LU86444A1 - Nouvelle compostion d'activateur tissulaire du plasminogene - Google Patents

Description

* «i

Nouvelle composition d'activateur tissulaire du plasminogène.

;

La présente invention concerne l'activateur tissulaire du plasminogène et, en particulier, des compositions pharmaceutiques contenant l'activateur tissulaire du plasminogène, leur préparation et leur utilisation en médecine humaine et vétérinaire.

On admet qu'il existe un équilibre dynamique * *4 entre le système' enzymatique capable de former les caillots de sang, à savoir le système de coagulation, et le système enzymatique capable de dissoudre les caillots de sang, à savoir le système fibrinolytique, qui maintient la perméabilité du système vasculaire intact. Pour limiter la perte de sang après une blessure, des caillots de sang se forment dans les vaisseaux atteints. Après la guérison naturelle de la blessure, les caillots de sang superflus sont dissous sous l'effet du système fibrinolytique. A l'occasion, des caillots de sang se forment en l'absence de traumatisme et peuvent se loger dans des vaisseaux sanguins importants, conduisant à une interruption partielle ou même totale de l'écoulement du sang. Lorsqu'il en est ainsi dans le coeur, les poumons ou le cerveau, le résultat peut être un infarctus du myocarde, un embole pulmonaire ou une congestion cérébrale. Ces conditions associées constituent la cause principale de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés.

Les caillots de sang consistent en un réseau fibreux qui est capable d'être dissous par la plasmine qui est une enzyme protéolytique. Cette enzyme est issue de la proenzyme inactive ou plasminogène, qui est un constituant du plasma du sang, sous l'action d'un activateur du plasminogène. Il existe chez les mammifères deux activateurs du plasminogène qui sont immuno-logiquement distincts. L'activateur intrinsèque du plasminogène, dit aussi urokinase, est une enzyme produite par les reins et peut être isolée de l'urine. Elle peut s'obtenir aussi a partir de différentes cultures de tissu. L'activateur extrinsèque du plasminogène, dit aussi activateur vasculaire du plasminogène ou activateur tissulaire du plasminogène (t-PA), peut être isolé de nombreux produits d'homogénéisation de tissus (notamment l'utérus humain), de la paroi des

CD.YD.F - 2 - A747A

♦ ♦ cellules vasculaires et de certaines cultures de cellules. En plus de ces deux variétés d'activateur du plasminogène, il existe aussi un produit bactérien, à savoir la Streptokinase, obtenue à partir de streptocoques bêta-hémolytiques. Un inconvénient majeur de l'urokinase et de la Streptokinase est qu'elles sont actives dans toute la circulation et non uniquement au site d'un caillot de sang. Par exemple, elles peuvent détruire d'autres protéines du sang, comme le fibrinogène, la prothrombine, le facteur V et le facteur VIII, réduisant ainsi l'aptitude du sang à coaguler et augmentant donc le risque d'hémorragie. Au contraire, l'activité biologique du t-PA dépend de la présence de la fibrine à laquelle il se combine et où il est activé. Une activité maximale est donc acquise uniquement au site d'un caillot de sang, c'est-à-dire en présence du réseau de fibrine à dissoudre, ce qui affaiblit beaucoup le risque d'hémorragie.

La voie principale d'administration du t-PA est la perfusion intravasculaire, ce qui nécessite donc que le t-PA soit présent à l'état de solution parentérale. Dans le cas d'une protéine, il est préférable de présenter le principe actif au médecin ou au vétérinaire à l'état de composition pharmaceutique lyophilisée, parce que celle-ci offre, sur une composition liquide, de notables avantages de transport et de conservation. Il est cependant important qu'une telle composition lyophilisée soit facile à convertir en la solution parentérale souhaitée sans difficulté ni incommodité exagérées et que le médecin ou le vétérinaire soit à même d'obtenir la concentration requise en principe actif dans une situation donnée quelconque simplement en mélangeant la composition avec la quantité convenable de solvant. Par exemple, il n'est pas souhaitable d'administrer un grand volume de solution à

CD.YD.F - 3 - A747A

« *4 un patient atteint de troubles cardiaques ou rénaux, parce que le coeur ou les reins pourraient se trouver sollicités encore davantage. Le volume doit donc être maintenu au minimum dans de telles circonstances. Il est donc souhaitable qu'une solution parentérale puisse être obtenue non seulement à une concentration relativement faible, mais aussi à une concentration relativement élevée en principe actif.

