NL8601355A

NL8601355A - Nieuwe samenstelling.

Info

Publication number: NL8601355A
Application number: NL8601355A
Authority: NL
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1985-05-28
Filing date: 1986-05-27
Publication date: 1986-12-16
Also published as: FR2583984A1; DK163173C; US4968617A; CH665356A5; GB8612780D0; ES8800601A1; SE8602405L; AU567236B2; DE3617752C2; ES555353A0; ES8802439A1; GB2176702B; IL78938A; CA1300008C; IL78938A0; DK246786D0; PT82646A; FI862227A0; NZ216307A; HUT41638A

Description

-1- *F « VO 8205

Nieuwe samenstelling.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op weefselplasmino-geenactivator en in het bijzonder op farmaceutische samenstellingen die weefselplasminogeenactivator bevatten, hun bereiding, en hun gebruik in de mens- en diergeneeskunde.

5 Men meent dat er een dynamisch evenwicht bestaat tussen het enzym- systeem dat bloedstolsels kan vormen - het coagulatiesysteem - en het enzymsysteem dat bloedstolsels kan oplossen - het fibrinolytische systeem - dat een intact voortreffelijk vaatbed in stand houdt. Om bloedverlies bij beschadigingen te beperken, worden in de beschadigde vaten 10 bloedstolsels gevormd. Na natuurlijke reparatie van de schade, worden de overbodige bloedstolsels opgelost door de werking van het fibrinolytische systeem. Soms vormen bloedstolsels zich zonder traumatische schade en blijven ze zitten in belangrijke bloedvaten, hetgeen resulteert in een gedeeltelijke of zelfs totale obstructie van de bloedstroming. Wanneer 15 dit in het hart, de longen of hersenen gebeurt, kan het resultaat een myocardiaal infarct, longembolie of beroerte zijn. Deze condities zijn in combinatie de belangrijkste oorzaak voor ziekte en sterfte in de geïndustrialiseerde landen.

Bloedstolsels bestaan uit een vezelhoudend netwerk dat door het 20 proteolytische enzym piasmine kan worden opgelost. Het enzym is afgeleid van het inactieve pro-enzym, plasminogeen, een component van bloedplasma, door de werking van een plasminogeenactivator. Er zijn twee immunologisch verschillende plasminogeenactivatoren bij zoogdieren. Intrinsieke plasminogeenactivator, ook bekend als urokinase, is een enzym dat door 25 de nieren wordt geproduceerd en uit urine kan worden geïsoleerd. Het kan ook uit een aantal weefselkweekbronnen worden bereid. Extrinsieke plasminogeenactivator, ook bekend als vaatplasminogeenactivator en als weef selplasminogeenactiva tor (t-PA) , kan uit vele weefselhomogenaten (met name humane uterus), de vaatcelwand en uit enkele celkweken wor-30 den geïsoleerd. Behalve deze twee soorten plasminogeenactivator is er ook een bacterieel produkt, streptokinase, bereid uit 8-haemolytische streptococcen. Een belangrijk nadeel van zowel urokinase als streptokinase is dat ze in de hele bloedsomloop actief zijn en niet alleen op de plaats van een bloedstolsel. Ze kunnen bijvoorbeeld andere bloed-35 eiwitten zoals fibrinogeen, prothrombine, factor V, en factor VIII ver-

863133S

i > -2- nietigen waardoor het vermogen van bloedstolling wordt verminderd en het risico van bloedingen wordt vergroot- Daarentegen is de biologische werkzaamheid van t-PA afhankelijk van de aanwezigheid van fibrine waaraan het bindt en waar het wordt geactiveerd. Maximale activiteit wordt derhalve 5 alleen ontwikkeld op de plaats van een bloedstolsel, dat wil zeggen in tegenwoordigheid van het fibrine netwerk dat moet worden opgelost, en hierdoor wordt het risico van bloedingen in hoge mate vermeden.

De belangrijkste toedieningsroute van t-PA is door intravasculaire infusie, hetgeen vereist dat de t-PA bevattende samenstelling een paren-10 terale oplossing is. In het geval van een eiwit heeft het de voorkeur dat het geneesmiddel aan de arts of diergeneeskundige wordt gepresenteerd in de vorm van een gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling, vanwege zijn significante transport- en bewaarvoordelen ten opzichte van een vloeibare samenstelling. Het is echter belangrijk dat een dergelijke 15 gelyofiliseerde samenstelling gemakkelijk kan worden omgezet in de gewenste parenterale oplossing zonder al te veel ongemakken en moeilijkheden en dat de arts of diergeneeskundige de vereiste geneesmiddelcon-centratie in elke gegeven situatie eenvoudig kan bereiken door reconstitute van de samenstelling in de gepaste hoeveelheid oplosmiddel. Het is 20 bijvoorbeeld niet raadzaam om een grote volumehoeveelheid oplossing aan een patiënt met een hart- of nierprobleem toe te dienen omdat daardoor het hart of de nieren onder nog grotere spanning zouden komen te staan.

