JPH0759517B2 - 組織プラスミノーゲン活性化因子含有医薬組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は組織プラスミノーゲン活
性化因子、特に組織プラスミノーゲン活性化因子を含有
する医薬組成物、それらの製造およびそれらのヒトおよ
び動物医療における使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】血塊を形成できる酵素系−凝血系−と血
塊を溶解できる酵素系、フィブリン溶解系との間の健全
な開放状血管床を維持している動的均衡があるものと考
えられている。損傷からの失血を制限するために、損傷
した血管には血塊が形成される。損傷が自然に回復され
た後に、余分の血塊はフィブリン溶解系の作動により溶
解される。時には、血塊が外傷をともなうことなく形成
され、これは主要血管にとどまることがあり、血流を部
分的にまたは全体的にさえも閉塞する結果をもたらす。
これが心臓、肺または脳で生じると、心筋梗塞、肺塞栓
症または卒中を発症させることがある。これらの組合せ
症状は工業国における罹病率および死亡率の主要因であ
る。

【０００３】血塊はタンパク分解酵素プラスミンにより
溶解されうる繊維網状構造よりなる。この酵素は不活性
なプロ酵素プラスミノーゲン（これは血漿の成分であ
る）からプラスミノーゲン活性化因子の作用により誘導
される。２種の免疫学的に異なる哺乳動物プラスミノー
ゲン活性化因子が存在する。ウロキナーゼとしても知ら
れている内在性プラスミノーゲン活性化因子は腎臓によ
り産生される酵素であり、尿から単離できる。これはま
た多くの組織培養源からも生成できる。血管プラスミノ
ーゲン活性化因子としておよび組織プラスミノーゲン活
性化因子（ｔ−ＰＡ）としても知られている外在性プラ
スミノーゲン活性化因子はかなりの組織ホモジネート
（特にヒト子宮）、血管細胞壁およびいくつかの細胞培
養物から単離できる。これらの２種のプラスミノーゲン
活性化因子に加えて、ベーター−血液溶解性ストレプト
コッシ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）から生成される細
菌生成物、ストレプトキナーゼがある。ウロキナーゼお
よびストレプトキナーゼの両方が付随する主要な欠点は
これらが循環器系全体に活性であり、血塊の部位でだけ
活性ではないことにある。これらは、たとえばフィブリ
ノーゲン、プロトロンビン、ファクターＶおよびファク
ターIII のようなその他の血液タンパクを破壊し、かく
して血塊形成能力を減じおよび出血の危険を増大させ
る。これに対して、ｔ−ＰＡの生物学的活性はｔ−ＰＡ
が結合しており、これを活性化させるフィブリンの存在
に依存する。かくして、最大活性が血塊の場所、すなわ
ち溶解しようとするフィブリン網状構造の存在する場所
でだけ生じ、これは出血の危険を格別に回避させる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ｔ−ＰＡ投与の主要経
路は血管内注入であり、従って非経口投与用溶液として
ｔ−ＰＡの製剤が要求される。タンパク質の場合に、医
師または獣医師に薬品を凍結乾燥医薬組成物として提供
することが好ましい。これは液体製剤にまさるその有意
の移送および貯蔵長所によるものである。しかしなが
ら、いづれのこのような凍結乾燥製剤も不当に不便で困
難な問題を付随することなく所望の非経口投与用溶液に
容易に変換でき、および医師または獣医師がこの製剤を
適量の溶剤中で再構成することにより単純にいづれか指
定の状況に要求される濃度を得ることができることが重
要である。たとえば、心臓または腎臓の障害を有する患
者に大量の溶液を投与することは、患者の心臓または腎
臓により大きいことさえあるストレスを与えることから
望ましくない。従って、投与容量はこのような状況で最
低に維持されるべきである。従って、非経腸投与用溶液
は比較的低濃度であるばかりでなく、また高い薬物濃度
を有するものとして得ることができることが望ましい。