Un certain nombre de compositions pharmaceutiques lyophilisées de t-PA ont déjà été décrites, par exemple dans les documents EP-A-113 319 et EP-A-123 304. Ces compositions sont préparées au départ de solutions aqueuses salines de t-PA, dont le pH est voisin de la neutralité et ont pour inconvénient que la solubilité du t-PA dans ces solutions est faible en l'absence d'augmentation de la concentration ionique. Par conséquent, les solutions parentérales obtenues au départ de ces compositions lyophilisées ont de faibles concentrations en t-PA, ce qui nécessite parfois d'administrer des volumes exagérément importants de solution à un patient, ou bien sont hypertoniques, ce qui peut nuire aux globules rouges lorsqu'elles sont administrées.

La Demanderesse a découvert à présent que la solubilité du t-PA dans une solution aqueuse peut être améliorée si le pH de la solution est situé dans le domaine acide, qu'une composition pharmaceutique lyophilisée peut être préparée à partir d'une solution acide de t-PA et que la composition est susceptible de donner une solution parentérale qui, à l'administration, ne suscite pas d'inconvénients physiologiques notables. L'invention a dès lors pour objet un procédé pour préparer une composition pharmaceutique lyophilisée de t-PA, suivant lequel on soumet à la dessiccation sous vide une solution aqueuse congelée de t-PA

CD.YD.F - 4 - A747A

t 44 dont le pH est de -2 à 5.

En conséquence de la meilleure solubilité du t-PA, il est possible de préparer conformément à la présente invention une composition pharmaceutique lyophilisée qui est capable de donner une solution parentérale ayant une concentration élevée en t-PA sans aucun risque sensible que le t-PA soit précipité hors de la solution· La composition lyophilisée peut donc être présentée au médecin ou au vétérinaire qui peuvent dissoudre la composition suivant les nécessités pour atteindre la concentration souhaitée en utilisant, par exemple, de l'eau dont le pH est à la neutralité ou dans le domaine acide. L'invention a donc pour objet une composition pharmaceutique lyophilisée stable qui offre une plus grande souplesse de manipulation et d'utilisation par les médecins et vértérinaires et qui, de plus, constitue un moyen plus commode de transport et de conservation.

Le t-PA à utiliser conformément à l'invention peut être toute protéine bioactive correspondant sensiblement à du t-PA de mammifère et spécialement du t-PA humain et comprend les formes avec et sans glycosylation. Il peut être du t-PA monocaténaire ou bicaté-naire ou un mélange de ceux-ci, comme décrit dans le document EP-A-112 122 et, dans le cas du t-PA humain complètement glocosylé, il a un poids moléculaire apparent sur gel de polyacrylamide d'environ 70.000 et un point isoélectrique entre 7,5 et 8,0. De préférence, le t-PA présente une activité spécifique d'environ 500.000 Ul/mg (Unités Internationales par mg), l'Unité Internationale étant une unité d'activité telle que définie par WHO, National Institute for Biological Standards and Control, Holly Hill, Hampstead, Londres, NW3 6RB, G.B.).

La séquence des aminoacides du t-PA correspond CD.YD.F - 5 - A747A

< i* de préférence sensiblement à celle indiquée à la Fig. 1. La séquence est donc identique à celle de la Fig. 1 comprend une ou plusieurs délétions, substitutions, insertions, inversions ou additions d'amino-acides d'origine allélique ou autre, la séquence résultante ayant au moins 80% et de préférence 90% d'homologie avec la séquence de la Fig. 1 et conservant sensiblement les propriétés biologiques et immunologiques de la protéine. En particulier, la séquence du t-PA est identique à celle de la Fig. 1 ou est la même séquence, mais dont 1'aminoacide à la 245ème position à partir de la N-terminaison de la sérine est la valine au lieu de la méthionine, l'une ou l'autre séquence étant éventuellement amputée de l'un quelconque des trois premiers aminoacides ou comprenant éventuellement une préséquence de Gly-Ala-Arg supplémentaire N-terminale du polypeptide.