De volumehoeveelheid moet daarom onder dergelijke omstandigheden op een minimum worden gehouden.Het is derhalve gewenst dat een parenterale op-25 lossing niet alleen met een relatief lage concentratie maar ook met een hoge concentratie van het geneesmiddel kan worden verkregen.

Een aantal gelyofiliseerde farmaceutische samenstellingen van t-PA zijn beschreven in EP-A-113 319 en EP-A-123 304. De samenstellingen worden bereid uit waterige zoutoplossingen van t-PA, waarin de pH 30 ongeveer neutraal is, en hebben het nadeel- dat de oplosbaarheid van t-PA in dergelijke oplossingen laag is in afwezigheid van een toename in de ionconcentratie. Daardoor bevatten de uit dergelijke gelyofiliseerde samenstellingen verkregen parenterale oplossingen lage t-PA concentraties, zodat in sommige situaties de toediening van ongewenst grote 35 volumehoeveelheden oplossing aan een patiënt nodig is, of zijn de samenstellingen hypertonisch, hetgeen bij toediening voor de rode bloedcellen schadelijk kan zijn.

i'i -S .Λ -4 V jj — w i ö 0 0

Sf * -3-

Thans is gevonden, dat de oplosbaarheid van t-PA in een waterige oplossing kan worden verbeterd wanneer de pH van de oplossing binnen een zuur gebied is gelegen, dat een gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling kan worden bereid uit een zure oplossing van t-PA, en dat de 5 samenstelling een parenterale oplossing kan geven die bij toediening geen significante fysiologische problemen schept. Derhalve verschaft de onderhavige uitvinding een werkwijze voor het bereiden van een gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling van t-PA, omvattende het vacuüm drogen van een ingevroren waterige oplossing van t-PA, waarin de 10 pH 2 - 5 is.

Als gevolg van de betere oplosbaarheid van t-PA, kan een gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling volgens de onderhavige uitvinding worden bereid die een parenterale oplossing kan geven welke een hoge t-PA concentratie bevat zonder dat een groot gevaar bestaat voor een 15 uit de oplossing neerslaan van t-PA. De gelyofiliseerde samenstelling kan derhalve aan artsen of diergeneeskundigen worden gepresenteerd die de samenstelling op de gewenste wijze en tijd kunnen oplossen tot de gewenste concentratie, waarbij bijvoorbeeld water met een neutrale of zure pH wordt gebruikt. De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een sta-20 biele gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling die een grotere flexibiliteit creëert in zijn hantering en gebruik door artsen en diergeneeskundigen, en tevens voorziet in een gemakkelijker wijze van transport en opslag.

Het volgens de onderhavige uitvinding te gebruiken t-PA kan 25 elk bioactief eiwit zijn dat in essentie overeenstemt met t-PA van zoogdieren, in het bijzonder de mens, en omvat vormen met en zonder glycosylering. Het kan uit één of uit twee ketens bestaand t-PA zijn, of een mengsel daarvan, zoals beschreven in EP-A-112 122, en heeft in het geval van volledig geglycosyleerd humaan t-PA een schijnbaar molecuul-30 gewicht op polyacrylamidegels van ongeveer 70.000 en een isoêlektrisch punt tussen 7,5 en 8,0. Bij voorkeur heeft het t-PA een specifieke activiteit van ongeveer 500.000 IU/mg (Internationale eenheden/mg, waarbij de internationale eenheid een activiteitseenheid is zoals gedefinieerd door WHO, National Institute for Biological Standards and 35 Control, Holly Hill, Hampstead, London, NW3 6 RB, U.K.).

η « M 1 (. λ λ te/ 'ί J J Ü 3 ψ ϊ -4-

De aminozuurvolgorde van t-PA correspondeert bij voorkeur in hoge mate met de in fig. 1 vermelde aminozuurvolgorde. De volgorde is derhalve identiek aan die in fig. 1 of bevat één of meerdere aminozuur-deleties, substituties, invoegingen, omkeringen of toevoegingen van 5 allel oorsprong of anderszins, waarbij de resulterende volgorde ten minste 80 % en bij voorkeur 90 % homologie heeft met de volgorde in fig. 1 en in essentie dezelfde biologische en immunologische eigenschappen van het eiwit behoudt. In het bijzonder is de t-PA volgorde identiek aan die in fig. 1 of heeft het dezelfde volgorde maar met 10 dien verstande dat het aminozuur op de 245ste positie vanaf de serine N-terminus valine is in plaats van methionine, waarbij elke volgorde desgewenst één of meer van de eerste drie aminozuren mist of desgewenst een aditionele polypeptide N-terminale voorsequentie van Gly-Ala-Arg heeft.