【０００５】ｔ−ＰＡの多くの凍結乾燥医薬製剤が従来
技術で、たとえばＥＰ−Ａ−１１３３１９およびＥＰ−
Ａ−１２３３０４に開示されている。これらの製剤はそ
のpHがほぼ中性であるｔ−ＰＡの水性塩類溶液から製造
され、このような溶液中におけるｔ−ＰＡの溶解度はイ
オン性濃度を増加しないと低いという欠点を有する。従
って、このような凍結乾燥製剤から得られる非経腸投与
用溶液は或る状況では望ましくない大量の溶液を患者に
投与する必要があるほど低い濃度でｔ−ＰＡを含有して
いるか、または高張性であって、投与すると赤血球に対
して有害であることがあるかのいづれかである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ここに、ｔ−ＰＡの水
溶液中における溶解度が、溶液のpHを酸性範囲内にする
と改善できること、凍結乾燥医薬製剤をｔ−ＰＡの酸性
溶液から製造できること、およびこの製剤が投与した場
合に有意の生理学的問題を示さない非経腸投与用溶液を
提供できることが見い出された。従って、本発明はｔ−
ＰＡの凍結乾燥医薬製剤を製造する方法を提供し、この
方法はpHが２〜５であるｔ−ＰＡの冷凍水溶液を乾燥さ
せることよりなる方法である。ｔ−ＰＡの改善された溶
解度の結果として、ｔ−ＰＡが溶液から沈殿析出するい
づれかの実質的な危険を付随することなく、高濃度でｔ
−ＰＡを含有する非経腸投与用溶液を提供できる凍結乾
燥医薬製剤が本発明に従い製造できる。従って、本発明
により必要な時および必要な場合に、製剤をたとえば中
性または酸性pHの水を使用して所望の濃度に溶解できる
医師または獣医師に凍結乾燥製剤を提供できる。すなわ
ち、本発明はその取り扱いが極めて柔軟であって、医師
および獣医師により使用できる安定な凍結乾燥医薬製剤
を提供するとともに、移送および貯蔵がさらに簡便な手
段を提供する。

【０００７】本発明で使用するｔ−ＰＡは哺乳動物に実
質的に対応するいづれかの生物活性タンパク質、特にヒ
トｔ−ＰＡであることができ、グリコシル化している形
およびグリコシル化していない形のものを包含する。こ
れはＥＰ−Ａ−１１２１２２に記載されているような１
鎖形または２鎖形ｔ−ＰＡであることができ、充分にグ
リコシル化しているヒトｔ−ＰＡの場合に、約７０，０
００のポリアクリルアミドゲルにもとづく見掛け上の分
子量および７．５〜８．０の等電点を有する。好ましく
は、ｔ−ＰＡは約５００，０００ＩＵ／mgの比活性を有
する〔ＩＵ．／mg＝国際単位／mg；国際単位はＷＨＯ、
ナショナル インスチチュート フォアバイオロジカル
スタンダード アンド コントロール（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏ
ｌ）、ホーリイ ヒル、ハムプステッド、ロンドン（Ｈ
ｏｌｌｙ Ｈｉｌｌ、Ｈａｍｐｓｔｅａｄ、Ｌｏｎｄｏ
ｎ）ＮＷ３ ６ＲＢ、英国により規定されているとおり
の活性単位である〕。

【０００８】ｔ−ＰＡのアミノ酸配列は好ましくは図１
に記載の配列に実質的に相当する。すなわち、この配列
は図１の配列と同一であるか、または対立形質源あるい
はその他の一種または二種以上のアミノ酸の欠落、置き
換え、挿入、転位または付加を含み、生成する配列は図
１の配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％の相同
性を有し、このタンパクの同一の生物学的および免疫学
的性質を基本的に保有している。特に、ｔ−ＰＡ配列は
図１の配列と同一であるか、あるいはセリンＮ−末端か
ら２４５番目の位置にメチオニンの代りにバリンを有す
る以外は同一配列を有し、これらどちらの配列も場合に
より、最初の３個のアミノ酸のいづれかが存在していな
いか、または場合によりＧｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇの追加
のポリペプチドＮ−末端先行配列を有する。