La séquence des aminoacides indiquée à la Fig. 1 comprend trente-cinq restes de cystéine et est donc à même de former dix-sept ponts disulfure. Sur base de l'analogie avec d’autres protéines dont la structure a été déterminée plus dans le détail, la structure postulée pour la séquence (résultant de la formation des ponts disulfure) entre 1'aminoacide à la 90ème position et la C-terminaison de proline est indiquée à la Fig. 2. La structure de la région N-terminale est moins certaine, bien que diverses propositions aient été avancées (Progress in Fibrinolysis, 1983, 6, 269-273; et Proc. Natl. Acad. Sei., 1984, 81, 5355-5359). Les particularités les plus importantes de la structure du t-PA sont les deux régions en anneau (entre les 92ème et 173ème aminoacides et entre les 180ème et 261ème aminoacides), qui sont responsables de la liaison de la protéine sur la fibrine, et la région de sérine protéase qui comprend la majeure partie de la

CD.YD.F - 6 - A747A

chaîne B et qui -est responsable de l'activation du plasminogène. Les aminoacides d'une importance spéciale dans les sérine protéases sont la triade catalytique, His/Asp/Ser. Dans le t-PA, ceux-ci apparaissent aux 322ème, 37lème et 463ème positions. Le pont disulfure entre les restes de cystéine aux positions 264 et 395 est important aussi parce qu'il maintient les chaînes A et B assemblées dans la forme bicaténaire du t-PA.

Dans les Fig. 1 et 2, les codes conventionnels à une et trois lettres ont été utilisés pour les restes des aminoacides comme indiqué ci-après :

Asp D Acide aspartique Ile I Isoleucine

Thr T Thréonine Leu L Leucine

Ser S Sérine Tyr Y Tyrosine

Glu E Acide glutamique Phe F Phénylalanine

Pro P Proline His H Histidine

Gly G Glycine Lys K Lysine

Ala A Alanine Arg R Arginine

Cys C Cystéine Trp W Tryptophane

Val V Valine Gin Q Glutamine

Met M Méthionine Asn N Asparagine

Le t-PA peut être obtenu suivant l'un quelconque des procédés décrits ou déjà connus. Par exemple, il peut être obtenu au départ d ' une lignée de cellules normales ou néoplasiques du type décrit dans Biochimica et Biophysica Acta, 1970, 580, 140-153; EP-A-41 766 ou EP-A-113 319. Il est cependant préféré que le t-PA soit obtenu à partir d'une lignée de cellules transformées ou transfectées mises en culture, obtenue suivant la technique de l'ADN recombinant ainsi qu'il est décrit, par exemple dans EP-A-93 619; EP-A-117 059 ou EP-A-117 060. Il est particulièrement préféré d'utiliser pour la production du t-PA des cellules d'ovaire de hamster de Chine (cellules CHO) qui s'obtiennent de la façon décrite dans Molecular and

CD.YD.F - 7 - A747A

« J*

Cellular Biology, -1985 5(7), 1750-1759. De cette façon, le gène cloné est cotransfecté avec le gène codant pour la dihydrofolate réductase (dhfr) dans des cellules CHO dhfr"·. Les transformants exprimant dhfr sont sélectionnés sur des milieux exempts de nucléosides et sont exposés à des concentrations croissantes de méthotrexate. Les gènes dhfr et t-PA sont ainsi coamplifiés et conduisent à une lignée cellulaire stable capable d'exprimer des teneurs élevées de t-PA.

Le t-PA est de préférence purifié suivant l'un quelconque des modes opératoires décrits ou déjà connus tels que ceux décrits dans Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J. Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; Ibid,, 1981, 256(13), 7035-7041; Eur. J.

Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41 766; EP-A-113 319 ou GB-A-2 122 219.

Il ne semble pas exister de limite supérieure à la solubilité du t-PA dans la solution aqueuse à utiliser dans le procédé de la présente invention. Aux concentrations fort élevées, par exemple supérieures à 150.000.000 UI par ml (Unités Internationales par ml), la solution devient simplement visqueuse sans aucune précipitation notable du t-PA. La concentration du t-PA dans la solution parentérale peut donc varier dans de larges limites, par exemple de 50.000 à 50.000.000 UI par ml. Pour tirer l'avantage maximal de la présente invention, il est préféré que la concentration du t-PA soit supérieure à 100.000 UI par ml, plus spécialement supérieure à 500.000 UI par ml et, en particulier, supérieure à 1.0000.000 UI par ml. Il est le plus particulièrement préféré que la concentration du t-PA soit d'environ 5.000.000 UI par ml.