15 De in fig. 1 getoonde aminozuurvolgorde heeft 35 cystelne- residuen en daardoor het potentieel om 17 disulfide bruggen te vormen. Gebaseerd op analogie met andere eiwitten waarvan de structuur in groter detail is bepaald, is de gepostuleerde structuur voor de volgorde (volgend uit de vorming van disulfide banden) tussen het aminozuur op de 20 90ste positie en de proline C-terminus in fig. 2 getoond. De structuur van het N-terminale gebied is minder zeker hoewel daarvoor enkele voorstellen zijn gedaan (Progress in Fibrinolysis, 1983, _6, 269 - 273; and Proc. Na tl. Acad. Sci., 1984, J31, 5355 - 5359). De belangrijkste kenmerken van de structuur van t-PA zijn de twee kringle-gebieden (tussen 25 de 92ste en 173ste aminozuren en tussen de 180ste en 261ste aminozuren), die verantwoordelijk zijn voor de binding van het eiwit aan fibrine, en het serine protease gebied, dat het belangrijkste deel van de B-keten omvat en verantwoordelijk is voor de activering van plasminogeen. De aminozuren van bijzonder belang in serine proteases zijn de kataly-30 tische triade His/Asp/Ser. In t-PA treden deze op op de 322ste, 371ste en de 463ste posities. De disulfide brug tussen de 264ste en 395ste cysteine aminozuur residuen is ook belangrijk doordat deze de A en B-ketens bij elkaar houdt in de uit twee ketens bestaande vorm van t-PA.

In de figuren 1 en 2 zijn de conventionele één en drie letter-35 codes gebruikt voor de aminozuur residuen, welke code als volgt is:

86 0 1 3 5 S

-5-

Asp D Aspartinezuur lie I Isoleucine

Thr T Threonine Leu L Leucine

Se r S Serine Tyr Y Tyrosine

Glu E Glutaminezuur Phe F Phenylalanine 5 Pro P Proline His H Histidine

Gly G Glycine Lys K Lysine

Ala A Alanine Arg R Arginine

Cys C Cysteine Trp W Tryptofaan

Val V Valine Gin Q Glutamine 10 Met M Methionine Asn N Asparagine

Het t-PA kan worden verkregen volgens elk van de eerder beschreven of bekende procedures. Het kan bijvoorbeeld worden verkregen uit een normale of neoplastische cellijn van de soort,beschreven in Biochi- 15 m^ca et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; EP-A-41 766 of EP-A-113 319. De voorkeur heeft echter dat t-PA verkregen is van een gekweekte getransformeerde of getransfecteerde cellijn, afgeleid met behulp van recombinant DNA technologie zoals beschreven in bijvoorbeeld EP-A 93 619; EP-A-117 059 of EP-A-117 060. Het heeft bijzondere voorkeur dat 2q Chinese hamsterovarium (CHO) cellen gebruikt worden voor de produktie van t-PA en afgeleid zijn op de wijze, beschreven in Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759. Op deze wijze wordt het gedoneerde gen samen met het gen dat codeert voor dihydrofolaat reductase (dhfr) getransfecteerd in dhfr CHO cellen. Transformanten waarin dhfr 25 tot expressie komt, worden geselecteerd op media die nucleosiden missen en worden blootgesteld aan toenemende concentraties methotrexaat.

De dhfr en t-PA genen worden aldus samen geamplificeerd hetgeen leidt tot een stabiele cellijn die in staat is tot een sterke expressie van t-PA.

30 Het t-PA wordt bij voorkeur gezuiverd onder toepassing van één van de eerder beschreven of bekende procedures, zoals de procedures beschreven in Biochimica et Biophysica Acta, 1979, 580, 140-153; J.Biol. Chem., 1979, 254(6), 1998-2003; ibid, 1981, 256(13) , 7035-7041; Eur. J. Biochem., 1983, 132, 681-686; EP-A-41 766; EP-A-113 319 of GB-A-2 122 35 219.