【０００９】図１に示されているアミノ酸配列は３５の
システイン残基を有し、従って１７のジスルフィド橋を
形成する能力を有する。構造がさらに詳細に決定されて
いるその他のタンパクとの同族性にもとづき、９０番目
の位置のアミノ酸とプロリンＣ−末端との間の配列につ
いての過程構造が図２に示されている。図２において、
＊印は２鎖形ｔ−ＰＡを与える１鎖形ｔ−ＰＡの開裂部
位を示す；ここでＡ鎖は２つの環状（ｋｒｉｎｇｌｅ）
領域を含み、そしてＢ鎖はセリンプロテアーゼ領域を含
有する。このＮ−末端領域の構造は限定していないが、
いくつかの提案が提示されている〔プログレス イン
フィブリノリシス（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎ Ｆｉｂｒｉ
ｎｏｌｙｓｉｓ）、１９８３年、６、２６９〜２７３
頁；およびプロク．ナトル．アカド．サイ．（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）１９８４年、８
１、５３５５〜５３５９頁参照〕。ｔ−ＰＡの構造の最
も重要な特徴はこのタンパクをフィブリンに結合する役
目をはたしている２つの環状部分（９２番目のアミノ酸
と１７３番目のアミノ酸の間および１８０番目のアミノ
酸と２６１番目のアミノ酸との間）およびＢ鎖の主要領
域を含むことおよび、プラスミノーゲンの活性化の役目
をはたすセリンプロテアーゼ領域にある。セリンプロテ
アーゼ領域における特別に重要なアミノ酸は触媒的三ツ
組アミノ酸、Ｈｉｓ／Ａｓｐ／Ｓｅｒである。ｔ−ＰＡ
においては、これらは３２２番目、３７１番目および４
６３番目に位置している。２６４番目および３９５番目
のシステインアミノ酸残基もまた重要であり、これらは
ｔ−ＰＡの２つの鎖形のＡ鎖とＢ鎖とを一緒に保持して
いる。

【００１０】図１および図２において、アミノ酸残基に
ついて下記のとおりの慣用の１字記号および３字記号を
使用した： Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸 Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン Ｔｈｒ Ｔ スレオニン Ｌｅｕ Ｌ ロイシン Ｓｅｒ Ｓ セリン Ｔｙｒ Ｙ チロシン Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸 Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン Ｐｒｏ Ｐ プロリン Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン Ｇｌｙ Ｇ グリシン Ｌｙｓ Ｋ リジン Ａｌａ Ａ アラニン Ａｒｇ Ｒ アルギニン Ｃｙｓ Ｃ システイン Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン Ｖａｌ Ｖ バリン Ｇｌｎ Ｑ グルタミン Ｍｅｔ Ｍ メチオニン Ａｓｎ Ｎ アスパラギン

【００１１】ｔ−ＰＡは当技術で既知のまたは開示され
ている製造方法のいづれかにより得ることができる。一
例として、ｔ−ＰＡはバイオキミカ エ バイオフィシ
カアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａ Ａｃｔａ）、１９７９年、５８０、１４０〜
１５３；ＥＰ−Ａ−４１ ７６６またはＥＰ−Ａ−１１
３ ３１９に記載されている種類の正常または腫瘍セル
ラインから得ることができる。しかしながら、ｔ−ＰＡ
は、たとえばＥＰ−Ａ−９３ ６１９；ＥＰ−Ａ−１１
７ ０５９またはＥＰ−Ａ−１１７ ０６０に記載され
ているようなＤＮＡ組換え技法を用いて誘導される培養
した形質転換またはトランスフェクションされたセルラ
インから得ると好ましい。ｔ−ＰＡの製造にチャイニー
ズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用し、モレキュラ
ー アンド セルラー バイオロジィ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、
１９８５年５（７）、１７５０〜１７５９頁に記載の方
法で誘導すると特に好ましい。この方法で、クローン化
された遺伝子がジヒドロフォレートレダクターゼ（ｄｈ
ｆｒ）をｄｈｆｒ^- ＣＨＯ細胞にコードする遺伝子によ
りコトランスフェクションされる。形質転換体を発現す
るｄｈｆｒはヌクレオシド不含培地で選択され、増加す
る濃度のメトトレキセートにさらされる。かくして、ｄ
ｈｆｒおよびｔ−ＰＡ遺伝子は共に増幅されて、高レベ
ルのｔ−ＰＡを発現することができる安定なセルライン
を導く。

