienten pr. time.

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de føl-35 gende eksempler.

DK 163173B

13

Eksempel 1

En klaret høst af t-PA opnået ud fra en dyrket transformeret CHO-cellelinie, som var opnået ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Molekular og Cellular 5 Biology, 1985,5(7), 1750-1759, blev renset chromatogra-fisk, og t-PA'et blev opsamlet som en vandig opløsning indeholdende 0,17M natriumcitrat og 0,01% (vægt/vol)

Tweeii^ 80 ved en pH-værdi på 5,5. Opløsningens pH-værdi blev indstillet til 3,0 med saltsyre, og den opnåede op-10 løsning blev opkoncentreret ved ultrafiltrering ved anvendelse af en H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England). Den koncentrerede vandige opløsning blev renset yderligere ved anbringelse på en gelfiltreringskolonne (Sephadej^ G-150; Pharmacia 15 Biotechnology, Uppsala, Sverige) og eluering med 0,85%'s saltopløsning indeholdende 0,01% (vægt/vol) Tweeri^ 80 ved en pH-værdi på 3,0. Der opnåedes således en i høj grad renset vandig opløsning af t-PA, som blev opkoncentreret en gang mere ved anvendelse af en kunstig nyre.

20 t-PA'en blev fældet ud af opløsningen ved forøgelse af pH-værdien til 5,5 med natriumhydroxid og opbevaring af suspensionen ved 4°C i 2 timer. t-PA'en blev udvundet ved centrifugering ved 4.000 x g i 30 minutter ved 4°C. t-PA-pillen blev genopløst i en vandig opløsning af na-25 triumchlorid (0,85% (vægt/vol)) indeholdende 0,1% (vægt/ vol)' Tweei^ 80 og indstillet til pH 3,0 med saltsyre. Volumenet af den anvendte saltopløsning var det der krævedes til opnåelse af en koncentration af t-PA på mellem 7.500.000 IU/ml og 10.000.000 IU/ml. t-PA opløsningen 30 blev fortyndet med yderligere vandig opløsning af natri-umchlorid (0,85% (vægt/vol)) indeholdende 0,1% (vægt/ vol) TweerP^ 80 og indstillet til pH 3,0 med saltsyre og med tilstrækkeligt af en opløsning af 10% (vægt/vol) mannitol i den samme sure saltopløsning til opnåelse af 35 endelige koncentrationer på 5.000.000 IU/ml t-PA og 25

DK 163173 B

14 mg/ml mannitol. Den opnåede opløsning blev steril-filtreret og fordelt i volumener på l ml i hætteglas, som blev frosset til -35°C. Et vakuum på 0,05 Torr blev påtrykt. Efter 24 timer blev temperaturen gradvist øget 5 til 5°C og holdt derpå i 16 timer. Den blev dernæst øget til 25 °C og trykket blev sænket til 0,02 Torr i yderligere 24 timer, hvorefter hætteglassene blev lukket under et partialt vakuum på 600 Torr af tør nitrogen.

10 Eksempel 2

Den thrombolytiske effektivitet af en parenteral opløsning opnået ud fra det lyofiliserede præparat af t-PA ifølge Eksempel 1 blev bedømt ved en in vivo model af halsvenethrombose.

15 (a) Fremgangsmåde.

Den fulgte fremgangsmåde var i det væsentlige den fremgangsmåde, der først er beskrevet af Collen et 20 al (J. Clin.Invest., 1983, 71, 368-376).

Det lyofiliserede præparat ifølge Eksempel 1 blev hurtigt og fuldstændigt opløst i sterilt isotonisk saltvand, indstillet til pH 3,0 og indeholdende 25 0,01% Tweei@ 80. Der tilvejebragtes herved en paren teral opløsning til en 2-timers infusion af 500.000 IU/kg af t-PA. Infusionen skete via en kanyle i den højre femorale vene. Fire New Zealand hvide kaniner blev anvendt ved denne undersøgelse. Efter infu-30 sionen bestemtes thrombolysegraden.

(b) Resultater:

Den procentvise thrombolyse var 28,9 ± 4,1, hvilket 35 således viser den thrombolytiske virkning af den parenterale opløsning opnået ud fra det lyofili-

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et lyofili-seret farmaceutisk præparat af vævs-plasminogenaktiva-tor, t-PA, kendetegnet ved, at den omfatter lyofilisering af en vandig opløsning af t-PA, hvori pH- 10 værdien er fra 2 til 5.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at koncentrationen af t-PA i den vandige opløsning er ca. 5.000.000 iu/ml.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l og 2, kende-15 tegnet ved, at den vandige opløsning har en pH- værdi på ca. 3,0.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til 3, k ende-tegnet ved, at den vandige opløsning indeholder et overfladeaktivt middel.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til 4, k ende- tegnet ved, at den vandige opløsning er i det væsentlige fri for puffer.

5 PATENTKRAV

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til 5, kendetegnet ved, at den vandige opløsning indeholder 25 natriumchlorid i en i det væsentlige isotonisk koncentration.