La limite supérieure du pH de la solution parentérale est de préférence de 4,5. En fait, le pH se situe de préférence dans l'intervalle de 2,5 à 4,0 et

CD.YD.F - 8 - A747A

plus avantageusement de 2,8 à 3,5 et est le plus avantageusement d'environ 3,0. Le pH souhaité de la solution parentérale est avantageusement établi au moyen d'un acide inorganique ou organique physiologiquement acceptable. Des exemples pour un tel acide sont notamment l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et l'acide nitrique, outre l'acide citrique, l'acide tartrique et l'acide benzènesulfonique. Parmi ces composés, l'acide chlorhydrique est préféré.

Bien que l'un ou l'autre cosolvant physiologiquement acceptable puisse éventuellement être présent en plus de l'eau, il est préféré que le milieu pour la solution parentérale soit entièrement ou sensiblement aqueux.

La solution parentérale obtenue à partir de la composition pharmaceutique lyophilisée peut être hypertonique, hypotonique ou isotonique par rapport au sérum du sang du patient. Toutefois, pour éviter des effets secondaires indésirables, la solution parentérale est de préférence isotonique, bien que de faibles écarts ne soient pas de grande importance physiologique. Une solution parentérale sensiblement isotonique peut être obtenue par addition d1 un agent physiologiquement acceptable qui est capable d'amener la pression osmotique de la solution à la valeur souhaitée. L'agent peut être compris dans la solution aqueuse qui sera lyophilisée de façon à être déjà présent dans la composition pharmaceutique lyophilisée ou bien il peut être compris dans l'eau dont le pH est à la neutralité ou dans le domaine acide qui est utilisée pour dissoudre la composition afin d'obtenir la solution parentérale souhaitée. Des exemples d'un tel agent sont bien connus et sont notamment le dextrose (sous forme anhydride ou monohydratée) et le chlorure de sodium, outre leurs mélanges. La concentra-

CD.YD.P - 9 - A747A

tion de l'agent dans la solution aqueuse ou dans l'eau pour la dissolution varie évidemment d'un agent à l'autre. Dans le cas du chlorure de sodium, la concentration est de préférence de 7 à 10 mg par ml et plus avantageusement d'environ 8,5 mg par ml, qui est celle ' de la solution physiologique salée ou simplement solution physiologique souvent mentionnée. Dans le cas du dextrose anhydre, la concentration est de préférence de 30 à 70 mg par ml et plus avantageusement d'environ 50 mg par ml.

La solution aqueuse peut facultativement contenir des additifs normalement associés aux compositions pharmaceutiques lyophilisées de ce genre. Des exemples en sont 1 ' albumine du sérum humain, de même que des liants et des excipients tels que le mannitol, le lactose et le glucose. De plus, le t-PA a tendance s'absorber sur les surfaces de verre et de matière plastique et il est dès lors souhaitable d'ajouter à la solution aqueuse un agent surfactif pour prévenir ou réduire au minimum cette absorption. Des exemples d'un tel agent sont notamment les dérivés polyoxyéthyléni-ques des esters partiels d'acides gras avec des anhydrides de sorbitol, comme ceux commercialisés sous la marque déposée "Tween 80".

L'un des avantages surprenants de la présente invention, en dehors de la solubilité sensiblement accrue du t-PA, est que l'utilisation d'une solution parentérale acide obtenue par redissolution de la composition pharmaceutique lyophilisée ne semble exercer aucun effet physiologique défavorable notable lors de l'administration au patient. Il semblerait que le sang en circulation soit de façon générale à même d'élever le pH de la solution jusqu'à la neutralité à peu près dès que le contact se fait, le t-PA étant réparti rapidement dans le sang qui circule. Il est

CD.YD.F - 10 - A747A

cependant préféré -qae ce processus ne soit pas sensiblement entravé de l'une ou l'autre façon et que la solution parentérale et dès lors la solution aqueuse qui doit être lyophilisée et l'eau pour la redissolution ne contiennent pas d'agent tampon puissant. Un agent tampon faible qui n'inhibe pas sensiblement le processus peut cependant être incorporé et, en effet, à un pH du domaine acide, le t-PA intervient comme s'il était son propre agent tampon. De plus, l'albumine du sérum humain est à même d'agir comme agent tampon faible.