【００１２】ｔ−ＰＡは好ましくは、下記の文献に記載
されているような当技術で既知のまたは開示されている
方法のいづれかを用いて精製する：バイオケミカ エ
バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）、１９７９年、５
８０、１４０〜１５３頁；ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリイ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、
１９７９年、２５４（６）、１９９８〜２００３頁；
同、１９８１年、２５６（１３）、７０３５〜７０４１
頁；ヨーロッパ ジャーナル オブ バイオケミストリ
ィ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９８３年、１
３２、６８１〜６８６頁；ＥＰ−Ａ−４１７６６；ＥＰ
−Ａ−１１３ ３１９；またはＧＢ−Ａ−２ １２２
２１９。

【００１３】本発明の方法で使用するｔ−ＰＡの水溶液
中における溶解度にはいづれかの上限が存在するように
はみえない。１５０，０００，０００ＩＵ／ml（国際単
位／ml）より大きいような極めて高い濃度でも、溶液は
いづれの有意のｔ−ＰＡ沈殿をともなうことなく単に粘
性になるだけである。従って、水溶液中におけるｔ−Ｐ
Ａの濃度は広い限界内、たとえば５０，０００〜５０，
０００，０００ＩＵ／mlで変えることができる。本発明
から最高の利益を確保するためには、ｔ−ＰＡの濃度は
１００，０００ＩＵ／mlより大、さらに特に５００，０
００ＩＵ／mlより大、さらに特に１，０００，０００Ｉ
Ｕ／mlより大である。ｔ−ＰＡの濃度が約５，０００，
０００ＩＵ／mlであると最高に好ましい。

【００１４】水溶液のpHの上限は好ましくは４．５であ
る。実際に、このpHは好ましくは２．５〜４．０の範
囲、さらに好ましくは２．８〜３．５の範囲、さらに特
に好ましくは約３．０である。水溶液の所望のpHは生理
学的に許容されうる無機または有機酸を用いて得ると簡
便である。このような酸の例には塩酸、硫酸および硝
酸、並びにクエン酸、酒石酸およびベンゼンスルホン酸
が包含される。これらの例の中で塩酸が好適である。

【００１５】或る種の生理学的に許容されうる共溶剤を
水に加えて場合により存在させることができるが、水溶
液用の媒質は全体的にあるいは実質的に水性であると好
ましい。凍結乾燥医薬製剤から得られる非経腸投与用溶
液は患者の血清と過張、低張または等張であることがで
きる。しかしながら、望ましくない副作用を回避するた
めに、非経腸投与用溶液は等張であると好ましく、低度
の変化は生理学的にあまり関係はない。実質的に等張性
の非経腸投与用溶液は溶液の張度を要求されるレベルに
上昇させることができる生理学的に許容されうる助剤を
含ませることにより得ることができる。このような助剤
は凍結乾燥医薬製剤中にすでに存在するように凍結乾燥
させる水溶液の中に含ませることができ、あるいは所望
の非経腸投与用溶液を得るためにこのような製剤を溶解
するために用いられる中性または酸性pHの水の中に含有
させることもできる。このような助剤の例は当技術でよ
く知られており、デキストロース（無水物形または一水
和物形）および塩化ナトリウムおよびまたその混合物を
包含する。水溶液または溶解用水中のこのような助剤の
濃度は使用する物質により変わることは勿論のことであ
る。塩化ナトリウムの場合に、この濃度は好ましくは７
〜１０mg／ml、さらに好ましくは約８．５mg／mlであ
り、この濃度はしばしば生理食塩液または生理食塩水と
称される濃度である。無水デキストロースの場合に、そ
の濃度は好ましくは３０〜７０mg／ml、さらに好ましく
は約５０mg／mlである。

【００１６】水溶液は場合によりこの種の凍結乾燥医薬
製剤が通常含有する添加剤を含有できる。このような例
としてはヒト血清アルブミン、結合剤およびマニトー
ル、乳糖およびグルコースのような充填剤を包含する。
さらに、ｔ−ＰＡはガラスおよびプラスチック表面に吸
着する傾向があり、従ってこのような吸着を防止する
か、または最低にするために、水溶液中に表面活性剤を
含有させることが望ましいことがある。このような表面
活性剤の例には「ツイーン８０」（Ｔｗｅｅｎ ８０）
の商品名で市販されているような無水ソルビトールの脂
肪酸部分エステルのポリオキシエチレン誘導体が含まれ
る。