Er lijkt geen bovengrens te bestaan voor de oplosbaarheid van 8301355 * * -6- t-PA in de waterige oplossing die in de werkwijze volgens de uitvinding wordt gebruikt. Bij zeer hoge concentraties,zoals boven 150.000.000 IU/ml (Internationale eenheden/ml), wordt de oplossing alleen visceus zonder dat enige significante precipitatie van het t-PA optreedt. De concen-5 tratie van t-PA in de waterige oplossing kan derhalve binnen ruime • grenzen variëren, bijvoorbeeld van 50.000 tot 50.000.000 IU/ml. Om een maximaal profijt van de onderhavige uitvinding te verzekeren, heeft het de voorkeur dat de concentratie van t-PA groter is dan 100.000 IU/ml, meer in het bijzonder groter dan 500.000 IU/ml, en liefst groter dan 10 1.000.000 IU/ml. De grootste voorkeur heeft dat de t-PA concentratie ongeveer 5.000.000 IU/ml bedraagt.

De bovengrens voor de pH van de waterige oplossing is bij voorkeur 4,5. In fiete ligt de pH bij voorkeur in een bereik van 2,5 tot 4,0, liever dan 2,8 tot 3,5, en liefst ongeveer 3,0. De gewenste pH van 15 de waterige oplossing wordt op een geschikte wijze verkregen door een fysiologisch aanvaardbaar anorganisch of organisch zuur te gebruiken. Voorbeelden van een dergelijk zuur zijn zoutzuur, zwavelzuur en salpeterzuur, alsmede citroenzuur, wijnsteenzuur en benzeensulfonzuur. Van deze voorbeelden heeft zoutzuur de voorkeur.

20 Hoewel behalve water desgewenst een fysiologisch aanvaardbaar co-solvent aanwezig kan zijn, heeft het de voorkeur dat het medium voor de waterige oplossing geheel of nagenoeg volledig op waterbasis is.

De parenterale oplossing, verkregen uit de gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling, kan hypertonisch, hypotonisch of isotonisch 25 zijn met het bloedserum van de patiënt. Om ongewenste neveneffecten te vermijden is de parenterale oplossing echter bij voorkeur isotonisch, hoewel ondergeschikte afwijkingen niet van grote fysiologische betekenis zijn. Een in hoge mate isotonische parenterale oplossing kan worden verkregen door een fysiologisch aanvaardbaar middel op te nemen dat de 30 toniciteit van de oplossing tot het vereiste niveau kan verhogen. Het middel kan in de te vriesdrogen waterige oplossing worden opgenomen zodat het reeds in de gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling aanwezig is, of kan worden opgenomen in het water met neutrale of zure pH, dat gebruikt wordt voor het oplossen van de samenstelling om de gewenste 35 parenterale oplossing te verkrijgen. Voorbeelden van een dergelijk middel zijn op zichzelf bekend en omvatten dextrose (in watervrije of monohydraatvorm) en natriumchloride en mengsels daarvan. De concentratie ö V* Λ Λ =5» ““

?♦. « If S V

y w & v 'fes- v* -7- van het middel in de waterige oplossing of in het oploswater zal natuurlijk van middel tot middel variëren. In het geval van natriumchloride is de concentratie bij voorkeur 7-10 mg/ml, en liefst ongeveer 8,5 mg/ml, welke concentratie vaak wordt aangeduid als een fysiologische 5 zoutoplossing of alleen maar fysiologisch zout. In het geval van water-vrije dextrose is de concentratie bij voorkeur 30 tot 70 mg/ml, liefst ongeveer 50 mg/ml.

De waterige oplossing kan desgewenst normaliter aan gelyofili-seerde farmaceutische samenstellingen van dit type verbonden additieven 10 bevatten. Voorbeelden omvatten humaan serum albumine en bindmiddelen en vulstoffen zoals mannitol, lactose en glucose. Bovendien heeft t-PA neiging om te adsorberen aan glazen en kunststoffen oppervlakken en het kan daarom gewenst zijn om een oppervlakte-actief middel in de waterige oplossing op te nemen om een dergelijke adsorptie te verhinderen of tot 15 een minimum te beperken. Voorbeelden van een dergelijk middel omvatten polyoxyëthyleen derivaten van partiële vetzuuresters van sorbitol-anhydriden, zoals die welke in de handel zijn onder de naam "Tween 80".

Eén van de verrassende voordelen van de onderhavige uitvinding, afgezien nog van de aanzienlijk verhoogde oplosbaarheid van t-PA, is 20 dat het gebruik van een zure parenterale oplossing, verkregen door re-constitutie van de gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling, geen significante nadelige fysiologische effecten blijkt te hebben op de toediening aan de patiënt. Men zou verwachten dat de bloedstroom in het algemeen in staat is om de pH van de oplossing bijna zondra contact wordt 25 gemaakt tot de neutrale waarde te verhogen, waarbij het t-PA snel in de bloedstroom wordt verdeeld. Het heeft echter de voorkeur dat dit proces niet wezenlijk op wat voor manier dan ook wordt belemmerd en dat de parenterale oplossing en dus de te vriesdrogen waterige oplossing en het voor reconstitutie gebruikte water geen sterk buffermiddel bevatten.