En raison de la solubilité sensiblement accrue du t-PA dans une solution aqueuse dont le pH est de 2 à 5, il n'est pas nécessaire d'incorporer à la solution parentérale obtenue par dissolution de la composition lyophilisée un constituant supplémentaire quelconque, comme la lysine ou l'ornithine ou un bien un sel de celles-ci pour augmenter la solubilité du t-PA.

La solution aqueuse de t-PA peut être préparée en partant d'une solution de t-PA purifiée et en échangeant le milieu contre un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5, ou bien en dissolvant du t-PA purifié dans un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5.

La purification du t-PA peut comprendre au stade final l'élution de la protéine hors d'une colonne chromatographique à l'état de solution contenant un agent tampon puissant. Comme déjà indiqué, il est préféré que la solution parentérale et dès lors la composition pharmaceutique lyophilisée et la solution aqueuse ne contiennent pas d'agent tampon puissant et par conséquent un moyen commode pour assurer son élimination pendant l'échange du milieu est de recourir à la dialyse. Celle-ci peut être exécutée dans un tube à dialyse ou un rein artificiel dans lequel la solution purifiée est dialysée contre un milieu aqueux dont le

CD.YD.F - 11 - A747A

pH est de 2 à 5. Il peut être souhaitable, spécialement si la concentration du t-PA dans la solution purifiée est élevée, d'ajuster d'abord le pH de la solution de façon qu'il soit de 2 à 5. Un autre moyen pour assurer l'élimination d'un agent tampon puissant pendant l'échange du milieu est de soumettre la solution purifiée à une filtration sur gel et de développer la colonne à l'aide d'un milieu aqueux dont le pH est de 2 à 5.

Le t-PA sous la forme d'un solide précipité peut être obtenu, par préférence, à partir d'une solution purifiée en ajustant le pH à environ 5,5, en refroidissant la solution jusque juste au-dessus de son point de congélation et en récoltant la protéine, par exemple, par centrifugation. Le solide précipité peut être ensuite dissous de façon classique dans un milieu aqueux ayant un pH de 2 à 5.

Il est préféré que la solution aqueuse résultante soit stérilisée de façon classique, par exemple par passage au filtre stérilisant, et qu'elle soit ensuite conditionnée dans des récipients stériles en matière plastique ou en verre, comme des ampoules ou des fioles, en volumes s'échelonnant, par exemple, de 0,5 à 20 ml.

La solution aqueuse de t-PA est congelée, de préférence, à une température de -10 à -40 °C. La solution aqueuse congelée est ensuite, de préférence, maintenue à cette température jusqu'au début de la dessiccation sous vide.

La dessiccation sous vide de la solution aqueuse stérile peut être exécutée de façon classique et comprend la dessiccation sous vide partiel ou complet, par exemple de 0,01 à 0,1 torr, pendant une durée suffisante pour éliminer sensiblement tout le liquide congelé.

CD.YD.F - 12 - A747A

La température à laquelle la dessiccation sous vide est exécutée est habituellement de -30 à -40 °C au début de l’opération de façon à maintenir la solution aqueuse à l'état sensiblement ou complètement congelé. A mesure que l’opération avance et que de l'eau est ’ éliminée/ la température peut être augmentée graduelle ment jusqu'à rejoindre la température ambiante. Il est préféré, au terme de l’opération, d'exécuter la dessiccation sous vide à la température ambiante ou juste au-dessus sous un vide sensible qui ést d'environ 0,01 torr afin d'éliminer autant que possible les dernières traces d'eau. La teneur en humidité et de la composition pharmaceutique lyophilisée résultante est de préférence inférieure à 2,5%. Lorsque la dessiccation sous vide a été achevée, le récipient stérile en matière plastique ou en verre contenant la composition pharmaceutique lyophilisée est avantageusement scellé.