【００１７】本発明の驚くべき利点の一つとしては、ｔ
−ＰＡの実質的に増大した溶解度は別にして、凍結乾燥
医薬製剤の再構成により得られる酸性非経腸投与用溶液
の使用が患者に投与した時にいづれか有意の有害な生理
学的作用を示さないことにある。血流は一般に、溶液の
pHを接触するとほとんどすぐに中性に上昇させるように
見え、ｔ−ＰＡは迅速に血流内に分布される。しかしな
がら、この方法はいづれの方法でも実質的に妨害されな
いことおよびこの非経腸投与用溶液および凍結乾燥させ
る水溶液およびまた再構成用の水は強力な緩衝剤を含有
しないことが好ましい。しかし、この方法を有意に阻害
しない弱い緩衝剤は含ませてもよく、酸性pHでｔ−ＰＡ
それ自体がそれ自体で弱い緩衝剤として作用することも
確かである。さらにまた、ヒト血清アルブミンは弱い緩
衝剤として作用できる。

【００１８】ｔ−ＰＡが２〜５のpHの水溶液中で実質的
に増大した溶解度を有することから、この凍結乾燥製剤
の再構成から得られる非経腸投与用溶液にはｔ−ＰＡの
溶解度を増強するためのリジンまたはオルニチンあるい
はその混合物のようないづれか追加の助剤を含有させる
必要はない。ｔ−ＰＡの水溶液は精製したｔ−ＰＡの溶
液を得、次いで２〜５のpHを有する水性媒質用メジウム
と交換することにより、あるいは精製したｔ−ＰＡを２
〜５のpHを有する水性メジウム中に溶解することにより
調製できる。

【００１９】ｔ−ＰＡの精製はクロマトグラフィカラム
から強力な緩衝剤を含有する溶液としてタンパクを溶離
する工程を最終工程として含むことができる。前記した
ように、非経腸投与用溶液および従って凍結乾燥医薬製
剤および水溶液は強力な緩衝剤を含有していない。従っ
て、その除去を行なう簡便な手段としてメジウムの交換
に透析を使用すべきである。透析は精製溶液が２〜５の
pHを有する水性メジウムに対して透析される透析管また
は人工腎臓を用いて実施できる。特に精製溶液中のｔ−
ＰＡの濃度が高い場合には、先ずこの溶液のpHを２〜５
に調製することが望ましいことがある。強力な緩衝剤を
除去するとともにメジウムを交換するためのもう一つの
手段は精製溶液をゲル濾過し、次いで２〜５のpHを有す
る水性メジウムでカラムを展開する方法である。

【００２０】沈殿した固体の形のｔ−ＰＡは好ましくは
精製溶液からそのpHを約５．５に調整し、溶液をその凍
結点のすぐ上の温度まで冷却し、次いでたとえば遠心分
離によりタンパクを取り出すことにより得ることができ
る。沈殿した固体は次いで２〜５のpHを有する水性媒質
中に常法により溶解できる。精製する水溶液は都合良
く、たとえば濾過殺菌により殺菌し、および次いでアン
プルまたはバイアルのような無菌プラスチックまたはガ
ラス容器に、たとえば０．５〜２０mlの容量で分配す
る。ｔ−ＰＡの水溶液は、好ましくは−１０〜−４０℃
の温度で冷凍する。冷凍した水溶液は次いで、好ましく
はこの温度に真空乾燥を開始するまで保持する。

【００２１】冷凍した水溶液の真空乾燥は適宜に実施で
き、たとえば０．０１〜０．１トールで実質的に全ての
冷凍液の除去が行なわれるまで充分な時間、部分的真空
または完全真空下に乾燥させることを包含する。真空乾
燥を行なう温度は通常、水溶液が実質的にまたは完全に
凍結した形で維持されるように、処理の開始時点で−３
０〜−４０℃である。処理が進行し、水が除去されるに
つれて、温度は室温に達するまで次第に上昇することが
ある。最後の痕跡量の水をできるだけ除去するために、
処理の終了時点において室温またはそのすぐ上温度で約
０．０１トールの実質的真空下に真空乾燥を行なうと好
ましい。精製する凍結乾燥医薬製剤の水含有量は好まし
くは２．５％以下である。真空乾燥が完了したならば、
凍結乾燥させた医薬製剤を含有する無菌のプラスチック
またはガラス容器を都合良く密封する。