30 Evenwel kan een zwak buffermiddel dat dit proces niet in significante mate belemmert, worden opgenomen en bij zure pH blijkt t-PA zelf als zijn eigen zwakke buffermiddel te werken. Bovendien kan humaan serum albumine als een zwak buffermiddel fungeren.

Vanwege de sterk verhoogde oplosbaarheid van t-PA in een wate-35 rige oplossing waarin de pH 2 - 5 is, is het niet nodig dat in de door reconstitutie van de gelyofiliseerde samenstelling verkregen parenterale oplossing additionele materialen zoals lysine of ornithine of 86 0 1 3 5 5 -8- zouten daarvan worden opgenomen om de oplosbaarheid van t-PA te vergroten.

De waterige t-PA oplossing kan worden bereid door het verkrijgen van een oplossing van gezuiverd t-PA en het uitwisselen van het medium 5 voor een waterig medium met een pH van 2 - 5; of door het oplossen van gezuiverd t-PA in een waterig medium met een pH van 2-5.

De zuivering van t-PA kan als laatste stap de elutie van het eiwit uit een chromatografische kolom omvatten als een oplossing die een sterk buffermiddel bevat. Zoals eerder vermeld heeft het de voorkeur dat 10 de parenterale oplossing en dus de gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling en waterige oplossing, geen sterk buffermiddel bevat en daarom is een geschikt middel om zijn verwijdering te realiseren onder uitwisseling van het medium, het gebruik van dialyse. Dit kan worden uitgevoerd door dialyseslangen of een kunstnier te gebruiken waarin de ge-15 zuiverde oplossing wordt gedialyseerd tegen een waterig medium waarin de pH 2 - 5 is. In het bijzonder wanneer de t-PA concentratie in de gezuiverde oplossing hoog is, kan het gewenst zijn om eerst de pH van de oplossing zodanig in te stellen dat deze 2-5 bedraagt. Een ander middel om de verwijdering van een sterk buffermiddel te realiseren terwijl het 20 medium wordt uitgewisseld, is het onderwerpen van de gezuiverde oplossing aan gelfiltratie en het ontwikkelen van de kolom met een waterig medium waarin de pH 2 - 5 is.

t-PA in de vorm van een neergeslagen vaste stof kan bij voorkeur worden verkregen uit een gezuiverde oplossing door de pH op ongeveer 25 5,5 in te stellen, de oplossing af te koelen tot net boven het vries punt, en het eiwit te winnen door bijvoorbeeld centrifugeren. De neergeslagen vaste stof kan vervolgens worden opgelost in een waterig medium met een pH van 2 - 5 op een conventionele wijze.

Het heeft de voorkeur dat de verkregen waterige oplossing op con-30 ventionele wijze, bijvoorbeeld door filtersterilisatie, wordt gesteriliseerd, en dat hij vervolgens wordt gebracht in steriele, kunststoffen of glazen houders, zoals ampullen of flesjes in volumehoeveelheden van bijvoorbeeld 0,5 tot 20 ml.

De waterige oplossing van t-PA wordt bij voorkeur bij een tempe-35 ratuur van -10 - -40°C ingevroren. De ingevroren waterige oplossing wordt daarna bij voorkeur op deze temperatuur gehouden tot dat het vacuüm fi ί A ai 7 c § o y j o o 5 r~ i -9- drogen is begonnen.

Vacuüm drogen van de ingevroren waterige oplossing 3<an op conventionele wijze worden uitgevoerd en omvat drogen onder een partieel of volledig vacuüm, bijvoorbeeld bij een druk van 0,01 - 0,1 Torr, ge-5 durende een voldoende tijd om verwijdering van nagenoeg alle ingevroren vloeistof te bewerken.

De temperatuur waarbij het vacuüm drogen wordt uitgevoerd, bedraagt gewoonlijk -30 --40°C aan het begin van het proces om de wate rige oplossing in een hoofdzakelijk of volledig ingevroren vorm te 10 houden. Naarmate het proces voortschrijdt en het water wordt verwijderd, kan de temperatuur geleidelijk worden verhoogd totdat hij kamertemperatuur bereikt. Het heeft de voorkeur dat het vacuüm drogen aan het einde van het proces wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur of net daar boven onder een sterk vacuüm van ongeveer 0,01 Torr om zoveel mogelijk van 15 de laatste sporen water te verwijderen. Het vochtgehalte van de resulterende gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling is bij voorkeur lager dan 2,5 %. Wanneer het vacuüm drogen eenmaal is voltooid, wordt de steriele, kunststoffen of glazen houder die de gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling bevat, daarna op een gepaste wijze gesloten.