Pendant la dessiccation sous vide de la solution aqueuse congelée, l'eau est chassée et laisse subsister le t-PA sous la forme d'un sel physiologiquement acceptable. La présente invention a dès lors aussi pour objet un sel physiologiquement acceptable, spécialement un sel d'addition d'acide physiologiquement acceptable, comme le chlorhydrate, du t-PA.

L'application de la présente invention permet pour la première fois d'obtenir une composition pharmaceutique lyophilisée qui est capable de donner une solution parentérale ayant une concentration élevée en t-PA. La présente invention a donc aussi pour objet une composition pharmaceutique lyophilisée de t-PA qui, par dissolution dans l'eau, est capable d'avoir une concentration en t-PA de plus de 100.000 UI par ml, plus spécialement de plus de 500.000 UI par ml et le plus spécialement de plus de 1.000.000 UI par ml.

Pour préparer une solution parentérale de t-PA

CD.YD.F - 13 - A747A

* fr en vue de l'administration, la composition pharmaceutique lyophilisée obtenue par le procédé de la présente invention est dissoute dans de l'eau dont le pH est à la neutralité ou dans le domaine acide. Si la solution aqueuse à partir de laquelle la composition pharmaceutique lyophilisée est obtenue est sensiblement isotonique, il est préféré que l'eau pour la reconstitution soit aussi sensiblement isotonique.

L'activité biologique du t-PA pour dissoudre le réseau de fibrine des caillots de sang s'est traduite par son utilité dans le traitement des troubles thrombotiques (The Lancet, 7 novembre 1981, 1018-1020; ibid., 13 avril 1985, 842-847; The New England Journal of Medecine, 1984, 310(10), 609-613; et ibid., 1985 312(14), 932-936). La présente invention a dès lors pour objet un procédé pour le traitement d'un trouble thrombotique chez un mammifère, qui comprend l'administration d'une solution parentérale de t-PA obtenue à partir d'une composition pharmaceutique lyophilisée comme défini ici. En variante, elle a aussi pour objet une composition pharmaceutique lyophilisée de t-PA comme défini ici à 1 ' usage de la médecine humaine ou vétérinaire, spécialement pour le traitement d'un trouble thrombotique.

Des exemples particuliers de troubles thrombotiques sont bien connus et sont notamment l'infarctus du myocarde, la thrombose veineuse profonde, l'embole pulmonaire et la congestion cérébrale.

La voie principale d'administration du t-PA est la perfusion intravasculaire, spécialement intraveineuse, mais il est concevable de recourir à d'autres voies d'administration, comme l'administration intramusculaire. Les perfusions intravasculaires sont normalement exécutées au moyen de la solution parentérale contenue dans un flacon ou une poche pour

CD.YD.F - 14 - A747A

4 *» perfusion ou dans' une seringue pour perfusion à fonctionnement électrique. La solution peut être injectée du flacon ou de la poche pour perfusion au patient, soit par gravité, soit au moyen d'une pompe de perfusion. Les systèmes de perfusion à alimentation par gravité n'offrent pas une maîtrise suffisante sur le débit d'administration de la solution parentérale et le recours à une pompe de perfusion est dès lors préféré, spécialement avec les solutions ayant des concentrations relativement élevées en t-PA. Il est toutefois davantage préféré d'utiliser une seringue pour perfusion à fonctionnement électrique qui permet une maîtrise encore plus précise du débit d'administration.

Une quantité efficace de t-PA pour le traitement d'un mammifère atteint d'un trouble thrombotique dépend évidemment d'un certain nombre de facteurs notamment, par exemple, l'âge et le poids du mammifère, l’affection précise nécessitant le traitement et sa gravité, outre la voie d'administration et est laissée en dernier recours à 11 appréciation du médecin ou du vétérinaire. Il est cependant probable qu'une quantité efficace pour la dissolution d'un thrombus dans une artère coronaire, par exemple, se situera dans l'intervalle de 150.000 à 450.000 UI par kg de poids du corps du patient et par heure. Ainsi, chez l'être humain adulte d'un poids de 70 kg, une quantité horaire efficace sera, dans le cas général, de 10.000.000 à 30.000.000 UI, et spécialement d'environ 20.000.000 UI, cette quantité pouvant être administrée avec ou sans dose d'attaque. Il est probable aussi que la dose sera inférieure pour certains états thrombotiques, comme la thrombose veineuse profonde ou la thrombose cérébrale aiguë, ou simplement pour l'entretien de la perméabilité d'une artère coronaire déjà reperfusée. Dans de tels cas, une quantité efficace sera généralement de

CD.YD.F - 15 - A747A

7.000 à 36.000 UI' par kg de poids du corps du patient et par heure.