【００２２】冷凍した水溶液の真空乾燥中に、水が除去
され、ｔ−ＰＡが生理学的に許容されうる塩の形で残
る。従って、本発明はまたｔ−ＰＡの生理学的に許容さ
れうる塩、特に塩酸塩のような生理学的に許容される酸
付加塩を提供する。本発明を使用することにより高濃度
でｔ−ＰＡを含有する非経腸投与用溶液を提供できる凍
結乾燥医薬製剤を最初に得ることができる。従って、本
発明はまた水を加えるとｔ−ＰＡを１００，０００ＩＵ
／mlより大の、さらに特に５００，０００ＩＵ／mlより
大の、最も特別に１，０００，０００ＩＵ／mlより大の
濃度で提供することができるｔ−ＰＡの凍結乾燥医薬製
剤を提供する。

【００２３】投与用のｔ−ＰＡの非経腸投与溶液を調整
するには、本発明の方法により得られた凍結乾燥医薬製
剤を中性または酸性pHの水で再構成する。凍結乾燥医薬
製剤が得られる水溶液が実質的に等張である場合に、再
構成用の水はまた実質的に等張であると好ましい。血塊
のフィブリン網状構造を溶解する際のｔ−ＰＡの生物学
的活性は血栓性障害の処置におけるその使用を導いてい
る〔ザ ランセット（Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ）、１９８
１年１１月７日、１０１８〜１０２０頁；１９８５年４
月１３日、８４２〜８４７頁；ザー ニュー イングラ
ンド ジャーナル オブ メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃ
ｉｎｅ）、１９８４年、３１０（１０）、６０９〜６１
３頁；同、１９８５年、３１２（１４）、９３２〜９３
６頁〕。従って、本発明は哺乳動物における血栓性障害
の処置方法を提供し、この方法は前記定義のとおりの凍
結乾燥医薬製剤から得られたｔ−ＰＡの非経腸投与用溶
液を哺乳動物に投与することを含んでいる。別様には、
ヒトまたは動物に使用する。特に血栓性障害の処置に使
用するためのｔ−ＰＡの凍結乾燥医薬製剤を提供する。

【００２４】血栓性障害の特定の例は当業者に知られて
いるが、心筋梗塞、深動脈血栓症、肺塞栓症および卒中
を包含する。ｔ−ＰＡの主要投与経路は血管内、特に静
脈内注入によるが、考えられるその他の投与経路、たと
えば筋肉内投与も使用できる。血管内注入は通常、注入
用袋またはビン内にあるいは電気的に操作される注入シ
リンジ内に含有されている非経腸投与用溶液を用いて行
なう。この溶液は注入袋またはビンから患者に重力供給
により、または注入ポンプを使用することにより与える
ことができる。重力供給注入システムを使用すると、非
経腸投与用溶液の投与速度を総体的に充分に制御して供
給できない。従って、注入ポンプの使用が比較的高濃度
のｔ−ＰＡを含有する溶液の場合に特に好適である。し
かしながら、さらに好ましくは、投与速度を総体的によ
り大きく制御できる電気的に操作する注入シリンジを使
用する。

【００２５】血栓性障害を持つ哺乳動物の処置に有効な
ｔ−ＰＡの量は多くの因子、たとえば哺乳動物の年令お
よび体重、処置を必要とする正確な症状およびその重篤
度、投与経路を含む因子に依存して変わることは勿論で
あり、究極的には主治医または主治獣医の裁量である。
しかしながら、たとえば冠状動脈血栓を溶解させる有効
量は一般に１５０，０００〜４５０，０００ＩＵ／患者
の体重kg／時の範囲であると好ましい。従って、体重７
０kgの成人の場合に、１時間当りの有効量は一般に１
０，０００，０００〜３０，０００，０００ＩＵ、特に
約２０，０００，０００ＩＵであり、この量は初回量を
用いてまたは用いることなく投与できる。さらに、この
投与量はいくつかの血栓症状、たとえば深動脈血栓症お
よび急性卒中のような症状に対しては、またはすでに再
灌流されている冠状動脈の開放性を単純に維持するため
の場合にはさらに少量にすると好ましい。これらの場合
に、有効量は一般に７，０００〜３６，０００ＩＵ／患
者の体重kg／時である。