20 Tijdens het vacuüm drogen van de ingevroren waterige oplossing wordt het water verwijderd waarbij het t-PA achterblijft in de vorm van een fysiologisch aanvaardbaar zout. Derhalve verschaft de onderhavige uitvinding ook een fysiologisch aanvaardbaar zout, in het bijzonder een fysiologisch aanvaardbaar zuur additiezout, zoals het hydrochloridezout, 25 van t-PA.

Het gebruik van de onderhavige uitvinding maakt voor het eerst mogelijk dat een gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling wordt verkregen die een parenterale oplossing met een hoge concentratie t-PA kan leveren. Derhalve verschaft de onderhavige uitvinding ook een ge-30 lyofiliseerde farmaceutische samenstelling van t-PA, die bij oplossen in water een t-PA concentratie kan geven van meer dan 100.000 lU/ml, meer in het bijzonder groter dein 500.000 IU/ml, en liefst groter dan 1.000.000 IU/ml.

Om een parenterale oplossing van t-PA voor toediening te bereiden, 35 wordt de volgens de onderhavige werkwijze verkregen gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling gereconstitueerd in water met een neutrale of zurepH. Wanneer de waterige oplossing waaruit de gelyofiliseerde farma- 560 13 * * % 'v -10- ceutische samenstelling werd verkregen, in hoge mate isotonisch is, heeft het de voorkeur dat het voor reconstitutie gebruikte water eveneens in hoge mate isotonisch is.

De biologische activiteit van t-PA in het oplossen van het fi-5 brine-netwerk van bloedstolsels heeft geleid tot zijn bruikbaarheid in de behandeling van trombosekwalen (The Lancet, 7 November 1981,1018-1020; ibid, 13 April 1985, 842-847; The New England Journal of Medicine, 1984 310(10),609-613; en ibid., 1985, 312(14) , 932-936). De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een methode voor het behandelen van een 10 trombosekwaal in een zoogdier, omvattende de toediening aan het zoogdier van een parenterale oplossing van t-PA verkregen uit een gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling zoals hierin gedefinieerd. Verder wordt ook een gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling van t-PA verschaft, zoals hierin gedefinieerd, voor gebruik in de humane of diergeneeskunde, 15 in het bijzonder voor gebruik in de behandeling van een trombosekwaal.

Bijzondere voorbeelden van trombosekwalen zijn op zichzelf bekend en omvatten myocardiaal infarct, diepe adertrombose, longembolie en beroerte.

De hoofdtoedieningsroute van t-PA is door intravasculaire, in het 20 bijzonder intraveneuze infusie hoewel mogelijk andere toedieningsrouten zoals intramusculaire toediening kunnen worden toegepast. Intravasculaire infusies worden normaliter uitgevoerd met de parenterale oplossing in een infusiezak of fles of binnen een elektrisch bestuurde infusie-naald. De oplossing kan uit de infusiezak of fles aan de patiënt worden 25 afgegeven door zwaartekrachttoevoer of door gebruik te maken van een infusiepomp. Het gebruik van zwaartekrachttoevoer infusiesystemen geeft niet voldoende controle over de toedieningssnelheid van de parenterale oplossing en daarom heeft het gebruik van een infusiepomp de voorkeur, in het bijzonder met oplossingen die betrekkelijk hoge concentraties 30 t-PA bevatten. Grotere voorkeur heeft echter het gebruik van een elektrisch bestuurde infusienaald die een nog grotere controle over de toe-dieningssnelheid biedt.