Les exemples ci-après illustrent l'invention et ne sont nullement à concevoir comme la limitant. EXEMPLE 1,- * On purifie par chromatographie une récolte clarifiée de t-PA, obtenue au départ d1 une lignée de cellules CHO transformées mises en culture qu'on a préparée suivant le mode opératoire de Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759, et on recueille le t-PA sous la forme d'une solution aqueuse contenant du citrate de sodium 0,17 M et 0,01% (p/v) de Tween 80 à un pH de 5,5. On ajuste le pH de la solution à 3,0 au moyen d'acide chlorhydrique et on concentre la solution résultante par ultrafiltration sur une cartouche H-10 (Amicon Ltd, Upper Mill, Stonehouse,

Gloucestershire, Angleterre). On purifie davantage la solution aqueuse concentrée en l'appliquant sur une colonne de filtration sur gel (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Suède) qu'on élue avec de la solution physiologique salée à 0,85% contenant 0,01% (p/v) de Tween 80 à un pH de 3,0. On obtient ainsi une solution aqueuse hautement purifiée de t-PA qu'on concentre une fois encore à l'aide d'un rein artificiel jetable. On précipite le t-PA hors de la solution en élevant le pH jusqu'à 5,5 au moyen d'hydroxyde de sodium et en maintenant la suspension à 4°C pendant 2 heures. On recueille t-PA par centrifugation à 4000 g pendant 30 minutes à 4°C. On redissout le culot de t-PA dans une solution aqueuse de chlorure de sodium (à 0,85% (p/v)) contenant 0,01% (p/v) de Tween 80 et ajustée à pH 3,0 au moyen d'acide chlorhydrique. Le volume de solution physiologique utilisé est celui nécessaire pour établir une concentration en t-PA entre 7.500.000 et 10.000.000 UI par ml. On dilue cette

CD.YD.F - 16 - A747A

• 4 * solution de t-PA avec un supplément de solution aqueuse de chlorure de sodium (à 0/85% (p/v)) contenant 0/01% (p/v) de Tween 80 et ajustée à pH 3,0 au moyen d'acide chlorhydrique et aussi avec suffisamment de solution à 10% (p/v) de mannitol dans la même solution physiolo-* gique salée acide pour arriver à des concentrations finales de 5.000.000 UI par ml de t-PA et 25 mg par ml de mannitol. On stérilise la solution résultante par filtration et on la conditionne en volumes de 1 ml dans des fioles en verre qu'on congèle à -35°C. On établit un vide de 0,05 torr. Après environ 24 heures, on élève la température graduellement jusqu'à 5°C et on la maintient à cette valeur pendant 16 heures. On l'augmente ensuite à nouveau jusqu'à 25eC et on pousse le vide jusqu'à 0,02 torr pour encore 24 heures au terme desquelles on scelle les fioles sous un vide partiel de 600 torrs d'azote sec.

EXEMPLE 2.-

On évalue l'efficacité thrombolytique d'une solution parentérale obtenue à partir de la composition lyophilisée de t-PA de l'exemple 1 sur un modèle in vivo de thrombose à la veine jugulaire.

(a) Mode opératoire.

Le mode opératoire expérimental est essentiellement celui décrit par Collen et collaborateurs (J. Clin. Invest., 1983, 71, 368-376).

On dissout rapidement et complètement la composition lyophilisée de l'exemple 1 dans de la solution salée isotonique stérile ajustée à pH 3,0 contenant 0,01% de Tween 80. On obtient ainsi une solution parentérale pour une perfusion de 2 heures à 500.000 UI par kg de t-PA. On effectue la perfusion au moyen d'une canule dans la veine fémorale droite. On utilise pour cette étude quatre lapins blancs de Nouvelle Zélande. On évalue le degré de thrombolyse

CD.YD.F - 17 - A747A

» λ' après la perfusion.