【００２６】

【実施例】次例は本発明を例示するために示すものであ
って、本発明をいづれの点でも制限しようとするもので
はない。 例 １ モレキュラー アンド セルラー バイオロジイ（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ）、１９８５年、５（７）、１７５０〜１７５９
頁の方法を使用して誘導された培養した形成転換された
ＣＨＯセルラインから得られたｔ−ＰＡの清浄にした収
穫物をクロマトグラフィにより精製し、ｔ−ＰＡを０．
１７Ｍクエン酸ナトリウムおよび０．０１％（重量／容
量）ツイーン８０を含有するpH５．５の水溶液として採
取する。溶液のpHを塩酸で３．０に調整し、精製する溶
液をＨ−１０カートリッジ（Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）〔ア
ミコン社（Ａｍｉｃｏｎ Ｌｔｄ．）アッパー ヒル、
ストーンハウス、グロセスターシャー（Ｕｐｐｅｒ Ｈ
ｉｌｌ、Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ
ｓｈｉｒｅ）、英国〕を用いて遠心分離により濃縮す
る。濃縮した水溶液をゲル濾過カラム〔セファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１５０；ファーマシア バイ
オテクノロジイ社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ）、アップサラ、スエーデン（Ｕｐｐｓ
ａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）〕に適用し、０．０１％（重量
／容量）ツイーン８０を含有する０．８５％塩類溶液で
３．０のpHにおいて溶出することによりさらに精製す
る。このようにして得られた高度に精製されたｔ−ＰＡ
の水溶液を使い捨て人工腎臓を用いてもう一度濃縮す
る。ｔ−ＰＡはpHを水酸化ナトリウムで５．５に増大
し、次いで懸濁液を４℃で２時間保持することにより溶
液から沈殿させる。

【００２７】この溶液を４℃で３０分間、４０００×ｇ
で遠心分離し、沈殿中に全部で１６８１０×１０⁶ 単位
のｔ−ＰＡを採取した。このｔ−ＰＡペレットを、０．
０１％（重量／容量）のツイーン８０を含有する塩化ナ
トリウムの水溶液〔０．８５％（重量／容量）〕２３０
０ml（７，５００，０００ＩＵ／ml〜１０，０００，０
００ＩＵ／mlの濃度をうるに必要な量）中に再溶解し、
塩酸でpH３．０に調整した。この再溶解したｔ−ＰＡペ
レットについてｔ−ＰＡ活性を繰返し測定し、８．０９
×１０⁶ ＩＵ／mlのｔ−ＰＡ活性を得た。このｔ−ＰＡ
の溶液を、０．０１％（重量／容量）のツイーン８０を
含有する塩化ナトリウムの水溶液〔０．８５％（重量／
容量）〕４９０mlでさらに希釈し、塩酸でpH３．０に調
整し、次いで同一酸性塩類溶液中の１０％（重量／容
量）マンニトール溶液９３０mlで希釈した。これによっ
て、ｔ−ＰＡ５，０００，０００ＩＵ／mlおよびマンニ
トール２５mg／mlを含有する溶液３７２０mlを得た。

【００２８】生成する溶液をフィルター殺菌し、次いで
ガラスバイアル中に１mlの容量で分配し、バイアルを−
３５℃で冷凍する。０．０５トールで減圧を適用する。
約２４時間後に、温度を徐々に５０℃に上昇させ、この
温度で１６時間保持する。次いで、再度２５℃に上昇さ
せ、減圧を０．０２トールにさらに２４時間増大し、そ
の後バイアルを乾燥窒素の６００トールの部分減圧下に
密封する。

【００２９】例 ２ 例１のｔ−ＰＡの凍結乾燥製剤から得られた非経口投与
用溶液の血栓溶解効果を頸静脈血栓のインビボモデルで
評価する。 (a) 方法 実験方法はコレン（Ｃｏｌｌｅｎ）他により最初に記載
された方法〔ジェイ．クリン．インベスト．（Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、１９８３年、７１、３６８〜
３７６頁〕に基本的に従う。例１の凍結乾燥製剤を、
０．０１％ツイーン８０を含有するpH３．０に調整した
無菌の等張塩類溶液に迅速に、完全に溶解する。この再
構成された、ｔ−ＰＡの濃度は５０，０００ＩＵ／mlで
ある。