De voor het behandelen van een zoogdier met een trombosekwaal effectieve hoeveelheid t-PA zal natuurlijk afhangen vein een aantal 35 factoren waaronder bijvoorbeeld de leeftijd en het gewicht van het zoogdier, de precieze conditie die behandeling vereist en de ernst daarvan, de toedieningsroute, en zal uiteindelijk onder de verantwoordelijkheid Ό i- i 0 0 3 -11- van de desbetreffende arts of diergeneeskundige vallen. Het is echter waarschijnlijk dat een effectieve hoeveelheid voor lysis van een coronaire slagadertroobus bijvoorbeeld in het algemeen in een bereik van 150.000 tot 450.000 lü/kg lichaamsgewicht van de patiënt per uur zal 5 bedragen. Voor een volwassen mens van 70 kg zal derhalve een effectieve hoeveelheid per uur in het algemeen 10.000.000 tot 30.000.000 IO, in het bijzonder ongeveer 20.000.000 10 bedragen, en deze hoeveelheid kan met of zonder een voorbehandelingsdosis worden toegediend. Het is ook waarschijnlijk dat de dosering voor sommige trombosecondities geringer 10 zal zijn, bijvoorbeeld voor diepe adertrombose en acute beroerte, of voor het eenvoudig in puike conditie houden van een reeds opnieuw door-stroombaar gemaakte coronair slagader. In deze situaties zal een effectieve hoeveelheid in het algemeen 7.000 tot 36.000 IU/kg lichaamsgewicht van de patiënt per uur zijn.

15 De volgende voorbeelden worden gegeven ter toelichting van de onderhavige uitvinding en dienen niet zodanig te worden uitgelegd dat ze de uitvinding beperken.

Voorbeeld I

- Een geklaarde oogst van t-PA, verkregen uit een gekweekte ge-20 transformeerde CHO-cellijn die afgeleid was onder toepassing van de procedure volgens Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7), 1750-1759, werd chromatografisch gezuiverd en het t-PA werd verzameld als een waterige oplossing die 0,17 M natriumcitraat en 0,01 % (w/v) Tween 80 bevatte, bij een pH van 5,5. De pH van de oplossing werd met zoutzuur in-25 gesteld op 3,0 en de verkregen oplossing werd door ultrafiltratie geconcentreerd onder toepassing van een H-10 Cartridge (Amicon Ltd., Upper Hill, Stonehouse, Gloucestershire, England). De geconcentreerde waterige oplossing werd verder gezuiverd door hem aan te brengen op een gelfil-tratiekolom (Sephadex G-150; Pharmacia Biotechnology, Uppsala, Sweden) 30 en te elueren met 0,85 % zoutoplossing die 0,01 % (w/v) Tween 80 bevatte,bij een pH van 3,0. Een sterk gezuiverde waterige oplossing van t-PA werd aldus verkregen, welke oplossing nog één keer werd geconcentreerd onder toepassing van een wegwerp kunstnier. Het t-PA werd uit de oplossing neergeslagen door de pH tot 5,5 te verhogen met behulp van 35 natriumhydroxyde en de suspensie gedurende 2 uur op 4°C te houden. Het t-PA werd gewonnen door centrifugeren gedurende 30 minuten bij 4°C bij mi 353 -12- 4000 x g. Het t-PA pellet werd opnieuw opgelost in een waterige oplossing van natriumehloride [0,85 % (w/v)] die 0,01 % (w/v) Tween 80 bevatte, en ingesteld met zoutzuur op een pH van 3,0. Er werd een volumehoe-veelheid zoutoplossing gebruikt die nodig was om een concentratie van 5 t-PA te verkrijgen tussen 7.500.000 en 10.000.000 IU/ml. Deze t-PA oplossing werd verdund met een verdere waterige oplossing van natrium-chloride [0,85 % (w/v)], die 0,01 % (w/v) Tween 80 bevatte en ingesteld op een pH van 3,0 met behulp van zoutzuur, en ook met een voldoende hoeveelheid van een oplossing van 10 % (w/v) mannitol in dezelfde zure 10 zoutoplossing om eindconcentraties van 5.000.000 IU/ml t-PA en 25 mg/ml mannitol te realiseren. De verkregen oplossing werd aan een filter-sterilisatie onderworpen en in volumehoeveelheden van 1 ml gebracht in glazen flesjes die ingevroren werden bij -35°C. Er werd een vacuüm aangelegd bij 0,05 Torr. (6,7 Pa). Na ongeveer 24 uur werd de temperatuur 15 geleidelijk verhoogd tot 5°C en gedurende 16 uur op deze temperatuur gehouden. Daarna werd hij opnieuw verhoogd tot 25°C en werd het vacuüm verhoogd tot 0,02 Torr (2,7 Pa) gedurende nog eens 24 uur, waarna de flesjes onder een partieel vacuüm van 600 Torr (80 kPa) van droog stikstof werden afgesloten.

20 Voorbeeld II.

De trombolytische werkzaamheid van een parenterale oplossing, verkregen uit de gelyofiliseerde t-PA samenstelling volgens voorbeeld I, werd onderzocht in een in vivo model van halsadertrombose.

(a) Procedure: 25 De experimentele procedure volgde in essentie de procedure be schreven door Collen et al (J. Clin.Invest., 1983, Tl, 368-376).