(b) Résultats.

Le pourcentage de thrombolyse est de 29,9 + 4,1, ce qui démontre l’efficacité thrombolytique de la solution parentérale préparée à partir de la composition lyophilisée de l’exemple 1. De plus, on n'observe lors de la perfusion de cette solution aucune réaction défavorable.

CD.YD.F - 18 - A747A

Claims (30)

1. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique lyophilisée de t-PA, caractérisé en ce qu'on soumet à la dessiccation sous vide une solution aqueuse congelée de t-PA dont le pH est de 2 à 5.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que t-PA est de la forme monocaténaire ou bien de la forme bicaténaire.

3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le t-PA a la séquence des amino-acides indiquée à la Fig. 1 ou a la même séquence des aminoacides, mais dont l'aminoacide à la position 245 à partir de l'extrémité N-terminale de la sérine est la valine au lieu de la méthionine, l'une ou l'autre séquence étant éventuellement exempte de l'un quelconque des trois premiers aminoacides ou comprenant éventuellement une préséquence de Gly-Ala-Arg supplémentaire N-terminale du polypeptide.

4. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le t-PA est obtenu à partir d'une lignée de cellules transfectées ou transformées mises en culture obtenue suivant la technique de l'ADN recombinant.

5. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration du t-PA dans la solution aqueuse est supérieure à 100.000 UI par ml.

6. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration du t-PA est supérieure 500.000 UI par ml.

7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la concentration du t-PA est CD.YD.F - 19 - A747A ' * • \ \ i supérieure à l.OOCf.OOO UI par ml.

8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que la concentration du t-PA est d'environ 5.000.000 UI par ml.

9. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le pH de la solution aqueuse est de 2 à 4,5.

10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce le pH est de 2,5 à 4,0.

11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce que le pH est de 2,8 à 3,5.

12. Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que le pH est d'environ 3,0.

13. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu est entièrement ou sensiblement aqueux.

14. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le milieu pour la solution aqueuse comprend un agent physiologiquement acceptable qui rend la solution sensiblement isotonique par rapport au sérum du sang humain.

15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que l'agent physiologiquement acceptable est le chlorure de sodium.

16. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que l'agent physiologiquement acceptable est le dextrose.

17. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution aqueuse comprend un agent surfactif.

18. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution aqueuse est sensiblement non tamponnée.

19. Procédé suivant l’une quelconque des CD.YD.F - 20 - A747A revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution aqueuse est sensiblement exempte de lysine ou d'ornithine ou d'un sel de celles-ci.

20. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution aqueuse est stérilisée.

21. Composition pharmaceutique lyophilisée obtenue par le procédé suivant 1'une quelconque des revendications précédentes.

22. Composition pharmaceutique lyophilisée de t-PA qui, par dissolution dans de l'eau, est capable d'avoir une concentration en t-PA supérieure à 100.000 UI par ml.

23. Composition pharmaceutique lyophilisée suivant la revendication 22, caractérisée en ce que la concentration est supérieure à 500.000 UI par ml.

24. Composition pharmaceutique lyophilisée suivant la revendication 23, caractérisée en ce que la concentration est supérieure à 1.000.000 UI par ml.

25. Récipient scellé d'une composition pharmaceutique lyophilisée telle que définie dans l'une quelconque des revendications 21 à 24.

26. Sel physiologiquement acceptable du t-PA

27. Sel d'addition d'acide physiologiquement acceptable du t-PA.

28. Chlorhydrate du t-PA.

29. Procédé de traitement d'un trouble thrombotique chez un mammifère, caractérisé en ce qu'on administre au mammifère une solution parentérale de t-PA obtenue à partir d'une composition pharmaceutique lyophilisée telle que définie dans l'une quelconque des revendications 21 à 24.

30. Composition pharmaceutique lyophilisée telle que définie dans l'une quelconque des revendications 21 à 24, à l'usage de la médecine humiane ou CD.YD.F - 21 - A747A * vétérinaire, spécialement pour le traitement d'un trouble thrombotique. w · CD.YD.F - 22 - A747A