【００３０】かくして、５００，０００ＩＵ／kgのｔ−
ＰＡを２時間注入するための非経口投与用溶液が得られ
る。注入は右大腿部静脈でカニューレを用いて行なう。
４匹のニュージランド白ウサギをこの実験に使用する。
注入後に、血栓溶解の程度を評価する。

【００３１】(b) 結果 例１の凍結乾燥製剤から得られた非経口投与用溶液の血
栓溶解効果は血栓溶解％で表わして２８．９±４．１で
ある。さらに、この溶液による有害な反応は見られな
い。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｔ−ＰＡの代表的アミノ酸配列を示すものであ
る。

【図２】ｔ−ＰＡの９０番目の位置のアミノ酸とプロリ
ンＣ末端との間のアミノ酸配列の仮定構造を示すもので
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 47/02 Ｚ 47/26 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 9/68 ＺＮＡ 9152−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 9/68 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 9/14 Ｌ (56)参考文献 特開 昭62−36332（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−26234（ＪＰ，Ａ)

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 pHが３．５〜５である組織プラスミノー
   ゲン活性化因子（ｔ−ＡＰ）の実質的に緩衝されていな
   い冷凍水溶液を減圧乾燥させて得られるｔ−ＰＡの凍結
   乾燥医薬製剤。
2. 【請求項２】 ｔ−ＰＡが一鎖形または二鎖形である請
   求項第１項に記載の製剤。
3. 【請求項３】 ｔ−ＰＡが以下に示すアミノ酸配列を有
   するか、またはセリンＮ−末端から２４５番目のアミノ
   酸がメチオニンの代りにバリンである以外は以下に示す
   アミノ酸配列と同一アミノ酸配列を有し、場合により最
   初の３つのアミノ酸のいずれかが存在していないか、ま
   たは場合によりＧｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇの追加のポリペ
   プチドＮ−末端先行配列を有するものである請求項第１
   項または第２項のいずれか一つに記載の製剤。 【化１】
4. 【請求項４】 ｔ−ＰＡをＤＮＡ組換え技術を用いて誘
   導された培養した形質転換またはトランスフェクション
   されたセルラインから得る請求項第１項〜第３項のいず
   れか一項に記載の製剤。
5. 【請求項５】 水溶液中のｔ−ＰＡの濃度が１００００
   ０ＩＵ／mlより大である請求項第１項〜第４項のいずれ
   か一項に記載の製剤。
6. 【請求項６】 ｔ−ＰＡの濃度が５０００００ＩＵ／ml
   より大である請求項第５項に記載の製剤。
7. 【請求項７】 ｔ−ＰＡの濃度が１００００００ＩＵ／
   mlより大である請求項第６項に記載の製剤。
8. 【請求項８】 ｔ−ＰＡの濃度が５００００００ＩＵ／
   mlである請求項第７項に記載の製剤。
9. 【請求項９】 水溶液用のメジウムが全体的にまたは実
   質的に水性である請求項第１項〜第８項のいずれか一項
   に記載の製剤。
10. 【請求項１０】 水溶液用のメジウムが溶液をヒト血清
    と実質的に等張にする生理学的に許容されうる助剤を含
    有する請求項第１項〜第９項のいずれか一項に記載の製
    剤。
11. 【請求項１１】 生理学的に許容されうる助剤が塩化ナ
    トリウムである請求項第１０項に記載の製剤。
12. 【請求項１２】 生理学的に許容されうる助剤がデキス
    トロースである請求項第１１項に記載の製剤。
13. 【請求項１３】 水溶液が表面活性剤を含有する請求項
    第１項〜第１２項のいずれか一項に記載の製剤。
14. 【請求項１４】 水溶液がリジンまたはオルニチンある
    いはその塩を実質的に含有していない請求項第１項〜第
    １３項のいずれか一項に記載の製剤。
15. 【請求項１５】 水溶液を殺菌する請求項第１項から第
    １４項のいずれか一項に記載の製剤。
16. 【請求項１６】 ヒトまたは動物医薬として、血栓症障
    害の処置に使用するための請求項第１項に記載の製剤。