De gelyofiliseerde samenstelling van voorbeeld I werd snel en volledig opgelost in een steriele isotonische zoutoplossing die op een pH van 3,0 was ingesteld en 0,01 % Tween 80 bevatte. Aldus werd een pa-30 renterale oplossing verkregen voor een twee uur durend infuus van 500.000 IU/kg t-PA. De infusie geschiedde via een canule in de rechterdij ader. Vier nieuw Zeelandse witte konijnen werden in dit onderzoek gebruikt. Na infusie werd de trombolysegraad geschat.

(b) Resultaten: 35 Het percentage trombolyse 28,9 _+ 4,1, hetgeen de trombolytische werking van de parenterale oplossing, verkregen uit de gelyofiliseerde t-PA samenstelling volgens voorbeeld I aantoont. Bovendien werden geen nadelige reacties met deze oplossing waargenomen.

9 S Ό 1 3 5 3

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van een gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling van t-PA, omvattende het vacuüm drogen van een ingevroren waterige t-PA oplossing, waarin de pH 2 - 5 bedraagt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin het t-PA in de uit één- 5 keten bestaande vorm of in de uit twee-ketens bestaande vorm verkeert.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarin het t-PA de amino-zuurvolgorde heeft volgens fig. 1 of dezelfde aminozuurvolgorde heeft, met dien verstande dat het aminozuur op de 245ste positie vanaf de serine N-terminus valine is in plaats van methionine, waarbij elke 10 volgorde desgewenst één of meer van de drie eerste aminozuren mist of desgewenst een extra polypeptide N-terminale voorsequentie van Gly-Ala-Arg heeft.

4. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarin het t-PA verkregen is uit een gekweekte getransformeerde 15 of getransfecteerde cellijn, afgeleid onder toepassing van recombinant DNA-technologie.

5. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarin de t-PA concentratie in de waterige oplossing groter is dan 100.000 IU/ml.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarin de concentratie van t-PA groter is dan 500.000 IU/ml.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarin de concentratie van t-PA groter is dan 1.000.000 IU/ml.

3. Werkwijze volgens conclusie 7, waarin de concentratie van t-PA 25 ongeveer 5.000.000 IU/ml is.

9. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarin de pH van de waterige oplossing 2 - 4,5 is.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarin de pH 2,5 - 4,0 is.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, waarin de pH 2,8 - 3,5 bedraagt.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarin de pH ongeveer 3,0 is.

13. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarin het medium voor de waterige oplossing geheel of in hoofdzaak op waterbasis is. J Μ i J . - -14-

14. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarin het medium voor de waterige oplossing een fysiologisch aanvaardbaar middel omvat dat de oplossing nagenoeg isotonisch met humaan bloed-serum maakt.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, waarin het fysiologisch aanvaard bare middel natriumchloride is.

16. Werkwijze volgens conclusie 14, waarin het fysiologisch aanvaardbare middel dextrose is.

17. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, 10 waarin de waterige oplossing een oppervlakte-actief middel omvat.

18. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarin de waterige oplossing in hoofdzaak ongebufferd is.

19. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarin de waterige oplossing in hoofdzaak vrij is van lysine of omi- 15 thine of een zout daarvan.

20. Werkwijze volgens één van de voorgaande conclusies, waarin de waterige oplossing wordt gesteriliseerd.

21. Gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling, verkregen met de werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies.

22. Gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling van t-PA, welke bij oplossen in water een t-PA concentratie kan geven boven 100.000 IU/ml.

23. Gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling volgens conclusie 22. waarin de concentratie groter is dan 500.000 IU/ml.

24. Gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling volgens conclusie 25 23, waarin de concentratie groter is dan 1.000.000 IU/ml.

25. Gesloten houder met een gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling, zoals gedefinieerd in één of meer van de conclusies 21 - 24.

26. Fysiologisch aanvaardbaar zout van t-PA.

27. Fysiologisch aanvaardbaar zuur additiezout van t-PA.

28. Hydrochloride zout van t-PA.

29. Werkwijze voor het behandelen van een trombosekwaal in een zoogdier, omvattende de toediening aan het zoogdier van een parenterale oplossing van t-PA, verkregen uit een gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling zoals gedefinieerd in één of meer van de conclusies 21 - 24.

30. Gelyofiliseerde farmaceutische samenstelling, zoals gedefinieerd in één of meer van de conclusies 21 - 24, voor gebruik in de mensgenees-kunde of diergeneeskunde, in het bijzonder voor gebruik in de behandeling van een trombosekwaal. A β Π 1 τ % s **** V - V ^ ζ)